BR112020006786A2 - composições e métodos para editar rna - Google Patents

composições e métodos para editar rna Download PDF

Info

Publication number
BR112020006786A2
BR112020006786A2 BR112020006786-5A BR112020006786A BR112020006786A2 BR 112020006786 A2 BR112020006786 A2 BR 112020006786A2 BR 112020006786 A BR112020006786 A BR 112020006786A BR 112020006786 A2 BR112020006786 A2 BR 112020006786A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
rna
mecp2
guide rna
guide
endogenous
Prior art date
Application number
BR112020006786-5A
Other languages
English (en)
Inventor
Gail Mandel
John P. Adelman
John SINNAMON
Original Assignee
Oregon Health & Science University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oregon Health & Science University filed Critical Oregon Health & Science University
Publication of BR112020006786A2 publication Critical patent/BR112020006786A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P23/00—Anaesthetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/85—Fusion polypeptide containing an RNA binding domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/122—Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

São fornecidas composições e métodos para editar moléculas de RNA endógeno.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA EDITAR RNA”
[0001] O presente pedido reivindica prioridade sob do U.S.C. S119(e) do Pedido de Patente Provisório nº U.S. 62/569,376, depositado em 6 de outubro de 2017. O pedido supracitado é incorporado a título de referência no presente documento.
[0002] A presente invenção foi elaborada com apoio governamental sob o nº de concessão NS087726 concedido pelos Institutos Nacionais de Saúde. O Governo tem determinados direitos sobre a presente invenção.
DESCRIÇÃO DO ARQUIVO DE TEXTO SUBMETIDO ELETRONICAMENTE
[0003] O conteúdo do arquivo de texto submetido eletronicamente em conjunto é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade: Uma cópia de formato legível por computador da Listagem de Sequências (nome do arquivo: SEQLIST.txt; data registrada: 9 de outubro de 2018; tamanho do arquivo: 44,6 KB).
CAMPO DA INVENÇÃO
[0004] A presente invenção refere-se ao campo de edição de ácido nucleico. De modo específico, são reveladas composições e métodos para editar de maneira terapêutica o RNA, particularmente, RNA endógeno dentro do núcleo.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0005] Diversas publicações e documentos de patente são citados ao longo do presente relatório descritivo a fim de descrever o estado da técnica ao qual esta invenção pertence. Cada uma dessas citações é incorporada no presente documento a título de referência conforme apresentado completamente.
[0006] Os avanços foram feitos em estratégias que ditam ou alteram o material genético, por exemplo, várias tecnologias de edição de gene. No entanto, permanece uma necessidade de metodologias que corrijam mutações que causam doenças, especialmente no sistemas nervoso.
[0007] A síndrome de Rett é um distúrbio de neurodesenvolvimento causado por mutações esporádicas na proteína 2 de aglutinação ao Metil-GpbG do fator de transcrição (MECP2) (Amir, et al. (1999) Nat. Genet., 23:185 a 188). MECP2 está localizado no cromossomo X. Devido aos mecanismos de compensação de dosagem em mamíferos, as fêmeas afetadas com síndrome de Rett são mosaicas, com uma divisão de aproximadamente 50:50 entre células do tipo selvagem e mutantes. Pessoas do sexo feminino com mutações MECP2 se sobrepõem à regressão de pontos de verificação de desenvolvimento precoce, tal como fala e movimentos da mão propositais, e em seguida adquirem anormalidades motoras graves , incluindo respiração e morrem, em média, aos 40 anos de idade (Neul, et al., (2010) Ann. Neurol., 68:944 a 950; Percy, et al. (2010) Ann. Neurol., 68:951 a 955).
Pessoas do sexo masculino em MECP2, com um único cromossomo X, têm uma doença ainda pior, normalmente sucumbindo antes dos 2 anos de idade (Schule, et al. (2008) Clin. Genet., 74:116 a 126). Não há cura para à síndrome de Rett.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0008] De acordo com um aspecto da presente invenção, são fornecidos métodos para editar a sequência de um RNA endógeno em uma célula, particularmente, no núcleo da célula. Em uma determinada modalidade, o método compreende entregar à célula i) uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão que compreende um sinal de localização nuclear e uma enzima de edição de RNA ligada a um domínio de aglutinação ao RNA e ii) uma molécula de ácido nucleico que codifica um ou mais RNAs-guia. O RNA-quia compreende uma sequência reconhecida especificamente pelo domínio de aglutinação ao RNA. o RNA-quia também hibridiza especificamente com uma sequência-alvo no RNA endógeno e compreende um mau pareamento em um nucleotídeo a ser editado. Em determinadas modalidades, a enzima de edição de RNA é uma Adenosina Deaminase que Atua no RNA (ADAR), tal como ADRARI ou ADAR2Q. Em determinadas modalidades, o domínio de aglutinação ao RNA é o peptídeo AN, e a sequência reconhecida especificamente pelo domínio de aglutinação ao RNA é a sequência BoxB. Em determinadas modalidades, o RNA endógeno é RNA de proteína 2 de aglutinação ao Metil-GpG (MECP2). Em determinadas modalidades, o sinal de localização nuclear é o sinal de localização nuclear do antígeno T SV40 Grande. As moléculas de ácido nucleico desses métodos podem estar contidas dentro de um único vetor, tal como um vetor viral (por exemplo, vetor de vírus adeno-associado (AAV)).
[0009] De acordo com outro aspecto da presente invenção, são fornecidos métodos adicionais para editar a sequência de um RNA endógeno em uma célula, particularmente, no núcleo da célula. Em determinadas modalidades, o método compreende entregar à célula uma molécula de ácido nucleico que codifica um ou mais RNA-quia, em que o RNA-quia compreende uma sequência (ou sequências) e/ou estrutura reconhecida especificamente por uma deaminase endógena, tal como Adenosina Deaminase que Atua no RNA (ADAR) humana. O RNA-guia também hibridiza especificamente com a sequência- alvo no RNA endógeno e compreende um mau pareamento em um nucleotídeo a ser editado. Em uma determinada modalidade, a ADAR é ADRAl ou ADAR2Z. Em determinadas modalidades, o RNA endógeno é RNA de proteína 2 de aglutinação ao Metil-GpG (MECP2). Em determinadas modalidades, uma molécula de ácido nucleico está contida dentro de um vetor viral (por exemplo, um vetor de AAV).
[0010] De acordo com outro aspecto da presente invenção, são fornecidos métodos adicionais para editar a sequência de um RNA endógeno em uma célula, particularmente,
no núcleo da célula. Em determinadas modalidades, o método compreende entregar à célula uma molécula de ácido nucleico que codifica um RNA-quia (por exemplo, dentro de um AAV), em que o RNA-guia compreende uma sequência (ou sequências) e/ou estrutura reconhecidas especificamente por uma Adenosina Deaminase que Atua no RNA (ADAR) humana endógena. Consequentemente, em vários aspectos, os presentes métodos de edição podem ser realizados na ausência de uma enzima de edição de RNA recombinante (por exemplo, na ausência de uma ADAR recombinante). Desse modo, nas modalidades, os presentes métodos iniciam atividades de ADAR endógena para afetar a edição descrita no presente documento.
[0011] De acordo com outro aspecto da presente invenção, são fornecidos métodos para tratar, inibir e/ou prevenir síndrome de Rett em um indivíduo. Em determinadas modalidades, o método compreende usar os métodos de edição de RNA da presente invenção. Por exemplo, o método pode compreender administrar ao indivíduo uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão que compreende uma enzima de edição de RNA ligada a um domínio de aglutinação ao RNA e uma molécula de ácido nucleico que codifica um RNA-guia, em que a proteína de fusão compreende um sinal de localização nuclear. Em determinadas modalidades, os métodos compreendem administrar ao indivíduo uma molécula de ácido nucleico que codifica um RNA-quia, em que o RNA-guia compreende uma sequência (ou sequências) e/ou estrutura (ou estruturas) reconhecidas especificamente por uma deaminase humana endógena, tal como Adenosina Deaminase que Atua no RNA (ADAR), e em que o RNA-guia hibridiza especificamente com RNA de proteína 2 de aglutinação ao Metil-GpG (MECP2) e compreente um mau pareamento no nucleotídeo mutante do RNA de MECP2 endógeno.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0012] As figuras 1A a 1D mostram que a eficiência de edição depende da sequência. Figura 1A: Esquemático que mostra posições de três mutações G > A em relação ao Domínio de Aglutinação Metil-DNA (MBD), Domínio Repressor Transcricional (TRD) e domínio de interação NCOR (NID) em MeCP2. Figura 1B: Esquemático dos componentes principais de edição de RNA sítio-direcionada. A Editase híbrida contém um domínio de aglutinação ao RNA do bacteriófago A (MN) e o domínio catalítico (domínio da deaminase) de Adenosina Deaminase que Atua no RNA 2 humana (hADAR2Q). Também incluídas, porém não mostradas, são três cópias de um sinal de localização nuclear (NLS) e duas cópias de uma tag de epitopo (HA)- de hemaglutinina de influenza humana. O RNA- guia é complementar ao mRNA de mecp2 e contém o grampo (haste-alça) reconhecido pelo domínio de aglutinação ao RNA de AN. Diferentemente do alvo A, um C tem introduzido no guia para aumentar a eficiência de edição. Figura 1C:
Cromatogramas de sequenciamento de cDNA de Mecp2woix após transfecção em células de neuroblastoma N2A de Editase com (Topo) ou sem (Baixo) guia. Figura 1D: Porcentagem de edição A-para-I (média + SD; n = 3) quantificada com o uso de sequenciamento direto de Mecp2 cDNA e incluindo dados na figura 1C. Barras cinza-claro, células submetidas à transfecção apenas com Editase; barras cinza-escuro, células submetidas à transfecção com Editase e guia. ***P < 0,001, ****P < 0,000l por ANOVA de uma via com teste Bonferroni post hoc. ns: não significativa.
[0013] As figuras 2A a 2F mostram que a edição não alvo com uma Editase mais eficiente pode ser reduzida com o uso de uma guia com um mau pareamento A-G sítio-específico com mRNA de Mecp2. Figura 2A: Porcentagem de edição de A- para-I no sódio R106Q (média + SD, n = 3) após transfecção nas células N2A do RNA-quia e Editasew ou Editaserssso (média t+ SD; n = 3, inclui dados na figura 2B). Figura 2B: Os cromatogramas representativos de Mecp2ri0so CDNA editado com Editasewr (Topo) ou Editasezs88o (Baixo). Figura 2C: mRNA de Mecp2 em relação a dois RNAs-guia diferentes. O guia padrão (Topo) contém um mau pareamento A-C (R106Q) no alvo A (destacado em negrito) para aperfeiçoar a edição. A guia modificada (Baixo) contém um mau pareamento A-G a um A não alvo marcado por um asterisco para inibir a edição nesse sítio. A sequência-alvo fornecida é a SEQ ID NO: 52. Figura
2D: Os cromatogramas de Mecp2 cDNA após a transfecção de células N2A com Editaser:sso e uma guia que contém apenas o mau pareamento no sítio-alvo (Topo) ou a guia modificada que contém tanto o mau pareamento no alvo A-C quanto o mau pareamento A-G no sítio não alvo (Baixo). Figura 2E: A edição não alvo é reduzida gravemente com a guia que contém o mau pareamento A-G (média + SD; n = 3, inclui os dados na figura 2D). Figura 2F: A presença do pareamento A-G não afeta a edição no sítio R106Q (média + SD; n = 3, inclui dados na figura 2D). As barras cinza claro, as células submetidas à transfecção com Editase apenas; barras cinza escuro, células submetidas à transfecção com Editase e guia; barras pretas, células submetidas à transfecção com Editase e guia que contém o mau pareamento A-G. **P < 0,01, ***P < 0,001, ****p < 0,0001 por ANOVA de uma via com teste Bonferroni post hoc. ns: não significativo.
[0014] As figuras 3A a 3B mostram análise de sequência de mRNA de mMRNA de MeCP2 endógeno em seguida da transdução de AAV1I/2 de neurônios primários. Figura 3A: Quantificação de edição (média + SD, n = 3) por análise de sequência de cDNA isolado dos neurônios do hipocampo de Mecp2rioso/y (DIVI4), 7 dias em seguida da transdução com o vírus AAV1/2. +quia se refere a AAV1/2 que contém Editase sob o controle do promotor neuronal Sinapsina I e seis cópias do guia, cada uma expressa sob o controle de um promotor U6.
O guia contém um mau pareamento de C na A tida como alvo para R106Q e um mau pareamento de G na A não alvo T105T. O vírus de controle codifica a Editase sob o controle do promotor de Sinapsina TI, porém carece de quaisquer sequências-guia (-gquia). ****P < 0,0001 por teste t bicaudal não pareado. Figura 3B: mRNA de Mecp2 (SEQ ID NO: 52) e sequências de aminoácidos primários (SEQ ID NO: 53) em relação a região do RNA-guia. A A-alvo está em negrito, e os asteriscos indicam resíduos de A editada não alvo. Os grampos na quia representam as posições das sequências BoxB reconhecidas pelo peptídeo NAN. O gráfico fornece a quantificação de edição nos sítios não alvo dentro do mRNA de Mecp2 (média + SD; n = 3). N126S Residual está fora da região-guia.
[0015] A figura 4 mostra que a edição de RNA sítio- direcionada aumenta os níveis de proteína de MeCP2, desse modo, demonstrando a recuperação funcional de uma doença endógena que causa proteína após edição. Um Western blot representativo é dotado de lisados de células inteiras do Mecp2rio6/y ou neurônios irmãos do hipocampo do tipo selvagem (WTI, Mecp2+/y) (DIVI4) submetido à transdução 7 dias antes com AAV1/2 que expressa ou Editase somente ou Editase e guia. O guia contém um mau pareamento de C no sítio R106Q e um mau pareamento de G na A não alvo, T1I05T. O gráfico fornece uma quantificação de Western blots (média + SD, n = 3), cada condição normalizada para B-actina. A barra cinza claro, as células submetidas à transdução com Editase somente; barra cinza escuro, células submetidas à transdução com Editase e guia. ****P < 0,001 por teste t bicaudal não pareado.
[0016] As figuras 5A a 5G mostram que a edição de RNA sítio-direcionada restaura a capacidade da MeCP2 para se ligar à heterocromatina, demonstrando uma recuperação da função de uma proteína endógena após edição. São mostrados imagens confocais representativas dos neurônios do hipocampo (DIVI14) confocais imunoidentificados para Editase (HA) e MeCP2. A marcação de DAPI delineia os núcleos e mostra focos heterocromáticos. As inserções demarcam as células imageadas em uma ampliação maior e maior ganho nos painéis adjacentes. Figura 5A: Culturas neuronais do tipo selvagem (Mecp2:/y). Figura 5B: As culturas neuronais Mecp2riocw/, submetidas à transdução com vírus AAV1/2 que expressa apenas a Editase (no guia). Esses neurônios nunca exibiram o enriquecimento de MeCP2 em heterocromatina. Figuras 5C e 5D: As culturas neuronais Mecp2rioso/y submetidas à transdução com vírus AAV1/2 que expressa a Editase e guia que contém o mau pareamento de C na A-alvo. Na figura 5D, + e - indicam os núcleos com a presença e a ausência, respectivamente, do enriquecimento de MeCP2 em heterocromatina. Barra de escala, 10 um. Figuras 5E a 5G: Cada histograma representa a quantificação de células (Editase apenas, n = 134; Editase e guia, n = 137) de três campos em cada uma das três barras (média + SD). Figura SE: A porcentagem de Editase+ células identificadas por marcação nuclear de HA após limitar os sinais das células não infectadas. As porcentagens estão relacionadas ao número total das células DAPI+. Figura 5F: A porcentagem de Editase+ células com enriquecimento de MeCP2 em heterocromatina (focos). Figura 5G: A porcentagem de todas as células com enriquecimento de MeCP2 em heterocromatina (focos). ns: não significativo.
[0017] A figura 6 fornece um gráfico de intensidade de MeCP2 em heterocromatina neuronal do dentado nos cérebros dos camundongos do tipo selvagem ou camundongos Mecp2317G>A (Mecp2ri06o) tratados com vetores de AAV que codificam a Editase apenas ou Editase com RNAs-guia.
[0018] A figura 7 fornece um esquemático de vários RNAs-guia e um gráfico da porcentagem de edição Mecp23176>A (Mecp2r106) em células HEK sem tratamento ou tratados com um RNA-guia com 2 hastes-alças BoxB, um RNA-quia que compreende um sítio de aglutinação R/G de GluA2 ou um RNA-guia que tem alças internas. As células HEK também foram submetidas à transfecção com cDNA de ADAR2 nativo de comprimento completo sob o controle do promotor CMV.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0019] A presente invenção se baseia, parcialmente, na surpreendente constatação de que é possível utilizar edição de RNA sítio-direcionada para reparar, ao nível do RNA (por exemplo, mRNA), uma mutação pontual que causa doença, por exemplo, uma mutação de guanosina para adenosina (G > A) no gene de domínio de aglutinação ao DNA da proteína 2 de aglutinação ao Metil-GpG (MECP2) que é subjacente à síndrome de Rett. Com importância, essa edição de RNA sítio- direcionada é útil, inter alia, para reparar um RNA endógeno e restaurar a função de proteína. Consequentemente, nas modalidades, a presente invenção se refere a composições e métodos para edição de RNA sítio-direcionada.
[0020] Os camundongos modificados com mutações em Mecp2 que causam à síndrome de Rett em humanos, ou linhagem germinativa ou confinados em células neuronais, exibem anormalidades de crescimento, ansiedade e déficits motores, que são semelhantes a pacientes com síndrome de Rett (Guy, et al. (2001) Nat. Genet., 27:322 a 326; Lioy, et al. (2011) Nature 475:497 a 500; Chen, et al. (2001) Nat. Genet., 27:327 a 331). Os estudos em camundongos indicam que os fenótipos de síndrome de Rett mais robustos são neurológicos, o que afeta tanto os neurônios e glia (Lioy, et al. (2011) Nature 475:497-500; Luikenhuis, et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci., 101:6033-6038), embora muitos outros tecidos também sejam afetados provavelmente (Ross, et al. (2016) Hum. Mol. Genet., 25:4.389 a 4.404). Quando a seres humanos, camundongos machos com Rett têm uma doença mais grave do que camundongos fêmeas.
Por exemplo, os camundongos fêmeas com Rett vivem uma vida normal, ao passo que camundongos machos morrem entre 3 e 4 meses de idade (Guy, et al. (2001) Nat.
Genet., 27:322 a 326; Chen, et al. (2001) Nat.
Genet., 27:327 a 331). No nível celular, as células neuronais em camundongos macho e fêmea Rett têm somas menores, núcleos e complexidades de processo reduzidas (Belichenko, et al. (2009) Neurobiol.
Dis., 34:71 a 77; Belichenko, et al. (2009) J.
Comp.
Neurol., 514:240 a 258; Fukuda, et al. (2005) J.
Neuropathol.
Exp.
Neurol., 64:537 a 544; Kishi, et al. (2004) Mol.
Cell.
Neurosci., 27:306 a 321; Robinson, et al. (2012) Brain 135:2.699 a 2.710; Tropea, et al. (2009) Proc.
Natl.
Acad.
Sci., 106:2.029 a 2.034; Stuss, et al. (2012) PLoS One 7:e31896), reminiscent of affected human cells (Armstrong, et al. (1995) J.
Neuropathol.
Exp.
Neurol., 54:195 a 201; Li, et al. (2013) Cell Stem Cell 13:446 a 458; Belichenko, et al. (1994) Neuroreport., 5:1.509 a 1.513; Bauman, et al. (1995) Neurology 45:1.581 a 1.586). Com importância, a restauração de MeCP2 nos camundongos de Mecp2 nulo, por meio da Cre recombinase condicional (Guy, et al. (2007) Science 315:1.143 a 1.147) ou abordagens de terapia de gene (Sinnett, et al. (2017) Mol.
Ther.
Methods Clin.
Dev., 5:106 a 115; Gadalla, et al. (2017) Mol.
Ther.
Methods Clin.
Dev., 5:180 a 190; Garg, et al. (2013) J.
Neurosci., 33:13.612-13.620; Gadalla, et al. (2013) Mol.
Ther., 21:18 a 30), reverte muitos sintomas do tipo Rett e déficits celulares, até mesmo em estágios tardios da doença. As reversões de fenótipo indicam que em seres humanos, a síndrome de Rett pode ser tratada com estratégias de substituição de gene (Robinson et al. (2012) Brain 135:2.699 a 2.710; Sinnett, et al. (2017 Mol. Ther. Methods Clin. Dev., 5:106 a 115; Gadalla, et al. (2017) Mol. Ther. Methods Clin. Dev., 5:180 a 190; Garg, et al. (2013) J. Neurosci., 33:13.612-13.620; Gadalla, et al. (2013) Mol. Ther., 21:18 a 30). No entanto, as duplicações que abrangem o gene de MECP2 em seres humanos resultam na sobrexpressão de MeCP2 e uma distúrbio neurológico grave (Van Esch, et al. (2005) Am. J. Hum. Genet., 77:442 a 453). Além disso, a MeCP2 em camundongos é expresso em níveis diferentes em tipos de célula neuronal diferente e perda de função de MeCP2 em camundongos resulta em alterações célula- específicas em expressão gênica (Skene, et al. (2010) Mol. Cell., 37:457 a 468; Ballas, et al. (2009) Nat. Neurosci., 12:311 a 317; Shahbazian, et al. (2002) Hum. Mol. Genet., 11:115 a 124; Sugino, et al. (2014) J. Neurosci., 34:12.877 a 12.883; Linhoff, et al. (2015) Cell 163:246 a 255). Essas constatações ressaltam os desafios para substituição de gene MECP2 que precisa ser sintonizado para restaurar os níveis normais de MeCP2 e fisiologia celular em diversos tipos de célula no sistema nervoso.
[0021] No presente documento, é mostrado que a reparação das mutações MECP2 no nível de RNA contorna os problemas tanto da sobrexpressão de MECP2 e regulação de célula tipo-específico uma vez que RNA é reparado no contexto da transcrição normal.
As mutações de guanosina para adenosina (G > A) que estão subjacentes à síndrome de Rett (Fyfe, et al. (2003) J.
Child.
Neurol., 18:709 a 713) foram tidas como alvo.
Uma família de enzimas de ocorrências natural, a Adenosina Deaminase que Atua no RNA (ADAR), desamina de maneira hidrolítica A para inosina (I) (Bass, et al. (1988) Cell 55:1.089 a 1.098; Bass, et al. (1987) Cell 48:607 a 613; Melcher, et al. (1996) Nature 379:460 a 464; O'"Connell, et al. (1998) Methods 15:51 a 62; Kim, et al. (1994) Proc.
Natl.
Acad.
Sci., 91:11.457 a 11.461) em mRNAS endógenos.
A base de inosina pareia com citosina (C) e é traduzida pelo ribossoma como G (Basilio, et al. (1962) Proc.
Natl.
Acad.
Sci., 48:613 a 616). Um membro de família da ADAR, ADAR2, é expresso em altos níveis no cérebro em que altera de maneira pós-transcricional as funções de proteína, tal como permeabilidade de canal de íons, através de desaminação da transcrição primária (Bhalla, et al. (2004) Nat.
Struct.
Mol.
Biol., 11:950 a 956; Sommer, et al. (1991) Cell 67:11 a 19; Burns, et al. (1997) Nature 387:303 a 308). Além da atividade catalítica, a edição natural por ADAR2 exige reconhecimento de uma estrutura de RNA de dupla fita, mediado por um íntron no pré-mRNA, que posiciona adequadamente o alto A em um éxon para edição (Bhalla, et al. (2004) Nat. Struct. Mol. Biol., 11:950 a 956; Dawson, et al. (2004) J. Biol. Chem., 279:4.941 a 4.951; Higuchi, et al. (1993) Cell 75:1.361 a 1.370; Maas, et al. (1996) O. Biol. Chem., 271:12.221 a 12.226; Lomeli, et al. (1994) Science 266:1.709 a 1.713; Yang, et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., 94:4.354 a 4.359). Um domínio catalítico clonado em ADAR2 humana (hADAR2) foi colocado subordinado, em várias configurações, a fim de ter como alvo o reparo de G > A em mMRNAs expressos de maneira heteróloga, normalmente em códons de parada (Hanswillemenke, et al. (2015) J. Am. Chem. Soc., 137:15.875 a 15.881; Vogel, et al. (2014) ChemMedChem 9:2.021 a 2.025; Vogel, et al. (2014) Angew Chem. Int. Ed. Engl., 53:6.267 a 6.271; Schneider, et al. (2014) Nucleic Acids Res., 42:e87; Montiel-González, et al. (2016) Nucleic Acids Res., 44:el157; Montiel-Gonzalez, et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci., 110:18.285 a 18.290). Em uma abordagem, os domínios de aglutinação de RNA nativo em ADAR2Q são substituídos por um peptídeo de aglutinação a RNA do bacteriófago lambda (AN; Montiel-Gonzalez, et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci., 110:18.285 a 18.290) que se aglutina a um grampo de RNA curto específico com afinidade nanomolar (Austin, et al. (2002) J. Am. Chem. Soc., 124:10.966 a
1.0967). A edição tida como alto do mMRNA heterólogo é, em seguida, obtida por expressão da proteína ADAR2 híbrida ao longo de um RNA guia que contém as hastes-alças reconhecidas por MN e uma região complementar ao mRNA-alvo (Montiel- González, et al. (2016) Nucleic Acids Res., 44:e157; Montiel- Gonzalez, et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci., 110:18.285 a 18.290).
[0022] Anteriormente, nenhum RNA ou mRNA endógeno foi reparado por edição de RNA sítio-direcionada, particularmente, com relação a ser reparado para render uma proteína funcional. No entanto, essa abordagem para mutações G > A em Mecp2 endógeno é demonstrada no presente documento pela primeira vez. As mutações em Mecp2 estão em domínios que codificam funções bem estabelecidas. Adicionalmente, a fidelidade de reparo pode ser monitorada por análise de sequência, Western blotting e, no único nível de célula, imunoquímica. No presente documento, a proteína hADAR2-AN recombinante (também denominado no presente documento como Editase) foi usada para reparo eficaz de mutações G > A dentro de transcrições de Mecp?2. Após determinar os parâmetros para edição de Mecp2 em células de neuroblastoma (N2A) de camundongo submetidas à transfecção, um vírus adeno- associado (AAV) foi usado para submeter à transdução as culturas neuronais primárias de um modelo de camundongo síndrome de Rett que contém uma mutação G > A grave humana no domínio de aglutinação de DNA (MeCP23176>a; MeCP2rR1060). Essa mutação resulta em níveis de proteína de MeCP2 reduzidos e atenuou consideravelmente a aglutinação à heterocromatina. A eficiência de edição do RNA mutante foi quantificada primeiramente em neurônios e, em seguida, foi testada se a edição resgata a níveis de proteína de MeCP2 e causa enriquecimento da aglutinação em focos de heterocromatina, uma propriedade-chave de MeCP2 em células, incluindo tipos de células neuronais, gliais e não neuronais. Os resultados apresentados no presente documento mostram que a edição de RNA sítio-direcionada pode reparar terapeuticamente mutações de MECP2 que causam a doença subjacentes à síndrome de Rett assim como outras doenças neurológicas tratáveis por terapia de gene.
[0023] De acordo com a presente invenção, os métodos para editar uma molécula de ácido nucleico em uma célula são fornecidos. Em uma modalidade particular, a molécula de ácido nucleico a ser editada é uma molécula de RNA, particularmente, uma molécula de RNA dentro do núcleo (por exemplo, uma transcrição primária, pré-mRNA ou mRNA (por exemplo, um mRNA antes de transportar para fora do núcleo)). Em uma modalidade particular, a molécula de ácido nucleico a ser editada é endógena e/ou uma transcrição nuclear. Com edição de gene, tal como com tecnologia de CRISPR, mutações não alvo no genoma são permanentes. Em contrapartida, a volta do RNA nas células significa que as mutações não alvo dentro do RNA serão temporárias. Adicionalmente, a edição de RNA,
diferentemente da edição genômica de CRISPR, pode ser classificada. Consequentemente, as mutações não alvo não são necessariamente editadas 100%.
[0024] Nas modalidades, a presente invenção fornece métodos de edição por RNA uma molécula de ácido nucleico que fornece sintonização precisa de expressão e/ou função de proteína. Por exemplo, os métodos da presente invenção permitem restauração de níveis normais de expressão e/ou função de proteína em relação a um estado não editado. No contexto dos tratamentos descritos no presente documento, os métodos da presente invenção permitem a restauração de níveis normais ou pelo menos níveis quase normais de expressão e/ou função de proteína em relação a um estado não tratado.
[0025] Nas modalidades, a presente invenção fornece métodos para editar por RNA uma molécula de ácido nucleico que fornece, por exemplo, no contexto das terapias descritas, edição de transiente que é sintonizável (por exemplo, por meio de dosagem). Por exemplo, a presente invenção permite uma edição reversível de um RNA-alvo.
[0026] Em uma modalidade particular, as células que são editadas são células não divisíveis. Em uma modalidade particular, as células que são editadas são células neuronais e/ou gliais. Em uma modalidade particular, as células que são editadas são células neuronais. Em uma modalidade particular, as células que são editadas são neurônios. As células (por exemplo, neurônios) pode estar no sistema nervoso central (por exemplo, cérebro, medula espinhal) e/ou sistema nervoso periférico. As células podem estar em um indivíduo a ser tratado (por exemplo, um método de tratamento in vivo) ou as células podem ser tratadas in vitro e, em seguida, administradas a um indivíduo (por exemplo, um método de tratamento ex vivo).
[0027] Em determinadas modalidades da presente invenção, os métodos compreendem entregar 1) uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima de edição de RNA ligado ou fundido a um domínio de aglutinação ao RNA e 2) um RNA-guia ou uma molécula de ácido nucleico que codifica o RNA-guia a uma célula. Em uma modalidade particular, o domínio de aglutinação ao RNA é ligado à extremidade N da enzima de edição de RNA. Nas modalidades, a fusão que compreende a enzima de edição de RNA e o domínio de aglutinação ao RNA não compreende pelo menos um sinal de localização nuclear (NLS). Nas modalidades, a fusão que compreende a enzima de edição de RNA e o domínio de aglutinação ao RNA compreende adicionalmente pelo menos um sinal de localização nuclear (NLS). Por exemplo, a fusão que compreende a enzima de edição de RNA e o domínio de aglutinação ao RNA compreende adicionalmente um, dois, três, cinco ou mais NLSs. Quando múltiplos NLSs são empregados, cada NLS podem ser ligados diretamente entre si ou separados por um ligante de aminoácido de 1 a cerca de 5 aminoácidos.
Em uma modalidade particular, os NLSs estão na extremidade N da proteína de fusão.
Os exemplos de NLS são fornecidos em Kosugi et al. (J]. Biol.
Chem. (2009) 284:478 a 485; incorporados a título de referência no presente documento). Em uma modalidade particular, o NLS compreende a sequência consenso K(K/R)X(K/R) (SEQ ID NO: 58) (por exemplo, um NLS de monopartido). Em uma modalidade particular, o NLS compreende a sequência consenso (K/R) (K/R) X10-12(K/R)3/5 (SEQ ID NO: 59), em que (K/R)3/s representa que pelo menos três dentre os cinco aminoácidos é ou lisina ou arginina.
Em uma modalidade particular, o NLS compreende o NLS de c-myc.
Em uma modalidade particular, o NLS de c-myc compreende a sequência PAAKRVKLD (SEQ ID NO: 54). Em uma modalidade particular, o NLS é o NLS de nucleoplasmina.
Em uma modalidade particular, o NLS de nucleoplasmina compreende a sequência KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 60). Em uma modalidade particular, o NLS compreende o NLS de antígeno T SV40 Grande.
Em uma modalidade particular, o NLS de antígeno T SV40 Grande compreende a sequência PKKKRKV (SEQ ID NO: 47). Em uma modalidade particular, a fusão compreende três NLSs de antígeno T SV40 Grande (por exemplo, a sequência DPKKKRKVDPKKKRKVDPKKKRKV (SEQ ID NO: 67)). Em várias modalidades, o NLS pode compreender mutações/variações nas sequências acimas (por exemplo, SEQ ID NOs: 58, 59, 60, 47,
54, ou 67) de modo que contenham 1 ou mais substituições, adições ou deleções (por exemplo, cerca de 1 ou cerca de 2 ou cerca de 3 ou cerca de 4 ou cerca de 5 ou cerca de 10 ou cerca de 15 incluindo cerca de 1 a 5 ou cerca de 1 a 10 ou cerca de 1 a 15 substituições, adições ou deleções). Em uma modalidade particular, os aminoácidos de lisina dentro do NLS podem ser substituídos por aminoácidos de arginina e/ou os aminoácidos de arginina dentro do NLS podem ser substituídos por aminoácidos de lisina. A proteína de fusão pode compreender adicionalmente uma tag de purificação (por exemplo, uma tag de HA), opcionalmente na extremidade de N da proteína de fusão.
[0028] As moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem estar contidas dentro de um único vetor ou contidas em vetores separados. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima de edição de RNA ligada ou fundida a um domínio de aglutinação ao RNA e a molécula de ácido nucleico que codifica o RNA-guia são contidos dentro de um vetor único. As moléculas de ácido nucleico podem ser entregues à célula consecutivamente (antes ou após) e/ou ao mesmo tempo (concomitantemente). As moléculas de ácido nucleico podem ser entregues na mesma composição ou em composições separadas (por exemplo, quando contido em vetores separados). Em uma modalidade particular, as moléculas de ácido nucleico são entregues em um vetor único, particularmente, um vetor viral, tal como um vetor de AAV.
[0029] Em uma modalidade particular, a enzima de edição de RNA é humana. Em uma modalidade particular, a enzima de edição de RNA é uma deaminase. Os exemplos de deaminases incluem, sem limitação, Adenosina Deaminase que Atua no RNA (ADAR) , enzima de edição de mRNA de apolipoproteína B, do tipo polipeptídeo catalítico (APOBEC (por exemplo, APOBEC1, APOBEC3A, APOBEC3G)) e deaminase de citidina induzidas por ativação (AICDA ou AID; C:G é convertido em uma T:A). Em uma modalidade particular, a enzima de edição de RNA é uma ADAR, tal como ADAR1, ADAR2, ou ADAR3. Em uma modalidade particular, a enzima de edição de RNA é ADARI (consultar, por exemplo, Gene ID: 103 e nº de Acesso GenBank NM 001111.5 e NP 001102.3 e isoformas da mesma). Em uma modalidade particular, a enzima de edição de RNA e ADAR2. A enzima de edição de RNA pode ter um comprimento que o completo. Em uma modalidade particular, a enzima de edição de RNA não tem seu domínio de aglutinação ao RNA natural. Por exemplo, a enzima de edição de RNA pode compreender ou consiste no domínio catalítico da enzima.
[0030] Um exemplo da sequência de aminoácidos de ADAR1 humano é:
MNPROGYSLS GYYTHPFOGY EHROLRYOOQP GPGSSPSSFL LKQIEFLKGO LPEAPVIGKOQ TPSLPPSLPG LRPRFPVLLA SSTRGROVDI RGVPRGVHLR SOGLORGFOH —PSPRGRSLPO RGVDCLSSHF QELSIYODOE QRILKFLEEL GEGKATTAHD LSGKLGTPKK EINRVLYSLA KKGKLOKEAG TPPLWKIAVS TOAWNQHSGV VRPDGHSQGA PNSDPSLEPE DRNSTSVSED LLEPFIAVSA QAWNQHSGVV RPDSHSQGSP NSDPGLEPED SNSTSALEDP LEFLDMAEIK EKICDYLFNV —SDSSALNLAK NIGLTKARDI NAVLIDMERO GDVYROGTTP PIWHLTDKKR —ERMOIKRNTN SVPETAPAAI PETKRNAEFL TCNIPTSNAS NNMVTTEKVE NGQEPVIKLE NRQOEARPEPA RLKPPVHYNG PSKAGYVDFE NGQWATDDIP DDLNSIRAAP “GEFRAIMEMP SFYSHGLPRC SPYKKLTECQ LKNPISGLLE YAQFASQTCE FNMIEQSGPP HEPRFKFQVWV INGREFPPAE AGSKKVAKOQD AAMKAMTILL EEAKAKDSGK SEESSHYSTE KESEKTAESQ TPTPSATSFF SGKSPVTTLL ECMHKLGNSC EFRLLSKEGP AHEPKFQYCV AVGAQTFPSV SAPSKKVAKO MAAEEAMKAL HGEATNSMAS DNQPEGMISE SLDNLESMMP —“NKVRKIGELV RYLNTNPVGG LLEYARSHGF AAEFKLVDOS GPPHEPKFVY QAKVGGRWFP AVCAHSKKOG KQEAADAALR VLIGENEKAE RMGFTEVTPV TGASLRRTML LLSRSPEAQP KTLPLTGSTF HDQIAMLSHR CFNTLTNSFOQ PSLLGRKILA AIIMKKDSED MGVVVSLGTG NRCVKGDSLS LKGETVNDCH AEIISRRGFI RFLYSELMKY NSQTAKDSIF EPAKGGEKLO IKKTVSFHLY ISTAPCGDGA LFDKSCSDRA MESTESRHYP VFENPKQOGKL RTKVENGEGT IPVESSDIVP TWDGIRLGER LRTMSCSDKI LRWNVLGLOG ALLTHFLOPI YLKSVTLGYL FSQGHLTRAI CCRVTRDGSA FEDGLRHPFI
VNHPKVGRVS IYDSKROSGK TKETSVNWCL ADGYDLEILD GTRGTVDGPR NELSRVSKKN IFLLFKKLCS FRYRRDLLRL SYGEAKKAAR — DYETAKNYFK KGLKDMGYGN WISKPQEEKN FYLCPV (SEQ ID NO: 72).
[0031] Em uma modalidade particular, o domínio da deaminase de ADAR1l compreende aminoácidos 839-1222 de SEQ ID
NO: 72. Em uma modalidade particular, a enzima de edição de RNA compreende uma sequência que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100% de homologia ou identidade, particularmente, de pelo menos 95%, 97%, 99% ou 100% de homologia ou identidade com a SEQ ID NO: 72 do domínio da deaminase da mesma.
[0032] Em uma modalidade particular, a enzima de edição de RNA compreende o domínio da deaminase da ADAR2 humana. Em uma modalidade particular, o domínio da deaminase de ADAR2 humana compreende amincácidos 299-701 no nº de Acesso GenBank U82120. Em uma modalidade particular, a ADAR2 ou domínio da deaminase da mesma compreende a mutação E4880Q0 (Montiel-González, et al. (2016) Nucleic Acids Res., 44:e157). Em uma modalidade particular, o domínio da deaminase de ADAR2 humana compreende
LHLDQOTPSROQPIPSEGLOLHLPQVLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHAR RKVLAGVVMTTGTDVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEII SRRSLLRFLYTOQLELYLNNKDDOKRSIFOKSERGGFRLKENVQFHLYIST SPCGDARIFSPHEPILEEPADRHPNRKARGOLRTKIESGEGTIPVRSNAS IQTWDGVLOGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFVEPIYFSSIILG SLYHGDHLSRAMYQORISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPNF SVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHALYCRWMRVHGKVPSHLL
RSKITKPNVYHESKLAAKEYQOAAKARLFTAFIKAGLGAWVEKPTEQDOFS LTP (SEQ IDNO: 55; E488 é indicado).
[0033] Em uma modalidade particular, o domínio da deaminase de ADAR2 humana compreende
LHLDQOTPSRQOPIPSEGLOLHLPOVLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHAR LHLDQOTPSROPIPSEGLOLHLPOVLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHAR RKVLAGVVMTTGTDVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEII SRRSLLRFLYTQOLELY LNNKDDOKRS I FOKSERGGFRLKENVQFHLYIST SPCGDARIFSPHEPILEEPADRHPNRKARGOLRTKIESGQGTIPVRSNAS IQTWDGVLOGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFVEPIYFSSIILG SLYHGDHLSRAMYORISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPNF SVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHAL YCRWMRVHGKVPSHLL
RSKITKPNVYHESKLAAKEYQAAKARLFTAFIKAGLGAWVEKPTEQDQOFS LTP (SEQ ID NO: 71; E488Q é indicado).
[0034] Em uma modalidade particular, a enzima de edição de RNA compreende uma sequência que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100% de homologia ou identidade, particularmente, de pelo menos 95%, 97%, 99% ou 100% de homologia ou identidade com a SEQ ID NO: 55 ou 71.
[0035] Conforme declarado anteriormente, a enzima de edição de RNA é ligada a um domínio de aglutinação ao RNA. A enzima de edição de RNA pode ser ligada diretamente (isto é, nenhuma sequência ligante) ao domínio de aglutinação ao RNA ou pode ser ligada por meio de um ligante de polipeptídeo. Por exemplo, o ligante de polipeptídeo compreender 1 a cerca de 50 aminoácidos, 1 a cerca de 25 aminoácidos, 1 a cerca de 20 aminoácidos, 1 a cerca de 15 aminoácidos, | a cerca de 10 aminoácidos ou 1 a cerca de 5 aminoácidos. Em uma modalidade particular, o ligante compreende a sequência (GGGGS)n (SEQ ID NO: 44), em que n é 1 a cerca de 10, particularmente, 1 a cerca de 5. Por exemplo, a sequência ligante pode ser: GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 45). Em várias modalidades, o ligante pode compreender mutações/variações nas sequências acimas (por exemplo, SEQ ID NOs: 44 ou 45) de modo que contenham 1 ou mais substituições, adições ou deleções (por exemplo, cerca de 1 ou cerca de 2 ou cerca de 3 ou cerca de 4 ou cerca de 5 ou cerca de 10 ou cerca de 15 incluindo cerca de 1 a 5 ou cerca de 1 a 10 ou cerca de 1 a 15 substituições, adições ou deleções).
[0036] O domínio de aglutinação ao RNA pode ser qualquer polipeptídeo que reconhece especificamente uma sequência de RNA particular e/ou RNA estrutura (por exemplo, grampo). Em uma modalidade particular, o domínio de aglutinação ao RNA é um domínio de aglutinação ao RNA artificial, particularmente, um com uma alta afinidade com RNA. Em uma modalidade particular, o domínio de aglutinação ao RNA é um domínio de aglutinação ao RNA de fago (consultar, por exemplo, Keryer-Bibens, et al., Biol. Cell (2008) 100:125 a 138). Por exemplo, o domínio de aglutinação ao RNA é o peptídeo AN (consultar, por exemplo, Cilley, et al., RNA (1997) 3:57 a 67) ou proteína de revestimento MS2 de fago
(consultar, por exemplo, Johansson, et al. Sem. Virol. (1997) 8:176 a 185). Em uma modalidade particular, o peptídeo AN compreende a sequência de aminoácidos: MNARTRRRERRAEKQAQWKAAN (SEQ ID NO: 46). Em uma modalidade particular, o peptídeo AN compreende uma sequência que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100% de homologia ou identidade, particularmente, de pelo menos 95%, 97%, 99% ou 100% de homologia ou identidade com a SEQ ID NO: 46.
[0037] Nas modalidades, a proteína de fusão compreende o peptídeo AN (SEQ ID NO: 46) ligado por meio de um ligante de aminoácido à extremidade amino do domínio da deaminase de ADAR2Q humana (por exemplo, SEQ ID NO: 55 ou 71). Em uma modalidade particular, o ligante compreende a sequência (GGGGS)n (SEQ ID NO: 44; em que n é 1 a cerca de ou 1 a cerca de 5) ou a sequência GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 45). Em uma modalidade particular, a proteína de fusão compreende a sequência:
MNARTRRRERRAEKQAQWKAANGGGGSGGGGSGGGGSLHLDQOTPSRQOPIP SEGLOLHLPQVLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHARRKVLAGVVMTTGT DVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEIISRRSLLRFLYTOL ELYLNNKDDQKRSIFQKSERGGFRLKENVQFHLYISTSPCGDARIFSPHE PILEEPADRHPNRKARGOLRTKIESGEGTIPVRSNASIQTWDGVLOGERL LTMSCSDKIARWNVVGIQOGSLLSIFVEPIYFSSIILGSLYHGDHLSRAMY ORISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPNFSVNWTVGDSAIEV INATTGKDELGRASRLCKHALYCRWMRVHGKVPSHLLRSKITKPNVYHES
KLAAKEYQAAKARLFTAFIKAGLGAWVEKPTEQDOFSLTP (SEQ ID NO: 68).
[0038] Em uma modalidade particular, a proteína de fusão compreende adicionalmente pelo menos um NLS na extremidade de N. Em uma modalidade particular, NLS compreende o NLS de antígeno T SV40 Grande (por exemplo, SEQ ID NO: 47). Em uma modalidade particular, a fusão compreende três NLSs de antígeno T SV40 Grande (por exemplo, SEQ ID NO: 67). Em uma modalidade particular, a proteína de fusão compreende a sequência:
DPKKKRKVDPKKKRKVDPKKKRKVMNARTRRRERRAEKQOAQWKAANGGGG SGGGGSGGGGSLHLDOTPSROPIPSEGLOLHLPQVLADAVSRLVLGKFGD LTDNFSSPHARRKVLAGVVMTTGTDVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRG LALNDCHAEIISRRSLLRFLYTQOLELYLNNKDDQKRSIFQOKSERGGFRLK ENVOFHLYISTSPCGDARIFSPHEPILEEPADRHPNRKARGOLRTKIESG EGTIPVRSNASIQTWDGVLQOGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFV EPIYFSSIILGSLYHGDHLSRAMYORISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNA EARQPGKAPNFSVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHALYCRWM
RVHGKVPSHLLRSKITKPNVYHESKLAAKEYQAAKARLFTAFIKAGLGAW VEKPTEQDOFSLTP (SEQ ID NO: 69).
[0039] Em uma modalidade particular, a proteína de fusão compreende uma sequência que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100% de homologia ou identidade, particularmente, de pelo menos 95%, 97%, 99% ou 100% de homologia ou identidade com a SEQ ID NO: 68 ou 69.
[0040] O RNA-guia da presente invenção compreende uma sequência que tem como alvo ou hibridiza especificamente com uma sequência-alvo (por exemplo, a sequência complementar) e uma sequência reconhecida pelo domínio de aglutinação ao RNA.
O RNA-guia compreende um mau pareamento com a sequência-alvo direcionada ao nucleotídeo (por exemplo, adenosina) a ser mudado ou editado.
Conforme no presente documento, o termo “hibridiza especificamente” não significa que a molécula de ácido nucleico precisa ser 100% complementar à sequência-alvo.
De preferência, a sequência - que não incluir o nucleotídeo de mau pareamento (ou nucleotídeos de mau pareamento) a ser mudado/editado - pode ser pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100% complementar, particularmente, pelo menos 95%, 97%, 99% ou 100% complementar à sequência-alvo.
No entanto, conforme explicado no presente documento, a sequência pode compreender maus pareamentos adicionais (por exemplo, um mau pareamento de G) para reduzir edição fora do alvo.
Nas modalidades, a sequência pode conter cerca de 1 ou cerca de 2 ou cerca de 3 ou cerca de 4 ou cerca de 5 ou cerca de 10 ou cerca de 15 que inclui cerca e 1 à 5 ou cerca de 1 a 10 ou cerca de 1 a 15 maus pareamentos.
Em uma modalidade particular, a região da complementaridade (por exemplo, entre um RNA-guia e uma sequência-alvo) é pelo menos cerca de 10 pelo menos cerca de 12, pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 17, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 30, pelo menos cerca de 35 ou mais nucleotídeos. Em uma modalidade particular, a região de complementaridade (por exemplo, entre um RNA-quia e uma sequência-alvo) é cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos, cerca de 15 a cerca de 25 nucleotídeos, cerca de 20 a cerca de 30 nucleotídeos, cerca de 20 a cerca de 25 nucleotídeos ou cerca de 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos. Tipicamente, o mau pareamento entre o RNA-quia e a sequência- alvo será direcionado ao meio (por exemplo, dentro do meio de 50% da sequência de RNA-guia) da região de complementaridade entre o RNA-guia e a sequência-alvo. Em uma modalidade particular, a sequência-alvo compreende SEQ ID NO: 52.
[0041] O RNA-guia compreende a edição correta ou desejada ao RNA na célula. O RNA-guia pode ser usado para corrigir qualquer mutação, particularmente, uma mutação pontual, incluindo mutações missenso e mutações não senso. Por exemplo, com síndrome de Rett, há mutações G>A comuns. Essas mutações resultam em mudanças de aminoácido R106Q0 (CAA), W1I04X (UAG) e R306H (CAC). No caso de mutações não senso, essas podem ser uma mutação de C para T com uma A na posição 3" para formar o códon de parada ou na posição intermediária (por exemplo, UAG a UGG). As mutações não senso podem ser editadas para remover o códon de parada. Em uma modalidade particular, o RNA-guia compreende uma C para parear com à A dessas mutações de modo que o A possa ser desaminado para I (por exemplo, por uma ADAR).
[0042] O RNA-guia da presente invenção compreende uma ou mais sequências reconhecidas pelo domínio de aglutinação ao RNA. Em uma modalidade particular, o RNA-guia compreende duas sequências reconhecidas pelo domínio de aglutinação ao RNA. Em uma modalidade particular, as duas sequências reconhecidas pelo domínio de aglutinação ao RNA pode estar em ambos os lados do mau pareamento ou a sequência que hibridiza especificamente com a sequência-alvo. Por exemplo, uma sequência reconhecida pelo domínio de aglutinação ao RNA (por exemplo, BoxB) está localizada cerca de 15 a 20 ou cerca de 16 a 18 nucleotídeos 5' da mutação- alvo e uma segunda sequência reconhecida pelo domínio de aglutinação ao RNA (por exemplo, BoxB) está localizada cerca de 8 a 12 ou cerca de 10 nucleotídeos 3" da mutação-alvo. Em uma modalidade particular, as sequências reconhecidas pelo domínio de aglutinação ao RNA não estão nas extremidades do RNA-guia (isto é, sequências nas extremidades do RNA-quia podem ser complementares à sequência-alvo). Quando duas ou mais sequências reconhecidas pelo domínio de aglutinação ao RNA estão presentes, as sequências podem ser iguais ou diferentes - embora sejam, de preferência, reconhecidas pelo menos domínio de aglutinação ao RNA. Em uma modalidade particular, a sequência reconhecida pelo domínio de aglutinação ao RNA é uma sequência BoxB. Em uma modalidade particular, a sequência BoxB compreende GCCCUGAAAAAGGGC (SEQ ID NO: 48) ou GGCCCUGAAAAAGGGCC (SEQ ID NO: 49). Em uma modalidade particular, a sequência BoxB tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100% de homologia ou identidade, particularmente, pelo menos 95%, 97%, 99% ou 100% de homologia ou identidade com a SEQ ID NO: 48 ou 49.
[0043] Em uma modalidade particular, o RNA-guia tem como alvo uma sequência ou compreende uma sequência (que inclui a versão de RNA de moléculas de DNA) conforme apresentado na Tabela 1. Em uma modalidade particular, o RNA-guia tem como alvo uma sequência ou compreende uma sequência que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100% de homologia ou identidade, particularmente, pelo menos 95%, 97%, 99% ou 100% de homologia ou identidade com uma sequência apresentada na Tabela l1. Em uma modalidade particular, o RNA-guia compreende uma dentre as SEQ ID NOs: a 22, particularmente, SEQ ID NO: 15, 17, 19 ou 21 ou compreende uma sequência que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 25%, 97%, 299% ou 100% homologia ou identidade, particularmente, pelo menos 95%, 97%, 99%, ou 100% homologia ou identidade com uma dentre as SEQ ID NOs: 15 a 22, particularmente, SEQ ID NO: 15, 17, 19 ou 21.
[0044] As moléculas de ácido nucleico que compreendem a sequência de ácidos nucleicos que codificam o
RNA-guia podem compreender múltiplas cópias da sequência de ácidos nucleicos que codifica o RNA-guia. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais cópias da sequência de ácidos nucleicos que codificam o RNA-guia, cada um sob o controle de um promotor.
[0045] Em uma modalidade particular, as moléculas de ácido nucleico da presente invenção são entregues (por exemplo, por meio de infecção, transfecção, eletroporação etc.) e expressos em células por meio de um vetor (por exemplo, um plasmídeo), particularmente, um vetor viral. Os vetores de expressão da presente invenção podem empregar um promotor forte, um promotor constitutivo, promotor tecido ou célula-específico, promotor onipresente e/ou um promotor regulado. Em uma modalidade particular, o promotor para a molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima de edição de RNA ligado ou fundido a um domínio de aglutinação ao RNA é um promotor tecido ou célula-específico. Em uma modalidade particular, o promotor é um promotor neurônio-específico ou um promotor onipresente. Os exemplos de promotores são bem conhecidos na técnica e incluem, porém sem limitação, a um promotor de sinapsina, particularmente, o promotor de Sinapsina I, o promotor de CAG e o promotor de MECP2. Com relação ao RNA-quia, os exemplos de promotores de RNA são bem conhecidos na técnica e incluem, porém sem limitação,
promotores de RNA polimerase III (por exemplo, U6 e Hl; consultar, por exemplo, Myslinski et al. (2001) Nucl. Acids Res., 29:2502-09) ou outros promotores conhecidos por expressar RNAs curtos. Em uma modalidade particular, o promotor é o promotor de U6 humano. Os exemplos de vetores de expressão para expressar as moléculas da invenção incluem, sem limitação, plasmídeos e vetores virais (por exemplo, vírus adeno-associados (AAVsS), adenovírus, retrovírus e lentivírus). Em uma modalidade particular, o vetor é um AAV (por exemplo, AAV-1 a AAV-12 e outros sorotipos e vetores de AAV híbridos; por exemplo, AAV1 ou AAV2 ou AAV3, ou AAV4 ou AAVS ou AAV6 ou AAV7 ou AAV8 ou AAV9 ou AAVIO ou AAV1 ou AAV12). Em uma modalidade particular, o vetor tem capacidade para infectar neurônios e/ou a glia.
[0046] De acordo com outro aspecto, os métodos da presente invenção, incluindo os métodos de edição de RNA terapêuticos, compreendem entregar um RNA-guia ou uma molécula de ácido nucleico que codifica o RNA-guia a uma célula, conforme descrito anteriormente, porém sem uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima de edição de RNA ligada ou fundida a um domínio de aglutinação ao RNA. ADARs (por exemplo, ADARs 1-3) são expressos em altos níveis no sistema nervoso. Desse modo, o RNA-guia da presente invenção podem atrair as enzimas de deaminase endógenas, tais como enzimas ADAR, particularmente, ADARl ou ADAR2 para
RNA de MECP2 endógeno.
Desse modo, nas modalidades, a presente invenção permite a fixação de enzimas endógenas de ADAR e não exige enzimas de ADAR recombinantes.
Com o uso apenas do RNA-guia, qualquer resposta imunológica potencial a domínios de aglutinação a RNA não mamífero é evitado.
Além disso, o método permite que as sequências-alvo altamente iterativas sejam contidas nos vetores de AAV e diminua edição fora do alvo.
Em uma modalidade particular desse aspecto da presente invenção, o guia compreende uma sequência que tem como alvo ou hibridiza especificamente uma sequência-alvo (por exemplo, sequência complementar) e uma sequência reconhecida por uma deaminase, particularmente, uma ADAR (por exemplo, ADAR1 ou ADAR2). O RNA-guia pode compreender, sem limitação, um grampo de RNA (por exemplo, com base em alvos naturais de ADARsS), maus pareamentos que criam "saliências de fita dupla" reconhecidas por ADARs e/ou quaisquer outras sequências que são exigidas normalmente para uma edição não alvo por ADARs endógeno.
Em uma modalidade particular, o RNA-guia compreende uma, duas ou mais sequências BoxB.
Em uma modalidade particular, o RNA- guia compreende um sítio de aglutinação R/G do GluR2 (Wettengel, et al. (2017) Nucleic Acids Res., 45(5): 2797- 2808; Fukuda, et al. (2017) Sci.
Rep.,7:41478; por exemplo, que compreende GUGGAAUAGUAUAACAA- UAUGCUAAAUGUUGUUAUAGUAUCCCAC (SEQ ID NO: 70) ou uma sequência que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou 100% homologia ou identidade, particularmente, pelo menos 95%, 97%, 99% ou 100% homologia ou identidade). Em uma modalidade particular, o RNA-guia compreende que tem alças internas (Lehmann, et al. (1999) J. Mol. Biol., 291(1):1-13; por exemplo, alças que compreendem 4, 6, 8, 10 ou mais nucleotídeos). Em uma modalidade particular, RNA-guia compreende uma região complementar ao RNA de MECP2, o mau pareamento (por exemplo, A:C) para editar, e, opcionalmente, maus pareamentos A:G para edição não alvo. Em uma modalidade particular, a molécula de ácido nucleico que codifica o RNA- guia está contida dentro de um vetor, conforme descrito no presente documento. Em uma modalidade particular, o RNA-guia é expresso a partir do promotor U6 ou outros promotores que expressam RNAs pequenos.
[0047] De acordo com a presente invenção, os métodos para tratar, inibir e/ou prevenir uma doença genética do sistema nervoso central são fornecidos. De acordo com a presente invenção, são fornecidos os métodos para tratar, inibir e/ou prevenir uma doença progressiva no neurodesenvolvimento. Por exemplo, a presente invenção fornece, nas modalidades, tratamento, inibição e/ou prevenção de uma doença genética do sistema nervoso central caracterizado por uma mutação em um RNA do indivíduo. Nas modalidades, a presente invenção fornece métodos para tratar, inibir e/ou prevenir uma doença progressiva no neurodesenvolvimento restaurando-se direta ou indiretamente a tradução de um RNA para uma proteína normal devido à restauração de uma mutação de G aberrante, por exemplo, editando-se o RNA para ser lido como tendo uma G.
[0048] De acordo com a presente invenção, os métodos para tratar, inibir e/ou prevenir uma doença genética do sistema nervoso central, incluindo uma doença progressiva no neurodesenvolvimento, incluindo síndrome de Rett são eficazes in vivo ou ex vivo. Por exemplo, para métodos in vivo, a presente molécula de ácido nucleico (ou moléculas de ácido nucleico) (por exemplo, que codificam uma proteína de fusão descrita, por exemplo, que codificam um RNA-guia descrito) é administrada a um indivíduo. Para métodos ex vivo, as células (singênicas ou alogênicas) entram em contato com a presente molécula de ácido nucleico (por exemplo, que codifica uma proteína de fusão descrita, por exemplo, que codifica um RNA-quia descrito) e são introduzidas em um indivíduo. As modalidades que se referem ao tratamento se aplicam igual a métodos in vivo e métodos ex vivo.
[0049] De acordo com a presente invenção, os métodos para tratar, inibir e/ou prevenir uma doença genética associada ao gene MECP2 são fornecidas. Nas modalidades, a presente invenção fornece edição genética, por exemplo, no nível de RNA, a fim de restaurar níveis de proteína de MeCP2 funcional para aquela de um indivíduo sem doença ou saudável. A MecP2 pode ser de ser humano ou de camundongo, particularmente, de ser humano. Nas modalidades, a presente invenção fornece edição genética, por exemplo, ao nível de RNA, a fim de aumentar os níveis de proteína de MeCP2 funcional em relação a um estado com doença. Nas modalidades, a doença genética associada ao gene MECP2 é uma encefalopatia neonatal, microcefalia, incapacidade intelectual ligada a X, síndrome de PPM-X ((p)sicose depressiva maníaca, Sinais (p) iramidais, (p)arquinson e (m)acro-orquidismo), distúrbio bipolar. Parquinson, tônus muscular aumentado, reflexos exagerados e macro-orquidismo ou combinações dos mesmos. Nas modalidades, a doença genética associada ao gene MECP2 afeta uma pessoa sexo masculino ou feminino.
[0050] De acordo com a presente invenção, são fornecidos métodos para tratar, inibir e/ou prevenir síndrome de Rett. Em uma modalidade particular, a síndrome de Rett é caracterizada por uma mutação G>A em MeCP2. Por exemplo, a síndrome de Rett pode ser caracterizada por uma mutação de R106Q, W1I04X ou R306H em MECP2. As sequências de aminoácidos de nucleotídeos exemplificativas de MECP2 humano são fornecidas no ID de Gene GenBank 4204 e nº de Acesso GenBank NM 004992.3 e NP 004983.1 (consultar, também, as isoformas no nº de Acesso GenBank NM 001110792.1, NP 001104262.1, NM 001316337.1 e NP 001303266.1). Em uma modalidade particular, i síndrome de Rett compreende a mutação de R106Q em MeCP2. Em uma modalidade particular, o método compreende administrar uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima de edição de RNA ligada ou fundida a um domínio de aglutinação ao RNA e um RNA-guia ou uma molécula de ácido nucleico que codifica o RNA-quia. Em uma modalidade particular, o método compreende administrar um RNA-guia ou uma molécula de ácido nucleico que codifica o RNA-guia. As moléculas de ácido nucleico podem ser administradas diretamente ao indivíduo ou podem ser entregues às células que são, em seguida, administradas ao indivíduo.
[0051] Em uma modalidade particular, a sequência de aminoácidos de MECP2 é:
MVAGMLGLRE EKSEDQODLOG LKDKPLKFKK VKKDKKEEKE GKHEPVQPSA HHSAEPAEAG KAETSEGSGS APAVPEASAS PKQRRSIIRD RGPMYDDPTL PEGWIRKLKO —RKSGRSAGKY DVYLINPOGK AFRSKVELIA YFEKVGDTSL DPNDFDFTVT GRGSPSRREQ KPPKKPKSPK APGTGRGRGR PKGSGTTRPK AATSEGVQVK RVLEKSPGKL LVKMPFOTSP GGKAEGGGAT TSTQVMVIKR PGRKRKAEAD PQOAIPKKRGR KPGSVVAAMAA AEAKKKAVKE SSIRSVOQETV LPIKKRKTRE TVSIEVKEVV KPLLVSTLGE KSGKGLKTCK SPGRKSKESS
PKGRSSSASS PPKKEHHHHH HHSESPKAPV PLLPPLPPPP PEPESSEDPT SPPEPOQDLSS —“SVCKEEKMPR GGSLESDGCP KEPAKTOQPAV ATAATAAEKY KHRGEGERKD IVSSSMPRPN REEPVDSRTP VTERVS (SEQ ID NO: 56) R106, W1I04 e R306 são indicados acima com sublinhado.
[0052] Em uma modalidade particular, o ácido nucleico que codifica MECP2 é: atgg tagctgggat gttagggcte agggaagaaa agtcagaaga ccaggacctce cagggcctea —aggacaaacc cctcaagttt aaaaaggtga agaaagataa gaaagaagag aaagagggea agcatgagcc cgtgcageca tcageceace actctgctga gccegcagag gcaggcaaag cagagacatcec agaagggtra —“ggctecgece caggetgtgace ggaagcttet gcocctecececa aacagcggeg ctcecatcatc cgtgaccggg gacccatgta tgatgacccce accctgcctg aaggctggac acggaagctt aagcaaagga aatctggcco ctctgctggg aagtatgatga tgtatttgat caatccccag ggaaaagect ttcegetetaa agtggagttg attgcecgtact tcgaaaaggt aggcgacaca tcecctaggace ctaatgattt tgacttcacg gtaactggga gagggagccee ctcceggega gagcagaaac cacctaagaa gcccaaatet cccaaagete caggaactgg cagaggcegg ggacgcceera aagggagegg caccacgaga cccaaggego ccacgtcaga gggtgtgacag gtgaaaaggo tcctaggagaa aagtcctggg aagctcecttg tcaagatgcc ttttcaaact tcgccagggg gcaaggctga ggggggtggg gccaccracat ccacccaggt catggtgatc aaacgcccecg gcaggaageg aaaagctgag gcegaceccte aggccattee caagaaacgg ggccgaaage cggggagtgat ggtggcagec gcetgeegecg aggccaaaaa gaaagccgtg aaggagtctt ctatcegate tgtgcaggag accgtactce ccatraagaa gcgcaagacc cgggagacgg tcagcatega ggtcaaggaa gtggtaaage ccetgctggt gtccacececte ggtgagaaga gcgggaaagg actgaagacc tgtaagagcc ctgggceggaa aagcaaggag agcagcceca aggggegeag cagcagegec tectracetce ccaagaagga gcaccaccac catcaccacc actcagagtc cccaaaggec ccegtgecac tgceteceace cetgeceeca ccetecacetg agcecgagag ctecgaggac CCccaccagec ccecetaagec ccaggacttg agcagcageg tctgcaaaga ggagaagatg cccagaggag gctcactagga gagcgacggc tgccccraagg agccagctaa —“gactcagcece gceggttgcoca cegeegecace ggccegcagaa aagtacaaac accgagggga gggagagcgc aaagacattg tttcatccte catgccaagg ccaaacagag aggagcctgt ggacagccgg acgccegtga ccgagagagt tagctga (SEQ ID NO: 57).
[0053] Nas modalidades, a presente invenção fornece métodos para tratar, inibir e/ou prevenir síndrome de Rett, incluindo síndrome de Rett clássica e síndrome de Rett variante (também denominada de síndrome de Rett atípica). Nas modalidades, a síndrome de Rett é a variante Zappella, variante Hanefeld, variante Rolando e/ou variante “forme fruste”.
[0054] Nas modalidades, a presente invenção fornece redução, melhora e/ou revogação de um ou mais sintomas de síndrome de Rett, incluindo, sem limitação, ataxia, movimentos descontrolados da mão (por exemplo, contorção ou aperto da mão, palmas, esfregar, lavagem, ou movimentos da mão para a boca), microcefalia adquirida, comportamentos autistas, irregularidades na respiração, dificuldades na alimentação e ingestão, retardo do crescimento, hipotonia, ataques de pânicos, ranger de dentes (bruxismo), tremores, apraxia, batimentos cardíacos irregulares (por exemplo, anormalidades em intervalo de QT e/ou onda em T) e convulsões.
[0055] Nas modalidades, as presentes composições podem ser usadas em combinação com qualquer um dentre o seguinte nos presentes métodos para tratar, inibir e/ou prevenir, por exemplo, síndrome de Rett: ácido tridecanoicio, fingolimod (por exemplo, GILENYA), cetamina, EPI-743 (vatiquinona), sarizotan (EMD-128,130), uma estatina (por exemplo, lovastatina), um antidepressivo tricíclico (TCA, por exemplo, desipramina), acetato de glatiramero (por exemplo, COPAXONE), dextrometorfano e/ou um inibidor oral da colesterol 24-hidroxilase (CH24H) (por exemplo, TAK- 935/0V935) .
[0056] Conforme declarado acima, a presente invenção fornece moléculas de ácido nucleico, vetores e composições e métodos para a inibição, tratamento e/ou prevenção da síndrome de Rett. As composições que compreendem pelo menos um ácido nucleico descrito no presente documento também são abrangidas pela presente invenção. Em uma modalidade particular, a composição compreende pelo menos um RNA-guia ou uma molécula de ácido nucleico que codifica o RNA-guia (por exemplo, um vetor de expressão) e pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável. A composição pode compreender adicionalmente uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima de edição de RNA ligada ou fundida a um domínio de aglutinação ao RNA. Em uma modalidade particular, todas as moléculas de ácido nucleico são codificadas dentro de um único vetor de expressão (por exemplo, vetor viral (por exemplo, AAV)). Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico podem estar contidas dentro de composições separadas com pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável. A presente invenção também abrange kits que compreendem uma primeira composição que compreende pelo menos um RNA-gquia ou uma molécula de ácido nucleico que codifica o RNA-guia (por exemplo, um vetor de expressão) e uma segunda composição que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima de edição de RNA ligada ou fundida a um domínio de aglutinação ao RNA. A primeira e segunda composições podem compreender adicionalmente pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade particular, os kits da presente invenção compreendem uma primeira composição que compreende pelo menos um RNA-guia ou uma molécula de ácido nucleico que codifica o RNA-guia (por exemplo, um vetor de expressão) e/ou molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima de edição de RNA ligada ou fundida a um domínio de aglutinação ao RNA. A primeira e segunda composições podem compreender adicionalmente pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0057] Conforme explicado acima, as composições da presente invenção são úteis para tratar síndrome de Rett.
Uma terapeuticamente eficaz da composição pode ser administrada a um indivíduo com necessidade do mesmos. As dosagens, métodos e períodos de administração são prontamente determináveis por pessoas versadas na técnica, dado os ensinamentos fornecidos no presente documento.
[0058] Os componentes, conforme descrito no presente documento, serão administrados geralmente a um paciente como uma preparação farmacêutica. O termo “paciente” ou “indivíduo”, conforme usado no presente documento, se refere a indivíduos humanos ou animais. Os componentes da presente invenção podem ser empregados terapeuticamente, sob orientação de um clínico para o tratamento da doença ou transtorno indicados.
[0059] A preparação farmacêutica que compreende os componentes da invenção podem ser formuladas de maneira conveniente para administração com um meio aceitável (por exemplo, carreador farmaceuticamente aceitável) tal como água, solução salina, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido e semelhantes), dimetil sulfóxido (DMSO), óleos, detergentes, agentes de suspensão ou misturas adequadas dos mesmos. A concentração dos agentes no meio escolhido pode ser variada, e o meio pode ser escolhido com base na rota desejada de administração da preparação farmacêutica. Salvo quando qualquer meio ou agente convencional é incompatível com os agentes a serem administrados, o uso dos mesmos na preparação farmacêutica é contemplado.
[0060] A seleção de uma preparação farmacêutica depende do método de administração escolhido. Por exemplo, os componentes da invenção podem ser administrados por injeção direta em qualquer tecido desejado (por exemplo, cérebro) ou na área circundante. Nesse exemplo, uma preparação farmacêutica compreende os componentes dispersos em um meio que é compatível com sangue ou tecido-alvo.
[0061] A terapia pode ser, por exemplo, administrada por via parenteral, por injeção na corrente sanguínea (por exemplo, intravenosa) ou por injeção subcutânea, intramuscular ou intraperitoneal. Em uma modalidade particular, a terapia é administrada por injeção direta (por exemplo, no tecido a ser tratado). As preparações farmacêuticas para injeção são conhecidas na técnica. Caso a injeção seja selecionada como um método para administrar a terapia, as etapas precisam ser feitas para garantir que quantidades suficientes das moléculas atinjam as células- alvo para exercer um efeito biológico.
[0062] As composições farmacêuticas que contêm um composto da presente invenção como o ingrediente ativo em mistura por adição íntima com um carreador farmacêutico podem ser preparadas de acordo com técnicas de composição farmacêutica convencional. O carreador pode assumir várias formas que dependem da forma de preparação desejada para administração, por exemplo, intravenosa, oral ou parenteral. Na preparação de uma forma de dosagem oral, qualquer um dentre os meios farmacêuticos comuns pode ser empregado, tal como, por exemplo, água, glicóis, óleos, álcoois, agentes aromatizantes, conservantes, agentes colorantes e semelhantes no caso de preparações líquidas orais (tais como, por exemplo, suspensões, elixires e soluções); ou carreadores, tais como amidos, açúcares, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, ligantes, desintegrantes e semelhantes no caso de preparações sólidas orais (tais como, por exemplo, pós, cápsulas e comprimidos). As suspensões injetáveis podem ser preparadas, nesse caso, carreadores líquidos adequados, agentes de suspensão e semelhantes podem ser empregados.
[0063] Uma preparação farmacêutica da invenção pode ser formulada em forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e uniformidade de dosagem. A forma de unidade unitária, conforme usado no presente documento, se refere a uma unidade fisicamente distinta da preparação farmacêutica apropriada para o paciente que se submete a tratamento. Cada dosagem deve conter uma quantidade de ingrediente ativo calculado para produzir o efeito desejado em associação ao carreador farmacêutico. Os procedimentos para determinar a unidade de dosagem apropriada são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. As unidades de dosagem pode ser aumentadas ou diminuídas proporcionalmente com base no peso do paciente. As concentrações adequadas para alívio de uma afecção patológica podem ser determinadas por cálculos para alívio de uma afecção patológica particular pode ser determinada por cálculos de curva de concentração de dosagem, conforme conhecido na técnica.
[0064] Os métodos da presente invenção podem compreender adicionalmente monitorar a doença ou distúrbio no indivíduo após administração da composição (ou composições) da presente invenção para monitorar a eficácia do método. Por exemplo, o indivíduo pode ser monitorado quanto a características da síndrome de Rett.
Definições
[0065] As definições a seguir são fornecidas para facilitar um entendimento da presente invenção:
[0066] As formas no singular “um(a)”, “uma”, “o” e “a” incluem os referentes plurais salvo quando o contexto declarar claramente de outro modo.
[0067] “Farmaceuticamente aceitável” indica a aprovação por uma agência reguladora do governo federal ou do estado ou listado na Farmacopeia dos EUA ou outra farmacopeia reconhecida de maneira geral para uso em animais e, mais particularmente, em seres humanos.
[0068] Um “carreador” se refere, por exemplo, um diluente, adjuvante, conservante (por exemplo, Thimersol, álcool benzílico), antioxidante (por exemplo, ácido ascórbico, metabissulfeto de sódio), solubilizante (por exemplo, Tweeno 80, polisorbato 80), emulsificante, tampão (por exemplo, Tris HCl, acetato, fosfato), antimicrobiano, substância volumosa (por exemplo, lactose, manitol), excipiente, agente ou veículo auxiliar com o qual um agente ativo da presente invenção é administrado. carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles de petróleo, animal, origem vegetal ou sintética. A água ou soluções salinas aquosas e dextrose aquosa e soluções de glierol são empregadas, de preferência, como carreadores, particularmente, para soluções injetáveis. Os carreadores farmacêuticos adequados são descritos em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (Lippincott, Williams and Wilkins); Liberman, et al., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y.; and Rowe, et al., Eds., Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Pr.
[0069] o termo “tratar”, conforme usado no presente documento, se refere a qualquer tipo de tratamento que confere um benefício a um paciente que sofre de uma doença, incluindo aprimoramento na condição do paciente (por exemplo, em um ou mais sintomas), atraso na progressão da condição etc.
[0070] Conforme usado no presente documento, o termo “impedir” se refere a um tratamento profilático de um indivíduo que corre risco de desenvolver uma afecção que resulta em uma diminuição na probabilidade de que o indivíduo desenvolverá a afecção.
[0071] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz" de um composto ou uma composição farmacêutica se refere a uma quantidade eficaz para impedir, inibir, ou tratar um distúrbio ou doença particular e/ou os sintomas dos mesmos.
[0072] Conforme usado no presente documento, o termo “indivíduo” se refere a um animal, particularmente, um mamífero, particularmente, um ser humano.
[0073] O termo “isolado(a)” se refere à separação de um composto de outros componentes presentes durante a sua produção. “Isolado” não deve excluir misturas sintéticas ou artificiais com outros compostos ou materiais, ou a presença de impurezas que não interferem substancialmente com a atividade fundamental, e que podem estar presentes, por exemplo, devido à purificação incompleta ou a adição de estabilizantes.
[0074] Os termos “ligante”, “domínio de ligante” e “ligação” se referem a uma porção química que compreende uma ligação covalente ou uma cadeia de átomos que se liga covalentemente a pelo menos dois compostos, por exemplo, uma enzima de edição de RNA e um domínio de aglutinação ao RNA.
O ligante pode ser uma sequência de aminoácidos (por exemplo, 1 a 50 aminoácidos, 1 a 25 aminoácidos, 1 a 20 aminoácidos, 1 a15 aminoácidos, 1 a 10 aminoácidos ou 1 a 5 aminoácidos).
[0075] O termo “oligonucleotídeo”, conforme usado no presente documento, inclui uma molécula de ácido nucleico compreendido de dois ou mais ou ribo- e/ou desoxirribonucleotídeos, de preferência, mais de três. O tamanho exato do oligonucleotídeo dependerá de vários fatores e da aplicação particular e uso do oligonucleotídeo.
[0076] O “ácido nucleico” ou uma “molécula de ácido nucleico”, conforme usado no presente documento, se refere a qualquer DNA ou molécula de RNA, ou de fita simples ou de dupla fita, caso de fita simples, a molécula de sua sequência complementar em forma ou linear ou circular. Em se tratando se moléculas de ácido nucleico, uma sequência ou estrutura de uma molécula de ácido nucleico particular pode ser descrita no presente documento de acordo com a convenção normal de fornecer a sequência na direção 5' a 3'. Com referência aos ácidos nucleicos da invenção, o termo “ácido nucleico isolado” é usado algumas vezes. Esse termo, quando aplicado ao DNA, se refere a uma molécula de a DNA que é separada das sequências com as quais é imediatamente contíguo no genoma de ocorrência natural do organismo no qual se originou. Por exemplo, um “ácido nucleico isolado” pode compreender uma molécula de DNA inserida em um vetor, tal como um vetor plasmídico ou viral, ou integrado no DNA genômico de uma célula procariótica ou eucariótica ou organismo hospedeiro.
[0077] Um “vetor” é um elemento genético, tal como um plasmídeo, cosmídeo, bacmídeo, fago ou vírus ao qual outra sequência ou elemento genético (ou DNA ou RNA) pode ser fixado. O vetor pode ser um replicon de modo a causar a replicação da sequência ou elemento fixada. Um vetor pode ser ou RNA ou DNA e pode ser de fita simples ou de fita dupla. Um vetor pode compreender operons de expressão ou elementos tais como, sem limitação, sequências de controle de transcrição ou de tradução, tais como promotores, intensificadores, sinais de início de tradução, sinais de poliadenilação, terminadores e semelhantes e que facilitam a expressão de um polinucleotídeo ou uma sequência de codificação de polipeptídeo em uma célula hospedeira ou organismo.
[0078] Um “operon de expressão” se refere a um segmento de ácido nucleico que pode possuir sequências de controle de transcrição e de tradução, tais como promotores, intensificadores, sinais de início de tradução (por exemplo, códons de ATG ou AUG), sinais de poliadenilação, terminadores e semelhantes e que facilitan a expressão de um polinucleotídeo ou uma sequência de codificação de polipeptídeo em uma célula hospedeira ou organismo. Um “vetor de expressão” é um vetor que facilita a expressão de um ácido nucleico ou uma sequência de codificação de polipeptídeo em uma célula hospedeira ou organismo.
[0079] Conforme usado no presente documento, um “sinal de localização nuclear” (NLS) se refere a uma molécula ou polipeptídeo que facilita o movimento de um polipeptídeo fixado ao núcleo da célula. Em uma modalidade particular, um sinal de localização nuclear é um peptídeo que direciona proteínas ao núcleo. Tipicamente, um NLS compreende, na maior parte, aminoácidos básicos carregados positivamente (particularmente, lisinas e argininas). O NLS pode monopartido, bipartido, ou multipartido. Os NLS são tipicamente peptídeos curtos (por exemplo, menores que cerca de 20 aminoácidos, menores que cerca de 15 aminoácidos ou menores que cerca de 10 aminoácidos). Os exemplos de NLS são fornecidos em Kosugi et al. (J. Biol. Chem. (2009) 284:478 a 485; incorporados a título de referência no presente documento). Em uma modalidade particular, o NLS compreende a sequência consenso K(K/R)X(K/R) (SEQ ID NO: 58) (por exemplo, um NLS de monopartido). Em uma modalidade particular, o NLS compreende a sequência consenso (K/R) (K/R) X10-12(K/R)3/s (SEQ ID NO: 59), em que (K/R)3/5s representa que pelo menos três dentre os cinco aminoácidos é ou lisina ou arginina. Em uma modalidade particular, o NLS é o NLS de antígeno T SV40 Grande (por exemplo, PKKKRKV (SEQ
ID NO: 47)). Em uma modalidade particular, o NLS de c-myc compreende a sequência PAAKRVKLD (SEQ ID NO: 54). Em uma modalidade particular, o NLS é o NLS de nucleoplasmina KRPAATKKAGQOAKKKK (SEQ ID NO: 60). Com relação às sequências fornecidas, os aminoácidos lisina e arginina são intercambiáveis.
[0080] Em várias modalidades, a inclusão de um NLS reduz ou revoga a edição não alvo, por exemplo, em relação à edição na ausência de um NLS. Por exemplo, em várias modalidades, os presentes métodos de edição de gene que envolvem um NLS reduzem edição não alvo em cerca de 10%, ou cerca de 20%, ou cerca de 30% ou cerca de 40%, ou cerca de 50%, ou cerca de 60% ou cerca de 70%, ou cerca de 80%, ou cerca de 90% ou cerca de 100%. Em várias modalidades, os presentes métodos de edição de gene que envolvem um NLS reduzem a edição não alvo em cerca de 2 ou cerca de 3 ou cerca de 5 ou cerca de 10 ou cerca de 30 vezes.
[0081] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar várias modalidades da presente invenção. Os exemplos são ilustrativos e não devem limitar a invenção de modo algum.
EXEMPLO 1 Construções Plasmídicas
[0082] Um plasmídeo pcDNA 3.1+ (Thermo Fisher
Scientific) que codifica o peptídeo AN fundido ao domínio catalítico ADAR2Q do tipo selvagem foi obtido (Montiel- Gonzalez, et al. (2016) Nucleic Acids Res., 44:e157; Montiel- Gonzalez, et al. (2013) Proc.
Natl.
Acad.
Sci., 110:18.285 a 18.290). A Editasers:sso CDNA foi gerada sobrepondo-se PCR da Editase do tipo selvagem e clonada em pcDNA3.1+. Ambas as versões da Editase foram modificadas em pcDNA3.1+ inserindo- se duas cópias de um epitopo HA e três cópias do SV40 NLS no quadro e N-terminal na Editase híbrida (pGM1090, tipo selvagem; pGM1091, E4880Q) . Para quias de Mecp2-BoxB, oligonucleotídeos sintéticos que representam três diferentes mutações G > A de Mecp2 e suas sequências não senso foram aneladas com saliências de Bsal e clonados no poliligante PENTR/U6 [pGM1099 (W1I04X), pGM1181 (306H), pGM1085 (R1069)] (Thermo Fisher Scientific). O guia de Mecp2-BoxB que contém o pareamento A-G não alvo (pGM11089) também está no pENTR/U6. Para o substrato de edição de Mecp2, um fragmento do cDNA de isoforma de Mecp2 El de camundongo (nº de Acesso do GenBank NP 001075448.1) foi clonado no sítio de clonagem múltipla do PEGFP-N3 (Clontech). As mutações G > A individuais da MeCP2 foram geradas sobrepondo-se a PCR com as mesmas saliências de sítio de restrição e clonadas no quadro como uma proteína de fusão com eGFP em pEGFP-N3 (Thermo Fisher Scientific). Toda a subclonagem foi verificada por análise de sequência.
As sequências iniciadores usadas em construções plasmídico e amplificações de PCR são encontradas na Tabela 1.
Moldes de cDNA e RNA Sequência, 5'- 3' Plasmídeos-alvo de Mecp2 de Clonagem mMecp2 El Fwd EcoRI gcgegaattecaccatggecegecegetgeege cac (1) mMecp2 El Rev KpnI sem|gcegegggtacegetaacteteteggteacgg códon de parada ge (2) iniciador de mMecp2 WlO4X|caccttgcctgaaggttagacacgaaagett mut Fwd aaac (3) mMecp2 W104X mut iniciador | gtttaagctttcgtgtetaacettcaggeaa Rev ggtg (4) iniciador de mMecp2 R106Q|cctgaaggttggacacaaaagcttaaacaaa mut Fwd 99 (5) mut iniciador de mMecp2|cctttgtttaagcttttgtatecaacettea R106Q Rev gg (6) iniciador mut de mMecp2|cccatcaagaagcacaagaccegggag (7) R306H Fwd iniciador mut de mMecp2|ctcecegagtettatgettettgatagg (8) R306H Rev Plasmídeos de Editase de clonagem (pGM1090, PGM1091) Editase EcoRI Kozak HA Fwd|gaattcgccaccatggtgtaccectatgacg tgcctgactacgccageggetatecatacga tgtcecegattatactt (9) Editase HA BspEI Rev ccggaagceataateggggacategtatagat agccegcaggegtagteaggeacgteataggg gtaccatggtggecg (10) SV40 3xNLS Rev gacaatcceggaggtggatectacetttetet t (12) hDD E488Q Fwd aatagagtctggtcaggggacgattce (13) hDD E488Q Rev ggaatcgtccecetgaccagactetatt (14)
Moldes de cDNA e RNA Sequência, 5'- 3'
Plasmídeos-alvo de Mecp2 de Clonagem
Guia de mMecp2 W104X 2xBoxB|cacegtectttgtttggccctgaaaaaggge guia Fwd cctttegtgtecaacetteaggeaaggggeo ctgaaaaagggceggteateatac (15)
Guia de mMecp2 W104X 2xBoxB/aaaagtatgatgaccggcectttttcaggge
Rev ccettgecetgaaggttggacacgaaagggec ctttttcagggccaaacaaaggac (16)
Guia de mMecp2 R106Q 2xBoxB|caccgcagacttccectggccctgaaaaaggge guia Fwd ctttaagctttegtgtcecaacettcaggcag gccctgaaaaagggectggggteate (17)
Guia de mMecp2 R106Q 2xBoxB|/aaaagatgaccccaggcecetttttcagggec
Rev tgcctgaaggttagacacgaaagcttaaagg cceetttttcagggccaggaagtetgc (18)
Guia de mMecp2 R306H 2xBoxB|caccgatgctgaccgtggecetgaaaaaggg guia Fwd ccecegggtettgegettettgataggageag gccetgaaaaagggecteteatgcaca (19)
Guia de mMecp2 R306H 2xBoxB|aaaatgtgcatgagaggcectttttcaggge
Rev ctgctececateaagaagegeaagaceeggg gcccetttttcagagecacggtcagecate (20)
Guia 2xBoxB de mau | caccgcagacttcctggecetgaaaaagggo pareamento não alvo delctttaagctttcegggtecaacetteaggea mMecp2 R106Q Fwd ggccctagaaaaagggectagggteate (21)
Guia 2xBoxB de mau|/aaaagatgaccccaggccectttttcagggce pareamento não alvo de tgcctgaaggttggacccgaaagcttaaago mMecp2 R106Q Rev ccetttttcagggccaggaagtetagc (22)
Amplificação de cDNA de
Mecp2-eGFP
CMV-mMecp2 ATG Fwd tcaagcttegaattecaceatagec (23
GFP-N3 ligante Rev ccttgeteaceatagtagega (24)
Amplificação de cDNA de
Mecp2 endógeno
|nMecp2 -14 mMecp2 ATG Fwd |Jaaccegtcceggaaaatagec (25)
mMecp2-3'UTR+92 Rev ggaagctttgtcagagcectaceccataag (26)
Moldes de cDNA e RNA Sequência, 5'- 3'
Plasmídeos-alvo de Mecp2 de Clonagem
Iniciadores de sequenciamento para Mecp2
RT-PCR mMecp2 554 Rev ctectggagaggetecetete (27 mMecp2 914 Rev gaccgtatggaagactcecttca (28)
mMecp2 1122 Rev actgctactagcgecectt (29)
Clonagem dos plasmídeos
PGM1257 e pGM1258 hU6 AfIII Fwd gtgtcttaaggagggecetatttceccatgatt (30)
hu6 Mfel Fwd gtgtcaattggagggcetattteccatgatt (31)
hu6 Nhel Fwd gtgtgctagcgagggccetatttcccatgatt (32)
huU6 SacI Fwd gtgtgagctegagggectatttcccatgatt (33)
hu6 SpeIl Fwd gtgtactagtgagggcetattteccato (34)
hu6 (m) Ndel Fwd gtgtcatatgcttacegtaacttgaaag (35)
R1060g9V2 Af1II Rev atatcttaagaaaaaagatgaccccaggece t (36)
R106Q0gV2 Apal Rev cacagggcccaaaaaagatgaccecaggece t (37)
R1060gV2 Mfel Rev atatcaattgaaaaaagatgaccccaggece t (38)
R106Q0Qg9V2 SacI Rev atatgagctcaaaaaagatgaccccaggece t (39)
R1060g9V2 SpeIl Rev atatactagtaaaaaagatgaccccaggece t (40)
R1060gV2 (+2)Apal Rev gegegggecettegaagetagcaaaaaagat gaccccaggecet (41)
Moldes de cDNA e RNA Sequência, 5'- 3' Plasmídeos-alvo de Mecp2 de Clonagem Clonagem de Editase no plasmídeo pGM1257 2xHA Editase Fwd NcoI Kozak/attegecaceatggtgtaccectatgacgta (42) Editase EcoRI Rev gcgcegaattctcaatagtgatggtgatagt (43) Tabela 1: quia, pcr e iniciadores de sequenciamento,. As sequências fornecidas são seq id nos: são fornecidas entre parênteses, Construtos plasmídicos
[0083] O construto inicial que contém o peptídeo AN e o cDNA de fusão de domínio catalítico ADAR2 do tipo selvagem (Editase) foi descrito (Montiel-Gonzalez, et al. (2016) Nucleic Acids Res., 44:e157; Montiel-Gonzalez, et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci., 110:18.285 a 18.290). Foi modificado para conter duas cópias da tag de epitopo HA seguida por três cópias do SV40 NLS no quadro e N-terminal à Editase híbrida (pGM1090). Para fazer isso, dois oligonucleotídeos de fita simples que codificam duas cópias da tag de epitopo HA e uma sequência Kozak foram anelados com saliências de EcoRI e BspeIl e ligados a 5' na sequência de domínio de AN. Três cópias do SV40 NLS foram amplificadas por PCR do pECFP-Nuc (Clontech) e adicionadas entre as tags de epitopo de HA e o domínio de AN com o uso das saliências de BspEI. O pGM1091 plasmídico, que contém a mutação E4880 no domínio catalítico ADAR2, foi gerado com o uso das mesmas etapas.
[0084] o PGM1258 plasmídico, usado para os experimentos de transdução AAV, contém Editase cDNA sob controle do promotor Sinapsina I e seis cópias do DNA-gquia de Mecp2ric6o com o pareamento A-G não alvo, cada um sob controle do promotor de U6 humano. Para introduzir a região- guia do U6-Mecp2ri06&, as sequências de promotor de U6 humano e de CRISPR sgRNA do plasmídeo pX552 (60.958; Addgene; Swiech, et al. (2015) Nat. Biotechnol., 33:102 a 106) foram removidas por digestão de restrição (NdeI/Apal), e sequências-guia de U6-Mecp2ri6c6swo foram inseridas entre esses sítios, em duas etapas. Na primeira etapa, três cópias da região-guia U6-Mecp2riocso foram clonadas em pX552 por uma ligação de quatro vias de amplicons de PCR (molde de pGM1108) com os seguintes sítios de restrição: NdeIl/MfeIl, MfeI/Spel e SpeI/NheItApaI (pGM1257). Na segunda etapa, três cópias adicionais da região-guia U6-Mecp2ric6w foram geradas por amplificação de PCR do pGM1108 com o uso de iniciadores adicionando os seguintes sítios de restrição: NhelI/SaclI, SacI/AfIII e AfIII/Apal. O plasmídeo final, pGM1258, foi gerado por restrição de pGM1257 digerido com NheIl/Apal e uma ligação de quatro vias com os três amplicons de PCR U6- Mecp2ri0vswo. Para introduzir a Editase cDNA em pGM1258, as sequências que correspondem ao ORF de Editase foram amplificadas do plasmídeo pGM1091 e adicionadas a jusante do promotor Sinapsina I em pGM1257, com o uso de saliências de NcoI e EcoRI.
Vetor de AAV e preparação de vírus
[0085] O vetor de backbone de AAV1/2, pX552, que contém o promotor de Sinapsina I humana foi obtido junto à Addgene (plasmídeo 60958; Swiech, et al. (2015) Nat. Biotechnol., 33:102 a 106). pX552 foi modificado substituindo-se a sequência de codificação de eGFP-KASH com a NLS Editase cDNA com tag de HA, sem e com seis cópias dos cDNAs-guia (pGMl186, Editase apenas; PpGM1258, Editase e guias de R106Q0). As sequências de Editase e sequências-guia foram verificadas por análise de sequência antes de gerar o vírus.
[0086] Cada vetor quimérico AAV1/2 foi produzido em células renais embrionárias humanas 293 (HEK293) em uma escala de três fracos de 225 cm2 por vetor por um método de transfecção plasmídico livre de adenovírus (Matsushita, et al. (1998) Gene Ther., 5:938 a 945; Earley, et al. (2017) JJ. Virol., 91:e01980 a 16). Em cada frasco, —-2 x 107 células HEK293 foram submetidas à transfecção com um total de 45 ug dos quatro DNAs plasmídicos misturados com polietileneimina (PEI) a uma razão de peso DNA:PEI de 1:2. A mistura de DNA plasmídico conteve 15 ug de pHelper (Agilent), 7,5 ug cada um de pHLP19-l1 e pHLPl19-2, e um dentre o plasmídeos recombinantes de Editase de vetor de AVV (15 ug) que contém as sequências genômicas do vetor de AAV com duas repetições de terminal invertido (ITRs). O pHLP19-1 é um plasmídeo auxiliar de AAV1 que fornece proteínas AAV2 Rep e proteínas AAV1 VP, e o pHLP19-2 é um plasmídeo auxiliar de AAV2 que fornece proteínas AAV2 Rep e proteínas AAV2 VP (Grimm, et al. (2003) Blood 102:2.412 a 2.419). Três duas após transfecção, as células foram colhidas. Em seguida, as partículas de vetor de AAV foram recuperadas das células por lise celular e purificadas com o uso de coluna de grampo HiTrap"" (GE Healthcare; Desterro, et al. (2003) J. Cell Sci., 116:1.805 a 1.818). A titulação de cada vírus foi determinada por um ensaio dot blot quantitativo com o uso de uma sonda gerada contra a sequência de codificação de Editase.
Cultura Celular
[0087] As células Neuro2A (ATCC CCL-131) foram mantidas em DMEM (Thermo Fisher Technologies) em 10% de FBS (lote nº AAC20-0955; HyClone) a 37 ºC em um incubador umidificado com 5% de CO2. Os neurônios primários foram derivados da linhagem de camundongo Mecp2ri06so que foi gerada por recombinação homóloga toda como alvo (Janelia Farms) e caracterizada por genotipagem. Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal Institucional da Universidade de Saúde e Ciência do Oregon.
Filhotes (PO) foram exterminados por decapitação e os cérebros dessecados em solução salina basal de Hanks gelada (HBSS, pH 7,4) com Hepes 25 mM. Os hipocampos individuais foram submetidos à excisão sem as meninges e agrupados por genótipo. O tecido foi tratado 1% de tripsina e 0,01% de DNase I em HBSS a 37 ºC por 10 minutos. As partes de tecido foram enxaguadas três vezes à temperatura ambiente em HBSS e desassociadas em Meio Essencial Mínimo (Gibco) que contém mM de glicose, 1% de pen/estrep, 1% de soro de cavalo (lote nº B02307-7021; HyClone), e 1% FBS. Os neurônios foram desassociados por filtragem através de um filtro de 0,4 um e colocados em placas revestidas com poli-L-lisina a uma densidade de 5 x 105 células por poço em uma placa de 12 cavidades ou 5 x 10: em uma câmara de vidro de 96 poços, em meio de crescimento neuronal que consiste em Neurobasal-A (Thermo Fisher Scientific), 1x Glutamax (Thermo Fisher Scientific), 2% de B27 (Thermo Fisher Scientific) e penicilina/estreptomicina. Após 24 horas, os neurônios receberam uma mudança média completa para remover dejetos celulares. As mudanças na metade do meio foram feitas a cada 2 a 3 dias. As células foram mantidas a 37 ºC em 5% de CO>?.
Geração e genotipagem de camundongos mecp2riv6a
[0088] O vetor de alvejamento para criar os camundongos Mecp2riosoe consistiu em éxon 3 de Mecp2, seguido por um cassete de neomicina flanqueado (frt) alvo de reconhecimento de flipase no íntron 3, o primeiro 1,2 kb do éxon Mecp2 4, e o gene de resistência de neomicina expresso do promotor de fosfoglicerato quinase (PGK). O construto linearizado foi eletroporado em células-tronco embrionárias de camundongo (mMESCs), e clones corretamente tidos como alvo foram identificados por sensibilidade e sequenciamento de G418. Os camundongos que expressam o alelo Mecp2rioso submetido a knockin foram gerados a partir de procedimentos padrão de mESCs. O cassete de resistência à neomicina foi removido cruzando-se os camundongos Mecp2r106o e os camundongos que expressam a flippase recombinase do locus Rosa 26 (estoque nº 009086; Jackson Labs). A remoçãOo do cassete foi confirmada por sequenciamento.
[0089] A genotipagem dos camundongos Mecp2R106Q0 foi realizada com o uso dos seguintes iniciadores: Mecp2-R106Q0 Fwd (5' ggacctatgtatgatgaccc 3' (SEQ ID NO: 50)) e Mecp2- R106Q Rev (5' ggtcattgggctagactgaa 3' (SEQ ID NO: 51)), o que amplifica uma região do terceiro íntron do gene Mecp2. O amplicon dos Mecp2rioso animais knockin contém o sítio frt restante usado para remover o cassete de neomicina, resultante em um produto de PCR de 93 pares de base maiores que o tipo selvagem (392 bp vs. 299 bp).
Edição de RNA
[0090] Para a análise de células de N2A, as células foram semeadas a uma densidade de 1,3 x 103 células por poço em uma placa de 12 cavidades.
Após 24 horas, as células foram submetidas à transfecção com plasmídeos que contêm Editase do tipo selvagem ou E488Q (pGM1090 e 1091), uma cópia de guia (pGM1099, pGM1181 ou pGM1108) e cDNAs de Mecp2-egfp (PGM1174, pGMl1172 ou pGM1173) com o uso da razão 2:1 de Lipofectamine"" 2000 (Thermo Fisher Scientific) e DNA em meio sérico reduzido de Opti-MEM" (Thermo Fisher Scientific). A quantidade de DNA plasmídico adicionado por poço foi 125 ng do alvo, 250 ng de Editase e 2,5 ug do guia.
Após 72 horas, as células foram colhidas e o total do RNA foi isolado com o uso do mini kit de RNA Purelinko (Ambion) de acordo com as instruções do fabricante.
O DNA plasmídico residual foi removido com o uso do kit TURBO DNA-free" (Ambion). O total do RNA foi submetido à transcrição reversa com o uso do Sistema de Síntese de Primeira Fita SuperScripte III (Life Technologies) e colocado com iniciador com o uso de oligo dT.
Os CDNAs Mecp2-egfp cDNAs submetidos à transfecção foram amplificados por análise de sequência por PCR com o uso de um iniciador 5' no promotor de CMV em pEGFP-N3 e um iniciador reversa no gene egfp.
Para editar análise de neurônios primários, a DIV7, 5 x 105 neurônios primários do hipocampo foram submetidos a transdução com AAV1/2 a uma multiplicidade de infecção de 3-6 x 10: genomas virais por célula.
O volume viral não excedeu 5% do volume médio total.
As células foram colhidas 1 semanas após a transdução e analisadas quanto à eficiência de edição, conforme descrito para as células de N2A submetidas à transfecção.
[0091] A eficiência da edição A para I foi determinada por PCR de transcrição reversa (RT-PCR) e sequenciamento direto de produtos PCR. A quantificação das alturas de pico de sequenciamento da fita antissenso foi determinada processando-se as quatro sequências de traço de corante com o uso Bioedit pacote Software (mbio.ncsu.edu/BioEdit/ bioedit.html; File > Batch Export of Raw Sequence Trace Data) A quantidade de edição em cada sítio foi, em seguida, determinada com o uso da altura máxima dos picos T (não editado) e C (editado) em um determinado sítio e calculando a porcentagem do cDNA editado (100% *x ([C altura/(T altura + C altura)]). Um limite de detecção de 5% de edição foi determinado medindo-se as alturas de pico G-A em misturas que contêm razões decrescentes entre plasmídeos mutantes de R106Q e mecp2 do tipo selvagem. As alturas de pico C/T do filamento não senso foram quantificadas devido ao fato de que é mais preciso que usar as alturas de pico A/G do filamento senso (Eggington, et al. (2011) Nat. Commun., 2:319). No entanto, a título de esclarecimento, todos os cromatogramas são mostrados no complemento reverso.
Western blotting
[0092] os neurônios do hipocampo primários, submetidos à transdução com AAV1/2 foram lisados em 100 ul de tampão de lise de célula inteira (25 mM de Tris, pH 7,6, 150 mM de NaCl, 1% de Igepal CA-630; Sigma), 1% de desoxicolato, 0,1% de SDS, inibidor da protease (completamente livre de EDTA; Roche), 1 mM de beta- mercaptoetanol e 250 unidades cada ml de benzonase (Sigma- Aldrich). Os lisados foram centrifugados a 9.300 x q por 10 minutos a 4 ºC e a fração solúvel isolada. As concentrações de proteína são medidas com o uso do kit de ensaio de proteína BCA (Pierce Biotechnology). Quantidades iguais de lisados de proteína foram separados em géis com Bis-Tris a 4 a 12% NuPage6 (Thermo Fisher Scientific) em tampão corrente de Mops-SDS (Thermo Fisher Scientific) e proteínas foram manchadas em uma membrana de nitrocelulose (GE Healthcare Life Sciences). As membranas foram bloqueadas com 3% de BSA em lx TBST (TBS com 0,05% de Tweend 20) por 1 hora, em seguida, incubadas com ou anti-mMeCP2 de coelho (Covance) ou anti-fB-actina de coelho (8227; Abcam) de um dia para o outro a 4ºC. Após lavar três vezes com lx TBST, as manchas foram incubadas com IgG DyLighto 680 anticoelho (diluição a 1:10,000; Thermo Scientific) por 1 hora. As manchas foram quantificadas com o uso do Sistema de Imageamento OdysseyO (LI-COR Biosciences).
Imunomarcação
[0093] Os neurônios primários do hipocampo foram fixados em 4% de paraformaldeído em PBS por 20 minutos à temperatura ambiente.
As células fixas foram lavadas duas vezes com 1x PBSG (0,1 M de glicina em 1x PBS) à temperatura ambiente por 10 minutos.
Em seguia, as células foram bloqueadas e permeabilizadas [0,5% de Igepal CA-630, Sigma; 3% BSA (fonte) em 1x PBS] por 1 hora a 4 ºC e incubadas com anticorpos primários elevados contra MeCP2 (mãab D4F3 de coelho; Sinalização Celular) e HA (mAb 3F10 de rato; Roche) em uma câmara umidificada de um dia para o outro a 4 ºC.
As células foram lavadas três vezes em lx PBS contendo 0,5% de Igepal e foram incubadas com anticorpos secundários Alexa 488 e Alexa 568 (Thermo Fisher Scientific) por 1 hora.
Após outra lavagem com lx PBS que contém 0,5% de Igepal, as células foram incubadas com 300 nM de DAPI por 5 minutos, em seguida, lavados novamente com lx PBS.
As células foram montadas com o uso de reagente antiesvanecimento ProLongO Gold (Thermo Fisher Scientific) de um dia para o outro.
Todas as imagens foram obtidas como pilhas z de seções ópticas de 0,5 um em um microscópio confocal Zeiss 710 com o uso de um objeto de imersão em água 40x.
As imagens fluorescentes de HA e MeCP2 foram obtidas com o uso das mesmas configurações em todas as amostras.
O número total de células ou números de células anticorpo-positivas foi determinado pelo contador de células ImageJ (National Institutes of Health, imagej.nih.gov/ij, versão 1.60 65 (32 bit)). Análise Estatística
[0094] Toda a estatística foi realizada com o uso do software GraphPad versão 6.0 (Prism). A porcentagem de edição A para IT em células de N2A foi analisada com o uso de ANOVA de uma via seguido por testes Bonferroni post hoc. O nível de edição A para I em Mecp2rioso/y neurônios submetidos à transdução, níveis de comparação níveis de proteína de MeCP2 de comparação por Western blots e o número de neurônios que mostram enriquecimento de MeCP2 enriquecimento em focos heterocromáticos foram analisados, cada um, com o uso de testes não pareados t. Todos os resultados experimentais são expressos como média + SD.
Resultados O direcionamento da editase para mrna de mecp2 expresso de maneira heteróloga pode reparar mutações em mecp2 de G >
A
[0095] Há pelo menos três mutações G > A em MECP2 humano que proporcionam síndrome de Rett clássica. Duas mutações permanecem dentro do Domínio de Aglutinação Metil- DNA (MBD), MeCP2r106o e MeCP2w101x e uma, MeCP2rR306HM, permanece no domínio de interação NCoOR (NID) (Fyfe, et al. (2003) JJ. Child. Neurol., 18:709 a 713; Lyst, et al. (2013) Nat. Neurosci., 16:898 a 902) (Figura 1A). A fim de determinar se a Editase pode reparar essas mutações, a edição foi testada seguindo as transfecções transientes de Editase, RNA-guia, e cDNAs de Mecp2 em células de N2A. A fim de distinguir as proteínas de MeCP2 expresso de maneira heteróloga das proteínas endógenas, a MeCP2 tag de eGFP C-terminal.
A Editase e os cDNAs Mecp2-gfp foram expressos do promotor- intensificador de gene imediatamente precoce do citomegalovírus (CMV), e o guia foi expresso do promotor de gene de RNA nuclear pequeno U6 humano.
Três cópias do sinal de localização nuclear do antígeno T Vírus Símio 40 Grande (NLS) foram adicionadas à Editase, além do peptídeo NAN, devido ao fato de que a ADAR2 edita mRNAs endógeno no núcleo como uma transcrição primária (Desterro, et al. (2003) JJ.
Cell.
Sci., 116:1.805 a 1.818). Cada RNA-quia contém duas hastes-alças (BoxB) que representam as sequências reconhecidas pelo peptídeo AN.
Uma haste-alça BoxB está localizada 16 a 18 bases 5' da A-alvo, e a segunda está localizada em 10 bases 3' da A-alvo (Figura 1B). O número de posição das hastes-alças em relação à A-alvo se baseou em estudos (Montiel-González, et al. (2016) Nucleic Acids Res., 44:e157; Montiel-Gonzalez, et al. (2013) Proc.
Natl.
Acad.
Sci., 110:18.285 a 18.290) e foi determinado empiricamente para Mecp2 em análises de transfecção.
A edição é ideal com um mau pareamento de C nesse sítio no quia complementar (Schneider, et al. (2014) Nucleic Acids Res., 42:e87; Wong, et al. (2001) RNA 7:846 a 858; Kállman, et al. (2003) Nucleic Acids Res., 31:4.874 a 4.881) e todos os mRNAs-guia de Mecp2 contêm esse mau pareamento.
[0096] As células de N2A foram submetidas à cotransfecção com plasmídeos separadas que codificam à Editase, MeCP2-GFP, e um terceiro plasmídeo que contém ou não tem as sequências-guia. Após 3 dias, o sequenciamento Sanger foi usado para analisar os cDNAs sintetizados a partir da região tida como alvo de mRNA de Mecp2-gfp (Figuras 1C e 1D). A eficiência de edição foi medida determinando-se as alturas de pico relativas na posição A tida como alvo. Todas as três mutações de Mecp2 foram editadas de maneira dependente do guia, consistente com edição mediada por ADAR2 que exige RNA dupla fita (Figuras 1C e 1D). A porcentagem de edição para uma A tida como alvo variou com o contexto do nucleotídeo 5', semelhante à presente de sequência do domínio catalítico ADAR2 (Eggington, et al. (2011) Nat. Commun., 2:319; Lehmann, et al. (2000) Biochemistry 39:12.875 a
12.884). De modo específico, com base em triagens in vitro, a hierarquia ideal de 5' para uma desaminação de A por domínio catalítico de ADAR2 é U> A> C > G e os nucleotídeos 3' mais ideais são C + G + A > U. WI04X (UAG) foi editado com mais eficiência (76 + 10%), seguido por R306H (CAC, 34 + 3%) e R106Q (CAA, 25 + 2%), que para Mecp2 foi não estatisticamente diferente (Figura 1D). A fim de otimizar adicionalmente o sistema de Editase para reparar mutações G > A em Mecp2, o foco foi para R106Q devido ao fato de que em pacientes humanos, é mais comum que a mutação W104X e causa uma forma mais grave de síndrome de Rett do que R306H (Fyfe, et al. (2003) J. Child. Neurol., 18:709 a 713; Cuddapah, et al. (2014) J. Med. Genet., 51:152 a 158).
Uma mutação no domínio da deaminase, e488q, aumenta a eficiência de edição da editase híbrida
[0097] Os domínios catalíticos hADAR2 que contêm uma mutação de E488Q aumentam eficiência de edição A > [1 aumentando-se tanto a taxa catalítica (Montiel-González, et al. (2016) Nucleic Acids Res., 44:el157; Kuttan, et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci., 109:E3295-E3304) quanto a afinidade do domínio catalítico para RNAs de substrato (Lehmann, et al. (2000) Biochemistry 39:12.875 a 12.884). Esse recurso permite que a mutação E488Q obtenha níveis mais altos de contextos 5' e 3' não favoráveis (Montiel-González, et al. (2016) Nucleic Acids Res., 44:el57; Kuttan, et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci., 109:E3295-E3304). A fim de testar se a Editaserz.s5o aumenta a eficiência de edição do A-alvo em Mecp2ri06o, que tem C em 5' não ideal, as células de N2A foram submetidas à cotransfecção com cDNAs de Mecp2ri0w-egfp e Editasers:ss50. A análise de sequência indicou que a expressão- guia foi necessária para editar e que a edição de porcentagem de mrna de mecp2 foi aumentada -duas vezes com Editaserzs8so em comparação a Editase do tipo selvagem (51 + 11% vs. 22 t 5%, n = 3, P< 0,01) (Figura 2A).
[0098] Com o uso ou de domínios catalíticos de hADAR2 ou hADAR2r:886 do tipo selvagem na Editase híbrida, um sítio de edição não alvo foi detectado dentro da região-guia do CcDNA de Mecp2rioso-egfp submetido à transfecção (Figura 2B). A edição nesse sítio resulta em uma mudança códon silenciosa, T105T (ACA > ACG). Um mau pareamento de G no sítio não alvo pode reduzir a edição não alvo nos substratos submetidos à transfecção (Vogel, et al. (2014) Angew Chem. Int. Ed. Engl., 53:6.267 a 6.271). A fim de determinar se um mau pareamento de G também reduz a edição não alvo em mrna de mecp2, a eficiência de edição foi analisada em células de N2A submetidas à transfecção com codificação de plasmídeos para cDNA de Mecp2rinso-egfp, Editaserisso e um quia com um mau pareamento de G na A não alvo próxima (Figura 2C). A quantidade de edição não alvo foi reduzida significativamente quando a Editase foi tida como alvo com uma guia que contém o mau pareamento A-G (4,9 + 0% com mau pareamento, 33 t 5% sem mau pareamento, n = 3, P < 0,0001; Figuras 2D e 2E), sem efeito significativo na edição no A- alvo (Figuras 2D e 2F). Todos os eventos de edição precisam da presença do RNA-gquia (Figuras 2E e 2F).
A edição de rna sítio-direcionada repara uma mutação que causa rett endógena, restaurando os níveis de proteína ea função de mecp2
[0099] Em seguida, testou-se se a Editaserssso pode (1) reparar a mutação missenso R1069 no mrna de
Mecp2endógeno, (ii) recuperar níveis de proteína e (iii restaurar a capacidade de MeCP2 para se aglutinar à heterocromatina, um recurso funcional de referência exigido para reverter sintomas do tipo Rett em camundongos (Garg, et al. (2013) J.
Neurosci., 33:13.612 a 13.620). Para esses testes, os neurônios foram isolados dos camundongos e modificados para conter a mutação R106Q no gene de Mecp2 endógeno.
Os neurônios cultivados foram submetidos à transdução com qualquer um dos dois AAVS (AAV1/2). Ambos os vírus expressam Editaserisso sob controle do promotor Sinapsina I humano (Swiech, et al. (2015) Nat.
Biotechnol., 33:102 a 106) e um vírus conteve adicionalmente seis cópias da guia (guia de mau pareamento não alvo; Figura 2C), cada um sob o controle do promotor de U6 humano.
Os outros vírus serviram como um controle e não tinham nenhuma sequência- guia.
Os neurônios do hipocampo foram gerados a partir de camundongos PO Mecp2ri06o/, e submetidos à transdução ou com vetores que contêm guia ou de AV de controle que portam os capsídeos híbridos de AAV1I/2 em 7 dias in vitro (DIV 7). Após permitir que a expressão do vírus por mais 7 dias, o CDNA de Mecp2 foi preparado a partir de culturas de controle e experimentais e analisado por sequenciamento Sanger.
Constatou-se que 72 t+ 5% do mrna de mecp2 foi reparado nas culturas que expressam tanto Editase quanto o guia (Figura 3A), ao passo que não houve edição detectável nos neurônios submetidos à transdução com o vírus de controle que não teve o guia. Além da edição a R106Q, a análise de sequência também identificou diversos “sítios de edição não alvo dentro do CcDNA de Mecp2 (Figura 3B). Os sítios não alvo ocorreram primariamente dentro da região complementar ao RNA-quia, embora um evento tenha ocorrido fora da quia (N126S).
[0100] As consequências funcionais da edição de RNA foi testada medindo-se a quantidade de proteína de MeCP2 nas culturas de AAVI/2 submetidas à transdução por Western blotting. Semelhantemente a outras mutações no MBD (Goffin, et al. (2011) Nat. Neurosci., 15:274 a 283; Brown, et al. (2016) Hum. Mol. Genet., 25:558 a 570), os níveis de proteína de MeCP2ri0so são diminuídos em comparação a níveis do tipo selvagem (Figura 4). Os níveis reduzidos de proteína de MeCP2 mutante são prováveis devido à desestabilização (Goffin, et al. (2011) Nat. Neurosci., 15:274-283). A expressão da Editase e guia nos neurônios primários mutantes aumentou os níveis de proteína de MeCP2 em —-três vezes em comparação à expressão apenas da Editase (Figura 4; 35,3 + 2% com guia em comparação a 12,9 + 1% sem guia, n = 3, P < 0,001). Isso demonstra, pela primeira vez, a recuperação funcional de uma proteína que causa doença endógena após edição.
[0101] A MeCP2 se aglutina com alta afinidade a metil-CpGs, tanto in vitro quanto in vivo (Skene, et al. (2010) Mol. Cell., 37:457 a 468; Lagger, et al. (2017) PLoS
Genet., 13: el006793), uma propriedade crucial para a função normal.
Nas células de camundongo, as mutações no MBD de MeCP2 reduzem a glutinação à heterocromatina que contém sequências satélite amplificadas ricas em mCG (Brown, et al. (2016) Hum.
Mol.
Genet., 25:558 a 570; Heckman, et al. (2014) eLife 3:e02676). MeCP2r106o, uma mutação de MBD, também mostra aglutinação reduzida a metil-CpGs in vitro (Yang, et al. (2016) ACS Chem.
Biol., 11:2.706-2.715). A fim de determinar se o MeCP2ri0so tem aglutinação semelhantemente reduzida em células e se a edição do RNA mutante de Mecp2 G > A restaura o enriquecimento em heterocromatina, os núcleos foram imunoidentificados em culturas neuronais de Mecp2rio6so/y submetidas à transdução com AAV1/2 que codifica Editase com tag de HA, com ou sem guia como um controle (Figura 5). DAPI (4', G6-diamidino-2-fenilindol), um indicador fluorescente que se aglutina fortemente a regiões ricas em A-T no DNA foi usado para identificar os núcleos e a heterocromatina.
Nas culturas dos neurônios do tipo selvagem (Mecp2:/y), os núcleos mostraram enriquecimento clássico de MeCP2 na heterocromatina marcada com DAPI (focos), refletindo um MBD funcional (Figura 5A). Em contrapartida, nas culturas preparadas a partir irmãos Mecp2rio6/y submetidos à transdução com vírus Editase que careceu de sequências-guia, a imunofluorescência de MeCP2 foi distribuída de maneira difundida ao longo do núcleo, conforme esperado por uma mutação no MBD que impede aglutinação ao DNA (Goffin, et al. (2011) Nat.
Neurosci., 15:274-283; Heckman, et al. (2014) eLife 3:e02676) (Figura 5B). A intensidade de marcação também foi menor em comparação aos núcleos do tipo selvagem, que supostamente refletem a proteína de MeCP2 desestabilizada.
Em contrapartida, Mecp2ri0ose os neurônios que expressam tanto a Editase quanto o RNA-guia mostraram um aumento evidente na imunofluorescência de MeCP2, a um nível semelhante a núcleos do tipo selvagem, e enriquecimento de proteína de MeCP2 em focos heterocromáticos, indicando restauração funcional do MBD (Figuras 5C e 5D). A fim de quantificar os resultados de quantificar os resultados de imunofluorescência, determinou- se primeiramente nos três experimentos que a Editase foi expressa na mesma porcentagem de células independentemente da presença do guia (Editase apenas 67 t+ 7%, Editase e guia 67 + 10%; n = 134 e 137 células, respectivamente; Figura 5E). Em seguida, determinou-se que nas culturas submetidas à transdução com Editase e guia, 74 + 11% das células que expressam Editase (Figura 5F) e 49 + 8% do total de células mostraram enriquecimento de MeCP2 nos focos heterocromáticos (Figura 5G). O enriquecimento de MeCP2 nunca foi detectado dentro dos focos heterocromáticos em Mecp2ricswo núcleos submetidos à transdução com vírus que carecem do guia, consistente com os resultados de sequenciamento que mostram que a edição depende da presença do guia.
[0102] A ADAR foi usado para reparar mutações G > A em mRNAs exógenos em oócitos de Xenopus (Woolf, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci., 92:8.298 a 8.302). Os dados apresentados no presente documento demonstram que a edição de RNA sítio-direcionada, com o uso de um domínio catalítico de hADAR2 modificado pode reparar um mRNA mutante endógeno e reverter um defeito celular causado pela mutação.
[0103] Três genes codificam as proteínas de ADAR em camundongos e humano, porém apenas ADARI e ADAR2 exibem atividade catalítica A-para-I (Nishikura, K. (2010) Annu. Rev. Biochem., 79:321 a 349). A edição mediada por ADAR nativa é crucialmente importante para modular de maneira pós-transcricional função de proteína no cérebro, mostrado primeiramente para canais de íon e receptores (Bhalla, et al. (2004) Nat. Struct. Mol. Biol., 11:950 a 956; Sommer, et al. (1991) Cell 67:11 a 19; Burns, et al. (1997) Nature 387:303 a 308), porém atualmente conhecidos por estender a muitas outras proteínas e RNAs de não codificação (Chen, et al. (2012) Curr. Top. Microbiol. Immunol., 353:111 a 121; Nishikura, K. (2016) Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 17:83 a 96). O domínio catalítico de ADAR2 recebeu foco devido a sua capacidade para editar mRNAs heterológicos (Vogel, et al. (2014) Angew Chem. Int. Ed. Engl., 53:6.267 a 6.271; Schneider, et al. (2014) Nucleic Acids Res., 42: e87; Montiel-González, et al. (2016) Nucleic Acids Res., 44:e157;
Montiel-Gonzalez, et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci., 110:18.285 a 18.290; Wong, et al. (2001) RNA 7:846 a 858) e devido ao seu mecanismo de edição bem caracterizado (Kuttan, et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci., 109:E3295 a E3304; Matthews, et al. (2016) Nat. Struct. Mol. Biol., 23:426 a 433). De fato, a eficiência de edição aumentada de mrna de Mecp2 foi constatada quando a Editase conteve mutação de E488Q dentro do domínio catalítico (Montiel-González, et al. (2016) Nucleic Acids Res., 44:el157; Kuttan, et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci., 109:E3295 a E3304; Phelps, et al. (2015) Nucleic Acids Res., 43:1123-1132). A elucidação da estrutura do domínio catalítico de hADAR2 complexada para RNA de dupla fita (Matthews, et al. (2016) Nat. Struct. Mol. Biol., 23:426-433) fornece um recurso valioso para gerar outras mutações a fim de otimizar adicionalmente a eficiência de edição e especificidade para MeCP2 e outras mutações (Wang, et al. (2016) Nucleic Acids Res., 44:9.872 a 9.880). Em contrapartida a tentativas anteriores, todos os construtos aqui incluíram um NLS, o que aumenta a eficiência de edição, particularmente, de mRNAs endógenos, devido ao fato de que ADARs normalmente editam transcrições primárias dentro do núcleo (Wong, et al. (2001) RNA 7:846 a 858).
[0104] Em células submetidas à transfecção, a eficiência de edição superior com Editaserssso na À tida como alvo também resultou em edição não alvo superior em um sítio dentro da região-guia. O sítio de edição não alvo único alvo foi atenuada com o uso de um mau pareamento G-A (Schneider, et al. (2014) Nucleic Acids Res., 42:e87). A saber, o sequenciamento de cinco cDNAs que representam mRNAsS altamente expressas, diferentemente do mRNA-alvo, não indicou a edição não alvo (Montiel-González, et al. (2016) Nucleic Acids Res., 44:e157). No entanto, e surpreendentemente, no presente estudo com neurônios, os sítios de edição não alvo eram diferentes entre mrna de Mecp2 submetidos à transfecção e endógenos. De modo específico, em mMRNA de Mecp2 reparado endógeno, diversos sítios de edição não alvo adicionais dentro, e um fora, constatou-se que a região-guia estava ausente do mRNA de Mecp2 expressa a partir de cDNA (Figura 3B). A diferença nos sítios de edição não alvo entre mRNAs de Mecp2 submetidos à transfecção e endógenos reflete provavelmente as diferenças de sequência que podem afetar a dobra de RNA e outros eventos de processamento a jusante. Com importância, nenhum dos sítios não alvo no mRNA de Mecp2 endógenos causam síndrome de Rett (Fyfe, et al. (2003) J. Child
[0105] Neurol., 18:709 a 713). Os modelos de camundongo de síndrome de Rett podem ser usados adicionalmente, e os sintomas comportamentais são revertidos por restauração da MeCP2 do tipo selvagem em camundongos sintomáticos (Guy, et al. (2007) Science 315:1.143 a 1.147;
[0106] Sinnett, et al. (2017) Mol. Ther. Methods Clin. Dev., 5:106 a 115; Gadalla, et al. (2017) Mol. Ther. Methods Clin. Dev., 5:180 a 190; Garg, et al. (2013) O. Neurosci., 33:13.612-13.620; Gadalla, et al. (2013) Mol. Ther., 21:18 a 30).
EXEMPLO 2
[0107] Camundongos com a mutação Mecp2 Mecp2317G>A foram usados para estar os presentes métodos in vivo. O mutação Mecp2317c3a gera um MeCP2 com a mudança de aminoácido R106Q0. Em suma, os camundongos com a mutação Mecp2 Mecp23176c>a foi tratada com vetores de AAV que codificam a Editase com a mutação de E4880 da presente invenção com ou sem 6 cópias de um RNA-guia. Um vetor de AAV com o capsídeo PHP.B (uma variante AAV9) foi usado devido ao às suas propriedades neurotrópicas (Hordeaux et al. (2018) Mol. Ther., 26(3):664 a 668). 1,1 x 1010 equivalentes de genoma viral (vge) do AAV foi injetado de maneira estereotáxica no hipocampo dos camundongos. 3 a 4 semanas após injeção viral direta, os camundongos foram sacrificados e função de MeCP2 foram detectados no cérebro. Conforme observado na Tabela 2, foram observadas edição eficiente de RNA tido como alvo in vivo e a recuperação da função de MeCP2 no cérebro. Além disso, com base em análise de sequência de RNA, a eficiência de edição A para I em neurônios granulares do dentado foi determinada como 39% ao passo que a eficiência de edição de A para I em neurônios CAl foi determinada como 64%. Conforme observado na Figura 6, a intensidade de MeCP2 em heterocromatina do dentado foi maior em camundongos injetados com AAV que tem o RNA-guia em comparação a camundongos injetados com AAV sem o RNA-guia. Esses resultados indicam o resgate da capacidade de aglutinação ao DNA de MeCP2. SA! Íeaz feas loiro aentado | núcleos
[0108] Tabela 2: A quantificação do número de células que expressam a enzima Editase e que mostram a MeCP2 in vivo funcional. AAV PHP.B que codifica a Editase e RNA-guia foi injetado o hipocampo de camundongos Mecp23176>a. Três semanas após a injeção, os camundongos foram processados para imuno- histoquímica. Editaser células foram identificadas por imunomarcação de HA das seções do cérebro dos camundongos injetados após limitar o sinal de células não infectadas. As porcentagens estão relacionadas ao número total de células identificadas por DAPI. A porcentagem de Editase+ células que mostram o enriquecimento de MeCP2 dentro de heterocromatina (focos) indica a função de restauração de proteína de MeCP2. n = 864 células.
EXEMPLO 3 Construções Plasmídicas
[0109] As sequência que codifica o ADAR2 humana de comprimento completo que contém o a tag Flag amino-terminal Flag foi subclonada de um vetor de expressão de levedura em pcDNA 3.1+ (Thermo Fisher Scientific). A fim de expressar as guias Mecp2 projetadas para recrutar ADAR2 de comprimento completo, os oligonucleotídeos sintéticos foram anelados saliências de Bsal e clonados no poliligante pENTR/U6 [PGM1099 (2xBoxB guia W104X), pGM1192 (guia de alça interna W104X), pGM1310 (GluA2 haste-alça W104X] (Thermo Fisher Scientific). O substrato de Mecp2 que contém a mutação Mecp23116>37 (W104X) é descrita no Exemplo 1. Toda a subclonagem foi verificada por análise de sequência. As sequências iniciadores usadas em construções plasmídico e amplificações de PCR são encontradas na Tabela 3.
Cultura Celular
[0110] As células HEK293T (ATCC CRL-3216) foram mantidas em DMEM (Thermo Fisher Technologies) em 10% de FBS a 37 ºC em um incubador umidificado com 5% de CO2.
Edição de RNA
[0111] Para a análise de edição com o uso de ADAR2 de comprimento completo, as células de HEK293T foram semeadas em uma densidade de 1.3 x 103 células por poço em uma placa de 12 cavidades. Após 24 horas, as células foram submetidas à transfecção com plasmídeos que codificam a ADAR2 humana de comprimento completo (pGMl155), uma cópia do guia (pGM1099,
pPGM1192 ou pGM1310) e cDNA de Mecp23116>3a-egfp com o uso de uma razão 2:1 de Lipofectamine" 2000 (Thermo Fisher Scientific) e DNA em meio sérico reduzido Opti-MEM" (Thermo Fisher Scientific). A quantidade de DNA plasmídico adicionada por poço foi 125 ng de alvo, 250 ng de ADAR2 humana e 2,5 ug do guia.
Após 72 horas, as células foram colhidas e o total do RNA foi isolado com o uso do mini kit de RNA Purelinko (Ambion) de acordo com as instruções do fabricante.
O DNA plasmídico residual foi removido com o uso do kit TURBO DNA-free". (Ambion). O total do RNA foi submetido à transcrição reversa com o uso do Sistema de Síntese de Primeira Fita SuperScripte III (Life Technologies) e colocado com iniciador com o uso de oligo dT.
O cDNA de Mecp23116;a-egfp submetido à transfecção foi amplificado para análise de sequência por PCR com o uso de um iniciador 5' no promotor de CMV em pEGFP-N3 e um iniciador reverso no gene egfp.
Plasmídeo de hADAR2 de clonagem hADAR2 3xFlag Fwd tggtggaattegecaccatggactacaago (61) hADAR2 Rev tcgagcggeegeteaatggtaatagtga (62) Sequências de BNA-guia | | Guia de mMecp2 W104X 2xBoxB|caccgtcectttgtttggecctgaaaaagggo guia Fwd cctttegtgtccaacetteaggeaaggageo ctgaaaaagaggceggteateatac (15) mMecp2 W1I04X 2xBoxB Guialaaaagtatgatgaccggcectttttcaggge
Moldes de cDNA e RNA Sequência, 5'- 3' Rev ccettgceetgaaggttggacacgaaagggec ctttttcagggccaaacaaaggac (16) mMecp2 W1l04X Guia de Alça|cacegacttectttgttattgctttegagte Interna Fwd caaccttcaggcatcetgggatceateata (63) mMecp2 W104X guia de alçajaaaatatgatgaccccaggatgccetgaaggt interna Rev tggacccgaaagcaataacaaaggaagte (64) Guia de mMecp2 W104X GluA2 | caccgtggaatagtataacaatatgctaaat guia Fwd gttgttatagtatcccactegtgtecaacet tcatctagagggccetgaagagggecettt (65) Guia de mMecp2 W104X GluA2/aaaaaaagggccetetteagggecetetaga Rev tgaaggttggacacgagtgggatactataac aacatttagcatattgttatactattccac (66) Amplificação de cDNA de Mecp2-eGFP |CMV-mMecp2 ATG Fwd tcaagcttegaattecaccatagec (23) GFP-N3 ligante Rev ccttgeteaceatggtagega (24) Iniciadores de sequenciamento para Mecp2 RT-PCR mMecp2 554 Rev ctcectggaggggetecetete (27) mMecp2 914 Rev gaccegtatggaagactecttcea (28) mMecp2 1122 Rev actgctagctagegecectt (29) s ; : são £ ss a Resultados
[0112] Células de rim embrionário humano (HEK) foram submetidas à transfecção com ADAR2 de comprimento completo humana e Mecp2:3xsa sob controle do promotor de citomegalovírus (CMV). A ADAR2 humana foi uma molécula de ADAR2 nativa de comprimento completo que imita a ADAR2 endógena. A mutação Mecp231763a resulta em uma mudança de aminoácido R106Q (Mecp2ri06o). Em seguida, as células foram tratadas com 1) um RNA-guia com 2 hastes-alças BoxB, conforme descrito acima (consultar, por exemplo, exemplo 1), 2) um RNA-guia que compreende um sítio de aglutinação R/G do GluAZ (Wettengel, et al. (2017) Nucleic Acids Res., 45(5): 2.797 a 2.808; Fukuda, et al. (2017) Sci. Rep.,7:41.478) ou 3) um RNA-guia que tem alças internas (Lehmann, et al. (1999) UU. Mol. Biol., 291(1):1 a 13). Conforme observado na Figura 7, os RNAs-guia, que incluem o RNA-guia que compreende 2 hastes- alças BoxB, puderam recrutar a ADAR2 de comprimento completo para editar RNA de MECP2 em células submetidas à transfecção HEK. Esses resultados demonstram que o recrutamento das ADARsS de comprimento completo ao RNA-alvo que pode incluir, além das sequências de RNA-alvo, a presença de sequências que não estão incluídas normalmente no RNA-alvo.
[0113] Embora algumas das modalidades preferenciais da presente invenção tenham sido descritas e exemplificativas especificamente acima, a invenção não deve se limitar a tais modalidades. Várias modificações podem ser feitas às mesmas sem haver afastamento do escopo e do espírito da presente invenção, de acordo com as reivindicações a seguir.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para editar uma sequência-alvo de um RNA endógeno em uma célula, preferencialmente em que o dito RNA endógeno está dentro do núcleo da dita célula, o dito método caracterizado pelo fato de que compreende entregar à célula um RNA-guia ou uma molécula de ácido nucleico que codifica um RNA-guia, em que o dito RNA-guia compreende uma sequência e/ou estrutura reconhecida especificamente por uma Adenosina Deaminase que Atua no RNA (ADAR) humana endógena, de preferência, ADARI ou ADAR 2, mais preferencialmente, em que a dita ADAR compreende pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 55, e em que o dito RNA-guia hibridiza especificamente com a sequência-alvo no dito RNA endógeno e compreende um mau pareamento em um nucleotídeo a ser editado.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o RNA endógeno é RNA da Proteína 2 de aglutinação ao Metil-GpG (MECP2).
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo a ser editado é uma mutação pontual, de preferência, uma mutação pontual que causa doença no RNA de MECP2, mais preferencialmente, uma mutação de guanosina para adenosina no RNA de MECP2.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
1 a 3, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo a ser editado é uma mutação antissenso que é editada para remover um códon de parada, ou em que o RNA-guia pode corrigir a mutação antissenso de C para T por meio da desaminação de um A na posição 3".
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o dito RNA-guia compreende adicionalmente um ou mais maus pareamentos a montante ou a jusante do nucleotídeo a ser editado.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a ADAR endógena reconhece o RNA-guia e/ou em que a ADAR endógena desamina a base de um nucleotídeo no RNA endógeno.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a edição da sequência- alvo altera os níveis e/ou a função de uma proteína codificada pela sequência-alvo.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico está contida dentro de um vetor viral, de preferência, em que o dito vetor viral é um vírus adeno- associado (AAV).
9. Método para tratar, inibir e/ou prevenir uma doença genética do sistema nervoso central em um indivíduo, de preferência, síndrome de Rett, sendo que o dito método é caracterizado pelo fato de que compreende editar uma sequência-alvo de um RNA endógeno em uma célula, de preferência, em que o RNA endógeno está dentro do núcleo da dita célula, administrando-se ao dito indivíduo um RNA-guia ou uma molécula de ácido nucleico que codifica um RNA-guia, em que o dito RNA-guia compreende uma sequência e/ou estrutura reconhecida especificamente por uma Adenosina Deaminase que Atua no RNA (ADAR) humana endógena, de preferência, ADARI ou ADAR2 ou uma variante das mesmas, mais preferencialmente, em que a dita ADAR compreende pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 55.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o RNA-guia hibridiza especificamente com RNA de proteína 2 de aglutinação ao Metil-GpG (MECP2) e compreende um mau pareamento no nucleotídeo mutante do RNA de MECP2 endógeno, de preferência, em que o nucleotídeo mutante é uma mutação pontual que causa doença, tal como uma mutação antissenso que é editada para remover o códon de parada ou em que o RNA-guia pode corrigir uma mutação antissenso de C para T por desaminação de um A na posição 3'.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que uma ADAR endógena reconhece o RNA-guia e/ou em que uma ADAR endógena desamina a base de um nucleotídeo no RNA endógeno.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que a edição da sequência-alvo altera os níveis e/ou a função de uma proteína codificada pela sequência-alvo.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico está contida dentro de um vetor viral, de preferência, em que o dito vetor viral é um vírus adeno-associado (AAV).
14. RNA-guia ou molécula de ácido nucleico que codifica um RNA-guia, o dito RNA-guia caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma sequência que alveja ou hibridiza especificamente com uma sequência-alvo, de preferência, que compreende uma região complementar ao RNA de MECP2 e que compreende um mau pareamento com a sequência-alvo direcionada ao nucleotídeo a ser mudado ou editado, de preferência, em que o mau pareamento é um mau pareamento A:C; E b) uma sequência e/ou estrutura reconhecida por uma deaminase endógena, de preferência, uma ADAR, mais preferencialmente, ADARI ou ADAR2
15. RNA-guia ou molécula de ácido nucleico que codificada um RNA-guia, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo a ser editado é uma mutação pontual, de preferência, uma mutação pontual que causa doença no RNA de MECP2, mais preferencialmente, uma mutação de guanosina para adenosina no RNA de MECP2.
16. RNA-qguia ou molécula de ácido nucleico que codifica um RNA-guia, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo a ser editado é uma mutação antissenso que pode ser editada para remover o códon de parada ou em que o RNA-guia pode corrigir uma mutação antissenso de C para T por meio de desaminação de um A na posição 3".
17. RNA-guia ou molécula de ácido nucleico que codifica um RNA-qguia, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que o RNA-guia compreende um grampo de RNA, tal como um grampo de RNA com base em alvos naturais de ADARS, e/ou um mau pareamento que cria protuberâncias de dupla fita reconhecidas por ADARS.
18. RNA-guia ou molécula de ácido nucleico que codifica uma RNA-guia, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato de que o RNA-qguia compreende uma, duas ou mais sequências BoxB ou um sítio de aglutinação R/G de GluR2, de preferência, em que o sítio de aglutinação R/G de GluR2 compreende SEQ ID NO: 70 ou uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com à mesma.
19. RNA-quia ou molécula de ácido nucleico que codifica um RNA-guia, de acordo com qualquer uma das reivindicações
14 a 18, caracterizado pelo fato de que o RNA-guia compreende alças internas, de preferência, alças que compreendem 4, 6, 8, 10 ou mais nucleotídeos.
20. RNA-guia ou molécula de ácido nucleico que compreende um RNA-guia, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 19, caracterizado pelo fato de que o RNA-guia compreende uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade com qualquer uma dentre as SEQ ID NO: 15 a 20 e 63 a 66.
BR112020006786-5A 2017-10-06 2018-10-09 composições e métodos para editar rna BR112020006786A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762569376P 2017-10-06 2017-10-06
US62/569,376 2017-10-06
PCT/US2018/055029 WO2019071274A1 (en) 2017-10-06 2018-10-09 COMPOSITIONS AND METHODS FOR EDITING RNA

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020006786A2 true BR112020006786A2 (pt) 2020-10-06

Family

ID=65994386

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020006786-5A BR112020006786A2 (pt) 2017-10-06 2018-10-09 composições e métodos para editar rna

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20200291383A1 (pt)
EP (2) EP4389889A3 (pt)
JP (2) JP2021502058A (pt)
CN (2) CN111629786B (pt)
AU (1) AU2018345919A1 (pt)
BR (1) BR112020006786A2 (pt)
CA (1) CA3076740A1 (pt)
IL (1) IL273817A (pt)
WO (1) WO2019071274A1 (pt)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017220751A1 (en) 2016-06-22 2017-12-28 Proqr Therapeutics Ii B.V. Single-stranded rna-editing oligonucleotides
EP3589751A4 (en) 2017-03-03 2021-11-17 The Regents of The University of California RNA TARGETING OF MUTATIONS VIA SUPPRESSOR RNA AND DEAMINASES
EP3844274A1 (en) 2018-08-28 2021-07-07 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Neoantigen engineering using splice modulating compounds
JP2022533673A (ja) * 2019-05-21 2022-07-25 ビーム セラピューティクス インク． プログラム可能塩基エディターシステムを用いた一塩基多型編集法
CA3159944A1 (en) 2019-12-02 2021-06-10 David HUSS Therapeutic editing
TW202136508A (zh) * 2019-12-09 2021-10-01 日商安斯泰來製藥股份有限公司 用於編輯目標rna之附加有功能性領域之反義型嚮導rna
EP4150076A1 (en) * 2020-05-15 2023-03-22 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
WO2022078569A1 (en) * 2020-10-12 2022-04-21 Eberhard Karls Universität Tübingen Artificial nucleic acids for rna editing
CN114380918B (zh) * 2020-10-19 2023-03-31 上海交通大学 一种目标rna单碱基编辑的系统和方法
US20240150754A1 (en) 2020-12-25 2024-05-09 Astellas Pharma Inc. Guide rna for editing polyadenylation signal sequence of target rna
WO2022256283A2 (en) * 2021-06-01 2022-12-08 Korro Bio, Inc. Methods for restoring protein function using adar
WO2023029532A1 (en) * 2021-08-30 2023-03-09 Huigene Therapeutics Co., Ltd. Engineered cas6 protein and uses thereof
CN113846102B (zh) * 2021-10-21 2024-05-28 徐州医科大学 一种rna编辑系统及其编辑方法与应用
EP4423274A2 (en) * 2021-10-26 2024-09-04 Shape Therapeutics Inc. Rna-editing compositions and methods of use
WO2023152371A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 Proqr Therapeutics Ii B.V. Guide oligonucleotides for nucleic acid editing in the treatment of hypercholesterolemia
WO2023173089A1 (en) * 2022-03-10 2023-09-14 Korro Bio, Inc. Compositions and methods for nucleic acid editing
WO2023196274A1 (en) * 2022-04-07 2023-10-12 Trustees Of Boston University Compositions and methods relating to nucleic acid interaction reporters
WO2024013361A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Proqr Therapeutics Ii B.V. Oligonucleotides for adar-mediated rna editing and use thereof
WO2024013360A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Proqr Therapeutics Ii B.V. Chemically modified oligonucleotides for adar-mediated rna editing
GB202215614D0 (en) 2022-10-21 2022-12-07 Proqr Therapeutics Ii Bv Heteroduplex rna editing oligonucleotide complexes
WO2024099575A1 (en) * 2022-11-11 2024-05-16 Eberhard Karls Universität Tübingen Artificial nucleic acids for site-directed editing of a target rna
WO2024110565A1 (en) 2022-11-24 2024-05-30 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of hereditary hfe-hemochromatosis
GB202218090D0 (en) 2022-12-01 2023-01-18 Proqr Therapeutics Ii Bv Antisense oligonucleotides for the treatment of aldehyde dehydrogenase 2 deficiency
WO2024121373A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of cardiovascular disease
GB202300865D0 (en) 2023-01-20 2023-03-08 Proqr Therapeutics Ii Bv Delivery of oligonucleotides
WO2024175550A1 (en) 2023-02-20 2024-08-29 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of atherosclerotic cardiovascular disease
CN118615431A (zh) * 2023-03-08 2024-09-10 广州医科大学 一种抗原表位在制备治疗肿瘤的产品中的应用
CN118620958A (zh) * 2023-03-08 2024-09-10 广州医科大学 一种抗原表位的制备方法
GB202304363D0 (en) 2023-03-24 2023-05-10 Proqr Therapeutics Ii Bv Chemically modified antisense oligonucleotides for use in RNA editing
WO2024206175A1 (en) 2023-03-24 2024-10-03 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of neurological disorders
WO2024200472A1 (en) 2023-03-27 2024-10-03 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for the treatment of liver disease
CN117095752B (zh) * 2023-08-21 2024-03-19 基诺创物(武汉市)科技有限公司 保持密码子偏好性的dna蛋白质编码区域流式数据存储方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003257181A1 (en) * 2002-08-05 2004-02-23 University Of Rochester Protein transducing domain/deaminase chimeric proteins, related compounds, and uses thereof
US9650627B1 (en) * 2012-07-19 2017-05-16 University Of Puerto Rico Site-directed RNA editing
EP3031921A1 (en) * 2012-12-12 2016-06-15 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
US8697359B1 (en) * 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
EP3323890A4 (en) * 2015-07-14 2019-01-30 Fukuoka University METHOD FOR INDUCING SITE SPECIFIC RNA MUTATIONS, TARGET EDITION GUIDING RNA-GUIDE USED IN THE METHOD, AND TARGET EDITING GUID-RNA TARGET RNA COMPLEX
DE102015012522B3 (de) * 2015-09-26 2016-06-02 Eberhard Karls Universität Tübingen Verfahren und Substanzen zur gerichteten RNA-Editierung
KR102501980B1 (ko) * 2016-09-01 2023-02-20 프로큐알 테라퓨틱스 Ⅱ 비.브이. 화학적으로 변형된 단일 가닥 rna-편집 올리고뉴클레오타이드

Also Published As

Publication number Publication date
CN118421665A (zh) 2024-08-02
WO2019071274A1 (en) 2019-04-11
US20200291383A1 (en) 2020-09-17
EP3691747A1 (en) 2020-08-12
EP3691747A4 (en) 2021-10-06
IL273817A (en) 2020-05-31
JP2023145597A (ja) 2023-10-11
CN111629786A (zh) 2020-09-04
EP4389889A3 (en) 2024-09-04
CA3076740A1 (en) 2019-04-11
EP4389889A2 (en) 2024-06-26
AU2018345919A1 (en) 2020-05-07
JP2021502058A (ja) 2021-01-28
CN111629786B (zh) 2024-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112020006786A2 (pt) composições e métodos para editar rna
Hordeaux et al. The GPI-linked protein LY6A drives AAV-PHP. B transport across the blood-brain barrier
KR20220007056A (ko) 뇌에서 증진된 특이성을 갖는 바이러스 조성물
KR20200039617A (ko) 아데노-연관 바이러스 캡시드 변이체 및 이의 사용 방법
Pryadkina et al. A comparison of AAV strategies distinguishes overlapping vectors for efficient systemic delivery of the 6.2 kb Dysferlin coding sequence
US20210395776A1 (en) Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof
KR20110086553A (ko) 포르포빌리노겐 디아미나아제 유전자 치료
TW202033224A (zh) 藉靶向肌營養相關蛋白基因治療肌肉萎縮症之方法
CN112451669A (zh) Ptbp1抑制剂在预防和/或治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病中的应用
JP2021500347A (ja) 神経変性の疾患または障害のための治療戦略としてのドミナントネガティブｓａｒｍ１分子
JP2022543722A (ja) 機能的ニューロン死に関連する神経系疾患の予防および／または治療におけるＰｔｂｐ１阻害剤の使用
BR112020015798A2 (pt) Composições de vírus adeno-associado para restaurar função de gene da pah e métodos de uso das mesmas
TW202112797A (zh) 經由靶向lama1基因治療肌肉萎縮症的方法
CN112386699A (zh) Ptbp1抑制剂在预防和/或治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病中的应用
CN113395975A (zh) 用于靶向血脑屏障的组合物和方法
Qudrat et al. Focus: Sex and Gender Health: Theoretical Approaches to Lentiviral Mediated Neurotrophin Delivery in Potential Treatments of Parkinson’s Disease
WO2019204457A1 (en) Zinc finger protein compositions for modulation of huntingtin (htt)
WO2020187272A1 (zh) 一种用于基因治疗的融合蛋白及其应用
KR20220071248A (ko) 알파-시누클레인 발현을 억제시키기 위한 아연 핑거 단백질 전사 인자
WO2022232442A2 (en) Multiplex crispr/cas9-mediated target gene activation system
KR20230080439A (ko) 알파-시누클레인 발현을 억제시키기 위한 신규 아연 핑거 단백질 전사 인자
KR20230123925A (ko) Neurod1 및 dlx2 벡터
CN116761812A (zh) Neurod1和dlx2载体
TW202221119A (zh) Dna結合域轉活化子及其用途
JP2024528997A (ja) 放射線誘発性唾液機能低下を予防するためのａｑｐ１遺伝子療法

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]