BR112020002260A2 - método para facilitar o diagnóstico pré-natal de um distúrbio genético a partir de uma amostra materna associada a uma gestante, método para facilitação de caracterização de uma condição médica a partir de uma amostra compreendendo moléculas alvo e método para quantificação de alvo biológico a partir de uma amostra compreendendo moléculas alvo - Google Patents
método para facilitar o diagnóstico pré-natal de um distúrbio genético a partir de uma amostra materna associada a uma gestante, método para facilitação de caracterização de uma condição médica a partir de uma amostra compreendendo moléculas alvo e método para quantificação de alvo biológico a partir de uma amostra compreendendo moléculas alvo Download PDFInfo
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Abstract
As realizações de um método e/ou sistema podem incluir a geração de um conjunto de moléculas associadas ao alvo (por exemplo, moléculas em pico) associado a um ou mais alvos biológicos; geração de uma ou mais misturas em pico com base no processamento do conjunto de moléculas associadas ao alvo com uma ou mais amostras que incluem o um ou mais alvos biológicos; realização de uma ou mais operações de sequenciamento de Sanger na uma ou mais misturas em pico; determinação de uma ou mais métricas de abundância com base nos resultados relacionados à cromatografia decorrentes da uma ou mais operações de sequenciamento de Sanger; e/ou facilitação de caracterização de uma ou mais condições médicas baseadas na uma ou mais métricas de abundância.
Description
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório norte-americano número de série 62/541.565, depositado em 4 de agosto de 2017, o qual é pelo presente incorporado em sua totalidade por esta referência.
[002] Esta revelação se refere geralmente ao campo de genomas.
[003] As Figuras 1A-1C incluem representações de fluxograma de variações de realizações de um método;
[004] A Figura 2 inclui uma representação esquemática de uma variação de uma realização de um método;
[005] A Figura 3 inclui exemplos específicos de uma sequência alvo, uma sequência associada ao alvo e primers associados;
[006] A Figura 4 inclui um exemplo específico de um primer PCR que inclui uma sequência tipo grampo;
[007] As Figuras 5A-5E incluem um exemplo específico de um produto decorrente de amplificação com um primer PCR que inclui uma sequência tipo grampo, em uma variação de uma realização do método;
[008] As Figuras 6A-6B incluem exemplos específicos de resultados relacionado à cromatografia e métricas de abundância;
[009] As Figuras 7A-7B incluem exemplos específicos de resultados relacionado à cromatografia e métricas de abundância;
[010] A Figura 8 inclui uma representação esquemática de uma variação de uma realização de um método;
[011] A Figura 9 inclui uma representação esquemática de uma variação de uma realização de um método;
[012] A Figura 10 inclui representações gráficas de porções de uma variação de uma realização de um método;
[013] A Figura 11 inclui um exemplo específico de uma sequência alvo e sequência associada ao alvo;
[014] As Figuras 12A-12B incluem representações gráficas de resultados decorrentes da validação de porções de uma variação de uma realização de um método;
[015] As Figuras 13A-13B incluem uma representação esquemática de porções de uma variação de uma realização de um método.
[016] A descrição a seguir das realizações (por exemplo, incluindo variações de realizações, exemplos de realizações, exemplo específicos de realizações, demais variantes adequadas, etc.) não pretende ser limitada a estas realizações, mas, ao contrário, possibilitar qualquer técnico no assunto à realização e uso.
1. Visão Geral.
[017] Como mostrado nas Figuras 1A-1C e 2, as realizações de um método 100 (por exemplo, para determinação de abundância de alvo biológico; para facilitação de caracterização de uma ou mais condições, etc.) pode incluir:
geração de um conjunto de moléculas associadas ao alvo (por exemplo, moléculas em pico, etc.) associado a um ou mais alvos biológicos S110; geração de uma ou mais misturas em pico S120 (por exemplo, com base no processamento do conjunto de moléculas associadas ao alvo com uma ou mais amostras, como amostras biológicas e/ou amostras sintéticas, inclusive o um ou mais alvos biológicos, etc.), como onde a uma ou mais misturas em pico podem ser configuradas para facilitar a precisão elevada (por exemplo, através da minimização de desvios de amplificação, como com base na co-amplificação das moléculas associadas ao alvo com o um ou mais alvos biológicos; etc.) e/ou destacabilidade elevada (por exemplo, através da compatibilidade com as tecnologias de sequenciamento, como o sequenciamento de Sanger, etc.); realização de uma ou mais operações de sequenciamento S130 (por exemplo, sequenciamento de Sanger, etc.), como com base na uma ou mais misturas em pico; e/ou determinação uma ou mais métricas de abundância S140 (por exemplo, uma proporção de abundância de moléculas alvo relativas às moléculas associadas ao alvo; etc.), como com base na uma ou mais operações de sequenciamento para a uma ou mais misturas em pico (por exemplo, com base nas intensidades relativas de pico de cromatografia entre as bases endógenas e as bases em pico, etc.).
[018] Adicional ou alternativamente, as realizações do método 100 podem incluir um ou mais entre: processamento de um conjunto de moléculas associadas à referência S115 (por exemplo, associadas às moléculas de referência na amostra, onde as métricas de abundância determinadas em relação ao conjunto de moléculas associadas à referência podem ser comparadas às métricas de abundância relacionadas ao alvo para facilitação de caracterizações e/ou tratamentos para uma ou mais condições; etc.); facilitação da caracterização de uma ou mais condições S150, como com base na uma ou mais métricas de abundância; facilitação de tratamento S160 (por exemplo, da uma ou mais condições com base na uma ou mais métricas de abundância, etc.); e/ou validação de S105, como a validação de uma ou mais porções de realizações do método 100; e/ou qualquer outro processo adequado.
[019] Em um exemplo específico, o método 100 (por exemplo, para facilitação de diagnóstico pré-natal de um distúrbio genético, como um ou mais distúrbios cromossômicos e/ou distúrbios genéticos únicos, a partir de uma amostra materna associada a uma gestante, etc.) pode incluir: geração de um conjunto de moléculas associadas ao alvo que inclui uma sequência associada ao alvo incluindo: uma região associada ao alvo com similaridade de sequência a uma região de sequência alvo de uma sequência alvo de um alvo biológico, onde o alvo biológico está associado ao distúrbio genético; e uma região de variação alvo com disparidade de sequência para uma região de sequência da sequência alvo; geração de uma mistura em pico co-amplificada com base na co-amplificação do conjunto de moléculas associadas ao alvo e moléculas de ácido nucleico decorrentes da amostra materna, onde as moléculas de ácido nucleico incluem a região de sequência alvo; sequenciamento de Sanger da mistura em pico co-amplificada para determinar pelo menos um resultado relacionado à cromatografia (por exemplo, uma cromatografia, picos correspondendo a bases, intensidades dos picos, etc.) incluindo picos associados à região associada ao alvo, à região de sequência alvo do alvo biológico, à região de variação alvo e à região de sequência do alvo biológico;
determinação de um conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo (e/ou outras métricas de abundância adequadas; etc.), onde cada proporção de abundância associada ao alvo, do conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo, corresponde a um par diferente de uma base da sequência associada ao alvo e uma base da sequência alvo (por exemplo, onde as bases do par compartilham um mesmo tipo de base; onde as bases do par compartilham tipos diferentes de base; etc.), onde a determinação do conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo inclui, para cada um dos pares diferentes: determinação de uma métrica de intensidade máxima (por exemplo, intensidade máxima para o pico; intensidade geral para o pico; etc.) para a base da sequência associada ao alvo do par, com base no pelo menos um resultado relacionado à cromatografia (por exemplo, com base nos valores de intensidade para picos, determinada baseado no sequenciamento de Sanger; etc.); determinação de uma métrica de intensidade máxima para a base da sequência alvo do par, com base no pelo menos um resultado relacionado à cromatografia; e determinação de uma proporção de abundância associada ao alvo (por exemplo, uma proporção da métrica de intensidade máxima para a base da sequência alvo com a métrica de intensidade máxima para a base da sequência molecular associada ao alvo; etc.) do conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo, com base na métrica de intensidade máxima para a base da sequência associada ao alvo e na métrica de intensidade máxima para a base da sequência alvo; determinação de uma proporção geral de abundância associada ao alvo com base no conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo; e/ou facilitação do diagnóstico pré-natal do distúrbio genético com base em uma comparação entre a proporção geral de abundância associada ao alvo e uma proporção geral de abundância associada à referência (e/ou outras métricas de abundância associadas à referência adequadas; etc.) descrevendo a abundância de uma referência biológica relativa às moléculas associadas à referência.
[020] Em um exemplo específico, o método 100 (por exemplo, para facilitação de caracterização de uma condição médica, como um ou mais distúrbios genéticos e/ou condições cancerosas, decorrente de uma amostra que inclui moléculas alvo, etc.) pode incluir: geração de um conjunto de moléculas associadas ao alvo que inclui uma sequência associada ao alvo incluindo: uma região associada ao alvo com similaridade de sequência com uma região de sequência alvo de uma sequência alvo de um alvo biológico, onde o alvo biológico está associado ao distúrbio genético; e uma região de variação alvo com disparidade de sequência com uma região de sequência da sequência alvo; realização de sequenciamento de Sanger com base no conjunto de moléculas associadas ao alvo e moléculas alvo que incluem a sequência alvo para determinar pelo menos um resultado relacionado à cromatografia que inclui um conjunto de picos associado à região associada ao alvo, à região de sequência alvo do alvo biológico, à região de variação alvo e à região de sequência do alvo biológico; determinação de um conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo (e/ou outras métricas de abundância adequadas; etc.) para um conjunto de pares diferentes de bases, com base no conjunto de picos do pelo menos um resultado relacionado à cromatografia, onde cada par diferente de bases do conjunto de pares diferentes de bases corresponde a um par de uma base da sequência associada ao alvo e uma base da sequência alvo; e/ou facilitação da caracterização (por exemplo, detecção, diagnóstico, etc.) da condição médica baseada no conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo e um conjunto de proporções de abundância associadas à referência (e/ou outras métricas de abundância associadas à referência adequadas; etc.) descrevendo a abundância de uma referência biológica relativa às moléculas associadas à referência (por exemplo, facilitação da caracterização baseada em uma comparação entre uma proporção geral de abundância associada ao alvo e uma proporção geral de abundância associada à referência; onde a proporção geral de abundância associada ao alvo pode ser determinada com base na combinação do conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo; onde a proporção geral de abundância associada à referência pode ser determinada com base na combinação do conjunto de proporções de abundância associadas à referência; etc.).
[021] Em um exemplo específico, o método 100 (por exemplo, para quantificação de alvo biológico decorrente de uma amostra que inclui moléculas alvo, etc.) pode incluir: determinação de pelo menos um resultado relacionado à cromatografia associado a um conjunto de moléculas associadas ao alvo e um conjunto de moléculas alvo, com base no sequenciamento de Sanger (por exemplo, por terceiros, por qualquer entidade adequada; etc.) associado ao conjunto de moléculas associadas ao alvo e ao conjunto de moléculas alvo, onde o conjunto de moléculas associadas ao alvo inclui uma sequência associada ao alvo que inclui: uma região associada ao alvo com similaridade de sequência com uma região de sequência alvo de uma sequência alvo de um alvo biológico, onde o conjunto de moléculas alvo inclui a região de sequência alvo; e uma região de variação alvo com disparidade de sequência com uma região de sequência da sequência alvo; determinação de um conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo (e/ou outras métricas de abundância adequadas; etc.) para diferentes conjuntos de bases, baseados no pelo menos um resultado relacionado à cromatografia, onde cada conjunto diferente de bases, decorrente dos diferentes conjuntos de bases, inclui pelo menos uma base da sequência associada ao alvo e pelo menos uma base da sequência alvo; e/ou determinação de uma métrica geral de abundância que descreve uma abundância do alvo biológico para a amostra, com base no conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo.
[022] Em um exemplo específico, o método 100 pode incluir: geração de um conjunto de ácidos nucleicos associados ao alvo (por exemplo, ácidos nucleicos em pico; etc.), onde os ácidos nucleicos incluem uma ou mais regiões associadas ao alvo (por exemplo, o conjunto de ácidos nucleicos associados ao alvo que inclui uma sequência de ácido nucleico associada ao alvo incluindo a região associada ao alvo; regiões de sequência que incluem uma sequência de nucleotídeo que corresponde com uma região de sequência alvo de uma sequência alvo de uma molécula alvo na amostra, onde as moléculas alvo correspondem ao alvo biológico; etc.) associadas a um cromossomo alvo (por exemplo, cromossomo 21; onde diferentes conjuntos de ácidos nucleicos associados ao alvo podem ser gerados, onde diferentes conjuntos podem corresponder a diferentes locais do cromossomo 21 e podem incluir diferentes regiões associadas ao alvo com similaridade de sequência com as diferentes regiões de sequência alvo de sequências alvo,
onde as diferentes regiões de sequência alvo ou as sequências alvo podem corresponder a diferentes locais; etc.), e incluem uma ou mais regiões de variação (por exemplo, inserções de sequência; exclusões de sequência; sequências de variação com uma pluralidade de bases misturas em relação a uma sequência alvo, como uma sequência alvo que identifica o cromossomo 21, etc.); combinação do conjunto de ácidos nucleicos associados ao alvo com um conjunto de ácidos nucleicos alvo (por exemplo, moléculas endógenas de DNA que identificam o cromossomo 21) decorrente de uma amostra (por exemplo, amostra sérica materna de uma gestante; etc.); co-amplificação do conjunto de ácidos nucleicos associados ao alvo e do conjunto de ácidos nucleicos alvo (por exemplo, para cada conjunto diferente de ácidos nucleicos associados ao alvo correspondendo a um local diferente, co-amplificação do conjunto de ácidos nucleicos associados ao alvo com o conjunto de ácidos nucleicos alvo correspondendo aos locais; etc.) com base em uma conjunto de primers associados ao alvo (por exemplo, visando uma sequência compartilhada pelos ácidos nucleicos associados ao alvo e pelos ácidos nucleicos alvo), gerando assim uma ou mais misturas em pico; realização do sequenciamento de Sanger na uma ou mais misturas em pico (e/ou no conjunto de ácidos nucleicos associados ao alvo separadamente, nos ácidos nucleicos alvo separadamente e/ou outras moléculas adequadas) para determinar um ou mais resultados relacionado à cromatografia; realização de análise de estimativa estatística (por exemplo, regressão linear geral, quadrados mínimos não negativos, detecção compressiva, consenso aleatório de amostra; etc.) no um ou mais resultados relacionado à cromatografia (por exemplo, cromatografias decorrentes do sequenciamento de Sanger; dados de pico, como dados sobre a intensidade de pico que incluem métricas de intensidade máxima, do sequenciamento de Sanger; etc.) para pares de base de sequência alvo e base de sequência associada ao alvo (por exemplo, para pares do mesmo tipo de base correspondendo a uma posição sequencial original para a sequência alvo e uma posição sequencial alterada para a sequência associada ao alvo, como onde a região de variação da sequência associada ao alvo inclui uma ou mais inserções e/ou exclusões; nas posições correspondentes à região de variação, como onde a região de variação inclui um conjunto de tipos de base misturados em relação à sequência alvo; etc.); para cada par, extraindo uma proporção de abundância individual de matéria endógina em pico com base na comparação de uma métrica de intensidade máxima (por exemplo, uma intensidade máxima para o pico; uma intensidade geral para o pico; etc.) (e/ou outro resultado de sequencialmente adequado) para a base de sequência alvo com uma métrica de intensidade máxima (e/ou outro resultado de sequenciamento adequado) para a base de sequência associada ao alvo; geração de uma proporção geral de abundância com base nas proporções de abundância individuais (por exemplo, cálculo de média de proporções de abundância individuais para pares diferentes da base de sequência alvo e da base de sequência associada ao alvo associadas a uma pluralidade de locais alvo para o cromossomo 21; cálculo de média de proporções de abundância entre os locais; etc.); e facilitação de uma ou mais caracterizações de uma ou mais condições (por exemplo, diagnóstico da síndrome de Down, outras caracterizações de condição, análises dos resultados de sequenciamento, etc.) com base nas proporções de abundância (por exemplo, com base na comparação da proporção geral de abundância para o cromossomo 21 com uma proporção geral de abundância de referência calculada para um cromossomo de referência, como o cromossomo 18, com base no processamento de moléculas associadas à referência com moléculas de referência decorrentes da amostra de acordo com as porções de uma realização do método 100; onde a comparação pode facilitar a caracterização da síndrome de Down e da síndrome de Edwards; etc.).
[023] As realizações do método 100 e/ou sistema 200 podem funcionar para melhorar o custo-eficácia (por exemplo, através alavancando a tecnologia de sequenciamento de Sanger, etc.), destacabilidade (por exemplo, em países com acesso limitado aos sistemas de sequenciamento de genoma, etc.) e precisão (por exemplo, associada ao coeficiente de variação inferior a 1% e/ou qualquer precisão adequada, etc.) em relação à determinação de métricas de abundância (por exemplo, contagens moleculares) para um ou mais alvos biológicos. As realizações do método 100 e/ou sistema 200 podem funcionar, adicional ou alternativamente, para alavancar as métricas de abundância para caracterizar (por exemplo, diagnosticar) e/ou tratar (por exemplo, através da determinação de tratamento, avaliação de tratamento e modificação ao longo do tempo, etc.) uma ou mais condições. As realizações do método 100 e/ou sistema 200 podem funcionar, adicional ou alternativamente, para superar questões com abordagens convencionais, como aumentar a capacidade de multiplexação nas aplicações (por exemplo, PCR digital), melhorar a precisão nas aplicações (por exemplo, qPCR) e/ou quaisquer melhorias adequadas. No entanto, as realizações podem incluir qualquer funcionalidade adequada.
[024] As realizações do método 100 e/ou sistema
200 podem ser usadas em associação a uma ou mais condições (por exemplo, em associação à caracterização, diagnóstico, tratamento e/ou realização de processos relacionados a uma ou mais condições; etc.), onde as condições podem incluir e/ou de outro modo ser associadas a um ou mais entre: teste pré-natal não invasivo (NIPT) (por exemplo, em relação à triagem genética quanto à presença de anormalidades cromossômicas que incluem aneuploidia, como trissomia 21 ou síndrome de Down, trissomia 18 ou síndrome de Edwards, trissomia 13 ou síndrome de Patau, aneuploidias do cromossomo sexual, como síndrome de Turner, outras aneuploidias adequadas; anormalidades cromossômicas, inclusive síndrome de DiGeorge; em relação à triagem genética quanto aos distúrbios genéticos únicos; condições associadas a variante rara; etc.); outro teste pré-natal; análise de aneuploidia e/ou outra análise adequada fora de um contexto pré-natal; distúrbios genéticos (por exemplo, distúrbios genéticos únicos que incluem anemia falciforme e/ou condições associadas a variante rara; anormalidades cromossômicas; distúrbios associados à amplificação de gene; exclusão de gene; anormalidades cromossômicas parciais; síndrome de exclusão 22q11.2 ou síndrome de DiGeorge; síndrome de Charcot-Marie- Tooth, fibrose cística, doença de Huntington; distrofia muscular de Duchenne; hemofilia, talassemia; condições associadas a variante rara, etc.), outras condições associadas a anormalidades cromossômicas (por exemplo, DNA cromossômico adicional, ausente, irregular, etc.), condições associadas a variante rara, câncer (por exemplo, através de análise de amplificações de gene de oncogenes em biópsias tumorais; através de análises associadas a um ou mais entre HER2, MET, MYC-N, MYC-C, EGFR, FGFR1, ER/PR, KRAS, UGT1A1, e-KIT, CD20,
CD30, FIP1L1-PDGFRalfa, PDGFR, VCR/ABL, PML/RAR-alfa, TPMT, UGT1A1, EML4/ALK, BRAF, e/ou quaisquer outros oncogenes adequados, biomarcadores de câncer, e/ou outros alvos associados ao câncer; análise de amostras de biópsia para avaliar a prevalência de DNA tumoral circulante ao longo do tempo na determinação e/ou avaliação de tratamentos, como herceptin; etc.), e/ou quaisquer outras condições adequadas. As condições podem incluir, adicional ou alternativamente: condições psiquiátricas ou comportamentais (por exemplo, um transtorno psicológico; depressão; psicose; etc.); condições relacionadas à comunicação (por exemplo, transtorno da linguagem expressiva; gagueira; transtorno fonológico; transtorno de autismo; condições de voz; condições de audição; condições oculares; etc.); condições relacionadas ao sono (por exemplo, insônia, apneia do sono; etc.); condições relacionadas ao sistema cardiovascular (por exemplo, doença arterial coronária; pressão arterial elevada; etc.); condições relacionadas ao metabolismo (por exemplo, diabetes, etc.), condições relacionadas a reumatismo (por exemplo, artrite, etc.); condições relacionadas ao peso (por exemplo, obesidade, etc.); condições relacionadas a dor; condições endócrino- relacionadas; condições genético-relacionadas; doença crônica e/ou qualquer outro tipo adequado de condições.
[025] As realizações do método 100 e/ou sistema 200 podem transformar, adicional ou alternativamente, entidades (por exemplo, amostras, alvos, referências, moléculas sintetizadas, usuários, sistemas de manipulação de amostra, sistemas de sequenciamento, sistemas informáticos, etc.) em diferentes estados ou objetos. Por exemplo, o método 100 pode incluir a sintetização de moléculas em pico (por exemplo, moléculas associadas ao alvo, etc.) que incluem regiões compartilhadas (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo compartilhada) e regiões de variação (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo misturada) em relação a um alvo biológico, onde tais moléculas em pico podem ser processadas junto a moléculas alvo (por exemplo, co-amplificadas com as moléculas alvo, usando os mesmos primers, etc.) para transformação em formas adequadas para determinação de abundância precisa enquanto minimiza os desvios de amplificação (por exemplo, onde ocorre co-amplificação na mesma eficiência para as moléculas associadas ao alvo e as moléculas alvo; etc.), como através da realização de sequenciamento de Sanger e análise computacional associada com base nos resultados decorrentes do sequenciamento de Sanger com as misturas em pico.
Estes processos podem possibilitar a quantificação de abundância anteriormente não executável (por exemplo, para moléculas alvo, para moléculas de referência, etc.), caracterizações de condição (por exemplo, melhora de diagnósticos para uma ou mais condições; etc.), e/ou tratamento (por exemplo, através da facilitação de precisão aperfeiçoada para quantificação significativa e comparações de moléculas em pico e moléculas alvo, como moléculas alvo associadas a diferentes locais; através da facilitação de determinação de abundância ao longo do tempo para a pressão de tratamento e avaliação ao longo do tempo; etc.). No entanto, as realizações do método 100 e/ou sistema 200 podem prover quaisquer outros benefícios adequados, como no contexto de uso de componentes não generalizados de porções de realizações do sistema 200 para a realização de porções não convencionais das realizações do método 100.
[026] Adicional ou alternativamente, os dados aqui descritos (por exemplo, métricas de abundância; caracterizações; resultados de sequenciamento; proporções; identificadores; desenhos de molécula, como desenhos de molécula associada ao alvo, desenhos de molécula associada à referência, desenhos de primer, desenhos de experimento; desenhos de sequência; desenhos de região de sequência; resultados experimentais; resultados de validação; dados relacionados à condição; dados relacionados ao tratamento; etc.) podem ser associados a quaisquer indicadores temporais adequados (por exemplo, segundos, minutos, horas, dias, semanas, períodos de tempo, time points, registros de hora/data, etc.) que incluem um ou mais: indicadores temporais indicando quando os dados foram coletados, determinados, transmitidos, recebidos e/ou de outro modo processados; indicadores temporais provendo contexto ao conteúdo descrito pelos dados, como indicadores temporais indicando diferentes estágios de geração de mistura em pico e/ou preparação de biblioteca de sequenciamento adequada e/ou sequenciamento; alterações nos indicadores temporais (por exemplo, dados ao longo do tempo, como métricas de abundância ao longo do tempo, que podem ser usadas na facilitação de caracterização de uma ou mais condições e/ou facilitação de tratamento, como em relação ao monitoramento de condição cancerosa; alterações nos dados; padrões dos dados; tendências dos dados; extrapolação dos dados e/ou outra previsão; etc.); e/ou quaisquer outros indicadores adequados relacionados ao tempo.
[027] Adicional ou alternativamente, parâmetros, métricas, inserções, resultados e/ou outros dados adequados aqui descritos podem ser associados aos tipos de valor que incluem qualquer um ou mais entre: pontuações, valores binários, classificações, níveis de confiança, identificadores (por exemplo, identificadores de amostra, identificadores moleculares para quaisquer moléculas adequadas aqui descritas, etc.), valores ao longo de um espectro, e/ou quaisquer outros tipos adequados de valores. Quaisquer tipos adequados de dados aqui descritos podem ser usados como inserções, gerados como resultados e/ou manipulados de qualquer forma adequada para quaisquer componentes adequados associados a realizações do método 100 e/ou sistema 200.
[028] Um ou mais casos e/ou porções de realizações do método 100 e/ou processos aqui descritos podem ser realizados de forma assíncrona (por exemplo, sequencialmente), concomitantemente (por exemplo, em paralelo; processando concomitantemente amostras de uma forma automatizada e multiplexada; processando de forma concomitantemente computacional os resultados produzidos pelo sequenciamento de Sanger, como dados de pico e/ou de cromatografias para melhorar a capacidade de processamento do sistema; qualquer processamento computacional concomitante adequado para qualquer número adequado de amostras, misturas, resultados de sequenciamento e/ou outros componentes; preparação de amostra multiplex e/ou operações de sequenciamento; etc.), em relação temporal a um evento acionador e/ou em qualquer outra ordem adequada em qualquer momento e frequência adequados e/ou uso de um ou mais exemplos do sistema 200, componentes e/ou entidades aqui descritos.
[029] As realizações do sistema 200 podem incluir uma ou mais redes de manipulação de amostra configuradas para gerar moléculas (por exemplo, moléculas associadas ao alvo; moléculas associadas à referência; etc.), processar amostras (por exemplo, amostras biológicas; amostras sintéticas; amostras de usuários; etc.), e/ou realizar outros processos adequados; um ou mais sistemas de sequenciamento (por exemplo, sistemas de sequenciamento de Sanger; etc.) configurados para sequenciar material genético decorrentes de misturas em pico, outras misturas e amostras adequadas, e/ou quaisquer componentes adequados; um ou mais sistemas computacionais (por exemplo, sistema informático remoto, sistema informático local, etc.) configurados pra analisar os resultados de sequenciamento do um ou mais sistemas de sequenciamento (por exemplo, na determinação de uma ou mais métricas de abundância; na facilitação de caracterizações de uma ou mais condições; na facilitação de tratamento; etc.); e/ou quaisquer outros componentes adequados. As porções de realizações do método 100 e/ou sistema 200 são realizadas de preferência por uma primeira parte, mas podem, adicional ou alternativamente, ser realizadas por um ou mais terceiros, usuários e/ou quaisquer entidades adequadas (por exemplo, prestadores de cuidados, técnicos laboratoriais, etc.).
[030] No entanto, o método 100 e sistema 200 podem ser configurados de qualquer forma adequada.
2.1 Geração de moléculas associadas ao alvo.
[031] As realizações do método 100 podem incluir geração de uma ou mais moléculas associadas ao alvo S110 (por exemplo, associadas a um ou mais alvos biológicos, etc.), que podem funcionar para sintetizar uma ou mais moléculas que compartilham uma ou mais características (por exemplo, características de sequência, características funcionais, características estruturais, características evolutivas, etc.)
com o um ou mais alvos (por exemplo, alvos biológicos; etc.), que podem facilitar parâmetros de processamento de amostra similar (por exemplo, condições de sequenciamento de Sanger para o sequenciamento de uma mistura em pico que inclui as moléculas associadas ao alvo e as moléculas alvo, para sequenciamento das moléculas associadas ao alvo individualmente ou das moléculas alvo individualmente; parâmetros similares de amplificação durante amplificação baseada em PCR, como através da co-amplificação de moléculas associadas ao alvo e moléculas alvo, das moléculas associadas à referência e moléculas de referência; etc.) para reduzir desvios (por exemplo, desvios de amplificação, etc.) e/ou melhorar a precisão durante processamento à jusante (por exemplo, para estimativa estatística como regressão linear; análise de pico; associação e/ou identificação de pares e/ou conjuntos de bases de sequência diferente para facilitação da determinação de proporção de abundância; deconvolução; realização de diversos exemplos de realizações do método 100 ao longo do tempo; etc.).
[032] As moléculas associadas ao alvo incluem preferencialmente uma ou mais sequências associadas ao alvo (por exemplo, sequência de nucleotídeos; cada molécula associada ao alvo de um conjunto de moléculas associadas ao alvo correspondendo a uma sequência de molécula associada ao alvo igual ou similar; etc.), onde uma sequência associada ao alvo pode incluir uma ou mais regiões associadas ao alvo. Por exemplo, uma sequência associada ao alvo pode incluir uma região associada ao alvo com similaridade de sequência (por exemplo, similaridade de sequência total; similaridade de sequência superior a uma porcentagem e/ou quantidade limiar;
etc.) com uma ou mais regiões de sequências alvo de uma ou mais sequências alvo de um ou mais alvos biológicos (por exemplo, uma sequência alvo correspondendo ao alvo biológico; etc.), onde o um ou mais alvos biológicos podem ser associados a uma ou mais condições médicas.
[033] As regiões associadas ao alvo (e/ou as moléculas associadas ao alvo e/ou sequências associadas ao alvo) são preferencialmente associadas a (por exemplo, compartilhando sequência de nucleotídeos com; compartilhando conjuntos de bases com uma sequência alvo em posições correspondentes; capaz de ser processadas com; capaz de ser sequenciadas de Sanger com; capaz de ser amplificadas com, como através de co-amplificação; capaz de ser direcionada pelos mesmos primers; complementar a; de direcionamento; digitalmente associadas a em um sistema informático; etc.) um ou mais alvos biológicos e/ou moléculas alvo (por exemplo, moléculas alvo que correspondem a alvos biológicos; moléculas alvo que incluem regiões de sequência alvo de alvos biológicos; etc.). Alvos biológicos (por exemplo, marcadores alvo; correspondendo a, causando, contribuindo para, terapêuticos em relação a, correlacionados com e/ou de outro modo associados a uma ou mais condições médicas; alvos de interesse; alvos conhecidos ou identificados; alvos desconhecidos ou anteriormente não identificados; etc.) podem incluir quaisquer uma ou mais regiões de sequência alvo (por exemplo, sequências que identificam um cromossomo; sequências indicativas de uma condição; sequências que são invariáveis entre uma população e/ou qualquer conjunto de assuntos; sequências conservadas; sequências que incluem mutações, polimorfismos; sequência de nucleotídeos; sequências de aminoácidos; etc.), genes (por exemplo, associados a um ou mais distúrbios genéticos únicos, etc.), locais, cromossomos (por exemplo, associados a uma ou mais anormalidades cromossômicas; etc.), proteínas (por exemplo, proteínas séricas, anticorpos, etc.), peptídeos, carboidratos, lipídios, ácidos nucleicos (por exemplo, RNA extracelular, microRNA, RNA mensageiro, onde a determinação de abundância para alvos de RNA podem incluir operações adequadas de transcriptase reversa, etc.), células (por exemplo, células inteiras, etc.), metabólitos, produtos naturais, biomarcadores cancerosos (por exemplo, moléculas secretadas por tumores; moléculas secretadas em resposta à presença de câncer; etc.), biomarcadores de predisposição genética, biomarcadores diagnósticos, biomarcadores prognósticos, biomarcadores preditivos, outros biomarcadores moleculares, marcadores de expressão de gene, biomarcadores de imagem e/ou outros alvos adequados.
Os alvos estão preferencialmente associados às condições aqui descritas, e podem, adicional ou alternativamente, ser associados a uma ou mais condições que incluem: sintomas, causas, doenças, distúrbios e/ou quaisquer outros aspectos adequados associados a condições.
Em um exemplo, as moléculas associadas ao alvo podem incluir sequências de nucleotídeos idênticas a uma ou mais regiões de uma sequência alvo de uma molécula alvo (por exemplo, identificando o cromossomo 21), onde os primers podem direcionar concomitantemente as moléculas associadas ao alvo e as moléculas alvo ao direcionar as regiões idênticas (por exemplo, para facilitação de co-amplificação, como para reduzir os desvios de amplificação, etc.). Em um exemplo, como mostrado na Figura 3, uma sequência associada ao alvo (por exemplo, sequência “spk”), pode incluir regiões associadas ao alvo com similaridade de sequência com regiões de sequência alvo da sequência alvo (por exemplo, sequência “hg19”), como onde um conjunto de primers (por exemplo, para um primeiro processo PCR, para um segundo processo PCR; “chr21:14439004_PCR2_FP”, “chr21:14439076_PCR2_RP_hp”, “chr21:14439004_PCR1_FP”, “chr21:14439076_PCR1_RP”; primers de PCR que incluem uma ou mais sequências tipo grampo; etc.) pode direcionar a sequência associada ao alvo e a sequência alvo (por exemplo, para facilitação de co-amplificação e redução correspondente de desvios de amplificação; etc.). Em um exemplo, as moléculas associadas ao alvo podem incluir sequências com qualquer identidade adequada de sequência para as sequências alvo, onde qualquer número e/ou tipo de primers pode ser usado no direcionamento concomitante ou separado de moléculas associadas ao alvo e moléculas alvo.
Em um exemplo específico, os alvos biológicos podem incluir sequências alvo que identificam um cromossomo correspondente a uma condição associada a aneuploidia (por exemplo, em relação a NIPT para aneuploidias nos cromossomos 21, 18, 13, etc.). Em um exemplo específico, os alvos biológicos podem incluir sequências alvo que identificam oncogenes (por exemplo, em relação à determinação de métricas de condição cancerosa, avaliação de tratamentos contra o câncer, etc.). No entanto, os alvos (por exemplo, alvos biológicos, etc.) podem ser configurados de qualquer forma adequada.
Adicional ou alternativamente, as moléculas associadas ao alvo (por exemplo, regiões associadas ao alvo de moléculas associadas ao alvo; etc.) podem compartilhar quaisquer características adequadas (por exemplo, componentes, etc.) com alvos biológicos (por exemplo, com moléculas alvo correspondentes a alvos biológicos; etc.), como para facilitar parâmetros de processamento de amostra similar capazes de gerar subsequentemente comparações significativas entre as métricas de abundância para as moléculas associadas ao alvo e as moléculas alvo. No entanto, as moléculas associadas ao alvo podem ser configuradas de qualquer forma adequada.
[034] Como mostrado na Figura 11, as moléculas associadas ao alvo incluem preferencialmente regiões de variação alvo (por exemplo, regiões de variação de sequências associadas ao alvo de moléculas associadas ao alvo; cada molécula associada ao alvo incluindo uma ou mais regiões de variação; etc.), onde uma região de variação pode incluir características diferentes das características da molécula alvo. As regiões de variação incluem preferencialmente uma ou mais variações (por exemplo, inserções, exclusões, substituições, etc.), como variações que podem possibilitar a uma molécula correspondente associada ao alvo (por exemplo, a molécula associada ao alvo que inclui uma sequência associada ao alvo incluindo a região de variação; etc.) a proceder através de operações de processamento de amostra de forma similar às moléculas alvo correspondentes (por exemplo, ácidos nucleicos que incluem uma região de sequência alvo de um alvo biológico; etc.), enquanto a facilitação de diferenciação das moléculas associadas ao alvo das moléculas alvo (por exemplo, durante determinação de resultados de sequenciamento; durante determinação de métricas de abundância, como realização de análise de estimativa estatística; para facilitação de caracterizações e/ou tratamentos de uma ou mais condições médicas; durante pós-processamento de resultados relacionados à cromatografia decorrentes de sequenciamento de Sanger de misturas em pico e/ou amostras adequadas; como durante deconvolução de picos de sobreposição para pares de base associada ao alvo e base alvo, como pares que correspondem a posições de regiões de variação e/ou outras regiões adequadas; durante análises de estimativa estatística para adequar as abundâncias para sequências associadas ao alvo e sequências alvo; etc.). Esta diferenciação pode facilitar a determinação de diferentes métricas de abundância correspondentes que podem ser comparadas de forma significativa (por exemplo, comparação quantitativa entre intensidades de pico de pares e/ou conjuntos de bases; comparação e/ou combinação de métricas de abundância individuais, como para determinar a métrica geral de abundâncias; como para facilitação de caracterização e/ou tratamento; etc.) Em um exemplo, a região de variação pode incluir uma região de variação de sequência que inclui uma sequência de nucleotídeo diferente de uma região de sequência de uma sequência alvo de uma molécula alvo.
Em um exemplo específico, como mostrado na Figura 3, uma sequência associada ao alvo (por exemplo, sequência “spk”; etc.), pode incluir uma exclusão (por exemplo, uma exclusão de três nucleotídeos; etc.) em relação a uma região de sequência da sequência alvo (por exemplo, em relação a uma região de sequência “att” da sequência alvo “hg19”; etc.). Adicional ou alternativamente, as regiões de variação podem incluir número adequado de substituições, inserções, exclusões e/ou outras modificações de qualquer tamanho adequado (por exemplo, inserções e/ou exclusões de qualquer número adequado de nucleotídeos; qualquer número adequado de mutações de ponto, como mutações de ponto 10; etc.) em relação a quaisquer bases adequadas e/ou tipos de base.
[035] Em um exemplo específico, as regiões de variação podem facilitar a determinação de resultados de sequenciamento (por exemplo, intensidades de pico, área de pico, dados de pico, cromatografias, etc.) para qualquer base associada ao alvo (por exemplo, de uma sequência associada ao alvo; etc.) e/ou base alvo (por exemplo, de uma sequência alvo; etc.), como onde um resultado de sequenciamento (por exemplo, métrica de intensidade máxima) para uma base associada ao alvo em uma ou mais regiões (por exemplo, uma região associada ao alvo, uma região de variação, etc.) pode ser comparado a um resultado de sequenciamento (por exemplo, métrica de intensidade máxima, etc.) para uma base alvo correspondente em uma posição diferente (por exemplo, onde uma posição de uma base correspondente pode ser deslocada devido a uma ou mais inserções e/ou exclusões de uma região de variação; etc.) ou mesma posição (por exemplo, para substituições de ponto de uma região de variação; etc.), como para determinação de uma ou mais métricas de abundância.
Em um exemplo específico, como mostrado na Figura 11, a molécula associada ao alvo pode incluir uma sequência de nucleotídeo região de variação diferente da sequência de nucleotídeo alvo correspondente em 10 bases (por exemplo, onde a sequência alvo inclui uma região “TCTTGGATAG” e onde a região de variação inclui uma região “CTGGTTTAGA” em posições correspondentes, etc.), onde cada uma da 10 diferenças de base pode possibilitar uma proporção diferente individual de métrica de abundância de endógenos ao pico que pode ser usada na geração de uma proporção geral de abundância de precisão aperfeiçoada.
Adicional ou alternativamente, a região de variação pode incluir diferenças (por exemplo, em relação a uma sequência alvo, etc.) de qualquer número adequado de bases.
[036] As regiões de variação podem ser projetadas em coordenação com as regiões associadas ao alvo para facilitar a disparidade de sequência e similaridade de sequência apropriadas, respectivamente (por exemplo, determinação de características das regiões de variação e/ou regiões associadas ao alvo para facilitar os resultados aperfeiçoados de sequenciamento dado parâmetros de sequenciamento associados às tecnologias de sequenciamento, como sequenciamento de Sanger; etc.).
[037] As regiões de variação de sequência podem diferir em sequências alvo em qualquer número e tipo adequados de bases, em quaisquer posições adequadas (por exemplo, posições sequenciais, não sequenciais; etc.), entre quaisquer locais adequados, para qualquer cromossomo adequado e/ou outro alvo, e/ou podem diferir das sequências alvo em qualquer forma adequada. As regiões de variação de sequência podem incluir quaisquer uma ou mais entre substituições, inserções, exclusões, quaisquer tipos adequados de mutação e/ou quaisquer modificações adequadas (por exemplo, em relação a uma ou mais regiões de sequência de uma sequência alvo e/ou alvo biológico; etc.).
[038] Em uma variação, as regiões de variação de sequência podem incluir bases aleatoriamente misturadas (por exemplo, em proporção igual de tipos de base, em porções predeterminadas para os tipos de base, etc.). Em uma variação, o método 100 pode incluir seleção de bases da sequência alvo para modificar (por exemplo, com base na otimização dos resultados de saída do sequenciamento de Sanger, como através da seleção de uma sequência específica de tipos de base para contabilizar uma dependência de qualidade de saída de Sanger na ordem de bases e tipo de base em uma sequência; com base na facilitação de estimativa estatística, não mistura, deconvolução durante pós-processamento computacional; com base em diversas diferenças de base exigidas para se atingir uma precisão de métrica de abundância limiar durante minimização de desvios de amplificação; etc.).
[039] Adicional ou alternativamente, as regiões de variação podem incluir regiões de variação de não sequência, com características funcional, estrutural, evolutiva e/ou demais características adequadas diferentes das características da uma ou mais moléculas alvo (por exemplo, de qualquer tipo adequado, etc.). No entanto, as regiões de variação podem ser configuradas de qualquer forma adequada, e as moléculas associadas ao alvo podem incluir quaisquer regiões adequadas de sequência de nucleotídeos.
[040] Nas variações, as moléculas associadas ao alvo podem incluir uma ou mais regiões de sequenciamento (por exemplo, de moléculas de sequenciamento; etc.) configuradas para auxiliar nas operações de sequenciamento (por exemplo, operação de sistemas de sequenciamento; determinação de resultados de sequenciamento, como de precisão elevada e/ou de uma forma que possibilite comparação quantitativa e/ou quantificação; etc.) S130, determinação de métricas de abundância S140 e/ou quaisquer porções adequadas do método 100 (por exemplo, facilitação de caracterizações S150 e/ou facilitação de tratamento S16; etc.). Em uma variação, uma molécula associada ao alvo (por exemplo, a sequência associada ao alvo de uma molécula associada ao alvo; etc.) pode incluir (por exemplo, através da adição de, etc.) uma ou mais regiões de sequência associadas a Sanger (por exemplo, configuradas para melhorar os resultados do sequenciamento de Sanger, etc.) e/ou quaisquer regiões adequadas de sequenciamento, que podem incluir uma ou mais de regiões adicionais associadas ao alvo (por exemplo, com similaridade de sequência com regiões adicionais de sequência alvo de uma ou mais sequências alvo, como sequências alvo iguais ou diferentes, de um ou mais alvos biológicos, como os alvos biológicos iguais ou diferentes; etc.); repetições de sequência (por exemplo, de quaisquer regiões adequadas de moléculas associadas ao alvo, moléculas alvo, moléculas associadas à referência, moléculas de referência, quaisquer sequências adequadas, regiões e/ou moléculas aqui descritas; etc.); e/ou quaisquer regiões adequadas de sequência (por exemplo, regiões de sequenciamento aqui descritas em relação a ser adicionadas a uma ou mais moléculas; etc.).
[041] Em uma variação, as regiões de sequência associadas a Sanger podem incluir sequência específica de nucleotídeos (por exemplo, de um comprimento predeterminado, com nucleotídeos especificamente selecionados; etc.) precedendo (e/ou em qualquer relação posicional adequada a) uma região de variação de sequência e/ou outra região adequada da molécula associada ao alvo, que pode facilitar o reposicionamento da região de variação de sequência para estar nas posições (por exemplo, nas bases 100-500, nas bases 200- 500, durante o sequenciamento de Sanger, e/ou em quaisquer posições adequadas) correspondendo ao resultado aperfeiçoado do sequenciamento de Sanger relacionado às cromatografias. Em um exemplo específico, pode-se aplicar a química Sanger BigDye
1.1 para precisão aperfeiçoada em relação as regiões iniciais de uma sequência (por exemplo, onde LCR e/ou RCA, como mostrado nas Figuras 13A-13B, pode ser omitido; etc.). Em um exemplo específico, pode-se aplicar a química Sanger BigDye 3.1 para possibilitar as leituras de sequenciamento mais longo, onde uma região inicial de sequência (por exemplo, em torno de 200 bp e/ou outro tamanho adequado) pode ser usada (por exemplo, inserida antes da região de sequência alvo e/ou região de sequência associada ao alvo) para precisão aperfeiçoada (por exemplo, como através de LCR e/ou RCA, como mostrado nas Figuras 13A-13B, que podem possibilitar a multiplexação). No entanto, as regiões de sequência associadas a Sanger podem ser configuradas de qualquer forma adequada.
[042] Adicional ou alternativamente, as moléculas de sequenciamento podem incluir primers de sequenciamento configurados para facilitar processos pelos sistemas de sequenciamento, sequências de adaptador, e/ou outros componentes adequados associados a quaisquer sistemas adequados de sequenciamento. No entanto, as moléculas de sequenciamento podem ser configuradas de qualquer forma adequada.
[043] As moléculas associadas ao alvo (e/ou outros componentes adequados aqui descritos, como moléculas associadas à referência, componentes de misturas em pico, etc.) podem ser de qualquer tamanho adequado (por exemplo, 100-500 pares de base, 200-500 pares de base de comprimento e incluindo repetições de regiões de sequência, como regiões associadas ao alvo e/ou regiões de variação; comprimento similar ou diferente das moléculas alvo; 80-150 pares de base de comprimento, incluindo uma região de variação de 10 pares de base de tipos de base misturados; etc.). O conjunto de moléculas associadas ao alvo pode incluir qualquer número de moléculas associadas ao alvo associado a qualquer número adequado de alvos (por exemplo, qualquer número de sequências alvo associado a qualquer número de locais, cromossomos, biomarcadores cancerosos, biomarcadores alvo, etc.), amostras (por exemplo, sintetizando concomitante um lote de moléculas para uso com amostras entre diversos usuários, para usuário com diversas amostras para um único usuário, para melhorar a eficiência do sistema de manipulação de amostra; etc.), condições (por exemplo, conjunto de moléculas associadas ao alvo associado a alvos biológicos associados a diferentes condições; etc.) e/ou demais aspectos adequados.
[044] Em variações, a geração de moléculas de associadas ao alvo pode incluir a geração de diferentes tipos de moléculas associadas ao alvo (por exemplo, inclusive diferentes regiões associadas ao alvo, diferentes regiões de variação, diferentes moléculas de sequência, etc.), como conjuntos de moléculas associadas ao alvo (por exemplo, cada conjunto correspondente a um tipo diferente de moléculas associadas ao alvo; etc.). As moléculas associadas ao alvo podem incluir conjuntos de moléculas associadas ao alvo (por exemplo, uma pluralidade de diferentes conjuntos, etc.), cada conjunto incluindo uma região diferente associada ao alvo associada a (por exemplo, similaridade de sequência para; etc.) uma região diferente de sequência alvo (por exemplo, diferentes regiões de sequência alvo de uma mesma sequência alvo e/ou alvo biológico, como um cromossomo; diferentes regiões de sequência alvo de diferentes sequências alvo e/ou alvos biológicos, como diferentes genes; etc.), o que pode facilitar pares e/ou conjuntos diferentes de um tipo de região associada ao alvo (por exemplo, correspondendo a uma região específica associada ao alvo sequência; etc.) e um tipo de região de sequência alvo (por exemplo, correspondendo a uma sequência alvo específica de um alvo biológico; etc.), e/ou par e/ou conjuntos diferente de bases (por exemplo, onde as bases do par e/ou conjunto podem ser de uma sequência associada ao alvo e uma sequência alvo; etc.), como para determinar as métricas de abundância correspondentes, como proporções de abundância individuais (por exemplo, correspondentes aos pares diferentes; como proporções de abundância individuais correspondentes a diferentes conjuntos de bases, onde os diferentes conjuntos de bases podem corresponder a diferentes locais de um alvo biológico de cromossomo; etc.), que pode ser usado na determinação de uma métrica geral de abundância com precisão elevada através de, por exemplo, cálculo de média e/ou realização de quaisquer operações de combinação adequadas com as métricas de abundância individuais.
[045] Em um exemplo específico, diferentes conjuntos de moléculas associadas ao alvo podem ser associados a diferentes sequências alvo (e/ou regiões de sequência alvo, etc.) entre diferentes locais. Em um exemplo específico, cada conjunto pode ser associado a um local diferente para o mesmo cromossomo (por exemplo, um primeiro, segundo, terceiro e quarto local para um cromossomo, como mostrado na Figura 9; etc.), onde uma sequência de uma molécula associada ao alvo de um determinado conjunto pode incluir uma região de sequência compartilhada pelo local correspondente ao conjunto, e pode incluir uma região de variação de sequência diferente (por exemplo, por inserções, exclusões, substituições de base, etc.) da sequência para o local.
[046] Qualquer número de conjuntos de moléculas associadas ao alvo e/ou qualquer número de tipos de moléculas associadas ao alvo pode ser gerado e/ou associado a qualquer número de alvos biológicos. Em um exemplo, a seleção de diferentes conjuntos de molécula associada ao alvo pode ser baseada nos parâmetros de sequenciamento, exigências de precisão para uma determinada condição e/ou aplicação (por exemplo, seleção de um número de conjuntos que leva a um número correspondente adequado de métricas de abundância individuais a ser usado no obtenção de uma precisão alvo para diagnóstico da síndrome de Down), e/ou pode ser selecionada com base em quaisquer critérios adequados (por exemplo, parâmetro a ser otimizado). No entanto, a geração de diferentes conjuntos de moléculas associadas ao alvo pode ser realizada de qualquer forma adequada.
[047] A geração de moléculas associadas ao alvo pode incluir a determinação de sequências alvo (por exemplo, regiões de sequência alvo de sequências alvo; quaisquer regiões adequadas de sequências alvo; etc.), que pode funcionar para selecionar sequências alvo nas quais a geração de moléculas associadas ao alvo pode ser baseada. A determinação de sequências alvo pode ser baseada em qualquer um ou mais entre: condição (por exemplo, seleção de sequências alvo que identifica o cromossomo 21 para facilitação do diagnóstico da síndrome de Down; seleção de sequências alvo que identifica oncogenes; etc.), parâmetros de sequenciamento (por exemplo, seleção de sequências alvo de um comprimento em particular, sequência de nucleotídeo e/ou outro parâmetro para otimização de qualidade de resultado relacionado à cromatografia a partir do sequenciamento de Sanger; para a geração de resultados relacionados à cromatografia adequados para análise de estimativa estatística e/ou outros adequados; para redução de custo, melhora de precisão, melhora de reprodutibilidade e/ou para outras otimizações adequadas em relação a sistemas e/ou operações de sequenciamento, etc.); parâmetros de amplificação (por exemplo, seleção de sequências alvo de um comprimento em particular, sequência de nucleotídeo e/ou outro parâmetro para otimização da especificidade de amplificação, como em relação à especificidade de primer para as sequências alvo quanto à amplificação da reação da cadeia de polimerase; etc.), outros parâmetros de processamento de amostra e/ou outros critérios adequados.
Em um exemplo, a determinação de sequências alvo pode incluir pesquisa computacional de uma base de dados (por exemplo, base de dados de DNA, base de dados de genoma, base de dados de expressão de gene, base de dados de fenótipo, base de dados de RNA, base de dados de proteínas, etc.) para gerar uma lista de candidato a sequência alvo; e filtração da lista de candidato a sequência alvo com base nos critérios aqui descritos, e/ou quaisquer critérios adequados.
Em um exemplo específico, a determinação do direcionamento de sequências pode incluir a extração de uma lista de candidato a sequência alvo (por exemplo, com base em exame suspenso; fusão em pedaços de um número adequado de pares de base; etc.); filtração de candidatos que incluem tipos definidos de mutações e/ou polimorfismos (por exemplo, filtração de candidatos associados a polimorfismos de nucleotídeo comum único para obter candidatos com invariância relativa entre indivíduos de uma população, etc.); identificação de primers para os candidatos restantes (por exemplo, com um Primer-BLAST para 80-150 bp amplicões); e determinação de regiões de candidato que sejam adequadas para variação na geração de uma região de variação de molécula associada ao alvo (por exemplo, através de mistura de bases em posições em relação a um primer adiante e/ou outra região da sequência, etc.). No entanto, a determinação de sequências alvo pode ser realizada de qualquer forma adequada.
[048] A geração de moléculas associadas ao alvo pode incluir a sintetização das moléculas através da realização de qualquer um ou mais entre: amplificação (por exemplo, amplificação de PCR, como com primers de PCR que incluem uma ou mais sequências tipo grampo; etc.), síntese de ácido nucleico baseada em plasmídeo (por exemplo, que inclui as moléculas associadas ao alvo e moléculas associadas à referência, respectivamente, correspondendo a diferentes locais de um cromossomo alvo e um cromossomo de referência; uso de plasmídeos que incluem quaisquer sítios de cor adequado, origem de sítios de replicação, diversos sítios de clonagem, marcadores selecionáveis, marcadores de relator, estrutura e/ou outros componentes; etc.), outras técnicas de síntese de gene artificial, técnicas de amplificação (por exemplo, reação de cadeia de polimerase, amplificação do círculo de rolamento, etc.), técnicas de ligação (por exemplo, Reação de Ciclase de Ligase, etc.), abordagens fosforamidita, pós-processamento sintético, purificação (por exemplo, uso de cromatografia líquida de alto desempenho ou outras abordagens cromatográficas, dessalinização, lavagem, centrifugação, etc.), técnicas de marcação (por exemplo, técnicas de marcação molecular, técnicas de marcação fluorescente, técnicas de rotulagem de partícula, etc.), técnicas de clonagem de molécula e/ou qualquer técnica adequada de processamento de amostra.
[049] Em uma variação, a sintetização de moléculas associadas ao alvo pode incluir a geração de uma sequência associada ao alvo que inclui uma pluralidade de regiões de sequência associadas a diferentes alvos (por exemplo, diferentes locais entre o mesmo cromossomo, diferentes locais de diferentes cromossomos, diferentes oncogenes, etc.). Em um exemplo específico, um tipo de molécula associada ao alvo pode ser configurado para reduzir o número de operações de sequenciamento necessárias (por exemplo, um tipo de molécula associada ao alvo que facilite a geração de um resultado informativo relacionado à cromatografia de uma pluralidade de alvos e gerada usando um único ciclo de sequenciamento de Sanger; etc.); no entanto, os tipos de molécula associada ao alvo podem ser sintetizados para otimizar qualquer parâmetro adequado. Adicional ou alternativamente, qualquer número adequado de moléculas e/ou tipos de moléculas associados a qualquer número de alvos pode ser gerado a qualquer momento e frequência adequados.
[050] No entanto, a geração de moléculas associadas ao alvo S110 pode ser realizada de qualquer forma adequada.
2.2 Geração de uma mistura em pico.
[051] As realizações do método 100 podem incluir a geração (por exemplo, facilitação de geração de, etc.) de uma ou mais misturas em pico S120 (por exemplo, com base no processamento do conjunto de moléculas associadas ao alvo com moléculas alvo de uma ou mais amostras de um usuário, etc.), que pode funcionar para amplificar (por exemplo, em parâmetros similares de amplificação), realizar pré-processamento (por exemplo, preparação de amostra, lise, processos baseados em esferas, outras técnicas de purificação e/ou de extração de ácido nucleico, etc.), modificar (por exemplo, gerar repetições de sequência, combinar sequências associadas com diferentes alvos, etc.) e/ou de outro modo processar as moléculas associadas ao alvo, moléculas alvo, e/ou outras moléculas adequadas (por exemplo, moléculas associadas à referência, moléculas de referência, etc.) de uma forma adequada para a análise subsequente (por exemplo, sequenciamento de Sanger, etc.) e determinação de métrica de abundância (por exemplo, com base em resultados do sequenciamento de Sanger, etc.). As amostras coletadas (por exemplo, amostras biológicas; coletadas usando recipientes de amostra providos aos usuários em kits de coleta de amostra) podem incluir qualquer um ou mais entre: sangue, plasma, soro, tecido, biópsias (por exemplo, biópsias tumorais, etc.), suor, urina, fezes, sêmen, secreções vaginais, lágrimas, fluido intersticial, outro fluido corporal e/ou quaisquer outras amostras adequadas (por exemplo, associadas a um usuário humano, animal, objeto, como alimento, microorganismos, etc.). Nos exemplos, como para NIPT, as amostras biológicas podem incluir uma ou mais amostras maternas.
As amostras incluem preferencialmente moléculas alvo (por exemplo, moléculas de ácido nucleico que incluem uma ou mais sequências alvo e/ou regiões de sequência alvo; etc.) e/ou moléculas de referência (por exemplo, moléculas de ácido nucleico que incluem uma ou mais sequências de referência e/ou região de sequências de referência; etc.), como onde as moléculas alvo podem ser amplificadas com as moléculas associadas ao alvo sob parâmetros similares; onde as moléculas de referência podem ser amplificadas com as moléculas associadas à referência sob parâmetros similares; etc.). Adicional ou alternativamente, as amostras podem incluir componentes (por exemplo, moléculas alvo) de diversos usuários (por exemplo, uma amostra sérica que inclui ácidos nucleicos de uma mãe e ácidos nucleicos do feto da mãe, onde a mistura de ácido nucleico pode ser indicativa de uma abundância anormal de cromossomo 21, etc.), componentes coletados entre diversos períodos de tempo, e/ou componentes que variam entre qualquer condição adequada, de modo que a geração de mistura(s) em pico possa ser realizada para qualquer número adequado e tipos de entidades.
[052] A geração de uma ou mais misturas em pico inclui preferencialmente combinação de moléculas associadas ao alvo com moléculas alvo (por exemplo, ácidos nucleicos que incluem regiões de sequência alvo e/ou sequências alvo, etc.) da amostra; e/ou combinação de moléculas associadas à referência com moléculas de referência; e/ou combinação com quaisquer moléculas adequadas. A combinação pode incluir um ou mais entre: combinação com cada uma das moléculas em uma única mistura (por exemplo, inclusive diferentes subconjuntos de moléculas associadas ao alvo e subconjuntos correspondentes de moléculas alvo; etc.); subamostragem da amostra (por exemplo, uma amostra pré-processada) em uma pluralidade de misturas, cada uma designada para um diferente subconjunto de moléculas associadas ao alvo (por exemplo, correspondendo a diferentes locais alvo para um cromossomo alvo, etc.); subamostragem da amostra nas diferentes misturas para moléculas associadas ao alvo e moléculas associadas à referência; e/ou qualquer outra abordagem adequada para combinar as moléculas. Em um exemplo, as moléculas alvo e as moléculas associadas ao alvo (por exemplo, par diferentes de tipos de moléculas alvo e moléculas associadas ao alvo; correspondendo a pares diferentes de regiões associadas ao alvo e regiões de sequência alvo; associadas a uma pluralidade de alvos diferentes; etc.) podem ser amplificadas no mesmo compartimento (por exemplo, tubo; etc.) (e/ou qualquer número adequado de compartimentos), como através de PCR multiplex e/ou processos de amplificação adequados, que podem facilitar a conservação de uma amostra preciosa; e os produtos de amplificação resultantes podem ser subsequentemente subamostrados em misturas separadas para subsequente sequenciamento de Sanger individual que visa diferentes tipos alvo (por exemplo, usando um primer de sequenciamento de Sanger associado a uma região invariante, como uma região de similaridade de sequência, compartilhada pela região associada ao alvo e região de sequência alvo; etc.). Em exemplos, subamostragem e/ou outras operações de modificação de amostra podem ser realizadas em qualquer ordem adequada.
[053] Adicional ou alternativamente, as amostras separadas (por exemplo, misturas, soluções, etc.) podem ser geradas para diferentes tipos de molécula (por exemplo, sem combinação de diferentes tipos de moléculas). Por exemplo, uma primeira amostra que inclui moléculas associadas ao alvo (por exemplo, sem moléculas alvo) pode ser gerada, e a mistura da amostra incluindo moléculas alvo (por exemplo, sem moléculas associadas ao alvo) pode ser gerada, onde a primeira e segunda misturas podem ser separadamente usadas em processamento à jusante (por exemplo, realização de ciclos de sequenciamento de Sanger separados para gerar resultados separados relacionados à cromatografia, como cromatografias separadas que podem ser usados durante a estimativa estatística, deconvolução e/ou outras operações de processamento computacional, como para determinação de métricas de abundância, etc.). No entanto, qualquer número adequado de amostras que incluir qualquer tipo separado adequado ou cominação de tipos de moléculas pode ser gerado e/ou processado.
[054] A combinação de moléculas inclui preferencialmente o uso de uma abundância conhecida de moléculas associadas ao alvo, mas uma abundância desconhecida de moléculas alvo pode ser usada alternativamente (por exemplo, onde os resultados dos ciclos anteriores de sequenciamento com a abundância desconhecida podem ser usados para informar resultados dos subsequentes ciclos de sequenciamento, etc.). Além disso, a combinação de moléculas inclui preferencialmente o uso de abundâncias iguais ou substancialmente similares entre diferentes subconjuntos de moléculas associadas ao alvo (por exemplo, associadas a diferentes locais), e/ou abundâncias iguais ou similares em relação às moléculas associadas à referência. Adicional ou alternativamente, quaisquer abundâncias adequadas para diferentes tipos de molécula podem ser usadas.
[055] Em uma variação, a combinação de moléculas pode incluir modificação (por exemplo, durante pré- processamento) de abundâncias das moléculas associadas ao alvo, das moléculas associadas à referência e/ou outros componentes adequados. Por exemplo, a modificação de abundâncias de moléculas pode incluir medição de abundâncias iniciais das moléculas (por exemplo, abundância das moléculas associadas ao alvo); e modificação das abundâncias (por exemplo, através de diluição, amplificação, etc.) com base nas abundâncias esperadas de moléculas alvo (por exemplo, contagem esperadas para moléculas endógenas alvo na amostra, etc.). Em uma variação, geração de misturas em pico pode omitir modificação (por exemplo, durante pré-processamento) de abundâncias (por exemplo, onde os resultados da abundância para um primeiro exemplo de uma realização do método 100 podem ser usados na determinação de um fator de correção a ser usado em exemplos subsequentes da realização do método 100; etc.). No entanto, a combinação de moléculas pode ser realizada de qualquer forma adequada.
[056] A geração da mistura em pico inclui preferencialmente amplificação das moléculas associadas ao alvo com as moléculas alvo. A amplificação pode incluir a realização de qualquer um ou mais entre: técnicas baseadas em reação de cadeia de polimerase (por exemplo, PCR de fase sólida, RT-PCR, qPCR, PCR multiplexada, PCR de toque, nanoPCR, PCR aninhada, PCR de início quente, etc.), amplificação dependente de helicase (HDA), amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP), replicação de sequência autossustentada (3SR), amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASBA), amplificação de deslocamento de filamento (SDA), amplificação de círculo de rolamento (RCA), reação de cadeia de ligase, reação de ciclagem de ligase (LCR), e/ou qualquer outras técnicas de amplificação adequadas e/ou protocolos associados (por exemplo, protocolos para minimização de estrangulamento de amplificação). Em um exemplo, como mostrado na Figura 3, a geração de uma mistura em pico pode incluir a realização de uma pluralidade de ciclos de PCR (por exemplo, qualquer número de ciclos de PCR) para co-amplificar as moléculas associadas ao alvo com as moléculas alvo (por exemplo, usando conjuntos de primers que visam uma sequência compartilhada pelas moléculas associadas ao alvo e pelas moléculas alvo; usando diferentes conjuntos de primers correspondendo a diferentes tipos de primer e sequências, como mostrado na Figura 3, onde um ou mais dos conjuntos de primers pode incluir uma ou mais sequências tipo grampo, como para facilitação de adição de repetições de sequência; etc.).
[057] Em uma variação, a geração de uma mistura em pico e/ou porções adequadas de realizações do método 100 (por exemplo, em variações onde as amostras que incluem moléculas associadas ao alvo são preparadas e sequenciadas independentemente das amostras que incluem moléculas alvo; em variações onde as amostras que incluem moléculas associadas à referência são preparadas e sequenciadas independentemente das amostras que incluem moléculas de referência; etc.) podem incluir adição de uma ou mais regiões de sequência para uma ou mais moléculas (por exemplo, uma ou mais regiões e/ou sequências de uma ou mais moléculas; para moléculas associadas ao alvo, para moléculas alvo, para moléculas associadas à referência, para moléculas de referência, etc.).
[058] A adição de regiões de sequência pode incluir um ou mais entre: geração de repetições de sequência (por exemplo, geração de uma sequência modificada que inclui repetições de uma sequência associada ao alvo e/ou sequência alvo; etc.); adição de regiões de sequência que identificam diferentes alvos (por exemplo, diferentes locais de um cromossomo identificado pelo alvo original; locais de diferentes cromossomos; regiões de sequência associadas a diferentes condições; etc.); e/ou adição de qualquer sequência adequada de nucleotídeos. Por exemplo, o método 100 pode incluir adição de pelo menos uma região de sequência a pelo menos um entre o conjunto de moléculas associadas ao alvo e as moléculas alvo, onde a pelo menos uma região de sequência inclui pelo menos um entre (a) uma segunda região associada ao alvo com similaridade de sequência com uma segunda região de sequência alvo (por exemplo, onde o conjunto de moléculas alvo inclui uma primeira região associada ao alvo com similaridade de sequência com uma primeira região de sequência alvo de uma sequência alvo de um alvo biológico; etc.), e (b) pelo menos uma repetição de sequência de pelo menos uma de uma região da sequência associada ao alvo e uma região da sequência alvo.
[059] A adição de regiões de sequência pode funcionar para: facilitar a qualidade de resultado melhorada dos sistemas de sequenciamento (por exemplo, qualidade de resultados de cromatografia), como através de adição de regiões de sequência posicionalmente anteriores às regiões de variação na qual a extração de métrica de abundância será baseada (por exemplo, onde as regiões de sequência adicionadas podem possibilitar reposicionamento das regiões de variação para estarem nas posições correspondentes a resultados de sequenciamento melhorados; etc.); facilitar a determinação de métricas de abundância adicionais individuais para as regiões de sequência adicionadas (por exemplo, pela análise de repetições de sequência da região de variação em relação às bases alvo correspondentes; etc.), que pode ser usada no cálculo de uma métrica geral de abundância de precisão melhorada; facilitar a redução em número e/ou custo de operações necessárias de sequenciamento (por exemplo, menos ciclos de sequenciamento de Sanger; etc.) para analisar uma pluralidade de alvos (por exemplo, entre diferentes locais, cromossomos, etc.), como através da ligação de diferentes sequências associadas a diferentes alvos.
[060] Em um exemplo, o método 100 pode incluir adição de pelo menos uma repetição de sequência (por exemplo, para facilitação de sequenciamento de passagem múltipla, como sequências de sequenciamento uma pluralidade de vezes, como nos ciclos de sequenciamento iguais ou diferentes, como para dados do resultado de sequenciamento crescentes, de modo que os dados do resultado de sequenciamento e/ou métricas de abundância associadas podem ser calculadas as médias e/ou de outro modo combinadas, como para reduzir ruído; etc.) para uma ou mais moléculas associadas ao alvo (por exemplo, uma ou mais regiões de uma sequência associada ao alvo das moléculas associadas ao alvo; etc.) e/ou uma ou mais moléculas alvo (por exemplo, uma ou mais regiões de uma sequência alvo das moléculas alvo; etc.), como onde o primeiro conjunto de picos do pelo menos um resultado relacionado à cromatografia (por exemplo, cromatografia, intensidades de pico, outros dados de pico, etc.) correspondem a um primeiro sequenciamento (por exemplo, de uma operação de sequenciamento de Sanger; etc.) para a região associada ao alvo, a região de sequência alvo do alvo biológico, a região de variação alvo e a região de sequência do alvo biológico, onde o pelo menos um resultado relacionado à cromatografia inclui um segundo conjunto de picos correspondente a um segundo sequenciamento (por exemplo, da mesma operação de sequenciamento de Sanger, etc.) para a região associada ao alvo, a região de sequência alvo do alvo biológico, a região de variação alvo e a região de sequência do alvo biológico, e onde a determinação de um conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo pode ser baseada no primeiro conjunto de picos e no segundo conjunto de picos
(por exemplo, com base nas proporções de abundância individuais de intensidades de pico, decorrentes do primeiro e do segundo conjunto de picos, para pares de bases da sequência alvo e da sequência associada ao alvo; etc.).
[061] Em uma variação, a adição de uma ou mais regiões de sequência (por exemplo, repetições de sequência; etc.) pode ser baseada em uma ou mais sequências tipo grampo (por exemplo, de primers, como usado nas amplificação de PCR; etc.), como onde a amplificação com primers de PCR que incluem a uma ou mais sequências tipo grampo podem possibilitar uma pluralidade de exemplos de extensão de nucleotídeos (por exemplo, através de autoferrante) para a adição de repetições de sequência que podem ser sequenciadas de Sanger. Em um exemplo, como mostrado na Figura 3, a adição de uma ou mais repetições de sequência (por exemplo, para quaisquer moléculas adequadas; etc.) pode incluir co-amplificação (e/ou amplificação separadamente), com um ou mais conjuntos de primers que incluem uma ou mais sequências tipo grampo (por exemplo, “chr21:14439076_PCR2_RP_hp”, como mostrado nas Figuras 3 e 4), o conjunto de moléculas associadas ao alvo e as moléculas de ácido nucleico da amostra (por exemplo, amostra materna; amostra biológica; etc.), onde as moléculas de ácido nucleico incluem a região de sequência alvo. Em um exemplo, os primers (por exemplo, primers de PCR) que incluem uma sequência tipo grampo podem incluir uma ou mais porções (por exemplo, porções de sequência, porções estruturais; etc.) de uma sequência mostrada nas Figuras 3 e 4 (“chr21:14439076_PCR2_RP_hp”). Em um exemplo, os produtos resultantes (por exemplo, moléculas resultantes, etc.) da adição de uma ou mais regiões de sequência (por exemplo,
repetições de sequência; etc.) com base em uma ou mais sequências tipo grampo, podem incluir uma ou mais porções (por exemplo, porções de sequência, porções estruturais; etc.) da sequência, como mostrado nas Figuras 5A-5E (por exemplo, onde as Figuras 5A-5E ilustram uma sequência completa, com a sequência na Figura 5A conectada à sequência na Figura 5B, conectada à sequência na Figura 5C, conectada à sequência na Figura 5D e conectada à sequência na Figura 5E; etc.).
[062] Nos exemplos, se um grampo é usado apenas em uma extremidade da sequência (por exemplo, de uma sequência de primer de PCR), obtém-se uma sequência de Sanger de duas passagens (por exemplo, resultados relacionados à cromatografia que incluem resultados de pico para duas passagens da sequência). Em um exemplo, uma contribuição significativa da sequência de Sanger de duas passagens é aquela da segunda sequência (por exemplo, segundo conjunto de dados de pico e/ou resultados adequados relacionados à cromatografia para a sequência, etc.) pode ser mais informativa e mais limpa no conteúdo de cromatografia que a sequência de primeira passagem (por exemplo, primeiro conjunto de dados de pico e/ou resultados adequados relacionados à cromatografia para a sequência, etc.) devido ao efeito reduzido de primer-dímeros neste comprimento aumentado e devido à qualidade aperfeiçoada em comprimentos mais longos com química Big Dye 3.1. Nos exemplos, caso um grampo seja usado em ambas as extremidades, uma pluralidade (por exemplo, muitos, múltiplos; etc.) em vez de dois (por exemplo, uma pluralidade superior a dois), cromatografias de Sanger para a mesma sequência seriam obtidas; apesar disto poder reduzir significativamente qualquer ruído associado à medição de abundância devido ao cálculo de média,
pode não reduzir similarmente os efeitos de primer-dímeros.
[063] Em uma variação, as sequências tipo grampo (por exemplo, de primers, etc.) podem ser configuradas para, geradas para, usadas para e/ou de outro modo processadas sem moléculas associadas ao alvo e moléculas associadas à referência. Por exemplo, uma ou mais repetições de sequência (por exemplo, geradas através de amplificação com primers de PCR que incluem uma ou mais sequências tipo grampo) podem ser adicionadas às moléculas alvo, moléculas de referência e/ou moléculas adequadas para possibilitar o sequenciamento de Sanger (e/ou tecnologias adequadas de sequenciamento) de uma sequência particular para uma pluralidade de exemplos (por exemplo, sequenciamento de passagem múltipla para possibilitar diversos conjuntos de dados a serem gerados para a mesma sequência em um único ciclos de sequenciamento; etc.). Em um exemplo, a proporção de um pico de alelo importante (por exemplo, métrica de intensidade máxima) (e/ou resultado adequado relacionado à cromatografia; etc.) para um pico de alelo menor (por exemplo, métrica de intensidade máxima) (e/ou resultado adequado relacionado à cromatografia; etc.) pode ser determinada uma pluralidade de vezes com base em resultados decorrentes dos resultados do sequenciamento de Sanger das repetições de sequência (por exemplo, geradas do uso de sequências tipo grampo; etc.) para determinar uma proporção geral de abundância. Adicional ou alternativamente, a adição de uma ou mais regiões de sequência pode ser realizada sem processamento de moléculas associadas ao alvo e/ou moléculas associadas à referência, como onde a adição da uma ou mais regiões de sequência pode melhorar independentemente (por exemplo, precisão de; redução de desvios sobre; redução de ruído sobre; etc.) os resultados relacionados à cromatografia, métricas de abundância, caracterizações e/ou tratamentos.
[064] No entanto, sequências tipo grampo podem ser configuradas de qualquer forma adequada, e a adição de uma ou mais regiões de sequência com base nas sequências tipo grampo pode ser realizada de qualquer forma adequada.
[065] Em um exemplo específico, como mostrado nas Figuras 13A-13B (por exemplo, que ilustram a geração de repetições paralelas de aproximadamente 150 amplicão de comprimento do par de base para posicionar bases em pico em uma janela de qualidade de Sanger predeterminada, como uma facilitação de janela de resultados de sequenciamento melhorado; onde a mistura de amplicão de alelos endógenos e em pico pode ser circulado por LCR, e onde as repetições paralelas podem ser então geradas por RCA dos amplicões circulados, e onde os locais das bases em pico podem ser indicados pelas áreas sombreadas, e onde as cromatografias podem ser geradas a partir do sequenciamento de Sanger multiplexado para diversos locais em pico, e onde os amplicões originários de quatro locais foram montados em DNA circular por LCR, e o produto foi amplificado por RCA e sequenciado por Sanger; etc.), a adição de regiões de sequência pode incluir: realização de operações de ligação (por exemplo, Reação de Ciclagem de Ligase com uma ligase Taq e/ou outras ligases adequadas; etc.) em uma mistura de amplicão gerada a partir da co-amplificação de ácidos nucleicos associados ao alvo e de ácidos nucleicos alvo, gerando assim amplicões circulados; realização de operações de amplificação (por exemplo, amplificação de círculo de rolagem) nos amplicões circulados, gerando assim uma ou mais sequências modificadas que incluem repetições de sequência (por exemplo,
repetições paralelas) e/ou regiões de sequência adicionais que identificam diferentes alvos, onde a mistura em pico resultante (por exemplo, que inclui ácidos nucleicos lineares que incluem as sequências modificadas) pode ser usada em subsequentes operações de sequenciamento (por exemplo, sequenciamento de Sanger, etc.). A adição de regiões de sequência inclui preferencialmente a adição de regiões de sequência a uma mistura de amplicões que incluem amplicões baseados em molécula alvo (por exemplo, amplicões gerados a partir de moléculas alvo endógenas) e amplicões baseados em molécula associada ao alvo (por exemplo, amplicões gerados a partir de moléculas associadas ao alvo em pico). Alternativamente, a adição de regiões de sequência pode ser realizada nas moléculas associadas ao alvo separadamente das moléculas alvo. Adicional ou alternativamente, as regiões de sequência podem ser geradas inicialmente (por exemplo, durante a geração de moléculas associadas ao alvo, moléculas associadas à referência, etc.), como para ser parte da sequência associada ao alvo inicial e/ou sequência associada à referência. A adição de regiões de sequência e/ou quaisquer porções adequadas de realizações do método 100 podem incluir a realização de quaisquer operações de processamento de amostra aqui descritas, e/ou outras operações adequadas. No entanto, as regiões de sequência podem ser configuradas de qualquer forma adequada, e a adição de regiões de sequência pode ser realizada de qualquer forma adequada.
[066] No entanto, as sequências associadas ao alvo, as sequências alvo e/ou outras sequências adequadas podem ser modificadas de qualquer forma adequada (por exemplo, regiões de exclusão, nucleotídeos de modificação em posições específicas, etc.) que usam quaisquer operações adequadas de processamento de amostra. No entanto, a geração de misturas em pico S120 pode ser realizada de qualquer forma adequada.
2.3 Realização de uma operação de sequenciamento.
[067] As realizações do método 100 podem incluir a realização de uma ou mais operações de sequenciamento S130 (por exemplo, na uma ou mais misturas em pico, etc.), que pode funcionar para sequenciar um ou mais componentes (por exemplo, uma ou mais misturas em pico; etc.) e/ou gerar um ou mais resultados de sequenciamento. A realização de operações de sequenciamento inclui preferencialmente o sequenciamento de Sanger (por exemplo, em uma mistura em pico, em moléculas alvo separadamente, em moléculas associadas ao alvo separadamente, etc.). O sequenciamento de Sanger inclui preferencialmente abordagens de terminação de cadeia e/ou quaisquer operações adequadas relacionadas ao sequenciamento de Sanger (por exemplo, usando dideoxinucleotídeos rotulados e polimerase de DNA, como durante replicação de DNA in vitro; geração de um conjunto de fragmentos de ácido nucleico que cobrem posições base para bases de sequências associadas ao alvo, sequências alvo, sequência de molécula associadas à referência, sequências de referência, quaisquer sequências adequadas; realização de análise dos fragmentos de ácido nucleico, como através de eletroforese de gel capilar, detecção a laser de bases rotuladas; realização de quaisquer operações adequadas relacionadas ao sequenciamento de Sanger como sequenciamento por dye-terminator, automatização e/ou preparação de amostra associada ao sequenciamento de Sanger, sequenciamento de Sanger micro fluídica, processos computacionais para determinar os resultados de sequenciamento; etc.). No entanto,
o sequenciamento de Sanger pode ser realizado de qualquer forma adequada.
[068] A realização de operações de sequenciamento incluem preferencialmente o sequenciamento de uma ou mais misturas em pico co-amplificado (por exemplo, uma mistura em pico que inclui moléculas associadas ao alvo co- amplificadas e ácidos nucleicos que incluem uma região de sequência alvo associada; etc.), mas podem, adicional ou alternativamente, sequenciar quaisquer componentes adequados (por exemplo, separadamente sequenciamento de moléculas associadas ao alvo decorrentes de uma primeira amostra e moléculas alvo decorrentes de uma segunda amostra; misturas em pico; amostras de usuários; amostras que incluem moléculas associadas à referência e/ou moléculas de referência; etc.) com qualquer número de operações de sequenciamento (por exemplo, qualquer número de ciclos de sequenciamento de Sanger, etc.).
[069] As operações de sequenciamento podem ser realizadas preferencialmente para determinar um ou mais resultados de sequenciamento (por exemplo, resultados de sequenciamento quantitativo nos quais as métricas de abundância podem ser determinada; etc.). Os resultados de sequenciamento podem incluir qualquer um ou mais entre: resultados relacionados à cromatografia, leituras de sequência, resultados de sequenciamento de alto rendimento, dados de texto, alinhamentos e/ou quaisquer outros resultados adequados decorrentes de quaisquer tecnologias adequadas de sequenciamento. Os resultados relacionados à cromatografia podem incluir qualquer um ou mais entre cromatografias (por exemplo, que inclui picos para bases sequenciadas de molécula associada ao alvo sequências, sequências alvo, sequências de molécula associada à referência, sequências de referência, de quaisquer regiões associadas adequadas, de quaisquer moléculas adequadas aqui descritas; etc.), posições de alinhamento (por exemplo, correspondentes a picos e/ou bases sequenciadas por sequenciamento de Sanger; cada posição de alinhamento correspondendo a um ou mais picos e/ou uma ou mais bases; correspondendo a bases de uma pluralidade de sequências alinhadas, como bases de uma sequência associada ao alvo e uma sequência alvo; como mostrado nas Figuras 6A e 7A; etc.), quaisquer posições adequadas relacionadas a sequenciamento, intensidades de pico, área de picos, similaridades de pico, diferenças de pico, métricas de pico em relação a picos para tipo igual ou diferente de base; intensidade média; intensidade mediana; alturas; larguras; sobreposição e/ou outras comparações entre picos de base associada ao alvo e uma base alvo na mesma posição ou em uma posição diferente, dados de texto (por exemplo, resultados de texto decorrente do sequenciamento de Sanger, etc.), e/ou quaisquer outros resultados adequados (por exemplo, relacionados ao sequenciamento de Sanger, etc.). Por exemplo, como mostrado na Figura 8, os resultados relacionados à cromatografia podem incluir cromatografias para as diferentes misturas (por exemplo, uma primeira cromatografia para a mistura em pico, uma segunda cromatografia para moléculas associadas ao alvo isoladas, uma terceira cromatografia para moléculas alvo isoladas; etc.), como onde os picos de cromatografia para diferentes bases podem ser processados computacionalmente para extrair resultados de sequenciamento.
[070] Os resultados de sequenciamento (por exemplo, em relação a picos para o sequenciamento de Sanger) para uma ou mais bases em particular podem incluir uma dependência no número e/ou tipo de bases que precedem (e/ou estão de outro modo relacionados a) a base em particular, onde a adição de regiões de sequência (por exemplo, repetições de sequência) na geração da mistura em pico pode contabilizar estas dependências.
Adicional ou alternativamente, a determinação de uma região de variação sequência para uma sequência associada ao alvo e/ou uma sequência de molécula associada à referência pode ser baseada nas dependências (por exemplo, no número e/ou tipo de bases precedentes na sequência, etc.) e/ou outros parâmetros adequados de sequenciamento (por exemplo, características das tecnologias de sequenciamento, como características de sequenciamento de Sanger, etc.), como onde a inserção predeterminada e/ou exclusões para regiões de variação podem possibilitar calibração (por exemplo, autocalibração) para ser capaz de comparar precisamente as intensidades de pico e/ou outros resultados adequados relacionados à cromatografia na facilitação da determinação de métrica de abundância.
Por exemplo, a região de variação alvo inclui pelo menos um entre uma ou mais inserções e uma ou mais exclusões, onde o pelo menos um resultado relacionado à cromatografia inclui posições de alinhamento correspondentes aos picos (por exemplo, associadas às bases da primeira região associada ao alvo, da região de sequência alvo do alvo biológico, da região de variação alvo e da região de sequência do alvo biológico, etc.), onde, para cada um dos pares diferentes (por exemplo, uma base da sequência associada ao alvo e uma base da sequência alvo, etc.), a base da primeira sequência associada ao alvo corresponde a uma primeira posição de alinhamento diferente de uma segunda posição de alinhamento correspondendo à base da primeira sequência alvo (por exemplo, como mostrado nas Figuras 6A e 7A), e onde as posições de alinhamento do pelo menos um resultado relacionado à cromatografia incluem a primeira e a segunda posições de alinhamento.
[071] Em um exemplo, a região de variação pode incluir bases misturadas predeterminadas (por exemplo, substituições de base, etc.) que podem possibilitar calibração e/ou operações adequadas de processamento (por exemplo, deconvolução, determinação de fator de correção e aplicação, etc.) para precisão aperfeiçoada na determinação da métrica de abundância. No entanto, a determinação de qualquer região e/ou sequência adequada pode ser baseada em quaisquer parâmetros adequados de sequenciamento de qualquer forma adequada. Adicional ou alternativamente, os resultados de sequenciamento para uma base em particular e/ou outra região de sequência, e/ou determinação de qualquer região e/ou sequência adequada pode ser independente de outras regiões de sequência e/ou parâmetros adequados de sequenciamento.
[072] Nas variações, a realização de uma ou mais operações de sequenciamento pode ser para um ou mais produtos (por exemplo, componentes de misturas em pico; moléculas associadas ao alvo, moléculas alvo e/ou outras moléculas adequadas; etc.) com regiões de sequência adicionadas (por exemplo, repetições de sequência; etc.), como um ou mais produtos gerados com base nas sequências tipo grampo (por exemplo, com base na amplificação com primers de PCR que incluem uma ou mais sequências tipo grampo; etc.). A realização de operações de sequenciamento nos produtos com repetições de sequência podem funcionar para sequenciar uma ou mais sequências e/ou regiões de sequência uma pluralidade de vezes, para a geração de resultados adicionais de sequenciamento, que podem reduzir o ruído, ser usados para determinar as métricas adicionais de abundância (por exemplo, para determinação de uma métrica geral de abundância de precisão aperfeiçoada; etc.) e/ou para quaisquer fins adequados (por exemplo, facilitação de caracterizações e/ou tratamentos; etc.).
[073] Adicional ou alternativamente, a realização de operações de sequenciamento (e/ou quaisquer porções adequadas de realizações do método 100 e/ou sistema 200) pode incluir determinação, aplicação, realização e/ou de outro modo uso de qualquer sequenciamento adequado e/ou tecnologias relacionadas ao sequenciamento, como sequenciamento de alto rendimento, que podem incluir e/ou estar associados a qualquer um ou mais entre: NGS, tecnologias associadas a NGS, sequenciamento de assinatura intensamente paralela, sequenciamento da Polônia, pirossequenciamento 454, sequenciamento Illumina, sequenciamento SOLiD, sequenciamento de semicondutor Ion Torrent, sequenciamento de nanobola de DNA, sequenciamento de molécula única Heliscope, sequenciamento de molécula única em tempo real (SMRT), sequenciamento de DNA Nanopore, qualquer geração de número de tecnologias de sequenciamento (por exemplo, tecnologias de sequenciamento de segunda geração, tecnologias de sequenciamento de terceira geração, tecnologias de sequenciamento de quarta tecnologia, etc.), sequenciamento associado a amplicão (por exemplo, sequenciamento direcionado ao amplicão), sequenciamento associado a metagenoma, sequenciamento por síntese, sequenciamento de correntes de tunelamento, sequenciamento por hibridização, sequenciamento de espectrometria em massa, técnicas à base de microscopia e/ou quaisquer tecnologias adequadas relacionadas ao sequenciamento de alto rendimento. Adicional ou alternativamente, o sequenciamento e/ou tecnologias relacionadas ao sequenciamento podem incluir quaisquer tecnologias adequadas (por exemplo, sequenciamento capilar, etc.).
[074] No entanto, a realização de operações de sequenciamento S130 pode ser realizada de qualquer forma adequada.
2.4 Determinação de uma métrica de abundância.
[075] As realizações do método 100 podem incluir a determinação de uma ou mais métricas de abundância S140 (por exemplo, para uma ou mais amostras; com base nos resultados da uma ou mais operações de sequenciamento para a uma ou mais misturas em pico, etc.), que pode funcionar para determinar precisamente métricas de abundância, como métricas de abundância que podem ser significativamente analisadas e comparadas (por exemplo, comparação de abundâncias individuais para uma molécula alvo e uma molécula associada ao alvo para gerar uma proporção de abundância, comparação de proporções de abundância para alvos versus referências; etc.), como métricas de abundância que podem ser usadas na facilitação de caracterizações e/ou tratamentos. As métricas de abundâncias podem incluir qualquer um ou mais entre: proporções de abundância (por exemplo, uma proporção de primeira métrica de intensidade máxima para um primeiro pico para uma segunda métrica de intensidade máxima para um segundo pico, como onde o primeiro e segundo picos correspondem a posições de alinhamento iguais ou diferentes; proporções de qualquer resultado de sequenciamento; uma proporção de conta de uma conta de molécula alvo endógena para uma conta de molécula associada ao alvo; uma proporção de resultado de sequenciamento de endógena para em pico, como proporção de métrica de intensidade máxima para uma base de sequência alvo e uma base de sequência associada ao alvo correspondente; proporções com qualquer numerador e denominador adequados; proporções individuais de abundância, como úteis na determinação de uma proporção geral de abundância e/ou métrica de abundância; etc.), mas podem incluir, adicional ou alternativamente, abundâncias individuais (por exemplo, intensidades individuais de pico; contas; etc.), abundâncias relativas, abundâncias absolutas e/ou outra métrica de abundância adequada. Em um exemplo específico, uma proporção de moléculas endógenas para moléculas em pico (por exemplo, proporção entre DNA endógeno e DNA em pico, etc.) pode ser calculada com base em uma proporção de resultado de sequenciamento (por exemplo, proporção de intensidades de pico para um pico endógeno- associado para um pico em pico-associado) e uma abundância conhecida de moléculas em pico (por exemplo, usada para a geração da mistura em pico).
[076] A determinação de métricas de abundância é baseada preferencialmente em um ou mais resultados de sequenciamento, mas pode ser baseada, adicional ou alternativamente, em quaisquer dados adequados (por exemplo, dados suplementares que incluem abundâncias conhecidas, dados biométricos, dados de histórico médico, dados demográficos, histórico genético, dados de pesquisa, dados alimentares, dados comportamentais, dados ambientais, tipo de amostra e/ou outros dados contextuais adequados). Por exemplo, a determinação de proporções de abundância (por exemplo, proporções de abundância associadas ao alvo; etc.) (e/ou quaisquer métricas adequadas de abundância) pode ser baseada em um ou mais resultados relacionados à cromatografia que incluem uma ou mais intensidades de pico, área de picos, métricas de pico para bases que compartilham um tipo de base, métricas de pico para bases com tipos diferentes de base e/ou quaisquer outros resultados adequados relacionados à cromatografia e/ou resultados de sequenciamento.
A determinação de métricas de abundância pode incluir processamento computacional (por exemplo, com um sistema informático remoto como um sistema informático em nuvem, com um sistema informático local, etc.), como processamento computacional de um ou mais resultados de sequenciamento (por exemplo, cromatografias, dados de pico, etc.) e/ou outros dados adequados, mas pode incluir, adicional ou alternativamente, qualquer processamento adequado (por exemplo, processamento manual; etc.). O processamento (por exemplo, para determinação de métricas de abundância; etc.) e/ou porções adequadas de realizações do método 100 (por exemplo, facilitação de caracterizações e/ou tratamentos, etc.) pode incluir qualquer um ou mais entre: realização de estimativa estatística nos dados (por exemplo, regressão de quadrados mínimos ordinários, regressão de quadrados mínimos não negativos, análise de componentes principais, regressão de crista, etc.), deconvolução (por exemplo, de sobreposição de picos decorrente de uma cromatografia, de picos com resolução inadequada, de quaisquer picos adequados; deconvolução de Fourier; deconvolução baseada na função gaussiana; deconvolução de
Lucy-Richardson, etc.), recursos de extração (por exemplo, para qualquer número adequado de picos de uma cromatografia, etc.), realização de reconhecimento de padrão nos dados, fusão de dados de diversas fontes, combinação de valores (por exemplo, valores de cálculo de média, etc.), compressão, conversão (por exemplo, conversão de digital para analógico, conversão de analógico para digital), modulação de onda, normalização, atualização, classificação, validação, filtração (por exemplo, para correção basal, recorte de dados, etc.), redução de ruído, suavização, preenchimento (por exemplo, preenchimento de lacuna), alinhamento, ajuste de modelo, realização de janela, recorte, transformações, operações matemáticas (por exemplo, derivativas, médias de movimento, soma, subtração, multiplicação, divisão, etc.), multiplexação, desmultiplexação, interpolação, extrapolação, agregação, outras operações de processamento de sinal, outras operações de processamento de imagem, visualização e/ou quaisquer outras operações adequadas de processamento.
[077] Em variações, a determinação de métricas de abundância pode ser baseadas em e/ou de outro modo associada a um ou mais resultados de sequenciamento associados a sequências associadas ao alvo (e/ou sequências associadas a referência) que incluem regiões de variação com uma ou mais inserções (por exemplo, inserções de nucleotídeo; etc.) e/ou uma ou mais exclusões (por exemplo, exclusões de nucleotídeo; etc.) e/ou quaisquer modificações adequadas. Por exemplo, determinação de um conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo pode ser baseada em um conjunto de picos (por exemplo, dados de intensidade de pico para picos que correspondem a bases sequenciadas de uma sequência alvo e uma sequência associada ao alvo; etc.) e pelo menos um entre a substituição, a inserção e a exclusão (por exemplo, características da uma ou mais substituições, inserções, e/ou exclusões; como tamanho da modificação, em relação ao número de nucleotídeos; tipos de modificação, como em relação às alterações do tipo de base; posições de onde as modificações são aplicadas; etc.). Como mostrado nas Figuras 6A e 7A, as regiões de variação que incluem uma ou mais inserções e/ou exclusões podem resultar em posições deslocadas de alinhamento (por exemplo, para bases da sequência associada ao alvo, bases relativas a sequência alvo; como onde a similaridade de sequência entre as bases de uma região associada ao alvo e uma região de sequência alvo pode ser deslocada em relação à posição devido a uma ou mais inserções e/ou exclusões; etc.). Em um exemplo, a região de variação alvo (por exemplo, de uma sequência associada ao alvo; etc.) pode incluir pelo menos um entre uma inserção e uma exclusão, onde o um ou mais resultados relacionados à cromatografia podem incluir posições de alinhamento que correspondem a um conjunto de picos (por exemplo, dados de pico para e/ou associados à região associada ao alvo das moléculas associadas ao alvo, da região de sequência alvo do alvo biológico, da região de variação alvo das moléculas associadas ao alvo e da região de sequência do alvo biológico, etc.), e onde a determinação do conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo (e/ou métricas de abundância adequadas) inclui, para cada um dos pares diferentes (por exemplo, de uma base da sequência associada ao alvo e uma base da sequência alvo; etc.): determinação de uma métrica de intensidade máxima (por exemplo, uma intensidade máxima para o pico; uma intensidade geral para o pico; etc.), em uma primeira posição de alinhamento das posições de alinhamento, para a base da sequência associada ao alvo do par, com base no pelo menos um resultado relacionado à cromatografia (por exemplo, baseado nos dados de intensidade de pico para as bases sequenciadas; com base em uma cromatografia; etc.); determinação de uma métrica de intensidade máxima, em uma segunda posição de alinhamento das posições de alinhamento, para a base da sequência alvo do par, com base no pelo menos um resultado relacionado à cromatografia (por exemplo, baseado nos dados de intensidade de pico para as bases sequenciadas; com base em uma cromatografia; etc.), onde a primeira posição de alinhamento é diferente da segunda posição de alinhamento, e onde as posições de alinhamento incluem a primeira e a segunda posições de alinhamento; e/ou determinação de uma proporção de abundância associada ao alvo (e/ou métrica de abundância adequada; etc.) do conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo (e/ou conjunto de métricas de abundância adequadas; etc.), com base na métrica de intensidade máxima para a base da sequência associada ao alvo e a métrica de intensidade máxima para a base da primeira sequência alvo.
Em um exemplo, como mostrado nas Figuras 6A e 7A, a primeira posição de alinhamento pode corresponder a um primeiro pico e um segundo pico (por exemplo, sobrepondo picos que correspondem à mesma posição de alinhamento; correspondendo a tipos iguais ou diferentes de base; etc.) do primeiro conjunto de picos, onde o primeiro pico corresponde a uma base de sobreposição da sequência associada ao alvo (por exemplo, onde as bases da sequência associada ao alvo são marcadas por um “*”, como mostrado nas Figuras 6A e 7A), onde o primeiro pico corresponde a uma primeira proporção de abundância associada ao alvo (por exemplo, para um par da base de sobreposição da sequência associada ao alvo e uma base correspondente, deslocada em posição de alinhamento, da sequência alvo, onde o valor de deslocamento em posição de alinhamento é baseada nas características da uma ou mais inserções e/ou exclusões, como os tamanhos da uma ou mais inserções e/ou exclusões; etc.) do conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo, onde o segundo pico corresponde a uma base de sobreposição da sequência alvo (por exemplo, onde as bases da sequência alvo são marcadas por um “O”, como mostrado nas Figuras 6A e 7A), e/ou onde o segundo pico corresponde a uma segunda proporção de abundância associada ao alvo (por exemplo, distinta da primeira proporção de abundância associada ao alvo; para um par da base de sobreposição da sequência alvo e uma base correspondente, deslocada em posição de alinhamento, da sequência associada ao alvo; etc.) do conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo.
[078] Em um exemplo específico, como mostrado nas Figuras 6A-6B, a abundância inicial do DNA da amostra para a região chr21:15811326-15811417 pode ser determinada ao estimar a proporção da intensidade de DNA “referência” para a intensidade em pico “Spk” (por exemplo, após sequenciamento de Sanger de uma mistura em pico gerado a partir da co- amplificação de moléculas associadas ao alvo e moléculas alvo que incluem a sequência alvo; etc.); onde a sequência associada ao alvo (por exemplo sequência em pico; das moléculas associadas ao alvo; etc.) inclui exclusão de três nucleotídeos, resultando em um deslocamento de três posições na posição de alinhamento para pares correspondentes (por exemplo, sequência similar; etc.) de uma base da sequência associada ao alvo e da sequência alvo; onde as proporções individuais de abundância associadas ao alvo podem ser determinadas com base nas intensidades de pico (por exemplo, indicadas pelas posições dos “*”s e “O”s nos picos da cromatografia) dos pares correspondentes (por exemplo, onde uma proporção individual de abundância para a posição de alinhamento 161, correspondendo a uma base “C” de uma sequência associada ao alvo e indicada por um “*”, pode ser determinada com base em uma proporção de uma métrica de intensidade máxima (por exemplo, intensidade máxima para o pico) para a base “C” da sequência associada ao alvo e uma métrica de intensidade máxima (por exemplo, intensidade máxima para o pico) para a base “C” da sequência alvo, indicada por um “O” e na posição 164 devido a um deslocamento de posição de alinhamento da exclusão de três nucleotídeos na região de variação da sequência associada ao alvo; etc.), como onde as proporções associadas ao alvo podem ser representadas (por exemplo, como mostrado na Figura 6B; como onde a proporção individual de abundância para o par de bases “C” nas posições 161 e 164, respectivamente, é indicada pelo número de posição de alinhamento “161” na representação; etc.), e/ou como onde a inclinação dos pontos de dados (por exemplo, 0,185; a regressão linear para os pontos de dados da proporção de abundância associada ao alvo; da representação; etc.) pode ser uma métrica de abundância que descreve a abundância das moléculas alvo na amostra em relação à abundância das moléculas associadas ao alvo (por exemplo, abundância de DNA endógeno para DNA em pico; o DNA da amostra foi abundante em 0,185 o nível do DNA em pico; etc.).
[079] Em um exemplo específico, como mostrado nas Figuras 7A-7B, a abundância inicial do DNA da amostra para a região chr21:22231528+22231612 pode ser determinada pela estimativa da proporção de intensidade de DNA “referência” hg19 para intensidade de “Spk” em pico (por exemplo, após sequenciamento de Sanger de uma mistura em pico gerada a partir da co-amplificação de moléculas associadas ao alvo e moléculas alvo que incluem a sequência alvo; etc.); onde a sequência associada ao alvo (por exemplo sequência em pico; das moléculas associadas ao alvo; etc.) inclui uma exclusão de três nucleotídeos, resultando em um deslocamento de três posições na posição de alinhamento para os pares correspondentes (por exemplo, sequência similar; etc.) de uma base da sequência associada ao alvo e da sequência alvo; onde as proporções individuais de abundância associadas ao alvo podem ser determinadas com base nas intensidades de pico (por exemplo, indicadas pelas posições dos “*”s e “O”s nos picos da cromatografia) dos pares correspondentes (por exemplo, onde uma proporção individual de abundância para a posição de alinhamento 15, correspondente a uma base “G” de uma sequência associada ao alvo e indicada por um “*”, pode ser determinada com base em uma proporção de métrica de intensidade máxima (por exemplo, intensidade máxima para o pico) para a base “G” da sequência associada ao alvo e uma métrica de intensidade máxima (por exemplo, intensidade máxima para o pico) para a base “G” da sequência alvo, indicada por um “O” e na posição 18 devido a um deslocamento da posição de alinhamento a partir da exclusão de três nucleotídeos na região de variação da sequência associada ao alvo; etc.), como onde as proporções associadas ao alvo podem ser representadas (por exemplo, como mostrado na Figura 7B; como onde a proporção individual de abundância para o par de bases “G” nas posições 15 e 18,
respectivamente, é indicada pelo número de posição de alinhamento “15” na representação; etc.), e/ou como onde a inclinação dos pontos de dados (por exemplo, 0,34; a regressão linear para os pontos de dados da proporção de abundância associada ao alvo; da representação; etc.) pode ser uma métrica de abundância que descreve a abundância das moléculas alvo na amostra em relação à abundância das moléculas associadas ao alvo (por exemplo, abundância de DNA endógeno para DNA em pico; DNA de amostra foi abundante a 0,34 do nível do DNA em pico; etc.).
[080] No entanto, a determinação de métricas de abundância baseada em e/ou de outro modo associada a resultados de sequenciamento associados a regiões de variação que incluem uma ou mais inserções, exclusões e/ou modificações adequadas, pode ser realizada de qualquer forma adequada.
[081] Em uma variação, a extração das métricas de abundância pode incluir desenvolvimento de picos de sobreposição (por exemplo, picos de cromatografia, etc.) que inclui um primeiro pico correspondendo a uma base de sequência associada ao alvo (por exemplo, uma base “A”) em uma região de variação posição, e um segundo pico correspondendo a uma base de sequência alvo (por exemplo, uma base “T”) na posição; e cálculo dos resultados de sequenciamento e/ou métricas de abundância para os picos desenvolvidos (por exemplo, uma proporção de intensidades de pico para a base “T” para a base “A”). Em uma variação, a deconvolução pode ser para picos de sobreposição entre uma base de um primeiro local (por exemplo, cromossomo 18) e uma base de um segundo local (por exemplo, do mesmo cromossomo, de um cromossomo diferente, como o cromossomo 21, etc.).
[082] Em uma variação, como mostrado na Figura 8, a estimativa estatística das abundâncias relativas de alvo e sequências associadas ao alvo de uma cromatografia de mistura em pico pode ser baseada em uma primeira cromatografia (e/ou quaisquer resultados adequados de sequenciamento como dados de pico; etc.) para moléculas alvo isoladamente e/ou uma segunda cromatografia (e/ou quaisquer resultados adequados de sequenciamento; etc.) para moléculas associadas ao alvo isoladamente (por exemplo, onde os picos para uma base em particular entre as cromatografias e/ou conjuntos de resultados de sequenciamento podem ser processados quanto a regressão linear múltipla; etc.). Em uma variação, a deconvolução (por exemplo, deconvolução de Lucy-Richardson) pode ser aplicada para resolver picos de uma cromatografia (por exemplo, obtendo melhora da separação entre picos da mesma cor) e/ou para resolver outros resultados adequados. Em um exemplo específico, o método 100 pode incluir: geração de um conjunto de cromatografias (e/ou dados relacionados à cromatografia; etc.) (por exemplo, para a mistura em pico, para as moléculas associadas ao alvo isoladamente, para as moléculas alvo isoladamente, etc.); resolução de picos dos conjuntos de cromatografia através de deconvolução (por exemplo, onde esta e/ou outras operações adequadas podem ser omitidas; etc.); e realização de análises de regressão nas cromatografias processadas. Adicional ou alternativamente, a deconvolução, análises de regressão ou outras operações computacionais podem ser realizadas para qualquer número e combinação adequados de picos de cromatografia e/ou outros componentes dos resultados do sistema de sequenciamento.
[083] Em uma variação, a determinação de uma métrica de abundância pode incluir a determinação de uma métrica geral de abundância decorrente de uma pluralidade de individual métricas de abundância, o que pode aumentar a precisão da métrica de abundância.
Em um exemplo, o método 100 pode incluir a determinação de pelo menos um resultado relacionado à cromatografia baseado no sequenciamento de Sanger associado ao primeiro conjunto de moléculas associadas ao alvo (por exemplo, incluindo uma primeira sequência associada ao alvo que inclui uma primeira região associada ao alvo com similaridade de sequência com uma primeira região de sequência alvo de uma primeira sequência alvo; etc.), o conjunto de moléculas alvo e um segundo conjunto de moléculas associadas ao alvo, onde o segundo conjunto de moléculas associadas ao alvo inclui uma segunda sequência associada ao alvo que inclui uma segunda região associada ao alvo com similaridade de sequência com uma segunda região de sequência alvo de uma segunda sequência alvo; determinação de um primeiro conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo para diferentes conjuntos de bases da primeira sequência associada ao alvo e da primeira sequência alvo (por exemplo, onde cada conjunto diferente de bases, dos diferentes conjuntos de bases, inclui pelo menos uma base da primeira sequência associada ao alvo e pelo menos uma base da primeira sequência alvo; etc.), com base no pelo menos um resultado relacionado à cromatografia; determinação de um segundo conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo para diferentes conjuntos de bases da segunda sequência associada ao alvo e da segunda sequência alvo (por exemplo, onde cada conjunto diferente de bases, dos diferentes conjuntos de bases, inclui pelo menos uma base da segunda sequência associada ao alvo e pelo menos uma base da segunda sequência alvo, etc.) com base no pelo menos um resultado relacionado à cromatografia; e/ou determinação de uma ou mais métricas geral de abundância (por exemplo, que descreve uma abundância do alvo biológico para a amostra, etc.) com base no primeiro e no segundo conjuntos de proporções de abundância associadas ao alvo. Em um exemplo, a primeira sequência alvo pode corresponder a um primeiro local de um cromossomo, onde a segunda sequência alvo pode corresponder a um segundo local do cromossomo, e onde a facilitação de caracterização da uma ou mais condições pode incluir a facilitação de caracterização de uma anormalidade cromossômica baseada na uma ou mais métricas geral de abundância.
[084] Por exemplo, como mostrado na Figura 9, a determinação de uma proporção geral de métrica de abundância pode ser baseada em: determinação de proporções individuais de resultado de sequenciamento para cada posição de uma região de variação baseada em resultados de sequenciamento (por exemplo, intensidades de pico, etc.) para pares de um pico endógeno- associado e um pico associado em pico correspondente para bases na posição, onde as proporções individuais do resultado de sequenciamento podem abranger qualquer número de posições da base, entre qualquer número de locais (por exemplo, onde as proporções individuais do resultado de sequenciamento para diferentes locais são extraídas de diferentes cromatografias para os diferentes locais; onde as proporções são extraídas da mesma cromatografia que inclui dados para uma pluralidade de locais; etc.), cromossomos, alvos e/ou outros aspectos adequados; e combinação das proporções individuais do resultado de sequenciamento (por exemplo, cálculo de média).
Adicional ou alternativamente, a determinação de métricas gerais de abundância de métricas individuais de abundância pode influenciar qualquer abordagem estatística adequada (por exemplo, cálculo de média, mediana, etc.) e/ou pode ser realizada de qualquer forma adequada.
Em uma variação, diferentes conjuntos de métricas de abundância podem ser determinados para amostras preparadas separadamente e/ou sequenciadas (por exemplo, para uma primeira amostra que inclui moléculas associadas ao alvo, e uma segunda amostra que inclui moléculas alvo, onde a primeira e a segunda amostras podem ser preparadas separadamente e/ou sequenciadas como sequência de Sanger; etc.). Por exemplo, o método 100 pode incluir o sequenciamento de Sanger (por exemplo, realizado por uma primeira parte, por terceiros, um usuário e/ou qualquer entidade adequada; etc.) que inclui: sequenciamento de Sanger de uma primeira amostra incluindo um conjunto de moléculas associadas ao alvo; e sequenciamento de Sanger de uma segunda amostra incluindo o conjunto de moléculas alvo, onde a determinação do pelo menos um resultado relacionado à cromatografia (por exemplo, um conjunto de intensidades de pico; cromatografias; etc.) pode incluir: determinação de um primeiro resultado relacionado à cromatografia (por exemplo, uma cromatografia, um conjunto de intensidades de pico; etc.) associado ao conjunto de moléculas associadas ao alvo (por exemplo, dados de intensidade de pico para bases de uma sequência associada ao alvo do conjunto de moléculas associadas ao alvo; etc.), com base no sequenciamento de Sanger da primeira amostra; e determinação de um segundo resultado relacionado à cromatografia (por exemplo, uma cromatografia, um conjunto de intensidades de pico; etc.) associado ao conjunto de moléculas alvo (por exemplo, dados de intensidade de pico para bases de uma sequência associada ao alvo do conjunto de moléculas associadas ao alvo; etc.), com base no sequenciamento de Sanger da segunda amostra, e onde a determinação de um conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo (e/ou quaisquer métricas de abundância adequadas) podem incluir a determinação do conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo com base no primeiro resultado relacionado à cromatografia e no segundo resultado relacionado à cromatografia (por exemplo, determinação de um primeiro conjunto de proporções individuais de abundância para o conjunto de moléculas associadas ao alvo com base no primeiro resultado relacionado à cromatografia; determinação de um segundo conjunto de proporções individuais de abundância para o conjunto de moléculas alvo com base no segundo resultado relacionado à cromatografia; onde uma proporção geral de abundância pode ser determinada com base nas proporções individuais de abundância; etc.).
[085] Em uma variação, as métricas de abundância podem ser determinadas ao longo do tempo (por exemplo, para diferentes amostras coletadas ao longo do tempo; pela realização de diversos exemplos de realizações do método 100 ao longo do tempo; etc.), onde as séries de métricas de abundância podem ser analisadas na facilitação de uma ou mais caracterizações de uma ou mais condições (por exemplo, monitoramento da contagem de moléculas associadas ao câncer ao longo do tempo; etc.), tratamentos (por exemplo, avaliação da eficácia de tratamento contra o câncer ao longo do tempo; etc.) e/ou outras informações adequadas. Por exemplo, o método 100 pode incluir, onde uma ou mais condições (por exemplo,
condições médicas, etc.) podem incluir pelo menos um entre um distúrbio genético único e uma condição cancerosa (e/ou quaisquer condições adequadas; etc.); determinação de uma primeira métrica geral de abundância (e/ou qualquer primeira métrica de abundância adequada; etc.) (por exemplo, que descreve uma primeira abundância do alvo biológico; etc.) associada a um primeiro período de tempo (por exemplo, associado a um primeiro exemplo de realização de uma ou mais porções de realizações do método 100; etc.); determinação de uma segunda métrica geral de abundância (por exemplo, que descreve uma segunda abundância do alvo biológico; etc.) onde a segunda métrica geral de abundância está associada a um segundo período de tempo (por exemplo, associado a um segundo exemplo de realização de uma ou mais porções de realizações do método 100; etc.); e/ou facilitação da caracterização da uma ou mais condições com base na primeira métrica geral de abundância (por exemplo, com base em uma primeira comparação entre a primeira métrica geral de abundância e uma primeira métrica de abundância associada à referência, como uma primeira métrica geral de abundância associada à referência; etc.) e a segunda métrica geral de abundância (por exemplo, uma segunda comparação entre a segunda métrica geral de abundância e uma segunda métrica geral de abundância associada à referência que descreve uma segunda abundância da mesma referência biológica e ou uma referência biológica diferente, onde a segunda métrica geral de abundância associada à referência pode ser associada ao segundo período de tempo e/ou qualquer período de tempo adequado; uma segunda comparação entre a segunda métrica geral de abundância e a primeira métrica geral de abundância associada à referência, etc.).
[086] Em uma variação, a determinação de uma métrica de abundância pode incluir a aplicação de um modelo de determinação de abundância que inclui qualquer uma ou mais entre: propriedades probabilísticas, propriedades heurísticas, propriedades determinísticas e/ou quaisquer outras propriedades adequadas.
[087] No entanto, a determinação de métricas de abundância S140 pode ser realizada de qualquer forma adequada.
2.5 Processamento de moléculas associadas à referência.
[088] Adicional ou alternativamente, as realizações do método 100 podem incluir processamento de um conjunto de moléculas associadas à referência (por exemplo, que inclui uma sequência de referência incluindo uma região associada à referência e uma região de variação de referência, como onde as sequências e/ou regiões são análogas à sequência e/ou regiões de moléculas associadas ao alvo, como onde estas moléculas, sequências e/ou regiões podem ser configuradas, geradas, aplicadas, processadas e/ou usadas de formas análogas, como em uma forma análoga àquela descrita em relação a S110, S120 e/ou pelo presente; etc.); S115, que pode funcionar para gerar e/ou processar (por exemplo, ao aplicar uma ou mais porções adequadas de realizações do método 100, etc.) moléculas associadas às moléculas de referência (por exemplo, ácidos nucleicos de referência que incluem uma sequência de referência que identifica um cromossomo de referência, como o cromossomo 21; ácidos nucleicos de referência que incluem uma sequência de referência associada às versões do tipo selvagem para distúrbios genéticos únicos; etc.), como moléculas de referência presentes em uma amostra
(por exemplo, a amostra biológica a partir da qual as moléculas alvo são extraídas; etc.), como para determinar as métricas de abundância de referência (por exemplo, métricas de abundância associadas à referência; etc.) que podem ser comparadas às métricas de abundância para alvos (por exemplo, na determinação da abundância relativa; comparadas às métricas de abundância associadas ao alvo; etc.) e/ou de outro modo processadas (por exemplo, para facilitação de caracterização e/ou tratamentos; etc.) como ao comparar uma proporção de abundância para o cromossomo alvo 21 com uma proporção de abundância para o cromossomo de referência 18 para teste quanto à trissomia 21 e/ou trissomia 18. O processamento de moléculas associadas à referência (por exemplo, geração das moléculas; processamento das moléculas para gerar misturas em pico de referência; sequenciamento; processamento computacional, etc.) e/ou moléculas de referência pode ser realizado de qualquer forma análoga para processamento das moléculas associadas ao alvo, moléculas alvo e/ou outros componentes adequados. No entanto, o processamento de moléculas associadas à referência S115 pode ser realizado de qualquer forma adequada.
2.6 Facilitação da Caracterização de uma Condição.
[089] Adicional ou alternativamente, as realizações do método 100 podem incluir a facilitação de caracterização de uma ou mais condições S150 (por exemplo, condições médicas como distúrbio genéticos; com base em uma ou mais métricas de abundância; etc.), que podem funcionar para detectar, diagnostica, analisar, determinar caracterizações para, auxiliar um ou mais prestadores de cuidados em relação a, prover dados (por exemplo, parâmetros; etc.) em relação a; e/ou de outro modo facilitar a caracterização de uma ou mais condições.
[090] As caracterizações podem incluir qualquer um ou mais entre: diagnósticos, avaliações de risco, causas (por exemplo, identificação de comportamentos do usuário, dados demográficos, histórico médico, genética e/ou outros aspectos adequados que contribuem para a condição) e/ou outras informações adequadas informativas da uma ou mais condições. Em variações, uma ou mais caracterizações podem ser usadas em qualquer um ou mais entre: determinação de um tratamento, informação aos usuários, informação aos prestadores de cuidados (por exemplo, orientar o prestador de cuidados nos diagnósticos; etc.) e/ou realização de quaisquer operações adequadas. A facilitação de uma ou mais caracterizações é baseada preferencialmente em comparações de proporções de abundância (por exemplo, uma comparação de uma proporção geral de abundância associada ao alvo com proporções gerais de abundância associadas à referência), mas pode ser baseada, adicional ou alternativamente, em qualquer número e/ou tipo de métricas de abundância (por exemplo, quaisquer técnicas analíticas adequadas, como análises de estimativa estatística, aplicadas para e/ou usadas na geração das métricas de abundância; etc.), porém, pode ser baseada, adicional ou alternativamente, em quaisquer métricas de abundância adequadas. Em um exemplo, o alvo biológico pode ser associado a uma ou mais condições médicas, e a facilitação de caracterização da uma ou mais condições médicas pode ser baseada em uma comparação entre uma primeira métrica geral de abundância (por exemplo, uma métrica geral de abundância associada ao alvo; etc.) e uma segunda métrica geral de abundância (por exemplo, uma métrica geral de abundância associada à referência que descreve abundância de uma referência biológica; etc.).
[091] Em um exemplo, a condição (por exemplo, condição médica; etc.) pode incluir um distúrbio genético que inclui pelo menos um entre uma anormalidade cromossômica e um distúrbio genético único; onde uma primeira região de sequência alvo (por exemplo, de uma primeira sequência alvo de um primeiro conjunto de moléculas associadas ao alvo; etc.) pode ser associada a pelo menos um entre um primeiro cromossomo e uma mutação; onde uma região de sequência de referência da referência biológica é associada a pelo menos um entre um segundo cromossomo e uma falta de mutação; e/ou onde a facilitação de diagnóstico pré-natal (e/ou caracterizações adequadas; etc.) do distúrbio genético inclui a facilitação do diagnóstico pré-natal de pelo menos um entre a anormalidade cromossômica e o distúrbio genético único com base na comparação entre uma proporção geral de abundância associada ao alvo (por exemplo, determinada com base em um primeiro conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo que correspondem às intensidades de pico de um par diferente de uma base da primeira sequência associada ao alvo e uma base da primeira sequência alvo; etc.) e uma proporção geral de abundância associada à referência (por exemplo, determinada com base em um conjunto de proporções de abundância associadas à referência que corresponde às intensidades de pico de um par diferente de uma base da sequência associada à referência e uma base da sequência de referência; etc.). Em um exemplo, a condição pode incluir um distúrbio genético que inclui a anormalidade cromossômica, onde a primeira sequência alvo corresponde a um primeiro local do primeiro cromossomo, e onde o método 100 pode incluir a geração de um segundo conjunto de moléculas associadas ao alvo que inclui uma segunda sequência associada ao alvo incluindo uma segunda região associada ao alvo com similaridade de sequência com uma segunda região de sequência alvo de uma segunda sequência alvo correspondendo a um segundo local do primeiro cromossomo; e determinação de um segundo conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo com base no pelo menos um resultado relacionado à cromatografia, onde cada proporção de abundância associada ao alvo, do segundo conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo, corresponde a um par diferente de uma base da segunda sequência associada ao alvo e uma base da segunda sequência alvo, onde a determinação da proporção geral de abundância associada ao alvo inclui a determinação da proporção geral de abundância associada ao alvo com base no primeiro conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo e no segundo conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo, e onde a região de sequência de referência da referência biológica é associada ao segundo cromossomo.
[092] Em um exemplo, a condição (por exemplo, condição médica; etc.) pode incluir pelo menos um entre uma ou mais anormalidades cromossômicas, um ou mais distúrbios genéticos únicos e/ou uma ou mais condições cancerosas, onde uma região de sequência alvo é associada a pelo menos um entre um primeiro cromossomo (por exemplo, associado à anormalidade cromossômica; associado à condição cancerosa; etc.) e uma mutação (por exemplo, associada à anormalidade cromossômica; associada à condição cancerosa; etc.), onde uma região de sequência de referência da referência biológica é associada a pelo menos um entre um segundo cromossomo e uma falta da mutação, e/ou onde a facilitação da caracterização da condição médica inclui facilitação da caracterização da pelo menos uma entre uma ou mais anormalidades cromossômicas, um ou mais distúrbios genéticos únicos e/ou uma ou mais condições cancerosas, com base em uma ou mais métricas de abundância (por exemplo, um conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo e um conjunto de proporções de abundância associadas à referência, como proporções gerais de abundância associadas ao alvo determinadas a partir do conjunto de proporções de abundância associadas ao alvo, e uma proporção geral de abundância associada à referência determinada a partir do conjunto de abundância associada à referência; etc.).
[093] Em variações, a facilitação de uma ou mais caracterizações pode ser baseada em uma ou mais medições de fração fetal (e/ou quaisquer outros dados adequados, como uma ou mais métricas de abundância; etc.). Por exemplo, a facilitação do diagnóstico pré-natal pode incluir facilitação do diagnóstico pré-natal de um ou mais distúrbios genéticos baseados em uma medição de fração fetal e/ou uma ou mais métricas de abundância (por exemplo, uma proporção geral de abundância associada ao alvo, uma proporção geral de abundância associada à referência, uma comparação entre as proporções, etc.). No entanto, a facilitação de caracterizações baseada em medições de fração fetal pode ser realizada de qualquer forma adequada.
[094] A facilitação de caracterização de uma ou mais condições e/ou quaisquer outras porções adequadas de realizações do método 100 (por exemplo, determinação de métricas de abundância; facilitação de tratamento; etc.) pode incluir aplicação de uma ou mais abordagens de inteligência artificial (por exemplo, abordagens de aprendizado de máquina, etc.) que incluem qualquer um ou mais entre: aprendizado supervisionado (por exemplo, utilizando regressão logística, utilizando redes neurais de retropropagação, utilizando florestas de decisão aleatória, árvores de decisão, etc.), aprendizado não supervisionado (por exemplo, utilizando um algoritmo Apriori, utilizando agrupamento K-means), aprendizado semissupervisionado, um algoritmo de aprendizado profundo (por exemplo, redes neurais, uma máquina de Boltzmann restrita, um método de redes de crença profunda, um método de rede neural convolucional, um método de rede neural recorrente, método de codificador automático empilhado, etc.), aprendizado por reforço (por exemplo, utilizando um algoritmo de aprendizado Q, utilizando aprendizado por diferença temporal), uma algoritmo por regressão (por exemplo, quadrados mínimos ordinários, regressão logística, regressão gradual, estrias de regressão adaptativa multivariada, suavização no gráfico de dispersão localmente estimado, etc.), um método baseado em exemplos (por exemplo, k-vizinhos mais próximos, quantização de vetor de aprendizado, mapa de auto-organização, etc.), um método de regularização (por exemplo, regressão de crista, redução menos absoluta e operador de seleção, rede elástica, etc.), um método de aprendizado por árvore de decisão (por exemplo, árvore de classificação e regressão, dicotomizador iterativo 3, C4.5, detecção de interação automática qui- quadrada, toco de decisão, floresta de decisão aleatória, estrias de regressão adaptativa multivariada, máquinas de aumento de gradiente, etc.), um método bayesiano (por exemplo, Bayes ingênuo, estimadores de uma dependência em média, rede de crença bayesiana, etc.), um método de Kernel (por exemplo,
uma máquina de vetor de suporte, uma função de base radial, uma análise discriminatória linear, etc.), um método de agrupamento (por exemplo, agrupamento k-means, maximização de expectativa, etc.), um algoritmo de aprendizado associado a regras (por exemplo, um algoritmo Apriori, um algoritmo Eclat, etc.), um modelo de rede neural artificial (por exemplo, um método Perceptron, um método de retropropagação, um método de rede de Hopfield, um método de mapa de auto-organização, um método de quantização de vetor de aprendizado, etc.), um método de redução de dimensionalidade (por exemplo, análise de componente principal, regressão de quadros mínimos parcial, mapeamento de Sammon, escala multidimensional, busca de projeção, etc.), um método de conjunto (por exemplo, de aumento, agregação de inicialização, AdaBoost, generalização empilhada, método de máquina de aumento de gradiente, método de floreta de decisão aleatória, etc.), e/ou qualquer abordagem adequada de inteligência artificial.
[095] No entanto, a facilitação de caracterização da uma ou mais condições S150 pode ser realizada de qualquer forma adequada.
2.7 Facilitação de tratamento.
[096] Adicional ou alternativamente, as realizações do método 100 podem incluir facilitação de tratamento S160 (por exemplo, com base em uma ou mais métricas de abundância; com base em uma ou mais caracterizações de uma ou mais condições; etc.), que podem funcionar para influenciar os dados de abundância para determinar, prover, administrar, promover, recomendar e/ou de outro modo facilitar a provisão de tratamento (por exemplo, provisão de tratamento personalizado, etc.) para uma ou mais condições. A facilitação de tratamento pode incluir aplicação de quaisquer técnicas adequadas associadas à análise de métricas de abundância (por exemplo, pra facilitação de uma ou mais caracterizações; usando operações ou algoritmos estatísticos similares ou diferentes; usando as métricas de abundância iguais ou diferentes, dados complementares, outros dados adequados; etc.). Os tratamentos podem incluir qualquer um ou mais entre: composições terapêuticas (por exemplo, composições relacionadas à gestação, tratamentos baseados em medicação, tratamentos baseados em probiótico, tratamentos à base tópica, etc.), tratamentos cirúrgicos, tratamentos baseados em dispositivo médico, notificações relacionadas à saúde (por exemplo, transmitidas ao indivíduo, a um prestador de cuidados, etc.) que incluem informações relacionadas à condição e/ou relacionadas ao tratamento derivadas com base nas métricas de abundância; tratamentos relacionados à alimentação; tratamentos cognitivos/comportamentais; terapias físicas; tratamentos relacionados a clínicas (por exemplo, telemedicina, agendamento de consulta com um prestador de cuidados, etc.); tratamentos baseados em medicina alternativa; tratamentos com base no ambiente; e/ou qualquer outro tipo adequado de tratamento. No entanto, a facilitação do tratamento S160 pode ser realizada de qualquer forma adequada.
2.8 Validação.
[097] Adicional ou alternativamente, as realizações do método 100 podem incluir validação de S105 (por exemplo, como a validação de uma ou mais porções de realizações do método 100 e/ou sistema 200, etc.), que podem funcionar para avaliar quaisquer parâmetros adequados (por exemplo, precisão, custo, eficácia, destacabilidade, etc.) associados às realizações do método 100 e/ou sistema 200. Em um exemplo específico, a Figura 10 pode incluir uma representação de um protocolo de laboratório úmido de adição de DNA em pico a uma amostra de massa desconhecida; onde a sequência de DNA em pico é idêntica ao DNA endógeno, exceto para uma região de variável 10 bp; onde o DNA em pico e endógeno é então amplificado por PCR, e o amplicon resultante é purificado e sequenciado por Sanger como utilizando química BigDye v3.3; onde a Figura 10 inclui cromatografias de DNA em pico e endógeno, preparações puras do DNA endógeno e em pico sequenciado individualmente; onde a cromatografia de uma mistura endógena/em pico é uma combinação linear das cromatografias puras em pico e endógenas; onde a Figura 10 inclui resultados de análise computacional de dados cromatográficos para o cálculo da massa do DNA endógeno; onde a proporção do DNA em pico e endógeno é determinada a partir de uma análise de regressão linear; onde cada canal da cromatografia de Sanger, correspondente a dideoxinucleotídeos fluorescentemente rotulados, é analisado individualmente; onde a análise sobre o canal “A” é representada; e onde as intensidades de pico nas posições de base esperadas para exibir um pico “A” nas cromatografias endógenas ou em pico são medidas.
Em um exemplo específico, como mostrado na Figura 10, a validação pode incluir realização de processamento de amostra e processamento computacional (por exemplo, utilizando quaisquer técnicas adequadas aqui descritas, etc.), a fim de avaliar a precisão para as realizações do método 100 na determinação de métricas de abundância para misturas em pico e/ou outros componentes adequados; onde a validação de métricas (por exemplo, proporção de mistura endógena para em pico para uma mistura em pico que inclui componentes de abundâncias desconhecidas, etc.) pode ser calculada de forma que possa ser usada como fator de calibração para ajuste da proporção de métricas de abundância calculada para amostras com abundâncias de molécula alvo desconhecida, e/ou pode ser usada para quaisquer fins adequados.
[098] Em uma variação, como mostrado nas Figuras 12A-12B, quaisquer abundâncias adequado (por exemplo, decorrentes de uma diluição em série, etc.) de moléculas associadas ao alvo (por exemplo, moléculas em pico) podem ser usadas para avaliar exatidão, precisão e/ou outros parâmetros adequados associados às porções de realizações do método 100. Em um exemplo específico, como mostrado nas Figuras 12A-12B (por exemplo, que indica a exatidão e/ou precisão da aplicação de porções de realizações do método 100), 42 ng de DNA genômico humano NA12878 foram misturadas a quantidades variantes de DNA em pico e amplificados com 30 ciclos de PCR, e a proporção do DNA em pico em cada amostra foi determinada pela aplicação de porções de realizações do método 100; e onde a linha de regressão foi ajustada às 4 amostras que produziram proporção em pico > 0, e com base no ajuste de regressão, 0,0226 amol, ou 44,9 ng, prevê-se o rendimento de uma proporção em pico de ½; onde 1 fmol do DNA de referência foi misturado ao DNA em pico nas proporções indicadas; e onde as misturas foram amplificadas para 20x PCR, purificadas, e as porções das realizações do método 100 podem ser realizadas.
[099] No entanto, a validação de S105 pode ser realizada de qualquer forma adequada.
[100] No entanto, as realizações do método 100 podem ser realizadas de qualquer forma adequada.
[101] As realizações do método 100 e/ou sistema
200 podem incluir qualquer combinação e permutação dos diversos componentes do sistema e dos diversos processos do método, inclusive quaisquer variantes (por exemplo, realizações, variações, exemplos, exemplos específicos, figuras, etc.), onde as porções de realizações do método 100 e/ou processos aqui descritos podem ser realizadas de forma assíncrona (por exemplo, sequencialmente), concomitante (por exemplo, em paralelo) ou em qualquer outra ordem adequada e/ou utilizando um ou mais exemplos, elementos, componentes de e/ou outros aspectos do sistema 200 e/ou outras entidades aqui descritas.
[102] Quaisquer variantes aqui descritas (por exemplo, realizações, variações, exemplos, exemplos específicos, figuras, etc.) e/ou qualquer porção das variantes aqui descritas podem ser, adicional ou alternativamente, combinadas, agregadas, excluídas, usadas, realizadas de forma serial, realizadas em paralelo e/ou de outro modo aplicadas.
[103] As porções das realizações do método 100 e/ou sistema 200 podem ser incorporadas e/ou implementadas pelo menos em parte como uma máquina configurada para receber uma mídia de leitura por computador que armazena instruções de leitura por computador. As instruções podem ser executadas por componentes executáveis por computador que podem ser integrados às realizações do sistema 200. A mídia de leitura por computador pode ser armazenada em qualquer mídia de leitura por computador adequada como RAMs, ROMs, memória flash, EEPROMs, dispositivos ópticos (CD ou DVD), discos rígidos, drives de disquete, ou qualquer dispositivo adequado. O componente executável por computador pode ser um processador geral ou de aplicação específica, mas qualquer hardware dedicado adequado ou dispositivo de combinação de hardware/firmware pode, alternativa ou adicionalmente, executar as instruções.
[104] Como um técnico no assunto reconhecerá a partir da descrição detalhada anterior e a partir das figuras e reivindicações, podem ser realizadas modificações e alterações às realizações do método 100, sistema 200 e/ou variantes sem se desviar do escopo definido nas reivindicações.
Claims (20)
1. MÉTODO PARA FACILITAR O DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL DE
UM DISTÚRBIO GENÉTICO A PARTIR DE UMA AMOSTRA MATERNA ASSOCIADA A UMA GESTANTE, sendo o método caracterizado por compreender: • geração de um primeiro conjunto de moléculas associadas ao alvo compreendendo uma primeira sequência associada ao alvo que compreende: • primeira região associada ao alvo com similaridade de sequência com uma primeira região de sequência alvo de uma primeira sequência alvo de um alvo biológico, em que o alvo biológico está associado ao distúrbio genético; e • região de variação alvo com disparidade de sequência com uma região de sequência da sequência alvo; • geração de uma mistura em pico coamplificado com base na coamplificação do primeiro conjunto de moléculas associadas ao alvo e primeiras moléculas de ácido nucleico a partir da amostra materna, em que as primeiras moléculas de ácido nucleico compreendem a região de sequência alvo; • sequenciamento de Sanger da mistura em pico coamplificado para determinar pelo menos um resultado relacionado à cromatografia compreendendo os primeiros picos associados à primeira região associada ao alvo, à região de sequência alvo do alvo biológico, à região de variação alvo e à região de sequência do alvo biológico; • determinação de um primeiro conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo, em que cada métrica de abundância associada ao alvo do primeiro conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo corresponde a um par diferente de uma base da primeira sequência associada ao alvo e uma base da primeira sequência alvo, em que a determinação do primeiro conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo compreende, para cada um dos pares diferentes: • determinação de uma métrica de intensidade máxima para a base da primeira sequência associada ao alvo do par, com base no pelo menos um resultado relacionado à cromatografia; • determinação de uma métrica de intensidade máxima para a base da primeira sequência alvo do par, com base no pelo menos um resultado relacionado à cromatografia; e • determinação de uma métrica de abundância associada ao alvo do primeiro conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo, com base na métrica de intensidade máxima para a base da primeira sequência associada ao alvo e na métrica de intensidade máxima para a base da primeira sequência alvo; • determinação de uma métrica geral de abundância associada ao alvo baseada no primeiro conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo; e • facilitação do diagnóstico pré-natal do distúrbio genético com base em uma comparação entre a métrica geral de abundância associada ao alvo e uma métrica geral de abundância associada à referência que descreve a abundância de uma referência biológica relativa às moléculas associadas à referência.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, • sendo o distúrbio genético caracterizado por compreender pelo menos um entre uma anormalidade cromossômica e um distúrbio genético único, • em que a primeira região de sequência alvo está associada a pelo menos um entre um primeiro cromossomo e uma mutação, • em que uma região de sequência de referência da referência biológica está associada a pelo menos um entre um segundo cromossomo e uma falta da mutação, e • em que a facilitação do diagnóstico pré-natal do distúrbio genético compreende a facilitação do diagnóstico pré-natal da pelo menos uma entre a anormalidade cromossômica e o distúrbio genético único com base na comparação entre a métrica geral de abundância associada ao alvo e a métrica geral de abundância associada à referência.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, sendo o distúrbio genético caracterizado por compreender a anormalidade cromossômica, em que a primeira sequência alvo corresponde a um primeiro local do primeiro cromossomo, em que o método compreende ainda: • geração de um segundo conjunto de moléculas associadas ao alvo compreendendo uma segunda sequência associada ao alvo, em que a segunda sequência associada ao alvo compreende: • segunda região associada ao alvo com similaridade de sequência com uma segunda região de sequência alvo de uma segunda sequência alvo, • em que a segunda sequência alvo corresponde a um segundo local do primeiro cromossomo; e • determinação de um segundo conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo com base no pelo menos um resultado relacionado à cromatografia, em que cada métrica de abundância associada ao alvo do segundo conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo corresponde a um par diferente de uma base da segunda sequência associada ao alvo e uma base da segunda sequência alvo, • em que a determinação da métrica geral de abundância associada ao alvo compreende a determinação da métrica geral de abundância associada ao alvo com base no primeiro conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo e no segundo conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo, e • em que a região de sequência de referência da referência biológica está associada ao segundo cromossomo.
4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, sendo a facilitação do diagnóstico pré-natal caracterizada por compreender a facilitação do diagnóstico pré-natal do distúrbio genético com base em uma medição de fração fetal, na métrica geral de abundância associada ao alvo e na métrica geral de abundância associada à referência.
5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, sendo a região de variação alvo caracterizada por compreender pelo menos entre uma inserção e uma exclusão comparada à sequência alvo, em que o pelo menos um resultado relacionado à cromatografia compreende posições de alinhamento correspondendo aos primeiros picos, em que, para cada um dos pares diferentes, a base da primeira sequência associada ao alvo corresponde a uma primeira posição de alinhamento diferente de uma segunda posição de alinhamento que corresponde à base da primeira sequência alvo, e em que as posições de alinhamento do pelo menos um resultado relacionado à cromatografia compreendem a primeira e a segunda posições de alinhamento.
6. MÉTODO PARA FACILITAÇÃO DE CARACTERIZAÇÃO DE UMA
CONDIÇÃO MÉDICA A PARTIR DE UMA AMOSTRA COMPREENDENDO MOLÉCULAS ALVO, sendo o método caracterizado por compreender: • geração de um conjunto de moléculas associadas ao alvo compreendendo uma sequência associada ao alvo que compreende: • primeira região associada ao alvo com similaridade de sequência com uma primeira região de sequência alvo de uma sequência alvo de um alvo biológico, em que o alvo biológico está associado ao distúrbio genético; e • região de variação alvo com disparidade de sequência com uma região de sequência da sequência alvo; • realização do sequenciamento de Sanger com base no conjunto de moléculas associadas ao alvo e de moléculas alvo compreendendo a sequência alvo para determinar pelo menos um resultado relacionado à cromatografia compreendendo um primeiro conjunto de picos associados à primeira região associada ao alvo, à primeira região de sequência alvo do alvo biológico, à região de variação alvo e à região de sequência do alvo biológico; • determinação de um conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo para um conjunto de pares diferentes de bases, com base no primeiro conjunto de picos do pelo menos um resultado relacionado à cromatografia, em que cada par diferente de bases, a partir do conjunto de pares diferentes de bases, corresponde a um par de uma base da sequência associada ao alvo e uma base da sequência alvo; e
• facilitação da caracterização da condição clínica com base no conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo e em um conjunto de métricas de abundância associadas à referência que descreve abundância de uma referência biológica relativa às moléculas associadas à referência.
7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, sendo a região de variação alvo caracterizada por compreender pelo menos uma entre uma substituição, uma inserção e uma exclusão relativas à região de sequência da sequência alvo, e em que a determinação do conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo compreende a determinação do conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo com base no primeiro conjunto de picos e na pelo menos uma entre a substituição, a inserção e a exclusão.
8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, sendo a região de variação alvo caracterizada por compreender pelo menos uma entre a inserção e a exclusão, em que o pelo menos um resultado relacionado à cromatografia compreende posições de alinhamento que correspondem ao primeiro conjunto de picos, e em que a determinação do conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo compreende, para cada um dos pares diferentes: • determinação de uma métrica de intensidade máxima, em uma primeira posição de alinhamento das posições de alinhamento, para a base da primeira sequência associada ao alvo do par, com base no pelo menos um resultado relacionado à cromatografia; • determinação de uma métrica de intensidade máxima, em uma segunda posição de alinhamento das posições de alinhamento, para a base da primeira sequência alvo do par, com base no pelo menos um resultado relacionado à cromatografia, em que a primeira posição de alinhamento é diferente da segunda posição de alinhamento, e em que as posições de alinhamento compreendem a primeira e a segunda posições de alinhamento; e • determinação de uma métrica de abundância associada ao alvo do conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo, com base na métrica de intensidade máxima para a base da sequência associada ao alvo e na métrica de intensidade máxima para a base da primeira sequência alvo.
9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, • caracterizado pela primeira posição de alinhamento corresponder a um primeiro pico e um segundo pico do primeiro conjunto de picos, • em que o primeiro pico corresponde a uma base de sobreposição da sequência associada ao alvo, • em que o primeiro pico corresponde a uma primeira métrica de abundância associada ao alvo do conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo, • em que o segundo pico corresponde a uma base de sobreposição da sequência alvo, e • em que o segundo pico corresponde a uma segunda métrica de abundância associada ao alvo do conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo.
10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, • sendo a condição médica caracterizada por compreender pelo menos um entre uma anormalidade cromossômica, um distúrbio genético único e uma condição cancerosa,
• em que a primeira região de sequência alvo está associada a pelo menos um entre um primeiro cromossomo e uma mutação, • em que uma região de sequência de referência da referência biológica está associada a pelo menos um entre um segundo cromossomo e uma falta da mutação, e • em que a facilitação de caracterização da condição médica compreende a facilitação de caracterização da pelo menos uma entre a anormalidade cromossômica, o distúrbio genético único e a condição cancerosa, com base no conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo e no conjunto de métricas de abundância associadas à referência.
11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender ainda adição de pelo menos uma região de sequência a pelo menos um do conjunto de moléculas associadas ao alvo e de moléculas alvo, em que a pelo menos um região de sequência compreende pelo menos uma entre (a) uma segunda região associada ao alvo com similaridade de sequência com uma segunda região de sequência alvo, e (b) pelo menos uma repetição de sequência de pelo menos uma entre uma região da sequência associada ao alvo e uma região da sequência alvo.
12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, • sendo a adição da pelo menos uma região de sequência caracterizada por compreender adição da pelo menos uma repetição de sequência de pelo menos uma entre a região da sequência associada ao alvo e a região da sequência alvo, • em que o primeiro conjunto de picos do pelo menos um resultado relacionado à cromatografia corresponde a um primeiro sequenciamento para a primeira região associada ao alvo, a primeira região de sequência alvo do alvo biológico, a região de variação alvo e a região de sequência do alvo biológico, • em que o pelo menos um resultado relacionado à cromatografia compreende um segundo conjunto de picos correspondendo a um segundo sequenciamento para a primeira região associada ao alvo, a primeira região de sequência alvo do alvo biológico, a região de variação alvo e a região de sequência do alvo biológico, e • em que a determinação do conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo compreende a determinação do conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo com base no primeiro conjunto de picos e no segundo conjunto de picos.
13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender ainda a adição de pelo menos uma repetição de sequência a pelo menos um entre o conjunto de moléculas associadas ao alvo e as moléculas alvo, em que a adição da pelo menos uma repetição de sequência compreende coamplificação, com um conjunto de primers compreendendo uma sequência tipo grampo, o conjunto de moléculas associadas ao alvo e as moléculas alvo.
14. MÉTODO PARA QUANTIFICAÇÃO DE ALVO BIOLÓGICO A PARTIR DE UMA AMOSTRA COMPREENDENDO MOLÉCULAS ALVO, sendo o método caracterizado por compreender: • determinação de pelo menos um resultado relacionado à cromatografia associado a um primeiro conjunto de moléculas associadas ao alvo e um conjunto de moléculas alvo, com base no sequenciamento de Sanger associado ao primeiro conjunto de moléculas associadas ao alvo e ao conjunto de moléculas alvo, em que o primeiro conjunto de moléculas associadas ao alvo compreende uma primeira sequência associada ao alvo que compreende: • primeira região associada ao alvo com similaridade de sequência com uma primeira região de sequência alvo de uma primeira sequência alvo de um alvo biológico, em que o conjunto de moléculas alvo compreende a primeira região de sequência alvo; e • região de variação alvo com disparidade de sequência com uma região de sequência da primeira sequência alvo; • determinação de um primeiro conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo para diferentes conjuntos de bases com base no pelo menos um resultado relacionado à cromatografia, em que cada conjunto diferente de bases, dos diferentes conjuntos de bases, compreende pelo menos uma base da primeira sequência associada ao alvo e pelo menos uma base da primeira sequência alvo; e • determinação de uma primeira métrica geral de abundância que descreve uma primeira abundância do alvo biológico para a amostra, com base no primeiro conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo.
15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, • sendo a determinação do pelo menos um resultado relacionado à cromatografia caracterizada por compreender a determinação do pelo menos um resultado relacionado à cromatografia com base no sequenciamento de Sanger associado ao primeiro conjunto de moléculas associadas ao alvo, ao conjunto de moléculas alvo e um segundo conjunto de moléculas associadas ao alvo,
• em que o segundo conjunto de moléculas associadas ao alvo compreende uma segunda sequência associada ao alvo compreendendo uma segunda região associada ao alvo com similaridade de sequência com uma segunda região de sequência alvo de uma segunda sequência alvo, e • em que o método compreende ainda a determinação de um segundo conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo para diferentes conjuntos de bases da segunda sequência associada ao alvo e da segunda sequência alvo, com base no pelo menos um resultado relacionado à cromatografia.
16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela primeira sequência alvo corresponder a um primeiro local de um cromossomo, em que a segunda sequência alvo corresponde a um segundo local do cromossomo, e em que o método compreende ainda a facilitação de caracterização de uma anormalidade cromossômica com base na primeira métrica geral de abundância.
17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo alvo biológico ser associado a uma condição médica, e em que o método compreende ainda a facilitação de caracterização da condição médica com base em uma primeira comparação entre a primeira métrica geral de abundância e uma métrica geral de abundância associada à referência que descreve a abundância de uma referência biológica.
18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, • sendo a condição médica caracterizada por compreender pelo menos um entre um distúrbio genético único e uma condição cancerosa,
• em que a primeira métrica geral de abundância está associada a um primeiro período de tempo, • em que o método compreende ainda a determinação de uma segunda métrica geral de abundância que descreve uma segunda abundância do alvo biológico, em que a segunda métrica geral de abundância está associada a um segundo período de tempo, e • em que a facilitação de caracterização da condição médica compreende a facilitação de caracterização da condição médica com base na primeira comparação e na segunda métrica geral de abundância.
19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, • sendo o sequenciamento de Sanger caracterizado por compreender: • sequenciamento de Sanger de uma primeira amostra compreendendo o primeiro conjunto de moléculas associadas ao alvo, e • sequenciamento de Sanger de uma segunda amostra compreendendo o conjunto de moléculas alvo, • em que o pelo menos um resultado relacionado à cromatografia compreende: • determinação de um primeiro resultado relacionado à cromatografia associado ao primeiro conjunto de moléculas associadas ao alvo, com base no sequenciamento de Sanger da primeira amostra, e • determinação de um segundo resultado relacionado à cromatografia associado ao conjunto de moléculas alvo, com base no sequenciamento de Sanger da segunda amostra, e
• em que a determinação do primeiro conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo compreende a determinação do primeiro conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo com base no primeiro resultado relacionado à cromatografia e ao segundo resultado relacionado à cromatografia.
20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, sendo a determinação do primeiro conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo baseado no pelo menos um resultado relacionado à cromatografia caracterizada por compreender a determinação do primeiro conjunto de métricas de abundância associadas ao alvo para os diferentes conjuntos de bases, baseado em pelo menos uma entre intensidades de pico, áreas de pico, métricas de pico para bases que compartilham um tipo de base, e métricas de pico para bases com diferentes tipos de base.
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