BR112020000690A2

BR112020000690A2 - aumento do crescimento e rendimento de plantas pelo uso de uma ferredoxina-tiorredoxina redutase

Info

Publication number: BR112020000690A2
Application number: BR112020000690-4A
Authority: BR
Inventors: Matthew Begemann
Original assignee: Benson Hill, Inc.
Priority date: 2017-07-13
Filing date: 2018-07-12
Publication date: 2020-07-14
Also published as: US20210147864A1; AR113336A1; EP3652308A1; CN111164206A; CA3069634A1; WO2019012483A1; US11279942B2

Abstract

São fornecidos composições e métodos para melhorar o crescimento das plantas. Polinucleotídeos que codificam proteínas ferredoxina-tiorredoxina redutase, polipeptídeos que abrangem proteínas ferredoxina-tiorredoxina redutase e construtos de expressão para expressar genes de interesse cuja expressão pode melhorar propriedades agronômicas, incluindo, mas não se limitando a, rendimento de culturas, tolerância ao estresse biótico e abiótico e vigor precoce, plantas compreendendo os polinucleotídeos, polipeptídeos e construtos de expressão, e métodos de produção de plantas transgênicas também são fornecidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “AUMENTO

DO CRESCIMENTO E RENDIMENTO DE PLANTAS PELO USO DE UMA FERREDOXINA-TIORREDOXINA REDUTASE” CAMPO DE INVENÇÃO

[001] A invenção é desenhada para composições e métodos para aumentar o crescimento e o rendimento das plantas através da expressão de um gene de ferredoxina-tiorredoxina redutase em uma planta.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A população mundial cada vez maior e a oferta cada vez menor de terras aráveis disponíveis para a agricultura impulsionam a pesquisa para o desenvolvimento de plantas com maior biomassa e rendimento. Os meios convencionais para melhorias nas culturas e na horticultura utilizam técnicas de melhoramento seletivo para identificar plantas com características desejáveis. No entanto, essas técnicas de criação seletiva têm várias desvantagens, a saber, que essas técnicas são tipicamente trabalhosas e resultam em plantas que geralmente contêm componentes genéticos heterogêneos que nem sempre resultam na transmissão da característica desejável das plantas de origem. Os avanços na biologia molecular fornecem meios para modificar com precisão o germoplasma das plantas. A engenharia genética de plantas envolve o isolamento e a manipulação de material genético (normalmente na forma de DNA ou RNA) e a subsequente introdução desse material genético em uma planta. Essa tecnologia tem capacidade para fornecer culturas ou plantas com várias características econômicas, agronômicas ou hortícolas melhoradas.

[003] Traços de interesse incluem biomassa e rendimento da planta. O rendimento é normalmente definido como o produto mensurável do valor econômico de uma colheita. Isso pode ser definido em termos de quantidade e/ou qualidade. O rendimento depende diretamente de vários fatores, por exemplo, número e tamanho dos órgãos, arquitetura da planta (por exemplo, número de ramos), produção de sementes, senescência das folhas e muito mais. O desenvolvimento radicular, a absorção de nutrientes, a tolerância ao estresse, as taxas de assimilação fotossintética de carbono e o vigor precoce também podem ser fatores importantes na determinação do rendimento. A otimização dos fatores acima mencionados pode, portanto, contribuir para aumentar o rendimento das culturas.

[004] Um aumento no rendimento de sementes é uma característica particularmente importante, pois as sementes de muitas plantas são importantes para o consumo humano e animal. Culturas tais como milho, arroz, trigo, canola e soja representam mais da metade da ingestão calórica humana total, seja pelo consumo direto das próprias sementes ou pelo consumo de produtos à base de carne produzidos em sementes processadas. Eles também são uma fonte de açúcares, óleos e muitos tipos de metabólitos usados em processos industriais. As sementes contêm um embrião (a fonte de novos rebentos e raízes) e um endosperma (a fonte de nutrientes para o crescimento do embrião durante a germinação e durante o crescimento inicial das mudas). O desenvolvimento de uma semente envolve muitos genes e requer a transferência de metabólitos das raízes, folhas e caules para a semente em crescimento. O endosperma, em particular, assimila os precursores metabólicos de carboidratos, óleos e proteínas e os sintetiza em macromoléculas de armazenamento para preencher o grão. Um aumento na biomassa das plantas é importante para culturas forrageiras como alfafa, silagem de milho e feno. Muitos genes estão envolvidos nas vias metabólicas que contribuem para o crescimento e o desenvolvimento das plantas. Modular a expressão de um ou mais desses genes em uma planta pode produzir uma planta com crescimento e desenvolvimento aprimorados em relação a uma planta de controle, mas geralmente pode produzir uma planta com crescimento e desenvolvimento prejudicados em relação a uma planta de controle. Portanto, são necessários métodos para melhorar o crescimento e desenvolvimento das plantas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] São fornecidos composições e métodos para regular a expressão gênica em uma planta. Os métodos aumentam o crescimento das plantas, resultando em maior rendimento das culturas. Tais métodos incluem aumentar a expressão de pelo menos um gene de ferredoxina-tiorredoxina redutase em uma planta de interesse. A invenção também abrange construtos compreendendo um promotor que dirige a expressão em uma célula vegetal operacionalmente ligada a uma sequência de codificação de ferredoxina-tiorredoxina redutase. As composições compreendem ainda plantas, sementes de plantas, órgãos de plantas, células de plantas e outras partes de plantas que aumentaram a expressão de uma sequência de ferredoxina-tiorredoxina redutase. A invenção inclui métodos que podem ser utilizados para aumentar a expressão de um gene de ferredoxina-tiorredoxina redutase em uma planta. Esse gene da ferredoxina-tiorredoxina redutase pode ser uma sequência nativa ou, alternativamente, pode ser uma sequência heteróloga à planta de interesse. Modalidades da invenção incluem:

[006] 1. Método para aumentar o rendimento das culturas, compreendendo a transformação de uma planta com pelo menos uma sequência de codificação da proteína ferredoxina- tiorredoxina redutase.

[007] 2. O método de acordo com a modalidade 1, em que a referida sequência de codificação da proteína ferredoxina- tiorredoxina redutase compreende a SEQ ID NO: 1 ou codifica uma proteína selecionada do grupo das SEQ ID NOs: 2 e l4-

106.

[008] 3. O método de acordo com a modalidade 1, em que a referida sequência de codificação da proteína ferredoxina- tiorredoxina redutase codifica uma proteína com pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência selecionado do grupo de SEQ ID NOs: 2 e 14-106 e que possui a função de ferredoxina- tiorredoxina redutase.

[009] 4. O método de acordo com a modalidade 1, em que a referida sequência de codificação da proteína ferredoxina- tiorredoxina redutase codifica uma proteína com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de sequência positiva em relação a uma sequência selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 2 e 14-106, e que possui a função de ferredoxina- tiorredoxina redutase.

[010] 5. Uma planta que tenha incorporado de maneira estável em seu genoma um promotor que dirige a expressão em uma planta operacionalmente ligada a uma sequência de codificação da proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase, em que o referido promotor é heterólogo à referida sequência codificadora da proteína da ferredoxina-tiorredoxina redutase.

[011] 6. A planta de acordo com a modalidade 5, em que a referida sequência de codificação da proteína ferredoxina-

tiorredoxina redutase compreende a SEQ ID NO: 1 ou codifica uma proteína selecionada do grupo das SEQ ID NOs: 2 e l4-

106.

[012] 7. A planta de acordo com a modalidade 5, em que a referida sequência que codifica a proteína ferredoxina- tiorredoxina redutase codifica uma proteína com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência selecionada do grupo de SEQ ID Nos: 2 e 14-106, e que tem a função de ferredoxina- tiorredoxina redutase.

[013] 8. A planta de acordo com a modalidade 5, em que a referida sequência de codificação da proteína ferredoxina- tiorredoxina redutase codifica uma proteína com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de sequência positiva em relação a uma sequência selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 2 e 14-106, e que possui a função de ferredoxina- tiorredoxina redutase.

[014] 9. Sementes transformadas de qualquer uma das plantas das modalidades de 5 a 8.

[015] 10. A planta de acordo com qualquer uma das modalidades de 5 a 8, em que a referida planta é uma monocotiledônea.

[016] 11. A planta de acordo com a modalidade 10, em que a referida planta é do gênero Zea, Oryza, Triticum, Sorgo, Secale, Eleusine, Setaria, Saccharum, Miscanthus, Panicum,

Pennisetum, Megathyrsus, Cocos, Ananas, Musa, Elaeis, Avena ou Hordeum.

[017] 12. A planta de acordo com qualquer uma das modalidades de 5 a 8, em que a referida planta é um dicotiledônea.

[018] 13. A planta de acordo com a modalidade 12, em que a referida planta é do gênero Glycine, Brassica, Medicago, Helianthus, Carthamus, Nicotiana, Solanum, Gossypium, Ipomoea, Manihot, Coffea, Citrus, Theobroma, Camellia, Persea, Ficus, Psidium, Mangifera, Olea, Carica, Anacardium, Macadâmia, Prunus, Beta, Populus ou Eucalyptus.

[019] 14. A planta de acordo com qualquer uma das modalidades de 5 a 8, em que a referida planta exibe crescimento aumentado em relação a uma planta de controle.

[020] 15. A planta de acordo com qualquer uma das modalidades de 5 a 8, em que a referida planta exibe maior rendimento de biomassa em relação a uma planta de controle.

[021] 16. A planta de acordo com qualquer uma das modalidades de 5 a 8, em que a referida planta exibe aumento do rendimento de sementes em relação a uma planta de controle.

[022] 17. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 4, em que a referida sequência de codificação da proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase é expressa a partir de um promotor regulado pelo desenvolvimento.

[023] 18. O método de acordo com a modalidade 17, em que o referido promotor regulado pelo desenvolvimento compreende a SEQ ID NO: 5.

[024] 19. O método de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 18, compreendendo ainda transformar uma planta com pelo menos uma sequência codificadora de proteína adicional.

[025] 20. O método de acordo com a modalidade 19, em que a referida pelo menos uma sequência codificadora de proteína adicional é selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 8 e 11, ou codifica uma proteína com pelo menos 90% de identidade com uma sequência selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 9 e 12.

[026] 21. O método de acordo com a modalidade 19 ou 20, em que a referida pelo menos uma sequência codificadora de proteína adicional codifica uma proteína selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 9 e 12.

[027] 22. A planta de acordo com qualquer uma das modalidades de 5 a 8, em que o referido promotor que impulsiona a expressão em uma planta é um promotor regulado pelo desenvolvimento.

[028] 23. A planta de acordo com a modalidade 22, em que o referido promotor do desenvolvimento compreende a SEQ ID NO: 5.

[029] 24. A planta de acordo com a modalidade 5 tendo incorporado de maneira estável em seu genoma um segundo promotor que dirige a expressão em uma planta operacionalmente ligada a uma segunda sequência de codificação de proteínas, em que o referido segundo promotor é heterólogo à referida segunda sequência de codificação de proteínas.

[030] 25. A planta de acordo com a modalidade 24, em que a referida segunda sequência de codificação de proteínas é selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 8 e 11, ou codifica uma proteína com pelo menos 90% de identidade para uma sequência selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 9 e 12.

[031] 26. A planta de acordo com a modalidade 24 ou 25, em que a referida segunda sequência de codificação de proteína codifica uma proteína selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 9 e 12.

[032] 27. Um construto de DNA compreendendo, em ligação operável, a. Um promotor que é funcional em uma célula vegetal e, b. Uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase.

[033] 28. O construto de DNA de acordo com a modalidade 27, em que a referida sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase compreende a SEQ ID NO: 1 ou codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2 e 14-

106.

[034] 29. O construto de DNA de acordo com a modalidade 27 ou 28, em que a referida sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase codifica uma proteína com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 2 e 14-106, e que possui a função de ferredoxina-tiorredoxina redutase.

[035] 30. O construto de DNA de acordo com a modalidade 27 ou 28, em que a referida sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase codifica uma proteína com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de sequência positiva em relação a uma sequência selecionada do grupo de SEQ ID NOs: 2 e 14-106, e que possui a função de ferredoxina-tiorredoxina redutase.

[036] 31. O construto de DNA de acordo com a modalidade 27 ou 28, em que o referido promotor que é funcional em uma célula vegetal compreende a SEQ ID NO: 5.

[037] 32. O construto de DNA, de acordo com qualquer uma das modalidades de 27 a 31, em que o referido promotor é heterólogo da referida sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de ferredoxina-tiorredoxina redutase.

[038] 33. Método para aumentar o rendimento da colheita, compreendendo a modulação da expressão de pelo menos uma sequência de codificação da proteína ferredoxina- tiorredoxina redutase em uma planta.

[039] 34. O método de acordo com a modalidade 33, em que a referida modulação da expressão compreende aumentar a expressão de pelo menos uma sequência de codificação da proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase em uma planta.

[040] 35. O método de acordo com a modalidade 34, em que o referido aumento da expressão compreende aumentar a atividade de uma sequência nativa de ferredoxina- tiorredoxina redutase na referida planta ou aumentar a atividade de uma sequência codificadora de proteína nativa de ferredoxina-tiorredoxina redutase na referida planta.

[041] 36. A planta de acordo com qualquer uma das modalidades de 5 a 8, em que o referido promotor que impulsiona a expressão em uma planta é ativo no tecido da folha.

[042] 37. O construto de DNA de acordo com qualquer uma das modalidades de 27 a 32, em que o referido promotor que é funcional em uma célula vegetal é ativo no tecido da folha.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[043] São fornecidos composições e métodos para aumentar a biomassa e o rendimento das culturas. Os métodos incluem aumentar a expressão de pelo menos um gene de ferredoxina- tiorredoxina redutase em uma planta de interesse. O rendimento das culturas é uma característica extremamente complexa que resulta do crescimento de uma planta agrícola em todas as etapas de seu desenvolvimento e alocação de recursos vegetais às partes colhíveis da planta. Em algumas culturas, incluindo, entre outras, milho e soja, as porções primárias colhíveis podem incluir sementes, com aplicações secundárias do restante da biomassa (por exemplo, folhas e caules). Em outras culturas, incluindo, entre outras, cana- de-açúcar e alfafa, as principais porções colhíveis da planta consistem nos caules ou em toda a parte acima da superfície da planta. Em outras culturas, incluindo, sem limitação batata e cenoura, as principais partes colhíveis da planta são encontradas no subsolo. Independentemente da (s) porção (ões) colhida (s) da planta de colheita, o acúmulo de biomassa colhível resulta do crescimento da planta e da alocação de carbono fotossinteticamente fixo nas partes colhidas da planta. O crescimento das plantas pode ser manipulado modulando a expressão de um ou mais genes de plantas. Essa modulação pode alterar a função de uma ou mais vias metabólicas que contribuem para o crescimento das plantas e o acúmulo de biomassa colhida.

[044] Os métodos da invenção incluem a manipulação do crescimento das plantas para aumentar o rendimento através da modulação da expressão de um ou mais genes que codificam uma proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase. Em uma modalidade preferencial, a expressão de um gene que codifica a proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase é regulada em relação aos níveis de expressão de ferredoxina-tiorredoxina redutase em uma planta de controle, resultando em aumento da biomassa colhível em plantas com expressão aumentada de ferredoxina-tiorredoxina-redutase em relação às plantas de controle. Quaisquer métodos para aumentar a atividade ou expressão de uma sequência que codifica a proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase em uma planta são abrangidos pela presente invenção.

[045] As composições da invenção incluem construtos que compreendem a sequência de codificação estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou que codifica uma proteína selecionada do grupo das SEQ ID NOs: 2 e 14-106 ou variantes da mesma, operacionalmente ligada a um promotor que é funcional em uma célula vegetal. Por "promotor" pretende-se significar uma região reguladora do DNA que é capaz de conduzir a expressão de uma sequência em uma planta ou célula vegetal. Reconhece- se que, tendo identificado as sequências proteicas de ferredoxina-tiorredoxina redutase aqui divulgadas, está dentro do estado da técnica isolar e identificar sequências adicionais de proteínas e sequências de nucleotídeos que codificam sequências de proteínas que codificam ferredoxina- tiorredoxina-redutase, por exemplo, através de pesquisas BLAST, ensaios de PCR e similares.

[046] As sequências de codificação da presente invenção, quando montadas dentro de um construto de DNA, de modo que um promotor esteja operacionalmente ligado à sequência de codificação de interesse, permitem a expressão e o acúmulo de proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase nas células de uma planta transformada de maneira estável com esse construto de DNA. "Operativamente ligado" pretende significar uma ligação funcional entre dois ou mais elementos. Por exemplo, uma ligação operável entre um promotor da presente invenção e um nucleotídeo heterólogo de interesse é um link funcional que permite a expressão da sequência nucleotídica heteróloga de interesse. Elementos operacionalmente vinculados podem ser contíguos ou não contíguos. Quando utilizado para referir a junção de duas regiões de codificação de proteínas, por operacionalmente ligado, pretende-se que as regiões de codificação estejam no mesmo quadro de leitura. O cassete pode adicionalmente conter pelo menos um gene adicional a ser co-transformado na planta. Alternativamente, os genes adicionais podem ser fornecidos em cassetes de expressão múltiplos ou construtos de DNA. O cassete de expressão pode conter adicionalmente genes marcadores selecionáveis.

[047] Desta maneira, as sequências nucleotídicas que codificam as proteínas ferredoxina-tiorredoxina redutase da invenção são fornecidas em cassetes de expressão ou construtos de expressão juntamente com uma sequência promotora de interesse, tipicamente uma sequência promotora heteróloga, para expressão na planta de interesse. Por "sequência promotora heteróloga" pretende-se significar uma sequência que não está naturalmente operacionalmente ligada à sequência nucleotídica que codifica a proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase. Embora a sequência nucleotídica que codifica a proteína ferredoxina- tiorredoxina redutase e a sequência promotora sejam heterólogas entre si, a sequência nucleotídica que codifica a proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase ou a sequência promotora heteróloga ou a sequência promotora heteróloga podem ser homólogas, nativas ou heterólogas ou estrangeiras, para o hospedeiro da planta. É reconhecido que o promotor também pode conduzir a expressão da sua sequência nucleotídica homóloga ou nativa. Nesse caso, a planta transformada terá uma mudança no fenótipo.

[048] Fragmentos e variantes dos polinucleotídeos e sequências de aminoácidos da presente invenção também podem ser expressos por promotores que são operáveis em células vegetais. Por "fragmento" entende-se uma porção do polinucleotídeo ou uma porção da sequência de aminoácidos. "Variantes" pretende significar sequências substancialmente semelhantes. Para polinucleotídeos, uma variante compreende um polinucleotídeo com deleções (isto é, truncamentos) na extremidade 5' e/ou 3'; deleção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais locais internos no polinucleotídeo nativo; e/ou substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais locais no polinucleotídeo nativo. Como aqui utilizado, um polinucleotídeo ou polipeptídeo "nativo" compreende uma sequência nucleotídica ou sequência de aminoácidos que ocorre naturalmente, respectivamente. Geralmente, as variantes de um polinucleotídeo específico da invenção terão pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com esse polinucleotídeo específico, conforme determinado por programas e parâmetros de alinhamento de sequência, como aqui descrito em outra parte. Fragmentos e variantes dos polinucleotídeos aqui divulgados “podem codificar proteínas que retêm a função de ferredoxina- tiorredoxina redutase.

[049] Aminoácido ou proteína "variante" pretende significar um aminoácido ou proteína derivada do aminoácido ou proteína nativa por exclusão (o chamado truncamento) de um ou mais aminoácidos na extremidade N-terminal e/ou C- terminal da proteína nativa; deleção e/ou adição de um ou mais aminoácidos em um ou mais locais internos na proteína nativa; ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais locais na proteína nativa. As proteínas variantes abrangidas pela presente invenção são biologicamente ativas, ou seja, continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína nativa, tal como a conversão de ferredoxina reduzida em tiorredoxina reduzida para regular a atividade enzimática. As variantes biologicamente ativas de um polipeptídeo nativo terão pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de sequência identidade com a sequência de aminoácidos da sequência nativa, conforme determinado pelos programas e parâmetros de alinhamento de sequência aqui descritos. Em algumas modalidades, as sequências polipeptídicas variantes compreenderão substituições de aminoácidos conservadoras. O número de tais substituições conservadoras de aminoácidos, somado ao número de identidades de aminoácidos, pode ser usado para calcular os positivos da sequência quando essa soma é dividida pelo número total de aminoácidos na sequência de interesse. Os cálculos positivos de sequência são realizados no servidor NCBI BLAST que pode ser acessado na Internet em blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Uma variante biologicamente ativa de uma proteína da invenção pode diferir dessa proteína em apenas 1 a 15 resíduos de aminoácidos, em apenas 1 a 10, tal como 6 a 10, tanto quanto 5, tanto quanto 4, 3, 2 ou mesmo 1 resíduo de aminoácido.

[050] Os aminoácidos podem ser geralmente classificados como alifáticos, hidroxil ou contendo enxofre/selênio, cíclicos, aromáticos, básicos ou ácidos e suas amidas. Sem ser limitado pela teoria, em alguns casos as substituições conservadoras de aminoácidos podem ser preferíveis às substituições não conservadoras de aminoácidos para a geração de sequências de proteínas variantes, pois as substituições conservadoras podem ser mais prováveis do que as substituições não conservadoras para permitir que a proteína variante retenha sua atividade biológica. Os polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo com uma ou mais substituições de aminoácidos na sequência são contemplados dentro do escopo da presente invenção. A Tabela 1 abaixo fornece uma lista de exemplos de aminoácidos pertencentes a cada classe. Tabela 1: Classes de aminoácidos Hidroxil ou contendo Ser, Cys, Thr, Met, Sec EE =

[051] Sequências variantes também podem ser identificadas por análise de bancos de dados existentes de genomas sequenciados. Deste modo, as sequências correspondentes podem ser identificadas e utilizadas nos métodos da invenção.

[052] Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Assim, a determinação da porcentagem de identidade de sequência entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático. Exemplos não limitativos de tais algoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4: 11-17; o algoritmo de alinhamento local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; o algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443- 453; o método de alinhamento por busca local de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444-2448; O algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877.

[053] As implementações em computador desses algoritmos matemáticos podem ser utilizadas para comparação de sequências para determinar a identidade da sequência. Tais implementações incluem, mas não estão limitadas a: CLUSTAL no programa PC/Gene (disponível em Intelligenetics, Mountain View, Califórnia); o programa ALIGN (Versão 2.0) e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA no pacote de software GCG Wisconsin Genetics, versão 10 (disponível na Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, Califórnia, EUA) . Alinhamentos usando esses programas podem ser realizados usando os parâmetros padrão. O programa CLUSTAL é bem descrito por Higgins et al. (1988) Gene 73: 237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5: 151-153; Corpet et al. (1988 Nucleic Acids Res. 16: 10881-900; Huang et al. (1992) CABIOS 8: 155-65; e Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24: 307-

331. O programa ALIGN é baseado no algoritmo de Myers e Miller (1988) supra. Uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade de 12 e uma penalidade de 4 podem ser usadas com o programa ALIGN ao comparar as sequências de aminoácidos. Os programas BLAST de Altschul et al. (1990) JJ. Mol. Biol. 215: 403 são baseados no algoritmo de Karlin e Altschul (1990) supra. As pesquisas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências nucleotídicas homólogas a uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína da invenção. As pesquisas de proteínas BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas a uma proteína ou polipeptídeo da invenção. Para obter alinhamentos espaçados para fins de comparação, o Gapped BLAST (no BLAST 2.0) pode ser utilizado como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389. Como alternativa, o PSI-BLAST (no BLAST 2.0) pode ser usado para executar uma pesquisa iterada que detecta relacionamentos distantes entre moléculas. Veja Altschul et al. (1997) supra. Ao utilizar BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST,

os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTN para sequências de nucleotídeos, BLASTX para proteínas) podem ser usados. Veja www.ncbi.nlm.nih.gov. O alinhamento também pode ser realizado manualmente por inspeção.

[054] Tais genes e regiões codificantes podem ser otimizados para a expressão em uma planta de interesse. Um "gene otimizado por códon" é um gene que tem sua frequência de uso de códon projetada para imitar a frequência de uso preferido de códon da célula hospedeira. As moléculas de ácido nucleico podem ser otimizadas por códon, total ou parcialmente. Como qualquer aminoácido (exceto metionina e triptofano) é codificado por vários códons, a sequência da molécula de ácido nucleico pode ser alterada sem alterar o aminoácido codificado. A otimização de códons ocorre quando um ou mais códons são alterados no nível de ácido nucleico, de modo que os aminoácidos não sejam alterados, mas a expressão em um organismo hospedeiro específico é aumentada. Aqueles versados na técnica reconhecerão que as tabelas de códons e outras referências que fornecem informações de preferência para uma ampla gama de organismos estão disponíveis na técnica (ver, por exemplo, Zhang et al. (1991 Gene 105: 61-72; Murray et al. al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 477-508). A metodologia para otimizar uma sequência de nucleotídeos para expressão em uma planta é fornecida, por exemplo, na Patente US 6.015.891, e as referências aqui citadas, bem como no documento WO 2012/142.371, e as referências nele citadas.

[055] As sequências nucleotídicas da invenção podem ser utilizadas em polinucleotídeos recombinantes. Um "polinucleotídeo recombinante" compreende uma combinação de dois ou mais segmentos de ácido nucleico quimicamente ligados que não são encontrados diretamente unidos na natureza. Por "unido diretamente", os dois segmentos de ácido nucleico são imediatamente adjacentes e unidos um ao outro por uma ligação química. Em modalidades específicas, o polinucleotídeo recombinante compreende um polinucleotídeo de interesse ou uma variante ou fragmento ativo do mesmo, de modo que um segmento adicional de ácido nucleico quimicamente ligado esteja localizado 5', 3' ou interno ao polinucleotídeo de interesse. Alternativamente, o segmento de ácido nucleico quimicamente ligado ao polinucleotídeo recombinante pode ser formado por deleção de uma sequência. O segmento de ácido nucleico adicional quimicamente ligado ou a sequência excluída para unir os segmentos de ácido nucleico ligados pode ter qualquer comprimento, incluindo, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ou mais nucleotídeos. Vários métodos para produzir esses polinucleotídeos recombinantes são aqui divulgados, incluindo, por exemplo, por síntese química ou pela manipulação de segmentos isolados de polinucleotídeos por técnicas de engenharia genética. Em modalidades específicas, o polinucleotídeo recombinante pode compreender uma sequência de DNA recombinante ou uma sequência de RNA recombinante. Um "fragmento de um polinucleotídeo recombinante" compreende pelo menos um dentre uma combinação de dois ou mais segmentos de aminoácidos quimicamente ligados que não são encontrados diretamente unidos na natureza.

[056] Ao "alterar" ou "modular", o nível de expressão de um gene significa que a expressão do gene é regulada em excesso ou em excesso. Reconhece-se que, em alguns casos, o crescimento e o rendimento das plantas aumentam pelo aumento dos níveis de expressão de um ou mais genes que codificam proteínas ferredoxina-tiorredoxina redutase, isto é, expressão positiva. Do mesmo modo, em alguns casos, o crescimento e o rendimento das plantas podem ser aumentados diminuindo os níveis de expressão de um ou mais genes que codificam proteínas de ferredoxina-tiorredoxina redutase, isto é, expressão negativa. Assim, a invenção abrange a regulação positiva ou negativa de um ou mais genes que codificam proteínas ferredoxina-tiorredoxina redutase. Além disso, os métodos incluem a regulação positiva de pelo menos um gene que codifica uma proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase e a regulação negativa de pelo menos um gene que codifica uma segunda proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase em uma planta de interesse. Ao modular a concentração e/ou a atividade de pelo menos um dos genes que codificam uma proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase em uma planta transgênica, pretende-se que a concentração e/ou atividade seja aumentada ou diminuída em pelo menos cerca de 1%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80% ou cerca de 90% ou mais em relação a uma planta de controle nativa, parte da planta ou célula que não teve a sequência da invenção introduzida.

[057] Reconhece-se que os níveis de expressão dos genes que codificam proteínas ferredoxina-tiorredoxina redutase da presente invenção podem ser controlados pelo uso de um ou mais promotores que são funcionais em uma célula vegetal. O nível de expressão do gene de interesse da codificação da proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase pode ser medido diretamente, por exemplo, analisando o nível do transcrito do gene da ferredoxina-tiorredoxina redutase ou da proteína codificada na planta. Os métodos para esses ensaios são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, Northern blotting ou transcriptase reversa-PCR quantitativa (qgRT-PCR) podem ser usados para avaliar os níveis de transcrição, enquanto western blotting, ensaios ELISA ou ensaios enzimáticos podem ser usados para avaliar os níveis de proteína. a função da ferredoxina-tiorredoxina redutase pode ser avaliada, por exemplo, avaliando a ativação do NADP-MDH em tilacóides reconstituídos (Droux et al. (1987) Arch Biochem Biophys 252: 426-439.

[058] Um "sujeito vegetal ou célula vegetal" é aquele em que alterações genéticas, tal como transformação, foram efetuadas quanto a um gene codificador da proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase de interesse, ou é uma planta ou célula vegetal que é descendente de uma planta ou célula assim alterada e que compreende a alteração. Um "controle" ou "planta de controle" ou "célula de planta de controle" fornece um ponto de referência para medir alterações no fenótipo da planta ou célula de planta em questão. Assim, os níveis de expressão de um gene de interesse que codifica a proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase são mais altos ou mais baixos do que os da planta de controle, dependendo dos métodos da invenção.

[059] Uma planta de controle ou célula vegetal pode compreender, por exemplo: (a) uma planta ou célula de tipo selvagem, isto é, do mesmo genótipo que o material de partida para a alteração genética que resultou na planta ou célula em questão; (b) uma planta ou célula vegetal do mesmo genótipo que o material de partida, mas que foi transformada com um construto nulo (isto é, com um construto que não tem efeito conhecido sobre a característica de interesse, tal como um construto que compreende um gene marcador); (c) uma planta ou célula vegetal que é um segregante não transformado entre descendentes de uma planta ou célula vegetal em questão; (d) uma planta ou célula vegetal geneticamente idêntica à planta ou célula vegetal em questão, mas que não seja exposta a condições ou estímulos que induzam a expressão do gene de interesse; ou (e) a planta ou célula vegetal em questão, sob condições em que o gene de interesse não seja expresso.

[060] Embora a invenção seja descrita em termos de plantas transformadas, é reconhecido que os organismos transformados da invenção também incluem células vegetais, protoplastos vegetais, culturas de tecidos de células vegetais das quais as plantas podem ser regeneradas, calos vegetais, aglomerados de plantas e células vegetais que são intacto em plantas ou partes de plantas, como embriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, galhos, frutas, grãos, orelhas, espigas, cascas, caules, raízes, pontas das raízes, anteras e similares. Por grão entende-se a semente madura produzida pelos produtores comerciais para outros fins que não o cultivo ou a reprodução da espécie. A progênie, variantes e mutantes das plantas regeneradas também estão incluídas no escopo da invenção, desde que essas partes compreendam os polinucleotídeos introduzidos.

[061] Para regular negativamente a expressão de um gene de interesse que codifique proteínas de ferredoxina-

tiorredoxina redutase, construtos anti-sentido, complementares a pelo menos uma porção do RNA mensageiro (MRNA) para as sequências de um gene de interesse, particularmente um gene que codifica uma proteína de ferredoxina-tiorredoxina redutase de interesse pode ser construída. Os nucleotídeos anti-sentido são projetados para hibridar com o mRNA correspondente. Modificações das sequências anti-sentido podem ser feitas desde que as sequências hibridizem e interfiram na expressão do mRNA correspondente. Deste modo, podem ser utilizados construtos anti-sentido com identidade de sequência de 70%, idealmente 80%, mais idealmente 85%, 90%, 95% ou superior às sequências correspondentes a serem silenciadas. Além disso, porções dos nucleotídeos anti-sentido podem ser usadas para interromper a expressão do gene alvo.

[062] os polinucleotídeos da invenção podem ser utilizados para isolar sequências correspondentes de outras plantas. Dessa maneira, métodos tais como PCR, hibridação e similares podem ser utilizados para identificar essas sequências com base em sua homologia ou identidade de sequências com as sequências aqui estabelecidas. As sequências isoladas com base na sua identidade de sequência para todas as sequências aqui apresentadas ou para variantes e fragmentos das mesmas são abrangidas pela presente invenção. Tais sequências incluem sequências que são ortólogos das sequências divulgadas. "Ortólogos" pretende significar genes derivados de um gene ancestral comum e encontrados em diferentes espécies como resultado de especiação. Os genes encontrados em diferentes espécies são considerados ortólogos quando suas sequências nucleotídicas e/ou sequências de proteínas codificadas compartilham pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maior identidade de sequência. As funções dos ortólogos costumam ser altamente conservadas entre as espécies. Assim, Ppolinucleotídeos isolados que possuem atividades de ativação ou aprimoramento da transcrição e que compartilham pelo menos 75% de identidade de sequência com as sequências aqui divulgadas, ou com variantes ou fragmentos das mesmas, são abrangidos pela presente invenção.

[063] Sequências variantes podem ser isoladas por PCR. Os métodos para projetar iniciadores de PCR e clonagem de PCR são geralmente conhecidos na técnica e são divulgados em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2º ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova Iorque). Veja também Innis et al., Eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nova Iorque); Innis e Gelfand, orgs. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nova Iorque); e Innis e Gelfand, orgs. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nova Iorque).

[064] Sequências variantes também podem ser identificadas por análise de bancos de dados existentes de genomas sequenciados. Deste modo, as sequências correspondentes que codificam proteínas de ferredoxina- tiorredoxina redutase podem ser identificadas e utilizadas nos métodos da invenção. As sequências variantes reterão a atividade biológica de uma proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase (isto é, catalisar a conversão de ferredoxina reduzida em tiorredoxina reduzida para regular a atividade enzimática). A presente invenção mostra que, inesperadamente, certas novas estratégias de expressão para superexpressão da proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase podem levar ao aumento da biomassa e do rendimento de sementes.

[065] O cassete de expressão incluirá na direção 5'-3 'da transcrição, uma região de iniciação transcricional e de tradução, um polinucleotídeo que codifica uma proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase da presente invenção e uma região de terminação transcricional e de tradução (isto é, região de terminação) funcional em plantas.

[066] Vários promotores podem ser utilizados na prática da invenção. Os polinucleotídeos que codificam uma proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase da invenção podem ser expressos a partir de um promotor com um perfil de expressão constitutivo. Os promotores constitutivos incluem o promotor

CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3: 2723-2730); Promotor ALS (Patente U.S. No. 5.659.026) e similares.

[067] Os polinucleotídeos da invenção que codificam proteínas ferredoxina-tiorredoxina redutase da invenção podem ser expressos a partir de promotores preferidos pelos tecidos. Os promotores preferidos de tecido incluem Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12 (2): 255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38 (7): 792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254 (3): 337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6 (2): 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112 (3): 1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112 (2): 525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112 (2): 513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5): 773-778; Resultados de Lam (1994) Probl. Cell Differ. 20: 181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23 (6): 1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90 (20): 9586-9590; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4 (3): 495-505. Os promotores preferidos por folhas também são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Yamamoto et al. (1997) Plant JJ. 12 (2): 255-265;

Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105: 357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5): 773-778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3: 509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23 (6): 1129-1138; e Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (20): 9586-9590.

[068] Promotores regulados pelo desenvolvimento podem ser desejáveis para a expressão de um polinucleotídeo que codifica uma proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase. Tais promotores podem mostrar um pico de expressão em um estágio de desenvolvimento particular. Tais promotores foram descritos na técnica, por exemplo, US 62/029.068; Gan e Amasino (1995) Science 270: 1986-1988; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol 112: 1331-1341; Gray-Mitsumune et al. (1999) Plant Mol Biol 39: 657-669; Beaudoin e Rothstein (1997) Plant Mol Biol 33: 835-846; Genschik et al. (1994) Gene 148: 195- 202 e similares.

[069] Os promotores que são induzidos após a aplicação de um estresse biótico e/ou abiótico particular podem ser desejáveis para a expressão de um polinucleotídeo que codifica uma proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase. Tais promotores foram descritos na técnica, por exemplo, Yi et al. (2010) Planta 232: 743-754; Yamaguchi-Shinozaki e Shinozaki (1993) Mol Gen Genet 236: 331-340; Patente U.S. No. 7.674.952; Rerksiri et al. (2013) Sci World J 2013: ID do artigo 397401; Khurana et al. (2013) PLoS One 8: e54418; Tao et al. (2015) Plant Mol Biol Rep 33: 200-208 e similares.

[070] Os promotores preferidos pelas células podem ser desejáveis para a expressão de um polinucleotídeo que codifica uma proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase. Tais promotores podem conduzir preferencialmente a expressão de um gene a jusante em um tipo de célula específico, como uma célula de mesófilo ou uma bainha de feixe. Tais promotores “preferidos por células foram descritos na técnica, por exemplo, Viret et al. (1994) Proc Natl Acad USA 91: 8577-8581; Patente U.S. No. 8.455.718; Patente U.S. No.

7.642.347; Sattarzadeh et al. (2010) Plant Biotechnol vu 8: 112-125; Engelmann et al. (2008) Plant Physiol 146: 1773- 1785; Matsuoka et al. (1994) Plant J 6: 311-319, e similares.

[071] Reconhece-se que um perfil de expressão não constitutivo específico pode fornecer um fenótipo de planta aprimorado em relação à expressão constitutiva de um gene ou genes de interesse. Por exemplo, muitos genes de plantas são regulados por condições de luz, pela aplicação de tensões específicas, pelo ciclo circadiano ou pelo estágio de desenvolvimento de uma planta. Estes perfis de expressão podem ser importantes para a função do gene ou produto genético na planta. Uma estratégia que pode ser usada para fornecer um perfil de expressão desejado é o uso de promotores sintéticos contendo elementos reguladores cis que direcionam os níveis de expressão desejados no tempo e local desejados na planta. Os elementos reguladores da cis que podem ser usados para alterar a expressão gênica em planta foram descritos na literatura científica (Vandepoele et al. (2009) Plant Physiol 150: 535-546; Rushton et al. (2002) Plant Cell 14: 749- 762). Os elementos reguladores da cis também podem ser usados para alterar os perfis de expressão do promotor, conforme descrito em Venter (2007) Trends Plant Sci 12: 118-124.

[072] Os terminadores de plantas são conhecidos na técnica e incluem aqueles disponíveis no plasmídeo Ti de A. tumefaciens, como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Veja também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 9627-9639.

[073] Como indicado, os nucleotídeos que codificam proteínas de ferredoxina-tiorredoxina redutase da presente invenção podem ser utilizados em cassetes de expressão para transformar plantas de interesse. Os protocolos de transformação, bem como os protocolos para a introdução de polipeptídeos ou sequências de polinucleotídeos nas plantas,

podem variar dependendo do tipo de planta ou célula vegetal, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, direcionada para transformação.

O termo "transformar" ou "transformação" refere-se a qualquer método usado para introduzir polipeptídeos ou polinucleotídeos nas células vegetais.

Os métodos “adequados de introdução de polipeptídeos e polinucleotídeos em células vegetais incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4: 320-334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 83: 5602- 5606, transformação mediada por Agrobacterium (patente US 5.563.055 e patente US 5.981.840), transferência direta de genes (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717- 2722) e aceleração de partículas balísticas (ver, por exemplo, Patentes US N º 4.945.050; Patente US N º 5.879.918; Patente US N º 5.886.244; e 5.932.782; Tomes et al. (1995) em Plant Cell, Tissue e Organ Culture: Fundamental Methods, ed.

Gamborg e Phillips (Springer - Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6: 923-926); e transformação Lecl (WO 00/28058). Ver também Weissinger et al. (1988) Ann.

Rev.

Genet. 22: 421- 477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5: 27-37 (cebola); Christou et al. (1988) Plant Physiol 87: 671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6: 923-926 (soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev.

Biol. 27P: 175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor.

Appl.

Genet. 96: 319-324 (soja); Datta et al.

(1990) Biotechnology 8: 736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309 (milho); Klein et al. (1988) Biotechnology 6: 559-563 (milho); Patentes U.S. Nos. 5.240.855; 5,322,783; e 5,324,646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91: 440-444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311: 763-764; Patente U.S. No.

5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, Nova Iorque), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9: 415-418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560-566 (transformação mediada por whisker); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (electroporação); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12: 250-255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75: 407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750 (milho via Agrobacterium tumefaciens); todos aqui incorporados por referência. "Transformação estável" pretende significar que o construto nucleotídico introduzido em uma planta se integra ao genoma da planta e é capaz de ser herdada pela sua progênie.

[074] As células que foram transformadas podem ser cultivadas em plantas de acordo com formas convencionais. Veja, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports

5: 81-84. Dessa maneira, a presente invenção fornece sementes transformadas (também denominadas "sementes transgênicas") com um polinucleotídeo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, incorporado de forma estável em seu genoma.

[075] A presente invenção pode ser utilizada para a transformação de qualquer espécie de planta, incluindo, mas não se limitando a, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de espécies de plantas de interesse incluem, entre outros, milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente as espécies Brassica úteis como fontes de óleo de sementes, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), milho (por exemplo, milheto de pérola (Pennisetum glaucum), milho proso (Panicum miliaceum), milho foxtail (Setaria italica), milho dedo (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), quinoa (Chenopodium quinoa), chicória (Cichorium intybus), alface (Lactuca sativa), açafrão (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata-doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), citros (Citrus sSpp.),

cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psi dium qguajava), manga (Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), mamão (Carica mamão), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba sacarina (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum sSpp.), óleo de palma (Elaeis guineensis), álamo (Populus SPpp.), eucalipto (Eucalyptus Spp.), aveia (Avena sativa), cevada (Hordeum vulgare), vegetais, plantas ornamentais e coníferas.

[076] Em uma modalidade, um construto contendo um promotor que é operável em uma célula vegetal, operacionalmente ligada a uma sequência de codificação que codifica uma proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase da presente invenção é usada para transformar uma célula ou células vegetais. A célula ou células vegetais transformadas são regeneradas para produzir plantas transformadas. Essas plantas transformadas com um construto compreendendo um promotor funcional dirigindo a expressão de um polinucleotídeo codificador da proteína ferredoxina- tiorredoxina redutase da invenção demonstraram aumento do rendimento das plantas, isto é, aumento da biomassa acima do solo e/ou e/ou aumento da biomassa colhida e/ou aumento produção de sementes.

[077] Agora que foi demonstrado que a regulação positiva da ferredoxina-tiorredoxina redutase aumenta o rendimento da planta, podem ser utilizados outros métodos para aumentar a expressão de uma sequência endógena de ferredoxina- tiorredoxina redutase em uma planta de interesse.

A expressão de um gene da ferredoxina-tiorredoxina redutase presente no genoma de uma planta pode ser alterada através da inserção de um intensificador de transcrição a montante do gene da ferredoxina-tiorredoxina redutase presente no genoma da planta.

Essa estratégia permitirá que a expressão do gene da ferredoxina-tiorredoxina redutase retenha seu perfil normal de desenvolvimento, enquanto mostra níveis elevados de transcrição.

Esta estratégia ocorrerá através da inserção de um elemento potenciador a montante de um gene de ferredoxina- tiorredoxina redutase de interesse usando uma meganuclease projetada contra a sequência genômica de interesse.

Alternativamente, uma endonuclease Cas9 acoplada a um RNA guia (gRNA) projetado contra a sequência genômica de interesse, ou uma endonuclease Cpfl acoplada a um gRNA projetado contra a sequência genômica de interesse ou uma endonuclease Csml acoplada a um gRNA projetado contra a sequência genômica de interesse é usado para efetuar a inserção de um elemento intensificador a montante de um gene de ferredoxina-tiorredoxina redutase de interesse.

Como alternativa, uma endonuclease desativada (por exemplo, uma endonuclease Cas9, Cpfl ou Csml desativada) fundida a um elemento potenciador da transcrição é direcionada para um local genômico próximo ao local de início da transcrição para um gene de interesse por ferredoxina-tiorredoxina redutase, modulando assim a expressão de o referido gene de interesse da ferredoxina-tiorredoxina redutase (Piatek et al. (2015) Plant Biotechnol J 13: 578-589).

[078] A modulação da expressão de um gene que codifica a proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase pode ser alcançada através do uso de tecnologias precisas de edição de genoma para modular a expressão da sequência endógena. Desta maneira, uma sequência de ácido nucleico será inserida proximalmente a uma sequência de planta nativa que codifica a ferredoxina-tiorredoxina redutase através do uso de métodos disponíveis na técnica. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, meganucleases projetadas contra a sequência genômica de plantas de interesse (D'Halluin et al (2013) Plant Biotechnol J 11: 933-941); CRISPR-Cas9, CRISPR- Cpfl, TALENsS e outras tecnologias para edição precisa de genomas (Feng et al. (2013) Cell Research 23: 1229-1232, Podevin et al. (2013) Trends Biotechnology 31: 375-383, Wei et al. (2013) J Gen Genomics 40: 281-289, Zhang et al. (2013 WO 2013/026740, Zetsche et al. (2015) Cell 163: 759-771, pedido de patente provisória nos EUA 62/295,325); Inserção de DNA mediada por N. gregoryi Argonaute (Gao et al. (2016)

Nat Biotechnol doi: 10.1038/nbt.3547); Recombinação específica do local Cre-lox (Dale et al. (1995) Plant J 7: 649-659; Lyznik, et al. (2007) Transgenic Plant J 1: 1-9; recombinação FLP-FRT (Li et al. (O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da aplicação de Bxbl na produção de Bxbl (Yau et al. (2011), Plant J 701: 147-166); integração mediada por zinco-dedo (Wright et al. (2005) Plant J 44; 693 -705); Cai et al. (2009) Plant Mol Biol 69: 699- 709); e recombinação homóloga (Lieberman-Lazarovich e Levy (2011) Methods Mol Biol 701: 51-65; Puchta (2002) Plant Mol Biol 48: 173-182). A inserção das referidas sequências de ácidos nucleicos será utilizada para alcançar o resultado desejado de superexpressão, expressão diminuída e/ou perfil de expressão alterado de um gene de ferredoxina-tiorredoxina redutase.

[079] Os potenciadores incluem qualquer molécula capaz de melhorar a expressão gênica quando inserida no genoma de uma planta. Assim, um potenciador pode ser inserido numa região do genoma a montante ou a jusante de uma sequência de ferredoxina-tiorredoxina redutase de interesse para melhorar a expressão. Os intensificadores podem ter ação cis e podem estar localizados em qualquer lugar dentro do genoma em relação a um gene para o qual a expressão será aprimorada. Por exemplo, um intensificador pode ser posicionado dentro de cerca de 1 Mbp, dentro de cerca de 100 kbp, dentro de cerca de 50 kbp, cerca de 30 kbp, cerca de 20 kbp, cerca de kKbp, cerca de 5 kbp, cerca de 3 kbp ou cerca de 1 kbp de uma sequência de codificação para a qual melhora a expressão.

Um intensificador também pode estar localizado dentro de cerca de 1500 pb de um gene para o qual ele melhora a expressão ou pode ser diretamente proximal ou localizado dentro de um íntron de um gene para o qual ele melhora a expressão.

Os intensificadores para uso na modulação da expressão de um gene endógeno que codifica uma proteína ou homólogo de ferredoxina-tiorredoxina redutase de acordo com a presente invenção incluem elementos potenciadores clássicos, como o elemento potenciador CaMV 35S, elemento potenciador precoce do citomegalovírus (CMV) e o potenciador SV40 elemento, e também elementos potenciadores mediados por intrão que melhoram a expressão gênica, como o elemento potenciador contraído-l do milho (Clancy e Hannah (2002) Plant Physiol. 130 (2): 918-29). Outros exemplos de intensificadores que podem ser introduzidos em um genoma vegetal para modular a expressão incluem um intensificador de PetE (Chua et al. (2003) Plant Cell 15: 11468-1479) ou um intensificador de a-amilase de arroz (Chen et al. (2002) JJ.

Biol.

Chem. 277: 13641-13649) ou qualquer intensificador conhecido na técnica (Chudalayandi (2011) Methods Mol.

Biol. 701: 2885-300). Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um subdomínio, fragmento ou elemento intensificador duplicado (Benfrey et al. (1990) EMBO J 9: 1677-1684).

[080] A alteração da expressão do gene da ferredoxina- tiorredoxina redutase também pode ser alcançada através da modificação do DNA de uma maneira que não altere a sequência do DNA. Tais alterações podem incluir a modificação do conteúdo ou estrutura da cromatina do gene de ferredoxina- tiorredoxina redutase de interesse e/ou do DNA que circunda o gene da ferredoxina-tiorredoxina redutase. Sabe-se que tais alterações no conteúdo ou na estrutura da cromatina podem afetar a transcrição gênica (Hirschhorn et al. (1992) Genes e Dev 6: 2288-2298; Narlikar et al. (2002) Cell 108: 475-487). Tais mudanças também podem incluir a alteração do status de metilação do gene de ferredoxina-tiorredoxina redutase de interesse e/ou do DNA que circunda o gene de ferredoxina-tiorredoxina redutase de interesse. É sabido que tais alterações na metilação do DNA podem alterar a transcrição (Hsieh (1994) Mol Cell Biol 14: 5487-5494). Foi demonstrado que a edição direcionada de epigenoma afeta a transcrição de um gene de maneira previsível (Hilton et al. (2015) 33: 510-517). Será óbvio para os especialistas na técnica que outras alterações similares (coletivamente denominadas "alterações epigenéticas") ao DNA que regula a transcrição do gene de ferredoxina-tiorredoxina redutase de interesse podem ser aplicadas a fim de alcançar o resultado desejado de uma alteração perfil de expressão gênica da ferredoxina-tiorredoxina redutase.

[081] A alteração da expressão gênica de ferredoxina- tiorredoxina redutase também pode ser alcançada através do uso de tecnologias de elementos transponíveis para alterar a expressão gênica. É bem entendido que os elementos transponíveis podem alterar a expressão do DNA próximo (McGinnis et al. (1983) Cell 34: 75-84). A alteração da expressão de um gene que codifica uma ferredoxina- tiorredoxina redutase pode ser conseguida através da inserção de um elemento transponível a montante do gene de ferredoxina-tiorredoxina redutase de interesse, fazendo com que a expressão do referido gene seja alterada.

[082] A alteração da expressão do gene da ferredoxina- tiorredoxina redutase também pode ser alcançada através da expressão de um fator de transcrição ou fatores de transcrição que regulam a expressão do gene de interesse da ferredoxina-tiorredoxina redutase. É bem entendido que a alteração da expressão do fator de transcrição pode por sua vez alterar a expressão do (s) gene (s) alvo (s) do referido fator de transcrição (Hiratsu et al. (2003) Plant J 34: 733- 739). A alteração da expressão do gene da ferredoxina- tiorredoxina redutase pode ser conseguida alterando a expressão do (s) fator (es) de transcrição que são conhecidos por interagir com um gene de interesse da ferredoxina- tiorredoxina redutase.

[083] A alteração da expressão do gene da ferredoxina- tiorredoxina redutase também pode ser alcançada através da inserção de um promotor a montante do quadro de leitura aberto que codifica uma ferredoxina-tiorredoxina redutase nativa nas espécies vegetais de interesse. Isto ocorrerá através da inserção de um promotor de interesse a montante de um quadro de leitura aberto que codifica a proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase usando uma meganuclease projetada contra a sequência genômica de interesse. Essa estratégia é bem compreendida e foi demonstrada anteriormente a inserção de um transgene em um local predefinido no genoma do algodão (D'Halluin et al. (2013) Plant Biotechnol J 11: 933-941). Será óbvio para os especialistas na técnica que outras tecnologias podem ser usadas para obter um resultado semelhante da inserção de elementos genéticos em um locus genômico predefinido, causando uma quebra de fita dupla no referido locus genômico predefinido e fornecendo um modelo de DNA apropriado para inserção (por exemplo, CRISPR-Cas9, CRISPR-cpfl, CRISPR- Csml, TALENsS e outras tecnologias para edição precisa de genomas) .

[084] os exemplos a seguir são oferecidos como ilustração e não como limitação. Todas as publicações e pedidos de patente mencionados na especificação são indicativos do nível dos especialistas na técnica a que esta invenção se refere. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incorporados por referência na mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específico e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

[085] Embora a invenção anterior tenha sido descrita em alguns detalhes a título de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendimento, será óbvio que certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas.

EXPERIMENTAL Exemplo 1 - Construto de vetores de transformação de plantas com ferredoxina-tiorredoxina redutase

[086] Foi sintetizada uma grelha de leitura aberta que codifica uma proteína de ferredoxina-tiorredoxina redutase de milho. Esta grelha de leitura aberta compreendeu a SEQ ID NO: 1, codificando a sequência proteica da SEQ ID NO: 2. Locais de restrição apropriados foram incluídos nas extremidades 5' e 3' da sequência de codificação para permitir que esse DNA seja clonado em vetores de transformação de plantas que continham elementos genéticos adequados para controlar a expressão gênica. Em cada construto de transformação de planta, a estrutura de leitura aberta da ferredoxina-tiorredoxina redutase estava localizada a jusante de um promotor da planta e da região não traduzida 5' (5S'UTR) e a montante de um 3'UTR. A Tabela 2 resume os construtos de transformação da planta que foram construídas contendo um quadro de leitura aberto de ferredoxina-tiorredoxina redutase. Tabela 2: Construtos de transformação de plantas de ferredoxina-tiorredoxina redutase Promotor + Construto S'UTR ORF 3'UTR GRMZM2G122793 (SEQ ID NO: 2x35S (SEQ|1, codificando SEQ ID NO: 358 poli A 131361 ID NO:3) 2) (SEQ ID NO: 4) RbcS7A GRMZM2G122793 (SEQ ID NO: (SEQ ID 1, codificando SEQ ID NO: | ZmRbcS (SEQ ID 131362 NO:5) 2) NO:6) RbcS7A GRMZM2G122793 (SEQ ID NO: (SEQ ID 1, codificando SEQ ID NO: | ZmRbcS (SEQ ID 132263 NO:5) 2) NO:6)

[087] Além dos construtos de transformação de plantas de ferredoxina-tiorredoxina redutase monogênicas listadas na Tabela 2, também foram construídos construtos de transformação de plantas multigênicas contendo um cassete genético de ferredoxina-tiorredoxina redutase e um segundo cassete vinculado. A Tabela 3 resume os construtos de transformação de plantas multigênicas de ferredoxina- tiorredoxina redutase. Tabela 3: Construtos de transformação multigênica de ferredoxina-tiorredoxina redutase

Promoter ; tmp | Promotor s "-” | conserato |EEBSE | O one — | som | HS!UTR2 — um GRMZM2G122793 | xmRbes RbcS-ictB RbcS7A (SEQ ID NO: Tso ZmRbeS (SEQ ID NO: ZmBbes (SE 132307 (SEQ ID 1, (ão (SEQ ID 8, A" Fis NO:5) codificando | no.5) NO:7) codificando : SEQ ID NO: 2) ' SEQ ID NO: 9) GRMZM2G122793 | >mebes ão ED NOS RbcS7A (SEQ ID NO: Tso 4xRGCGR o : ZmCAl (SE 132308 (SEQ ID 1, (SFQ (SEQ ID o — (SEO " : ID : codi ficando ID NO:13) NO:5) codificando | vo.6, | NO:10) SEO ID NO: SEQ ID NO: 2) 7 =. | 12) cmmeGI2279 | sracs Foo RbcS7A (SEQ ID NO: Sem 4xRGCGR oO y 1 (SEQ . 11, ZmCAl (SEQ 132689 (SEQ ID , (SEQ ID 1: e: . : ID : codificando ID NO:13) NO:5) codificando | no.6, | NO:10) SEG ID NO; SEQ ID NO: 2) : > 12)

[088] Além dos cassetes de genes descritos nas Tabelas 2 e 3, cada construto de transformação de plantas listado nas Tabelas 2 e 3 também continha um cassete marcador selecionável adequado para a seleção de células vegetais transformadas e a regeneração de plantas após a introdução do vetor de transformação de plantas, como descrito abaixo. Cada vector de transformação foi construído em um plasmídeo que continha sequências adequadas para manutenção do plasmídeo em E. coli e em Agrobacterium tumefaciens. Após verificação de que os construtos de transformação de plantas listadas nas Tabelas 2 e 3 continham as sequências desejadas, elas foram transformadas em células de A. tumefaciens para transformação de plantas. Exemplo 2 - Transformação de Setaria viridis

[089] As células de A. tumefaciens que abrigam vetores de transformação de plantas com ferredoxina-tiorredoxina redutase foram usadas para transformar células de S. viridis de acordo com um método descrito anteriormente (PCT/US2015/43989, aqui incorporado por referência). Após a transformação das células de S. viridis com os vetores de transformação de plantas relevantes e a regeneração de plantas de S. viridis, foram realizadas análises de PCR para confirmar a presença do (s) gene (s) de interesse no genoma de S. viridis. A Tabela 4 resume os construtos de transformação usadas para transformar S. viridis, juntamente com o número de plantas transgênicas verificadas por PCR que resultaram da transformação com cada construto.

Tabela 4: Resumo da transformação de S. viridis com vetores de transformação de plantas com ferredoxina- tiorredoxina redutase o a Exemplo 3 - Transformação de milho (Zea mays)

[090] As células de A. tumefaciens que abrigam vetores de transformação de plantas com ferredoxina-tiorredoxina redutase são usadas para transformar células de milho (Zea mays cv. BlO04) adequadas para regeneração em meio de cultura de tecidos. Após a transformação das células de milho com os vetores de transformação de plantas relevantes e a regeneração de plantas de milho, são realizadas análises de PCR para confirmar a presença do (s) gene (s) de interesse no genoma do milho. Exemplo 4 - Transformação de arroz (Oryza sativa)

[091] As células de A. tumefaciens que abrigam vetores de transformação de plantas com ferredoxina-tiorredoxina redutase são usadas para transformar células de arroz (Oryza sativa cv. Kitaake) adequadas para regeneração em meio de cultura de tecidos. Após a transformação das células de arroz com os vetores de transformação de plantas relevantes e a regeneração de plantas de arroz, são realizadas análises de PCR para confirmar a presença do (s) gene (s) de interesse no genoma do arroz.

Exemplo 5 - Caracterização de S. viridis transgênico

[092] Após a transformação e regeneração das plantas de S. viridis transformadas com um vetor de transformação de ferredoxina-tiorredoxina redutase, as plantas da geração TO foram cultivadas até a maturidade para produzir sementes da geração Tl. Plantas de S. viridis da geração Tl que abrigam o cassete do gene ferredoxina-tiorredoxina redutase foram cultivadas em ambiente de estufa para avaliar os efeitos da expressão do gene da ferredoxina-tiorredoxina redutase no crescimento da planta e na biomassa acima do solo terminal e no rendimento de sementes. Utilizou-se um delineamento em blocos casualizados com uma linha de borda de S. viridis do tipo selvagem para eliminar os efeitos de borda da análise. Plantas segregantes nulas foram cultivadas ao lado das plantas transgênicas de S. viridis em condições ambientais idênticas. A Tabela 5 resume os resultados das determinações de biomassa e rendimento de sementes feitas a partir de experimentos com plantas de S. viridis da geração Tl que abrigan um cassete de gene de ferredoxina-tiorredoxina redutase como resultado da transformação. Esta tabela indica o construto usado para a transformação, conforme descrito na Tabela 2, seguido pelo número do evento TO a partir do qual a semente T1 foi colhida. Tabela 5: Resumo das observações em estufa de S. viridis com plantas de geração T1 Ras Mudança Mudança Evento DW (9) sementes | de DW de TÇÕO A sementes (9) IEEE 3,35 + 0,90 +

131361.12 0,30 0,13 -16,0% -19,4% 3,58 + 0,99 +

131361.15 0,37 0,16 10,3% -11,4% 4,32 + 1,15 +

131361.18 0,14 0,08 8,3% 2,3% 4,08 + 1,06 t

131361.21 0,46 0,14 2,3% —5,2% 4,00 + 1,14 +

131361.23 0,32 0,12 0,4% 2,2%

131361. 3,99 + 1,12 + nulo 0,13 0,07 n/a n/a 3,59 + 1,04 +

131362.10 0,21 0,11 5,2% 11,2%

4,18 + 1,29 +

131362.24 0,20 0,09 22,4% 37,4% 2,59 t 0,60 t

131362.29 0,48 0,15 -24,1% —35,3% 4,17 + 1,15 +

131362.31 0,24 0,08 22,1% 22,9%

131362. 3,41 + 0,93 + nulo 0,51 0,17 n/a n/a 3,88 + 0,94 + 132308-2 0,45 0,14 -9,3% -21,0% 4,33 + 1,41 + 132308-3 0,71 0,07 1,2% 18,5% 4,46 + 1,42 t 132308-6 0,15 0,07 4,2% 19,3% 4,28 + 1,19 + 132308-nulo 0,12 0,07 n/a n/a

[093] Na Tabela 5, o peso seco da biomassa acima do solo é indicado na coluna DW em gramas. Da mesma forma, o peso seco das sementes colhidas é indicado em gramas na coluna Rendimento das Sementes. As colunas Mudança de DW e Mudança de Semente indicam a porcentagem de mudança na biomassa acima do solo e no rendimento de sementes, respectivamente, em relação aos segregantes nulos do construto 131220. Como esta tabela mostra, três de cinco eventos do construto 131361 apresentaram aumento do peso seco (aumentos de 0,4-8,3%), enquanto dois de cinco eventos do construto 131361 apresentaram aumento no rendimento de sementes em relação aos controles nulos. Três dos quatro eventos testados no construto 131362 mostraram aumentos no peso seco e no rendimento de sementes. Dois dos três eventos testados a partir do construto 132308 mostraram aumentos no peso seco e no rendimento de sementes. Exemplo 6 - Caracterização do milho transgênico

[094] As plantas de milho da geração TO transformadas com o vetor de transformação de ferredoxina-tiorredoxina redutase de interesse e confirmadas como contendo o (s) gene (s) de interesse são cultivadas até a maturidade em estufa. Quando as plantas TO atingem estágios reprodutivos, são polinizadas por uma linhagem de milho apropriada para produzir sementes híbridas de milho. Alternativamente, ou além da polinização da planta de milho transgênica TO, o pólen da TO é usado para polinizar uma ou mais linhagens de milho endogâmicas para produzir sementes de milho híbridas. As sementes híbridas da geração Fl resultantes dessas polinizações são plantadas em um campo em parcelas de duas ou quatro linhagens e cultivadas usando práticas agronômicas padrão. As plantas são genotipadas para determinar quais plantas contêm e quais não contêm o cassete de gene de ferredoxina-tiorredoxina redutase e quaisquer outros cassetes de genes relevantes (por exemplo, um cassete de gene marcador selecionável) que foram incluídos no vetor de transformação de plantas de ferredoxina-tiorredoxina redutase. Após a maturação das plantas de milho, a semente é colhida. As sementes das plantas que contêm o cassete do gene da ferredoxina-tiorredoxina redutase são reunidas,

assim como as sementes das plantas segregantes nulas sem o cassete do gene da ferredoxina-tiorredoxina redutase. As sementes são pesadas e os rendimentos das sementes são calculados para as plantas que contêm o cassete do gene da ferredoxina-tiorredoxina redutase, bem como para as plantas segregantes nulas sem o cassete do gene da ferredoxina- tiorredoxina redutase. Análises estatísticas apropriadas são realizadas para determinar se as plantas que contêm um cassete de gene de ferredoxina-tiorredoxina redutase produzem rendimentos mais altos do que aquelas que não possuem um cassete de gene de ferredoxina-tiorredoxina redutase.

[095] Alternativamente, as plantas de milho da geração TO transformadas com o vetor de transformação de ferredoxina- tiorredoxina redutase de interesse e confirmadas como contendo o (s) gene (s) de interesse são cultivadas até a maturidade em uma estufa e depois autopolinizadas. As sementes Tl resultantes são plantadas em estufa e as plantas Tl são cultivadas. As plantas Tl são genotipadas para identificar plantas segregantes homozigotas, heterozigotas e nulas. O pólen de plantas Tl homozigotas é usado para polinizar uma ou mais linhagens de milho para produzir sementes híbridas de milho. O pólen de plantas segregantes nulas também é usado para polinizar uma ou mais linhagens de milho para produzir sementes híbridas de milho. As sementes híbridas resultantes são plantadas em um campo em parcelas de duas ou quatro linhagens e cultivadas usando práticas agronômicas padrão. Após a maturação das plantas de milho, a semente é colhida. As sementes das plantas que contêm o cassete do gene da ferredoxina-tiorredoxina redutase são reunidas, assim como as sementes das plantas segregantes nulas sem o cassete do gene da ferredoxina-tiorredoxina redutase. As sementes são pesadas e os rendimentos das sementes são calculados para as plantas que contêm o cassete do gene da ferredoxina-tiorredoxina redutase, bem como para as plantas segregantes nulas sem o cassete do gene da ferredoxina-tiorredoxina redutase. Análises estatísticas apropriadas são realizadas para determinar se as plantas que contêm um cassete de gene de ferredoxina-tiorredoxina redutase produzem rendimentos mais altos do que aquelas que não possuem um cassete de gene de ferredoxina-tiorredoxina redutase. Exemplo 7 - Caracterização do Arroz Transgênico

[096] As plantas de arroz da geração TO transformadas com o vetor de transformação de ferredoxina-tiorredoxina redutase de interesse e confirmadas como contendo o (s) gene (s) de interesse são cultivadas até a maturidade em uma estufa e depois autopolinizadas. As sementes Tl resultantes são plantadas em estufa e as plantas Tl são cultivadas. As plantas Tl são genotipadas para identificar plantas segregantes homozigotas, heterozigotas e nulas. As plantas de cada grupo são cultivadas até a maturidade e autorizadas a polinizar para produzir sementes T2. A semente T2 resultante desta autopolinização é colhida e pesada, e calcula-se o rendimento de sementes de plantas segregantes homozigotas, heterozigotas e nulas. Análises estatísticas apropriadas são realizadas para determinar se as plantas que contêm um cassete de gene de ferredoxina-tiorredoxina redutase produzem rendimentos mais altos do que aquelas que não possuem um cassete de gene de ferredoxina-tiorredoxina redutase.

[097] Plantas de geração Tl cultivadas a partir de sementes que resultaram da autopolinização de plantas da geração TO ou plantas de geração T2 cultivadas a partir de sementes que resultaram da autopolinização de plantas homogêneas da geração Tl, são cultivadas em um campo. No caso de plantas de geração T2, as plantas de geração T1l segregadas a nulo também são autopolinizadas para produzir plantas nulas de geração T2 como controles negativos. As plantas são cultivadas usando práticas agronômicas padrão e permitidas atingir a maturidade. Ao atingirem a maturidade, as plantas podem autopolinizar. As sementes resultantes dessas autopolinizações são colhidas e pesadas, e calcula- se a produção de sementes de plantas segregantes homozigotas, heterozigotas e nulas. Análises estatísticas apropriadas são realizadas para determinar se as plantas que contêm um cassete do gene de ferredoxina-tiorredoxina redutase produzem rendimentos mais altos do que aquelas que não possuem um cassete de gene de ferredoxina-tiorredoxina redutase.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para aumentar o rendimento das culturas caracterizado pelo fato de que compreende a transformação de uma planta com pelo menos uma sequência de codificação da proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de codificação da proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase compreende a SEQ ID NO: 1, ou codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2 e 14-

106.

3. Planta que tem incorporado de maneira estável em seu genoma um promotor que dirige a expressão em uma planta operacionalmente ligada a uma sequência de codificação da proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase, caracterizada pelo fato de que o referido promotor é heterólogo à referida sequência de codificação da proteína ferredoxina- tiorredoxina redutase.

4. Planta, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a referida sequência de codificação da proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase compreende a SEQ ID NO: 1 ou codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2 e l14-

106.

5. Semente transformada caracterizada pelo fato de que é de qualquer uma das plantas como definidas nas reivindicações 3 a 4.

6. Planta, de acordo com a reivindicação 3 ou a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a referida planta é uma monocotiledônea.

7. Planta, de acordo com a reivindicação 3 ou a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a referida planta é uma dicotiledônea.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de codificação da proteína ferredoxina- tiorredoxina redutase é expressa a partir de um promotor regulado pelo desenvolvimento.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido promotor regulado pelo desenvolvimento compreende a SEQ ID NO: 5.

10. Planta, de acordo com a reivindicação 3 ou a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o referido promotor que dirige a expressão em uma planta é um promotor regulado pelo desenvolvimento.

11. Planta, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o referido promotor regulado pelo desenvolvimento compreende a SEQ ID NO: 5.

12. Construto de DNA caracterizado pelo fato de que compreende, em ligação operável, a. Um promotor que é funcional em uma célula vegetal e, b. Uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase.

13. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína ferredoxina- tiorredoxina redutase compreende a SEQ ID NO: 1 ou codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2 e 14-106.

14. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 12 ou a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o referido promotor que é funcional em uma célula vegetal compreende a SEQ ID NO: 5.

15. Construto de DNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 12 a 14, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é heterólogo à referida sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína ferredoxina-tiorredoxina redutase.