BR112020025530A2 - Aumento do crescimento e do rendimento de planta com o uso de uma proteína da superfamília ring/u-box - Google Patents

Aumento do crescimento e do rendimento de planta com o uso de uma proteína da superfamília ring/u-box Download PDF

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Matthew Begemann
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Abstract

“aumento do crescimento e do rendimento de planta com o uso de uma proteína da superfamília ring/u-box”. a presente invenção se refere a composições e métodos para aprimorar o crescimento vegetal. polinucleotídeos que codificam proteínas da superfamília ring/u-box, polipeptídeos que abrangem proteínas da superfamília ring/u-box e construtos de expressão para expressar genes de interesse cuja expressão pode melhorar as propriedades agronômicas, que incluem, porém sem limitação, rendimento da colheita, tolerância ao estresse biótico e abiótico e vigor precoce, plantas que compreendem os polinucleotídeos, polipeptídeos e construtos de expressão e métodos de produção de plantas transgênicas também são fornecidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção “AUMENTO DO
CRESCIMENTO E DO RENDIMENTO DE PLANTA COM O USO DE UMA PROTEÍNA DA SUPERFAMÍLIA RING/U-BOX” Campo da Invenção
[001] A invenção se refere a composições e métodos para aumentar o crescimento vegetal e rendimento através da expressão de um gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box em uma planta.
Fundamentos da Invenção
[002] A crescente população mundial e a diminuição de oferta de terras aráveis disponíveis para a agricultura alimentam pesquisas para o desenvolvimento de plantas com aumento de biomassa e rendimento. Os meios convencionais para melhorias hortícola e de colheita utilizam técnicas de reprodução seletiva para identificar plantas que tem características desejáveis. No entanto, tais técnicas de reprodução seletiva tem várias desvantagens, ou seja, que essas técnicas são tipicamente intensivas em mão-de-obra e resultam em plantas que muitas vezes contêm componentes genéticos heterogêneos que nem sempre podem resultar no traço desejável sendo passado a partir de plantas-mãe. Os avanços na biologia molecular fornecem meios para modificar precisamente o germoplasma das plantas. A engenharia genética das plantas implica o isolamento e manipulação do material genético (tipicamente no formato de DNA ou RNA) e a subsequente introdução desse material genético em uma planta. Tal tecnologia tem a capacidade de entregar colheitas ou plantas que tem vários traços econômicos, agronômicos ou hortícolas melhorados.
[003] Os traços de interesse incluem biomassa vegetal e rendimento. O rendimento é normalmente definido como o produto mensurável do valor econômico a partir de uma colheita. Isso pode ser definido em termos de quantidade e/ou qualidade. O rendimento depende diretamente de vários fatores, por exemplo, o número e o tamanho dos órgãos, a arquitetura vegetal (por exemplo, o número de ramos), a produção de sementes, senescência de folhas e mais. O desenvolvimento radicular, absorção de nutrientes, tolerância ao estresse, taxas de assimilação de carbono fotossintéticos e vigor precoce também podem ser fatores importantes na determinação do rendimento. A otimização dos fatores mencionados acima pode, portanto, contribuir para aumentar o rendimento da colheita.
[004] Um aumento no rendimento da semente é um traço particularmente importante, já que as sementes de muitas plantas são importantes para o consumo humano e animal. As colheitas como milho, arroz, trigo, canola e soja são responsáveis por mais da metade do consumo calórico humano total, seja através do consumo direto das sementes em si ou através de produtos de carne criados em sementes processadas.
Eles também são uma fonte de açúcares, óleos e muitos tipos de metabólitos usados em processos industriais. As sementes contêm um embrião (a fonte de novos brotos e raízes) e um endosperma (a fonte de novos nutrientes para o crescimento de embriões durante a germinação e durante o crescimento precoce de mudas). O desenvolvimento de uma semente envolve muitos genes, e requer a transferência de metabólitos das raízes, folhas e caules para a semente crescente. O endosperma, em particular, assimila os precursores metabólicos de carboidratos, óleos e proteínas e os sintetiza em macromoléculas de armazenamento para preencher os grãos.
Um aumento na biomassa vegetal é importante para colheitas de forragem como alfafa, milho de silagem e feno. Muitos genes estão envolvidos nos caminhos metabólicos que contribuem para o crescimento vegetal e o desenvolvimento.
Modular a expressão de um ou mais de tais genes em uma planta pode produzir uma planta com melhor crescimento e desenvolvimento em relação a uma planta de controle, mas muitas vezes pode produzir uma planta com crescimento e desenvolvimento prejudicados em relação a uma planta de controle. Portanto, são necessários métodos para melhor o crescimento vegetal e o desenvolvimento.
Sumário da Invenção
[005] São fornecidos composições e métodos para regular a expressão genética em uma planta. Os métodos aumentam o crescimento vegetal que resultam em maior rendimento da colheita. Tais métodos incluem o aumento da expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box em uma planta de interesse. A invenção também engloba construções que compreendem um promotor que conduz a expressão em uma célula vegetal ligada operacionalmente a uma sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box. As composições compreendem adicionalmente plantas, sementes de plantas, órgãos vegetais, células vegetais e outras partes vegetais que têm maior expressão de uma sequência que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box. A invenção inclui métodos que podem ser utilizados para aumentar a expressão de um gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U- Box em uma planta. Tal gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box pode ser uma sequência nativa ou, alternativamente, pode ser uma sequência que é heterólogo para a planta de interesse.
Modalidades da Invenção incluem:
1. Um método para aumentar o rendimento da colheita que compreende uma planta com pelo menos uma sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box.
[006] 2. O método da modalidade 1, em que a dita sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box compreende a SEQ ID NO:1, ou codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste nos SEQ ID NOs: 2 e 7 a 68,
[007] 3. O método da modalidade 1, em que a dita sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box codifica uma proteína com pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência selecionada do grupo que consiste nos SEQ ID NOs: 2 e 7 a 68 e que tem atividade ligase de ubiquitina-proteína.
[008] 4. O método da modalidade 1, em que a dita sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box codifica uma proteína com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de positivos de sequência em relação a uma sequência selecionada do grupo que consiste nos SEQ ID NOs: 2 e 7 a 68 e que tem atividade ligase de ubiquitina-proteína.
[009] 5. Uma planta que tem incorporado de forma estável em seu genoma um promotor que conduz a expressão em uma planta ligada operacionalmente a uma sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box, em que o dito promotor é heterólogo para a dita sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box.
[0010] 6. A planta da modalidade 5, em que a dita sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box compreende SEQ ID NO:1, ou codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste nos SEQ ID NOs: 2 e 7 a 68,
[0011] 7. A planta da modalidade 5, em que a dita sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box que codifica uma proteína com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência a uma sequência selecionada do grupo que consiste nos SEQ ID NOs: 2 e 7 a 68 e que tem atividade ligase de ubiquitina-proteína.
[0012] 8. A planta da modalidade 5, em que a dita sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box que codifica uma proteína com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de positivos de sequência em relação a uma sequência selecionada do grupo que consiste nos SEQ ID NOs: 2 e 7 a 68 e que tem atividade ligase de ubiquitina-proteína.
[0013] 9. Semente transformada de qualquer uma das plantas das modalidades 5 a 8,
[0014] 10. A planta de qualquer uma das modalidades 5 a 8, sendo que a dita planta é uma monocotiledônea.
[0015] 11. A planta da modalidade 10, sendo que a dita planta é do gênero Zea, Oryza, Triticum, Sorghum, Secale, Eleusine, Setaria, Saccharum, Miscanthus, Panicum,
Pennisetum, Megathyrsus, Cocos, Ananas, Musa, Elaeis, Avena ou Hordeum.
[0016] 12. A planta de qualquer uma das modalidades 5 a 8, sendo que a dita planta é uma dicotiledônea.
[0017] 13. A planta da modalidade 12, sendo que a dita planta é do gênero Glycine, Brassica, Medicago, Helianthus, Carthamus, Nicotiana, Solanum, Gossypium, Ipomoea, Manihot, Coffea, Citrus, Theobroma, Lactuca, Chenopodium, Cichorium, Pisum, Camellia, Persea, Ficus, Psidium, Mangifera, Olea, Carica, Anacardium, Macadamia, Prunus, Beta, Populus ou Eucalyptus.
[0018] 14. A planta de qualquer uma das modalidades 5 a 8, sendo que a dita planta exibe aumento de crescimento em relação a uma planta de controle.
[0019] 15. A planta de qualquer uma das modalidades 5 a 8, sendo que a dita planta exibe aumento do rendimento de biomassa em relação a uma planta de controle.
[0020] 16. A planta de qualquer uma das modalidades 5 a 8, sendo que a dita planta exibe aumento de rendimento da semente em relação a uma planta de controle.
[0021] 17. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que a dita sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box é expresso a partir de um promotor de feixe de células de revestimento preferenciais.
[0022] 18. O método da modalidade 17, em que o dito promotor de feixe de células de revestimento preferenciais compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nos SEQ ID NOs:3 e 4,
[0023] 19. A planta de qualquer uma das modalidades 5 a 8, em que o dito promotor que conduz a expressão em uma planta é um promotor de feixe de células de revestimento preferenciais.
[0024] 20. A planta da modalidade 19, em que o dito promotor de feixe de células de revestimento preferenciais compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nos SEQ ID NOs:3 e 4,
[0025] 21. A planta da modalidade 5 que tem incorporado de forma estável em seu genoma um promotor que conduz a expressão em uma planta ligada operacionalmente a uma segunda proteína em sequência de codificação, em que o dito segundo promotor é heterólogo para a dita segunda proteína em sequência de codificação.
[0026] 22. Um construto de DNA que compreende, em ligação operacional,
[0027] a. Um promotor que é funcional em uma célula vegetal e,
[0028] b. Uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box.
[0029] 23. O construto de DNA da modalidade 22, em que a dita sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box compreende SEQ ID NO:1 ou codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste nos SEQ ID NOs: 2 e 7 a 68,
[0030] 24. O construto de DNA da modalidade 22 ou 23, em que a dita sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box que codifica uma proteína com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a uma sequência selecionada do grupo que consiste nos SEQ ID NOs: 2 e 7 a 68 e que tem atividade ligase de ubiquitina-proteína.
[0031] 25. O construto de DNA da modalidade 22 ou 23, em que a dita sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box que codifica uma proteína com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% positivos de sequência em relação a uma sequência selecionada do grupo que consiste nos SEQ ID NOs: 2 e 7 a 68 e que tem atividade ligase de ubiquitina-proteína.
[0032] 26. O construto de DNA da modalidade 22 ou 23, em que o dito promotor que é funcional em uma célula vegetal compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nos SEQ ID NOs:3 e 4,
[0033] 27. O construto de DNA de qualquer uma das modalidades 22 a 26, em que o dito promotor é heterólogo para a dita sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box.
[0034] 28. O método para aumentar o rendimento da colheita que compreende modular a expressão de pelo menos uma sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box em uma planta.
[0035] 29. O método da modalidade 28 em que a dita modular a expressão compreende aumentar a expressão de pelo menos uma sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box em uma planta.
[0036] 30. O método da modalidade 29, em que o dito aumentar a expressão compreende aumentar a atividade de uma sequência nativa que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box na dita planta ou aumentar a atividade de uma sequência de codificação nativa que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box na dita planta.
[0037] 31. A planta de qualquer uma das modalidades 5 a 8, em que o dito promotor que conduz a expressão em uma planta é ativo no tecido da folha.
[0038] 32. O construto de DNA de qualquer uma das modalidades 22 a 27, em que o dito promotor que é funcional em uma célula vegetal é ativo no tecido da folha.
Descrição Detalhada da Invenção
[0039] Composições e métodos para aumentar a biomassa de colheita e rendimento são fornecidos. Os métodos incluem aumentar a expressão de pelo menos um gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box em uma planta de interesse. O rendimento da colheita é um traço extremamente complexo que resulta a partir do crescimento de uma planta de colheita através de todas as fases de seu desenvolvimento e alocação de recursos vegetais para as porções colhíveis da planta. Em algumas colheitas que incluem, porém sem limitação, ao milho e soja, as porções primárias colhíveis podem incluir sementes, com aplicações secundárias a partir do restante da biomassa (por exemplo, as folhas e caules).
Em outras colheitas que incluem, porém sem limitação, a cana- de-açúcar e alfafa, as porções primárias colhíveis da planta consistem em hastes ou porção inteira acima do solo da planta. Em outras colheitas que incluem, porém sem limitação, à batata e à cenoura, as porções primárias colhíveis da planta são encontradas abaixo do solo. Independentemente da porção (ou porções) da planta colhida, o acúmulo de biomassa colhível resulta a partir do crescimento vegetal e da alocação de carbono fotossinteticamente fixado para a porção (ou porções) colhida da planta. O crescimento vegetal pode ser manipulado por modular a expressão de um ou mais genes de planta. Essa modulação pode alterar a função de um ou mais caminhos metabólicos que contribuem para o crescimento vegetal e o acúmulo de biomassa colhível.
[0040] Os métodos da invenção incluem a manipulação do crescimento vegetal para o aumento do rendimento através da modulação da expressão de um ou mais genes que codificam uma proteína da superfamília RING/U-Box. Em uma modalidade preferencial, a expressão de uma proteína da superfamília RING/U-Box que codifica o gene é regulado em relação aos níveis de expressão de genes que codificam a proteína da superfamília RING/U-Boxs em uma planta de controle, que resulta em aumento da biomassa colhível em plantas com maior expressão de genes que codificam a proteína da superfamília RING/U-Boxs em relação as plantas de controle. Quaisquer métodos para aumentar a atividade ou expressão de uma sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box em uma planta são englobados pela presente invenção.
[0041] As composições da invenção incluem construtos que compreendem a sequência de codificações estabelecidas em SEQ ID NO:1 ou que codificam uma proteína selecionada do grupo que consiste nos SEQ ID NOs: 2 e 7 a 68 ou variantes do mesmo, ligados operacionalmente a um promotor que é funcional em uma célula vegetal. "Promotor" significa uma região regulatória do DNA que é capaz de conduzir a expressão de uma sequência em uma planta ou célula vegetal. Reconhece- se que tendo identificado as sequências de proteína da superfamília RING/U-Box reveladas no presente documento, está dentro do estado da técnica para isolar e identificar as sequências de proteína da superfamília RING/U-Box adicionais e as sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de proteína da superfamília RING/U-Box, a título de exemplo, através das pesquisas BLAST, ensaios PCR, e semelhantes.
[0042] A sequência de codificações da presente invenção, quando montada dentro de um construto de DNA de tal forma que um promotor está ligado operacionalmente à sequência de codificação de interesse, permite a expressão e acúmulo de proteína da superfamília RING/U-Box nas células de uma planta transformada de forma estável com esse construto de DNA. "Ligado operacionalmente" significa uma ligação funcional entre dois ou mais elementos. Por exemplo, uma ligação operacional entre um promotor da presente invenção e um nucleotídeo heterólogo de interesse é um enlace funcional que permite a expressão da sequência de nucleotídeo heterólogo de interesse. Os elementos ligados operacionalmente podem ser contíguos ou não contíguos.
Quando utilizado para se referir à junção de duas regiões de codificação de proteínas, ao ligar operacionalmente pretende-se que as regiões de codificação estejam no mesmo quadro de leitura. O cassete contém adicionalmente pelo menos um gene adicional para ser transformado em planta.
Alternativamente, o gene (ou genes) adicional podem ser fornecidos em múltiplas cassetes de expressão ou construto de DNAs. O cassete de expressão pode conter adicionalmente os genes marcadores selecionáveis.
[0043] Dessa maneira, as sequências de nucleotídeos que codificam a proteína da superfamília RING/U-Boxs da invenção fornecida nos cassetes de expressão ou construtos de expressão juntamente com uma sequência de promotor de interesse, tipicamente uma sequência de promotor heterólogo, para expressão na planta de interesse. "Sequência de promotor heterólogo" significa uma sequência que não é naturalmente ligado operacionalmente com a proteína da superfamília RING/U-Box que codifica a sequência de nucleotídeo. Enquanto a proteína da superfamília RING/U-Box que codifica a sequência de nucleotídeo e a sequência de promotor são uns heterólogos aos outros, tanto a proteína da superfamília RING/U-Box que codifica a sequência de nucleotídeo quanto a sequência de promotor heterólogo podem ser homólogos ou nativos ou heterólogo ou estrangeiro, para o hospedeiro da planta. Reconhece-se que o promotor também pode conduzir a expressão de sua sequência de nucleotídeo homóloga ou nativa.
Neste caso, a planta transformada terá uma mudança no fenótipo.
[0044] Os fragmentos e variantes das sequências de polinucleotídeos e aminoácidos da presente invenção também podem ser expressos por promotores que são operáveis em células vegetais. "Fragmento" significa uma porção do polinucleotídeo ou uma porção da sequência de aminoácido.
"Variantes" significam sequências substancialmente semelhantes. Para os polinucleotídeos, uma variante compreende uma polinucleotídeo que tem supressões (isto é, truncagens) na extremidade 5' e/ou 3'; supressão e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais locais internos no polinucleotídeo nativo; e/ou substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais locais no polinucleotídeo nativo.
Como usado no presente documento, um polinucleotídeo “nativo” ou polipeptídeo compreende uma sequência de nucleotídeo de ocorrência natural ou sequência de aminoácido, respectivamente. Geralmente, as variantes de um polinucleotídeo particular da invenção terão pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência para aquele polinucleotídeo particular como determinado por programas de alinhamento de sequência e parâmetros como descritos em outros lugares no presente documento. Os fragmentos e variantes dos polinucleotídeos revelados no presente documento codificar proteínas que retêm atividade ligase de ubiquitina-proteína.
[0045] O aminoácido ou proteína "Variante" significa um aminoácido ou proteína derivado a partir de aminoácido ou proteína nativa ou proteína por supressão (a chamada truncagem) de um ou mais aminoácidos na extremidade N- terminal e/ou C-terminal da proteína nativa; supressão e/ou adição de um ou mais aminoácidos em um ou mais locais internos na proteína nativa; ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais locais na proteína nativa.
As proteínas variantes englobadas pela presente invenção são biologicamente ativas, ou seja, continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína nativa, como a atividade ligase de ubiquitina-proteína.
Variantes biologicamente ativas de um polipeptídeo nativo terão pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência a sequência de aminoácido para a sequência nativa como determinada por programas de alinhamento de sequência e parâmetros descritos no presente documento.
Em algumas modalidades, as sequências variantes de polipeptídeos compreenderão substituição de aminoácidos conservadores.
O número de tal substituição de aminoácidos conservadores, somado com o número de identidades aminoácidos, pode ser usado para calcular os positivos de sequência quando essa soma é dividida pelo número total de aminoácidos quando essa soma é dividida pelo número total de aminoácidos na sequência de interesse.
Os cálculos positivos de sequência são realizados no servidor
NCBI BLAST que pode ser acessado na web em todo mundo em blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
Uma variante biologicamente ativa de uma proteína da invenção pode diferir a partir dessa proteína por tão poucos como 1-15 resíduos de aminoácidos, tão poucos como 1-10, como 6-10, tão pouco como 5, tão pouco como 4, 3, 2 ou mesmo 1 resíduo de aminoácido.
[0046] Os aminoácidos podem ser geralmente categorizados como alifático, hidroxilas ou contendo enxofre/selênio, cíclicos, aromáticos, básicos ou ácidos e suas amidas. Sem ser limitado pela teoria, a substituição de aminoácidos conservadores pode ser preferível, em alguns casos, a não substituição de aminoácidos conservadores para a geração de sequências de proteína variante, como substituições conservadoras podem ser mais prováveis do que substituições não conservadoras para permitir que a proteína variante retenha sua atividade biológica. Os polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo que tem uma ou mais substituições de aminoácido na sequência são contemplados dentro do escopo da presente invenção. A tabela 1 abaixo fornece uma lista de exemplos de aminoácidos que pertencem a cada classe.
Tabela 1: Classes de aminoácidos Classe de Exemplo de aminoácidos aminoácidos Alifático Gly, Ala, Val, Leu, Ile Hidroxilas ou Ser, Cys, Thr, Met, Sec contendo enxofre/selênio Cíclicos Pro Aromáticos Phe, Tyr, Trp Básicos His, Lys, Arg Ácidos e suas amidas Asp, Glu, Asn, Gln
[0047] As sequências variantes também podem ser identificadas pela análise dos bancos de dados existentes de genomas sequenciados. Desta forma, as sequências correspondentes podem ser identificadas e utilizadas nos métodos da invenção.
[0048] Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Assim, a determinação de porcentagem de identidade de sequência dentre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático. Os exemplos não limitantes de tais algoritmos matemáticos são: the algorithm of Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11 a 17; the local alignment algorithm of Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; the global alignment algorithm of Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443 a 453; the search-for-local alignment method of Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 a 2448; the algorithm of Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87:2264 a 2268, modificado como no Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 a 5877,
[0049] As implementações de computador destes algoritmos matemáticos podem ser utilizadas para comparação de sequências para determinar a identidade de sequência.
Tais implementações incluem, porém não se limitam ao: CLUSTAL no programa PC/Gene (disponível em Intelligenetics, Mountain
View, California); o programa ALIGN (Versão 2,0) e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA na GCG Wisconsin Genetics Software Package, Versão 10 (disponível em Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, USA). Os alinhamentos que usam esses programas podem ser realizados usando os parâmetros padrão. O programa CLUSTAL é bem descrito pelos Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151 a 153; Corpet et al.
(1988) Nucleic Acid Res. 16:10881 a 10890; Huang et al.
(1992) CABIOS 8:155 a 165; e Pearson et al. (1994) Meth.
Mol. Biol. 24:307 a 331, O programa ALIGN com base no the algorithm of Myers and Miller (1988) supra. Uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de vão de 12 e uma penalidade de vão de 4 pode ser usada com o programa ALIGN ao comparar as sequências de aminoácidos. The BLAST programs of Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 com base no the algorithm of Karlin and Altschul (1990) supra. As pesquisas de nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter as sequências de nucleotídeos homólogos para uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína da invenção. As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter as sequências de aminoácidos homólogos a uma proteína ou polipeptídeo da invenção. Para obter alinhamentos em lacunas para fins de comparação, BLAST em lacunas (no BLAST 2,0) pode ser utilizado como descrito na Altschul et al. (1997) Nucleic Acid Res. 25:3389, Alternativamente, PSI-BLAST (in BLAST 2,0) pode ser usado para realizar uma pesquisa iterada que detecta relações distantes entre moléculas. Consultar a Altschul et al. (1997) supra. Ao utilizar o BLAST, BLAST em lacunas, PSI-BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTN para sequências de nucleotídeos, BLASTX para proteínas) podem ser usados.
Consultar o www.ncbi.nlm.nih.gov. O alinhamento também pode ser realizado manualmente por inspeção.
[0050] Tais genes e regiões de codificação podem ser códon otimizado para expressão em uma planta de interesse.
Um "gene de códon otimizado" é um gene que tem sua frequência de uso de códon projetado para imitar a frequência do uso preferencial de códon da célula hospedeira. As moléculas de ácido nucleico podem ser códon otimizado, no todo ou em parte. Porque qualquer um aminoácido (exceto para metionina e triptofano) é codificado por um número de códons, a sequência da molécula de ácido nucleico pode ser mudada sem mudar o aminoácido codificado. A otimização de códon é quando um ou mais códons são alterados no nível de ácido nucleico tal que os aminoácidos não são mudados, mas a expressão em um organismo hospedeiro particular é aumentado. As pessoas de habilidade comum na técnica reconhecerão que as tabelas de códon e outras referências que fornecem informações de preferência para uma ampla gama de organismos estão disponíveis na técnica (consultar, por exemplo, Zhang et al.
(1991) Gene 105:61-72; Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res.
17:477 a 508). A metodologia para otimizar uma sequência de nucleotídeos para expressão em uma planta é fornecida, por exemplo, na U.S. Pat. No. 6.015.891, e as referências citadas no mesmo, bem como no WO 2012/142.371, e as referências citadas no mesmo.
[0051] As sequências de nucleotídeos da invenção podem ser usadas nos polinucleotídeos recombinantes. Um “polinucleotídeo recombinante” compreende uma combinação de dois ou mais segmentos de ácido nucleico ligados quimicamente que não são encontrados diretamente unidos na natureza. Por “diretamente unido” destina-se os dois segmentos de ácido nucleico são imediatamente adjacentes e unidos um ao outro por uma ligação química. Nas modalidades específicas, o polinucleotídeo recombinante compreende um polinucleotídeo de interesse ou variante ativa ou fragmento do mesmo tal que um segmento de ácido nucleico ligado quimicamente é adicionalmente localizado tanto no 5’, 3’ quanto internos para o polinucleotídeo de interesse. Alternativamente, o segmento de ácido nucleico ligado quimicamente do polinucleotídeo recombinante pode ser formado pela supressão de uma sequência. O segmento de ácido nucleico ligado quimicamente adicional ou a sequência excluída para unir os segmentos de ácido nucleico ligados podem ser de qualquer comprimento, que inclui, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ou nucleotídeos maiores. Os vários métodos para fazer tais polinucleotídeos recombinantes são revelados no presente documento, que inclui, por exemplo, por síntese química ou pela manipulação de segmentos isolados de polinucleotídeos por técnicas de engenharia genética. Nas modalidades específicas, o polinucleotídeo recombinante pode compreender uma sequência de DNA recombinante ou uma sequência de RNA recombinante. Um “fragmento de um polinucleotídeo recombinante” compreende pelo menos um de uma combinação de dois ou mais sequências de aminoácido ligado quimicamente que não são encontrados diretamente unidos na natureza.
[0052] Por “alteração” ou “modulação” do nível de expressão de um gene pretende-se que a expressão do gene seja regulada de modo crescente ou regulada de modo decrescente. Reconhece-se que, em alguns casos, o crescimento vegetal e o rendimento são aumentados ao aumentar os níveis de expressão de um ou mais genes que codificam a proteína da superfamília RING/U-Boxs, isto é, a expressão regulada de modo crescente. Igualmente, em alguns casos, o crescimento vegetal e o rendimento podem ser aumentados ao diminuir os níveis de expressão de um ou mais genes que codificam a proteína da superfamília RING/U-Boxs, isto é, a expressão regulada de modo decrescente. Assim, a invenção engloba a regulada de modo crescente ou regulada de modo decrescente de um ou mais genes que codificam a proteína da superfamília RING/U-Boxs. Adicionalmente, os métodos incluem a regulada de modo crescente de pelo menos um gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box e a regulada de modo decrescente de pelo menos um gene que codifica uma segunda proteína da superfamília RING/U-Box em uma planta de interesse. Ao modular a concentração e/ou atividade de pelo menos um dos genes que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box em uma planta transgênica pretende-se que a concentração e/ou atividade seja aumentada ou diminuída por pelo menos cerca de 1%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80% ou cerca de 90% ou maior em relação a uma planta de controle nativa, parte vegetal ou célula que não teve a sequência da invenção introduzida.
[0053] Reconhece-se que os níveis de expressão dos genes que codificam a proteína da superfamília RING/U-Boxs da presente invenção podem ser controlados pelo uso de um ou mais promotores que são funcionais em uma célula vegetal. O nível da expressão da proteína da superfamília RING/U-Box- que codifica o gene de interesse pode ser medido diretamente,
por exemplo, ao ensaiar para o nível do gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box transcrição ou da proteína codificada na planta. Os métodos para tais ensaios são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o Northern blotting ou PCR transcriptase reversa quantitativa (qRT-PCR) pode ser usado para avaliar os níveis de transcrição, enquanto o western blotting, ensaios de ELISA ou ensaios de enzima podem ser usados para avaliar os níveis de proteína.
A função da proteína da superfamília RING/U-Box pode ser avaliado por, por exemplo, os ensaios de fluorescência e/ou electroquimioluminescência descritos pelo Davydov et al.
(2004) J Biomol Screen 9:695-703,
[0054] Uma “planta ou célula vegetal objeto” é aquela em que a alteração genética, como a transformação, foi efetuada quanto a uma proteína da superfamília RING/U-Box que codifica o gene de interesse ou é uma planta ou célula vegetal que é descende de uma planta ou célula assim alterada e que compreende a alteração. Um “controle” ou “planta de controle” ou “célula vegetal de controle” fornece um ponto de referência para medir mudanças no fenótipo da planta ou célula vegetal objeto. Assim, os níveis de expressão de uma proteína da superfamília RING/U-Box que codificam o gene de interesse são superiores ou inferiores do que aqueles na planta de controle que dependem nos métodos da invenção.
[0055] Uma planta de controle ou célula vegetal pode compreender, por exemplo: (a) uma planta ou célula de tipo selvagem, isto é, de mesmo genótipo que o material inicial para a alteração genética que resultou na planta ou célula objeto; (b) uma planta ou célula vegetal de mesmo genótipo que o material inicial, mas que foi transformada com um construto nulo (isto é, com um construto que não tem efeito conhecido no traço de interesse, como um construto que compreende um gene marcador); (c) uma planta ou célula vegetal que é um segregante não transformado entre a progenitura de uma planta ou célula vegetal objeto; (d) uma planta ou célula vegetal geneticamente idêntica a planta ou célula vegetal objeto, mas que não está exposto a condições ou estímulos que poderiam induzir a expressão do gene de interesse; ou (e) a planta ou célula vegetal objeto em si, sob condições em que o gene de interesse não é expresso.
[0056] Enquanto a invenção é descrita em termos de plantas transformadas, reconhece-se que os organismos transformados da invenção também incluem células vegetais, protoplastos vegetais, culturas de tecido celular vegetal a partir do qual as plantas podem ser regeneradas, calos vegetais, touceiras de planta, e células vegetais que estão intactas nas plantas ou partes vegetais como embriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, ramos, fruta, grãos, espigas, sabugos, cascas, caules, raízes, pontas da raiz, anteras, e semelhantes. O cereal pretende significar a semente madura produzida pelos produtores comerciais para fins que não sejam cultivar ou reproduzir as espécies. A progenitura, as variantes e mutantes das plantas regeneradas também estão incluídos dentro do escopo da invenção, desde que essas partes compreendam os polinucleotídeos introduzidos.
[0057] Para regular de modo decrescente a expressão de uma proteína da superfamília RING/U-Box que codifica o gene de interesse, as construções antissentidos, complementares a pelo menos uma porção do RNA mensageiro (mRNA) para as sequências de um gene de interesse, particularmente um gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box de interesse pode ser construído. Os nucleotídeos antissentido são projetados para hibridizar com o mRNA correspondente. As modificações das sequências antissentido podem ser feitas desde que as sequências hibridizem e interfiram com a expressão do mRNA correspondente. Desse modo, as construções antissentidos que tem 70%, de forma ideal 80%, de forma mais ideal 85%, 90%, 95% ou identidade de sequência maior para as sequências correspondentes a serem silenciadas pode ser utilizada. Além disso, as porções dos nucleotídeos antissentido podem ser utilizadas para interromper a expressão do gene-alvo.
[0058] Os polinucleotídeos da invenção podem ser usados para isolar as sequências correspondentes de outras plantas.
Desse modo, os métodos como PCR, hibridização e semelhantes podem ser usados para identificar tais sequências com base em sua sequência de homologia ou identidade para as sequências estabelecidas no presente documento. As sequências isoladas com base em sua identidade de sequência a todas as sequências estabelecidas no presente documento ou para as variantes e fragmentos do mesmo são englobadas pela presente invenção. Tais sequências incluem sequências que são ortólogos das sequências reveladas. Os "Ortólogos" destina-se a significar genes derivados de um gene ancestral comum e que são encontrados em diferentes espécies como resultado da especiação. Os genes encontrados em diferentes espécies são considerados ortólogos quando sua sequência de nucleotídeos e/ou sua sequência de proteína codificada compartilha pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou identidade de sequência maior. Como funções de ortólogos são muitas vezes altamente conservados entre as espécies. Assim, os polinucleotídeos isolados que ativação de transcrição ou atividades de aprimoramento e que compartilham pelo menos de 75% de identidade de sequência para as sequências reveladas no presente documento ou para variantes ou fragmentos do mesmo, são englobados pela presente invenção.
[0059] As sequências variantes podem ser isoladas por PCR. Os métodos para projetar PCR primários e PCR clonagem são geralmente conhecidos na técnica e são revelados na Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Consultar também Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); and Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York).
[0060] As sequências variantes também podem ser identificadas pela análise de bancos de dados existentes de genomas sequenciados. Desse modo, as sequências correspondentes que codificam a proteína da superfamília RING/U-Boxs podem ser identificadas e usadas nos métodos da invenção. As sequências variantes manterão a atividade biológica de uma proteína da superfamília RING/U-Box (isto é, atividade ligase de ubiquitina-proteína). A presente invenção mostra que, inesperadamente, certas estratégias de expressão inovadoras para a proteína da superfamília RING/U- Box superexpressão pode levar a um aumento da biomassa e rendimento das sementes.
[0061] A expressão cassete incluirá na direção 5'-3' de transcrição, uma região de iniciação translacional e transcricional, um polinucleotídeo que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box da presente invenção, e uma região de terminação translacional e transcricional (isto é, região de terminação) funcional em plantas.
[0062] Um número de promotores pode ser utilizado na prática da invenção. Os polinucleotídeos que codificam uma proteína da superfamília RING/U-Box da invenção podem ser expressos de um promotor com um perfil de expressão constitutiva. Os promotores constitutivos incluem o promotor CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810 a 812); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Célula vegetal 2:163 a 171); ubiquitin (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619 a 632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675 a 689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581 a 588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723 a 2730); ALS promotor (U.S. Patent No. 5.659.026), e semelhantes.
[0063] Os polinucleotídeos da invenção que codificam a proteína da superfamília RING/U-Boxs da invenção podem ser expressos a partir dos promotores de tecido preferencial. Os promotores de tecido preferencial incluem Yamamoto et al.
(1997) Plant J. 12(2):255 a 265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792 a 803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337 a 343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157 a 168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol.
112(3):1331 a 1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol.
112(2):525 a 535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol.
112(2):513 a 524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol.
35(5):773 a 778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ.
20:181 a 196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129 a 1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586 a 9590; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J.
4(3):495 a 505, Promotores de folha preferencial também são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255 a 265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357 a 367; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773 a 778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509 a 518; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129 a 1138; e Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586 a 9590,
[0064] Os promotores regulados pelo desenvolvimento podem ser desejáveis para a expressão de um polinucleotídeo que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box. Tais promotores podem mostrar um pico na expressão em uma fase de desenvolvimento particular. Tais promotores foram descritos na técnica, por exemplo, US 62/029.068; Gan e Amasino (1995) Science 270: 1986 a 1988; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol 112: 1331 a 1341; Gray-Mitsumune et al. (1999) Plant Mol Biol 39: 657 a 669; Beaudoin e Rothstein (1997) Plant Mol Biol 33: 835 a 846; Genschik et al. (1994) Gene 148: 195 a 202, e semelhantes.
[0065] Os promotores que são induzidos seguindo a aplicação de um estresse abiótico e/ou biótico particular podem ser desejáveis para a expressão de um polinucleotídeo que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box. Tais promotores foram descritos na técnica, por exemplo, Yi et al. (2010) Planta 232: 743 a 754; Yamaguchi-Shinozaki e Shinozaki (1993) Mol Gen Genet 236: 331 a 340; U.S. Patent No. 7,674,952; Rerksiri et al. (2013) Sci World J 2013: ID de Artigo 397401; Khurana et al. (2013) PLoS One 8: e54418; Tao et al. (2015) Plant Mol Biol Rep 33: 200 a 208, e semelhantes.
[0066] Os promotores de células preferenciais podem ser desejáveis para a expressão de um polinucleotídeo que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box. Tais promotores podem preferencialmente conduzir a expressão de um gene a jusante em um tipo de celular particular como uma célula mesofilo ou uma célula da bainha do feixe. Tais promotores de células preferenciais foram descritos na técnica, por exemplo, Viret et al. (1994) Proc Natl Acad USA 91: 8577-8581; U.S. Patent No. 8.455.718; U.S. Patent No.
7.642.347; Sattarzadeh et al. (2010) Plant Biotechnol J 8: 112 a 125; Engelmann et al. (2008) Plant Physiol 146: 1773 a 1785; Matsuoka et al. (1994) Plant J 6: 311 a 319, e semelhantes.
[0067] Reconhece-se que um perfil de expressão não constitutiva específico pode fornecer um fenótipo vegetal melhorado em relação a expressão constitutiva de um gene ou genes de interesse. Por exemplo, muitos genes vegetais são regulados por condições de luz, a aplicação de estresses particulares, o ciclo circadiano ou a fase do desenvolvimento de uma planta. Esses perfis de expressão podem ser importantes para a função do gene ou produto genético in planta. Uma estratégia que pode ser utilizada para fornecer um perfil de expressão desejado é o uso de promotores sintéticos que contêm elementos cis-reguladores que conduzem os níveis de expressão desejados no tempo e local desejados na planta. Os elementos cis-reguladores que podem ser utilizados para alterar a expressão genética in planta foi descrita na literatura científica (Vandepoele et al. (2009) Plant Physiol 150: 535 a 546; Rushton et al. (2002) Plant Cell 14: 749 a 762). Os elementos cis-reguladores também podem ser usados para alterar os perfis de expressão de promotor, como descrito em Venter (2007) Trends Plant Sci 12: 118 a 124,
[0068] Os terminadores de planta são conhecidos na técnica e incluem aqueles disponíveis no Ti-plasmídeo de A.
tumefaciens, como a síntese de octopina e regiões de terminação de sintase de octopina. Também consultar Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141 a 144; Proudfoot (1991) Cell 64:671 a 674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141 a 149; Mogen et al. (1990) Plant cell 2:1261 a 1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151 a 158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891 a 7903; e Joshi et al.
(1987) Nucleic Acids Res. 15:9627 a 9639,
[0069] Como indicado, os nucleotídeos que codificam a proteína da superfamília RING/U-Boxs da presente invenção podem ser utilizados nos cassetes de expressão para transformar plantas de interesse. Os protocolos de transformação bem como os protocolos para introduzir polipeptídeos ou polissequências de nucleotídeos em plantas podem variar dependendo no tipo de planta ou célula vegetal, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, direcionado para a transformação. O termo “transformar” ou “transformação” se refere a qualquer método utilizado para introduzir os polipeptídeos ou polinucleotídeos em células vegetais. Os métodos adequados de introdução de polipeptídeos e polinucleotídeos em células vegetais incluem a microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320 a 334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 83:5602 a 5606, Transformação mediada por agrobacterium (U.S. Patent No. 5.563.055 e U.S. Patent No. 5.981.840), transferência direta de genes (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717 a 2722), e aceleração de partículas balísticas (consultar, por exemplo, U.S. Patent Nos. 4.945.050; U.S.
Patent No. 5.879.918; U.S. Patent No. 5.886.244; e,
5.932.782; Tomes et al. (1995) in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988)
Biotechnology 6:923 a 926); e Lec1 transformation (WO 00/28058). Também consultar Weissinger et al. (1988) Ann.
Rev. Genet. 22:421 a 477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27 a 37 (cebola); Christou et al.
(1988) Plant Physiol. 87:671 a 674 (soja); McCabe et al.
(1988) Bio/Technology 6:923 a 926 (soja); Finer and McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175 a 182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319 a 324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736 a 740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305 a 4309 (maís); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559 a 563 (maís); U.S.
Patent Nos. 5.240.855; 5.322.783; e, 5.324.646; Klein et al.
(1988) Plant Physiol. 91:440 a 444 (maís); Fromm et al.
(1990) Biotechnology 8:833 a 839 (maís); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763 a 764; U.S.
Patent No. 5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84:5345 a 5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) no The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197 a 209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415 a 418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560 a 566 (transformação mediada por whisker); D'Halluin et al.
(1992) Plant Cell 4:1495 a 1505 (eletroporação); Li et al.
(1993) Plant Cells Reports 12:250 a 255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75:407 a 413 (arroz); Osjoda et al.
(1996) Nature Biotechnology 14:745 a 750 (milho através de Agrobacterium tumefaciens); todos são incorporados no presente documento a título de referência. A "Transformação estável" pretende significar que o construto de nucleotídeo introduzido em uma planta se integra ao genoma da planta e é capaz de ser herdada pela progenitura da mesma.
[0070] As células que foram transformadas podem ser cultivadas em plantas de acordo com as formas convencionais.
Consultar, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81 a 84, desse modo, a presente invenção fornece semente transformada (também referida como “semente transgênica”) que tem um polinucleotídeo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, incorporado de forma estável em seu genoma.
[0071] A presente invenção pode ser utilizada para a transformação de qualquer espécie vegetal, que inclui, porém sem limitação, às monocotiledóneas e às dicotiledóneas. Os exemplos de espécies vegetais de interesse incluem, porém sem limitação, ao milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente essas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de sementes, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), milheto (e.g., pearl millet (Pennisetum glaucum), milheto de proso(Panicum miliaceum), milho painço (Setaria italica),
milho-miúdo (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), quinoa (Chenopodium quinoa), chicória (Cichorium intybus), alface (Lactuca sativa), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tobaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoins (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores de citrinos (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), mamão (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba sacarina (Beta vulgaris), cana-de-açúcar(Saccharum spp.), óleo de palma (Elaeis guineensis), choupo (Populus spp.), eucalyptus (Eucalyptus spp.), aveias (Avena sativa), cevada (Hordeum vulgare), vegetais, ornamentais e coníferas.
[0072] Em uma modalidade, um construto que contêm um promotor que é operável em uma célula vegetal, ligado operacionalmente a uma sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box da presente invenção é utilizada para transformar uma célula vegetal ou células.
A célula vegetal transformada ou células são regeneradas para produzir plantas transformadas. Essas plantas transformadas com um construto que compreende um promotor funcional que conduz a expressão de uma proteína da superfamília RING/U-Box que codifica o polinucleotídeo da invenção demonstrou aumento do rendimento vegetal, isto é, aumento da biomassa acima do solo e/ou aumento da biomassa colhível e/ou aumento do rendimento da semente.
[0073] Agora que foi demonstrado que a regulada de modo crescente de genes que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box aumenta o rendimento vegetal, outros métodos para aumentar a expressão de uma sequência endógena que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box em uma planta de interesse podem ser utilizados. A expressão de um gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box presente em um genoma de planta pode ser alterada ao inserir um melhorador transcricional a montante do gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box presente no genoma da planta. Essa estratégia permitirá que o gene que codifica uma expressão da proteína da superfamília RING/U-Box para reter seu perfil de desenvolvimento normal, enquanto mostra os níveis elevados de transcrição. Essa estratégia ocorrerá através da inserção de um elemento melhorador a montante de um gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box de interesse usando um meganuclease projetado contra a sequência genômica de interesse. Alternativamente, uma endonuclease Cas9 juntamente com um RNA guia (gRNA) projetado contra a sequência genômica de interesse, ou uma endonuclease Cpf1 juntamente com um gRNA projetado contra a sequência genômica de interesse, ou uma Cms1 endonuclease juntamente com um gRNA projetado contra a sequência genômica de interesse é utilizado para efetuar a inserção de um elemento melhorador a montante de um gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box de interesse. Alternativamente, uma endonuclease desativada (por exemplo, uma endonuclease Cas9, Cpf1 ou Cms1 desativada) fundida a um elemento melhorador transcricional é direcionada para um local genômico perto do lugar de início de transcrição para um gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box de interesse, através do mesmo modulando a expressão do dito gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box de interesse (Piatek et al. (2015) Plant Biotechnol J 13:578 a 589).
[0074] A modulação da expressão de uma proteína da superfamília RING/U-Box que codifica o gene pode ser alcançada através do uso de tecnologias precisas de edição de genoma para modular a expressão da sequência endógena.
Desse modo, uma sequência de ácido nucleico será inserida próxima a uma sequência vegetal nativa que codifica a proteína da superfamília RING/U-Box através do uso de métodos disponíveis na técnica. Tais métodos incluem, porém sem limitação, a meganucleases projetada contra a sequência genômica vegetal de interesse (D’Halluin et al (2013) Plant Biotechnol J 11: 933 a 941); CRISPR-Cas9, CRISPR-Cpf1, TALENs, e outras tecnologias para a edição precisa de genomas (Feng et al. (2013) Cell Research 23:1229 a 1232, Podevin et al. (2013) Trends Biotechnology 31: 375 a 383, Wei et al.
(2013) J Gen Genomics 40 : 281 a 289, Zhang et al (2013) WO 2013/026740, Zetsche et al. (2015) Cell 163:759 a 771, US Provisional Patent Application 62/295,325); N. gregoryi Argonaute-mediated DNA insertion (Gao et al. (2016) Nat Biotechnol doi:10,1038/nbt.3547); Cre-lox site-specific recombination (Dale et al. (1995) Plant J 7:649 a 659; Lyznik, et al. (2007) Transgenic Plant J 1:1 a 9; FLP-FRT recombination (Li et al. (2009) Plant Physiol 151:1087 a 1095); Bxb1-mediated integration (Yau et al. (2011) Plant J 701:147 a 166); zinc-finger mediated integration (Wright et al. (2005) Plant J 44:693 a 705); Cai et al. (2009) Plant Mol Biol 69:699 a 709); e recombinação homóloga (Lieberman- Lazarovich e Levy (2011) Methods Mol Biol 701: 51 a 65; Puchta (2002) Plant Mol Biol 48:173 a 182). A inserção da dita sequência de ácido nucleicos será utilizada para alcançar o resultado desejado de superexpressão, expressão reduzida, e/ou perfil de expressão alterado de um gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box.
[0075] Os melhoradores incluem qualquer molécula capaz de melhorar a expressão genética quando inserida no genoma de uma planta.
Assim, um melhorador pode ser inserido em uma região do genoma a montante ou a jusante de uma sequência que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box de interesse para melhorar a expressão.
Os melhoradores podem ser cis-atuante, e podem estar localizados em qualquer lugar dentro do genoma em relação a um gene para qual expressão será aprimorada.
Por exemplo, um melhorador pode estar posicionado dentro de cerca de 1 Mbp, dentro de cerca de 100 kbp, dentro de cerca de 50kbp, cerca de 30 kbp, cerca de 20 kbp, cerca de 10 kbp, cerca de 5 kbp, cerca de 3kbp ou cerca de 1kbp de uma sequência de codificação para qual melhora a expressão.
Um melhorador também pode estar localizado dentro de cerca de 1.500 bp de um gene para qual melhora a expressão,
ou pode estar diretamente próximo ou localizado dentro de um intron de um gene para qual melhora a expressão.
Os melhoradores para uso em modular a expressão de um gene endógeno que codifica uma proteína da superfamília RING/U-
Box ou homólogo de acordo com a presente invenção inclui elementos de melhorador clássicos como o elemento melhorador
CaMV 35S, cytomegalovirus (CMV) elemento melhorador de promotor precoce, e o elemento melhorador SV40, e também elementos melhoradores mediados por intron que melhoram a expressão genética como o elemento melhorador shrunken-1 de
(Clancy e Hannah (2002) Plant Physiol. 130(2):918 a 29).
Adicionalmente, os exemplos de melhoradores que podem ser introduzidos em um genoma vegetal para modular a expressão incluem um melhorador PetE (Chua et al. (2003) Célula vegetal 15:1 1468 a 1479), ou um melhorador de α-amilase de arroz(Chen et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:13641 a 13649), ou qualquer melhorador conhecido na técnica (Chudalayandi (2011) Methods Mol. Biol. 701:285 a 300). Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um subdomínio, fragmento ou elemento melhorador duplicado (Benfrey et al.
(1990) EMBO J 9:1677 a 1684).
[0076] A alteração de um gene que codifica uma expressão da proteína da superfamília RING/U-Box também pode ser alcançado através da modificação de DNA de certa forma que não altera a sequência do DNA. Tais mudanças podem incluir modificar o conteúdo ou estrutura da cromatina do gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box de interesse e/ou do DNA em torno do gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box. É bem conhecido que tais mudanças no conteúdo ou estrutura da cromatina pode afetar a transcrição de gene (Hirschhorn et al. (1992) Genes and Dev 6:2288 a 2298; Narlikar et al. (2002) Cell 108: 475 a 487). Tais mudanças também podem incluir alterar o status de metilação do gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box de interesse e/ou de DNA em torno do gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box de interesse. É bem conhecido que tais mudanças na metilação de DNA podem alterar a transcrição (Hsieh (1994) Mol Cell Biol 14: 5487 a 5494). A edição de epigenoma direcionada tem sido mostrada para afetar a transcrição de um gene de forma previsível (Hilton et al. (2015) 33: 510 a 517). Será óbvio para aqueles especialistas no assunto da técnica que outras alterações similares (coletivamente denominadas “alterações epigenéticas”) para o DNA que regula a transcrição do gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box de interesse pode ser aplicado de modo a alcançar o resultado desejado de um gene alterado que codifica um perfil de expressão da proteína da superfamília RING/U-Box.
[0077] A alteração de gene que codifica uma expressão da proteína da superfamília RING/U-Box também pode ser alcançada através do uso de tecnologias de elemento transponível para alterar a expressão. É bem compreendido que elementos transponíveis podem alterar a expressão do DNA próximo (McGinnis et al. (1983) Cell 34:75 a 84). A alteração da expressão de um gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box pode ser alcançada ao inserir uns elementos transponíveis a montante do gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box de interesse, fazendo com que a expressão do dito gene seja alterada.
[0078] A alteração do gene que codifica uma expressão da proteína da superfamília RING/U-Box também pode ser alcançadas através da expressão de um fator de transcrição ou fatores de transcrição que regula a expressão do gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box de interesse. É bem compreendido que a alteração da expressão do fator de transcrição pode, por sua vez, alterar a expressão do gene-alvo (genes-alvo) do dito fator de transcrição (Hiratsu et al. (2003) Plant J 34:733 a 739). A alteração do gene que codifica uma expressão da proteína da superfamília RING/U-Box pode ser alcançada ao alterar a expressão do fator (ou fatores) de transcrição que são conhecidos por interagir com um gene que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box de interesse.
[0079] A alteração do gene que codifica uma expressão da proteína da superfamília RING/U-Box também pode ser alcançada através da inserção de um promotor a montante do quadro de leitura aberto que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box nativa nas espécies de planta de interesse. Isso ocorrerá através da inserção de um promotor de interesse a montante de uma proteína da superfamília RING/U-Box que codifica o quadro de leitura aberto usando uma meganuclease projetada contra a sequência genômica de interesse. Essa estratégia é bem compreendida e já foi demonstrada anteriormente para inserir um transgene em um local predefinido no genoma do algodão (D’Halluin et al.
(2013) Plant Biotechnol J 11: 933 a 941). Será óbvio para aqueles especialistas no assunto da técnica que outras tecnologias podem ser utilizadas para alcançar um resultado similar da inserção de elementos genéticos em um lócus genômico predefinido, causando uma quebra de fio duplo no dito lócus genômico predefinido e fornecendo um modelo de DNA apropriado para inserção (por exemplo, CRISPR-Cas9, CRISPR-Cpf1, CRISPR-Cms1, TALENs e outras tecnologias para a edição precisa de genomas).
[0080] Os exemplos seguintes são oferecidos por meio de ilustração e não por limitação. Todas as publicações e pedidos de patente mencionadas na especificação são indicativos do nível daqueles especialistas no assunto da técnica a que esta invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patente são incorporados no presente documento a título de referência na mesma medida em que cada publicação individual ou pedido de patente foi especificamente e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência.
[0081] Embora a invenção anterior tenha sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplo para fins de clareza e compreensão, será óbvio que certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas.
Experimental Exemplo 1 – A construção de vetores de transformação de plantas da superfamília RING/U-Box
[0082] Um quadro de leitura aberto que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box de milho foi sintetizado. Esse quadro de leitura aberto compreendido no SEQ ID NO:1, que codifica a sequência de proteína de SEQ ID NO:2, os locais de restrições adequadas foram incluídos nas extremidades 5’ e 3’ das sequências de codificações para permitir que esse DNA seja clonado em vetores de transformação de plantas que continham elementos genéticos adequados para controlar a expressão genética. Em cada construtos de transformação de planta, o quadro de leitura aberto que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box foi localizado a jusante de um promotor de planta e região não traduzida 5’(5’UTR) e a montante de um 3’UTR. A tabela 2 resume os construtos de transformação da planta que foram construídas contendo uma proteína da superfamília RING/U-Box que codifica o quadro de leitura aberto.
Tabela 2: Os construtos de transformação de planta da proteína da superfamília RING/U-Box Construto Promotor ORF 3'UTR GRMZM2G058450 (SEQ ID NO:1, que GLDC (SEQ codifica SEQ ID ZmRbcS (SEQ ID 131468 ID NO:3) NO:2) NO:6) GRMZM2G058450 (SEQ ZmRbcS7A ID NO:1, que (SEQ ID codifica SEQ ID ZmRbcS (SEQ ID 131469 NO:4) NO:2) NO:6)
Construto Promotor ORF 3'UTR GRMZM2G058450 (SEQ ID NO:1, que GLDC (SEQ codifica SEQ ID ZmRbcS (SEQ ID 131504 ID NO:3) NO:2) NO:6) GRMZM2G058450 (SEQ ZmRbcS7A ID NO:1, que (SEQ ID codifica SEQ ID ZmRbcS (SEQ ID 131505 NO:4) NO:2) NO:6) GRMZM2G058450 (SEQ ID NO:1, que GLDC (SEQ codifica SEQ ID ZmRbcS (SEQ ID 132684 ID NO:3) NO:2) NO:6) GRMZM2G058450 (SEQ ZmRbcS+5'UT ID NO:1, que R (SEQ ID codifica SEQ ID ZmRbcS (SEQ ID 132685 NO:5) NO:2) NO:6)
[0083] Além disso para os cassetes de gene descritos na tabela 2, cada construto de transformação de planta listado na tabela 2 também continha um cassete de marcador selecionável adequado para a seleção de células vegetais transformadas e regeneração de plantas seguindo a introdução do vetor de transformação da planta, como descrito abaixo.
Cada vetor de transformação foi construído em um plasmídeo que continha sequências adequadas para a manutenção do plasmídeo em E. coli e em Agrobacterium tumefaciens. Após a verificação de que os construtos de transformação da planta listados na tabela 2 continham as sequências desejadas, eles foram transformados em células A. tumefaciens para transformação de plantas. Alternativamente, os construtos listados na Tabela 2 são utilizados para transformação de plantas através de bombardeio biolítico de partículas.
Exemplo 2 – A transformação de setaria viridis
[0084] As células A. tumefaciens que abrigam o vetor de transformações da planta da proteína da superfamília RING/U- Box foram utilizadas para transformar as células S. viridis de acordo com um método descrito anteriormente (PCT/US2015/43989, incorporado no presente documento a título de referência). Após a transformação das células S.
viridis com o vetor de transformações da planta relevante e regeneração de plantas S. viridis, foram realizadas análises da PCR para confirmar a presença do gene (genes) de interesse no genoma S. viridis. A tabela 3 resume os construtos de transformação utilizadas para transformar S. viridis, juntamente com o número de plantas transgênicas verificadas por PCR que resultaram da transformação com cada construto.
Tabela 3: O resumo da transformação s. viridis com o vetor de transformações da planta da proteína da superfamília RING/U-Box nº de Construto eventos 131504 32 131505 35 Exemplo 3 – A transformação do milho (zea mays)
[0085] As células A. tumefaciens que abrigam o vetor de transformações da planta da proteína da superfamília RING/U-
Box foram usadas para transformar as células de milho (Zea mays cv. B104) adequadas para a regeneração no meio da cultura tecidual. Após a transformação das células de milho com o vetor de transformações da planta relevante e regeneração de plantas de milho, foram realizadas análises da PCR para confirmar a presença do gene (genes) de interesse no genoma de milho. Tabela 4 resume os construtos de transformação utilizadas para transformar o milho, juntamente com o número de plantas transgênicas verificadas por PCR que resultaram da transformação com cada construto.
Tabela 4: O resumo da transformação do milho com o vetor de transformações da planta da proteína da superfamília RING/U-Box Construto # eventos 132684 8 132685 8 Exemplo 4 – A transformação do arroz (oryza sativa)
[0086] As células A. tumefaciens que abrigam o vetor de transformações da planta da proteína da superfamília RING/U- Box são utilizadas para transformar as células de arroz (Oryza sativa cv. Kitaake) adequadas para a regeneração em meio da cultura tecidual. Após a transformação das células de arroz com o vetor de transformações da planta relevante e regeneração de plantas de arroz, foram realizadas análises da PCR para confirmar a presença do gene (genes) de interesse no genoma do arroz.
Exemplo 5 – Caracterização de s. viridis transgênico
[0087] Após a transformação e regeneração das plantas S. viridis transformadas com um vetor de transformação da planta da proteína da superfamília RING/U-Box, as plantas da geração T0 foram cultivadas até a maturidade para produzir sementes da geração T1. As plantas S. viridis da geração T1 que abrigam o gene que codifica um cassete de interesse da proteína da superfamília RING/U-Box foram cultivadas em um ambiente de estufa para avaliar os efeitos do gene que codifica uma expressão da proteína da superfamília RING/U- Box no crescimento vegetal e biomassa acima do solo terminal e rendimento de semente. Um projeto de bloco randomizado foi utilizado com uma linha de borda S. viridis do tipo selvagem para eliminar efeitos de borda da análise. As plantas segregantes nulas foram cultivadas ao lado das plantas transgênicas S. viridis em condições ambientais idênticas.
As plantas T1 foram autorizadas a autopolinizar e sementes de geração T2 foram colhidas dessas autopolinizações. A tabela 5 resume os resultados das determinações da biomassa e rendimento de semente feitas a partir de experimentos com a geração T1 (experimentos S80 e S101) e geração T2 (experimento U24) plantas S. viridis que abrigam um gene que codifica um cassete da proteína da superfamília RING/U-Box como um resultado da transformação. Essa tabela indica o construto utilizado para transformação, como descrito na tabela 2, seguido pelo número de evento T0 a partir do qual a semente T1 foi colhida.
Tabela 5: Resumo de observações de estufa de s. viridis com plantas da geração T1 Mudança Rendimento de Mudanç Experimento Evento DW (g) de semente (g) a DW semente 131505- 2,92 ± 0,44 ± 0,08 -15,4% -30,2% 1 0,34 131505- 3,18 ± 0,51 ± 0,06 -7,8% -19,0% 11 0,27 131505- 3,62 ± 0,75 ± 0,07 4,9% 19,0% 12 0,22 131505- 3,78 ± S80 0,72 ± 0,05 9,6% 14,3% 18 0,16 131505- 3,80 ± 0,68 ± 0,07 10,1% 7,9% 19 0,21 131505- 3,16 ± 0,52 ± 0,05 -8,4% -17,5% 26 0,21 131505- 3,45 ± 0,63 ± 0,07 n/a n/a nulo 0,28 131504- 5,12 ± 1,54 ± 0,10 3,9% 4,1% 21 0,28 131504- 5,37 ± 1,65 ± 0,07 8,9% 11,5% 22 0,17 131504- 5,64 ± 1,73 ± 0,06 14,4% 16,9% 23 0,09 131504- 4,86 ± S101 1,51 ± 0,09 -1,4% 2,0% 24 0,15 131504- 4,40 ± 1,39 ± 0,07 -10,8% -6,1% 25 0,08 131504- 4,28 ± 1,30 ± 0,04 -13,2% -12,2% 31 0,11 131504- 4,93 ± 1,48 ± 0,08 n/a n/a nulo 0,14
Mudança Rendimento de Mudanç Experimento Evento DW (g) de semente (g) a DW semente 131504- 4,01 ± 0,72 ± 0,04 -4,5% 12,5% 21 0,13 131504- 4,55 ± 0,69 ± 0,05 8,3% 7,8% 22 0,19 131504- 5,04 ± 0,73 ± 0,05 20,0% 14,1% 23 0,14 131504- 4,41 ± U24 0,85 ± 0,04 5,0% 32,8% 24 0,09 131504- 4,47 ± 0,81 ± 0,05 6,4% 26,6% 25 0,17 131504- 4,22 ± 0,79 ± 0,04 0,5% 23,4% 31 0,14 131504- 4,20 ± 0,64 ± 0,03 n/a n/a nulo 0,10
[0088] Na tabela 5, o peso seco da biomassa acima do solo é indicado na coluna DW em gramas. Da mesma forma, o peso seco das sementes colhidas é indicado em gramas na coluna do rendimento de semente. As colunas de mudança de semente e mudança DW indicam a mudança percentual na biomassa acima do solo e rendimento de semente, respectivamente, em relação aos segregantes nulos do construto apropriado. Como essa tabela mostra, os três de seis eventos T1 do construto 131505 mostraram que a biomassa e o rendimento de semente aumentam em relação aos segregantes nulos no experimento S80, três de seis eventos T1 do construto 131504 mostraram que a biomassa aumenta em relação aos segregantes nulos no experimento S101; quatro de seis eventos T1 deste construto mostrou que o rendimento de semente aumenta neste experimento. Cinco de seis eventos de geração T2 do construto 131504 mostraram que a biomassa aumenta em relação aos segregantes nulos no experimento U24; todos os eventos testados neste experimento mostraram que o rendimento de semente aumenta em relação aos segregantes nulos.
Exemplo 6 – Caracterização de milho transgênico
[0089] As plantas de melhor da geração T0 transformadas com o vetor de transformação da planta da proteína da superfamília RING/U-Box de interesse e confirmaram conter o gene (ou genes) de interesse são cultivados até a maturidade em uma estufa. Quando as plantas T0 chegam as fases reprodutivas, elas são polinizadas por uma linha de milho natural para produzir sementes de milho híbridas.
Alternativamente, ou além disso para a polinização da planta de milho transgênica T0, o pólen do T0 é utilizado para polinizar um ou mais linhas de milho naturais para produzir sementes de milho híbridas. A semente híbrida da geração F1 que resulta dessas polinizações são plantadas em um ambiente de campo em plotagens de duas ou quatro fileiras e cultivadas usando práticas agronómicas padrão. As plantas são genótipas para determinar quais plantas fazem e quais não contêm o gene que codifica um cassete da proteína da superfamília RING/U-Box e quaisquer outros cassetes genéticos relevantes (por exemplo, um cassete genético marcador selecionável) que foram incluídos no vetor de transformação da planta da proteína da superfamília RING/U-Box. Após o amadurecimento das plantas de milho, a semente é colhida. As sementes das plantas que contêm o gene que codifica um cassete da proteína da superfamília RING/U-Box são agrupadas, como são as sementes das plantas segregantes nulas sem o gene que codifica um cassete da proteína da superfamília RING/U-Box.
As sementes são pesadas e os rendimentos das sementes são calculados para as plantas que contêm o gene que codifica um cassete da proteína da superfamília RING/U-Box bem como para as plantas segregantes nulas sem o gene que codifica um cassete da proteína da superfamília RING/U-Box. As análises estatísticas apropriadas são realizadas para determinar se as plantas que contêm um cassete genética da proteína da superfamília RING/U-Box produzem os rendimentos maiores que aquelas plantas que não possuem um gene que codifica um cassete da proteína da superfamília RING/U-Box.
[0090] Alternativamente, as plantas de milho da geração T0 transformadas com o vetor de transformação da planta da proteína da superfamília RING/U-Box de interesse e confirmadas para conter o gene (ou genes) de interesse são cultivadas até a maturidade em uma estufa, depois autopolinizadas. As sementes T1 resultantes são plantas em uma estufa e as plantas T1 são cultivadas. As plantas T1 são genótipas para identificar homozigótica, heterozigótica, e plantas segregantes nulas. O pólen das plantas T1 homozigótica é usado para polinizar uma ou mais linhas de milho naturais para produzir sementes de milho híbridas. O pólen das plantas segregantes nulas também é usado para polinizar uma ou mais linhas de milho naturais para produzir sementes de milho híbridas. As sementes híbridas resultantes são plantadas em um ambiente de campos em plotagem de duas ou quatro fileiras e cultivadas usando as práticas agronómicas padrão. Após o amadurecimento das plantas de milho, a semente é colhida. As sementes das plantas que contêm o que codifica um cassete da proteína da superfamília RING/U-Box são agrupadas, como são as sementes das plantas segregantes nulas sem o gene que codifica um cassete da proteína da superfamília RING/U-Box. As sementes são pesadas, e os rendimentos da semente são calculados para as plantas que contêm o gene que codifica um cassete da proteína da superfamília RING/U-Box bem como para as plantas segregantes nulas sem o gene que codifica um cassete da proteína da superfamília RING/U-Box. As análises estatísticas apropriadas são realizadas para determinar se as plantas que contêm um gene que codifica um cassete da proteína da superfamília RING/U-Box produzem rendimentos maiores que aquelas plantas que não possuem um gene que codifica um cassete da proteína da superfamília RING/U-Box.
Exemplo 7 – Caracterização de arroz transgênico
[0091] As plantas de arroz da geração T0 transformadas com o vetor de transformação da planta da proteína da superfamília RING/U-Box de interesse e confirmadas para conter o gene (ou genes) de interesse são cultivadas à maturidade em uma estufa, depois autopolinizadas. As sementes T1 resultantes são plantadas em uma estufa e as plantas T1 são cultivadas. As plantas T1 são genótipas para identificar homozigótica, heterozigótica e plantas segregantes nula. As plantas de cada grupo são cultivadas à maturidade e podem se autopolinizar para produzir sementes T2. A semente T2 resultante dessa autopolinização é colhida e pesada, e rendimentos de semente da homozigótica, heterozigótica, e plantas segregantes nulas são calculadas.
As análises estatísticas apropriadas são realizadas para determinar se as plantas que contêm um gene que codifica um cassete da proteína da superfamília RING/U-Box produzem rendimentos maiores que aquelas plantas que não possuem um gene que codifica um cassete da proteína da superfamília RING/U-Box.
[0092] As plantas da geração T1 cultivadas a partir de sementes resultantes da autopolinização de plantas da geração T0, ou plantas da geração T2 cultivas a partir da semente que resulta da autopolinização das plantas da geração T1, são cultivadas em um ambiente de campo. No caso de plantas da geração T2, as plantas da geração T1 segregantes nulas também são autopolinizadas para produzir plantas nulas da geração T2 como controles negativos.
As plantas são cultivadas utilizando práticas agronómicas padrão e permitidas a atingir a maturidade.
Ao atingir a maturidade,
as plantas podem se autopolinizar.
A semente resultante dessas autopolinizações é colhida e pesada, e os rendimentos da semente das homozigótica, heterozigótica, e plantas segregantes nulas são calculadas.
As análises estatísticas apropriadas são realizadas para determinar se as plantas que contêm um gene que codifica um cassete da proteína da superfamília RING/U-Box produzem rendimentos maiores que aquelas plantas que não possuem um gene que codifica um cassete da proteína da superfamília RING/U-Box.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para aumentar o rendimento da colheita caracterizado pelo fato de que compreende a transformação de uma planta com pelo menos uma sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box, em que a referida sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box compartilha pelo menos 95% de identidade com o SEQ ID NO:1, ou codifica uma proteína que apresenta pelo menos 95% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nos SEQ ID NOs:2 e 7 a 68.
2. Planta caracterizada pelo fato de que tem incorporado de forma estável em seu genoma um promotor que conduz a expressão em uma planta ligada operacionalmente a uma sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box, em que a referida sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box compartilha pelo menos 95% de identidade com o SEQ ID NO: 1, ou codifica uma proteína que compartilha pelo menos 95% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nos SEQ ID NOs: 2 e 7 a 68, em que o dito promotor é heterólogo para a dita sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box.
3. Semente transformada caracterizada pelo fato de que é da planta, conforme definida na reivindicação 2.
4. Planta, de acordo com a reivindicação 2,
caracterizada pelo fato de que a dita planta é uma monocotiledônea.
5. Planta, de acordo com a reivindicação 2, sendo que a dita planta é caracterizada pelo fato de que é uma dicotiledônea.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box é expressa a partir de um promotor de feixe de células de revestimento preferenciais.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dito promotor de feixe de células de revestimento preferenciais compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nos SEQ ID NOs:3 e 4.
8. Planta, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o dito promotor que conduz a expressão em uma planta é um promotor de feixe de células de revestimento preferenciais.
9. Planta, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o dito promotor de feixe de células de revestimento preferenciais compreende o SEQ ID NO:3 ou 4.
10. Construto de DNA caracterizado pelo fato de que compreende, em ligação operacional,
a. um promotor que é funcional em uma célula vegetal e b. uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box, em que a dita sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box compreende uma sequência que compartilha pelo menos 95% de identidade com o SEQ ID NO:1, ou codifica uma proteína que compartilha pelo menos 95% de identidade com uma sequência selecionada do grupo que consiste nos SEQ ID NOs:2 e 7 a 68.
11. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dito promotor que é funcional em uma célula vegetal compreende o SEQ ID NO:3 ou
4.
12. Construto de DNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o dito promotor é heterólogo à dita sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília RING/U-Box compreende o SEQ ID NO:1, ou codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste nos SEQ ID NOs:2 e 7 a 68.
14. Planta, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a dita sequência de codificação que codifica uma proteína da superfamília
RING/U-Box compreende o SEQ ID NO:1, ou codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste nos SEQ ID NOs:2 e 7 a 68.
15. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a dita sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína da superfamília RING/U- Box compreende o SEQ ID NO:1, ou codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste nos SEQ ID NOs:2 e 7 a 68.
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