BR112020000258A2 - composições e métodos para tratar ou prevenir taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica - Google Patents

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Donghui Zhang
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Abstract

A presente invenção apresenta composições de peptídeos e polinucleotídeos AIP, métodos de utilização de tais composições para o tratamento de CPVT, bem como um modelo de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, útil na caracterização de agentes que modulam a condução e contração do miocárdio.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA TRATAR OU PREVENIR TAQUICARDIA VENTRICULAR POLIMÓRFICA CATECOLAMINÉRGICA”
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO
[001] Este pedido é um Pedido Internacional que designou os EUA e que reivindica o benefício sob código 35 EUA § 119 (e) do Pedido Provisório dos EUA No. 62/529.256 depositado em 6 de julho de 2017, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência na sua totalidade.
DECLARAÇÃO DE DIREITOS A INVENÇÕES REALIZADAS EM PESQUISA FEDERALMENTE PATROCINADA
[002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob os nºs de concessão: NIH U01 HL100401 e UG3 TR002145 concedidos pelos Institutos Nacionais de Saúde. O governo tem certos direitos na invenção.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] A taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (CPVT) é uma condição caracterizada por um ritmo cardíaco anormal, que afeta até uma em cada dez mil pessoas. Os sintomas da CPVT incluem tonturas ou desmaios associados a exercícios ou estresse emocional. Episódios de taquicardia ventricular podem fazer com que o coração pare de bater de maneira eficaz (parada cardíaca), levando à morte súbita em crianças e adultos jovens sem anormalidades cardíacas reconhecidas. Os tratamentos para CPVT incluem restrição ao exercício, uso de betabloqueadores e desfibriladores cardioversores implantáveis automáticos.
Outros tratamentos são simpatectomia cirúrgica e tratamento com flecainida. Infelizmente, esses tratamentos não são eficazes para todos os pacientes e são limitados pela adesão do paciente, efeitos colaterais dos medicamentos ou pelo risco de eventos adversos, tais como tempestades elétricas fatais causadas por desfibriladores implantáveis.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[004] Modalidades dessa divulgação são baseadas, em parte, na descoberta de que a inibição da ativação de CaMKII e subsequente sinalização a jusante reduz significativamente a arritmia latente estimulada por catecolamina que está associada a mutações no canal de rianodina de cálcio, RYR2.
Em experiências in vivo, os inventores mostraram que o inibidor peptídico, AIP, quando expresso in vivo em tecidos cardíacos de camundongos modelo CPVT, inibia a arritmia nos camundongos. Veja o Exemplo 2, FIGURAS 17 e 18. Os inventores também descobriram que a fosforilação mediada por CaMKII do resíduo serina em S2814 em RYR2 é essencial para arritmia latente estimulada por catecolamina em mutações de CPVT. A mutação da serina em alanina reverte a frequência aberrante de liberação de Ca2+ registrada para células cardíacas com mutações associadas à CPVT na proteína RYR2.
[005] Por conseguinte, como descrito abaixo, a presente invenção apresenta peptídeos inibidores da quinase II dependentes de Ca2+ calmodulina (CaMKII), incluindo peptídeo inibitório relacionado à autocamtídeo-2 (AIP) e peptídeos relacionados, e CaM-KNtídeo e polipeptídeos relacionados (como CN19o) e composições de polinucleotídeos relacionados e métodos de uso de tais composições para o tratamento de CPVT. A invenção fornece ainda cardiomiócitos pluripotentes induzidos por CPVT (iPSC-CMs) e métodos para usá-los para caracterizar agentes para o tratamento de CPVT.
[006] Em um aspecto, esta divulgação fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um vetor que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII.
[007] Em um aspecto, é aqui fornecida uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um vetor que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII para uso no tratamento de arritmia cardíaca, por exemplo, como taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (CPVT).
[008] Em um aspecto, é aqui fornecida uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um vetor que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII para uso na fabricação de medicamento para o tratamento de arritmia cardíaca, por exemplo, como CPVT.
[009] Em outro aspecto, é aqui fornecido um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII.
[010] Em um aspecto, é aqui fornecido um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII para uso no tratamento de arritmia cardíaca, por exemplo, como CPVT.
[011] Em um aspecto, é aqui fornecido um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII para uso na fabricação de medicamentos para o tratamento de arritmia cardíaca, por exemplo, como CPVT.
[012] Em outro aspecto, é aqui fornecida uma célula compreendendo um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII.
[013] Em um aspecto, é aqui fornecida uma célula compreendendo um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII para uso no tratamento de arritmia cardíaca, por exemplo, como CPVT.
[014] Em um aspecto, é aqui fornecida uma célula compreendendo um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um inibidor de peptídeo de
CaMKII para uso na fabricação de medicamentos para o tratamento de arritmia cardíaca, por exemplo, como CPVT.
[015] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método para modular uma arritmia cardíaca em um indivíduo, o método compreendendo o contato de uma célula compreendendo um canal de rianodina cardíaco (RYR2) com um inibidor de CaMKII, inibidor de peptídeo de CaMKII ou polinucleotídeo que codifica o inibidor do peptídeo de CaMKII.
[016] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método para inibir a fosforilação de um polipeptídeo de canal de rianodina (RYR2) em um indivíduo, o método compreendendo o contato de uma célula compreendendo um canal de rianodina cardíaco (RYR2) com um inibidor de CAMKII, inibidor de peptídeo de CaMKII ou polinucleotídeo que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII.
[017] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método de tratamento de um indivíduo compreendendo uma mutação associada a uma arritmia cardíaca, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um inibidor de CaMKII, inibidor de peptídeo de CaMKII, análogo ou fragmento do mesmo ou polinucleotídeo que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII.
[018] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método para caracterizar um cardiomiócito, o método que compreende monitorar condução ou contração cardíaca ou monitorar arritmia cardíaca usando um cardiomiócito induzido derivado de célula-tronco pluripotente que expressa um canal de rianodina cardíaco (RYR2) compreendendo uma mutação associada à CPVT.
[019] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método de triagem de composto, o método compreendendo o contato de um cardiomiócito derivado de célula-tronco pluripotente induzida, expressando um canal cardíaco de rianodina (RYR2) compreendendo uma mutação associada à CPVT com um agente candidato e medindo a condução ou contração cardíaca na célula.
[020] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos, o inibidor de peptídeo de CaMKII é AIP, CN19, CN19o, CN27, CN21, ou um análogo ou fragmento do mesmo.
[021] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos ou qualquer uma das modalidades anteriores, o inibidor de peptídeo de CaMKII está operacionalmente ligado a um promotor adequado para direcionar a expressão do peptídeo em uma célula cardíaca de mamífero.
[022] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos ou qualquer uma das modalidades anteriores, o vetor é uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um inibidor de peptídeo de CaMKII, análogo ou fragmento do mesmo.
[023] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos ou de qualquer uma das modalidades anteriores, o vetor é um vetor viral retroviral, adenoviral ou adenoassociado.
[024] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos ou de qualquer uma das modalidades anteriores, a mutação está em um canal cardíaco de rianodina (RYR2).
[025] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos ou qualquer uma das modalidades anteriores, a mutação é selecionada a partir do grupo que consiste em RYR2R4651I, RYR2R176Q, RYR2D385N, RYR2S404R e RYR2G3946S.
[026] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos ou qualquer uma das modalidades anteriores, o método inibe uma arritmia cardíaca.
[027] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos ou qualquer uma das modalidades anteriores, o método inibe a taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica no indivíduo.
[028] As composições e artigos definidos pela invenção foram isolados ou de outro modo fabricados em conexão com os exemplos fornecidos abaixo. Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada e das reivindicações.
Definições
[029] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o significado comumente entendido por um técnico no assunto ao qual esta invenção pertence. As seguintes referências fornecem aos técnicos uma definição geral de muitos dos termos usados nesta invenção: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2ª ed. 1994); O Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5ª Ed., R. Rieger et al.
(eds.), Springer Verlag (1991); e Hale e Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Conforme usados aqui, os termos a seguir têm o significado que lhes é atribuído abaixo, a menos que especificado de outra forma.
[030] Por "peptídeo inibitório relacionado à autocamtídeo-2 (AIP)", entende-se um peptídeo ou fragmento do mesmo compreendendo pelo menos cerca de 9 a 13 aminoácidos de KKALRRQEAVDAL (SEQ. ID. NO: 1) e possuindo atividade reguladora cardíaca e/ou inibidora de atividade de CAMKII.
Em uma modalidade, o peptídeo AIP compreende uma ou mais alterações na sequência peptídica. Em uma modalidade, o peptídeo AIP consiste essencialmente em SEQ. ID. NO: 1. Em outra modalidade, o peptídeo AIP consiste em SEQ. ID. NO: 1 ou consiste em cerca de 9 a 13 aminoácidos contíguos de SEQ.
ID. NO: 1. Em uma modalidade, o peptídeo AIP consiste essencialmente em SEQ. ID. NO: 1 ou consiste essencialmente em cerca de 9 a 13 aminoácidos contíguos de SEQ. ID. NO: 1.
Em outra modalidade, o peptídeo AIP compreende um ou mais aminoácidos modificados.
[031] Por "inibidor de CAMKII" entende-se um peptídeo ou molécula pequena que inibe a atividade de CAMKII. Inibidores exemplares são conhecidos na técnica (por exemplo, AIP, CN19, CN27, CN19o, CN21) e descritos, por exemplo, por Coultrap et al., PLOS One e25245, Vol 6, edição 10, 2011 e Pellicena et al., Frontiers em Pharmacology 21: 1-20, 2014. Outros inibidores incluem os seguintes:
[032] Por "polinucleotídeo AIP", um polinucleotídeo que codifica um peptídeo AIP.
[033] Por "agente" entende-se um peptídeo, polipeptídeo, molécula de ácido nucleico ou composto pequeno.
[034] "Melhorar" significa diminuir, suprimir, atenuar, diminuir, interromper ou estabilizar o desenvolvimento ou progressão de uma doença.
[035] Por "alteração" em um peptídeo AIP entende-se uma alteração na sequência de aminoácidos do peptídeo AIP.
[036] Por exemplo, um análogo de polinucleotídeo retém a atividade biológica de um polipeptídeo de ocorrência natural correspondente, enquanto possui certas modificações bioquímicas que aprimoram a função do análogo em relação a um polinucleotídeo de ocorrência natural. Tais modificações bioquímicas podem aumentar a resistência às nucleases, a permeabilidade da membrana ou a meia-vida do análogo, sem alterar, por exemplo, a atividade funcional, tal como sua função de codificação de proteínas. Um análogo pode incluir uma molécula de ácido nucleico modificada.
[037] O termo "cardiomiócito", como aqui utilizado, se refere amplamente a uma célula muscular do coração. Em uma modalidade, uma célula cardíaca de mamífero é um cardiomiócito. Noutra modalidade, um cardiomiócito que é diferenciado de uma célula-tronco pluripotente induzida é um cardiomiócito.
[038] Como aqui utilizado, a frase "condição cardiovascular, doença ou distúrbio" pretende incluir todos os distúrbios caracterizados por função cardíaca insuficiente, indesejada ou anormal, por exemplo cardiopatia isquêmica, arritmia cardíaca, cardiopatia hipertensiva e cardiopatia hipertensiva pulmonar, doença valvular, cardiopatia congênita e qualquer condição que leve à insuficiência cardíaca congestiva em um indivíduo, particularmente um indivíduo humano. Função cardíaca insuficiente ou anormal pode ser o resultado de doença, lesão, mutações genéticas e/ou envelhecimento. A título de conhecimento, uma resposta à lesão do miocárdio segue um caminho bem definido no qual algumas células morrem enquanto outras entram em um estado de hibernação onde ainda não estão mortas, mas são disfuncionais. Isto é seguido pela infiltração de células inflamatórias, deposição de colágeno como parte das cicatrizes, as quais acontecem paralelamente ao crescimento de novos vasos sanguíneos e a um grau de morte celular contínua.
[039] O termo "quantidade eficaz", conforme aqui utilizado, se refere à quantidade de agente terapêutico da composição farmacêutica, por exemplo, para expressar quantidade suficiente da proteína para reduzir pelo menos um ou mais sintomas da doença ou distúrbio e se refere a uma quantidade suficiente de composição farmacológica para proporcionar o efeito desejado. A frase "quantidade terapeuticamente eficaz", tal como aqui utilizada, por exemplo, de um peptídeo AIP, como aqui divulgado, significa uma quantidade suficiente da composição para tratar um distúrbio, a uma razão benefício/risco razoável aplicável a qualquer tratamento médico. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere, portanto, a uma quantidade da composição aqui divulgada que é suficiente para, por exemplo, efetuar uma redução terapeuticamente ou profilaticamente significativa em um sintoma ou marcador clínico associado a uma disfunção ou distúrbio cardíaco quando administrado a um indivíduo típico que tem uma condição cardiovascular, doença ou distúrbio.
[040] Com referência ao tratamento de, por exemplo, uma condição ou doença cardiovascular em um indivíduo, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere à quantidade que é segura e suficiente para impedir ou retardar o desenvolvimento ou uma doença ou distúrbio cardiovascular (por exemplo, arritmia cardíaca). A quantidade pode, assim, curar ou fazer com que a arritmia seja suprimida ou fazer com que a doença ou distúrbio cardiovascular entre em remissão, retardar o curso da progressão da doença cardiovascular, retardar ou inibir um sintoma de uma doença ou distúrbio cardiovascular, retardar ou inibir a estabelecimento de sintomas secundários de uma doença ou distúrbio cardiovascular ou inibir o desenvolvimento de um sintoma secundário de uma doença ou distúrbio cardiovascular. A quantidade eficaz para o tratamento da doença ou distúrbio cardiovascular depende do tipo de doença cardiovascular a ser tratada, da gravidade dos sintomas, do indivíduo a ser tratado, da idade e do estado geral do indivíduo, do modo de administração e assim por diante.
Portanto, não é possível especificar a "quantidade eficaz" exata. No entanto, para qualquer caso, uma "quantidade eficaz" apropriada pode ser determinada por um versado na técnica usando apenas experimentação de rotina.
A eficácia do tratamento pode ser julgada por um profissional comum,
por exemplo, a eficácia pode ser avaliada em modelos animais de uma doença ou distúrbio cardiovascular, conforme discutido aqui, por exemplo, tratamento de um roedor com infarto agudo do miocárdio ou lesão por isquemia-reperfusão,
e qualquer tratamento ou administração das composições ou formulações que leva a uma diminuição de pelo menos um sintoma da doença ou distúrbio cardiovascular, como divulgado aqui, por exemplo, aumento da fração de ejeção cardíaca, diminuição da taxa de insuficiência cardíaca,
diminuição do tamanho do infarto, diminuição da morbidade associada (edema pulmonar, insuficiência renal, arritmias)
melhorou a tolerância ao exercício ou outras medidas de qualidade de vida e a diminuição da mortalidade indica tratamento eficaz.
Nas modalidades em que as composições são usadas para o tratamento de uma doença ou distúrbio cardiovascular, a eficácia da composição pode ser julgada usando um modelo animal experimental de doença cardiovascular, por exemplo, modelos animais de lesão por isquemia-reperfusão (Headrick JP, Am J Physiol Heart circ
Physiol 285; H1797; 2003) e modelos animais de infarto agudo do miocárdio. (Yang Z, Am J.
Physiol Heart Circ.
Physiol
282: H949: 2002; Guo Y, J.
Mol Cell Cardiol 33; 825-830,
2001). Ao usar um modelo animal experimental, a eficácia do tratamento é evidenciada quando uma redução em um sintoma da doença ou distúrbio cardiovascular, por exemplo, uma redução em um ou mais sintomas de dispneia, dor no peito, palpitações, tontura, síncope, edema, cianose, palidez, fadiga e pressão alta, que ocorrem mais cedo em animais tratados do que em animais não tratados.
[041] Os indivíduos passíveis de tratamento pelos métodos aqui divulgados podem ser identificados por qualquer método para diagnosticar arritmia cardíaca. Os métodos para diagnosticar essas condições são bem conhecidos por pessoas versadas na técnica. A título de exemplo não limitativo, a arritmia cardíaca pode ser diagnosticada por eletrocardiograma (ECG ou EKG), que é uma gravação gráfica da atividade cardíaca, seja em papel ou em um monitor de computador.
[042] Os termos "doença arterial coronariana" e "síndrome coronariana aguda", conforme aqui utilizados de forma intercambiável, e se referem a infarto do miocárdio, se referem a uma condição cardiovascular, doença ou distúrbio, incluem todos os distúrbios caracterizados por função cardíaca insuficiente, indesejada ou anormal, por exemplo cardiopatia isquêmica, cardiopatia hipertensiva e cardiopatia hipertensiva pulmonar, doença valvular, cardiopatia congênita e qualquer condição que leve à insuficiência cardíaca congestiva em um indivíduo, particularmente um indivíduo humano. Função cardíaca insuficiente ou anormal pode ser o resultado de doença, lesão e/ou envelhecimento. A título de conhecimento, uma resposta à lesão do miocárdio segue um caminho bem definido no qual algumas células morrem enquanto outras entram em um estado de hibernação onde ainda não estão mortas, mas são disfuncionais. Isto é seguido pela infiltração de células inflamatórias, deposição de colágeno como parte das cicatrizes, as quais acontecem paralelamente ao crescimento de novos vasos sanguíneos e a um grau de morte celular contínua.
[043] Nesta divulgação, "compreende", "compreendendo", "contém" e "possui" e similares pode ter o significado que lhes é atribuído na lei de patentes dos EUA e pode significar "inclui", "incluindo" e similares; "consistindo essencialmente em" ou "consiste essencialmente" também tem o significado atribuído na lei de patentes dos EUA e o termo é aberto, permitindo a presença de mais do que aquilo que é recitado, desde que características básicas ou novas do que é recitado não é alterado pela presença de mais do que aquilo que é recitado, mas exclui modalidades da técnica anterior.
[044] Por "fragmento" entende-se uma porção de uma molécula de polipeptídeo ou ácido nucleico. Esta porção contém, de preferência, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%,
60%, 70%, 80% ou 90% de todo o comprimento da molécula ou polipeptídeo de ácido nucleico de referência. Um fragmento pode conter 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 nucleotídeos ou aminoácidos.
[045] "Hibridação" significa ligação de hidrogênio, que pode ser ligação de hidrogênio de Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen reversa, entre nucleobases complementares. Por exemplo, adenina e timina são nucleobases complementares que emparelham através da formação de ligações de hidrogênio.
[046] Os termos "isolado", "purificado" ou "biologicamente puro" se referem a material que é gratuito em graus variados a partir de componentes que normalmente o acompanham como encontrado em seu estado nativo. "Isolar" indica um grau de separação da fonte original ou do ambiente.
"Purificar" denota um grau de separação maior que o isolamento. Uma proteína "purificada" ou "biologicamente pura" é suficientemente livre de outros materiais, de modo que quaisquer impurezas não afetem materialmente as propriedades biológicas da proteína ou causem outras consequências adversas. Ou seja, um ácido nucleico ou peptídeo desta invenção é purificado se estiver substancialmente livre de material celular, material viral ou meio de cultura quando produzido por técnicas de DNA recombinante, precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizados quimicamente. A pureza e a homogeneidade são tipicamente determinadas usando técnicas químicas analíticas, por exemplo, eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alta eficiência.
O termo "purificado" pode denotar que um ácido nucleico ou proteína origina essencialmente uma banda em um gel de eletroforese. Para uma proteína que pode ser sujeita a modificações, por exemplo, fosforilação ou glicosilação, diferentes modificações podem dar origem a diferentes proteínas isoladas, que podem ser purificadas separadamente.
[047] Por "polinucleotídeo isolado" entende-se um ácido nucleico (por exemplo, um DNA) que está livre dos genes que, no genoma natural do organismo a partir do qual a molécula de ácido nucleico da invenção é derivada, flanqueiam o gene.
O termo inclui, portanto, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado em um vetor; em um plasmídeo ou vírus de replicação autónoma; ou no DNA genômico de um procarionte ou eucarioto; ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA ou um fragmento genômico ou de cDNA produzido por PCR ou digestão com endonucleases de restrição) independente de outras sequências. Além disso, o termo inclui uma molécula de RNA que é transcrita a partir de uma molécula de DNA, bem como um DNA recombinante que faz parte de um gene híbrido que codifica a sequência polipeptídica adicional.
[048] Por "polipeptídeo isolado" entende-se um polipeptídeo da invenção que foi separado dos componentes que o acompanham naturalmente. Tipicamente, o polipeptídeo é isolado quando está pelo menos 60%, em peso, livre de proteínas e moléculas orgânicas de ocorrência natural com as quais está naturalmente associado. De preferência, a preparação é pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 90% e mais preferencialmente pelo menos 99%, em peso, um polipeptídeo da invenção. Um polipeptídeo isolado da invenção pode ser obtido, por exemplo, por extração de uma fonte natural, pela expressão de um ácido nucleico recombinante que codifica esse polipeptídeo; ou sintetizando quimicamente a proteína. A pureza pode ser medida por qualquer método apropriado, por exemplo, cromatografia em coluna, eletroforese em gel de poliacrilamida ou por análise por HPLC.
[049] Conforme usado neste documento, "obter" como em "obter um agente" inclui sintetizar, comprar ou adquirir o agente.
[050] Por "redução" no contexto de arritmia cardíaca aqui descrita ou no contexto de sintomas significa uma redução de pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75 %, ou pelo menos 100% de incidências de arritmia ou sintomas, ou gravidade dos sintomas, incluindo porcentagens inteiras de 1% a 100%.
[051] Uma "sequência de referência" é uma sequência definida usada como base para comparação de sequência. Uma sequência de referência pode ser um subconjunto ou a totalidade de uma sequência especificada; por exemplo, um segmento de um cDNA ou sequência de genes completo, ou o cDNA ou sequência de genes completa. Para polipeptídeos, o comprimento da sequência polipeptídica de referência será geralmente pelo menos cerca de 16 aminoácidos, preferencialmente pelo menos cerca de 20 aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 25 aminoácidos e ainda mais preferencialmente cerca de 35 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos ou cerca de 100 aminoácidos. Para ácidos nucleicos, o comprimento da sequência de ácidos nucleicos de referência será geralmente pelo menos cerca de 50 nucleotídeos, preferencialmente pelo menos cerca de 60 nucleotídeos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 75 nucleotídeos e ainda mais preferencialmente cerca de 100 nucleotídeos ou cerca de 300 nucleotídeos ou qualquer número inteiro sobre ou entre eles. Em uma modalidade, um peptídeo de referência AIP é KKALRRQEAVDAL (SEQ. ID. NO: 1).
[052] As moléculas de ácido nucleico úteis nos métodos da invenção incluem qualquer molécula de ácido nucleico que codifique um polipeptídeo da invenção ou um fragmento do mesmo. Tais moléculas de ácido nucleico não precisam ser 100% idênticas a uma sequência de ácido nucleico endógena, mas normalmente exibem identidade substancial.
Polinucleotídeos com "identidade substancial" com uma sequência endógena são tipicamente capazes de hibridar com pelo menos uma cadeia de uma molécula de ácido nucleico de cadeia dupla. As moléculas de ácido nucleico úteis nos métodos da invenção incluem qualquer molécula de ácido nucleico que codifique um polipeptídeo da invenção ou um fragmento do mesmo. Tais moléculas de ácido nucleico não precisam ser 100% idênticas a uma sequência de ácido nucleico endógena, mas normalmente exibem identidade substancial.
Polinucleotídeos com "identidade substancial" com uma sequência endógena são tipicamente capazes de hibridar com pelo menos uma cadeia de uma molécula de ácido nucleico de cadeia dupla. Por "hibridizar" entende-se par para formar uma molécula de fita dupla entre sequências polinucleotídicas complementares (por exemplo, um gene aqui descrito), ou porções das mesmas, sob várias condições de rigor. (Ver, por exemplo, Wahl, G. M. e S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399; Kimmel, A.R. (1987) Methods Enzymol. 152: 507).
[053] Por exemplo, a concentração rigorosa de sal normalmente será inferior a cerca de 750 mM de NaCl e 75 mM de citrato trissódico, de preferência inferior a cerca de
500 mM de NaCl e 50 mM de citrato de trissódio e mais preferencialmente inferior a cerca de 250 mM de NaCl e 25 mM de citrato trissódico.
A hibridação de baixo rigor pode ser obtida na ausência de solvente orgânico, por exemplo,
formamida, enquanto a hibridação de alto rigor pode ser obtida na presença de pelo menos cerca de 35% de formamida e, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 50% de formamida.
Condições rigorosas de temperatura normalmente incluem temperaturas de pelo menos cerca de 30 °C, mais preferencialmente de pelo menos cerca de 37 °C e mais preferencialmente de pelo menos cerca de 42 °C.
Vários parâmetros adicionais, como tempo de hibridação,
concentração de detergente, por exemplo, dodecilsulfato de sódio (SDS) e a inclusão ou exclusão de DNA transportador,
são bem conhecidos dos especialistas na técnica.
Vários níveis de rigor são alcançados combinando essas várias condições, conforme necessário.
Em uma modalidade preferida,
a hibridação ocorrerá a 30 °C em NaCl 750 mM, citrato trissódico 75 mM e SDS a 1%. Em uma modalidade mais preferida, a hibridação ocorrerá a 37 °C em NaCl 500 mM,
citrato trissódico 50 mM, SDS a 1%, formamida a 35% e DNA de esperma de salmão desnaturado a 100 ug/ml (ssDNA). Em uma modalidade mais preferida, a hibridação ocorrerá a 42 °C em
NaCl 250 mM, citrato trissódico 25 mM, SDS a 1%, formamida a 50% e ssDNA de 200 µg/ml. Variações úteis nessas condições serão facilmente aparentes para os técnicos no assunto.
[054] Para a maioria das aplicações, as etapas de lavagem que seguem a hibridação também variam em rigor. As condições rigorosas de lavagem podem ser definidas pela concentração de sal e pela temperatura. Como acima, o rigor da lavagem pode ser aumentado diminuindo a concentração de sal ou aumentando a temperatura. Por exemplo, a concentração rigorosa de sal para as etapas de lavagem será preferencialmente inferior a cerca de 30 mM de NaCl e 3 mM de citrato trissódico e mais preferencialmente inferior a cerca de 15 mM de NaCl e 1,5 mM de citrato trissódico.
Condições rigorosas de temperatura para as etapas de lavagem normalmente incluem uma temperatura de pelo menos cerca de 25 °C, mais preferencialmente de pelo menos cerca de 42 °C e ainda mais preferencialmente de pelo menos cerca de 68 °C.
Em uma modalidade preferida, as etapas de lavagem serão ocorrem a 25 °C em NaCl 30 mM, citrato trissódico 3 mM e SDS a 0,1%. Em uma modalidade mais preferida, as etapas de lavagem ocorrerão a 42 °C em NaCl 15 mM, citrato trissódico 1,5 mM e SDS a 0,1%. Em uma modalidade mais preferida, as etapas de lavagem ocorrerão a 68 °C em NaCl 15 mM, citrato trissódico 1,5 mM e SDS a 0,1%. Variações adicionais nessas condições serão prontamente aparentes para os técnicos no assunto. As técnicas de hibridação são bem conhecidas dos técnicos no assunto e são descritas, por exemplo, em Benton e Davis (Science 196: 180, 1977); Grunstein e Hogness (Proc.
Natl. Acad. Sci., USA 72: 3961, 1975); Ausubel et al.
(Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Nova Iorque, 2001); Berger e Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Nova York); e Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque.
[055] Por "substancialmente idêntico" entende-se uma molécula de polipeptídeo ou ácido nucleico que exibe pelo menos 50% de identidade com uma sequência de aminoácidos de referência (por exemplo, qualquer uma das sequências de aminoácidos aqui descritas) ou sequência de ácido nucleico (por exemplo, qualquer uma de as sequências de ácidos nucleicos aqui descritas). Preferencialmente, essa sequência é pelo menos 60%, mais preferencialmente 80% ou 85% e mais preferencialmente 90%, 95% ou mesmo 99% idêntica no nível de aminoácido ou ácido nucleico à sequência usada para comparação.
[056] A identidade da sequência é tipicamente medida usando o software de análise de sequência (por exemplo, Sequence Analysis Software Package do Genetics Computer Group, Centro de Biotecnologia da Universidade de Wisconsin, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, programas BLAST, BESTFIT, GAP ou PILEUP/PRETTYBOX). Esse software combina sequências idênticas ou semelhantes, atribuindo graus de homologia a várias substituições, exclusões e/ou outras modificações. As substituições conservadoras normalmente incluem substituições dentro dos seguintes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina. Em uma abordagem exemplar para determinar o grau de identidade, um programa BLAST pode ser usado, com uma pontuação de probabilidade entre e-3 e e-100 indicando uma sequência intimamente relacionada.
[057] Conforme usados aqui, o termo "modular" se refere a regular ou ajustar até um certo grau.
[058] Como usados aqui, os termos "farmaceuticamente aceitável", "fisiologicamente tolerável" e variações gramaticais dos mesmos, quando se referem a composições, carreadores, diluentes e reagentes, são usados de forma intercambiável e representam que os materiais são capazes de administrar a ou sobre um mamífero sem a produção de efeitos fisiológicos indesejáveis, tais como náusea, tontura, perturbação gástrica e similares. Um carreador farmaceuticamente aceitável não promoverá o aumento de uma resposta imune a um agente com o qual é misturado, a menos que desejado. A preparação de uma composição farmacológica que contém ingredientes ativos nela dissolvidos ou dispersos é bem entendida na técnica e não precisa ser limitada com base na formulação. Tipicamente, essas composições são preparadas como injetáveis como soluções ou suspensões líquidas, no entanto, também podem ser preparadas formas sólidas adequadas para solução ou suspensões em líquido antes da utilização. A preparação também pode ser emulsionada ou apresentada como uma composição lipossômica. O ingrediente ativo pode ser misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo e em quantidades adequadas para uso nos métodos terapêuticos aqui descritos. Excipientes adequados incluem, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol ou similares e combinações dos mesmos. Além disso, se desejado, a composição pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes tamponantes de pH e similares que aumentam a eficácia do ingrediente ativo. A composição terapêutica da presente invenção pode incluir sais farmaceuticamente aceitáveis dos componentes nela contidos.
Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres do polipeptídeo) que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos como acético, tartárico, mandélico e similares. Os sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas, como, por exemplo,
hidróxido de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico, e bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-
etilamino etanol, histidina, procaína e gostar.
Os carreadores fisiologicamente toleráveis são bem conhecidos na técnica.
Carreadores líquidos exemplificativos são soluções aquosas estéreis que não contêm materiais além dos ingredientes ativos e água ou contêm um tampão como fosfato de sódio com valor fisiológico de pH, solução salina fisiológica ou ambos, como solução salina tamponada com fosfato.
Além disso, os carreadores aquosos podem conter mais de um sal tampão, bem como sais como cloretos de sódio e potássio, dextrose, polietilenoglicol e outros solutos.
As composições líquidas também podem conter fases líquidas além e à exclusão de água.
Exemplos de tais fases líquidas adicionais são glicerina, óleos vegetais, como óleo de semente de algodão e emulsões de óleo de água.
A quantidade de um agente ativo usado nos métodos aqui descritos que será eficaz no tratamento de um distúrbio ou condição particular dependerá da natureza do distúrbio ou condição e pode ser determinada por técnicas clínicas padrão.
Os carreadores farmacêuticos adequados são descritos em Remington's
Pharmaceutical Sciences, A.
Osol, um texto de referência padrão neste campo da técnica.
Por exemplo, uma composição parentérica adequada para administração por injeção é preparada dissolvendo 1,5% em peso de ingrediente ativo em solução de cloreto de sódio a 0,9%.
[059] Em uma modalidade, o carreador "farmaceuticamente aceitável" não inclui meios de cultura de células in vitro.
[060] Em uma modalidade, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopeia dos EUA ou em outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e, mais particularmente, em humanos.
Especificamente, se refere aos compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo de um julgamento médico adequado, adequados para uso em contato com tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, proporcional a uma relação benefício/risco razoável.
[061] O termo "carreador" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou carreador com o qual a terapêutica é administrada. Esses carreadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, como água e óleos, incluindo aqueles de origem animal, vegetal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. A água é um carreador preferido quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa.
Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol também podem ser empregadas como carreadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e o gosto. A composição, se desejado, também pode conter pequenas quantidades de agentes umectantes ou emulsificantes ou agentes tamponantes de pH.
Estas composições podem assumir a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação sustentada e similares. A composição pode ser formulada como um supositório, com ligantes e carreadores tradicionais, como triglicerídeos. A formulação oral pode incluir carreadores padrão, tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio, etc. Exemplos de carreadores farmacêuticos adequados são descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed., Gennaro, ed. (Mack Publishing Co., 1990).
A formulação deve se adequar ao modo de administração.
[062] Um "indivíduo", como usado aqui, inclui qualquer animal que exibe um sintoma de uma doença, distúrbio ou condição monogênica que pode ser tratada com os vetores de terapia gênica, terapêutica baseada em células e métodos divulgados em outras partes deste documento. Em modalidades preferidas, um indivíduo inclui qualquer animal que exibe sintomas de uma doença, distúrbio ou condição que pode ser tratada com os vetores de terapia genética, terapêutica baseada em células e métodos aqui contemplados. Os indivíduos adequados (por exemplo, pacientes) incluem animais de laboratório (como camundongo, rato, coelho ou porquinho da índia), animais de fazenda e animais domésticos ou animais de estimação (como um gato ou cachorro). Primatas não humanos e, preferencialmente, pacientes humanos, estão incluídos. Os assuntos típicos incluem animais que exibem quantidades aberrantes (quantidades inferiores ou superiores a um indivíduo "normal" ou "saudável") de uma ou mais atividades fisiológicas que podem ser moduladas pela terapia. Um indivíduo significa um mamífero, incluindo, entre outros, um mamífero humano ou não humano, como bovinos, equinos, caninos, ovinos ou felinos.
[063] As faixas aqui fornecidas são entendidas como atalhos para todos os valores dentro do intervalo. Por exemplo, entende-se que um intervalo de 1 a 50 inclui qualquer número, combinação de números ou subintervalos do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50.
[064] O termo "tecido" se refere a um grupo ou camada de células similarmente especializadas que juntas desempenham certas funções especiais. O termo "específico de tecido" se refere a uma fonte ou característica definidora de células de um tecido específico.
[065] Conforme usados aqui, os termos "tratar", "tratando", "tratamento" e similares se referem a reduzir ou melhorar um distúrbio e/ou sintoma associado a ele. Será apreciado que, embora não seja impedido, o tratamento de um distúrbio ou condição não requer que o distúrbio, condição ou sintomas associados a ele sejam completamente eliminados.
[066] A menos que seja especificamente declarado ou óbvio a partir do contexto, como usados aqui, o termo "ou" é entendido como inclusivo. A menos que seja especificamente declarado ou óbvio a partir do contexto, como usados aqui, os termos "um", "uma" e "o", "a" são entendidos como singulares ou plurais.
[067] A menos que seja especificamente declarado ou óbvio a partir do contexto, como usados aqui, o termo "cerca de" é entendido como dentro de uma faixa de tolerância normal na técnica, por exemplo, dentro de 2 desvios padrão da média.
Sobre pode ser entendido como dentro de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% ou 0,01% do valor declarado. Salvo disposição em contrário do contexto, todos os valores numéricos aqui fornecidos são modificados pelo termo cerca de.
[068] A recitação de uma lista de grupos químicos em qualquer definição de uma variável aqui inclui definições dessa variável como qualquer grupo único ou combinação de grupos listados. A recitação de uma modalidade para uma variável ou aspecto neste documento inclui essa modalidade como qualquer modalidade única ou em combinação com quaisquer outras modalidades ou porções das mesmas.
[069] Quaisquer composições ou métodos aqui fornecidos podem ser combinados com uma ou mais de qualquer uma das outras composições e métodos aqui fornecidos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[070] As FIGS. 1A a 1C mostram a caracterização de oscilações de Ca2+ em ilhas iPSC-CM isoladas. A FIG. 1A mostra imagens imunofluorescentes de WT, CPVTp e CPVTe iPSC-CMs, coradas para o marcador sarcômero ACTN2. As linhagens celulares tinham aparência indistinguível. Barra, 50 µm. A FIG. 1B mostra que liberações de Ca2+ gravadas a partir de iPSC-CMs carregadas com Fluo-4 por imagem de varredura confocal. O gráfico de violino mostra a distribuição da frequência de liberação de Ca2+. O número de cada forma indica o número de aglomerados de células. A FIG. 1C mostra as oscilações de Ca2+ registradas por imagens de varredura em linha confocal de ilhas iPSC-CM isoladas. Setas e pontas de seta indicam eventos aberrantes de liberação precoce e atrasada de Ca2+, respectivamente. O número de cada forma indica o número de aglomerados de células. Teste não paramétrico de aço Dwass com correção de teste múltiplo; #, vs WT; † vs TP + ISO; § vs CPVTp; ¥ vs CPVT. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001.
[071] As FIGS. 2A a 2F mostram o tecido cardíaco modificado por opto-MTF para modelagem de arritmia. A FIG.
2A mostra o esquema do sistema opto-MTF para monitorar e medir opticamente a propagação e contração da onda de Ca2+ no nível do tecido. Os cardiomiócitos programados para expressar o ChR2 são semeados em gelatina micro-moldada com cantilevers flexíveis em uma extremidade. A iluminação focal usando fibras óticas excita as células, resultando na propagação da onda Ca2+ ao longo do MTF e nos cantilevers. A propagação da onda de Ca2+ é medida por imagem fluorescente do corante sensível a Ca2+ X-Rhod-1 e contração mecânica por imagem de campo escuro dos cantilevers. A FIG. 2B mostra imagens confocais de opto-MTF coradas com ACTN2. A gelatina micro-moldada induz iPSC-CMs a crescer com seu eixo longo alinhado com o eixo longo do MTF. A FIG. 2C mostra o acoplamento excitação-contração nos opto-MTFs da CPVTp.
Imagens representativas do lapso de tempo mostram a propagação da onda Ca2+ e a sístole mecânica registrada induzida pela estimulação optogenética do ponto. A FIG. 2D mostra os traços de Ca2+ que foram registrados nos pontos marcados a-d na imagem mais à direita da FIG. 2C. Linhas paralelas verticais em cada traço indicam a estimulação ótica no ponto de estimulação. Tempo de ativação é o tempo até a velocidade máxima de avanço do sinal de Ca2+. CaTD80 é a duração do transitório de Ca2+ com decaimento de 80%. A FIG.
2E mostra os mapas espaciais do tempo de ativação, velocidade e direção da onda Ca2+, e CaTD80 para opto-MTFs WT e CPVTp na estimulação de 1,5 Hz, demonstrando um comportamento bem ordenado de ambos os tecidos. Barra, 1 mm. A FIG. 2F mostra a comparação da frequência de pós-despolarizações em ilhas de células espontaneamente batendo ou tecido opto-MTF. Teste exato de Fisher: ***, P < 0,001.
[072] As FIGS. 3A a 3I mostram a caracterização de CPVT opto-MTFs. A FIG. 3A mostra as imagens de lapso de tempo da propagação da frente de onda do CPVTp opto-MTF Ca2+ e contração cantilever. As frentes de onda Ca2+, calculadas a partir da derivada temporal dos sinais Ca2+, mostram a reentrada em onda espiral. Barra, 1 mm. A FIG. 3B mostra o sinal Ca2+ e traços de tensão contrátil durante a reentrada.
Exemplo representativo de CPVTp opto-MTF com ritmo de 3 Hz.
Linhas paralelas verticais ao longo de cada traço indicam estimulação ótica no local da estimulação. A FIG. 3C mostra a ocorrência de reentrada em CPVT e WT opto-MTFs. hi, estimulação ≥ 2 Hz; lo, estimulação <2 Hz. A alta taxa de ritmo e o ISO aumentaram a ocorrência de reentrada. Teste qui-quadrado de Pearson versus TP com as mesmas condições: †, P < 0,05. ††, P < 0,01. †††, P < 0,001. Barras são rotuladas com números de amostra. As FIGS. 3D a 3F mostram os mapas espaciais do tempo de ativação da onda Ca2+, velocidade e CaTD80 em opto-MTFs WT ou CPVTp. O mesmo tecido é mostrado com estimulação de 1,5 Hz ou 3 Hz. A estimulação de 3 Hz aumentou a heterogeneidade espaço-temporal. As FIGS.
3G a 3H mostram a velocidade global normalizada e CaTD80 (FIG. 3G) e sua dispersão espacial e temporal (FIG. 3H) em função da frequência de estimulação, sob estimulação ISO.
Dados de tecidos com acoplamento 1: 1 foram incluídos (n = 12 TP, 12 CPVTp, 13 CPVTe de > 3 colheitas). Linhas suaves são funções quadráticas ajustadas aos dados. As áreas sombreadas representam o intervalo de confiança de 95% para o ajuste. Na FIG. 3G, os dados foram normalizados para valores do mesmo opto-MTF a 1,5 Hz de estimulação sem ISO.
A FIG. 3I mostra que o gráfico do vulcão mostra 54 parâmetros no nível de tecido da propagação de Ca2+ no WT vs. CPVT opto- MTFs. Cada um dos nove marcadores representa a propriedade indicada medida em três taxas de estimulação diferentes (1, 2 e 3 Hz) com e sem ISO. As regiões sombreadas indicam parâmetros com P < 0,05 e alteração superior a 2 vezes. Barra em A, D-F = 1 mm.
[073] As FIGS. 4A a 4D mostram o início da reentrada no CPVT opto-MTFs. A FIG. 4A mostra o CPVTp opto-MTF a 2 Hz de estimulação com ISO. O mapa de ativação e os campos de velocidade foram bem ordenados. O histograma de velocidade reflete uma faixa estreita de valores. A FIG. 4B mostra os traçados de Ca2+ dos pontos a e b no painel FIG. 4A. A FIG.
4C mostra o mesmo opto-MTF que na FIG. 4A, estimulado a 3 Hz com ISO. Há uma maior heterogeneidade no campo da velocidade e desorganização do mapa de ativação. O bloqueio de condução localizado e a condução retrógrada tornam-se evidentes nos pulsos 18 e 19. Os histogramas indicam uma maior dispersão espacial da velocidade. A FIG. 4D mostra os traçados de Ca2+ nos pontos a e b no painel FIG. 4C. O bloqueio da condução e o início da reentrada foram associados a uma anormalidade transitória do Ca2+.
[074] As FIGS. 5A a 5F mostram que a fosforilação de CaMKII de RYR2-S2814 é necessária para expressar o fenótipo arrítmico de CPVT em aglomerados de células isolados. A FIG.
5A mostra que os iPSC-CMs em grupos de células isoladas foram tratados com ISO e inibidores seletivos de CaMKII (C) ou PKA (P). As liberações de Ca2+ foram captadas por varredura confocal de linha. A FIG. 5B mostra o esquema do RYR2 (duas subunidades do tetrâmero mostradas). Três resíduos principais são destacados: S2808, o alvo da fosforilação da PKA; S2814, o alvo da fosforilação de CaMKII; e R4651, mutado em CPVTp. As FIGS. 5C a 5D mostram que a frequência de liberação Ca2+ no CPVTe foi reduzida pela mutação S2814A, mas não pela mutação S2808A. A FIG. 5C mostra traços representativos. A FIG. 5D mostra a distribuição da frequência de liberação Ca2+. As FIGS. 5E a 5F mostram frequência transitória anormal de Ca2+. Setas e pontas de seta indicam eventos anormais e tardios de liberação anormal de Ca2+ em traçados representativos (FIG. 5E). Distribuição da fração de transientes anormais de Ca2+ por célula (FIG.
5F). Teste não-paramétrico Steel-Dwass com correção de multiteste; † vs WT com tratamento ISO correspondente; §, vs CPVTe com tratamento ISO correspondente. † ou §, P < 0,05; †† ou §§, P < 0,01; ††† ou §§§, P < 0,001.
[075] As FIGS. 6E a 6H mostram que a mutação RYR2-S2814A impede a reentrada em tecidos manipulados por CPVT. A FIG.
6A são imagens confocais de opto-MTF construídas usando iPSC- CMs CPVTe-S2814A. Os miócitos são alinhados por substrato de gelatina micro-moldada. A FIG. 6B mostra CPVTe-S2814A opto- MTF representativo. Os transientes de Ca2+ e a contração sistólica foram acoplados 1: 1 com estímulos óticos de 3 Hz (linhas azuis). A FIG. 6C mostra a ocorrência de reentrada no CPVTe-S2814A em comparação com os opto-MTFs WT (†) e CPVTe (§) nas condições correspondentes. Teste qui-quadrado de Pearson: † ou §, P < 0,05. †† ou §§, P < 0,01. ††† ou §§§, P < 0,001. As barras são rotuladas com tamanhos de amostras.
A FIG. 6D mostra os mapas espaciais do mesmo CPVTe-S2814A opto-MTF com ritmo de 1,5 Hz ou 3,0 Hz, na presença de ISO.
O tempo de ativação, a velocidade de propagação da onda Ca2+ e o CaTD80 foram bem organizados e relativamente homogêneos em comparação com o CPVTe (ver FIG. 3). As FIGS. 6E a 6F mostram a velocidade global e CaTD80 (FIG. 6E) ou sua dispersão espacial ou temporal (FIG. 6F) como uma função da frequência de estimulação no CPVTe-S2814A em comparação ao CPVT e WT. As amostras foram tratadas com ISO. As amostras foram tratadas com ISO. Apenas os tecidos que responderam 1: 1 a cada estímulo foram incluídos (n = 12 TP, 12 CPVTp, 13 CPVTe e 18 CPVTe-S2814A de > 3 colheitas). Linhas suaves são funções quadráticas ajustadas aos dados; áreas sombreadas mostram o intervalo de confiança de 95% para o ajuste. A velocidade global e o CaTD80 foram normalizados para dados do mesmo tecido adquirido a 1,5 Hz sem ISO. A FIG. 6G mostra um gráfico de vulcão de 54 parâmetros no nível de tecido da propagação de ondas de Ca2+ (consulte a FIG. 3). Ao contrário dos parâmetros teciduais da CPVT, os parâmetros teciduais da CPVTe-S2814A não foram estatisticamente diferentes dos da WT. A FIG. 6H fornece um diagrama esquemático que ilustra uma estratégia experimental para gerar vetores de vírus adenoassociados (AAV) que codificam um Autocamtídeo de Peptídeo Inibitório de CaMKII (AIP). O AAV9 foi injetado em camundongos intraperitonealmente em um estudo de eletrofisiologia (EP).
[076] A FIG. 7 fornece uma série de painéis mostrando a expressão de AAV9-GFP-AIP no coração (linha superior) e em micrografias de tecido cardíaco.
[077] A FIG. 8 fornece dois gráficos mostrando a porcentagem de cardiomiócitos infectados pelo vírus AAV9. O gráfico esquerdo mostra células com baixo GFP e células com sinais médios de GFP. A coluna à esquerda de cada par de colunas é GFP baixa e a coluna à direita é GFP média. O gráfico da direita mostra células com AIP diferentes, as colunas em cada 3 colunas da esquerda para a direita são AIP médias, altas e cheias. O primeiro conjunto de colunas em cada painel inclui esses identificadores.
[078] A FIG. 9 fornece imagens de transferências Western mostrando níveis de CaMKII fosforilado (P) vs. CaMKII (total) em lisados de coração inteiro de camundongos p10 injetados com um vetor de expressão de AIP, AAV9-GFP-AIP ou com vetor de controle.
[079] A FIG. 10 fornece um gráfico de caixa mostrando a quantificação da fosforilação de CaMKII em células que expressam AAV9-GFP-AIP ou um vetor de controle.
[080] A FIG. 11 fornece um diagrama esquemático que descreve uma penetração de R176Q no canal cardíaco de rianodina (RYR2) como um modelo de CPVT.
[081] A FIG. 12 é um diagrama esquemático que mostra a colocação de um cateter de estimulação e registro em camundongos. O método está completamente descrito em Mathur, N. et al. Circulação: Arritmia e Eletrofisiologia (2009).
[082] A FIG. 13 é um diagrama esquemático que ilustra o protocal usado para induzir e registrar arritmias CVPT murinas.
[083] A FIG. 14 mostra eletrocardiogramas de linha de base em tipo selvagem e camundongos com uma mutação R176Q no canal cardíaco de rianodina (RYR2).
[084] A FIG. 15 é um gráfico que mostra as alterações da frequência cardíaca no tipo selvagem (WT) e camundongos que sofrem uma penetração de R176Q no canal cardíaco de rianodina (RYR2), onde os camundongos estão expressando um adenovírus que codifica a Autocamtídeo In vitro inibidor de CaMKII (AIP) ou um controle GFP. As colunas em cada conjunto de três colunas da esquerda para a direita são: linha de base, isoproterenol e epinefrina. O primeiro conjunto de colunas inclui esses identificadores.
[085] A FIG. 16 é um gráfico que quantifica mudanças no intervalo QT. As colunas em cada conjunto de três colunas da esquerda para a direita são linha de base, isoproterenol e epinefrina. O primeiro conjunto de colunas inclui esses identificadores.
[086] As FIGS. 17A a 17D são eletrocardiogramas mostrando arritmia basal e espontânea em camundongos com uma mutação R176Q no canal cardíaco de rianodina (RYR2), (camundongos mutantes R176Q) injetados com vetores de controle que expressam GFP ou injetados com vetores que expressam AIP.
[087] As FIGS. 18A a 18F mostram que a expressão in vivo de AIP reduz a probabilidade de arritmia induzida com estimulação (FIGS. 18A a 18B) e catecolaminas (FIGS. 18C a 18D). A FIG. 18E mostra um nível relativo de transdução com doses aumentadas de vírus AAV9. A FIG. 18F mostra a supressão de arritmias ventriculares induzidas com várias doses de PAI. ** P < 0,001, §P = 0,7. * P < 0,01, † P = 0,4. N como indicado. Valores p por qui-quadrado Valores p por qui- quadrado.
[088] As FIGS. 19A a 19C de paciente CPVT com mutação RYR2-R4651I. A FIG. 19A mostra os dados eletrocardiográficos de um sistema de monitoramento cardíaco inserível obtido para este paciente. O paciente desenvolveu taquicardia ventricular bidirecional (superior esquerda), que se converteu em taquicardia ventricular polimórfica (superior direita e inferior esquerda). O paciente se recuperou espontaneamente em ritmo sinusal (canto inferior direito).
A FIG. 19B mostra os dados de sequenciação de Sanger no locus RYR2-R4651 para um iPSCs individual normal e para um iPSCs derivados do paciente. A seta aponta para apontar uma mutação que causa a substituição do R4651I. A FIG. 19C é um desenho esquemático da proteína RYR2 mostrando as regiões de hotspot de mutação (Regiões 1-4) e a localização da mutação R4651I na região 4.
[089] As FIGS. 20A a 20G demonstram a caracterização e edição de genoma de linhas CPVT iPSC. As FIGS. 20A a 20D mostram análises de controle de qualidade da linha CPVTp iPSC. As células CPVTp tinham cariótipo normal (FIG. 20A), expressão de marcadores de pluripotência (FIG. 20B), morfologia típica das colônias (FIG. 20C) e formaram teratomas que produziam derivados de três camadas germinativas, avaliados pela coloração de H&E de cortes histológicos (FIG. 20D). A FIG. 20E é um esquema do protocolo usado para diferenciar iPSC-CMs de iPSCs. A FIG. 20F é um gráfico de FACS mostrando a pureza de iPSC-CMs selecionados com lactato. A FIG. 20G é o resultado do sequenciamento de Sanger mostrando a edição eficaz do genoma para introduzir a mutação heterozigótica R4651I em iPSCs do tipo selvagem PGP1, criando a linha celular denominada CPVTe.
[090] A FIG. 21 é a plataforma de gravação Opto-MTF projetada. As fibras óticas estimulam as áreas focais no opto-MTF. O Opto-MTF é iluminado sob um microscópio para geração simultânea de imagens em campo escuro de cantilevers mecânicos usando uma câmera de alta resolução espacial e imagens fluorescentes da propagação de ondas Ca2+ usando uma câmera de alta velocidade e alta sensibilidade
[091] As FIGS. 22A a 22L mostram a fabricação de opto- MTFs semeados com hiPSC-CMs.
[092] A FIG. 23 mostra a imagem focal do CPVTe opto-MTF.
A CPVTe opto-MTF foi imunocorada para o marcador sarcomérico de disco Z ACTN2 e o marcador nuclear DAPI. Os iPSC-CMs foram alinhados em paralelo. Barra = 20 µm.
[093] As FIGS. 24A a 24B mostram o mapeamento ótico da propagação de ondas Ca2+ em um opto-MTF. A FIG. 24A são imagens de lapso de tempo de opto-MTF mostrando sinal X- Rhod-1 ("imagem Ca2+") e imagens de campo escuro de modilhões deformáveis no terminal do MTF. A FIG. 24B são traços de transitórios de Ca2+ e estresse mecânico em MTFs. O sinal Ca2+ X-Rhod-1 foi gravado nos pontos a-d, rotulados na imagem mais à direita da (FIG. 24A). Linhas paralelas verticais ao longo dos traços indicam sinais de estimulação ótica de 488 nm.
[094] As FIGS. 25A a 25B mostram a independência de MTFs adjacentes na construção opto-MTF. A FIG. 25A mostra o pico de contração sistólica e diastólica dos MTFs após estimulação ótica independente no MTF com diferentes frequências de estimulação (1,5, 2, 3 e 4 Hz). A FIG. 25B mostra traços de estresse de cada MTF. Cada MTF é estimulado por uma fibra ótica separada em uma frequência diferente. A sístole mecânica de cada MTF era independente dos outros MTFs, como demonstrado aqui pelas diferentes frequências dos traços de estresse. Linhas azuis indicam estimulação ótica.
[095] As FIGS. 26A a 26D mostram a dispersão espacial e temporal da velocidade e duração transitória do cálcio em opto-MTFs. A heterogeneidade da velocidade de propagação ou duração transitória do cálcio na recuperação de 80% (CaTD80) foi calculada para opto-MTFs construídos usando as células indicadas: NRVMs, cardiomiócitos ventriculares de ratos neonatais; Cor.4U, iPSC-CMs da Axiogênese; WT, CPVTe e CPVTe- S2814A, iPSC-CMs deste estudo. Nome Teste estatístico: *, P < 0,05. **, P < 0,01. ***, P < 0,001.
[096] As FIGS. 27A a 27D mostram as ondas espontâneas de Ca2+ nos opto-MTFs. Opto-MTFs construídos a partir de CPVTp (FIG. 27A), CPVTe (FIG. 27B) ou WT iPSC-CMs (FIG. 27C), permitido bater espontaneamente. As ondas Ca2+ foram registradas opticamente pela intensidade da fluorescência X- Rhod-1. Nas FIGURAS 27A-27C, os painéis esquerdos são mapas de ativação e traços direitos são sinal Ca2+ nos pontos indicados no MTF. Observe a falta de transientes aberrantes de Ca2+. As ondas espontâneas de Ca2+ originaram-se das bordas dos MTFs. A FIG. 27D mostra que o sinal de Ca2+ em pixels individuais dos tecidos indicados foi analisado para anormalidades transitórias de Ca2+ consistentes com EADs ou DADs. Nenhum foi observado em nenhum dos opto-MTFs espontaneamente espancados. A frequência de batimento espontâneo dos opto-MTFs foi comparável entre os tipos de iPSC-CM. Tudo representa a união de todos os tecidos CPVTp e CPVTe registrados.
[097] A FIG. 28 demonstra a ocorrência de reentrada em opto-MTFs WT, CPVTp e CPVTe. Ocorrência de reentrada em opto- MTFs montados a partir de opto-MTFs WT, CPVTp e CPVTe, estimulados com estimulação ISO ou baixa (< 2 Hz) ou alta (≥ 2Hz). †, comparação com o grupo de tratamento comparável para WT; § Comparação com grupo de tratamento comparável para CPVTp. Teste de Fisher: † ou §, P < 0,05; †† ou §§, P < 0,01; ††† ou §§§, P < 0,001.
[098] As FIGS. 29A a 29D mostram a reentrada no CPVTe opto-MTF. FIGS. 29A a 29B. Estimulação a 2 Hz. As ondas Ca2+ são bem ordenadas. Traços de Ca2+ a partir dos pontos marcados no painel esquerdo de A são mostrados em B. FIGS. 29C a 29D.
Estimulação do mesmo tecido a 3 Hz. As ondas de Ca2+ são caóticas e várias áreas de forma de reentrada. Traços de Ca2+ a partir de pontos marcados nos painéis esquerdos da FIG.
29C são mostrados na FIG. 29D. Observe que o ponto mais distal d tem acoplamento 3: 2 ou 2: 1 com o estímulo de estimulação. Os mapas de ativação e os traços de Ca2+ foram calculados processando os dados de imagem de Ca2+ nos filmes obtidos.
[099] As FIGS. 30A a 30B mostram a vulnerabilidade dos opto-MTFs WT, CPVTp e CPVTe para reentrada. A FIG. 30A mostra a velocidade de propagação da onda Ca2+ e CaTD80 de tecidos tratados com ISO nas taxas de estimulação indicadas. A FIG.
30B mostra a dispersão espacial e temporal da velocidade de propagação da onda Ca2+ e CaTD80 em tecidos tratados com ISO nas taxas de estimulação indicadas.
[100] A FIG. 31 mostra a análise estatística das propriedades opto-MTF. Nove parâmetros foram analisados com e sem tratamento ISO nas frequências de estimulação de 1, 2 e 3 Hz. Essas 54 comparações foram feitas entre WT e CPVT (união de CPVTp e CPVTe) e entre WT e CPVTe-S2814A.
[101] As FIGS. 32A a 32D mostram o início da reentrada no CPVTe opto-MTF. As FIGS. 32A a 32B mostram as ondas Ca2+ organizadas a 2 Hz de estimulação. Traços na FIG. 32B foram registrados a partir dos pontos marcados na FIG. 32A. As FIGS. 32C a 32D. Desenvolvimento de reentrada em estimulação de 2,5 Hz. Traços na FIG. 32D foram registrados a partir dos pontos marcados na FIG. 32C. Observe o desenvolvimento de anormalidade transitória do Ca2+ após o pulso 2, acompanhada pelo início de reentrada no pulso 3.
[102] A FIG. 33 mostra a inibição da atividade de CaMKII pelo peptídeo inibitório permeável às células. Os iPSCCMs foram tratados com o inibidor de peptídeo de CaMKII permeável às células AIP (250 nM). As células foram estimuladas por 60 minutos com 1 µM ISO antes da análise de extratos celulares por imunotransferência. Nas células do tipo selvagem (PGP1), a fosforilação de CaMKII T286 foi bloqueada pela AIP, enquanto o CaMKII total permaneceu inalterado. Nas células CPVTp, houve ativação basal de CaMKII. Isso foi bloqueado pelo AIP.
[103] As FIGS. 34A a 34D mostram a edição do genoma dos locais S2808 e S2814 de RYR2. A FIG. 34A é um esquema da estratégia de edição de genoma usada para obter mutações homozigóticas S2808A ou S2814A em iPSCs de PGP1 (WT) ou PGP1- RYR2R4651I/+ (CPVTe). A FIG. 34B mostra sequenciamento de sanger representativo para confirmar a edição do genoma. A FIG. 34C mostra a diferenciação iPSC-CM de linhagens de células editadas pelo genoma. FIG. 34D mostra que as linhagens celulares mutantes S2814A não exibiram fosforilação de S2814 na estimulação ISO.
[104] A FIG. 35A mostra que os pacientes com CPVT têm eletrocardiogramas em repouso normais, mas arritmias graves com risco de vida com o exercício. TV, taquicardia ventricular. FV, fibrilação ventricular. Traços são esboços idealizados mostrados para fins de ilustração.
[105] A FIG. 35B mostra a fisiopatologia da CPVT. À esquerda, desenho animado da liberação de Ca2+ induzido por cardiomiócito. 1. O potencial de ação abre o canal Ca2+ do tipo L (LTCC); 2. Ca2+ induz a abertura de RYR2 e liberação de Ca2+ a partir do retículo sarcoplasmático (SR); 3. Ca2+ intracelular elevado induz contração do miofilamento; 4. O Ca2+ é eliminado do citosol por SERCA e NCX. Certo, mutações de CPV no RYR2 aumentam o vazamento diastólico de Ca2+.
[106] A FIG. 36 mostra um esquema para o tratamento de animais adolescentes com AAV9 e fluxo de trabalho para teste de células únicas e com estimulação ventricular.
[107] As FIGS. 37A a 37B mostram os efeitos de AAV9-GFP- AIP em cardiomiócitos isolados de animais tratados. A FIG.
37A demonstra traçados confocal da linha do indicador de Ca2+ (Rhod-2) após estimulação externa por 1 minuto. O Ca2+ espontâneo é registrador e quantificado (FIG. 37B). N = 33 (GFP), N = 25 (AIP). ** P < 0,01.
[108] As FIGS. 38A a 38C mostram a supressão de arritmias ventriculares induzidas em camundongos mutantes R176Q tratados com GFP ou AIP por AAV9 por injeção retro-orbital.
A FIG. 38A mostra traçado representativo de arritmia ventricular induzida (painel superior) ou sem arritmia (painel inferior) em animais tratados com GFP ou AIP, respectivamente. As FIGS. 38B a 38C mostram a porcentagem de animais com arritmias ventriculares (FIG. 38B) ou a duração das arritmias ventriculares induzidas por estimulação (FIG.
38C). N = 6 (GFP), N = 6 (AIP), * P < 0,01.
[109] As FIGS. 39A a 39B mostram supressão de sinalização Ca2+ anormal com RNAs modificados para inibidores de peptídeo. Os cardiomiócitos adultos de camundongos RYR2- R176Q foram transfectados com RNA modificado (modRNAs) para inibidores de peptídeo AIP e CN19o ou fundidos com a proteína de ligação ao RYR2 FKBP12.6 e co-expressando mCherry. Após a cultura por 12 horas, os cardiomiócitos individuais foram carregados com um indicador Ca2+ (Fluo-4) e marcados por 1 minuto antes da gravação dos eventos de Ca2+ pós-estimulação.
A FIG. 39A mostra traçados representativos de linhas confocais de cardiomiócitos adultos e expressão de mCherry (esquerda). A FIG. 39B mostra a quantificação de todos os inibidores testados em comparação com o mCherry. Redução estatisticamente significativa nos eventos anormais de Ca2+ pós-marcapasso nos cardiomiócitos que expressam CN19o e quase significativa nas células que expressam AIP em comparação apenas ao mCherry. N = 15 (mCherry), N = 5 (AIP), N = 5 (FKBP12.6-AIP), N = 5 (CN19o), N = 7 (FKBP12.6-CN19o).
Valor de P para AIP = 0,07, * P < 0,05, §P> 0,5.
[110] A FIG. 40 mostra a expressão relativa de novos capsídeos de AAV através de múltiplos tecidos. Após a injeção de 2x1010 vg/g de cada vírus AAV por injeção subcutânea no dia pós-natal 3, os tecidos foram colhidos no dia pós-natal 28 e processados para o RNA total. A FIG. 40 mostra níveis relativos de mRNA de GFP normalizados para expressão da proteína de ligação a tata (TBP). O Anc82 auto-complementar
(SC) demonstra aumento da expressão no músculo e no coração quando comparado ao AAV9.
[111] A FIG. 41 mostra a inibição da AIP de transientes de cálcio aberrantes em dois iPSC-CMs adicionais derivados do paciente contendo mutações RYR2 nas regiões 1 e 3 dos pontos ativos (R1 e R3). Os genótipos CPVT-R1 e CPVT-R3 foram S404R e G3946S, respectivamente. A AIP foi eficaz na redução de transientes anormais de cálcio nesses dois genótipos adicionais de CPVT. Número de células individuais, conforme indicado, P < 0,01 pelo Qui-quadrado.
[112] A FIG. 42 mostra a inibição de AIP de liberações aberrantes de cálcio em iPSC-CMs projetadas por Cas9 (CPVTe2) que são isogênicas para a linha WT. A mutação manipulada é o RYR2-D385N, encontrado em pacientes com CPVT. AIP reduziu a frequência de liberação de cálcio de volta a taxas comparáveis às observadas no WT.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[113] A taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (CPVT) é uma arritmia herdada causada predominantemente pela mutação autossômica dominante do gene que codifica o receptor cardíaco de rianodina (RYR2), o principal canal intracelular de liberação de cálcio dos cardiomiócitos. Normalmente, os pacientes com CPVT são assintomáticos em repouso, mas desenvolvem taquicardia ventricular potencialmente letal durante o exercício ou sofrimento emocional (FIG. 35A). Nos cardiomiócitos do tipo selvagem, quando o potencial de ação cardíaca abre o canal Ca2+ do tipo L sensível à tensão localizado na membrana plasmática, o influxo local resultante de Ca2+ desencadeia a liberação de Ca2+ do retículo sarcoplasmático via RYR2 (FIG.
35B). O aumento resultante no Ca2+ citoplasmático leva à contração dos sarcômeros. À medida que a célula entra na diástole, o RYR2 se fecha e o Ca2+ citosólico é bombeado de volta para o retículo sarcoplasmático. Em células portadoras de mutações associadas à CPVT, o RYR2 libera mais no citoplasma, resultando em Ca2+ diastólico elevado que impulsiona a troca de sódio e cálcio através da membrana plasmática por meio do trocador de cálcio e sódio (NCX1), levando a pós-despolarizações que podem desencadear ação adicional potenciais. O mecanismo molecular pelo qual a estimulação da catecolamina desmascara a natureza arrítmica das mutações na CPVT não é conhecido. Os mecanismos pelos quais a mutação RYR2 produz o fenótipo clínico da taquicardia ventricular também são incertos.
[114] Os inventores descobriram que a inibição da ativação de CaMKII e subsequente sinalização a jusante reduz significativamente a arritmia latente estimulada por catecolamina que está associada a mutações no canal de rianodina de cálcio, RYR2. Em experiências in vivo, os inventores mostraram que o inibidor peptídico, AIP, quando expresso in vivo em tecidos cardíacos de camundongos modelo CPVT, inibia a arritmia nos camundongos modelo CPVT. Veja o Exemplo 2, FIGS. 17 e 18. Os inventores também descobriram que a fosforilação mediada por CaMKII do resíduo serina em S2814 em RYR2 é essencial para arrítmica latente estimulada por catecolamina em mutações em CPVT. A mutação da serina em alanina reverte a frequência aberrante de liberação de Ca2+ registrada para células cardíacas com mutações associadas à CPVT na proteína RYR2.
[115] Por conseguinte, a invenção apresenta composições que apresentam inibidores de CAMKII, como um peptídeo AIP, análogo ou fragmento do mesmo, polinucleotídeos que codificam esses peptídeos, composições terapêuticas compreendendo peptídeos e polinucleotídeos AIP e métodos de utilização de tais composições para o tratamento de indivíduos com uma mutação no um canal cardíaco de rianodina (RYR2) que os predispõe à CPVT. Esses inibidores de peptídeo podem ser administrados usando vetores virais adenoassociados (AAV), ou outros vetores, incluindo adenovírus e lentivírus. As composições e métodos também podem ser utilizados para o tratamento de outras formas de doença cardíaca.
[116] Enquanto os cardiomiócitos isolados derivados de iPSC da CPVT (iPSC-CMs) eram propensos a transientes de cálcio aberrantes, estes eram incomuns em tecidos de CPVT não estimulados. No entanto, os tecidos da CPVT estimulados pelas catecolaminas e a estimulação rápida eram vulneráveis à reentrada do potencial de ação, recapitulando a característica dependência do exercício da doença clínica.
Utilizando a edição do genoma Cas9, um único evento de fosforilação dirigido à catecolamina, a fosforilação RYR2- S2814 pela proteína quinase II dependente de Ca2+ calmodulina (CaMKII), foi identificado como necessário para desmascarar a pró-arritmia em folhas de miocárdio de CPVT projetadas.
Esses estudos iluminam a patogênese molecular e celular da CPVT, revelando um papel crítico da reentrada dependente de CaMKII no mecanismo de escala de tecidos dessa doença.
Importante, a invenção fornece um modelo de arritmia in vitro compreendendo iPSC-CMs em um modelo de tecido do miocárdio optogenético manipulado.
[117] Em um aspecto, é aqui fornecida uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um vetor que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[118] Em um aspecto, é aqui fornecida uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um vetor que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII e um carreador farmaceuticamente aceitável para uso no tratamento de arritmia cardíaca, por exemplo, como CPVT.
[119] Em um aspecto, é aqui fornecida uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um vetor que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII e um carreador farmaceuticamente aceitável para uso na fabricação de medicamento para o tratamento de arritmia cardíaca, por exemplo, como CPVT.
[120] Em outro aspecto, é aqui fornecido um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII.
[121] Em um aspecto, é aqui fornecido um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII para uso no tratamento de arritmia cardíaca, por exemplo, como CPVT.
[122] Em um aspecto, é aqui fornecido um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII para uso na fabricação de medicamentos para o tratamento de arritmia cardíaca, por exemplo, como CPVT.
[123] Em outro aspecto, é aqui fornecida uma célula compreendendo um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII.
[124] Em um aspecto, é aqui fornecida uma célula compreendendo um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um inibidor de peptídeo de
CaMKII para uso no tratamento de arritmia cardíaca, por exemplo, como CPVT.
[125] Em um aspecto, é aqui fornecida uma célula compreendendo um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII para uso na fabricação de medicamentos para o tratamento de arritmia cardíaca, por exemplo, como CPVT.
[126] A composição farmacêutica descrita, o vetor de expressão e as células compreendendo um vetor de expressão são todos úteis para o tratamento de arritmia cardíaca em um indivíduo.
[127] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método para modular uma arritmia cardíaca em um indivíduo, o método compreendendo o contato de uma célula compreendendo um canal de rianodina cardíaco (RYR2) com um inibidor de CaMKII, inibidor de peptídeo de CaMKII ou polinucleotídeo que codifica o inibidor de peptídeo de CaMKII.
[128] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método para inibir a fosforilação de um polipeptídeo de canal de rianodina (RYR2) em um indivíduo, o método compreendendo o contato de uma célula compreendendo um canal de rianodina cardíaco (RYR2) com um inibidor de CAMKII, inibidor de peptídeo de CaMKII ou polinucleotídeo que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII.
[129] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método de tratamento de um indivíduo compreendendo uma mutação associada a uma arritmia cardíaca, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um inibidor de CaMKII, inibidor de peptídeo de CaMKII, análogo ou fragmento do mesmo ou polinucleotídeo que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII.
[130] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método de tratamento de um indivíduo com uma arritmia cardíaca, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um vetor que codifica um inibidor de peptídeo de CaMKII e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a arritmia cardíaca é CPVT. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa ou por injeção intracardíaca.
[131] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método para caracterizar um cardiomiócito, o método compreendendo o monitoramento da condução ou contração cardíaca usando um cardiomiócito derivado de célula-tronco induzida por pluripotente (iPSC-CM) que expressa um canal de rianodina cardíaco (RYR2) compreendendo uma mutação associada à CPVT.
[132] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método de triagem de composto, o método compreendendo o contato de um cardiomiócito derivado de célula-tronco pluripotente induzida, expressando um canal cardíaco de rianodina (RYR2) compreendendo uma mutação associada à CPVT com um agente candidato e medindo a condução ou contração cardíaca na célula. Em outras modalidades, o método compreende medir a frequência de liberação de Ca2+ e a reentrada de Ca2+ e outros parâmetros descritos na seção Exemplo.
[133] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos, o inibidor de peptídeo de CaMKII é AIP, CN19, CN19o, CN27, CN21, ou um análogo ou fragmento do mesmo.
[134] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos ou qualquer uma das modalidades anteriores descritas, o inibidor de peptídeo de CaMKII está operacionalmente ligado a um promotor adequado para direcionar a expressão do peptídeo em uma célula cardíaca de mamífero. Os promotores da expressão específica de células musculares cardíacas são conhecidos na técnica, por exemplo, o promotor da troponina cardíaca T, o promotor da cadeia pesada da α-miosina (α-MHC), o promotor da miosina da cadeia leve 2v (MLC-2v) ou o promotor NCX1 cardíaco.
[135] Em uma modalidade de qualquer aspecto do método descrito, a célula contatada é um cardiomiócito.
[136] Em uma modalidade de qualquer aspecto do método descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o cardiomiócito contatado possui uma mutação em um canal cardíaco de rianodina (RYR2) no mesmo.
[137] Em uma modalidade de qualquer aspecto do método descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o cardiomiócito contatado tem mais de uma mutação em um canal RYR2 no mesmo.
[138] Em uma modalidade de qualquer aspecto descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o vetor é utilizado em uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um inibidor de peptídeo de CaMKII, análogo ou fragmento do mesmo.
[139] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos ou de uma modalidade anterior descrita, o vetor é um vetor viral retroviral, adenoviral ou adenoassociado.
[140] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos ou de uma modalidade anterior descrita, a arritmia cardíaca é uma taquicardia ventricular.
[141] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos ou de uma modalidade anterior descrita, a taquicardia ventricular é induzida por exercício ou induzida por estresse.
[142] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos ou de uma modalidade anterior descrita, a taquicardia ventricular é CPVT.
[143] Em uma modalidade de qualquer aspecto descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, a arritmia cardíaca envolve ou está associada a uma mutação genética.
[144] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos ou de uma modalidade descrita anteriormente, a mutação genética associada à arritmia cardíaca é encontrada em um canal RYR2 nos cardiomiócitos.
[145] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos ou de uma modalidade anterior descrita, a mutação genética em RYR2 ocorre na região 1 (resíduos de aminoácidos 77-466), região 2 (resíduos de aminoácidos 2246-2534), região 3 (resíduos de aminoácidos 3778-4201) ou região 4 (resíduos de aminoácidos 4497-4959) do polipeptídeo RYR2.
[146] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos ou de uma modalidade anterior descrita, a mutação genética em RYR2 é uma substituição de aminoácido arginina em isoleucina na posição de aminoácido 4651 na região 4 do polipeptídeo RYR2 (R4651I) (RYR2R4651I).
[147] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos ou de uma modalidade anterior descrita, a mutação genética em RYR2 é uma substituição de aminoácido arginina em glutamina na posição de aminoácido 176 na região 1 do polipeptídeo RYR2 (R176Q) (RYR2 R176Q).
[148] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos ou de uma modalidade anterior descrita, a mutação genética em RYR2 é um ácido aspártico de aminoácido para substituição de asparagina na posição de aminoácido 385 do polipeptídeo RYR2 (D385N) (RYR2D385N).
[149] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos ou de uma modalidade anterior descrita, a mutação genética em RYR2 é uma substituição de aminoácido serina para arginina na posição de aminoácido 404 do polipeptídeo RYR2 (S404R) (RYR2S404R).
[150] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos descritos, a mutação genética em RYR2 é uma substituição de aminoácido glicina em serina na posição de aminoácido 3946 do polipeptídeo RYR2 (G3946S) (RYR2G3946S).
[151] Em uma modalidade de qualquer aspecto do método descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o método inibe uma arritmia cardíaca no indivíduo.
[152] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos do método descrito ou de uma modalidade anterior descrita, o método reduz as incidências de arritmia cardíaca no indivíduo. Por exemplo, a frequência de arritmia cardíaca durante um período de tempo no indivíduo.
[153] Em uma modalidade de qualquer aspecto do método descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o método reduz as incidências de arritmia cardíaca no indivíduo durante a estimulação do exercício ou estresse emocional.
[154] Em uma modalidade de qualquer aspecto do método descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o método inibe a taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (CPVT) no indivíduo.
[155] Em uma modalidade de qualquer aspecto do método descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o método reduz a CPVT no indivíduo.
[156] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos do método de tratamento ou modulação descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o método compreende ainda selecionar um indivíduo com uma arritmia cardíaca ou CPVT.
[157] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos do método de tratamento ou modulação descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o método compreende ainda selecionar um indivíduo com uma mutação associada a uma arritmia cardíaca ou CPVT.
[158] Em uma modalidade de qualquer aspecto do método de tratamento ou modulação descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o método compreende ainda selecionar um indivíduo com uma mutação associada a uma arritmia cardíaca, em que a mutação é encontrada em um canal de rianodina de cálcio (RYR2) nos cardiomiócitos. Em uma modalidade, a mutação genética em RYR2 ocorre na região 1 (resíduos de aminoácidos 77-466), região 2 (resíduos de aminoácidos 2246- 2534), região 3 (resíduos de aminoácidos 3778-4201) ou região 4 (resíduos de aminoácidos 4497-4959) do polipeptídeo RYR2.
Em outra modalidade, a mutação genética é selecionada do grupo que consiste em RYR2R4651I, RYR2 R176Q, RYR2D385N, RYR2S404R e RYR2G3946S.
[159] Em uma modalidade de qualquer aspecto do método de triagem descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o iPSC-CM é derivado de um indivíduo com uma mutação associada a uma arritmia cardíaca. Em outra modalidade, o indivíduo tem mais de uma mutação associada a uma arritmia cardíaca, como RYR2R4651I, RYR2 R176Q, RYR2D385N, RYR2S404R e RYR2G3946S na proteína do canal RYR2.
[160] Em uma modalidade de qualquer aspecto do método de triagem descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o iPSC-CM possui uma ou mais mutações em um canal cardíaco de rianodina (RYR2) no mesmo. Por exemplo, tendo as mutações RYR2R4651I e RYR2 R176Q, as mutações RYR2D385N e RYR2S404R ou as mutações RYR2S404R e RYR2G3946S. Em algumas modalidades, todas as combinações possíveis de múltiplas mutações que ocorrem nos RYR2R4651I, RYR2R176Q, RYR2D385N, RYR2S404R e RYR2G3946S na proteína do canal RYR2 estão incluídas.
[161] Em uma modalidade de qualquer aspecto do método de triagem descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o iPSC-CM tem uma ou mais mutações no RYR2 que ocorrem na região 1 (resíduos de aminoácidos 77-466), região 2 (resíduos de aminoácidos 2246 -2534), região 3 (resíduos de aminoácidos 3778-4201) ou região 4 (resíduos de aminoácidos 4497-4959) do polipeptídeo RYR2.
[162] Em uma modalidade de qualquer um dos aspectos do método de rastreamento descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o iPSC-CM tem uma mutação que resulta em uma substituição de aminoácido arginina em isoleucina na posição de aminoácido 4651 na região 4 do polipeptídeo RYR2 (R4651I) (RYR2R4651I).
[163] Em uma modalidade de qualquer aspecto do método de rastreamento descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o iPSC-CM tem uma mutação que resulta em uma substituição de aminoácido arginina em glutamina na posição de aminoácido 176 na região 1 do polipeptídeo RYR2 (R176Q) (RYR2 R176Q).
[164] Em uma modalidade de qualquer aspecto do método de triagem descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o iPSC-CM tem uma mutação que resulta em uma substituição de ácido aspártico de aminoácido para asparagina na posição de aminoácido 385 do polipeptídeo RYR2 (D385N) (RYR2D385N).
[165] Em uma modalidade de qualquer aspecto do método de rastreamento descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o iPSC-CM tem uma mutação que resulta em uma substituição de aminoácido serina em arginina na posição de aminoácido 404 do polipeptídeo RYR2 (S404R) (RYR2S404R)
[166] Em uma modalidade de qualquer aspecto do método de triagem descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o iPSC-CM tem uma mutação que resulta em uma substituição de aminoácido glicina a serina na posição de aminoácido 3946 do polipeptídeo RYR2 (G3946S) (RYR2G3946S)
[167] Em um aspecto, é aqui fornecido um cardiomiócito derivado de célula-tronco induzida (iPSC-CM) que expressa um canal cardíaco de rianodina (RYR2) compreendendo uma mutação associada à CPVT. Por exemplo, como RYR2R4651I, RYR2 R176Q, RYR2D385N, RYR2S404R e RYR2G3946S.
[168] Em um aspecto, é aqui fornecido um cardiomiócito derivado de célula-tronco induzida por pluripotentes (iPSC- CM) que expressa um canal cardíaco de rianodina (RYR2) compreendendo uma mutação no mesmo.
[169] Em outro aspecto, é aqui fornecida uma composição compreendendo iPSC-CMs expressando um canal cardíaco de rianodina (RYR2) compreendendo uma mutação no mesmo.
[170] Em outro aspecto, é aqui fornecida uma composição compreendendo iPSC-CMs expressando um canal cardíaco de rianodina (RYR2) compreendendo uma mutação associada à CPVT.
Por exemplo, como RYR2R4651I, RYR2 R176Q, RYR2D385N, RYR2S404R e RYR2G3946S.
[171] Em uma modalidade de qualquer aspecto do iPSC-CM descrito ou composição compreendendo o iPSC-CM descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o iPSC-CM tem uma mutação no RYR2 que ocorre na região 1 (resíduos de aminoácidos 77-466), região 2 (resíduos de aminoácidos 2246- 2534), região 3 (resíduos de aminoácidos 3778-4201) ou região 4 (resíduos de aminoácidos 4497-4959) do polipeptídeo RYR2.
[172] Em uma modalidade de qualquer aspecto do iPSC-CM descrito ou composição compreendendo o iPSC-CM descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o iPSC-CM tem mais de uma mutação no canal RYR2.
[173] Em uma modalidade de qualquer aspecto do iPSC-CM descrito ou composição compreendendo o iPSC-CM descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o iPSC-CM tem uma mutação que resulta em uma substituição de aminoácido arginina a isoleucina na posição de aminoácido 4651 na região 4 do polipeptídeo RYR2 (R4651I) (RYR2R4651I).
[174] Em uma modalidade de qualquer aspecto do iPSC-CM descrito ou composição compreendendo o iPSC-CM descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o iPSC-CM tem uma mutação que resulta em uma substituição de aminoácido arginina para glutamina na posição de aminoácido 176 na região 1 do polipeptídeo RYR2 (R176Q) (RYR2 R176Q).
[175] Em uma modalidade de qualquer um aspecto do iPSC- CM descrito ou composição compreendendo o iPSC-CM descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o iPSC-CM tem uma mutação que resulta em um aminoácido ácido aspártico para substituição de asparagina na posição de aminoácido 385 do polipeptídeo RYR2 (D385N) (RYR2D385N).
[176] Em uma modalidade de qualquer aspecto do iPSC-CM descrito ou composição compreendendo o iPSC-CM descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o iPSC-CM tem uma mutação que resulta em uma substituição de aminoácido serina para arginina na posição aminoácido 404 do polipeptídeo RYR2 (S404R) (RYR2S404R).
[177] Em uma modalidade de qualquer um aspecto do iPSC- CM descrito ou composição compreendendo o iPSC-CM descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o iPSC-CM tem uma mutação que resulta em uma substituição de aminoácido glicina para serina na posição de aminoácido 3946 do polipeptídeo RYR2 (G3946S) (RYR2G3946S).
[178] Em uma modalidade de qualquer um aspecto do iPSC- CM descrito ou composição compreendendo o iPSC-CM descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o iPSC-CM tem uma mutação no RYR2 em S2814. Por exemplo, uma mutação S2814A.
[179] Em uma modalidade de qualquer um aspecto do iPSC- CM descrito ou composição compreendendo o iPSC-CM descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o iPSC-CM tem uma mutação no RYR2 em S2808. Por exemplo, uma mutação S2808A.
[180] Em uma modalidade de qualquer aspecto do iPSC-CM descrito ou composição compreendendo o iPSC-CM descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, o iPSC-CM tem uma primeira mutação no RYR2 em S2808 ou S2814 e uma segunda mutação no RYR2 que ocorre na região 1 (resíduos de aminoácidos 77-466), região 2 (resíduos de aminoácidos 2246- 2534), região 3 (resíduos de aminoácidos 3778-4201) ou região 4 (resíduos de aminoácidos 4497-4959) do polipeptídeo RYR2.
Por exemplo, uma primeira mutação no RYR2 em S2808 ou S2814 e uma segunda mutação em R4651 ou R176.
[181] Em uma modalidade de qualquer aspecto da iPSC-CM descrito ou composição compreendendo a iPSC-CM descrita ou qualquer modalidade anterior descrita, a mutação é uma substituição de aminoácidos. Por exemplo, uma substituição de serina por alanina, ou uma substituição de arginina por glutamina, ou uma substituição de arginina por isoleucina.
[182] Em uma modalidade de qualquer aspecto da composição compreendendo o iPSC-CM descrito ou qualquer modalidade anterior descrita, a composição compreende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.
Taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (CPVT)
[183] A taquicardia ventricular polimórfica, polimórfica catecolaminérgica (CPVT) é uma arritmia herdada causada predominantemente por mutação autossômica dominante do gene que codifica o receptor cardíaco 2 de rianodina (RYR2), o principal canal intracelular de liberação de cálcio dos cardiomiócitos. Geralmente, os pacientes com CPVT são assintomáticos em repouso, mas desenvolvem taquicardia ventricular potencialmente letal durante o exercício ou sofrimento emocional. O potencial de ação cardíaca abre o canal Ca2+ do tipo L sensível à tensão localizado na membrana plasmática. O influxo local resultante de Ca2+ abre o RYR2,
posicionado no retículo sarcoplasmático, liberando Ca2+ no citosol, onde desencadeia a contração do sarcômero. Quando o potencial de ação cardíaca termina e a célula entra na diástole, o RYR2 se fecha e o Ca2+ citosólico é bombeado de volta para o retículo sarcoplasmático pelo retículo sarcoplasmático Ca2+ -ATPase.
[184] As mutações na CPVT aumentam a liberação diastólica de Ca2+ do retículo sarcoplasmático no citoplasma pelo RYR2. Nos cardiomiócitos individuais, o Ca2+ diastólico elevado induz a troca reversa de sódio e cálcio através do NCX1 na membrana plasmática, resultando em pós- despolarizações que potencialmente podem desencadear potenciais de ação adicionais. O mecanismo molecular pelo qual a estimulação com catecol desmascara a natureza arrítmica das mutações na CPVT não é conhecido, embora a ativação induzida por catecol da proteína cinase II dependente de Ca2+ com calmodulina (CaMKII) esteja implicada.
Os mecanismos pelos quais a mutação RYR2 produz o fenótipo clínico de taquicardia ventricular também são incertos, embora uma teoria seja que a atividade desencadeada por cardiomiócitos produz taquicardia ventricular.
[185] O advento da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) e métodos eficientes para diferenciar iPSCs de cardiomiócitos (iPSC-CMs) criaram oportunidades empolgantes para o estudo de arritmias herdadas. Os iPSC-CMs foram gerados a partir de pacientes com CPVT, bem como outras arritmias hereditárias, e demonstraram capturar os principais recursos dessas doenças, incluindo duração potencial anormal da ação e respostas a medicamentos. No entanto, os estudos atuais limitaram-se a células isoladas ou agrupamentos de células, deixando uma grande lacuna na modelagem de arritmias clínicas, que são as propriedades emergentes das células reunidas no tecido do miocárdio.
AIP e Análogos
[186] Também estão incluídos na invenção os vetores virais adenovirais ou adenoassociados que codificam polipeptídeos AIP ou seus fragmentos que são modificados de maneira a melhorar ou não inibir sua capacidade de modular o ritmo cardíaco. Em uma modalidade, a invenção fornece métodos para otimizar uma sequência de aminoácidos AIP ou sequência de ácidos nucleicos, produzindo uma alteração.
Tais alterações podem incluir determinadas mutações, exclusões, inserções, modificações pós-traducionais e replicação em tandem. Em uma modalidade preferida, a sequência de aminoácidos AIP é modificada para aumentar a resistência à protease, particularmente a resistência à metaloprotease. Por conseguinte, a invenção inclui ainda análogos de qualquer polipeptídeo de ocorrência natural da invenção. Os análogos podem diferir do polipeptídeo de ocorrência natural da invenção por diferenças na sequência de aminoácidos, por modificações pós-traducionais ou por ambas.
Os análogos da invenção geralmente exibem pelo menos
85%, mais preferencialmente 90% e mais preferencialmente 95%
ou mesmo 99% de identidade com todo ou parte de uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural da invenção.
A comparação da duração da sequência é de pelo menos 10, 13,
15 resíduos de aminoácidos.
Novamente, em uma abordagem exemplar para determinar o grau de identidade, um programa
BLAST pode ser usado, com uma pontuação de probabilidade entre e-3 e e-100 indicando uma sequência intimamente relacionada.
As modificações incluem derivatização química in vivo e in vitro de polipeptídeos, por exemplo, acetilação,
carboxilação, fosforilação ou glicosilação; tais modificações podem ocorrer durante a síntese ou processamento do polipeptídeo ou após o tratamento com enzimas modificadoras isoladas.
Os análogos também podem diferir dos polipeptídeos de ocorrência natural da invenção por alterações na sequência primária.
Isso inclui variantes genéticas, naturais e induzidas (por exemplo, resultantes de mutagênese aleatória por irradiação ou exposição a sulfato de etanometil ou por mutagênese específica do local, conforme descrito em Sambrook, Fritsch e Maniatis, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual (2d ed.), CSH Press, 1989, ou Ausubel et al., Supra). Também estão incluídos peptídeos, moléculas e análogos ciclizados que contêm resíduos que não sejam aminoácidos L, por exemplo, aminoácidos D ou aminoácidos sintéticos ou de ocorrência não natural, por exemplo, aminoácidos betas ou gama.
[187] Além dos polipeptídeos completos, a invenção também inclui fragmentos de qualquer um dos polipeptídeos da invenção. Como aqui utilizado, o termo "um fragmento" significa pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 aminoácidos de comprimento. Fragmentos da invenção podem ser gerados por métodos conhecidos dos especialistas na técnica ou podem resultar do processamento normal de proteínas (por exemplo, remoção de aminoácidos do polipeptídeo nascente que não são necessários para a atividade biológica ou remoção de aminoácidos por splicing alternativo de mRNA ou eventos alternativos de processamento de proteínas).
[188] Os análogos de AIP não proteicos com uma estrutura química projetada para imitar a atividade funcional de AIP (por exemplo, atividade reguladora cardíaca) podem ser administrados de acordo com os métodos da invenção. Os análogos da AIP podem exceder a atividade fisiológica da AIP nativa. Os métodos de design analógico são bem conhecidos na técnica, e a síntese de análogos pode ser realizada de acordo com esses métodos, modificando as estruturas químicas de modo que os análogos resultantes exibam a atividade imunomoduladora de um AIP nativo. Essas modificações químicas incluem, entre outras, a substituição de grupos R alternativos e a variação do grau de saturação em átomos de carbono específicos da AIP nativa. De preferência, os análogos de AIP são relativamente resistentes à degradação in vivo, resultando em um efeito terapêutico mais prolongado na administração. Os ensaios para medir a atividade funcional incluem, mas não estão limitados aos descritos nos Exemplos abaixo.
[189] Esta invenção também contempla métodos para aumentar a especificidade e potência da inibição de CaMKII à sua ação no RYR2. Por exemplo, o peptídeo inibidor pode ser localizado em RYR2 por expressão de um módulo de ligação à proteína de fusão e de ligação a RYR2 e uma sequência inibidora de CaMKII. O módulo de ligação RYR2 pode consistir em FKBP12.6 ou um derivado de FKBP12.6.
Terapia com polinucleotídeos
[190] A terapia polinucleotídica caracterizando um polinucleotídeo que codifica um peptídeo AIP, análogo, variante ou fragmento do mesmo é outra abordagem terapêutica para o tratamento de uma arritmia cardíaca (por exemplo, CPVT). Espera-se que a expressão de tais proteínas em uma célula cardíaca module a função da célula, tecido ou órgão cardíaco, por exemplo, inibindo a fosforilação de RYR2, inibindo a atividade de CAMKII ou regulando o ritmo cardíaco.
Tais moléculas de ácido nucleico podem ser entregues às células de um indivíduo com arritmia cardíaca. As moléculas de ácido nucleico devem ser entregues às células de um indivíduo de uma forma na qual elas possam ser absorvidas, de modo que possam ser produzidos níveis terapeuticamente eficazes de um peptídeo AIP ou fragmento do mesmo.
[191] Transduzir vetores virais (por exemplo, retrovirais, adenovirais e virais adenoassociados) pode ser usado para terapia genética de células somáticas, especialmente devido à sua alta eficiência de infecção e integração e expressão estáveis (ver, por exemplo, Cayouette et al., Human Gene Therapy 8: 423-430, 1997; Kido et al., Current Eye Research 15: 833-844, 1996; Bloomer et al., Journal of Virology 71: 6641-6649, 1997; Naldini et al., Science 272: 263 -267, 1996; e Miyoshi et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94: 10319, 1997). Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um peptídeo AIP, variante ou um fragmento do mesmo, pode ser clonado em um vetor retroviral e a expressão pode ser direcionada de seu promotor endógeno, da repetição terminal longa retroviral ou de um promotor específico para uma célula alvo tipo de interesse. Outros vetores virais que podem ser usados incluem, por exemplo, um vírus vaccinia, um vírus do papiloma bovino ou um vírus do herpes, como o vírus Epstein-Barr (veja também, por exemplo, os vetores de Miller, Human Gene Therapy 15-14 , 1990; Friedman, Science 244: 1275-1281, 1989; Eglitis et al.,
BioTechniques 6: 608-614, 1988; Tolstoshev et al., Current Opinion in Biotechnology 1: 55-61, 1990; Sharp, The Lancet 337 : 1277-1278, 1991; Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36: 311-322, 1987; Anderson, Science 226: 401-409, 1984; Moen, Blood Cells 17: 407-416, 1991; Miller et al., Biotechnology 7: 980-990, 1989; Le Gal La Salle et al., Science 259: 988-990, 1993; e Johnson, Chest 107: 77S-83S, 1995). Os vetores retrovirais são particularmente bem desenvolvidos e têm sido utilizados em contextos clínicos (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med 323: 370, 1990; Anderson et al., Patente U.S. No. 5.399.346). Em uma modalidade, um vetor viral é usado para administrar um polinucleotídeo que codifica um peptídeo AIP a um tecido cardíaco.
[192] Os vetores virais transdutores têm tropismos teciduais que permitem a transdução seletiva de um tipo de célula em comparação com outro. Por exemplo, embora a inibição da CAMKII nos cardiomiócitos seja terapêutica para a CPVT ou outras formas de doenças cardíacas, sua inibição em outros tecidos, como o cérebro, pode não ser desejável.
Em algumas modalidades, são utilizados vetores que têm como alvo cardiomiócitos com alta especificidade em comparação com outros tipos de células. Isto permitiria um direcionamento cardíaco específico da expressão da molécula peptídica inibidora de CAMKII. Isso ocorre porque a inibição da CAMKII em outras células não cardíacas pode ser prejudicial. Entre os possíveis candidatos a vírus adenoassociados estão o AAV9, AAV6, AAV2i8, Anc80 e Anc82.
A eficiência da transdução do vírus adenoassociado é aprimorada quando o genoma é "auto complementar". Em algumas modalidades, o vírus adenoassociado auto complementar é usado para aumentar a transdução cardíaca pelo vetor de terapia genética.
[193] Abordagens não virais também podem ser empregadas para a introdução de terapêutica em uma célula cardíaca de um paciente que requer inibição da CPVT. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em uma célula administrando o ácido nucleico na presença de lipofecção (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413, 1987; Ono et al., Neuroscience Letters 17: 259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298: 278, 1989; Staubinger et al., Methods in Enzymology 101: 512, 1983), conjugação asialoorossomucóide-polilisina (Wu et al. , Journal of Biological Chemistry 263: 14621, 1988; Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264: 16985, 1989) ou por micro-injeção sob condições cirúrgicas (Wolff et al., Science 247: 1465, 1990). Preferencialmente, os ácidos nucleicos são administrados em combinação com um lipossoma e protamina.
[194] A transferência de genes também pode ser realizada usando meios não virais envolvendo transfecção in vitro.
Tais métodos incluem o uso de fosfato de cálcio, DEAE dextrano, eletroporação e fusão de protoplastos. Os lipossomas também podem ser potencialmente benéficos para a entrega de DNA em uma célula. O transplante de genes normais nos tecidos afetados de um paciente também pode ser realizado transferindo um ácido nucleico normal para um tipo de célula cultivável ex vivo (por exemplo, uma célula primária autóloga ou heteróloga ou sua progênie), após o qual a célula (ou seus descendentes)) são injetados em um tecido alvo.
[195] A expressão de cDNA para uso em métodos de terapia com polinucleotídeos pode ser direcionada a partir de qualquer promotor adequado (por exemplo, citomegalovírus humano (CMV), vírus símio 40 (SV40), promotor híbrido de b- actina CMV-galinha ("CAG") ou promotores de metalotioneína e regulado por qualquer elemento regulador de mamífero apropriado. Para o tratamento da CPVT, é desejável expressar seletivamente o inibidor da CAMKII em cardiomiócitos e minimizar a expressão em outros tipos de células. Em algumas modalidades, promotores seletivos de cardiomiócitos são usados para a expressão do Peptídeo inibidor da CAMKII. Os promotores ou intensificadores usados podem incluir, sem limitação, aqueles que são caracterizados como intensificadores específicos de tecidos ou células. Por exemplo, o promotor da troponina cardíaca T, o promotor da cadeia pesada da α-miosina (α-MHC), o promotor da cadeia leve-2v da miosina (MLC-2v) ou o promotor NCX1 cardíaco podem ser usados para direcionar a expressão em cardiomiócitos. Em alternativa, se um clone genômico for usado como construto terapêutico, pode ser mediada pelas sequências reguladoras cognatas ou, se desejado, pelas sequências reguladoras derivadas de uma fonte heteróloga, incluindo qualquer um dos promotores ou elementos reguladores descritos acima.
[196] Outra abordagem terapêutica incluída na invenção envolve a administração de um inibidor terapêutico de CaMKII recombinante, como um peptídeo recombinante de AIP, variante ou fragmento do mesmo, diretamente no local de um tecido potencial ou real afetado pela doença ou sistemicamente (por exemplo, por qualquer técnica de administração de proteína recombinante convencional). A dosagem do peptídeo administrado depende de vários fatores, incluindo o tamanho e a saúde de cada paciente. Para qualquer assunto em particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições.
Ensaios de triagem
[197] A invenção fornece métodos para modificar um ritmo cardíaco através da administração de um inibidor de CAMKII, AIP ou um análogo do mesmo, ou um polinucleotídeo que codifica AIP. Enquanto os Exemplos aqui descritos discutem especificamente o uso de um vetor AAV que codifica um peptídeo AIP, um especialista na técnica entende que os métodos da invenção não são tão limitados. Virtualmente qualquer agente que iniba a fosforilação de um canal cardíaco de rianodina (RYR2) por CAMKII pode ser empregado nos métodos da invenção. Inibidores de CAMKII exemplares são conhecidos na técnica e aqui descritos.
[198] Os métodos da invenção são úteis para a triagem de baixo custo e alto rendimento de agentes candidatos que inibem a CPVT ou que regulam vantajosamente um ritmo cardíaco. Tais agentes podem ser identificados usando, por exemplo, cardiomiócitos humanos derivados de iPSC que expressam atuadores ou sensores optogenéticos. Um agente candidato que inibe especificamente a CPVT, inibe a fosforilação de CaMKII do RYR2 é então isolado e testado quanto à atividade em um ensaio in vitro ou in vivo quanto à sua capacidade de inibir a CPVT, modular de forma desejável um ritmo cardíaco ou outra função cardíaca. Um especialista na técnica entende que os efeitos de um agente candidato em uma célula, tecido ou órgão são tipicamente comparados com uma célula, tecido ou órgão de controle correspondente não contatado com o agente candidato. Assim, os métodos de triagem incluem a comparação das propriedades da célula contatada com as propriedades de uma célula de controle não tratada.
[199] Agentes que imitam os efeitos da AIP, isto é, agentes que inibem a CPVT, inibem a fosforilação de RYR2 por CaMKII ou que regulam um ritmo cardíaco, podem ser utilizados, por exemplo, como terapêutica para regular um ritmo cardíaco. Cada uma das sequências polinucleotídicas aqui fornecidas também pode ser usada na descoberta e desenvolvimento de tais compostos terapêuticos. Os peptídeos AIP codificados e seus análogos, após expressão, podem ser utilizados para impedir a CPVT em um indivíduo.
Compostos e extratos de teste
[200] Em geral, inibidores de CaMKII, análogos de peptídeos AIP e miméticos são identificados a partir de grandes bibliotecas de produtos naturais ou extratos sintéticos (ou semissintéticos) ou bibliotecas químicas ou de bibliotecas de polipeptídeos ou ácidos nucleicos, de acordo com métodos conhecidos na técnica. Os especialistas na área de descoberta e desenvolvimento de drogas compreenderão que a fonte precisa de extratos ou compostos de teste não é crítica para o (s) procedimento (s) de triagem da invenção. Os agentes utilizados nas triagens podem incluir aqueles conhecidos como terapêuticos para o tratamento de arritmias cardíacas. Alternativamente, praticamente qualquer número de extratos ou compostos químicos desconhecidos pode ser rastreado usando os métodos aqui descritos. Exemplos de tais extratos ou compostos incluem, entre outros, extratos de origem vegetal, fúngica, procariótica ou animal, caldos de fermentação e compostos sintéticos, bem como a modificação dos polipeptídeos existentes.
[201] Bibliotecas de polipeptídeos naturais na forma de extratos bacterianos, fúngicos, vegetais e animais estão disponíveis comercialmente em várias fontes, incluindo Biotics (Sussex, Reino Unido), Xenova (Slough, Reino Unido), Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce, Fla.) E PharmaMar, EUA (Cambridge, Massachusetts). Tais polipeptídeos podem ser modificados para incluir um domínio de transdução de proteínas usando métodos conhecidos na técnica e aqui descritos. Além disso, as bibliotecas naturais e produzidas sinteticamente são produzidas, se desejado, de acordo com métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por métodos padrão de extração e fracionamento. Exemplos de métodos para a síntese de bibliotecas moleculares podem ser encontrados na técnica, por exemplo em: DeWitt et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S. 90: 6909, 1993; Erb et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 91: 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med.
Chem. 37: 2678, 1994; Cho et al., Science 261: 1303, 1993; Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061, 1994; e Gallop et al., J. Med. Chem. 37: 1233, 1994. Além disso, se desejado, qualquer biblioteca ou composto é facilmente modificada usando métodos químicos, físicos ou bioquímicos padrão.
[202] Também estão disponíveis vários métodos para gerar síntese aleatória ou direcionada (por exemplo, semi síntese ou síntese total) de qualquer número de polipeptídeos, compostos químicos, incluindo, entre outros compostos à base de sacarídeo, lipídeo, peptídeo e ácidos nucleicos. As bibliotecas de compostos sintéticos estão comercialmente disponíveis na Brandon Associates (Merrimack, N.H.) e Aldrich Chemical (Milwaukee, Wis.). Alternativamente, os compostos químicos a serem utilizados como compostos candidatos podem ser sintetizados a partir de materiais de partida prontamente disponíveis usando técnicas e metodologias sintéticas padrão conhecidas pelos especialistas na técnica. As transformações químicas sintéticas e as metodologias de grupos de proteção (proteção e desproteção) úteis na síntese dos compostos identificados pelos métodos aqui descritos são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, aquelas descritas em R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T. W. Greene e P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2ª ed., John Wiley e Sons (1991); L.
Fieser e M. Fieser, Reagentes de Fieser e Fieser para Síntese Orgânica, John Wiley e Sons (1994); e L. Paquette, ed.,
Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley e Sons (1995), e suas edições subsequentes.
[203] Bibliotecas de compostos podem ser apresentadas em solução (por exemplo, Houghten, Biotechniques 13: 412-421, 1992) ou em contas (Lam, Nature 354: 82-84, 1991), chips (Fodor, Nature 364: 555-556, 1993), bactérias (Ladner, Patente US N° 5.223.409), esporos (Patente US Ladner N°
5.223.409), plasmídeos (Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865-1869, 1992) ou em fagos (Scott e Smith, Science 249: 386-390, 1990; Devlin, Science 249: 404-406, 1990; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378-6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222: 301-310, 1991; Ladner supra.).
[204] Além disso, os técnicos no assunto de descoberta e desenvolvimento de medicamentos compreendem prontamente que os métodos de desreplicação (por exemplo, desreplicação taxonômica, desreplicação biológica e desreplicação química ou qualquer combinação dos mesmos) ou a eliminação de repetições ou repetições de materiais já conhecidos por sua atividade deve ser empregada sempre que possível.
[205] Quando um extrato bruto apresenta atividade reguladora do ritmo cardíaco ou atividade inibidora de CAMKII, é necessário mais fracionamento do extrato positivo de chumbo para isolar os constituintes moleculares responsáveis pelo efeito observado. Assim, o objetivo do processo de extração, fracionamento e purificação é a cuidadosa caracterização e identificação de uma entidade química no extrato bruto com a atividade desejada. Os métodos de fracionamento e purificação de tais extratos heterogêneos são conhecidos na técnica. Se desejado, os compostos que demonstram ser úteis como terapêuticos são quimicamente modificados de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Métodos terapêuticos
[206] Os agentes identificados como inibidor de CaMKII, com atividade mimética de AIP (por exemplo, atividade inibidora de CaMKII, atividade reguladora do ritmo cardíaco) e/ou polinucleotídeos que codificam um análogo AIP ou AIP, são úteis para prevenir ou melhorar a CPVT ou outra arritmia cardíaca. As doenças e distúrbios caracterizados por arritmia cardíaca podem ser tratados usando os métodos e composições da invenção.
[207] Em uma abordagem terapêutica, um agente identificado como aqui descrito é administrado no local de um tecido afetado por doença potencial ou real ou é administrado sistemicamente. A dosagem do agente administrado depende de vários fatores, incluindo o tamanho e a saúde de cada paciente. Para qualquer assunto em particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições.
Terapêutica Farmacêutica
[208] A invenção fornece um meio simples para identificar composições (incluindo polinucleotídeos, peptídeos, inibidores de pequenas moléculas e miméticos de AIP) possuindo atividade inibidora de CaMKII e/ou atividade reguladora do ritmo cardíaco. Por conseguinte, uma entidade química descoberta como tendo valor medicinal utilizando os métodos aqui descritos é útil como um medicamento ou como informação para modificação estrutural de compostos existentes, por exemplo, por projeto racional de medicamento. Tais métodos são úteis para agentes de triagem que afetam uma variedade de condições caracterizadas por uma arritmia cardíaca.
[209] Para usos terapêuticos, as composições ou agentes identificados usando os métodos aqui divulgados podem ser administrados sistemicamente, por exemplo, formulados em um tampão farmaceuticamente aceitável, como solução salina fisiológica. As vias de administração preferidas incluem, por exemplo, injeções subcutâneas, intravenosas, interperitoneais, intramusculares ou intradérmicas que fornecem níveis contínuos e sustentados do fármaco no paciente. Para terapia genética com AAV, a administração pode ser intravenosa ou intracoronária. O tratamento de pacientes humanos ou outros animais será realizado utilizando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um terapêutico aqui identificado em um carreador fisiologicamente aceitável. Os carreadores adequados e a sua formulação são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin. A quantidade do agente terapêutico a ser administrado varia dependendo da maneira de administração, idade e peso corporal do paciente e com os sintomas clínicos da arritmia cardíaca. Geralmente, as quantidades estarão na faixa daquelas usadas para outros agentes usados no tratamento de outras doenças que requerem regulação da função cardíaca, embora em certos casos sejam necessárias quantidades mais baixas devido à maior especificidade do composto. Um composto é administrado em uma dosagem com atividade inibidora de CAMKII ou atividade reguladora do ritmo cardíaco, conforme determinado por um método conhecido por um especialista na técnica, ou usando qualquer um dos ensaios que mede a expressão ou a atividade biológica de um polipeptídeo de CAMKII.
Formulação de composições farmacêuticas
[210] A administração de um composto para o tratamento de arritmia cardíaca pode ser por qualquer meio adequado que resulte em uma concentração da terapêutica que, combinada com outros componentes, seja eficaz para melhorar, reduzir ou estabilizar uma arritmia cardíaca. O composto pode estar contido em qualquer quantidade apropriada em qualquer substância carreadora adequada e está geralmente presente em uma quantidade de 1-95% em peso do peso total da composição.
A composição pode ser fornecida em uma forma de dosagem que é adequada para a via de administração parentérica (por exemplo, subcutânea, intravenosa, intramuscular ou intraperitoneal). As composições farmacêuticas podem ser formuladas de acordo com a prática farmacêutica convencional (ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20ª ed.), Ed. AR Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 e Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. Swarbrick e JC Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nova Iorque).
[211] As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser formuladas para liberar o composto ativo substancialmente imediatamente após a administração ou em qualquer tempo ou período de tempo pré-determinado após a administração. Os últimos tipos de composições são geralmente conhecidos como formulações de liberação controlada, que incluem (i) formulações que criam uma concentração substancialmente constante do fármaco no corpo durante um período prolongado de tempo; (ii) formulações que após um tempo de atraso predeterminado criam uma concentração substancialmente constante do fármaco no corpo durante um período prolongado de tempo; (iii) formulações que sustentam a ação durante um período de tempo predeterminado, mantendo um nível relativamente, constante e eficaz no corpo, com minimização concomitante de efeitos colaterais indesejáveis associados a flutuações no nível plasmático da substância ativa (padrão cinético dente de serra); (iv) formulações que localizam a ação por, por exemplo, colocação espacial de uma composição de liberação controlada adjacente ou em contato com o timo; (v) formulações que permitem dosagem conveniente, de modo que as doses sejam administradas, por exemplo, uma vez a cada uma ou duas semanas; e (vi) formulações que têm como alvo uma arritmia cardíaca usando carreadores ou derivados químicos para entregar o agente terapêutico a um tipo de célula específico (por exemplo, célula cardíaca).
Para algumas aplicações, as formulações de liberação controlada evitam a necessidade de dosagem frequente durante o dia para manter o nível plasmático no nível terapêutico.
[212] Qualquer uma de várias estratégias pode ser seguida, a fim de obter liberação controlada, na qual a taxa de liberação supera a taxa de metabolismo do composto em questão. Em um exemplo, a liberação controlada é obtida por seleção apropriada de vários parâmetros e ingredientes da formulação, incluindo, por exemplo, vários tipos de composições e revestimentos de liberação controlada. Assim, o terapêutico é formulado com excipientes apropriados para uma composição farmacêutica que, após administração, libera o terapêutico de maneira controlada. Os exemplos incluem composições de comprimido ou cápsula de unidade única ou múltipla, soluções oleosas, suspensões, emulsões, microcápsulas, microesferas, complexos moleculares, nanopartículas, adesivos e lipossomas.
Composições Parenterais
[213] A composição farmacêutica pode ser administrada parentericamente por injeção, infusão ou implantação (subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intracoronária ou semelhante) em formas de dosagem, formulações ou via dispositivos ou implantes de entrega adequados contendo carreadores convencionais e não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis e adjuvantes. A formulação e preparação de tais composições são bem conhecidas dos especialistas na técnica de formulação farmacêutica. As formulações podem ser encontradas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, supra.
[214] As composições para uso parenteral podem ser fornecidas em formas de dosagem unitárias (por exemplo, em ampolas de dose única) ou em frascos contendo várias doses e nas quais um conservante adequado pode ser adicionado (ver abaixo). A composição pode estar na forma de uma solução, uma suspensão, uma emulsão, um dispositivo de infusão ou um dispositivo de entrega para implantação, ou pode ser apresentado como um pó seco para ser reconstituído com água ou outro carreador adequado antes do uso. Além do agente ativo que reduz ou melhora uma arritmia cardíaca, a composição pode incluir carreadores e/ou excipientes parentericamente aceitáveis adequados. O (s) agente (s) terapêutico (s) pode (m) ser incorporado (s) em microesferas, microcápsulas, nanopartículas, lipossomas ou similares para liberação controlada. Além disso, a composição pode incluir agentes de suspensão, solubilização, estabilização, ajuste de pH, agentes de ajuste de tonicidade e/ou agentes de dispersão.
[215] Como indicado acima, as composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem estar na forma adequada para injeção estéril. Para preparar essa composição, os terapêuticos adequados são dissolvidos ou suspensos em um carreador líquido parentericamente aceitável. Entre os carreadores e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão água, água ajustada a um pH adequado pela adição de uma quantidade adequada de ácido clorídrico, hidróxido de sódio ou um tampão adequado, 1,3-butanodiol, solução de Ringer e solução isotônica de cloreto de sódio e solução de dextrose. A formulação aquosa também pode conter um ou mais conservantes (por exemplo, p-hidroxibenzoato de metil, etil ou n-propil). Nos casos em que um dos compostos é apenas moderadamente ou ligeiramente solúvel em água, pode ser adicionado um agente de melhoria ou solubilização da dissolução, ou o solvente pode incluir 10-60% p/p de propilenoglicol ou semelhante.
Composições parenterais de liberação controlada
[216] As composições parenterais de liberação controlada podem estar na forma de suspensões aquosas, microesferas, microcápsulas, microesferas magnéticas, soluções oleosas, suspensões oleosas ou emulsões. Alternativamente, o fármaco ativo pode ser incorporado em carreadores, lipossomas, nanopartículas, implantes ou dispositivos de infusão biocompatíveis.
[217] Os materiais a serem utilizados na preparação de microesferas e/ou microcápsulas são, por exemplo, polímeros biodegradáveis/bioerodíveis, como poligalactina, poli (isobutil cianoacrilato), poli (2-hidroxietil-L-glutamina nove) e poli (ácido lático). Os carreadores biocompatíveis que podem ser utilizados na formulação de uma formulação parentérica de liberação controlada são carboidratos (por exemplo, dextranos), proteínas (por exemplo, albumina), lipoproteínas ou anticorpos. Os materiais para uso em implantes podem ser não biodegradáveis (por exemplo, polidimetilsiloxano) ou biodegradáveis (por exemplo, poli (caprolactona), poli (ácido láctico), poli (ácido glicólico) ou poli (ésteres ortopédicos) ou combinações dos mesmos).
Formas de dosagem sólidas para uso oral
[218] As formulações para uso oral incluem comprimidos contendo o (s) ingrediente (s) ativo (s) em uma mistura com excipientes farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos. Tais formulações são conhecidas do especialista na técnica. Os excipientes podem ser, por exemplo, diluentes ou enchimentos inertes (por exemplo, sacarose, sorbitol, açúcar, manitol, celulose microcristalina, amidos incluindo amido de batata, carbonato de cálcio, cloreto de sódio, lactose, fosfato de cálcio, sulfato de cálcio ou fosfato de sódio); agentes de granulação e desintegração (por exemplo, derivados de celulose incluindo celulose microcristalina, amidos incluindo amido de batata, croscarmelose sódica, alginatos ou ácido algínico); agentes de ligação (por exemplo, sacarose, glicose, sorbitol, acácia, ácido algínico, alginato de sódio, gelatina, amido, amido pré-gelatinizado, celulose microcristalina, silicato de alumínio e magnésio, carboximetilcelulose sódica, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, etilcelulose, polivinilpirrolidolona); e agentes lubrificantes, deslizantes e anti-adesivos (por exemplo, estearato de magnésio, estearato de zinco, ácido esteárico, sílicas, óleos vegetais hidrogenados ou talco). Outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem ser corantes, agentes aromatizantes, plastificantes, umectantes, agentes tamponantes e similares.
[219] Os comprimidos podem não ser revestidos ou podem ser revestidos por técnicas conhecidas, opcionalmente para atrasar a desintegração e absorção no trato gastrointestinal e, assim, proporcionando uma ação sustentada por um período mais longo. O revestimento pode ser adaptado para liberar o medicamento ativo em um padrão predeterminado (por exemplo, para obter uma formulação de liberação controlada) ou pode ser adaptado para não liberar o medicamento ativo até após a passagem do estômago (revestimento entérico). O revestimento pode ser um revestimento de açúcar, um revestimento de filme (por exemplo, à base de hidroxipropilmetilcelulose, metilcelulose, metil hidroxietilcelulose, hidroxipropilcelulose, carboximetilcelulose, copolímeros de acrilato, polietileno glicóis e/ou polivinilpirrolidona) ou um revestimento entérico (por exemplo, à base de ácido metacrílico copolímero, ftalato de acetato de celulose, ftalato de hidroxipropilmetilcelulose, succinato de acetato de hidroxipropilmetilcelulose, ftalato de acetato de polivinil, goma-laca e/ou etilcelulose). Além disso, um material de atraso de tempo, tal como, por exemplo, monoestearato de gliceril ou distearato de gliceril pode ser empregado.
[220] As composições sólidas para comprimidos podem incluir um revestimento adaptado para proteger a composição contra alterações químicas indesejadas (por exemplo, degradação química antes da liberação do ativo da substância terapêutica ativa cardíaca). O revestimento pode ser aplicado na forma de dosagem sólida de uma maneira semelhante à descrita em Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, supra.
[221] Em uma modalidade, duas ou mais terapêuticas cardíacas podem ser misturadas no comprimido ou podem ser particionadas. Em um exemplo, a primeira terapêutica cardíaca ativa está contida no interior do comprimido e a segunda terapêutica ativa está do lado de fora, de modo que uma porção substancial da segunda terapêutica seja liberada antes da liberação da primeira terapêutica ativa.
[222] As formulações para uso oral também podem ser apresentadas como comprimidos mastigáveis ou como cápsulas de gelatina dura, em que o ingrediente ativo é misturado com um diluente sólido inerte (por exemplo, amido de batata, lactose, celulose microcristalina, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulino) ou como cápsulas de gelatina mole em que o ingrediente ativo é misturado com água ou um meio oleoso, por exemplo, óleo de amendoim, parafina líquida ou azeite. Os pós e granulados podem ser preparados utilizando os ingredientes mencionados acima sob comprimidos e cápsulas de uma maneira convencional usando, por exemplo, um misturador, um aparelho de leito fluidizado ou um equipamento de secagem por pulverização.
Formas de dosagem oral de liberação controlada
[223] As composições de liberação controlada para uso oral podem, por exemplo, ser construídas para liberar a terapêutica cardíaca ativa, controlando a dissolução e/ou a difusão da substância ativa. A liberação controlada por dissolução ou difusão pode ser conseguida através do revestimento apropriado de uma formulação de compostos para comprimidos, cápsulas, pellets ou granulados, ou incorporando o composto em uma matriz apropriada. Um revestimento de liberação controlada pode incluir uma ou mais das substâncias de revestimento mencionadas acima e/ou, por exemplo, goma-laca, cera de abelha, cera de glicose, mamona, cera de carnaúba, álcool estearílico, monoestearato de gliceril, distearato de gliceril, palmitostearato de glicerol, etilcelulose, resinas acrílicas, ácido dl- polilático, butirato de acetato de celulose, cloreto de polivinil, acetato de polivinil, vinil pirrolidona, polietileno, polimetacrilato, metilmetacrilato, 2- hidroximetacrilato, hidrogéis de metacrilato, 1,3 butileno glicol, metacrilato de etileno glicol e/ou polietileno glicóis. Em uma formulação de matriz de liberação controlada, o material da matriz também pode incluir, por exemplo, metilcelulose hidratada, cera de carnaúba e álcool estearílico, carbopol 934, silicone, triestearato de gliceril, acrilato de metila-metacrilato de metila, cloreto de polivinila, polietileno e/ou fluorocarboneto halogenado.
[224] Uma composição de liberação controlada contendo um ou mais compostos terapêuticos também pode estar na forma de um comprimido ou cápsula flutuante (isto é, um comprimido ou cápsula que, após administração oral, flutua sobre o conteúdo gástrico por um certo período de tempo). Uma formulação de comprimido flutuante do (s) composto (s) pode ser preparada granulando uma mistura do (s) composto (s) com excipientes e 20-75% p/p de hidrocolóides, como hidroxietilcelulose, hidroxipropilcelulose ou hidroxipropilmetilcelulose. Os grânulos obtidos podem então ser comprimidos em comprimidos.
Em contato com o suco gástrico, o comprimido forma uma barreira de gel substancialmente impermeável à água em torno de sua superfície. Essa barreira de gel participa da manutenção de uma densidade menor que uma, permitindo assim que o comprimido permaneça flutuante no suco gástrico.
Terapias combinadas
[225] Opcionalmente, uma terapêutica cardíaca descrita aqui (por exemplo, inibidor de CAMKII, peptídeo AIP ou polinucleotídeo) pode ser administrada em combinação com qualquer outra terapia padrão útil para regular a função cardíaca; esses métodos são conhecidos do especialista na técnica e descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin.
Edição do genoma do mutante RYR2
[226] Como os indivíduos que compreendem uma mutação RYR2 são predispostos à CPVT, seria desejável reparar especificamente o gene defeituoso que codifica o polipeptídeo RYR2. A edição terapêutica de genes é um dos principais focos da pesquisa biomédica, abraçando a interface entre a ciência básica e a clínica. Um grande número de diferentes síndromes hereditárias recessivas de doenças humanas é causado pela herança de mutações bialélicas de ponto de inativação dos genes da doença. O desenvolvimento de novas ferramentas de "edição de genes" fornece a capacidade de manipular a sequência de DNA de uma célula em um locus cromossômico específico, sem introduzir mutações em outros locais do genoma. Essa tecnologia permite efetivamente ao pesquisador manipular o genoma das células de um indivíduo in vitro ou in vivo, para efetuar uma reversão de um genótipo deletério (por exemplo, o gene que codifica RYR2R4651I). Altnerativamente, como os inventores descobriram que a fosforilação de RYR2-S2814 por CAMKII desmascara mutações de CPVT e que a mutação RYR2-S2814A é protetora, a edição terapêutica de genes pode envolver a introdução de uma mutação S2814A nos cardiomiócitos dos pacientes para torná-los menos vulneráveis à arritmia.
[227] Em uma modalidade, a edição de genes envolve direcionar uma endonuclease (uma enzima que causa quebras de DNA internamente dentro de uma molécula de DNA) para um local específico do genoma e, assim, desencadear a formação de uma quebra de fita dupla cromossômica (DSB) no local escolhido.
Se, concomitantemente com a introdução das quebras do cromossomo, uma molécula de DNA doador for introduzida (por exemplo, pela introdução de plasmídeo ou oligonucleotídeo), poderão ocorrer interações entre o cromossomo quebrado e o DNA introduzido, especialmente se as duas sequências compartilharem homologia. Nesse caso, pode ocorrer um processo denominado "direcionamento de genes", no qual as extremidades do DNA do cromossomo invadem sequências homólogas do DNA do doador por recombinação homóloga (HR).
Utilizando a sequência plasmídica doadora como um modelo para a FC, pode ser realizado um reparo contínuo do DSB cromossômico. Importante, se a molécula de DNA do doador diferir ligeiramente em sequência da sequência cromossômica, o reparo de DSB mediado por HR introduzirá a sequência do doador no cromossomo, resultando na conversão gênica/correção gênica do locus cromossômico. No contexto do direcionamento terapêutico do gene, a sequência alterada escolhida seria um fragmento ativo ou funcional (por exemplo, tipo selvagem, normal) do gene da doença de interesse. Ao direcionar a nuclease para um local genômico que contém a mutação pontual causadora da doença, o conceito é usar a formação de DSB para estimular a FC e, assim, substituir a sequência da doença mutante pela sequência do tipo selvagem (correção do gene). A vantagem da via de RH é que ela tem o potencial de gerar perfeitamente uma cópia do tipo selvagem do gene no lugar do alelo mutante anterior.
[228] As ferramentas atuais de edição de genoma usam a indução de quebras de fita dupla (DSBs) para aprimorar a manipulação genética de células. Tais métodos incluem nucleases de dedos de zinco (ZFNs; descritas, por exemplo, nas patentes US Nos. 6.479.626 e as patentes US Publ.
20030232410 e US2009020314, que são incorporadas aqui por referência), Nucleases Efetoras do Tipo Ativador de Transcrição (TALENs), descritas por exemplo nas Patentes US Nos 8.440.431, 8.440.432, 8.450.471, 8.586.363 e 8.697.853, e Publ. US Pat. 20110145940, 20120178131, 20120178169, 20120214228, 20130122581, 20140335592 e 20140335618, que são incorporadas aqui por referência) e o sistema CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas entre Espaços Regularmente Agrupados)/Cas9 (descrito por exemplo em Patentes US Nos.
8.697.359, 8.771.945, 8.795.965, 8.871.445, 8.889.356,
8.906.616, 8.932.814, 8.945.839, 8.993.233 e 8.999.641, e Patentes US Publ. Nos. 20140170753, 20140227787, 20140179006, 20140189896, 20140273231, 20140242664, 20140273232, 20150184139, 20150203872, 20150031134, 20150079681, 20150232882 e 20150247150, que são aqui incorporados por referência). Por exemplo, os recursos e a especificidade de reconhecimento de sequência de DNA da ZFN podem ser imprevisíveis. Da mesma forma, os TALENs e o CRISPR/Cas9 se aglutinam não apenas no local desejado, mas também em outros locais "fora do alvo". Esses métodos têm problemas significativos relacionados à indução de ruptura de fita dupla fora do alvo e ao potencial de mutações deletérias, incluindo indels, rearranjos genômicos e rearranjos cromossômicos, associados a esses efeitos fora do alvo. ZFNs e TALENs envolvem o uso de proteínas modulares de ligação a DNA específicas da sequência para gerar especificidade para sequências de ~ 18 pb no genoma.
[229] A edição de genomas mediada por nucleases guiadas por RNA, com base nos sistemas CRISPR Tipo 2 (Repetição Palindrômica Curta Intercalada Regularmente em Aglomerado)/Cas (CRISPR Associated), oferece uma abordagem valiosa para alterar o genoma. Em resumo, Cas9, uma nuclease guiada por RNA de guia único (sgRNA), se liga a um locus genômico direcionado ao lado do motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) e gera uma quebra de fita dupla (DSB).
O DSB é então reparado por junção de extremidade não homóloga (NHEJ), que leva a mutações de inserção/exclusão (indel) ou por reparo direcionado por homologia (HDR), que requer um modelo exógeno e pode gerar uma modificação precisa local de destino (Mali et al., Science. 2013, 15 de fevereiro; 339 (6121): 823-6). Ao contrário de outros métodos de terapia genética, que adicionam uma cópia funcional ou parcialmente funcional de um gene às células de um paciente, mas retêm a cópia original disfuncional do gene, esse sistema pode remover o defeito. A correção genética usando nucleases manipuladas foi demonstrada em células de cultura de tecidos e modelos de roedores de doenças raras.
[230] O CRISPR tem sido utilizado em uma ampla gama de organismos, incluindo levedura de padaria (Saccharomyces cerevisiae), peixe-zebra, nematoides (Caenorhabditis elegans), plantas, camundongos e vários outros organismos.
Além disso, o CRISPR foi modificado para criar fatores de transcrição programáveis que permitem aos cientistas direcionar e ativar ou silenciar genes específicos.
Bibliotecas de dezenas de milhares de RNAs guia estão agora disponíveis.
[231] Desde 2012, o sistema CRISPR/Cas tem sido utilizado para edição de genes (silenciamento, aprimoramento ou alteração de genes específicos) que até funcionam em eucariotos como ratos e primatas. Ao inserir um plasmídeo contendo genes cas e CRISPRs projetados especificamente, o genoma de um organismo pode ser cortado em qualquer local desejado.
[232] As repetições do CRISPR variam em tamanho de 24 a 48 pares de bases. Eles geralmente mostram alguma simetria da díade, implicando a formação de uma estrutura secundária, como um gancho de cabelo, mas não são verdadeiramente palindrômicos. As repetições são separadas por espaçadores de comprimento semelhante. Algumas sequências espaçadoras CRISPR correspondem exatamente às sequências de plasmídeos e fagos, embora alguns espaçadores correspondam ao genoma do procarionte (espaçadores auto direcionados). Novos espaçadores podem ser adicionados rapidamente em resposta à infecção por fagos.
[233] Os genes (cas) associados ao CRISPR são frequentemente associados a matrizes espaçadoras de repetição CRISPR. A partir de 2013, mais de quarenta famílias diferentes de proteínas Cas haviam sido descritas. Destas famílias de proteínas, Cas1 parece onipresente entre os diferentes sistemas CRISPR/Cas. Combinações particulares de genes cas e estruturas de repetição foram usadas para definir 8 subtipos de CRISPR (Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern e Mtube), alguns dos quais estão associados a um módulo genético adicional que codifica genes misteriosos associados à repetição proteínas (RAMPs). Mais de um subtipo de CRISPR pode ocorrer em um único genoma. A distribuição esporádica dos subtipos CRISPR/Cas sugere que o sistema está indivíduo a transferência horizontal de genes durante a evolução microbiana.
[234] Aparentemente, o DNA exógeno é processado por proteínas codificadas pelos genes Cas em pequenos elementos (cerca de 30 pares de bases), que são então inseridos no locus CRISPR próximo à sequência líder. Os RNAs dos loci CRISPR são expressos constitutivamente e são processados pelas proteínas Cas em pequenos RNAs compostos de elementos de sequência individuais derivados exogenamente com uma sequência de repetição de flanqueamento. Os RNAs guiam outras proteínas Cas para silenciar elementos genéticos exógenos no nível de RNA ou DNA. As evidências sugerem diversidade funcional entre os subtipos de CRISPR. As proteínas Cse (Cas subtipo Ecoli) (chamadas CasA-E em E. coli) formam um complexo funcional, Cascade, que processa os transcritos de RNA CRISPR em unidades de repetição espaçadora que Cascade retém. Em outros procariontes, o Cas6 processa as transcrições do CRISPR. Curiosamente, a inativação do fago CRISPR em E. coli requer Cascade e Cas3, mas não Cas1 e Cas2.
As proteínas Cmr (módulo Cas RAMP) encontradas em Pyrococcus furiosus e outros procariontes formam um complexo funcional com pequenos RNAs CRISPR que reconhecem e clivam RNAs alvo complementares. As enzimas CRISPR guiadas por RNA são classificadas como enzimas de restrição do tipo V.
[235] Veja também a Publicação de Patente U.S.
2014/0068797, que é incorporada por referência na sua totalidade.
Cas9
[236] Cas9 é uma nuclease, uma enzima especializada no corte de DNA, com dois locais de corte ativos, um para cada fio da dupla hélice. A equipe demonstrou que eles poderiam desativar um ou ambos os sítios, preservando a capacidade do Cas9 de localizar seu DNA alvo. Jinek et al. (2012)
combinaram o tracrRNA e o RNA espaçador em uma molécula de "RNA de guia único" que, misturada com Cas9, poderia encontrar e cortar os alvos de DNA corretos. Foi proposto que esses RNAs sintéticos de guia possam ser usados para edição de genes (Jinek et al., Science. 2012 Aug 17; 337 (6096): 816-21).
[237] As proteínas Cas9 são altamente enriquecidas em bactérias patogênicas e comensais. A regulação gênica mediada por CRISPR/Cas pode contribuir para a regulação de genes bacterianos endógenos, particularmente durante a interação bacteriana com hospedeiros eucarióticos. Por exemplo, a proteína Cas Cas9 de Francisella novicida usa um RNA pequeno e único associado ao CRISPR/Cas (scaRNA) para reprimir um transcrito endógeno que codifica uma lipoproteína bacteriana essencial para F. novicida para amortecer a resposta do hospedeiro e promover a virulência.
A co-injeção de RNAm Cas9 e sgRNAs na linha germinativa (zigotos) gerou ratos com mutações. A entrega de sequências de DNA Cas9 também é contemplada.
gRNA
[238] Como uma proteína guiada por RNA, Cas9 requer um RNA curto para direcionar o reconhecimento de alvos de DNA.
Embora Cas9 interrogue preferencialmente sequências de DNA contendo uma sequência PAM NGG, ele pode se ligar aqui sem um alvo protoespaçador. No entanto, o complexo Cas9-gRNA requer uma correspondência próxima ao gRNA para criar uma quebra de fita dupla. As sequências de CRISPR nas bactérias são expressas em vários RNAs e depois processadas para criar cadeias-guia para o RNA. Como os sistemas eucarióticos carecem de algumas das proteínas necessárias para processar RNAs CRISPR, o construto sintético gRNA foi criado para combinar as partes essenciais de RNA para Cas9 direcionadas a um único RNA expresso com o promotor de RNA polimerase tipo 2I U6). Os gRNAs sintéticos têm pouco mais de 100 pb no comprimento mínimo e contêm uma porção que tem como alvo os 20 nucleotídeos protospacer imediatamente antes da sequência PAM NGG; gRNAs não contêm uma sequência de PAM.
[239] Em uma abordagem, uma ou mais células de um indivíduo são alteradas para expressar uma forma selvagem de RYR2R4651I usando um sistema CRISPR-Cas. Cas9 pode ser usado para atingir um RYR2R4651I compreendendo uma mutação. Após o reconhecimento do alvo, Cas9 induz quebras de fita dupla no gene alvo RYR2R4651I. O reparo direcionado à homologia (HDR) no local de quebra de fita dupla pode permitir a inserção de uma sequência RYR2R4651I de tipo selvagem desejada.
[240] As seguintes patentes e publicações de patentes dos EUA são aqui incorporadas por referência: Patente No.
8.697.359, 20140170753, 20140179006, 20140179770, 20140186843, 20140186958, 20140189896, 20140227787, 20140242664, 20140248702, 20140255546, 20140273230,
20140273233, 20140273234, 20140295556, 20140295557, 20140310830, 20140356956, 20140356959, 20140357530, 20150020223, 20150031132, 20150031133, 20150031134, 20150044191, 20150044192, 20150045546, 20150050699, 20150056705, 20150071898, 20150071899, 20150071903, 20150079681, 20150159172, 20150165054, 20150166980, e
20150184139.
[241] A prática da presente invenção emprega, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão bem ao alcance do especialista. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura, como, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, segunda edição (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996); "Vetores de transferência de genes para células de mamíferos" (Miller e Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction" (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991). Estas técnicas são aplicáveis à produção dos polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção e, como tal, podem ser considerados na fabricação e na prática da invenção. Técnicas particularmente úteis para modalidades particulares serão discutidas nas seções a seguir.
[242] Os exemplos a seguir são apresentados de modo a fornecer aos técnicos no assunto uma divulgação e descrição completas de como fazer e usar os métodos de ensaio, triagem e terapêuticos da invenção e não se destinam a limitar o escopo de o que os inventores consideram sua invenção.
EXEMPLOS Exemplo 1: CPVT isogênico (PGP1-RYR2R4651I)
[243] Os fibroblastos da pele foram obtidos de um paciente com CPVT. Este paciente apresentava eletrocardiograma normal em repouso, mas taquicardia ventricular polimórfica induzida pelo exercício. A genotipagem revelou que o paciente apresentava uma mutação pontual no RYR2 que causava a substituição da arginina pela isoleucina na posição 4651 (R4651I; FIGURAS 19A-19C). A genotipagem clínica não implicou outros genes candidatos à arritmia herdada. Os fibroblastos foram reprogramados em iPSCs (linha CPVTp, onde p indica derivado do paciente; FIGURAS 20A-20D), que se diferenciaram fortemente em iPSC- CMs com eficiência comparável à linha iPSC de tipo selvagem PGP1 (FIGURAS 1A, 20E-20F) A edição do genoma da Cas9 foi usada para introduzir a mutação do paciente na PGP1, produzindo linhas de CPVT isogênica (PGP1-RYR2R4651I, CPVTe abreviado, onde e denota engenharia) e linhas de controle (PGP1, WT abreviado) (FIG. 20G).
[244] O manuseio de Ca2+ de iPSC-CMs de tipo selvagem (WT), CPVTp e CPVTe foi analisado carregando ilhas espaciais isoladas de células espancadas com o corante sensível a Ca2+ Fluo-4 e imagens de varredura de linha confocal. Comparado ao TP, os iPSC-CMs isogênicos editados pelo genoma (CPVTp) e os editados pelo genoma (CPVTe) tiveram eventos de liberação espontânea de Ca2+ mais frequentes em unidades individuais de liberação de Ca2+, conhecidas como liberações de Ca2+, e isso foi ainda mais exacerbado pelo isoproterenol (ISO) , um beta-simpatomimético (FIG. 1B). A função RYR2 foi examinada registrando transientes de cálcio. Na linha de base, o CPVTp e o CPVTe aumentaram dramaticamente a frequência pós-despolarização (FIG. 1C). Com a estimulação com isoproterenol, a frequência pós-despolarização permaneceu acentuadamente elevada na CPVTp e CPVTe em comparação com a TP.
[245] Como as arritmias clínicas emergem do comportamento coletivo dos cardiomiócitos reunidos nos tecidos, para modelar melhor as arritmias herdadas, os filmes finos musculares foram integrados (MTF), a optogenética e o mapeamento ótico para produzir “opto-MTFs”, uma plataforma que permite a avaliação simultânea do miocárdio condução e contração (FIG. 2A).
[246] O lentivírus foi usado para programar cardiomiócitos para expressar o canal de rodopsina (ChR2),
um canal fechado pela luz, conforme descrito.
Em experimentos piloto, a expressão de ChR2 em cardiomiócitos possibilitou estimulação ótica usando luz azul sem afetar mensurável sua atividade elétrica (FIG 21). Os cardiomiócitos que expressam
ChR2 que respondem à luz foram semeados em chips de gelatina micro-moldados (FIG. 22H), de modo que se reunissem com a característica de alinhamento paralelo do miocárdio nativo
(FIGURAS 2A-2B). A iluminação da luz LED azul (470 nm, pulsos de 10 ms) dirigida através de uma fibra ótica iluminava uma região de ~ 0,79 mm2, contendo ~ 500 células, em uma extremidade dos MTFs de 3 x 10 mm.
Isso foi suficiente para provocar ondas de potenciais de ação que foram conduzidas através dos MTFs ao longo do longo eixo das fibras musculares
(FIG. 2A). Ao atingir dois cantilevers de filme localizados na outra extremidade do MTF, as ondas de potencial de ação induzem a contração de iPSC-CM, deslocando o cantilever
(FIGURAS 2A e 2C). Usando mapeamento ótico fluorescente com o corante sensível ao Ca2+ X-Rhod-1 em combinação com microscopia de campo escuro, transientes e contração de cálcio foram registrados simultaneamente.
A propagação das ondas de cálcio seguida pela deflexão dos cantilevers foi claramente observada para os MTFs montados usando iPSC-CMs de controle, demonstrando um acoplamento de excitação-
contração eficaz (FIGURAS 2C e 24). Características espaço- temporais dos MTFs, como mapeamento de ativação, duração transitória de cálcio e velocidade de condução, foram medidas a partir dos dados do mapeamento ótico (FIG. 2D). Os MTFs adjacentes eram independentes um do outro, e o sistema de estimulação ótica permitiu que cada MTF fosse controlado separadamente em diferentes frequências.
[247] Tendo estabelecido a plataforma opto-MTF, foi utilizada para caracterizar as propriedades em escala de tecido dos tecidos cardíacos projetados por CPVT. A duração transitória do Ca2+ e a velocidade de condução dos CPVT opto- MTFs não diferiram significativamente dos controles (FIGURAS 2E-2G e 24A). Enquanto os iPSC-CM da CPVT exibiram frequentes pós-despolarizações mesmo na linha de base (FIG. 1C), a montagem no tecido opto-MTF aboliu amplamente essa atividade aberrante (FIG. 2F). As folhas de tecido da CPVT recapitularam melhor o fenótipo inicial dos pacientes, que apresentam poucas arritmias na ausência de exercício ou estresse emocional.
[248] Pacientes com CPVT desenvolvem taquicardia ventricular durante o exercício ou estresse emocional. Para simular características-chave dessas condições provocativas in vitro, os opto-MTFs foram estimulados com o aumento da frequência de estimulação ótica (1-3 Hz) ou estimulação β- adrenérgica (0-10 µM ISO). Notavelmente, o tratamento de
CPVT, mas não o controle de opto-MTFs com estimulação ou ISO induziu um subconjunto para sustentar a reentrada em onda espiral, o equivalente em nível de tecido de taquicardia ventricular (FIGURAS 3A-3C). A combinação da alta taxa de marcapasso e da ISO evocou a reentrada mais potentemente.
Durante a reentrada, os cantilevers opto-MTF emparelhados se moviam de forma assíncrona (FIG. 3D), imitando a contração cardíaca descoordenada que prejudica o débito cardíaco na taquicardia ventricular clínica. Esses dados mostram que a montagem de CPVT iPSC-CMs em modelos opto-MTF apresenta os principais recursos da doença em nível de tecido. Além disso, os dados implicam a reentrada como um mecanismo de arritmia na CPVT.
[249] A heterogeneidade da excitabilidade do tecido aumenta a vulnerabilidade do tecido à reentrada. Para investigar os mecanismos celulares que tornam os tecidos da CPVT vulneráveis à reentrada, os dados do mapeamento ótico foram analisados para determinar o efeito da taxa de estimulação e do isoproterenol na dispersão da velocidade de condução (CV) e da duração transitória do Ca2+ (CaTD) no espaço e no tempo. Apenas gravações com captura 1: 1 e sem reentrada foram utilizadas para essas análises. Com o aumento da estimulação e da ISO, os tecidos de CPVT desenvolveram maior dispersão espacial e temporal de CV e CaTD do que os tecidos de controle (FIG. 4A, 4B e 24). Esses dados sugerem que a mutação RYR2 aumenta a heterogeneidade da excitabilidade do tecido, criando um substrato vulnerável para o desenvolvimento da reentrada.
[250] Os eventos que iniciaram a reentrada no substrato vulnerável da CPVT foram analisados. Foram identificadas três gravações que capturaram o início da reentrada (FIG.
4C). Em cada caso, ocorreu uma pós-despolarização (FIG. 4C, seta) no momento do início do rotor. O DAD não foi suficiente para desencadear a despolarização regional, mas causou bloqueio de condução regional e condução de impulso unidirecional, resultando na formação de rotores. Este papel dos DADs de sublimiar para iniciar a reentrada foi predito por um estudo anterior de modelagem computacional.
[251] Embora se saiba que a estimulação com catecolamina provoca arritmia na CPVT, os alvos moleculares através dos quais a estimulação β-adrenérgica desmascara o potencial arrítmico latente das mutações no RYR2 não eram conhecidos.
A estimulação β-adrenérgica ativa inúmeras vias de sinalização, incluindo a quinase II dependente de Ca2+ - mododulina (CaMKII) e a proteína quinase A (PKA). A inibição da PKA usando um peptídeo potente e permeável às células não reduziu significativamente a frequência de liberação de Ca2+ em iPSC-CMs isogênicos (CPVTe) derivados de pacientes (CPVTp) e geneticamente modificados por engenharia genética (CPVTe) (FIG. 5A). Em contraste, a inibição de CaMKII com peptídeo inibidor de autocamtídeo permeável a células (AIP), um inibidor de CaMKII altamente seletivo e potente, reduziu de forma potente a frequência de liberação de Ca2+ em CPVT iPSC-CMs (FIGURAS 5A e 25).
[252] O CaMKII tem como alvo várias proteínas que afetam direta ou indiretamente o tratamento com Ca2+. Um alvo importante de CaMKII é a serina 2814 (S2814) no próprio RYR2 (FIG. 5B). A fosforilação de RYR2-S2814 por CaMKII melhora o vazamento diastólico de RYR2 Ca2+ e geralmente é pró- arrítmica. Para testar a hipótese de que a fosforilação do RYR2-S2814 mediada por CaMKII é essencial para a expressão de mutações no CPVT, a edição do genoma de Cas9 foi usada para substituir S2814 por alanina (S2814A; FIG. 26) em ambos os alelos RYR2, tanto no tipo selvagem RYR2 quanto nos fundos RYR2R4651I/+. Estes alelos mutantes são denominados WT-S2814A e CPVTe-S2814A, respectivamente. O RYR2 também é fosforilado no S2808 por PKA, e na edição paralela do genoma também foi usada para gerar as linhas mutantes homozigotas análogas RYR2-S2808A, denominadas WT-S2808A e CPVTe-S2808A (FIG. 26).
De acordo com o efeito do peptídeo inibidor de CaMKII, os iPSC-CMs de CPVTe-S2814A exibiram frequência de liberação de Ca2+ menor que CPVTe e comparável à WT, tanto na linha de base quanto com estimulação com isoproterenol (FIGURAS 5C, 5D e 26). Por outro lado, os iPSC-CMs do CPVTe-S2808A apresentaram frequência de liberação de Ca2+ semelhante à do
CPVTe (FIGURAS 5C e 5D), consistente com a falta de efeito da inibição farmacológica da PKA (FIG. 5A). Resultados semelhantes foram obtidos medindo a frequência de transientes de Ca2+ interrompidos por pós-despolarizações (FIGURAS 5E e 5F). Esses dados indicam que a fosforilação de CaMKII de RYR2-S2814 é necessária para desmascarar o potencial pró-arrítmico da mutação CPVT R4651I.
[253] Para modelar o efeito da inibição de CaMKII no tecido CPVT, CPVTe ou opto-MTFs de controle isogênico foram tratados com o inibidor seletivo AIP. Tanto no CPVTp quanto no CPVTe opto-MTFs, o AIP atenuou a frequência de reentrada em onda espiral (dados não mostrados). Em seguida, os opto- MTFs foram fabricados a partir de iPSC-CMs CPVTe-S2814A, que não exibiram liberação aberrante de Ca2+ em ensaios em ilhas celulares. A estimulação rápida e a ISO não induziram a reentrada nesses tecidos (FIGURAS 6B-6D). A medição da dispersão de CV e CaTD nesses tecidos mostrou que a abolição da fosforilação de S2814 impedia aumentos induzidos por estimulação e ISO na heterogeneidade do tecido de CPVT (FIGURAS 6D-6G). Esses dados mostram que a prevenção da fosforilação de RYR2-S2814 é suficiente para bloquear a reentrada no nível de tecido na CPVT.
[254] Um modelo de CPVT em tecido humano foi criado e utilizado para elucidar a patogênese molecular e celular desta doença. A nível molecular, é necessária a fosforilação de CaMKII de RYR2-S2814 para expressão completa do potencial arrítmico da mutação R4651I CPVT. Este evento de fosforilação pode ser um alvo terapêutico seletivo cardíaco para o tratamento da CPVT. No nível tecidual, esses estudos indicam que a reentrada é um importante mecanismo de arritmia na CPVT. Com estimulação rápida e estimulação ISO, os opto-MTFs da CPVT desenvolveram maior heterogeneidade tecidual, resultando em um substrato vulnerável à reentrada. Nesse substrato vulnerável, as pós-despolarizações do sublimiar causadas pela mutação da CPVT iniciam a reentrada em onda espiral.
Exemplo 2: AIP inibe arritmia em um modelo murino de
CPVT
[255] Como aqui relatado acima, o AIP inibiu seletivamente a CPVT em um modelo opto-MTF que expressa a mutação R4561I. Para determinar a eficácia in vivo, foi gerado um vetor adenoviral que codifica um Autocamtídeo de Peptídeo Inibitório de CaMKII (AIP) ligado a GFP. Este vetor adenoviral foi injetado em camundongos intraperitonealmente (FIG. 6H). Como mostrado na FIG. 7, a expressão de AIP GFP foi observada em tecidos cardíacos murinos. Micrografias de tecido cardíaco mostram a localização da expressão de AIP- GFP. Cerca de dezesseis por cento das células positivas para troponina expressaram baixos níveis de GFP, enquanto a grande maioria das células positivas para troponina expressou GFP em níveis mais altos (FIG. 8, painel esquerdo). A expressão de AIP em células positivas para troponina também foi quantificada (FIG. 8, painel direito). Com a maioria das células que expressam AIP ligadas à GFP em um nível médio ou alto.
[256] A expressão de AIP foi suficiente para inibir a fosforilação por CaMKII em resposta à estimulação com isoproterenol (FIGURAS 9 e 10). A estimulação com isoproterenol simula os principais recursos da CPVT induzida pelo exercício. Os níveis de CaMKII fosforilada no lisado do coração inteiro foram reduzidos em camundongos estimulados com isoproterenol que foram injetados com o vetor adenoviral que expressa AIP, AAV9-GFP-AIP, em relação ao nível de CaMKII fosforilada presente nos lisados de controle derivados de camundongos injetados com um vetor controle (FIGURAS 9 e 10).
[257] O papel da fosforilação na ativação do canal cardíaco de rianodina foi ainda mais explorado, gerando um knock-in de R176Q no canal cardíaco de rianodina (RYR2) (FIG.
11) e caracterizando a eletrofisiologia de camundongos portadores da mutação R176Q (FIG. 12 e 13) Eletrocardiogramas de linha de base (ECGs) de tipo selvagem e camundongos com uma mutação R176Q no canal cardíaco de rianodina (RYR2) são mostrados na FIG. 14. Para imitar os efeitos da CPVT induzida pelo exercício, foi utilizado um protocolo de estimulação e isoproterenol ou epinefrina. Curiosamente, os ratos portadores R176Q que foram tratados com isoproterenol ou epinefrina portando a mutação R176Q mostraram alterações na frequência cardíaca e nos intervalos QT da linha de base em relação aos ratos controle do tipo selvagem (FIGURAS 15 e 16). Alterações na linha de base e arritmia espontânea em camundongos R176Q são mostradas nas FIGURAS 17A-17E.
Arritmia induzida foi observada em camundongos R176Q (FIG.
18). Essas arritmias não foram observadas em camundongos R176Q que receberam um vetor viral que codifica AIP.
[258] Os resultados aqui descritos acima foram obtidos usando os seguintes métodos e materiais.
[259] Isolamento e reprogramação de células de fibroblastos humanos - As biópsias de pele fresca dos pacientes foram cortadas em pedaços pequenos (menos de 1 mm3) e incubadas com colagenase 1 (1 mg/ml em DMEM) a 37 °C por 8 horas. O tecido digerido de cada paciente foi colocado em um prato de cultura de tecidos, coberto com uma lamela de vidro e cultivado em DMEM contendo 10% de FBS. Após 7 dias com trocas diárias de mídia, foram passadas consequências de fibroblastos no prato de cultura de tecidos e na lamela. Os fibroblastos foram reprogramados antes da passagem 5 através da transfecção epissomal com construções de expressão OCT4, SOX2, KLF4 e OCT4 usando Kits Nucleofector™ para fibroblastos dérmicos humanos (Lonza). Os iPSCs foram testados quanto à pluripotência por qRTPCR e imunocoloração de genes de pluripotência, cariotipagem e formação de teratoma in vivo.
[260] Manutenção humana de iPSC - Todas as linhas de IPSC em estudo foram mantidas em meio mTeSR™ 1 (STEMCELL Technologies) e passadas em solução de verseno (15040066, Thermo Fisher Scientific) a cada cinco dias. Os pratos de cultura foram revestidos com Matrigel diluído 1: 100 (Matriz Corning® Matrigel® hESC-Qualified, LDEV-Free) antes da passagem.
[261] Diferenciação de cardiomiócitos (iPSC-CMs) de iPSCs humanas - As iPSC humanas foram semeadas em placas revestidas com Matrigel em densidade de passagem normal. A diferenciação de iPSC para iPSCCMs seguiu a linha do tempo mostrada na FIG. 20E. No dia 3 da cultura iPSC, o meio mTeSR™ 1 foi removido, as células foram lavadas uma vez com PBS (sem Ca2+ ou Mg2+) e cultivadas em Meio de Diferenciação (meio RPMI (11875093, Thermo Fisher Scientific) com B27 sem insulina (A1895601, Thermo Fisher Scientific)) contendo 5 µM de CHIR99021 (72054, STEMCELL Technologies). Após 24 horas, o meio foi alterado para meio de diferenciação sem CHIR99021.
No dia 3 da diferenciação, as células foram cultivadas em meio de diferenciação contendo 5 µM de IWR-1 (3532, Tocris).
Após 48 horas, as células foram cultivadas em meio de diferenciação sem IWR até o dia 15, com trocas de mídia a cada 2-3 dias. No dia 15, as células foram cultivadas em meio de seleção (DMEM sem glicose (11966025, Thermo Fisher Scientific) com lactato 0,4 mM (# L7022, Sigma Aldrich)) por 5 dias para enriquecer para iPSCCMs.
Isolamento e semeadura diferenciados de cardiomiócitos no chip de engenharia
[262] Os cardiomiócitos humanos derivados de iPSC foram isolados por incubação em colagenase 1 (Sigma C-0130, 100 mg de colagenase 1 em 50 ml de PBS/20% de FBS) por 1 hora, seguida por uma incubação de 0,25% de tripsina a 37 °C por 5 a 10 minutos. FBS a 50% em DMEM com 50 µg/ml de DNase I (# 260913, EMD Millipore) foi usado para interromper a tripsinização. Os iPSC-CMs foram suspensos em meio de cultura (RPMI: DMEM sem glicose 1: 1, mais 1x B27 sem insulina e lactato 0,2 mM) contendo 10% de FBS e 10 µM de Y27632. Os cardiomiócitos foram suspensos com meio de cultura contendo 10% de FBS e 10 µM de Y27632 em concentração final como 1 milhão de células por 600 µl de volume para o chip de engenharia. Após 48 horas, o meio foi mudado para meio de cultura de aparas (1: 1 misturado por meio de cultura e meio de seleção). Ao mesmo tempo, os cardiomiócitos ressecados foram infectados com lentivírus CHR2 por 24 horas para futuras experiências.
[263] Coloração por imunofluorescência - Os cardiomiócitos diferenciados foram semeados em placa com fundo de vidro revestido com Matrigel por 5 dias. As células foram fixadas por paraformaldeído a 4%, 10 minutos em temperatura ambiente, depois soro de burro a 5% mais triton X-100 a 0,02% X-100 a 4 °C permeabilizado durante a noite.
Os anticorpos primários foram utilizados como 1: 200 em 4 °C > 8 h. Oct4 (SANTA CRUZ, SC8628), SSEA4 (Millipore, MAB4304), Troponina cardíaca I (Abcam, ab56357), ACTN2 (Abcam, ab56357), RYR2 (Abcam, ab2827). As imagens foram obtidas pelo microscópio confocal Olympus FV1000.
[264] Imagem de Ca2+ - Os cardiomiócitos diferenciados foram semeados em placa de fundo de vidro revestido com Matrigel por 5 dias. Cada 50 µg de Fluo 4 (F14201, Thermo Fisher Scientific) foram dissolvidos com 8 µl de DMSO e depois diluídos 1: 1 com Pluronic® F-127 (solução a 20% em DMSO) (P3000MP, Thermo Fisher Scientific). Os cardiomiócitos foram tratados com 3 ug/ml de Fluo 4 a 37 °C durante meia hora. Em seguida, lavou-se com meio de cultura antes da gravação de Ca2+. Toda a gravação foi gravada em meio de cultura. A gravação foi digitalizada pelo microscópio confocal FV1000 - Olympus em 10ms/linha e 1000 linhas por gravação. Utilizaram-se 10 µM de KN93 (K1385 SIGMA) e 10 µM de DIHIDROCLORETO como composto inibidor de CAMKII e PKA, peptídeo inibidor relacionado ao autocamptídeo-2 0,025 µM (SCP0001 SIGMA) e inibidor de PKA 1 µM 14-22 (476485, EMD Millipore) inibir peptídeo. O isoproterenol foi utilizado em 1 µM.
[265] Edição de genoma mediada por CRISPR/Cas9 - Os procedimentos para edição de genoma de CRISPR/Cas9 são conhecidos na técnica. Em geral, iPSCs PGP1 humanas de tipo selvagem que continham Cas9 induzível por doxiciclina. O RNA guia de expressão do plasmídeo e o oligonucleotídeo doador de 90 nucleotídeos foram transfectados para as células PGP1- Cas9 com os kits Nucleofector™ para células-tronco humanas (Lonza # VPH-5012) no programa B-016. Os clones candidatos da edição do genoma foram amplificados por PCR e sequenciados para verificar se a mutação de substituição ocorreu. Os iniciadores de sequenciamento como a seguir:
[266] Para o sítio R4651: Iniciador direto R4651: TTG TAA GTT TAC GTG GCA GGA (SEQ. ID. NO: 2); Iniciador reverso R4651: CGC GTG CAT ATG TGT GTG TA (SEQ. ID. NO: 3);
[267] Para o sítio S2814: Iniciador direto S2814: ACACTATGTTTGGAAATTTGTGCCA (SEQ.
ID. NO: 4); Iniciador inverso S2814: TGCTTTCCTGCATATATTTGGCA (SEQ.
ID. NO: 5);
[268] Para o sítio S2808: Iniciador direto S2808: GGGCTGGAGAATTGAAAGAAC (SEQ. ID.
NO: 6);
Iniciador reverso S2808: CCCTTCTAAATTTTGTGACTCTTCA (SEQ. ID. NO: 7).
[269] Selecionamos mutação heterozigótica no local R4651 e mutação homozigótica no local S2814 e S2808.
[270] As sequências guiam de RNA (gRNAs) utilizadas foram: Para o sítio 2808: CGTATTTCTCAGACAAGCCAGG (SEQ. ID. NO: 8) Para o sítio 2814: CAAATGATCTAGGTTTCTGTGG (SEQ. ID. NO: 9) Para o sítio 4651: GACAAATTTGTTAAAATAAAGG (SEQ. ID. NO: 10)
[271] O modelo de reparo dirigido por homologia (HDR) de 90 nucleotídeos foi:
[272] Para o sítio 2808:
CGGGAGGGAGACAGCATGGCCCTTTACAACCGGACTCGTCGTATTGCTCAGACA AGCCAGGTAAGAATTCATCACGGTGATGAATCAACTG (SEQ. ID. NO: 11)
[273] Para o sítio 2814:
AGGTTTTTAATGAGGCACTGTTTTTTCACACAAATGATCTAGGTTGCTGTGGAC GCTGCCCATGGTTACAGTCCCCGGGCCATTGACATGA (SEQ. ID. NO: 12)
[274] Para o sítio 4651:
ATTTTAGGTCATTTCCCAACAACTACTGGGACAAATTTGTTAAAATAAAGGTAA TATTACTTGGAATCCTCTACATTTTTCTTAAAGCACA (SEQ. ID. NO: 13)
[275] Cultura de iPSC-CMs comerciais - Os cardiomiócitos comerciais derivados de hiPSC (hiPSC-CMs, Cor4U;
Axiogenesis, Colônia, Alemanha) foram cultivados de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, um balão de cultura de células T-25 (por cada 1 milhão de criotubos) foi revestido com 0,01 µg/mL de fibronectina (FN) (BD Biosciences, Bedford, MA) um dia antes da semeadura celular.
Os criogênicos foram rapidamente descongelados em banho- maria a 37 °C e ressuspensos em 9 mL de meio de cultura completo (Axiogenesis, Colônia, Alemanha) suplementado com 4,5 µL de 10 mg/mL de puromicina (Axiogenesis, Colônia, Alemanha). Após 24 horas, os meios de cultura de células foram substituídos por meios isentos de puromicina (volume total de 10 ml). Após 48 horas, as células foram dissociadas com tripsina-EDTA a 0,25% (Life Technologies) por 10 min e depois lavadas e suspensas em meio livre de puromicina. As células ressuspensas foram usadas para semear coberturas ou chips opto-MTF.
[276] Colheita de miócitos ventriculares de ratos neonatais - O isolamento de miócitos ventriculares de ratos neonatais foi realizado como descrito anteriormente na técnica. Resumidamente, os ventrículos foram removidos de filhotes de ratos Sprague Dawley com 2 dias de idade (Charles River Laboratories). O tecido foi picado manualmente. Para a primeira digestão enzimática, o tecido foi colocado em uma solução de tripsina a 0,1% (Sigma Aldrich) a 4 °C por aproximadamente 12 horas. Para o segundo estágio da digestão enzimática, a tripsina foi substituída por uma solução de colagenase tipo II a 0,1% (Sigma Aldrich). Após quatro iterações das digestões do segundo estágio a 37 °C, os miócitos ventriculares foram ainda isolados da solução celular dissociada resultante por centrifugação e passagem da solução ressuspensa através de um filtro de células de 40 µm. A solução foi pré-plaqueada duas vezes por 45 minutos cada a 37 °C para remover fibroblastos e células endoteliais.
Em seguida, criamos a solução de semeadura ressuspendendo os miócitos ventriculares resultantes em um meio de célula M199 (Life Technologies) suplementado com 10% de FBS inativado por calor (Life Technologies).
Fabricação de substrato de película fina muscular de gelatina (MTF)
[277] As lamelas de vidro (22 por 22 mm quadrados) foram limpas com etanol a 70% (Sigma) e depois cobertas com fita adesiva baixa (3M). Usando um sistema de gravação a laser (Epilog Laser), a fita foi cortada para ter dois retângulos no centro, cercados por quatro trapézios nas bordas externas.
Os retângulos internos de 3 mm por 10 mm e 7 mm por 10 mm são para a região cantilever e base dos MTFs, respectivamente.
[278] As lamelas de vidro foram ativadas seletivamente, de modo que a gelatina na região base dos MTFs se fixasse firmemente nas lamelas de vidro, mas a gelatina na região cantilever seria facilmente descascada. Primeiramente, apenas a fita da região base foi removida, enquanto as fitas nas regiões cantilever e externa permaneceram para proteger o vidro da ativação a seguir. As lamelas foram ativadas com uma solução de NaOH (Sigma) 0,1 M por 5 minutos, uma solução APTES (Sigma) a 0,5% em etanol a 95% (Sigma) por 5 minutos, seguida por uma solução de glutaraldeído a 0,5% por 30 minutos.
[279] A fita na região do cantilever foi removida após o processo de ativação, mas as fitas nas regiões externas permaneceram nas lamelas de vidro. A gelatina a 20% p/v (Sigma) e a MTG a 8% p/v (Ajinomoto) foram aquecidas a 65 °C e 37 °C, respectivamente por 30 minutos. Em seguida, as soluções foram misturadas para produzir uma solução final de 10% p/v de gelatina e 4% p/v de MTG. 300 µl da mistura de gelatina foram rapidamente pipetados nas regiões retangulares internas expostas das lamelas de vidro. Os selos PDMS com recursos de ranhura de linha (largura da crista de 25 µm, largura de ranhura de 4 µm e profundidade de ranhura de 5 µm) foram então invertidos no topo da gota de gelatina e o peso foi aplicado usando um peso de 200 g. Deixou-se então a gelatina curar durante a noite à temperatura ambiente com o marcador e o peso no lugar.
[280] Após a cura da gelatina, o peso foi cuidadosamente removido juntamente com o excesso de gelatina nas laterais do marcador. Para minimizar os danos à gelatina micro- moldada, a lamela e o marcador foram imersos em água destilada para reidratar a gelatina por uma hora. O selo foi então cuidadosamente retirado da gelatina.
[281] As lamelas com a gelatina micro-moldada foram rapidamente secas com toalhetes de papel (Kimwipes, Kimberly-Clark Professional). Os cantilevers (1 mm de largura × 2 mm de comprimento) foram gravados a laser na gelatina micro-moldada desidratada usando um sistema de gravação a laser Epilog com 3% de potência, 7% de velocidade e uma frequência de 1900 Hz. Os chips de gelatina foram tratados com UVO por 90 segundos e re-hidratados em uma solução MES 2 mM de pH 4,5 com 1 mg/ml de colágeno e 0,1 mg/mg de fibronectina. Os chips de gelatina foram armazenados em solução à temperatura ambiente durante 2 horas. A solução de colágeno e fibronectina foi substituída por PBS. Os chips de gelatina foram armazenados a 4 ºC até a semeadura celular.
[282] Litografia macia e fabricação de marcadores micromoldados PDMS - Os marcadores micromoldados foram fabricados a partir de polidimetilsiloxano (PDMS, Sylgard 184, Dow Corning) usando protocolos de litografia mole publicados anteriormente e conhecidos na técnica.
Resumidamente, o fotorresistente SU-8 2005 (MicroChem) com 5 µm de espessura foi revestido por rotação em pastilhas de silício e pré-cozido a 90 °C, conforme sugerido no manual do protocolo MicroChem. A camada SU-8 foi exposta à luz UV sob máscaras fotográficas personalizadas com recursos de linha (linhas escuras de 25 µm de largura e linhas claras de 4 µm de largura). Após a exposição, as bolachas foram pós-cozidas a 90 °C, desenvolvidas com acetato de éter monometílico- propilenoglicol e silanizadas com fluorosilano (United Chemical Technologies). O PDMS foi misturado na proporção 10: 1 da base para o agente de cura, vertido sobre a bolacha, curado a 65 °C por 4 horas, cuidadosamente retirado da bolacha e cortado em marcadores micromoldados.
[283] Construção Opto-MTF - vetor lentiviral ChR2 no qual o promotor da troponina T cardíaca conduz o ChR2-eYFPP foi construído com base no plasmídeo FCK (1.3) GW com o promotor da troponina cardíaca T (cTnT), ChR2 e etiqueta fluorescente amarela aprimorada.
[284] Antes da semeadura, os chips de gelatina foram lavados com PBS e incubados com meio de semeadura hiPSC-CM ou NRVM. WT dissociado, CPVTp e CPVTe iPSC-CMs foram suspensos em meio de cultura contendo 10% de FBS e 10 µM Y27632 a uma concentração final de 1 milhão de células por 600 µl. Após 48 horas, o meio de cultura foi substituído por meio de cultura de aparas (mistura 1: 1 de meio de cultura e meio de seleção). Ao mesmo tempo, os iPSC-CMs foram transduzidos com lentivírus ChR2 a uma multiplicidade de infecção de 14-23 por 24 horas. As células hiPSC-CMs comerciais (Cor4U; Axiogenesis, Colônia, Alemanha) e as células NRVM foram semeadas em dispositivos a uma densidade de 220 k/cm2 e 110 k/cm2, respectivamente. Após 24 horas, as NRVMs foram tratadas com lentivírus ChR2 na multiplicidade de infecção de 14-23 por 24 horas.
[285] Coloração imunofluorescente de tecidos cardíacos manipulados em hidrogéis de gelatina micromoldados - iPSC- CM opto-MTFs foi lavada com PBS a 37 °C, fixada em PBS com paraformaldeído a 4% e Triton X-100 a 0,05% por 12 minutos a 37 °C e enxaguada com PBS. Os tecidos foram corados com anticorpo monoclonal anti-sarcomérico de α-actinina (Sigma) de camundongo por 1 hora à temperatura ambiente e, em seguida, com um anticorpo secundário contra IgG de camundongo conjugado com Alexa-Fluor 546 (Life Technologies) e DAPI (Life Technologies). As amostras foram montadas em lâminas de vidro com suporte antifade ProLong Gold (Life Technologies). As imagens da pilha Z foram adquiridas usando um microscópio confocal (Zeiss LSM) equipado com uma objetiva alfa Plan-Apochromat 100x/1,46 Oil DIC M27.
[286] Western Blot - 10% de gel Invitrogen Bolt foram utilizados para executar todas as amostras. Para transferências Western RYR2 e RYR2-P2814, a transferência foi realizada usando 75V por 900 minutos. Outros westerns foram transferidos usando 80V por 120 min. Os anticorpos, anticorpos utilizados para transferências Western foram os seguintes: CaMKII-fosfo-T286 (Abcam, ab171095), CaMKII (Abcam, ab134041), RYR2-fosfo-S2814 (Badrilla A010-31AP) e Troponina cardíaca T (Abcam ab45932). Os padrões de proteína pré-manchada HiMark (Life Technologies # LC5699) foram usados como marcadores de peso molecular.
[287] Imagem de Ca2+ de aglomerados de células - iPSC- CMs foram semeadas em placas de fundo de vidro revestido com Matrigel por 5 dias. Dissolveram-se 50 µg de Fluo-4 (F14201, Thermo Fisher Scientific) em 8 µl de DMSO e depois diluíram- se 1: 1 com Pluronic® F-127 (solução a 20% em DMSO) (P3000MP, Thermo Fisher Scientific). Os iPSC-CMs foram tratados com 3 µg/ml de Fluo-4 a 37 °C por meia hora. As amostras foram então lavadas com Meios de Cultura antes da geração de imagens Ca2+ em uma Olympus FV1000 usando o modo de varredura de linha (10 ms/linha, 1000 linhas por gravação). A linha de varredura foi posicionada dentro de iPSC-CMs individuais que pertenciam a grupos de 3 a 10 células. Registros de eventos espontâneos de liberação de Ca2+ foram feitos durante períodos em que as células não exibiam transientes espontâneos de Ca2+ ou durante períodos de batimentos espontâneos. Utilizaram-se peptídeo inibidor relacionado à autocamtídeo-2 0,025 µM miristolado (SCP0001 Sigma) e 1 µM de inibidor de PKA 14-22 amida (476485, EMD Millipore) como peptídeos inibidores de CaMKII e PKA. O isoproterenol foi utilizado a 1 µM.
[288] Configuração ótica para o macroscópio opto-MTF -
Tandem-lens (Scimedia) foi modificada para a imagem simultânea de Ca2+ e medição da contratilidade com estimulação optogenética (FIG. 20). Para a imagem Ca2+, o sistema foi equipado com uma câmera de alta velocidade (MiCAM
Ultima, Scimedia), um objetivo APO 1 × plano, um colimador
(Lumencor) e uma lâmpada de mercúrio de 200 mW para iluminação de epifluorescência (X-Cite exacte, Lumen
Dynamics). Para medições de contratilidade, uma câmera sCMOS de alta resolução espacial (pco.edge, PCO AG) e uma luz LED de campo escuro de 880 nm (Advanced Illumination) foram incorporadas ao sistema.
O campo de visão do sistema para
Ca2+ e imagens de campo escuro foi de 10 mm por 10 mm e 16 mm por 13 mm, respectivamente.
Para estimulação optogenética, um painel de LEDs de 8 canais (465/25 nm,
lentes dóricas) foi usado para gerar pulsos óticos.
Os pulsos de luz para estimulação de MTFs individuais foram entregues através das 8 fibras óticas (400 µm de diâmetro, NA 0,48,
lentes dóricas) e 8 cânulas monofibras (extremidade plana,
400 µm de diâmetro, NA 0,48, lentes dóricas) montadas 500 µm acima da gelatina chips usando um manipulador de 3 eixos
(Zaber, Canadá). Para evitar a sobreposição do comprimento de onda da luz de excitação para transientes de Ca2+ e iluminação de campo escuro para medições de contratilidade com o comprimento de onda de excitação ChR2, foi utilizado um conjunto de filtros com comprimentos de onda mais longos que o comprimento de onda de excitação ChR2. Para a imagem Ca2+, foi utilizado um filtro de excitação com 580/14 nm, um espelho dicróico com corte de 593 nm e um filtro de emissão com 641/75 nm (Semrock, Rochester, NY). Para imagens de campo escuro, um espelho dicróico com corte de 685 nm e filtro de emissão de passagem longa com corte de 664 nm (Semrock, Rochester, NY) foram adicionados ao caminho da luz para imagens de Ca2+. As fontes de luz do conjunto de LEDs foram controladas independentemente por sinais analógicos que foram sintetizados com um módulo de saída analógica (NI 9264, National Instruments) por software personalizado escrito em LabVIEW (National Instruments). Para o processamento pós- imagem, esses sinais analógicos foram gravados usando uma câmera de alta velocidade e uma câmera sCMOS de alta resolução espacial simultaneamente, para usar os sinais analógicos como referência para o alinhamento de quadros de ambos os sistemas.
[289] Aquisição de dados no nível do tecido - No dia 3 pós-transdução, os tecidos opto-MTF manipulados foram incubados com 2 µM X-Rhod-1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) por 30 minutos a 37 °C, lavados com meio de cultura com 2% de FBS para remover o corante não específico associado e incubado novamente por 30 minutos para concluir a desesterificação do corante. Antes da gravação das experiências, o meio de cultura foi substituído pela solução de Tyrode (1,8 mM de CaCl2, 5 mM de glicose, 5 mM de Hepes, 1 mM de MgCl2, 5,4 mM de KCl, 135 mM de NaCl e 0,33 mM de NaH2PO4 em água desionizada, pH 7,4 , a 37 °C; Sigma). A amostra de tecido manipulado na solução de Tyrode foi mantida a 37 °C durante as experiências usando uma incubadora de placas de cultura (Warner Instruments).
[290] Os tecidos opto-MTF projetados foram estimulados com um pulso ótico de 10 ms em uma faixa de frequências de 0,7 a 3 Hz, usando um programa LabVIEW personalizado (National Instruments). A estimulação do ponto ótico foi aplicada em uma extremidade do tecido MTF usando uma fonte de luz LED (465/25 nm, lentes dóricas). Para cada gravação, Ca2+ e imagens de campo escuro foram adquiridas simultaneamente com 2000 quadros e 400 quadros a uma taxa de quadros de 200 Hz e 100 Hz ao longo de 10 s e 4 s, respectivamente.
[291] Análise dos dados de imagem de cálcio - O pós- processamento dos dados brutos de cálcio foi realizado com um software personalizado escrito em MATLAB (MathWorks). Um filtro espacial de 3 × 3 pixels foi aplicado para melhorar a relação sinal-ruído. Primeiro, o tempo de ativação local de Ca2+, Tactp,px e tempo de repolarização de 80%, CaTD80p,px de cada pixel (px) e cada pulso (p) foi calculado identificando o tempo com a inclinação máxima de avanço e o tempo desde o início até 80% de recuperação, respectivamente.
Em seguida, a velocidade de propagação do cálcio, CaSp,px de cada pixel e cada pulso foi determinada calculando a taxa de mudança direcional xey de Tactp,px em 21 pixels (3 pixels na direção transversal, x e 7 pixels na direção longitudinal da onda, y). Para calcular as dispersões espaciais da velocidade de propagação do Ca2+, CaSspat e tempo de repolarização de 80%, CaTD80spat, calculamos a média de CaSp,px e CaTD80p,px em vários pulsos consecutivos (3-20 pulsos) de cada pixel e calculamos o coeficiente de variação de essas médias temporais sobre uma área de interesse (500 a 1000 pixels).
Para calcular as dispersões temporais das velocidades de propagação do cálcio, CaStemp e tempo de repolarização de 80%, CaTD80temp, calculamos a média de CaS p,px e CaTD80p,px em todas as áreas de interesse de cada pulso e calculamos o coeficiente de variação dessas médias espaciais por várias consecutivas pulsos. A velocidade de propagação global de Ca2+, CaSglobal e tempo de repolarização de 80%, CaTD80global, foi calculada pela média de CaSp,px e CaTD80p,px em vários pulsos consecutivos e áreas de pixel de interesse. Regiões onde a velocidade de propagação local de Ca2+ foi menor que 0,2 cm/s foram definidas como tendo bloqueio de condução funcional. Além disso, medimos o comprimento de onda global de Ca2+, a amplitude do sinal de Ca2+ e o nível diastólico relativo de Ca2+. O comprimento de onda global do cálcio foi definido como a distância percorrida pelas ondas durante o período refratário do cálcio e calculado multiplicando a velocidade de propagação do cálcio, CaSglobal e 80% de tempo de repolarização, CaTD80global. A amplitude de cálcio foi calculada como uma diferença entre o pico sistólico e o nível diastólico de Ca2+. Os níveis diastólicos relativos de Ca2+ foram calculados a partir do valor diastólico médio em mais de 500 pontos de amostragem distribuídos por todo o tecido, subtraindo a intensidade de fundo medida em 10 pontos fora do opto-MTF. Este valor subtraído em segundo plano na taxa base (0,7 Hz, sem ISO) foi definido como F0. A mudança no nível diastólico relativo de Ca2+ nas frequências de estimulação mais altas foi calculada como (F-F0)/F0. Para determinar a ISO e a dependência da frequência de estimulação de variáveis globais, os dados das variáveis globais foram normalizados para valores do mesmo opto-MTF a 1,5 Hz de estimulação sem ISO.
[292] Análise dos dados de imagem de campo escuro de contratilidade - O pós-processamento dos dados de imagem de campo escuro foi realizado usando o software personalizado escrito em MATLAB (MathWorks). O programa de software ImageJ para quantificação de tensão contrátil foi modificado como conhecido na técnica. Primeiro, o comprimento projetado de cada MTF de cada quadro foi medido usando as funções MATLAB de limiar de imagem. Em seguida, a tensão do filme foi calculada usando o comprimento projetado, a espessura do filme de gelatina e as propriedades da gelatina considerando a relação geométrica do raio de curvatura, o ângulo do arco e o comprimento projetado do filme, usando uma equação de Stoney modificada. Aqui, o módulo de Young = 56 kPa e a espessura da gelatina MTF = 188 µm, conforme determinado anteriormente na técnica. O estresse por contração muscular foi calculado como a diferença entre o pico e o estresse basal.
[293] Análise estatística - As diferenças funcionais no nível do tecido foram calculadas com o teste t de Student (P < 0,05) e a correção do teste múltiplo de Benjamini-Hochberg foi aplicada com taxa de falsa descoberta (FDR) de 20%.
Outras modalidades
[294] A partir da descrição anterior, será aparente que variações e modificações podem ser feitas na invenção aqui descrita para adotá-la para vários usos e condições. Tais modalidades também estão dentro do escopo das reivindicações a seguir.
[295] A recitação de uma lista de elementos em qualquer definição de uma variável aqui inclui definições dessa variável como qualquer elemento único ou combinação (ou subcombinação) de elementos listados. A recitação de uma modalidade aqui inclui essa modalidade como qualquer modalidade única ou em combinação com quaisquer outras modalidades ou porções das mesmas.
[296] Todas as patentes e publicações mencionadas nesta especificação são aqui incorporadas por referência na mesma extensão como se cada patente e publicação independente fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de um vetor que codifica um inibidor de peptídeo CaMKII.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o inibidor de peptídeo CaMKII é AIP, CN19, CN19o, CN27, CN21, ou um análogo ou fragmento dos mesmos.
3. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica um inibidor de peptídeo CaMKII.
4. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o inibidor de peptídeo CaMKII está operacionalmente ligado a um promotor adequado para direcionar a expressão do peptídeo em uma célula cardíaca de mamífero.
5. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o vetor é uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um inibidor de peptídeo CaMKII, análogo ou fragmento do mesmo.
6. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 3 a 5, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor viral retroviral, adenoviral ou adeno- associado.
7. Célula caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de expressão conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores 3 a 6.
8. Método para modular uma arritmia cardíaca em um indivíduo, o método caracterizado pelo fato de que compreende contatar uma célula compreendendo um canal de rianodina cardíaco (RYR2) com um inibidor de CaMKII, inibidor de peptídeo CaMKII ou polinucleotídeo que codifica o inibidor de peptídeo CaMKII.
9. Método para inibir a fosforilação de um polipeptídeo de canal de rianodina (RYR2) em um indivíduo, o método caracterizado pelo fato de que compreende contatar uma célula compreendendo um canal de rianodina cardíaco (RYR2) com um inibidor de CAMKII, inibidor de peptídeo CaMKII ou polinucleotídeo que codifica um inibidor de peptídeo CaMKII.
10. Método de tratamento de um indivíduo compreendendo uma mutação associada com uma arritmia cardíaca, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo um inibidor de CaMKII, inibidor de peptídeo CaMKII, análogo ou fragmento do mesmo, ou polinucleotídeo que codifica um inibidor de peptídeo CaMKII.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a mutação está em um canal de rianodina cardíaco (RYR2).
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a mutação é RYR2R4651I.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pelo fato de que o método inibe uma arritmia cardíaca.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado pelo fato de que o método inibe a taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica no indivíduo.
15. Método para caracterizar um cardiomiócito, o método caracterizado pelo fato de que compreende monitorar condução ou contração cardíaca usando um cardiomiócito derivado de células-tronco pluripotentes induzidas expressando um canal de rianodina cardíaco (RYR2) compreendendo uma mutação associada à CPVT.
16. Método de triagem de composto, o método caracterizado pelo fato de que compreende contatar um cardiomiócito derivado de células-tronco pluripotentes induzidas expressando um canal de rianodina cardíaco (RYR2) compreendendo uma mutação associada à CPVT com um agente candidato e medir a condução ou contração cardíaca na célula.
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