BR112019022957A2

BR112019022957A2 - métodos e composições para tratamento de distúrbios gastrointestinais inflamatórios

Info

Publication number: BR112019022957A2
Application number: BR112019022957A
Authority: BR
Inventors: Andrew Youngblood Bradford; Robert Bebbington Christopher; C Brock Emily; Tomasevic Nenad
Original assignee: Allakos Inc
Priority date: 2017-05-05
Filing date: 2018-05-04
Publication date: 2020-05-19
Also published as: MX2019013136A; AU2018263937A1; EP3618872A1; WO2018204871A1; KR20200015511A; CA3062430A1; US20200270344A1; IL270304A; IL270304B1; JP2020518645A; JP7346304B2; SG10202112259VA; ZA201907372B; SG11201910206QA; CN111246880A; EP3618872A4; JP2023099232A

Abstract

a presente invenção refere-se a métodos para o tratamento da doença inflamatória intestinal (ibd) ou um distúrbio gastrointestinal eosinofílico (egid), como a esofagite eosinofílica (eoe), gastrite eosi-nofílica (eg), gastroenterite eosinofílica (ege) e colite eosinofílica (ec). em particular, a presente invenção refere-se a métodos para o tratamento da ibd ou um egid através da administração de anticorpos que se ligam ao siglec-8 humano ou composições compreendendo os referidos anticorpos. a presente invenção também se refere a artigos de fabricação ou kits compreendendo anticorpos que se ligam ao siglec-8 humano para o tratamento da ibd ou um egid.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS GASTROINTESTINAIS INFLAMATÓRIOS.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente US provisório N° 62/502,480, depositado em 5 de maio de 2017, e ao Pedido de Patente N° 62/572,337, depositado em 13 de outubro de 2017, cujas descrições são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.

DEPÓSITO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIA EM ARQUIVO DE TEXTO ASCII

[002] O conteúdo do depósito a seguir em arquivo de texto ASCII é aqui incorporado por referência em sua totalidade: um formulário de leitura computador (CRF) da Listagem de Sequência (nome do arquivo: 701712000640SEQLIST.TXT, data registrada: 03 de maio de 2018, tamanho: 115 KB).

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção refere-se a métodos para tratamento de distúrbios inflamatórios gastrointestinais, por exemplo, doença inflamatória intestinal (IBD) ou um distúrbio gastrointestinal eosinofílico (EGID), por administração de anticorpos que se ligam à Siglec-8 humana e/ou composições compreendendo os referidos anticorpos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] Os distúrbios gastrointestinais representam um conjunto de doenças variadas e altamente problemáticas. Por exemplo, a IBD, que inclui várias formas de colite (por exemplo, colite ulcerativa) e a doença de Crohn, afeta aproximadamente 1 em 200 pessoas em países desenvolvidos, causando sintomas debilitantes e ao longo da vida (Cleynen, I. et al. (2016) Lancet 387:156-167). Só nos Estados Unidos,

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2/169 a carga financeira da IBD é estimada em mais de $ 2,2 bilhões de Dólares. As EGIDs também representam vários distúrbios distintos que são associados a sintomas gastrointestinais debilitantes e muitas vezes variados. Por exemplo, a esofagite eosinofílica (EOE) é considerada uma das causas mais comuns de problemas de alimentação em crianças e estima-se que afete 0,4% de todas as crianças e adultos nos países ocidentais (Furuta, G.T. e Katzka, D.A. (2015), l\l. Engl. J. Med. 373:1640-1648).

[005] As causas da inflamação que levam a patologias gastrointestinais ainda estão sendo exploradas. Os fatores que têm sido implicados incluem desequilíbrios entre as células Th1/Th17 e as células T reguladoras, resposta mucosal desregulada à flora intestinal comensal, respostas atípicas da Th2 e similares. Enquanto alguns tipos de disfunção de mastócitos e eosinófilos tenham sido associados a sintomas gastrointestinais (Kiwamoto, T. et al. (2012) Pharmacol. Ther. 135:327-336; Sokol, H. et al. (2013) J. Allergy Clin. Immunol. 132:866873), o envolvimento dos mastócitos na IBD foi proposto, porém ainda não estudado. Faltam evidências do tratamento da IBD em seres humanos usando moduladores da função dos mastócitos (Boeckxstaens, G. (2015) Curr. Opin. Pharmacol. 25:45-49).

[006] Há ainda a necessidade de novas abordagens terapêuticas que visem as doenças gastrointestinais inerentes à inflamação, como IBD e EGIDs.

[007] Todas as referências citadas neste documento, incluindo os pedidos de patente, publicações de patentes e a literatura científica, são aqui incorporadas por referência em sua totalidade, como se cada referência específica estivesse individualmente e especificamente indicada como incorporada por referência.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] Para atender a essa e outras necessidades, a presente

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3/169 invenção se refere, inter alia, a métodos de tratamento ou prevenção de distúrbios inflamatórios gastrointestinais, por exemplo, doença inflamatória intestinal (IBD) ou um distúrbio gastrointestinal eosinofílico (EGID; incluindo a esofagite eosinofílica (EOE), gastrite eosinofílica (GE), gastroenterite eosinofílica (EGE) e colite eosinofílica (CE)). A presente invenção se baseia, em parte, à surpreendente descoberta de que a terapia com anticorpo anti-Siglec-8 reduz a inflamação, a infiltração imune e a patologia da doença em vários modelos de camundongo da inflamação gastrointestinal (Gl) subjacente a esses distúrbios.

[009] Por conseguinte, alguns aspectos da presente invenção se referem a métodos para tratamento ou prevenção de distúrbios inflamatórios gastrointestinais em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana.

[0010] Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos de tratamento ou prevenção de distúrbios gastrointestinais eosinofílicos (EGID) em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana.

[0011] Em algumas formas de realização, o indivíduo tem IBD. Em algumas formas de realização, o indivíduo tem colite ulcerativa, colite colagenosa, colite linfocítica, doença de Crohn ou IBD colônica não classificada (IBD-U). Em algumas formas de realização, o indivíduo tem colite ulcerativa moderada a grave. Em algumas formas de realização, o indivíduo tem propagação da doença colônica entre cerca de 5 cm e cerca de 40 cm. Em algumas formas de realização, o indivíduo tem colite ulcerativa aguda. Em algumas formas de realização, o indivíduo tem doença de Crohn ileal, doença de Crohn colônica ou doença de Crohn ileocolônica. Em algumas formas de realização, antes da

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4/169 administração do anticorpo, o indivíduo obteve insucesso em uma terapia de primeira linha para colite ulcerativa ou doença de Crohn. Em algumas formas de realização, o indivíduo tem inflamação aumentada em pelo menos uma parte do trato gastrointestinal, em comparação a um indivíduo sem IBD ou um valor de referência. Em algumas formas de realização, o indivíduo tem um aumento do número de mastócitos, neutrófilos, eosinófilos, e/ou linfócitos em pelo menos uma parte do trato gastrointestinal, em comparação a um indivíduo sem IBD. Em algumas formas de realização, a biopsia do cólon do indivíduo mostra aumento da permeabilidade da mucosa, quando comparada ao obtido a partir de uma biópsia obtida do cólon de um indivíduo sem IBD ou um valor de referência. Em algumas formas de realização, uma amostra de urina obtida do indivíduo tem níveis aumentados de um ou mais dentre: Nmetil-histamina, leucotrienos e prostaglandinas, em comparação a uma amostra de urina obtida de um indivíduo sem IBD ou um valor de referência. Em algumas formas de realização, uma amostra de sangue obtida do indivíduo tem níveis aumentados de um ou mais dentre: IL-6, IL-8, TNFa, VEGF, PDGF e MCP-1, em comparação a uma amostra de sangue obtida de um indivíduo sem IBD ou um valor de referência. Em algumas formas de realização, um ou mais sintomas no indivíduo com IBD são reduzidos em comparação a um nível basal antes da administração da composição ou anticorpo. Em algumas formas de realização, um ou mais dentre diarréia, inchaço, náusea, dor abdominal, sangue nas fezes, frequência de fezes líquidas, abscessos abdominais ou pélvicos, fistulas, perda de peso, fadiga, febre, suores noturnos e retardo de crescimento no indivíduo são reduzidos em comparação ao nível basal antes administração da composição ou anticorpo.

[0012] Em algumas formas de realização, a composição ou anticorpo é administrado em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais para tratamento ou prevenção da IBD. Em

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5/169 algumas formas de realização, o um ou mais agentes terapêuticos para tratamento ou prevenção da IBD são selecionados dentre o grupo que consiste em sulfasalazina, azatioprina, mercaptopurina, ciclosporina, um corticosteróide, infliximabe, adalimumabe, etrolizumabe, golimumabe, metotrexato, natalizumabe, vedolizumabe, ustequinumabe, certolizumabe pegol e um antibiótico. Em algumas formas de realização, antes da administração do anticorpo, o indivíduo foi submetido a uma cirurgia para tratamento da IBD.

[0013] Em algumas formas de realização, o indivíduo tem um distúrbio gastrointestinal eosinofílico (EGID). Em algumas formas de realização, o indivíduo tem esofagite eosinofílica (EOE). Em algumas formas de realização, o indivíduo tem gastrite eosinofílica (EG). Em algumas formas de realização, o indivíduo tem um gastroenterite eosinofílica (EGE). Em algumas formas de realização, o indivíduo tem EGE e EG. Em algumas formas de realização, o indivíduo tem colite eosinofílica (EC). Em algumas formas de realização, o indivíduo tem infiltração eosinofílica aumentada em pelo menos uma parte do trato gastrointestinal, em comparação a um indivíduo sem EGID ou um valor de referência. Em algumas formas de realização, uma amostra obtida do trato gastrointestinal do indivíduo tem 15 ou mais eosinófilos por campo de alta potência (HPF). Em algumas formas de realização, uma amostra obtida do trato gastrointestinal do indivíduo tem uma média de 15 ou mais eosinófilos por campo de alta potência (HPF) em dois ou mais HPFs. Em algumas formas de realização, uma amostra obtida do trato gastrointestinal do indivíduo tem um pico da contagem de eosinófilos de 50 ou mais eosinófilos por campo de alta potência (HPF) em dois ou mais HPFs. Em algumas formas de realização, uma amostra de sangue periférico obtida do indivíduo tem 200 ou mais eosinófilos por μΙ_. Em algumas formas de realização, um ou mais sintomas no indivíduo com a EGID são reduzidos em comparação a um nível basal

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6/169 antes da administração do anticorpo. Em algumas formas de realização, um ou mais dentre dor abdominal, disfagia, impactação alimentar, vômito, azia, náusea, falha no crescimento, problemas de alimentação, dispepsia, perda de peso, diarréia, obstrução gastrointestinal, sangramento gastrointestinal, ascite, má absorção, anemia, enteropatia com perda de proteína, espessamento colônico e obstrução colônica no indivíduo são reduzidos em comparação ao nível basal antes da administração do anticorpo. Em algumas formas de realização, a eosinofilia periférica no indivíduo é reduzida em comparação a um nível basal antes da administração da composição ou anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-8 em que pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas de anticorpo é não fucosilada, como descrito neste documento).

[0014] Em algumas formas de realização de qualquer uma das formas de realização acima, a amostra é de uma biópsia gástrica. Em algumas formas de realização, o indivíduo tem eosinofilia no sangue periférico. Em algumas formas de realização, uma amostra (por exemplo, de uma biópsia gástrica) obtida do trato gastrointestinal do indivíduo tem pelo menos cinco campos de alta potência (HPFs) que têm, cada um, uma contagem de eosinófilos de 30 ou mais eosinófilos por HPF. Em algumas formas de realização, pelo menos cinco amostras obtidas do trato gastrointestinal do indivíduo têm, cada uma, uma contagem de eosinófilos de 30 ou mais eosinófilos por campo de alta potência (HPF). Em algumas formas de realização, as pelo menos cinco amostras são de biópsias gástricas. Em algumas formas de realização, uma amostra do sangue periférico obtida do indivíduo tem expressão aumentada de CCL2, em comparação a um valor de referência. Em algumas formas de realização, o número de eosinófilos por campo de alta potência (HPF) em uma amostra obtida do trato gastrointestinal do indivíduo é reduzido em comparação a um nível basal antes da

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7/169 administração da composição. Em algumas formas de realização, a amostra é de uma biópsia gástrica. Em algumas formas de realização, o indivíduo tem um aumento do número de mastócitos, neutrófilos, eosinófilos, e/ou linfócitos em pelo menos uma parte do trato gastrointestinal, em comparação a um indivíduo sem uma EGID.

[0015] Outros aspectos da presente invenção se referem a métodos para tratar ou prevenir um distúrbio gastrointestinal eosinofílico (EGID) em um indivíduo, compreendendo: (a) avaliar a expressão de CCL2em uma amostra de sangue periférico obtida do indivíduo; e (b) administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana se a expressão de CCL2 na amostra de sangue periférico for maior que um valor de referência. Outros aspectos da presente invenção se referem a métodos para seleção de um indivíduo para tratamento com uma composição compreendendo um anticorpo que se liga à Siglec-8, os métodos compreendendo: (a) avaliar a expressão de CCL2 em uma amostra de sangue periférico obtida do indivíduo; e (b) selecionar o indivíduo para tratamento com uma quantidade eficaz da composição se a expressão de CCL2 na amostra de sangue periférico for maior que um valor de referência. Outros aspectos da presente invenção se referem a métodos para avaliação da atividade e/ou farmacodinâmica de um tratamento com anticorpo anti-Siglec-8 em um indivíduo, os métodos compreendendo: (a) administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana; e (b) avaliar a expressão de CCL2 em uma amostra de sangue periférico obtida a partir do indivíduo, em que uma redução na expressão de CCL2 em relação a um nível basal antes da administração da composição indica atividade e/ou farmacodinâmica do tratamento com anticorpo anti-Siglec-8. Em algumas formas de realização, o indivíduo é um ser humano.

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[0016] Em algumas formas de realização, a composição ou anticorpo é administrado em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais para tratamento ou prevenção de uma EGID. Em algumas formas de realização, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais para tratamento ou prevenção do EGID são selecionados dentre o grupo que consiste em um corticosteroide, inibidor de leucotrienos, anti-histamina, cromoglicato de sódio, inibidor da bomba de prótons (PPI) e sulfassalazina.

[0017] Em algumas formas de realização de qualquer uma das formas de realização acima, a composição ou anticorpo é administrado por infusão endovenosa. Em algumas formas de realização de qualquer uma das formas de realização acima, a composição ou anticorpo é administrado por injeção ou infusão subcutânea.

[0018] Em algumas formas de realização dos métodos aqui descritos (por exemplo, acima), o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 63; e/ou em que a região variável da cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 66. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 6 e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre a SEQ ID N^Q: 16 ou 21. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende uma região Fc da cadeia pesada

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9/169 compreendendo a região Fc do IgG humano. Em algumas formas de realização, a região Fc do IgG humano compreende um IgG 1 humano. Em algumas formas de realização, a região Fc do IgG humano compreende um lgG4 humano. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 75 e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre a SEQ ID N^Q: 76 ou 77. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 67-70; e/ou em que a região variável da cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 71. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID N^QS: 11-14; e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 23-24. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 2-14; e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 16-24. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID N^QS: 2-10; e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo a

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10/169 sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 16-22. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende: (a) região variável da cadeia pesada compreendendo: (1) uma HC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 26-29; (2) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 61; (3) uma HC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 31-36; (4) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 62; (5) uma HC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 38-43; (6) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 63; e (7) uma HC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 45-46, e/ou (b) uma região variável da cadeia leve compreendendo: (1) uma LC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 48-49; (2) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q:64; (3) uma LC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 51-53; (4) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 65; (5) uma LC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^2S: 55-58; (6) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 66; e (7) uma LC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 60. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende: (a) região variável da cadeia pesada compreendendo: (1) uma HC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 26; (2) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 61; (3) uma HC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 34; (4) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 62; (5) uma HC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da

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SEQ ID N^Q: 38; (6) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 63; e (7) uma HC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 45, e/ou (b) uma região variável da cadeia leve compreendendo: (1) uma LC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID N^Q: 48; (2) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 64; (3) uma LC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 51; (4) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 65; (5) uma LC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 55; (6) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 66; e (7) uma LC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 60. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende: (a) região variável da cadeia pesada compreendendo: (1) uma HC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 26; (2) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 61; (3) uma HC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 34; (4) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 62; (5) uma HC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 38; (6) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 63; e (7) uma HC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 45, e/ou (b) uma região variável da cadeia leve compreendendo: (1) uma LC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID N^Q: 48; (2) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 64; (3) uma LC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 51; (4) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 65; (5) uma LC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 58; (6) uma HVR-L3 compreendendo a

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12/169 sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 66; e (7) uma LC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 60. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende: uma região variável da cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 88, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 91 e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 94 e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 97, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 100, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 103; uma região variável da cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 89, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 92, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 95; e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 98, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 101, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q:104; ou uma região variável da cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 90, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 93, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 96; e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 99, (ii) a HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 102, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 105. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende: uma região variável da cadeia pesada compreendendo a

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13/169 sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 106; e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 109; uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 107; e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 110; ou uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 108; e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 111. Em algumas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo lgG1. Em algumas formas de realização, o anticorpo foi engenheirado para melhorar a atividade da citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC). Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos na região Fc que melhora a atividade da ADCC. Em algumas formas de realização, pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo é não fucosilada. Em algumas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende um fragmento de anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em fragmentos Fab, Fab'SH, Fv, scFv e (FAB')₂.

[0019] Em algumas formas de realização dos métodos descritos aqui (por exemplo, acima), o anticorpo compreende uma região Fc e cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeo ligadas à região Fc, em que menos de 50% das cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeo do anticorpo na composição contêm um resíduo de fucose. Em algumas formas de realização, praticamente nenhuma das cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeo do anticorpo na composição contém um resíduo de fucose. Em algumas formas de realização, o anticorpo

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14/169 se liga a uma Siglec-8 humana e a uma Siglec-8 não humana de primata. Em algumas formas de realização, o primata não humano é um babuíno. Em algumas formas de realização, o anticorpo se liga a um epítopo no Domínio 1 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 112. Em algumas formas de realização, o anticorpo se liga a um epítopo no Domínio 3 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 114. Em algumas formas de realização, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo 4F11. Em algumas formas de realização, o anticorpo se liga a um epítopo no Domínio 2 ou Domínio 3 da Siglec-8 humana. Em algumas formas de realização, o Domínio 2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 113. Em algumas formas de realização, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo 1C3. Em algumas formas de realização, o Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 114. Em algumas formas de realização, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo 1H10. Em algumas formas de realização, o anticorpo se liga a um epítopo no Domínio 1 da Siglec-8 humana e compete com o anticorpo 4F11 pela ligação à Siglec-8. Em algumas formas de realização, o anticorpo não compete com anticorpo 2E2 pela ligação à Siglec-8. Em algumas formas de realização, o anticorpo não é o anticorpo 2E2. Em algumas formas de realização, o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 112. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende uma região Fc da cadeia pesada compreendendo a região Fc do IgG humano. Em algumas formas de realização, a região Fc do IgG humano compreende uma região Fc do lgG1 humano. Em algumas formas de realização, a região Fc do lgG1 humano é não fucosilada. Em algumas formas de realização, a região Fc do IgG humano compreende uma região Fc do lgG4 humano. Em algumas formas de realização, a região Fc lgG4

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15/169 compreende a substituição de aminoácido S228P, em que os resíduos de aminoácidos são numerados de acordo com o índice europeu (EU) como em Kabat. Em algumas formas de realização, o anticorpo esgota eosinófilos no sangue e/ou inibe a ativação de mastócitos.

[0020] Em algumas formas de realização dos métodos descritos neste documento (por exemplo, acima), o indivíduo é um ser humano. Em algumas formas de realização, o anticorpo está em uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) compreendendo o anticorpo e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0021] Outros aspectos da presente invenção se referem a um artigo de fabricação compreendendo um medicamento compreendendo um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana e um folheto compreendendo instruções para administração do medicamento a um indivíduo em sua necessidade, de acordo com qualquer uma das formas de realização acima.

[0022] Deve ser entendido que uma, algumas ou todas as propriedades das várias formas de realização aqui descritas podem ser combinadas para formar outras formas de realização da presente invenção. Esses e outros aspectos da presente invenção se tornarão aparentes para os versados na técnica. Essas e outras formas de realização da presente invenção são ainda descritas pela descrição detalhada a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0023] A Figura 1A apresenta um diagrama esquemático de um estudo que examina os efeitos do tratamento com anticorpo anti-Siglec8 em um modelo de camundongo induzido com dextrano sulfato de sódio (DSS) da IBD.

[0024] A Figura 1B mostra que o tratamento com o anticorpo antiSiglec-8 previne a perda de peso induzida por DSS. A variação percentual do peso corporal em comparação ao dia 0 é mostrada para

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16/169 camundongos que receberam água potável normal (círculos) ou expostos ad libitum a DSS a 3,5% por 5 dias, seguido de água potável normal por 4 dias, de acordo com o cronograma apresentado na Figura 1A. Os camundongos expostos a DSS a 3,5% foram tratados com uma dose intraperitoneal (IP) de anticorpo monoclonal anti-Siglec-8 (triângulos) ou anticorpo de controle de isotipo (quadrados), começando no dia 2. * p < 0,05 Controle de isotipo versus água comum; # p < 0,05 Isotipo versus anti-Siglec-8. As estatísticas foram geradas usando o teste t bicaudal não emparelhado; as médias do grupo são plotadas +/SEM.

[0025] A Figura 2 mostra que o tratamento com o anticorpo antiSiglec-8 melhora o índice de atividade da doença (DAI) no modelo da IBD de camundongo induzida por DSS. Os grupos de teste e esquema de tratamento foram conforme descrito acima em referência às Figuras 1A e 1B. A perda de peso, consistência das fezes e sangue visível nas fezes foram pontuados em uma escala de 0 - 4 por gravidade das categorias mencionadas acima. * p < 0,05 Controle de isotipo versus água comum; # p < 0,05 Isotipo versus anti-Siglec-8. As estatísticas foram geradas usando o teste t bicaudal não emparelhado; as médias do grupo são plotadas +/- SEM.

[0026] A Figura 3 mostra que o tratamento com o anticorpo antiSiglec-8 reduziu significativamente o aumento de peso do cólon no modelo de camundongo induzido por DSS da IBD. Os grupos de teste e esquema de tratamento foram conforme descrito acima em referência às Figuras 1A e 1B. As estatísticas foram geradas usando o teste t Mann-Whitney, os pesos do cólon para os animais individuais são plotados +/- SD. Os pesos do cólon foram medidos no dia 9 ao final do estudo.

[0027] A Figura 4 mostra que o tratamento com o anticorpo antiSiglec-8 diminuiu a infiltração de células imunes no modelo de

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17/169 camundongo induzido por DSS da IBD. Os grupos de teste e esquema de tratamento foram conforme descrito acima em referência às Figuras 1A e 1B. No dia 5 após a exposição ao DSS, os camundongos foram analisados quanto à infiltração de células imunes na lâmina própria do cólon usando a citometria de fluxo. As estratégias de marcação de células imunes para citometria de fluxo são as seguintes: neutrófilos (CD45+ 7DAA- Ly6G+ CD11 b+); monócitos recrutados (CD45+ 7DAACD11b+ Ly6G- F480+ Ly6C+) e macrófagos residentes (CD45+ 7DAACD11b+ Ly6G- F480+ Ly6C-). As estatísticas foram geradas usando o teste t de Mann-Whitney. Os animais individuais são plotados em % do CD45+ leucócitos viáveis +/- SD.

[0028] A Figura 5A apresenta um diagrama esquemático de um estudo que examina os efeitos do tratamento com anticorpo anti-Siglec8 sobre o modelo de camundongo de gastroenterite eosinofílica (EGE). [0029] A Figura 5B mostra os efeitos do tratamento com anticorpo anti-Siglec-8 sobre eosinófilos sanguíneos, eosinófilos teciduais no intestino delgado e mastócitos teciduais no intestino delgado do modelo EGE de camundongo. * = p < 0,05; ** = p < 0,01; as estatísticas foram geradas usando um teste t de Mann Whitney. Os grupos são plotados +/- SEM (n=6-7 camundongos/grupo). As estratégias de marcação de células imunes para a citometria de fluxo são como a seguir: eosinófilos (CD45+ 7DAA- Ly6G- CD11b+ Siglec-F+); mastócitos (CD45+ 7AADCD117+ lgER+).

[0030] A Figura 6A mostra o projeto de estudo para testes da atividade anti-Siglec-8 em um modelo de camundongo de gastrite eosinofílica (EG) e gastroenterite (EGE).

[0031] A Figura 6B mostra a estratégia de marcação da citometria de fluxo no tecido do estômago para eosinófilos. Os eosinófilos foram marcados como CD45+ 7AAD- Lin- (CD3, CD4, CD8, CD19, TER119, CD5) Ly6G- CD11b+ Siglec-F+ CCR3+. Os eosinófilos no tecido do

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18/169 estômago marcados positivos para Siglec-8, em comparação à fluorescência menos um (FMO), conforme indicado por setas.

[0032] A Figura 6C mostra a estratégia de marcação da citometria de fluxo no tecido do estômago para mastócitos. Os mastócitos foram marcados como CD45+ 7DAA- Lin-, CD117+ lgER^Mid. Os mastócitos no tecido do estômago marcados positivos para Siglec-8, em comparação à fluorescência menos um (FMO), conforme indicado por setas.

[0033] As Figuras 7A e 7B mostram a quantificação de eosinófilos por citometria de fluxo no estômago (Figura 7A) e intestino delgado (Figura 7B) no encerramento do estudo no dia 39. * P < 0,05 n=6-8 camundongos/grupo.

[0034] A Figura 8 mostra gráficos da citometria de fluxo de eosinófilos nos linfonodos mesentéricos (MLNs) no controle falso, controle OVA + isotipo ou camundongos tratados com OVA + antiSiglec-8.

[0035] As Figuras 9A e 9B mostram a quantificação de eosinófilos por citometria de fluxo no MLN (Figura 9A) e sangue (Figura 9B) no encerramento do estudo no dia 39. * P < 0,05 **p < 0,01 n=6-8 camundongos/grupo.

[0036] A Figura 10 mostra gráficos da citometria de fluxo de mastócitos no estômago em controle falso, controle OVA + isotipo ou camundongos tratados com OVA + anti-Siglec-8.

[0037] As Figuras 11A-11C mostram a quantificação de mastócitos por citometria de fluxo no estômago (Figura 11 A) e intestino delgado (Figura 11B) e MLNs (Figura 11C) no encerramento do estudo no dia 39. * P < 0,05 **p < 0,01 n=6-8 camundongos/grupo.

[0038] As Figuras 12A-12E mostram a análise da expressão gênica qPCR de mediadores inflamatórios envolvidos no recrutamento de mastócitos e eosinófilos no tecido do intestino delgado. São mostradas as expressões do MCPT1 (Figura 12A), MBP (Figura 12B), CCL5

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19/169 (Figura 12C), CCL2 (Figura 12D) e CCL17 (Figura 12E). * P < 0,05 **p < 0,01 n=6-8 camundongos/grupo. Abrev: MCPT1: protease de mastócitos-1; MBP: proteína básica principal; CCL: ligante da quimiocina (motivo c-c).

[0039] As Figuras 13A-13C mostram a concentração de CCL2 (Figura 13A), CXCL1/KC (Figura 13B) e OVA-lgE (Figura 13C) no soro de controle e camundongos tratados com OVA no encerramento do estudo no dia 39. * P < 0,05 n=6-8 camundongos/grupo. Abrev: CCL2: ligante da quimiocina (motivo c-c); CXCL1: quimiocina (motivo c-x-c)-1. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

I. DEFINIÇÕES

[0040] Deve ser entendido que a presente invenção não é limitada a determinadas composições ou sistemas biológicos, que podem, evidentemente, variar. Também deve ser entendido que a terminologia aqui usada tem a finalidade de descrever as formas de realização particulares apenas, e não deve ser considerada limitante da presente invenção. Como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares uma, uma e o, a incluem as referências plurais, a menos que o contexto determine claramente o contrário. Assim, por exemplo, referência a uma molécula opcionalmente inclui uma combinação de duas ou mais dessas moléculas, e similares.

[0041] O termo cerca de, como aqui usado, se refere ao intervalo de erro habitual para o respectivo valor facilmente conhecido para o versado na técnica neste campo técnico. A referência a cerca de um valor ou parâmetro aqui inclui (e descreve) formas de realização que se referem a esse próprio valor ou parâmetro.

[0042] Deve ser entendido que os aspectos e formas de realização da presente invenção incluem compreender, consistir e consistir essencialmente em aspectos e formas de realização.

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[0043] O termo anticorpo inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos com comprimento total que possuem uma região Fc da imunoglobulina), composições de anticorpos com especificidade poliepitópica, anticorpos multispecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos, diacorpos e moléculas de cadeia única), bem como os fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, F(ab')2 e Fv). O termo imunoglobulina (Ig) é usado alternadamente com anticorpo neste documento.

[0044] A unidade básica de anticorpo de 4 cadeias é uma glicoproteína heterotetramérica composta de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Um anticorpo IgM consiste em 5 das unidades básicas de heterotetrâmero, juntamente com um polipeptídeo adicional chamado uma cadeia J, e contém 10 sítios de ligação ao antígeno, enquanto os anticorpos IgA compreendem de 2-5 das unidades básicas de 4 cadeias que podem polimerizar para formar conjuntos polivalentes em combinação com a cadeia J. No caso de IgGs, a unidade de 4 cadeias tem geralmente cerca de 150.000 Daltons. Cada cadeia L é ligada a uma cadeia H por uma ligação bissulfeto covalente, enquanto as duas cadeias H são ligadas entre si por uma ou mais ligações bissulfeto, dependendo do isotipo da cadeia H. Cada cadeia H e L também tem ligações bissulfeto intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia H tem, no N-terminal, um domínio variável (Vh) seguido por três domínios constantes (Ch) para cada uma das cadeias α e γ e quatro domínios Ch para os ίεοίίροεμ ε e □ . Cada cadeia L tem, no N-terminal, um domínio variável (Vl) seguido de um domínio constante em sua outra extremidade. O Vl é alinhado ao Vh e o Cl é alinhado ao primeiro domínio constante da cadeia pesada (Ch1). Acredita-se que os resíduos de aminoácidos especiais formam uma interface entre os domínios variáveis da cadeia leve e cadeia pesada. O emparelhamento de um Vh e Vl em conjunto forma um único

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21/169 sítio de ligação ao antígeno. Para a estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos, veja, por exemplo, Basic and Clinicai Immunology, 8- Edição, Daniel P. Sties, Abba I. Terr e Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 e capítulo 6.

[0045] A cadeia L de qualquer espécie de vertebrados pode ser atribuída a um de dois tipos claramente distintos, chamados kappa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes ou isotipos. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, com as cadeias pesadas designadas α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. E as classes γ α são divididas em subclasses com base em diferenças relativamente pequenas na sequência e função da CH, por exemplo, os seres humanos expressam as seguintes subclasses: lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2. Os anticorpos lgG1 podem existir em várias variantes polimórficas denominadas alotipos (revisado em Jefferis e Lefranc 2009. mAbs Vol. 1 edição 4 1-7), que são adequados para uso na presente invenção. As variantes alotípicas comuns em populações humanas são aquelas designadas pelas letras a, f, n, z.

[0046] Um anticorpo isolado é aquele que foi identificado, separado e/ou recuperado a partir de um componente de seu ambiente de produção (por exemplo, de forma natural ou recombinante). Em algumas formas de realização, o polipeptídeo isolado é livre de associação com todos os outros componentes de seu ambiente de produção. Os componentes contaminantes de seu ambiente de produção, como aqueles resultantes de células recombinantes transfectadas, são materiais que normalmente interferiríam com a investigação, diagnóstico ou usos terapêuticos para o anticorpo, e

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22/169 podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteicos ou não proteicos. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo é purificado: (1) a mais de 95% em peso do anticorpo como determinado, por exemplo, pelo método de Lowry e, em algumas formas de realização, a mais de 99% em peso; (1) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna pelo uso de um seqüenciador de copo giratório, ou (3) para homogeneidade por SDS-PAGE sob condições de redução ou não redução usando azul de Coomassie ou mancha de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes, visto que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Normalmente, no entanto, um polipeptídeo ou anticorpo isolado é preparado por pelo menos uma etapa de purificação. [0047] O termo anticorpo monoclonal, como usado neste documento, se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compõem a população são idênticos, exceto para possíveis mutações de ocorrência natural e/ou modificações póstradução (por exemplo, isomerizações, amidações) que podem estar presentes em pequenas quantidades. Em algumas formas de realização, os anticorpos monoclonais têm uma divagem C-terminal na cadeia pesada e/ou cadeia leve. Por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoácidos são clivados no C-terminal da cadeia pesada e/ou cadeia leve. Em algumas formas de realização, a divagem C-terminal remove uma lisina C-terminal da cadeia pesada. Em algumas formas de realização, os anticorpos monoclonais têm uma divagem N-terminal na cadeia pesada e/ou cadeia leve. Por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoácidos são clivados no N-terminal da cadeia pesada e/ou cadeia leve. Em algumas formas de realização, os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidas contra um único

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23/169 sítio antigênico. Em algumas formas de realização, os anticorpos monoclonais são altamente específicos, dirigidos contra vários sítios antigênicos (como um anticorpo biespecífico ou um anticorpo multiespecífico). O modificador monoclonal indica a natureza do anticorpo, como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como exigindo a produção dos anticorpos por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados em conformidade com a presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método do hibridoma, métodos de DNA recombinante, tecnologias de exibição de fagos (phage display) e tecnologias para produção de anticorpos humanos ou similares a humanos em animais que tenham partes ou todos os loci da imunoglobulina humana ou genes que codificam as sequências da imunoglobulina humana.

[0048] O termo anticorpo nu se refere a um anticorpo que não é conjugado a uma porção citotóxica ou radiomarcador.

[0049] Os termos anticorpo de comprimento total, anticorpo intacto ou anticorpo inteiro são usados alternadamente para referência a um anticorpo em sua forma substancialmente intacta, em oposição a um fragmento de anticorpo. Os anticorpos inteiros especificamente incluem aqueles com cadeias pesada e leve, incluindo uma região Fc. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, os domínios constantes da sequência nativa humana) ou suas variantes da sequência de aminoácidos. Em alguns casos, o anticorpo intacto pode ter uma ou mais funções efetoras.

[0050] Um fragmento de anticorpo compreende uma porção de um anticorpo intacto, a região de ligação ao antígeno e/ou a região variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos

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24/169 incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (veja a Patente US N° 5.641.870, Exemplo 2; Zapata et at., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); single-chain antibody molecules and multispecific antibodies formed from antibody fragments.

[0051] A digestão da papaína de anticorpos produziu dois fragmentos idênticos de ligação ao antígeno, chamados fragmentos Fab, e um fragmento Fc residual, cuja designação reflete a capacidade de cristalizar-se prontamente. O fragmento Fab consiste em uma cadeia L inteira junto com o domínio da região variável da cadeia H (Vh), e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (Ch1). Cada fragmento Fab é monovalente com respeito à ligação ao antígeno, ou seja, tem um único sítio de ligação ao antígeno. O tratamento com pepsina de um anticorpo produz um único fragmento F(ab')2 grande que corresponde em geral a dois fragmentos Fab com ligação bissulfeto tendo diferente atividade de ligação ao antígeno e ainda é capaz de reticulação do antígeno. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos FAB por terem resíduos adicionais no C-terminal carbóxi do domínio Ch1 domain, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para Fab', em que o(s) resíduo(s) cisteína dos domínios constantes portam um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas da dobradiça entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.

[0052] O fragmento Fc compreende as partes carbóxi-terminais de ambas as cadeias H unidas por dissulfetos. As funções efetoras dos anticorpos são determinadas pelas sequências na região Fc, a região que também é reconhecida pelos receptores Fc (FcR) encontrados em alguns tipos de células.

[0053] Fv é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio

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25/169 completo de reconhecimento e de ligação ao antígeno. Esse fragmento consiste em um dímero de um domínio da região variável de uma cadeia pesada e de uma cadeia leve em estreita associação não covalente. A partir da dobragem desses dois domínios, emanam seis loops hipervariáveis (3 loops cada das cadeias H e L) que contribuem com os resíduos de aminoácidos para ligação ao antígeno e conferem ao anticorpo a especificidade de ligação ao antígeno. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de uma Fv compreendendo apenas três HVRs específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecimento e ligação ao antígeno, embora a uma menor afinidade do que todo o sítio de ligação.

[0054] Fv de cadeia única também abreviada como sFv ou scFv são fragmentos de anticorpos que compreendem os domínios de anticorpos VH e VL ligados a uma única cadeia polipeptídica. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo sFv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios Vne Vl, o que permite à sFv formar a estrutura desejada para ligação ao antígeno. Para uma revisão do sFv, veja Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, páginas 269-315 (1994).

[0055] Fragmentos funcionais dos anticorpos da presente invenção compreendem uma parte de um anticorpo intacto, geralmente incluindo a região variável ou de ligação ao antígeno do anticorpo intacto ou a região Fv de um anticorpo que tem a capacidade de ligação a FcR original ou modificada. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem anticorpo linear, moléculas de anticorpos de cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

[0056] Os anticorpos monoclonais aqui incluem especificamente anticorpos quiméricos (imunoglobulinas), em que uma parte da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes

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26/169 em anticorpos derivados de uma determinada espécie ou pertencentes a uma determinada classe ou subclasse de anticorpos, enquanto a(s) outra(s) cadeia(s) é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos desses anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada (Pattente US N° 4.816.567; Morrison et at., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 81:6851-6855 (1984)). Os anticorpos quiméricos de interesse neste documento incluem os anticorpos PRIMATIZED®, em que a região de ligação ao antígeno do anticorpo é derivada de um anticorpo produzido, por exemplo, por imunização de macacos do gênero Macaca com um antígeno de interesse. Neste documento, anticorpo humanizado é usado como um subconjunto de anticorpos quiméricos.

[0057] Formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm a sequência mínima derivada da imunoglobulina não humana. Em uma forma de realização, um anticorpo humanizado é uma imunoglobulina humana (anticorpo receptor) em que os resíduos de uma HVR do receptor são substituídos por resíduos de uma HVR de uma espécie não humana (anticorpo doador), como camundongo, rato, coelho ou primatas não humanos com a especificidade, afinidade e/ou capacidade desejada. Em alguns casos, resíduos da FR da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações podem ser feitas para aperfeiçoar o desempenho de anticorpos, tal como a afinidade de ligação. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e geralmente dois, domínios variáveis, em que todos ou

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27/169 substancialmente todos os loops hipervariáveis correspondem àqueles de uma sequência de imunoglobulina não humana, e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência da imunoglobulina humana, embora as regiões FR possam incluir uma ou mais substituições individuais de resíduos da FR que melhoram o desempenho do anticorpos, como a afinidade de ligação, isomerização, imunogenicidade, etc. Em algumas formas de realização, o número dessas substituições de aminoácidos na RF não é maior que 6 na cadeia H, e, na cadeia L, não é maior que 3. O anticorpo humanizado opcionalmente compreenderá também pelo menos uma parte de uma região constante da imunoglobulina (Fc), normalmente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, veja, por exemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Veja também, por exemplo, Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); e a Patente US N° 6.982.321 e 7.087.409. Em algumas formas de realização, os anticorpos humanizados são direcionados a um único sítio antigênico. Em algumas formas de realização, os anticorpos humanizados são direcionados a vários sítios antigênicos. Um método de humanização alternativo é descrito na Patente US N° 7.981.843 e Publicação de Pedido de Patente US N^Q 2006/0134098.

[0058] A região variável ou domínio variável de um anticorpo se refere aos domínios amino-terminais da cadeia pesada ou leve do anticorpo. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve podem ser referidos como VH e VL, respectivamente. Esses domínios são geralmente as partes mais variáveis do anticorpo (em relação a outros anticorpos da mesma classe) e contêm os sítios de ligação ao antígeno.

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[0059] O termo região hipervariável, HVR ou HR, quando usado neste documento, se refere às regiões de um domínio variável do anticorpo que são hipervariáveis em sequência e/ou formam loops estruturalmente definidos. Geralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs; três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). Em anticorpos nativos, H3 e L3 exibem a maior diversidade das seis HVRs, e acredita-se que a H3, em particular, desempenhe um papel único na atribuição de especificidade fina a anticorpos. Veja, por exemplo, Xu et al. Imunidade 13:37-45 (2000); Johnson e Wu em Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). De fato, os anticorpos camelídeos de ocorrência natural que consistem em apenas uma cadeia pesada são funcionais e estáveis na ausência da cadeia leve. Veja, por exemplo, Hamers-Casterman etal., Nature 363:446-448 (1993) e XERIFE etal., Natureza Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

[0060] Várias definições da HVR estão em uso e são abrangidas por este documento. As HVRs, que são regiões determinantes da complementaridade (CDRs) de Kabat, se baseiam na variabilidade da sequência e são comumente as mais usadas (kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^a ed. Serviço de Saúde Pública, Instituto Nacional de Saúde, Bethesda, MD (1991)). HVRs de Chothia se referem, inversamente, ao local dos loops estruturais (Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). As HVRs de contato se baseiam em uma análise das complexas estruturas de cristais disponíveis. Os resíduos de cada uma dessas HVRs são indicados a seguir.

Loop	Kabat	Chothia	Contato
L1	L24-L34	L26-L34	L30-L36
L2	L50-L56	L50-L56	L46-L55
L3	L89-L97	L91-L96	L89-L96
H1	H31-H35B	H26-H32	H30-H35B (Numeração de Kabat)
H1	H31-H35	H26-H32	H30-H35 (Numeração de Chothia)
H2	H50-H65	H53-H56	H47-H58
H3	H95-H102	H95-H102	H93-H101

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[0061] A menos que indicado de outra forma, os resíduos do domínio variável (resíduos da HVR e resíduos da região framework) são numerados de acordo com Kabat etaL, acima.

[0062] Resíduos da framework ou FR são os resíduos do domínio variável diferentes dos resíduos HVR como aqui definidos.

[0063] A expressão numeração de resíduos do domínio variável como em Kabat ou numeração da posição de aminoácidos como em Kabat, e suas variações, se refere ao sistema de numeração usado para domínios variáveis da cadeia pesada ou domínios variáveis da cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat etaL, acima. Usando esse sistema de numeração, a sequência linear de aminoácidos real pode conter menos ou mais aminoácidos correspondentes a um encurtamento de, ou inserção em, uma FR ou HVR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável da cadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (o resíduo 52a, de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, os resíduos 82a, 82b e 82c, etc, de acordo com Kabat) após o resíduo 82 da FR na cadeia pesada. A numeração Kabat de resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo por alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada Kabat padrão. [0064] Uma framework humana receptora, para as finalidades deste documento, é uma framework compreendendo a sequência de aminoácidos de uma framework da VL ou VH derivada de uma framework da imunoglobulina humana ou uma framework consenso humana. Uma framework humana receptora derivada de uma framework da imunoglobulina humana ou uma framework consenso humana pode compreender a sua mesma sequência de aminoácidos, ou pode conter alterações nas sequências de aminoácidos preexistentes. Em algumas formas de realização, o número de alterações de aminoácidos pre-existentes é de 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou

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30/169 menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, ou 2 ou menos.

[0065] O percentual (%) de identidade da sequência de aminoácidos em relação a uma sequência de polipeptídeos de referência é definido como o percentual de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência de polipeptídeos de referência, após alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para obter a identidade de sequência percentual máxima, e sem considerar quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação da identidade de sequência de aminoácidos percentual pode ser obtido de várias formas que estão dentro do conhecimento na técnica, por exemplo, usando software de computador disponível publicamente, como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Uma pessoa com habilidades na técnica pode determinar parâmetros adequados para o alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para obter o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências em comparação. Por exemplo, o % de identidade da sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A para, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (que também pode ser expresso como uma determinada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende um determinado % de identidade da sequência de aminoácidos para, com ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B) é calculado do seguinte modo:

100 vezes a fração X/Y em que X é o número de resíduos de aminoácidos marcados como idênticos pela sequência nesse alinhamento do programa de A e B, e em que Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Será

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31/169 apreciado que, nos casos em que o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, o % de identidade da sequência de aminoácidos de A para B não será igual a % de identidade da sequência de aminoácidos de B para A.

[0066] Um anticorpo que se liga a, se liga especificamente a ou é específico para um determinado um polipeptídeo ou um epítopo em um determinado polipeptídeo é aquele que se liga a esse polipeptídeo ou epítopo particular em um polipeptídeo particular substancialmente sem ligação a qualquer outro polipeptídeo ou epítopo de polipeptídeo. Em algumas formas de realização, a ligação de um anticorpo antiSiglec-8 aqui descrito (por exemplo, um anticorpo que se liga ao Siglec8 humano) a um polipeptídeo não Siglec-8 não relacionado é menor do que cerca de 10% do anticorpo que se liga à Siglec-8, como medido pelos métodos conhecidos na técnica (por exemplo, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Em algumas formas de realização, um anticorpo que se liga a um Siglec-8 (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) tem uma constante de dissociação (Kd) < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 2 nM, < 1 nM, < 0,7 nM, < 0,6 nM, < 0,5 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou < 0,001 nM (por exemplo, 10^-8 M ou menos, por exemplo de 10^-8 M a 10^-13 M, por exemplo de 10^-9M a 10’¹³ M).

[0067] O termo anticorpo anti-Siglec-8 ou um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana se refere a um anticorpo que se liga a um polipeptídeo ou um epítopo da Siglec-8 humana substancialmente sem ligação a qualquer outro polipeptídeo ou epítopo de um polipeptídeo não Siglec-8 não relacionado.

[0068] O termo Siglec-8, conforme usado neste documento, se refere a uma proteína Siglec-8 humana. O termo também inclui

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32/169 variantes de ocorrência natural da Siglec-8, incluindo variantes de splicing ou variantes alélicas. A sequência de aminoácidos de uma Siglec-8 humana exemplificativa é mostrada na SEQ ID N^Q: 72. A sequência de aminoácidos de outra Siglec-8 humana exemplificativa é mostrada na SEQ ID N^Q: 73. Em algumas formas de realização, uma proteína Siglec-8 humana compreende o domínio extracelular da Siglec8 fundido a uma região Fc da imunoglobulina. A sequência de aminoácidos de um domínio extracelular da Siglec-8 humana exemplificativa é mostrada na SEQ ID N^Q: 74. A sequência de aminoácidos sublinhada na SEQ ID N^Q: 74 indica a região Fc da sequência de aminoácidos da proteína de fusão Siglec-8 Fc.

[0069] Sequência de Aminoácidos da Siqlec-8 Humana

GYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAGDRPYQDA PVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKGSYFFRLERG SMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGTLESGHSRNLTCSVPWAC KQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGV TTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFQGDATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAV NSNPPARLSWTRGSLTLCPSRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQ HISLSLSLQNEGTGTSRPVSQVTLAAVGGAGATALAFLSFCIIFIIVRSCRK KSARPAAGVGDTGMEDAKAIRGSASQGPLTESWKDGNPLKKPPPAVAPSSGE EGELHYATLSFHKVKPQDPQGQEATDSEYSEIKIHKRETAETQACLRNHNPS SKEVRG (SEQ ID N°: 72)

[0070] Sequência de Aminoácidos da Siqlec-8 Humana

GYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAGDRPYQDA PVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKGSYFFRLERG SMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGTLESGHPRNLTCSVPWAC KQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGV TTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFQGDATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAV NSNPPARLSWTRGSLTLCPSRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQ HISLSLSLQNEGTGTSRPVSQVTLAAVGGAGATALAFLSFCIIFIIVRSCRK KSARPAAGVGDTGMEDAKAIRGSASQGPLTESWKDGNPLKKPPPAVAPSSGE EGELHYATLSFHKVKPQDPQGQEATDSEYSEIKIHKRETAETQACLRNHNPS SKEVRG (SEQ ID N°: 73)

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[0071 ] Sequência de Aminoácidos da Proteína de Fusão Siqlec-8

Fc

GYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAGDRPYQDA PVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKGSYFFRLERG SMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGTLESGHSRNLTCSVPWAC KQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGV TTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFQGDATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAV NSNPPARLSWTRGSLTLCPSRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQ HISLSLSLQNEGTGTSRPVS QVT LAAVGGIEGRSDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K (SEQ ID N°: 74)

[0072] Os anticorpos que induzem a apoptose ou são apoptóticos são aqueles que induzem a morte celular programada, conforme determinado pelos ensaios de apoptose padrão, como a ligação da anexina V, fragmentação do DNA, encolhimento de células, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação de células e/ou a formação de vesículas de membrana (chamadas corpos apoptóticos). Por exemplo, a atividade apoptótica dos anticorpos anti-Siglec-8 (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) da presente invenção pode ser mostrada por coloração das células com anexina V. [0073] As funções efetoras do anticorpo se referem às atividades biológicas que podem ser atribuídas à região Fc (uma região Fc da sequência nativa ou região Fc da sequência de aminoácidos variante) de um anticorpo, e variam de acordo com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras do anticorpo incluem: ligação ao C1q e citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores da superfície celular (por exemplo, receptores de células B); e ativação de células B. [0074] A citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo ou ADCC se refere a uma forma de citotoxicidade em que o Ig secretado ligado a receptores Fc (FcRs) presentes em algumas

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34/169 células citotóxicas (por exemplo, células exterminadoras naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) ativam essas células efetoras citotóxicas para se ligarem especificamente a uma célula-alvo portando antígeno e, em seguida, matar a célula-alvo com citotoxinas. Os anticorpos armam as células citotóxicas e são necessários para matar a célula-alvo por esse mecanismo. As células primárias para mediação da ADCC, as células NK, expressam FcyRIII apenas, ao passo que os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão do Fc em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3, página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec8 humana) aqui descrito melhora a ADCC. Para avaliar a atividade da ADCC de uma molécula de interesse, pode ser realizado um ensaio ADCC in vitro, como o descrito na Patente US n° 5,500,362 ou 5,821,337. As células efetoras úteis para ensaios desse tipo incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células exterminadoras naturais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade da ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal como aquele descrito em Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998). Outras variantes do Fc que alteram a atividade da ADCC e outras propriedades de anticorpos incluem aquelas divulgados por Ghetie et al., Nat Biotech. 15:637-40, 1997; Duncan et al, Nature 332:563-564, 1988; Lund et al., J. Immunol 147:2657-2662, 1991; Lund et al, Mol Immunol 29:53-59, 1992; Alegre et al, Transplantation 57:1537-1543, 1994; Hutchins et al., Proc Natl. Acad Sei EUA 92:11980-11984, 1995; Jefferis et al, Immunol Lett. 44:111 -117, 1995; Lund et al., FASEB J9:115-119, 1995; Jefferis et al, Immunol Lett 54:101 -104, 1996; Lund et al, J Immunol 157:4963-4969, 1996; Armour et al., Eur J Immunol 29:2613-2624, 1999; Idusogie et al, J Immunol 164:4178-4184, 200; Reddy et al, J Immunol 164:1925-1933,

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2000; Xu et al., Cell Immunol 200:16-26, 2000; Idusogie etal, J Immunol 166:2571 -2575, 2001; Shields et al., J Biol Chem 276:6591 -6604, 2001; Jefferis etal, Immunol Left 82:57-65. 2002; Presta et al., Biochem Soo Trans 30:487-490, 2002; Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005-4010, 2006; Patentes US N^Q 5,624,821; 5,885,573; 5,677,425; 6,165,745; 6,277,375; 5,869,046; 6,121,022; 5,624,821; 5,648,260; 6,194,551; 6,737,056; 6,821,505; 6,277,375; 7,335,742 e 7,317,091.

[0075] O termo região Fc aqui é usado para definir uma região Cterminal de uma cadeia pesada da imunoglobulina, incluindo as regiões Fc da sequência e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada da imunoglobulina possam variar, a região Fc da cadeia pesada de IgG humano é geralmente definida para se estender a partir de um resíduo de aminoácido na posição Cys226, ou do Pro230, para o seu carbóxi-terminal. As regiões Fc de sequência nativa adequadas para uso nos anticorpos da presente invenção incluem IgG 1, lgG2, lgG3 e lgG4 humanos. Uma única substituição de aminoácidos (S228P de acordo com a numeração de Kabat; designada lgG4Pro) pode ser introduzida para abolir a heterogeneidade observada no anticorpo lgG4 recombinante. Veja Angal, S. etal., (1993) Mol Immunol 30, 105-108.

[0076] Anticorpo não fucosilado ou deficiente em fucose se refere a uma variante do anticorpo de glicosilação compreendendo uma região Fc em que uma estrutura de carboidratos ligada à região Fc tem redução de fucose ou falta de fucose. Em algumas formas de realização, um anticorpo com redução de fucose ou falta de fucose tem a função ADCC melhorada. Os anticorpos não fucosilados ou deficientes em fucose têm redução de fucose em relação à quantidade de fucose no mesmo anticorpo produzido em uma linhagem de células. Em algumas formas de realização, uma composição com anticorpo não fucosilado ou deficiente em fucose anticorpos contemplados neste documento é uma

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36/169 composição em que menos de cerca de 50% dos glicanos vinculados a N ligados à região Fc dos anticorpos na composição compreende fucose.

[0077] Os termos fucosilação ou fucosilado se refere à presença de resíduos de fucose dentro dos oligossacarídeos ligados à estrutura principal do peptídeo de um anticorpo. Especificamente, um anticorpo fucosilado compreende fucose ligada a α (l,6) no resíduo Nacetilglucosamine (GlcNAc) mais interno em um ou ambos os oligossacarídeos vinculados a N ligados à região Fc do anticorpo, por exemplo, na posição Asn 297 do domínio Fc do lgG1 humano (numeração EU de resíduos da região Fc). O Asn297 também pode estar localizado a cerca de + 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, ou seja, entre as posições 294 e 300, devido a pequenas variações da sequência em imunoglobulinas.

[0078] O grau de fucosilação é o percentual de oligossacarídeos fucosilados em relação a todos os oligossacarídeos identificados pelos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, em uma composição de anticorpos tratada com F N-glicosidase, avaliada por espectrometria de massa por tempo-de-voo por ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS). Em uma composição de um anticorpo totalmente fucosilado, essencialmente todos os oligossacarídeos compreendem resíduos de fucose, ou seja, são fucosilados. Em algumas formas de realização, uma composição de um anticorpo totalmente fucosilado tem um grau de fucosilação de pelo menos cerca de 90%. Por conseguinte, um anticorpo individual em uma composição desse tipo compreende normalmente os resíduos de fucose em cada um dos dois oligossacarídeos ligados a N na região Fc. Por outro lado, em uma composição de um anticorpo totalmente não fucosilado, essencialmente nenhum dos oligossacarídeos é fucosilado, e um anticorpo individual em uma composição desse tipo não contém

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37/169 resíduos de fucose em qualquer um dos dois oligossacarídeos ligados a N na região Fc. Em algumas formas de realização, uma composição de um anticorpo totalmente não fucosilado tem um grau de fucosilação inferior a cerca de 10%. Em uma composição de um anticorpo parcialmente fucosilado, apenas parte dos oligossacarídeos compreende fucose. Um anticorpo individual em uma composição desse tipo pode compreender resíduos de fucose em nenhum deles, em um ou ambos os oligossacarídeos ligados a N na região Fc, desde que a composição não compreenda essencialmente todos os anticorpos individuais sem resíduos de fucose nos oligossacarídeos ligados a N na região Fc, nem essencialmente todos os anticorpos individuais que contêm os resíduos de fucose em ambos os oligossacarídeos ligados a N na região Fc. Em uma forma de realização, uma composição de um anticorpo parcialmente fucosilado tem um grau de fucosilação de cerca de 10% a cerca de 80% (por exemplo, cerca de 50% a cerca de 80%, cerca de 60% a cerca de 80%, ou cerca de 70% a cerca de 80%).

[0079] Afinidade de ligação, como usado aqui, se refere à força das interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Em algumas formas de realização, a afinidade de ligação de um anticorpo para uma Siglec-8 (que pode ser um dímero tal como a proteína de fusão Siglec-8-Fc aqui descrita) pode, geralmente, ser representada por uma constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida pelos métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles aqui descritos.

[0080] Avidez da ligação, como aqui usado, se refere à força de ligação de vários sítios de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno).

[0081] Uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica os

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38/169 anticorpos neste documento é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual é normalmente associada no ambiente no qual foi produzida. Em algumas formas de realização, o ácido nucleico isolado é livre de associação com todos os componentes associados ao ambiente de produção. As moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam os polipeptídeos e anticorpos neste documento estão em uma forma ou configuração em que é encontrada na natureza. As moléculas de ácido nucleico isoladas, portanto, são distintas do ácido nucleico que codifica os polipeptídeos e anticorpos aqui naturalmente existentes nas células.

[0082] O termo formulação farmacêutica se refere a uma preparação que está em uma forma de modo a permitir que a atividade biológica do ingrediente ativo seja eficaz, e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um indivíduo ao qual a formulação seria administrada. Essas formulações são estéreis.

[0083] Veículos, como usado neste documento, incluem veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis que são não tóxicos para a célula ou mamífero sendo exposto a eles nas doses e concentrações empregadas. Muitas vezes, o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução aquosa tamponada para pH. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões, como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo o ácido ascórbico; polipeptídeo de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos); proteínas, como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, como polivinilpirrolidona; aminoácidos, como a glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo a glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, como EDTA; álcoois

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39/169 de açúcar, como sorbitol ou manitol; contra-íons formadores de sal, como o sódio; e/ou tensoactivos não iônicos, como Tween™, polietileno glicol (PEG) e PLURONICS™.

[0084] Como usado neste documento, o termo tratamento ou tratar se refere- à intervenção clínica concebida para alterar o curso natural do indivíduo ou célula sendo tratada durante o curso da patologia clínica. Efeitos desejáveis do tratamento incluem diminuição da taxa de progressão da doença, melhora ou atenuação do estado da doença, e remissão ou melhora do prognóstico. Um indivíduo é tratado com sucesso, por exemplo, se um ou mais sintomas associados a uma doença (por exemplo, um distúrbio inflamatório Gl) são atenuados ou eliminados. Por exemplo, um indivíduo é tratado com sucesso se o tratamento resulta em aumento da qualidade de vida dos que sofrem de uma doença, diminuição da dose de outros medicamentos necessários para o tratamento da doença, redução da frequência de recorrência da doença, diminuição da gravidade da doença, retardo do desenvolvimento ou progressão da doença e/ou prolongamento da sobrevida dos indivíduos.

[0085] Neste documento, juntamente com ou em combinação com se refere à administração de uma modalidade de tratamento em adição a outra modalidade de tratamento. Como tal, juntamente com ou em combinação com se refere à administração de uma modalidade de tratamento antes, durante ou após a administração da outra modalidade de tratamento ao indivíduo.

[0086] Como usado neste documento, o termo prevenção ou prevenir inclui o fornecimento de profilaxia em relação à ocorrência ou recorrência de uma doença em um indivíduo. Um indivíduo pode ser predisposto a uma doença, suscetível a uma doença ou em risco de desenvolver uma doença, mas ainda não foi diagnosticado com a doença. Em algumas formas de realização, anticorpos anti-Siglec-8 (por

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40/169 exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) descritos aqui são usados para retardar o desenvolvimento de uma doença (por exemplo, um distúrbio inflamatório Gl).

[0087] Como usado neste documento, um indivíduo em risco de desenvolver uma doença (por exemplo, um distúrbio inflamatório Gl) pode ou não ter doença detectável ou sintomas da doença, e pode ou não ter apresentado doença detectável ou sintomas da doença antes dos métodos de tratamento descritos neste documento. Em risco significa que um indivíduo tem um ou mais fatores de risco, que são parâmetros mensuráveis que se correlacionam ao desenvolvimento da doença (por exemplo, um distúrbio inflamatório Gl), tal como é conhecido na técnica. Um indivíduo com um ou mais desses fatores de risco tem maior probabilidade de desenvolver a doença do que um indivíduo sem um ou mais desses fatores de risco.

[0088] Uma quantidade eficaz se refere a pelo menos uma quantidade eficaz, em doses e por períodos de tempo necessários, para alcançar o efeito desejado ou indicado, incluindo um resultado terapêutico ou profilático. Uma quantidade eficaz pode ser fornecida em uma ou mais administrações. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é pelo menos a concentração mínima exigida para o efeito de uma melhora mensurável de uma determinada doença. Uma quantidade terapeuticamente eficaz aqui pode variar de acordo com fatores como o estado da doença, idade, sexo e peso do paciente, e a capacidade do anticorpo de eliciar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também pode ser uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma quantidade profilaticamente eficaz se refere a uma quantidade eficaz, nas doses e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático desejado. Geralmente, mas não necessariamente, uma vez que uma

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41/169 dose profilática é usada em indivíduos antes ou na fase mais precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz pode ser menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.

[0089] Administração crônica se refere à administração do(s) medicamento(s) em um modo contínuo, em vez de agudo, a fim de manter o efeito terapêutico (atividade) inicial por um período de tempo prolongado. Administração intermitente é o tratamento que não é feito consecutivamente sem interrupção, mas sim de natureza cíclica.

[0090] O termo folheto é usado para se referir às instruções normalmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dose, administração, terapia de combinação, contraindicações e/ou avisos em relação ao uso desses produtos terapêuticos.

[0091] Como usado neste documento, um indivíduo (individual ou subject) é um mamífero. Um mamífero, para fins de tratamento, inclui seres humanos, animais domésticos, de fazenda e de zoológico, para a prática de esportes ou animais de estimação, como cães, cavalos, coelhos, gado, porcos, hamsters, gerbos, camundongos, furões, ratos, gatos, etc. Em algumas formas de realização, o indivíduo é um ser humano.

II. MÉTODOS

[0092] São aqui fornecidos métodos para tratar e/ou prevenir um distúrbio inflamatório gastrointestinal (por exemplo, IBD ou EGID) em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo aqui descrito que se liga à Siglec-8 humana (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-8) ou uma composição compreendendo os referidos anticorpos. Em algumas formas de realização, o anticorpo está em uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas formas de realização, o indivíduo é um ser humano.

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A. DISTÚRBIOS INFLAMATÓRIOS Gl

[0093] Alguns aspectos da presente invenção se referem a indivíduos com um transtorno inflamatório gastrointestinal. Em algumas formas de realização, o indivíduo foi diagnosticado com IBD. Em algumas formas de realização, o indivíduo está em risco de desenvolver IBD. Várias classificações e subtipos da IBD foram propostos (veja, por exemplo, Cleynen, I. et al. (2016) Lancet 387:156-167). Em algumas formas de realização, o indivíduo tem colite ulcerativa (por exemplo, colite ulcerativa aguda). Em algumas formas de realização, o indivíduo tem colite colagenosa. Em algumas formas de realização, o indivíduo tem colite linfocítica. Em algumas formas de realização, o indivíduo tem a doença de Crohn (por exemplo, a doença de Crohn colônica, ileal ou ileocolônica. Em algumas formas de realização, o indivíduo tem IBD colônica não classificada (IBD-U). Em algumas formas de realização, o indivíduo tem colite eosinofílica crônica.

[0094] Em algumas formas de realização, o indivíduo tem colite ulcerativa moderada a grave. Os critérios para identificação da colite ulcerativa moderada a grave são conhecidos na técnica; veja, por exemplo, Kornbluth, A. etal. (2010) Am J. Gastroenterol. 105:501-523. [0095] Em algumas formas de realização, o indivíduo tem propagação da doença colônica maior do que aproximadamente qualquer dos seguintes (em cm): 5, 10, 15, 20, 25, 30 ou 35. Em algumas formas de realização, o indivíduo tem propagação da doença colônica menor do que aproximadamente qualquer um dos seguintes (em cm): 40, 35, 30, 25, 20,15 ou 10. Isto é, o indivíduo tem propagação da doença colônica com um limite superior de 40, 35, 30, 25, 20, 15 ou 10 cm e um limite inferior selecionado independentemente de 5, 10, 15, 20, 25, 30 ou 35 cm, em que o limite superior é maior que o limite inferior. Em algumas formas de realização, o indivíduo tem propagação da doença colônica entre cerca de 5 cm e cerca de 40 cm. Em algumas

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43/169 formas de realização, o indivíduo tem propagação da doença colônica e oolite ulcerativa moderada a grave entre cerca de 5 cm e cerca de 40 cm.

[0096] Em algumas formas de realização, o indivíduo obteve insucesso em uma terapia de primeira linha para a colite ulcerativa ou doença de Crohn (por exemplo, antes da administração de um anticorpo da presente invenção). Em algumas formas de realização, o indivíduo tem colite ulcerativa moderada a grave e obteve insucesso em uma terapia de primeira linha para a colite ulcerativa ou doença de Crohn (por exemplo, antes da administração de um anticorpo da presente invenção).

[0097] Os termos referência e valor de referência usados como sinônimos neste documento podem se referir a uma medição ou caracterização de um valor ou sintoma em um indivíduo sem um distúrbio Gl (ou em um grupo desses indivíduos). Um valor de referência pode ser um valor absoluto; um valor relativo; um valor que tem um limite superior e/ou limite inferior; um intervalo de valores; um valor mediano; um valor médio ou um valor em comparação a um valor basal. Da mesma forma, um valor basal pode ser um valor absoluto; um valor relativo; um valor que tem um limite superior e/ou limite inferior; um intervalo de valores; um valor médio; um valor mediano; ou um valor em comparação a um valor de referência. Um valor de referência pode ser obtido a partir de um indivíduo, a partir de dois indivíduos diferentes ou a partir de um grupo de indivíduos (por exemplo, um grupo de dois, três, quatro, cinco ou mais indivíduos). Em algumas formas de realização, um valor de referência se refere a um padrão ou de referência no campo. Em algumas formas de realização, um valor de referência se refere a um valor calculado de novo a partir de um ou mais indivíduos (por exemplo, sem um distúrbio Gl).

[0098] Em algumas formas de realização, o indivíduo tem

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44/169 inflamação aumentada em pelo menos uma parte do trato gastrointestinal (por exemplo, em comparação a uma referência adequada, como um indivíduo sem IBD ou um valor de referência). Em algumas formas de realização, o indivíduo tem um número aumentado de células imunes em pelo menos uma parte do trato gastrointestinal (por exemplo, em comparação a uma referência adequada, como um indivíduo sem IBD ou um valor de referência). Por exemplo, em algumas formas de realização, o indivíduo tem um aumento do número de mastócitos, neutrófilos, eosinófilos e/ou linfócitos em pelo menos uma parte do trato gastrointestinal (por exemplo, em comparação a uma referência adequada, como um indivíduo sem IBD ou um valor de referência). Os distúrbios gastrointestinais, como a doença de Crohn, são conhecidos pela possibilidade de afetar qualquer parte do trato gastrointestinal. Em algumas formas de realização, partes do trato gastrointestinal incluem a boca, faringe, esôfago, estômago, duodeno, jejuno, íleo, ceco, cólon, reto e ânus.

[0099] Em algumas formas de realização, o indivíduo tem maior permeabilidade da mucosa do intestino ou cólon. A permeabilidade da mucosa intestinal foi identificada como um fator crítico na patogênese gastrointestinal. Para descrições mais detalhadas da permeabilidade e sua mensuração, veja, por exemplo, Bischoff, S.C. et al. (2014), BMC Gastroenterol. 14:189 Os ensaios exemplificativos para medir a permeabilidade da mucosa incluem, sem limitação, a câmara de Ussing, a administração oral de uma sonda (por exemplo, um oligossacarídeo, açúcar ou outra porção rotulada que pode ser detectada na urina, se passar através da barreira intestinal), ensaios para marcadores bacterianos (por exemplo, um produto bacteriano como uma endotoxinas ou produto da fermentação, ou um anticorpo específico para um antígeno bacteriano), ou ensaios para biomarcadores associados à inflamação intestinal ou perda da integridade da barreira.

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Em algumas formas de realização, a biopsia do cólon do indivíduo mostra aumento da permeabilidade da mucosa (por exemplo, quando comparada a uma referência adequada, como um indivíduo sem IBD ou um valor de referência).

[00100] Em algumas formas de realização, uma amostra de urina obtida do indivíduo tem níveis aumentados de um ou mais dentre: Nmetil-histamina, leucotrienos e prostaglandinas (por exemplo, em comparação a uma referência adequada, como uma amostra de urina obtida de um indivíduo sem IBD ou um valor de referência). Em algumas formas de realização, uma amostra de sangue obtida do indivíduo tem níveis aumentados de um ou mais dentre: IL-6, IL-8, TNFa, VEGF, PDGF e MCP-1 (por exemplo, em comparação a uma referência adequada, como uma amostra de sangue obtida de um indivíduo sem IBD ou um valor de referência).

[00101] Em algumas formas de realização, o indivíduo tem dor abdominal, diarréia e/ou náuseas. Em algumas formas de realização, o indivíduo reportou um ou mais sintomas de uma EGID por auto-relato, por exemplo, um questionário de resultados reportados pelo paciente (PRO). Em algumas formas de realização, o indivíduo obteve insucesso, ou teve EGID não controlada devidamente por, um ou mais tratamentos anteriores para uma EGID, por exemplo, PPIs, corticosteroides tópicos ou sistêmicos e/ou dieta.

[00102] Outras técnicas para identificar um indivíduo a ser tratado pelos métodos da presente invenção incluem, sem limitação, um exame de sangue oculto nas fezes, um hemograma completo (CBC) (por exemplo, para diagnosticar anemia ou infecção), colonoscopia, endoscopia, imagem por ressonância magnética (MRI), raios X, tomografia computadorizada, enterografia por ressonância magnética (RM) (por exemplo, para detectar uma fistula, inflamação ou estreitamento) ou ressonância magnética colônica ou retal.

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[00103] Em algumas formas de realização, o indivíduo foi diagnosticado com um distúrbio gastrointestinal eosinofílico (EGID) ou está em risco de desenvolver um distúrbio gastrointestinal eosinofílico (EGID). EGIDs são distúrbios que afetam o trato Gl, que são caracterizados por inflamação (por exemplo, a infiltração eosinofílica). Em algumas formas de realização, essa inflamação ocorre sem uma causa típica para a infiltração eosinofílica, como a infecção por parasitas, malignidade e reação a fármacos. Os EGIDs incluem esofagite eosinofílica (EOE), gastrite eosinofílica (EG), gastroenterite eosinofílica (EGE) e colite eosinofílica (EC).

[00104] Em algumas formas de realização, o indivíduo foi diagnosticado com EOE ou está em risco de desenvolver EOE. EOE se refere a um distúrbio do esôfago caracterizado por infiltração de eosinófilos e patologias associadas, como dor abdominal, disfagia, impactação alimentar, vômitos, azia, náuseas, falta de crescimento, e problemas de alimentação. Veja Furuta, G.T. e Katzka, D.A. (2015), Λ/. Engl. J. Med. 373:1640-1648. Em algumas formas de realização, o paciente também apresenta eosinofilia no sangue periférico.

[00105] Em algumas formas de realização, o indivíduo foi diagnosticado com EGE ou está em risco de desenvolver EGE. EGE se refere a um distúrbio do trato gastrointestinal (Gl), caracterizado por infiltração de uma parte do trato gastrointestinal por eosinófilos e patologias gastrointestinais associadas, como dispepsia, dor abdominal, náuseas, vômitos, perda de peso, diarréia, obstrução, sangramento Gl e ascite. Em algumas formas de realização, um indivíduo é diagnosticado com EGE devido à infiltração eosinofílica em uma parte de um ou mais dentre a boca, faringe, esôfago, estômago, duodeno, íleo, jejuno, ceco, cólon, reto e ânus. Por exemplo, em algumas formas de realização, o indivíduo tem duodenite eosinofílica, jejunite /ou ileíte.

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Em algumas formas de realização, o paciente também apresenta eosinofilia no sangue periférico.

[00106] Em algumas formas de realização, o indivíduo foi diagnosticado com EG ou está em risco de desenvolver EG. EG se refere a um distúrbio caracterizado por infiltração de uma parte do estômago (por exemplo, revestimento do estômago) por eosinófilos e patologias gastrointestinais associadas, como dispepsia, dor abdominal, náuseas, vômitos, diarréia, perda de peso, má-absorção e anemia. Em algumas formas de realização, o paciente também apresenta eosinofilia no sangue periférico.

[00107] Em algumas formas de realização, o indivíduo foi diagnosticado com EC ou está em risco de desenvolver EC. EC se refere a um distúrbio do cólon caracterizado por infiltração de eosinófilos e patologias associadas, como dor abdominal, diarréia, perda de peso, má-absorção, enteropatia perdedora de proteínas, obstrução intestinal, espessamento colônico, obstrução colônica e ascite. A EC é comumente diagnosticada em crianças ou adultos jovens. Veja Alfadda, A.A. et al. (2011) Therap. Adv. Gastroenterol. 4:301-309. Em algumas formas de realização, o paciente também apresenta eosinofilia no sangue periférico.

[00108] Em algumas formas de realização, o indivíduo tem dois ou mais, três ou mais ou todos os quatro EGIDs acima. Por exemplo, em algumas formas de realização, o indivíduo tem EGE e EG.

[00109] Os EGIDs são caracterizados por infiltração eosinofílica em um ou mais tecidos ou partes afetadas do trato Gl. Em algumas formas de realização, a infiltração eosinofílica se refere à presença de 15 ou mais, 20 ou mais ou 30 ou mais eosinófilos por campo de alta potência (HPF) em uma amostra (por exemplo, lâmina de biópsia, tal como uma biópsia endoscópica) obtida do trato gastrointestinal (ou seja, esôfago para EOE, estômago para EG, cólon para CE, etc.). Em algumas formas

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48/169 de realização, a infiltração eosinofílica se refere à presença de uma média de 15 ou mais, 20 ou mais, ou 30 ou mais eosinófilos por campo de alta potência (HPF) em 2, 3, 4 ou 5 HPFs (por exemplo, a partir de uma lâmina de biópsia, tal como uma biópsia endoscópica) obtida do trato gastrintestinal (ou seja, esôfago para EOE, estômago para EG, cólon para EC, etc.). Por exemplo, vários HPFs (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5 HPFs, como descrito no presente documento) podem ser obtidos de uma única biópsia (veja Caldwell, J.M. et al. (2014) J. Allergy Clin. Immunol. 134:1114-1124) ou, em alguns casos, de várias biópsias. Em algumas formas de realização, a infiltração eosinofílica se refere à presença de 30 ou mais eosinófilos em 5 HPFs (por exemplo, a partir de uma lâmina de biópsia, tal como uma biópsia endoscópica) obtidos do trato gastrintestinal (isto é, esôfago para EOE, estômago para EG, cólon para EC, etc.). Os 5 HPFs podem ser obtidos de 1, 2, 3, 4 ou 5 indivíduos (por exemplo, biópsias individuais). Em outras palavras, a título de exemplo, os 5 HPFs podem ser de um total de 2 amostras (por exemplo, 3 HPFs de uma amostra e 2 da outra, em vez de requerer 5 HPFs de cada uma das duas amostras). Em algumas formas de realização, a infiltração eosinofílica se refere à presença de 30 ou mais eosinófilos por HPF em 5 amostras (por exemplo, a partir de uma lâmina de biópsia, tal como uma biópsia endoscópica) obtidos do trato gastrintestinal (isto é, esôfago para EOE, estômago para EG, cólon para EC, etc.). Em algumas formas de realização, a infiltração eosinofílica se refere à presença de uma contagem máxima de eosinófilos de 50 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 250 ou mais ou 300 ou mais eosinófilos por campo de alta potência (HPF) em 2, 3, 4 ou 5 HPFs (por exemplo, a partir de uma lâmina de biópsia, tal como uma biópsia endoscópica) obtida do trato gastrintestinal (ou seja, esôfago para EOE, estômago para EG, cólon para EC, etc.). Em algumas formas de realização, a infiltração eosinofílica se refere à presença de 100 ou mais

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49/169 eosinófilos/mm² em um HPF ou amostra (por exemplo, lâmina de biópsia, tal como de uma biópsia endoscópica) obtida do trato gastrintestinal (isto é, esôfago para EOE, estômago para EG, cólon para EC, etc.). Em algumas formas de realização, a infiltração eosinofílica se refere a um aumento do número de eosinófilos em um HPF ou amostra (por exemplo, em comparação a uma referência adequada, como uma amostra de um indivíduo sem IBD, ou um valor de referência). Outras técnicas de observação do trato Gl, como endoscopia, colonoscopia e esofagografia com bário, também podem ser usadas, por exemplo, para procurar por perturbações morfológicas de uma ou mais partes do trato Gl. Veja, por exemplo, Caldwell, J.M. et al. (2014) J. Allergy Clin. Immunol. 134:1114-1124; Furuta, G.T. e Katzka, D.A. (2015) N. Engl. J. Med. 373:1640-1648; e Lwin, T. et al. (2011) Mod. Pathol. 24:556-563. [00110] Em algumas formas de realização, uma amostra de um indivíduo com EOE (por exemplo, uma amostra de uma biópsia esofágica) é caracterizada por uma ou mais das seguintes características: maior ou igual a 15 por eosinófilos intraepiteliais por HPF em pelo menos um local do esôfago, alteração do caráter de eosinófilos (por exemplo, manifestam-se como camadas de superfície e abscessos), alterações epiteliais (por exemplo, hiperplasia da camada basal e/ou espaços intercelulares dilatados), espessada e fibras da lâmina própria espessadas. Em algumas formas de realização, uma amostra de um indivíduo com EG (por exemplo, uma amostra de uma biópsia gástrica) é caracterizada por uma ou mais das seguintes características: maior ou igual a 30 eosinófilos por HPF em 5 HPFs, alteração do comportamento de eosinófilos (por exemplo, se manifestam como folhas da lâmina própria, glandulite eosinofílica, abscessos glandulares de eosinófilos), alterações epiteliais (por exemplo, redução de mucina, aumento da razão nuclear/citoplasmática e/ou aumento da atividade mitótica epitelial), e alteração da distribuição

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50/169 de eosinófilos (por exemplo, um ou mais por HPF no epitélio de superfície, mais de um por HPF no epitélio glandular, excesso de eosinófilos na mucosa e submucosa muscular e/ou concentração de eosinófilos na lâmina própria superficial subepitelial em vez da lâmina própria profunda). Em algumas formas de realização, uma amostra de um indivíduo com EGE (por exemplo, uma amostra de uma biópsia do duodeno, jejuno ou íleo) é caracterizada por uma ou mais das seguintes características: mais do que o dobro do número normal de eosinófilos na lâmina própria por HPF (por exemplo, mais de 52 eosinófilos por HPF no duodeno, ou mais de 56 eosinófilos por HPF no íleo), alteração do comportamento de eosinófilos (por exemplo, se manifestam como folhas da lâmina própria, criptite eosinofílica, abscessos crípticos eosinofílicos), alterações epiteliais (por exemplo, redução de mucina, aumento da razão nuclear/citoplasma e/ou aumento da atividade mitótica epitelial), alteração da distribuição de eosinófilos (por exemplo, mais de 2 por HPF e mais de 4 por HPF no epitélio de superfície no duodeno e íleo, respectivamente; mais de 6 por HPF e mais de 4 por HPF no epitélio da cripta no duodeno e íleo, respectivamente; excesso de eosinófilos na mucosa ou submucosa muscular; e/ou concentração de eosinófilos na lâmina própria superficial subepitelial em vez da lâmina própria profunda), e ausência de células inflamatórias agudas. Em algumas formas de realização, uma amostra de um indivíduo com CE (por exemplo, uma amostra de uma biopsia do cólon) é caracterizada por uma ou mais das seguintes características: mais do dobro do número normal de eosinófilos na lâmina própria por HPF (por exemplo, mais de 100 eosinófilos por HPF no cólon direito, mais de 84 eosinófilos por HPF no cólon transverso e descendente, ou seja, mais de 64 eosinófilos por HPF no cólon rectossigmoide), alteração do comportamento de eosinófilos (por exemplo, se manifestam como folhas da lâmina própria, criptite eosinofílica, abscessos crípticos

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51/169 eosinofílicos), alterações epiteliais (por exemplo, redução de mucina, aumento da razão nuclear/citoplasmática e/ou aumento da atividade mitótica epitelial), alteração da distribuição de eosinófilos (por exemplo, mais de 3 por HPF, mais de 4 por HPF e mais de 2 por HPF no epitélio superficial direito, cólon transverso/descendente e retossigmoide, respectivamente; mais de 11 por HPF, mais de 4 por HPF e mais de 9 por HPF no epitélio críptico direito, cólon transverso/descendente e retossigmoide, respectivamente; excesso de eosinófilos na mucosa e submucosa muscular, e/ou concentração de eosinófilos na lâmina própria superficial subepitelial em vez da lâmina própria profunda), e ausência de células inflamatórias agudas. Para mais descrições exemplificativas dos critérios de diagnósticos para EGIDs, veja, por exemplo, Collins, M.H. (2014) Gastroenterol. Clin. N. Am. 43:257-268. [00111] Em algumas formas de realização, um indivíduo com uma EGID apresenta também aumento da eosinofilia no sangue (por exemplo, em relação à quantidade de eosinófilos no sangue periférico em um indivíduo sem um EGID ou um valor de referência). Por exemplo, em algumas formas de realização, uma amostra de sangue periférico obtida de um indivíduo com EGID tem 200 ou mais, 300 ou mais, 400 ou mais, 500 ou mais, ou 600 ou mais eosinófilos/pL.

[00112] A presente invenção demonstra que a expressão de determinados genes é aumentada em um modelo de camundongo de gastrite eosinofílica (EG) e gastroenterites (EGE). Veja o Exemplo 3 e as Figuras 12A-12E. Assim, em algumas formas de realização, um indivíduo com um EGID também apresenta aumento da expressão do MCPT1, MBP, CCL5, CCL2 e/ou CCL17, por exemplo, em um ou mais tecidos do trato gastrointestinal (ou seja, esôfago para EOE, estômago para EG, cólon para EC, etc.). Em algumas formas de realização, um indivíduo com um EGID apresenta também aumento da expressão do MCPT1 em um ou mais tecidos do trato gastrointestinal (ou seja,

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52/169 esôfago para EOE, estômago para EG, cólon para EC, etc.). Em algumas formas de realização, um indivíduo com um EGID apresenta ainda expressão aumentada do CCL2 em um ou mais tecidos do trato gastrointestinal (ou seja, esôfago para EOE, estômago para EG, cólon para EC, etc.). Em algumas formas de realização, a expressão gênica é medida em uma amostra de biópsia obtida do tecido do indivíduo. Em algumas formas de realização, expressão gênica se refere ao nível de expressão do mRNA. Em algumas formas de realização, expressão gênica se refere ao nível de expressão da proteína. Em algumas formas de realização, a expressão gênica é medida em relação a uma referência ou valor de referência. Em algumas formas de realização, o valor de referência se refere à expressão de um ou mais outros genes, por exemplo, um gene de manutenção. Em algumas formas de realização, o valor de referência se refere à expressão gênica em um ou mais indivíduos sem um EGID. Um valor de referência pode ser obtido a partir de um indivíduo, a partir de dois indivíduos diferentes ou a partir de um grupo de indivíduos (por exemplo, um grupo de dois, três, quatro, cinco ou mais indivíduos). Em algumas formas de realização, um valor de referência se refere a um padrão ou de referência no campo. Em algumas formas de realização, um valor de referência se refere a um valor calculado de novo a partir de um ou mais indivíduos (por exemplo, sem um distúrbio Gl).

[00113] A presente invenção demonstra ainda que a expressão de determinados genes em uma amostra de sangue ou soro é aumentada em um modelo de camundongo de gastrite eosinofílica (EG) e gastroenterite (EGE). Veja o Exemplo 3 e as Figuras 13A-13C. Assim, em algumas formas de realização, um indivíduo com um EGID também apresenta a expressão aumentada de CCL2 e/ou CXCL1 em uma amostra de soro ou sangue. Em algumas formas de realização, um indivíduo com um EGID apresenta ainda a expressão aumentada de

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CCL2 em uma amostra de soro ou sangue. Em algumas formas de realização, a expressão gênica é medida em uma amostra de soro ou sangue obtida do indivíduo. Em algumas formas de realização, expressão gênica se refere ao nível de expressão do mRNA. Em algumas formas de realização, expressão gênica se refere ao nível de expressão da proteína. Em algumas formas de realização, a expressão gênica é medida em relação a uma referência ou valor de referência. Em algumas formas de realização, o valor de referência se refere à expressão de um ou mais outros genes, por exemplo, um gene de manutenção. Em algumas formas de realização, o valor de referência se refere à expressão do gene em uma ou mais amostras de sangue ou soro de um ou mais indivíduos sem um EGID. Um valor de referência pode ser obtido a partir de um indivíduo, a partir de dois indivíduos diferentes ou a partir de um grupo de indivíduos (por exemplo, um grupo de dois, três, quatro, cinco ou mais indivíduos). Em algumas formas de realização, um valor de referência se refere a um padrão ou de referência no campo. Em algumas formas de realização, um valor de referência se refere a um valor calculado de novo a partir de um ou mais indivíduos (por exemplo, sem um distúrbio Gl).

B. RESPOSTA AO TRATAMENTO

[00114] Em algumas formas de realização, administrar a um indivíduo como descrito neste documento (por exemplo, um indivíduo com IBD, como colite ou doença de Crohn, ou um EGID) uma quantidade eficaz de um anticorpo aqui descrito que se liga à Siglec-8 humana (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-8) reduz um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, etc.) sintomas no indivíduo, em relação a um nível basal anterior à administração do anticorpo.

[00115] Os termos linha de base ou valor basal, usados alternadamente neste documento, podem se referir a uma medição ou

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54/169 caracterização de um sintoma antes da administração da terapia (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-8) ou no início da administração da terapia. O valor basal pode ser comparado a um valor de referência a fim de determinar a redução ou a melhora de um sintoma da doença gastrointestinal (por exemplo, IBD ou um EGID) contemplada neste documento. Um valor de referência e/ou valor basal pode ser obtido a partir de um indivíduo, a partir de dois indivíduos diferentes ou a partir de um grupo de indivíduos (por exemplo, um grupo de dois, três, quatro, cinco ou mais indivíduos).

[00116] A resposta ao tratamento em indivíduos com doença gastrointestinal (por exemplo, IBD ou um EGID) pode ser avaliada por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a resposta ao tratamento em um indivíduo com doença gastrointestinal (por exemplo, IBD ou um EGID) pode ser a redução ou a melhora de qualquer sintoma aqui descrito. Os sintomas da IBD podem incluir, mas não se limitam a, diarréia, inchaço, náusea, dor abdominal, sangue nas fezes, frequência de fezes líquidas, abscessos abdominais ou pélvicos, fistulas, perda de peso, fadiga, febre, suores noturnos e retardo de crescimento. Os sintomas da EOE podem incluir, mas não se limitam a, dor abdominal, disfagia, impactação alimentar, vômitos, azia, náuseas, falta de crescimento e problemas de alimentação. Os sintomas da EG podem incluir, mas não se limitam a, dispepsia, dor abdominal, náuseas, vômitos, diarréia, perda de peso, má-absorção e anemia. Os sintomas da EGE podem incluir, mas não se limitam a, dispepsia, dor abdominal, náuseas, vômitos, perda de peso, diarréia, obstrução, sangramento Gl e ascite. Os sintomas da EC podem incluir, mas não se limitados a, dor abdominal, diarréia, perda de peso, má-absorção, enteropatia perdedora de proteínas, obstrução intestinal, espessamento colônico, obstrução colônica e ascite. A resposta ao tratamento pode resultar em remissão completa (CR), remissão parcial (PR) ou uma melhora clínica

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55/169 (Cl) de doença gastrointestinal (por exemplo, IBD ou um EGID) em um indivíduo.

[00117] Técnicas de medição da resposta ao tratamento para uma variedade de doenças gastrointestinais e sintomas são conhecidas na arte. Por exemplo, para monitorar a IBD, as técnicas para medir a resposta ao tratamento podem incluir, sem limitação, avaliação e pontuação endoscópica (por exemplo, usando o índice Endoscópico de Gravidade da Doença de Crohn, Pontuação Endoscópica Simples para a Doença de Crohn, escala de classificação endoscópica de Rutgeerts, índice de Atividade da CD por cápsula endoscópica, índice de Atividade modificado da Doença Colite Ulcerativa ou pontuação de Mayo); ultrassonografia; tomografia computadorizada; ressonância magnética (por exemplo, enterografia por MR, enteróclese por MR, ou usando um sistema de pontuação, tal como o índice MRI para a Doença de Crohn ou o índice de Atividade por MR); níveis da proteína C reativa; ou níveis da calprotectina fecal, lactoferrina ou elastase (veja D'Inca, R. e Caccaro, R. (2014) Clin. Exp. Gastroenterol. 7:151-161; Walsh, A. e Travis, S. (2012) Gastroenterol. Hepatol. (NY) 8:751-754). Para monitorar urn EGID, as técnicas para medir a resposta ao tratamento podem incluir, sem limitação, endoscopia, colonoscopia, esofagografia, contagem de eosinófilos em uma amostra do trato Gl (por exemplo, número total, média para várias amostras e/ou pico para várias amostras), e a contagem de eosinófilos em uma amostra de sangue periférico.

[00118] Em algumas formas de realização, o tratamento com uma quantidade eficaz de um anticorpo aqui descrito que se liga à Siglec-8 humana (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-8) reduz a atividade da doença IBD ou EGID (por exemplo, usando um índice de avaliação/pontuação com base na imagem endoscópica ou por MRI, como o índice Endoscópico de Gravidade da Doença de Crohn,

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Pontuação Endoscópica Simples para a doença de Crohn, escala de classificação endoscópica de Rutgeerts, índice de Atividade da CD por cápsula endoscópica, índice de Atividade modificado da Doença Colite Ulcerativa, Pontuação de Mayo, índice de RM da Doença de Crohn ou o índice de Atividade por MR e/ou com base na gravidade de um ou mais sintomas, como diarréia, inchaço, náusea, dor abdominal, sangue nas fezes, frequência de fezes líquidas, abscessos abdominais ou pélvicos, fistulas, perda de peso, fadiga, febre, suores noturnos e retardo do crescimento), reduz os neutrófilos no cólon, reduz os monócitos recrutados no cólon, e/ou reduz os macrófagos residentes no cólon. Em algumas formas de realização, o indivíduo tem IBD ou um EGID. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-Siglec-8 se liga uma Siglec-8 humana expressa em mastócitos e esgota ou reduz o número de mastócitos. Em algumas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo lgG1.

[00119] Em algumas formas de realização, o tratamento com uma quantidade eficaz de um anticorpo aqui descrito que se liga à Siglec-8 humana (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-8) reduz os eosinófilos no sangue, eosinófilos no intestino delgado e/ou mastócitos no intestino delgado. Em algumas formas de realização, o indivíduo tem EGE. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-Siglec-8 se liga uma Siglec-8 humana expressa em mastócitos e esgota ou reduz o número de mastócitos. Em algumas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo IgG 1.

[00120] A presente invenção demonstra ainda que a expressão de determinados genes em uma amostra de sangue ou soro é aumentada em um modelo de camundongo de gastrite eosinofílica (EG) e gastroenterite (EGE), e diminui mediante tratamento com um anticorpo anti-Siglec-8. Veja o Exemplo 3 e as Figuras 13A-13C. Assim, a expressão desses genes pode servir como um biomarcador útil para a

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57/169 atividade e/ou farmacodinâmica do anti-Siglec-8. Em algumas formas de realização, a expressão do CCL2e/ou CXCL1 em uma amostra de soro ou sangue é reduzida após a administração de um anticorpo antiSiglec-8 da presente invenção ou uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) da presente invenção, por exemplo, em comparação a um valor de referência. Em algumas formas de realização, a expressão do CCL2 em uma amostra de soro ou sangue é reduzida após a administração de um anticorpo anti-Siglec-8 da presente invenção ou uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) da presente invenção, por exemplo, em relação a um valor de referência. Em algumas formas de realização, a expressão gênica é medida em uma amostra de soro ou sangue obtida do indivíduo. Em algumas formas de realização, expressão gênica se refere ao nível de expressão do mRNA. Em algumas formas de realização, expressão gênica se refere ao nível de expressão da proteína. Em algumas formas de realização, a expressão gênica é medida em relação a uma referência ou valor de referência. Em algumas formas de realização, a expressão gênica é medida em relação a um nível basal anterior à administração da composição. Em algumas formas de realização, o valor de referência se refere à expressão de um ou mais outros genes, por exemplo, um gene de manutenção. Em algumas formas de realização, o valor de referência se refere à expressão do gene em uma ou mais amostras de sangue ou soro de um ou mais indivíduos sem um EGID. Um valor de referência pode ser obtido a partir de um indivíduo, a partir de dois indivíduos diferentes ou a partir de um grupo de indivíduos (por exemplo, um grupo de dois, três, quatro, cinco ou mais indivíduos). Em algumas formas de realização, um valor de referência se refere a um padrão ou de referência no campo. Em algumas formas de realização, um valor de referência se refere a um valor calculado de novo a partir de um ou mais indivíduos (por exemplo, sem um distúrbio Gl).

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C. ADMINISTRAÇÃO

[00121] Para prevenção ou tratamento da doença, a dosagem adequada de um agente ativo dependerá do tipo da doença a ser tratada, como definido acima, da gravidade e curso da doença, se o agente é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, da terapia anterior, do histórico clínico do indivíduo e da resposta ao anticorpo, e do critério do médico assistente. O anticorpo é adequadamente administrado ao indivíduo uma única vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Em algumas formas de realização, um intervalo entre as administrações de um anticorpo anti-Siglec-8 (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) aqui descrito é de cerca de um mês ou mais. Em algumas formas de realização, o intervalo entre as administrações é de cerca de dois meses, cerca de três meses, cerca de quatro meses, cerca de cinco meses, cerca de seis meses ou mais. Como usado neste documento, um intervalo entre as administrações se refere ao período de tempo entre uma administração do anticorpo e a próxima administração do anticorpo. Como usado neste documento, um intervalo de cerca de um mês inclui quatro semanas. Assim, em algumas formas de realização, o intervalo entre as administrações é cerca de quatro semanas, cerca de cinco semanas, cerca de seis semanas, cerca de sete semanas, cerca de oito semanas, cerca de nove semanas, cerca de dez semanas, cerca de onze semanas, de cerca de doze semanas, cerca de dezesseis semanas, cerca de vinte semanas, cerca de vinte e quatro semanas, ou mais. Em algumas formas de realização, o tratamento inclui várias administrações dos anticorpos, em que o intervalo entre as administrações pode variar. Por exemplo, o intervalo entre a primeira administração e a segunda administração é de cerca de um mês, e os intervalos entre as administrações subsequentes são de cerca de três meses. Em algumas formas de realização, o intervalo entre a primeira administração e a

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59/169 segunda administração é de cerca de um mês, o intervalo entre a segunda administração e a terceira administração é de cerca de dois meses, e os intervalos entre as administrações subsequentes são de cerca de três meses. Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) é administrado a uma dose regular. Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo a uma dosagem de 0,1 mg a cerca de 1800 mg por dose. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-Siglec-8 (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo a uma dosagem de aproximadamente qualquer uma dentre 0,1 mg, 0,5 mg, 1 mg, 5 mg , 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 950 mg, 1000 mg, 1100 mg, 1200 mg, 1300 mg, 1400 mg, 1500 mg, 1600 mg, 1700 mg e 1800 mg por dose. Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo a uma dosagem de 150 mg a cerca de 450 mg por dose. Em algumas formas de realização, o anticorpo antiSiglec-8 (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo a uma dosagem de aproximadamente qualquer uma dentre 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg e 450 mg por dose. Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo a uma dosagem de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg por dose. Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo

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60/169 a uma dosagem de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg por dose. Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo a uma dosagem de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg ou de cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito é administrado a um indivíduo a uma dosagem de aproximadamente qualquer uma dentre 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg; 1,0 mg/kg; 1,5 mg/kg; 2,0 mg/kg; 2,5 mg/kg; 3,0 mg/kg; 3,5 mg/kg; 4,0 mg/kg; 4,5 mg/kg; 5,0 mg/kg; 5,5 mg/kg; 6,0 mg/kg; 6,5 mg/kg; 7,0 mg/kg; 7,5 mg/kg; 8,0 mg/kg; 8,5 mg/kg; 9,0 mg/kg; 9,5 mg/kg ou 10,0 mg/kg. Pode ser usada qualquer uma das frequências de dosagem acima descritas. Qualquer frequência de dosagem acima descrita pode ser usada nos métodos ou usos das composições aqui descritas. A eficácia do tratamento com um anticorpo aqui descrito (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec8 humana) pode ser avaliada usando qualquer uma das metodologias ou ensaios descritos aqui em intervalos que variam entre a cada semana e a cada três meses. Em algumas formas de realização, a eficácia do tratamento (por exemplo, a redução ou a melhora de um ou mais sintomas) é avaliada aproximadamente a cada um mês, aproximadamente a cada dois meses, aproximadamente a cada três meses, aproximadamente a cada quatro meses, aproximadamente a cada cinco meses, aproximadamente a cada seis meses ou mais tempo após a administração de um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana. Em algumas formas de realização, a eficácia do tratamento (por exemplo, a redução ou a melhora de um ou mais sintomas) é avaliada aproximadamente a cada semana, aproximadamente a cada duas semanas, aproximadamente a cada três semanas, aproximadamente a cada quatro semanas, aproximadamente a cada cinco semanas, aproximadamente a cada seis semanas, aproximadamente a cada sete

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61/169 semanas, aproximadamente a cada oito semanas, aproximadamente a cada nove semanas, aproximadamente a cada dez semanas, aproximadamente a cada onze semanas, aproximadamente a cada doze semanas, aproximadamente a cada dezesseis semanas, aproximadamente a cada vinte semanas, aproximadamente a cada vinte e quatro semanas, ou mais.

[00122] Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec8 aqui descrito (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo mensalmente a uma dosagem de 0,3 mg/kg a 1,0 mg/kg por infusão intravenosa. Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo mensalmente a uma dosagem de 0,3 mg/kg a 1,0 mg/kg por injeção subcutânea. Em algumas formas de realização, um anticorpo antiSiglec-8 aqui descrito (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec8 humana) é administrado a um indivíduo a cada quatro semanas a uma dosagem de 0,3 mg/kg a 1,0 mg/kg por infusão intravenosa. Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo a cada quatro semanas a uma dosagem de 0,3 mg/kg a 1,0 mg/kg por injeção subcutânea.

[00123] Os anticorpos aqui descritos que se ligam à Siglec-8 humana podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros agentes nos métodos descritos neste documento. Por exemplo, um anticorpo que se liga a uma Siglec-8 humans pode ser coadministrado com um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, etc.) agentes terapêuticos adicionais para tratar e/ou prevenir doenças gastrointestinais (por exemplo, IBD ou um EGID). Os agentes terapêuticos, contemplados neste documento para IBD incluem, mas não se limitam a, sulfassalazina, azatioprina, mercaptopurina,

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62/169 ciclosporina, um corticosteroide (por exemplo, budesonida, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisona ou predisona), infliximabe, adalimumabe, etrolizumabe, golimumabe, metotrexato, natalizumabe, vedolizumabe, ustekinumabe, certolizumabe pegol e antibióticos (por exemplo, ciprofloxacina, aminoglicosídeos, rifamixine ou metronidazol). Os agentes terapêuticos contemplados neste documento para um EGID incluem, mas não se limitam a, um corticosteroide (por exemplo, budesonida, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona ou predisona), inibidor de leucotrienos, anti-histamina (por exemplo, cetirizina ou cetotifeno), cromoglicato de sódio, inibidor da bomba de prótons (por exemplo, para EOE sensível a PPI) e sulfasalazina. Em algumas formas de realização, o indivíduo foi submetido a uma cirurgia para tratamento de uma doença gastrointestinal (por exemplo, IBD ou uma EGID) antes da administração do anticorpo.

[00124] Essas terapias de combinação acima abrangem a administração combinada (quando dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos na mesma formulação ou formulações diferentes), e administração separada, nesse caso, a administração do anticorpo da presente invenção pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após a administração dos um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em algumas formas de realização, a administração de um anticorpo antiSiglec-8 aqui descrito e a administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais ocorrem dentro de cerca de um mês, cerca de dois meses, cerca de três meses, cerca de quatro meses, cerca de cinco meses, ou cerca de seis meses uma da outra. Em algumas formas de realização, a administração de um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito e a administração de um ou mais agentes terapêuticos ocorrem dentro de aproximadamente uma semana, aproximadamente duas semanas ou aproximadamente três semanas uma da outra. Em algumas formas

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63/169 de realização, a administração de um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito e a administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais ocorrem dentro de cerca de um dia, cerca de dois dias, cerca de três dias, cerca de quatro dias, cerca de cinco dias ou cerca de seis dias uma das outras.

[00125] Os anticorpos anti-Siglec-8 e/ou um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados por qualquer via de administração adequada conhecida na técnica, incluindo, sem limitação, por administração oral, administração sublingual, administração bucal, administração tópica, administração retal, via inalação, administração transdérmica, injeção subcutânea, injeção intradérmica, injeção intravenosa (IV), a injeção intra-arterial, injeção intramuscular, injeção intracardíaca, injeção intraóssea, injeção intraperitoneal,administração transmucosal, administração vaginal, administração intravítrea, administração intra-articular, administração periarticular, administração local, administração epicutânea ou quaisquer combinações dos mesmos.

D. ANTICORPOS

[00126] Determinados aspectos da presente invenção fornecem anticorpos isolados que se ligam a uma Siglec-8 humana (por exemplo, um anticorpo agonista que se liga à Siglec-8 humana). Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito tem uma ou mais das seguintes características: (1) liga uma Siglec-8 humana; (2) liga-se a um domínio extracelular de uma Siglec-8 humana; (3) liga-se uma Siglec-8 humana com maior afinidade do que o anticorpo de camundongo 2E2 e/ou anticorpos de camundongo 2C4; (4) liga uma Siglec-8 humana com maior avidez do que o anticorpo de camundongo 2E2 e/ou o anticorpo de camundongo 2C4; (5) tem um T_m de cerca de 70°C-72°C ou mais em um ensaio de mudança térmica; (6) com um grau reduzido de fucosilação ou é não fucosilado; (7) liga uma Siglec-8

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64/169 humana expressa em eosinófilos e induz a apoptose de eosinófilos; (8) liga uma Siglec-8 humana expressa em mastócitos e esgota ou reduz o número de mastócitos; (9) liga uma Siglec-8 humana expressa em mastócitos e inibe atividades dependentes de FceRI de mastócitos (por exemplo, liberação de histamina, liberação de PGD2, fluxo de Ca²⁺ e/ou liberação de β-hexosaminidase, etc.); (10) foi engenheirado para melhorar a atividade da ADCC; (11) liga uma Siglec-8 humana expressa em mastócitos e mata mastócitos por atividade da ADCC (in vitroe/ou in vivo); (12) liga-se à Siglec-8 de um ser humano e um primata não humano; (13) liga-se ao Domínio 1, Domínio 2 e/ou Domínio 3 da Siglec8 humana, ou liga um polipeptídeo Siglec-8 compreendendo 0 Domínio 1, Domínio 2 e/ou Domínio 3 da Siglec-8 humana (por exemplo, proteínas de fusão aqui descritas); e (14) esgota eosinófilos ativados com um EC50 inferior ao EC50 do anticorpo de camundongo 2E2 ou 2C4. Qualquer dos anticorpos descritos na Patente US N^Q 9,546,215 e/ou Publicação de Patente WO2015089117 pode encontrar uso nos métodos, composições e kits fornecidos neste documento.

[00127] Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpos que se ligam a uma Siglec-8 humana. Em algumas formas de realização, a Siglec-8 humana compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 72. Em algumas formas de realização, a Siglec-8 humana compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 73. Em algumas formas de realização, 0 anticorpo aqui descrito se liga uma Siglec-8 humana expressa em mastócitos e esgota ou reduz 0 número de mastócitos. Em algumas formas de realização, um anticorpo aqui descrito se liga a uma Siglec-8 humana expressa em mastócitos e inibe a atividade mediada por mastócitos.

[00128] Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos que se ligam a uma Siglec-8 humana. Em algumas formas de realização, a Siglec-8 humana compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 72.

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Em algumas formas de realização, a Siglec-8 humana compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 73. Em algumas formas de realização, o anticorpo aqui descrito se liga a um epítopo no Domínio 1 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 112. Em algumas formas de realização, o anticorpo aqui descrito se liga a um epítopo no Domínio 2 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 113. Em algumas formas de realização, o anticorpo aqui descrito se liga a um epítopo no Domínio 3 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 114. Em algumas formas de realização, o anticorpo aqui descrito se liga a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID N^Q: 116, mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido da SEQ ID N^Q: 115. Em algumas formas de realização, o anticorpo aqui descrito se liga a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID N^Q: 117, mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido da SEQ ID N^Q: 115. Em algumas formas de realização, o anticorpo aqui descrito se liga a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID N^Q: 117, mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido da SEQ ID N^Q: 116. Em algumas formas de realização, o anticorpo aqui descrito se liga a um epítopo linear no domínio extracelular da Siglec-8 humana. Em algumas formas de realização aqui descrito, o anticorpo aqui descrito se liga a um epítopo conformacional no domínio extracelular da Siglec-8 humana. Em algumas formas de realização, um anticorpo aqui descrito se liga a uma Siglec-8 humana expressa em eosinófilos e induz a apoptose de eosinófilos. Em algumas formas de realização, um anticorpo aqui descrito se liga a uma Siglec-8 humana expressa em mastócitos e esgota os mastócitos. Em algumas formas de realização, um anticorpo aqui descrito se liga a uma Siglec-8 humana expressa em mastócitos e

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66/169 inibe a atividade mediada por mastócitos. Em algumas formas de realização, um anticorpo aqui descrito se liga a uma Siglec-8 humana expressa em mastócitos e mata os mastócitos por atividade da ADCC. Em algumas formas de realização, um anticorpo descrito neste documento esgota os mastócitos e inibe a ativação de mastócitos. Em algumas formas de realização, um anticorpo aqui esgota eosinófilos ativados e inibe a ativação de mastócitos. Em algumas formas de realização, um anticorpo aqui (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-8 não fucosilado) esgota eosinófilos no sangue e inibe a ativação de mastócitos.

[00129] É aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 isolado que se liga à Siglec-8 humana e à Siglec-8 não humana de primatas. A identificação de anticorpos com reatividade cruzada a primatas seria útil para testes pré-clínicos de anticorpos anti-Siglec-8 em primatas não humanos. Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos que se ligam a uma Siglec-8 não humana de primata. Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos que se ligam a uma Siglec-8 humana e a uma Siglec8 não humana de primata. Em algumas formas de realização, a Siglec8 não humana de primata compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 118 ou uma parte dela. Em algumas formas de realização, a Siglec-8 não humana de primata compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 119 ou uma parte dela. Em algumas formas de realização, o primata não humano é um babuíno (por exemplo, Papio Anubis). Em algumas formas de realização, o anticorpo que se liga a uma Siglec-8 humana e uma Siglec-8 não humana de primata liga-se a um epítopo no Domínio 1 da Siglec-8 humana. Em uma forma de realização adicional, o Domínio 1 da Siglec8 humana compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 112. Em algumas formas de realização, o anticorpo que se liga a uma Siglec8 humana e uma Siglec-8 não humana de primata liga-se a um epítopo

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67/169 no Domínio 3 da Siglec-8 humana. Em uma forma de realização adicional, o Domínio 3 da Siglec-8 humana compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 114. Em algumas formas de realização, o anticorpo que se liga a uma Siglec-8 humana e uma Siglec-8 não humana de primata é um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humano. Em algumas formas de realização, o anticorpo que se liga a uma Siglec-8 humana e a uma Siglec-8 não humana de primata é um anticorpo de murino. Em algumas formas de realização, o anticorpo que se liga a uma Siglec-8 humana e a uma Siglec-8 não humana de primata é um anticorpo IgG 1 humano.

[00130] Em um aspecto, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito é um anticorpo monoclonal. Em um aspecto, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito é um fragmento de anticorpo (incluindo o fragmento de ligação ao antígeno), por exemplo, um fragmento FAB, Fab'-SH, Fv, scFv ou (Fab')2. Em um aspecto, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito compreende um fragmento de anticorpo (incluindo o fragmento de ligação ao antígeno), por exemplo, um fragmento Fab, Fab'-SH, Fv, scFv ou (Fab')2. Em um aspecto, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Em um aspecto, qualquer um dos anticorpos anti-Siglec-8 aqui descritos é purificado.

[00131] Em um aspecto, são fornecidos anticorpos anti-Siglec-8 que competem com o anticorpo 2E2 de murino e o anticorpo 2C4 de murino que se ligam à Siglec-8. Também são fornecidos os anticorpos anti-Siglec8 que se ligam ao mesmo epítopo como o anticorpo 2E2 de murino e o anticorpo 204 de murino. Anticorpos de murino para Siglec-8, anticorpos 2E2 e 204 são descritos na Patente US N° 8.207.305; Patente US N° 8.197.811, Patente US N° 7.871.612 e Patente US N° 7.557.191.

[00132] Em um aspecto, são fornecidos anticorpos anti-Siglec-8 que competem com qualquer anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito (por

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68/169 exemplo, HEKA, HEKF, 1C3, 1H10, 4F11, 2C4, 2E2) por ligação à Siglec-8. Também são fornecidos anticorpos anti-Siglec-8 que se ligam ao mesmo epítopo como qualquer anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito (por exemplo, HEKA, HEKF, 1C3, 1H10, 4F11,2C4, 2E2)

[00133] Em um aspecto da presente invenção, são fornecidos polinucleotídeos que codificam anticorpos anti-Siglec-8. Em algumas formas de realização, são fornecidos vetores compreendendo polinucleotídeos que codificam anticorpos anti-Siglec-8. Em uma forma de realização, são fornecidas células hospedeiras compreendendo esses vetores. Em outro aspecto da presente invenção, são fornecidas composições compreendendo anticorpos anti-Siglec-8 ou polinucleotídeos que codificam anticorpos anti-Siglec-8. Em algumas formas de realização, uma composição da presente invenção é uma formulação farmacêutica para o tratamento da IBD. Em algumas formas de realização, uma composição da presente invenção é uma formulação farmacêutica para a prevenção da IBD.

[0013d] Em um aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo 1,2, 3, 4, 5 ou 6 das sequências HVR do anticorpo 2C4 de murino. Em um aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo 1,2, 3, 4, 5 ou 6 das sequências HVR do anticorpo 2E2 de murino. Em algumas formas de realização, a HVR é uma CDR de Kabat ou CDR de Chothia.

[00135] Em um aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo 1,2, 3, 4, 5 ou 6 das sequências HVR do anticorpo 1C3 de murino. Em um aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 das sequências HVR do anticorpo 4F11 de murino. Em um aspecto, é aqui fornecido um anticorpo antiSiglec-8 compreendendo 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 das sequências HVR do anticorpo 1H10 de murino. Em algumas formas de realização, a HVR é uma CDR de Kabat ou CDR de Chothia.

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[00136] Em algumas formas de realização, o anticorpo aqui descrito se liga a um epítopo no Domínio 1 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 112. Em algumas formas de realização, o anticorpo aqui descrito se liga a um epítopo no Domínio 2 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 113. Em algumas formas de realização, o anticorpo aqui descrito se liga a um epítopo no Domínio 3 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 114.

[00137] Em algumas formas de realização, o anticorpo aqui descrito se liga a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID N^Q: 116, mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido da SEQ ID N^Q: 115. Em algumas formas de realização, o anticorpo aqui descrito se liga a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID N^Q: 117, mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido da SEQ ID N^Q: 115. Em algumas formas de realização, o anticorpo aqui descrito se liga a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID N^Q: 117, mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido da SEQ ID N^Q: 116.

[00138] Em outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec8 compreendendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 88, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 91, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 94; e/ou uma região variável da cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 97, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 100, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 103. Em

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70/169 algumas formas de realização, o anticorpo aqui descrito se liga a um epítopo no Domínio 2 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 113.

[00139] Em outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec8 compreendendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 89, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 92, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 95; e/ou uma região variável da cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 98, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 101, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 104. Em algumas formas de realização, o anticorpo aqui descrito se liga a um epítopo no Domínio 3 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 114. Em algumas formas de realização, o anticorpo aqui descrito se liga a uma Siglec-8 humana e a uma Siglec-8 não humana de primata.

[00140] Em outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec8 compreendendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 90, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 93, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 96; e/ou uma região variável da cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 99, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 102, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 105. Em

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71/169 algumas formas de realização, o anticorpo aqui descrito se liga a um epítopo no Domínio 1 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 112. Em algumas formas de realização, o anticorpo aqui descrito se liga a uma Siglec-8 humana e a uma Siglec-8 não humana de primata.

[00141] Em um aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 63; e/ou em que a região variável da cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 66.

[00142] Em um aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 67-70; e/ou em que a região variável da cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 66.

[00143] Em um aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8

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72/169 compreendendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 63; e/ou em que a região variável da cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 71.

[00144] Em outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec8 compreendendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 67-70; e/ou em que a região variável da cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 71.

[00145] Em outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec8 compreendendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 88, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 91, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 94; e/ou uma região variável

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73/169 da cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 97, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 100, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 103.

[00146] Em outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec8 compreendendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 89, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 92, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 95; e/ou uma região variável da cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 98, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 101, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 104.

[00147] Em outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec8 compreendendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 90, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 93, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 96; e/ou uma região variável da cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 99, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 102, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 105.

[00148] Um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito pode compreender qualquer sequência de domínio variável framework adequada, desde que o anticorpo tenha a capacidade de ligação à Siglec-8 humana. Conforme usado neste documento, as regiões framework da cadeia

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74/169 pesada são designadas HC-FR1-FR4, e as regiões framework da cadeia leve são designadas LC-FR1-FR4. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-Siglec-8 compreende uma sequência framework do domínio variável da cadeia pesada da SEQ ID N^QS: 26, 34, 38 e 45 (HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 e HC-FR4, respectivamente). Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-Siglec-8 compreende uma sequência framework do domínio variável da cadeia leve da SEQ ID N^QS: 48, 51, 55 e 60 (LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 e LC-FR4, respectivamente). Em algumas formas de realização, o anticorpo antiSiglec-8 compreende uma sequência framework do domínio variável da cadeia leve da SEQ ID N^QS: 48, 51,58 e 60 (LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 e LC-FR4, respectivamente).

[00149] Em uma forma de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 compreende um domínio variável da cadeia pesada, compreendendo uma sequência framework e regiões hipervariáveis, em que a sequência framework compreende as sequências HC-FR1-HC-FR4 SEQ ID N^QS: 26-29 (HC-FR1), SEQ ID N^QS: 31-36 (HC-FR2), SEQ ID N^QS: 38-43 (HCFR3) e SEQ ID N^QS: 45 ou 46 (HC-FR4), respectivamente; a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 61; a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 62; e a HVRH3 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 63. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência framework e regiões hipervariáveis, em que a sequência framework compreende as sequências HC-FR1-HC-FR4 SEQ ID N^QS: 26-29 (HCFR1), SEQ ID N^QS: 31-36 (HC-FR2), SEQ ID N^QS: 38-43 (HC-FR3), e a SEQ ID N^Q: 45 ou 46 (HC-FR4), respectivamente; a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 61; a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 62; e a HVRH3 é compreende uma sequência de aminoácidos selecionados dentre

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75/169 as SEQ ID N^QS: 67-70. Em uma forma de realização, um anticorpo antiSiglec-8 compreende um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência framework e regiões hipervariáveis, em que a sequência framework compreende as sequências LC-FR1-LCFR4 SEQ ID N^Q: 48 ou 49 (LC-FR1), SEQ ID N^QS: 51-53 (LC-FR2), SEQ ID N^QS: 55-58 (LC-FR3) e SEQ ID N^Q: 60 (LC-FR4), respectivamente; a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 64; a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 65, e a HVR-L3 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 66. Em uma forma de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 compreende um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência framework e regiões hipervariáveis, em que a sequência framework compreende as sequências LC-FR1-LC-FR4 SEQ ID N^Q: 48 ou 49 (LC-FR1), SEQ ID N^QS: 51-53 (LC-FR2), SEQ ID N^QS: 55-58 (LCFR3) e SEQ ID N^Q: 60 (LC-FR4), respectivamente; a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 64; a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 65, e a HVRL3 compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 71. Em uma forma de realização desses anticorpos, o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 2-10 e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 16-22. Em uma forma de realização desses anticorpos, o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 2-10 e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre a SEQ ID N^Q: 23 ou 24. Em uma forma de realização desses anticorpos, o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 1114 e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência de

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76/169 aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 16-22. Em uma forma de realização desses anticorpos, o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 11 -14 e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre a SEQ ID N^Q: 23 ou 24. Em uma forma de realização desses anticorpos, o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N-: 6 e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 16. Em uma forma de realização desses anticorpos, o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N-: 6 e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 21.

[00150] Em algumas formas de realização, as sequências HVR da cadeia pesada compreendem as seguintes:

a) HVR-H1 (IYGAH (SEQ ID N^Q: 61));

b) HVR-H2 (VIWAGGSTNYNSALMS (SEQ ID N^Q: 62)); e

c) HVR-H3 (DGSSPYYYSMEY (SEQ ID N^Q: 63); DGSSPYYYGMEY (SEQ ID N^Q: 67); DGSSPYYYSMDY (SEQ ID N^Q:68); DGSSPYYYSMEV (SEQ ID N^Q: 69); ou DGSSPYYYGMDV (SEQ ID N^Q: 70)).

[00151] Em algumas formas de realização, as sequências HVR da cadeia pesada compreendem as seguintes:

a) HVR-H1 (SYAMS (SEQ ID N^Q: 88); DYYMY (SEQ ID N^Q: 89); or SSWMN (SEQ ID N^Q: 90));

b) HVR-H2 (IISSGGSYTYYSDSVKG (SEQ ID N^Q: 91); RIAPEDGDTEYAPKFQG (SEQ ID N^Q: 92); or QIYPGDDYTNYNGKFKG (SEQ ID N^Q: 93)); and c) HVR-H3 (HETAQAAWFAY (SEQ ID N^Q: 94); EGNYYGSSILDY (SEQ ID N^Q: 95); or LGPYGPFAD (SEQ ID N^Q: 96)). [00152] Em algumas formas de realização, as sequências FR da

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77/169 cadeia pesada compreendem as seguintes:

[00153] HC-FR1 (EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLT (SEQ ID N²: 26); EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLT (SEQ ID N²: 27); QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIS (SEQ ID N²: 28); ou QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLT (SEQ ID N²: 29));

[00154] HC-FR2 (WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID N²: 31); WVRQAPGKGLEWLG (SEQ ID N²: 32); WVRQAPGKGLEWLS (SEQ ID N²: 33); WVRQAPGKGLEWVG (SEQ ID N²: 34);

WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID N²: 35); ou WVRQPPGKGLEWLG (SEQ ID N²: 36));

[00155] HC-FR3 (RFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID N²: 38); RLSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID N²: 39); RLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID N²: 40); RFSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID N²: 41); RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID N²: 42); ou RLSISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID N²: 43)); e

[00156] HC-FR4 (WGQGTTVTVSS (SEQ ID N²: 45); ou WGQGTLVTVSS (SEQ ID N²: 46)).

[00157] Em algumas formas de realização, as sequências HVR da cadeia leve compreendem as seguintes:

a) HVR-L1 (SATSSVSYMH (SEQ ID N²: 64));

b) HVR-L2 (STSNLAS (SEQ ID N²: 65)); e

c) HVR-L3 (QQRSSYPFT (SEQ ID N²: 66); ou QQRSSYPYT (SEQ ID N²: 71)).

[00158] Em algumas formas de realização, as sequências HVR da cadeia leve compreendem as seguintes:

a) HVR-L1 (SASSSVSYMH (SEQ ID N²: 97);

RASQDITNYLN (SEQ ID N²: 98); ou SASSSVSYMY (SEQ ID N²: 99));

b) HVR-L2 (DTSKLAY (SEQ ID N²: 100); FTSRLHS (SEQ ID N²: 101); ou DTSSLAS (SEQ ID N²: 102)); e

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c) HVR-L3 (QQWSSNPPT (SEQ ID N^Q: 103); QQGNTLPWT (SEQ ID N^Q: 104); ou QQWNSDPYT (SEQ ID N^Q: 105)). [00159] Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende: uma região variável da cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 88, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 91, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 94; e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 97, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 100, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 103;

uma região variável da cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 89, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 92, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 95; e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 98, (ii) a HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 101, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 104; ou i.uma região variável da cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 90, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 93, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 96; e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 99, (ii) a HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 102, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 105.

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[00160] Em algumas formas de realização, as sequências FR da cadeia leve compreendem as seguintes:

a) LC-FR1 (EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID N²: 48); ou EIILTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID N²: 49));

b) LC-FR2 (WFQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID N²: 51); WFQQKPGQAPRLWIY (SEQ ID N²: 52); ou WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID N²: 53));

c) LC-FR3 (GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID N²: 55); GVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID N²: 56); GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID N²: 57); ou GIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID N²: 58)); e

d) LC-FR4 (FGPGTKLDIK (SEQ ID N²: 60)).

[00161] Em algumas formas de realização, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-8 humanizado) que se liga à Siglec-8 humana, em que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que o anticorpo compreende:

(a) domínio variável da cadeia pesada compreendendo:

(1) uma HC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^2S: 26-29;

(2) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N²: 61;

(3) uma HC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^2S: 31-36;

(4) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N²: 62;

(5) uma HC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^2S: 38-43;

(6) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de

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80/169 aminoácidos da SEQ ID N^Q: 63; e (7) uma HC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^QS: 45-46, e/ou (b) um domínio variável da cadeia leve compreendendo:

(8) uma LC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^QS: 48-49;

(9) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 64;

(10) uma LC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^QS: 51-53;

(11) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 65;

(12) uma LC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^QS: 55-58;

(13) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 66; e (14) uma LC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 60.

[00162] Em um aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável da cadeia pesada selecionado dentre as SEQ ID N^QS: 2-10 e/ou compreendendo um domínio variável da cadeia leve selecionado dentre as SEQ ID N^QS:16-22. Em um aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável da cadeia pesada selecionado dentre as SEQ ID N^QS: 2-14 e/ou compreendendo um domínio variável da cadeia leve selecionado dentre as SEQ ID N^QS:16-24. Em um aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável da cadeia pesada selecionado dentre as SEQ ID N^QS: 2-10 e/ou compreendendo um domínio variável da cadeia leve selecionado dentre

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81/169 a SEQ ID N^Q: 23 ou 24. Em um aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável da cadeia pesada selecionado dentre as SEQ ID N^QS: 11-14 e/ou compreendendo um domínio variável da cadeia leve selecionado dentre as SEQ ID N^QS: 1622. Em um aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável da cadeia pesada selecionado dentre as SEQ ID N^QS: 11-14 e/ou compreendendo um domínio variável da cadeia leve selecionado dentre as SEQ ID N^Q: 23 e 24. Em um aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável da cadeia pesada da SEQ ID N^Q: 6 e/ou compreendendo um domínio variável da cadeia leve selecionado dentre as SEQ ID N^Q: 16 ou 21.

[00163] Em um aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável da cadeia pesada selecionado dentre as SEQ ID N^QS: 106-108 e/ou compreendendo um domínio variável da cadeia leve selecionado dentre as SEQ ID N^QS:109-111. Em um aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável da cadeia pesada da SEQ ID N^Q: 106 e/ou compreendendo um domínio variável da cadeia leve da SEQ ID N^Q: 109. Em um aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável da cadeia pesada da SEQ ID N^Q: 107 e/ou compreendendo um domínio variável da cadeia leve da SEQ ID N^Q: 110. Em um aspecto, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável da cadeia pesada da SEQ ID N^Q: 108 e/ou compreendendo um domínio variável da cadeia leve da SEQ ID N^Q: 111.

[00164] Em algumas formas de realização, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de

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82/169 identidade de sequência para uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 2-14. Em algumas formas de realização, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 106-108. Em algumas formas de realização, uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência contém substituições, inserções ou exclusões em relação à sequência de referência, mas um anticorpo compreendendo essa sequência de aminoácidos mantém a capacidade de se ligar à Siglec-8 humana. Em algumas formas de realização, as substituições, inserções ou deleções (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos) ocorrem em regiões fora das HVRs (ou seja, nas FRs). Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 6. Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 106-108.

[00165] Em algumas formas de realização, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 16-24. Em algumas formas de realização, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou

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99% de identidade de sequência para uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 109-111. Em algumas formas de realização, uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência contém substituições, inserções ou exclusões em relação à sequência de referência, mas um anticorpo compreendendo essa sequência de aminoácidos mantém a capacidade de se ligar à Siglec-8 humana. Em algumas formas de realização, as substituições, inserções ou deleções (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos) ocorrem em regiões fora das HVRs (ou seja, nas FRs). Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 compreende um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 16 ou 21. Em algumas formas de realização, um anticorpo antiSiglec-8 compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 109-111.

[00166] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo (a) uma, duas ou três HVRs VH selecionadas dentre aquelas mostradas na Tabela 1 e/ou (b) uma, duas ou três HVRs VL selecionadas dentre as apresentadas na Tabela 1.

[00167] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo (a) uma, duas ou três HVRs VH selecionadas dentre aquelas mostradas na Tabela 2 e/ou (b) uma, duas ou três HVRs VL selecionadas dentre as apresentadas na Tabela 2.

[00168] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo (a) uma, duas, três ou quatro FRs VH selecionadas dentre aquelas mostradas na Tabela 3 e/ou (b) uma, duss, três ou quatro FRs VL selecionadas dentre aquelas mostradas na Tabela 3.

[00169] Em algumas formas de realização, é aqui fornecido um

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84/169 anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável da cadeia pesada e/ou um domínio variável da cadeia leve de um anticorpo mostrado na Tabela 4, por exemplo, anticorpo HAKA, anticorpo HAKB, anticorpo HAKC, etc.

TABELA 1. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DAS HVRS DE ANTICORPOS

Cadeia de Anticorpos	HVR1	HVR2	HVR3
	X	\nticorpo 2E2
Cadeia pesada	IYGAH SEQ ID N^e: 61	VIWAGGSTNYNSALMS SEQ ID N^e: 62	DGSSPYYYSMEY SEQ ID N^e: 63
Cadeia leve	SATSSVSYMH SEQ ID N^e: 64	STSNLAS SEQ ID N^e: 65	QQRSSYPFT SEQ ID N^e: 66
Variantes Humanizadas de Cadeia Pesada 2E2 RHA, 2E2 RHB, 2E2 RHC, 2E2 RHD, 2E2 RHE, 2E2 RHE, 2E2 RHG, 2E2 RHA2 e 2E2 RHB2
Cadeia pesada	IYGAH SEQ ID N^e: 61	VIWAGGSTNYNSALMS SEQ ID N^e: 62	DGSSPYYYSMEY SEQ ID N^e: 63
Variantes Humanizadas de Cadeia Leve 2E2 RKA, 2E2 RKB, 2E2 RKC, 2E2 RKD, 2E2 RKE, 2E2 RKF e 2E2 RKG
Cadeia leve	SATSSVSYMH SEQ ID N^e: 64	STSNLAS SEQ ID N^e: 65	QQRSSYPFT SEQ ID N^e: 66
Variantes Humanizadas de Cadeia Pesada 2E2 RHE S-G, 2E2 RHE E-D, 2E2 RHE Y-Ve 2E2 RHE triple
2E2 RHE S-G	IYGAH SEQ ID N^e: 61	VIWAGGSTNYNSALMS SEQ ID N^e: 62	DGSSPYYYGMEY SEQ ID N^e: 67
2E2 RHE E-D	IYGAH SEQ ID N^e: 61	VIWAGGSTNYNSALMS SEQ ID N^e: 62	DGSSPYYYSMDY SEQ ID N^e: 68
2E2 RHE Y-V	IYGAH SEQ ID N^e: 61	VIWAGGSTNYNSALMS SEQ ID N^e: 62	DGSSPYYYSMEV SEQ ID N^e: 69
2E2 RHE triple	IYGAH SEQ ID N^e: 61	VIWAGGSTNYNSALMS SEQ ID N^e: 62	DGSSPYYYGMDV SEQ ID N^e: 70
Variantes Humanizadas de Cadeia Leve 2E2 RKA F-Y e 2E2 RKF F-Y
2E2 RKA F-Y	SATSSVSYMH SEQ ID N^e: 64	STSNLAS SEQ ID N^e: 65	QQRSSYPYT SEQ ID N^e: 71
2E2 RKF F-Y	SATSSVSYMH SEQ ID N^e: 64	STSNLAS SEQ ID N^e: 65	QQRSSYPYT SEQ ID N^e: 71

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TABELA 2. Sequências de aminoácidos das HVRs de anticorpos 1C3, 1H10 e 4F11 de murino

Anticorpo	Cadeia	HVR1	HVR2	HVR3
1C3	Cadeia	SYAMS	IISSGGSYTYYSDSVKG	HETAQAAWFAY
	Pesada	SEQ ID N^s: 88	SEQ ID N^s: 91	SEQ ID N^s: 94
1H10	Cadeia	DYYMY	RIAPEDGDTEYAPKFQG	EGNYYGSSILDY
	Pesada	SEQ ID N^s: 89	SEQ ID N^s: 92	SEQ ID N^s: 95
4F11	Cadeia	SSWMN	QIYPGDDYTNYNGKFKG	LGPYGPFAD
	Pesada	SEQ ID N^s: 90	SEQ ID N^s: 93	SEQ ID N^s: 96
1C3	Cadeia	SASSSVSYMH	DTSKLAY	QQWSSNPPT
	Leve	SEQ ID N^s: 97	SEQ ID N^s: 100	SEQ ID N^s: 103
1H10	Cadeia	RASQDITNYLN	FTSRLHS	QQGNTLPWT
	Leve	SEQ ID N^s: 98	SEQ ID N^s: 101	SEQ ID N^s: 104
4F11	Cadeia	SASSSVSYMY	DTSSLAS	QQWNSDPYT
	Leve	SEQ ID N^s: 99	SEQ ID N^s: 102	SEQ ID N^s: 105

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TABELA 3. Sequências de aminoácidos das FRs de anticorpos

Cadeia Pesada	FR1	FR2	FR3	FR4
2E2	QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLT (SEQ ID N°: 25)	WVRQPPGKGLEWLG (SEQ ID N°: 30)	RLSISKDNSKSQVFLKINSLQTDDTALYYCAR (SEQ ID N°: 37)	WGQGTSVTVSS (SEQ ID N°: 44)
2E2 RHA	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLT (SEQ ID N°: 26)	WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID N°: 31)	RFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID N°: 38)	WGQGTTVTVSS (SEQ ID N°: 45)
2E2 RHB	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLT (SEQ ID N°: 27)	WVRQAPGKGLEWLG (SEQ ID N°: 32)	RLSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID N°: 39)	WGQGTTVTVSS (SEQ ID N°: 45)
2E2 RHC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLT (SEQ ID N°: 27)	WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID N°: 31)	RFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID N°: 38)	WGQGTTVTVSS (SEQ ID N°: 45)
2E2 RHD	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLT (SEQ ID N°: 26)	WVRQAPGKGLEWLS (SEQ ID N°: 33)	RFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID N°: 38)	WGQGTTVTVSS (SEQ ID N°: 45)
2E2 RHE	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLT (SEQ ID N°: 26)	WVRQAPGKGLEWVG (SEQ ID N°: 34)	RFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID N°: 38)	WGQGTTVTVSS (SEQ ID N°: 45)
2E2 RHF	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLT (SEQ ID N°: 26)	WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID N°: 31)	RLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID N°: 40)	WGQGTTVTVSS (SEQ ID N°: 45)
2E2 RHG	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLT (SEQ ID N°: 26)	WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID N°: 31)	RFSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID N°: 41)	WGQGTTVTVSS (SEQ ID N°: 45)
2E2 RHA2	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIS (SEQ ID N°: 28)	WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID N°: 35)	RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID N°: 42)	WGQGTLVTVSS (SEQ ID N°: 46)
2E2 RHB2	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLT (SEQ ID N°: 29)	WVRQPPGKGLEWLG (SEQ ID N°: 36)	RLSISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID N°: 43)	WGQGTLVTVSS (SEQ ID N°: 46)
2E2 RHE S-G	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLT (SEQ ID N°: 26)	WVRQAPGKGLEWVG (SEQ ID N°: 34)	RFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID N°: 38)	WGQGTTVTVSS (SEQ ID N°: 45)
2E2 RHE E-D	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLT (SEQ ID N°: 26)	WVRQAPGKGLEWVG (SEQ ID N°: 34)	RFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID N°: 38)	WGQGTTVTVSS (SEQ ID N°: 45)

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2E2 RHE Y-V	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLT (SEQ ID N°: 26)	WVRQAPGKGLEWVG (SEQ ID N°: 34)	RFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID N°: 38)	WGQGTTVTVSS (SEQ ID N°: 45)
2E2 RHE triple	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLT (SEQ ID N°: 26)	WVRQAPGKGLEWVG (SEQ ID N°: 34)	RFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID N°: 38)	WGQGTTVTVSS (SEQ ID N°: 45)
Cadeia Leve	FR1	FR2	FR3	FR4
2E2	QIILTQSPAIMSASPGEKVSITC (SEQ ID N°: 47)	WFQQKPGTSPKLWIY (SEQ ID N°: 50)	GVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYC (SEQ ID N°: 54)	FGSGTKLEIK (SEQ ID N°: 59)
RKA	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID N°: 48)	WFQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID N°: 51)	GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID N°: 55)	FGPGTKLDIK (SEQ ID N°: 60)
RKB	EIILTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID N°: 49)	WFQQKPGQAPRLWIY (SEQ ID N°: 52)	GVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID N°: 56)	FGPGTKLDIK (SEQ ID N°: 60)
RKC	EIILTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID N°: 49)	WFQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID N°: 51)	GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID N°: 55)	FGPGTKLDIK (SEQ ID N°: 60)
RKD	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID N°: 48)	WFQQKPGQAPRLWIY (SEQ ID N°: 52)	GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID N°: 55)	FGPGTKLDIK (SEQ ID N°: 60)
RKE	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID N°: 48)	WFQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID N°: 51)	GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID N°: 57)	FGPGTKLDIK (SEQ ID N°: 60)
RKF	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID N°: 48)	WFQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID N°: 51)	GIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID N°: 58)	FGPGTKLDIK (SEQ ID N°: 60)
RKG	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID N°: 48)	WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID N°: 53)	GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID N°: 55)	FGPGTKLDIK (SEQ ID N°: 60)
RKA F-Y	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID N°: 48)	WFQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID N°: 51)	GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID N°: 55)	FGPGTKLDIK (SEQ ID N°: 60)
RKF F-Y	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID N°: 48)	WFQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID N°: 51)	GIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID N°: 58)	FGPGTKLDIK (SEQ ID N°: 60)

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TABELA 4. Sequências de aminoácidos das regiões variáveis de anticorpos

Nome do Anticorpo	Cadeia Pesada Variável	Cadeia Leve Variável
ch2C4	ch2C4 VH	ch2C4 VK
ch2E2	ch2E2 VH (SEQIDNM)	ch2E2 VK (SEQ ID N^s: 15)
cVHKA	ch2E2 VH (SEQIDNM)	2E2 RKA (SEQ ID N^s: 16)
cVHKB	ch2E2 VH (SEQIDNM)	2E2 RKB (SEQ ID N^s: 17)
HAcVK	2E2 RHA (SEQ ID N^s: 2)	ch2E2 VK (SEQ ID N^s: 15)
HBcVK	2E2 RHB (SEQ ID N^s: 3)	ch2E2 VK (SEQ ID N^s: 15)
HAKA	2E2 RHA (SEQ ID N^s: 2)	2E2 RKA (SEQ ID N^s: 16)
HAKB	2E2 RHA (SEQ ID N^s: 2)	2E2 RKB (SEQ ID N^s: 17)
HAKC	2E2 RHA (SEQ ID N^s: 2)	2E2 RKC (SEQ ID N^s:18)
HAKD	2E2 RHA (SEQ ID N^s: 2)	2E2 RKD (SEQ ID N^s: 19)
HAKE	2E2 RHA (SEQ ID N^s: 2)	2E2 RKE (SEQ ID N^s: 20)
HAKF	2E2 RHA (SEQ ID N^s: 2)	2E2 RKF (SEQ ID N^s: 21)
HAKG	2E2 RHA (SEQ ID N^s: 2)	2E2 RKG (SEQ ID N^s: 22)
HBKA	2E2 RHB (SEQ ID N^s: 3)	2E2 RKA (SEQ ID N^s: 16)
HBKB	2E2 RHB (SEQ ID N^s: 3)	2E2 RKB (SEQ ID N^s: 17)
HBKC	2E2 RHB (SEQ ID N^s: 3)	2E2 RKC (SEQ ID N^s: 18)
HBKD	2E2 RHB (SEQ ID N^s: 3)	2E2 RKD (SEQ ID N^s: 19)
HBKE	2E2 RHB (SEQ ID N^s: 3)	2E2 RKE (SEQ ID N^s: 20)
HBKF	2E2 RHB (SEQ ID N^s: 3)	2E2 RKF (SEQ ID N^s: 21)
HBKG	2E2 RHB (SEQ ID N^s: 3)	2E2 RKG (SEQ ID N^s: 22)
HCKA	2E2 RHC (SEQ ID N^s: 4)	2E2 RKA (SEQ ID N^s: 16)
HCKB	2E2 RHC (SEQ ID N^s: 4)	2E2 RKB (SEQ ID N^s: 17)
HCKC	2E2 RHC (SEQ ID N^s: 4)	2E2 RKC (SEQ ID N^s: 18)
HCKD	2E2 RHC (SEQ ID N^s: 4)	2E2 RKD (SEQ ID N^s: 19)
HCKE	2E2 RHC (SEQ ID N^s: 4)	2E2 RKE (SEQ ID N^s: 20)
HCKF	2E2 RHC (SEQ ID N^s: 4)	2E2 RKF (SEQ ID N^s: 21)
HCKG	2E2 RHC (SEQ ID N^s: 4)	2E2 RKG (SEQ ID N^s: 22)
HDKA	2E2 RHD (SEQ ID N^s: 5)	2E2 RKA (SEQ ID N^s: 16)
HDKB	2E2 RHD (SEQ ID N^s: 5)	2E2 RKB (SEQ ID N^s: 17)
HDKC	2E2 RHD (SEQ ID N^s: 5)	2E2 RKC (SEQ ID N^s: 18)
HDKD	2E2 RHD (SEQ ID N^s: 5)	2E2 RKD (SEQ ID N^s: 19)
HDKE	2E2 RHD (SEQ ID N^s: 5)	2E2 RKE (SEQ ID N^s: 20)
HDKF	2E2 RHD (SEQ ID N^s: 5)	2E2 RKF (SEQ ID N^s: 21)

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H DKG	2E2 RHD (SEQ ID N^s: 5)	2E2 RKG (SEQ ID N^s: 22)
HEKA	2E2 RHE (SEQ ID N^s: 6)	2E2 RKA (SEQ ID N^s: 16)
HEKB	2E2 RHE (SEQ ID N^s: 6)	2E2 RKB (SEQ ID N^s: 17)
HEKC	2E2 RHE (SEQ ID N^s: 6)	2E2 RKC (SEQ ID N^s: 18)
HEKD	2E2 RHE (SEQ ID N^s: 6)	2E2 RKD (SEQ ID N^s: 19)
HEKE	2E2 RHE (SEQ ID N^s: 6)	2E2 RKE (SEQ ID N^s: 20)
HEKF	2E2 RHE (SEQ ID N^s: 6)	2E2 RKF (SEQ ID N^s: 21)
HEKG	2E2 RHE (SEQ ID N^s: 6)	2E2 RKG (SEQ ID N^s: 22)
HFKA	2E2 RHF (SEQ ID N^s: 7)	2E2 RKA (SEQ ID N^s: 16)
HFKB	2E2 RHF (SEQ ID N^s: 7)	2E2 RKB (SEQ ID N^s: 17)
HFKC	2E2 RHF (SEQ ID N^s: 7)	2E2 RKC (SEQ ID N^s: 18)
HFKD	2E2 RHF (SEQ ID N^s: 7)	2E2 RKD (SEQ ID N^s: 19)
HFKE	2E2 RHF (SEQ ID N^s: 7)	2E2 RKE (SEQ ID N^s: 20)
HFKF	2E2 RHF (SEQ ID N^s: 7)	2E2 RKF (SEQ ID N^s: 21)
HFKG	2E2 RHF (SEQ ID N^s: 7)	2E2 RKG (SEQ ID N^s: 22)
HGKA	2E2 RHG (SEQ ID N^s: 8)	2E2 RKA (SEQ ID N^s: 16)
HGKB	2E2 RHG (SEQ ID N^s: 8)	2E2 RKB (SEQ ID N^s: 17)
HGKC	2E2 RHG (SEQ ID N^s: 8)	2E2 RKC (SEQ ID N^s: 18)
HGKD	2E2 RHG (SEQ ID N^s: 8)	2E2 RKD (SEQ ID N^s: 19)
HGKE	2E2 RHG (SEQ ID N^s: 8)	2E2 RKE (SEQ ID N^s: 20)
HGKF	2E2 RHG (SEQ ID N^s: 8)	2E2 RKF (SEQ ID N^s: 21)
HGHG	2E2 RHG (SEQ ID N^s: 8)	2E2 RKG (SEQ ID N^s: 22)
HA2KA	2E2 RHA2 (SEQ ID N^s: 9)	2E2 RKA (SEQ ID N^s: 16)
HA2KB	2E2 RHA2 (SEQ ID N^s: 9)	2E2 RKB (SEQ ID N^s: 17)
HB2KA	2E2 RHB2 (SEQ ID N^s: 10)	2E2 RKA (SEQ ID N^s: 16)
HB2KB	2E2 RHB2 (SEQ ID N^s: 10)	2E2 RKB (SEQ ID N^s: 17)
HA2KF	2E2 RHA2 (SEQ ID N^s: 9)	2E2 RKF (SEQ ID N^s: 21)
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HA2KE	2E2 RHA2 (SEQ ID N^s: 9)	2E2 RKE (SEQ ID N^s: 20)
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Petição 870190127814, de 04/12/2019, pág. 93/213

90/169

HB2KFmut	2E2 RHB2 (SEQ ID N^s: 10)	2E2 RKF F-Y mut (SEQ ID N^s: 24)
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91/169

RHE Triple-KA	2E2 RHE triple (SEQ ID N^s: 14)	2E2 RKA (SEQ ID N^s: 16)
RHE Triple-KB	2E2 RHE triple (SEQ ID N^s: 14)	2E2 RKB (SEQ ID N^s: 17)
RHE Triple-KC	2E2 RHE triple (SEQ ID N^s: 14)	2E2 RKC (SEQ ID N^s: 18)
RHE Triple-KD	2E2 RHE triple (SEQ ID N^s: 14)	2E2 RKD (SEQ ID N^s: 19)
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RHE Triple-KFmut	2E2 RHE triple (SEQ ID N^s: 14)	2E2 RKF F-Y mut (SEQ ID N^s: 24)
RHE Y-VKFmut	2E2 RHE Y-V (SEQ ID N^s: 13)	2E2 RKF F-Y mut (SEQ ID N^s: 24)
RHE E-DKFmut	2E2 RHE E-D (SEQ ID N^s: 12)	2E2 RKF F-Y mut (SEQ ID N^s: 24)

[00170] Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, com as cadeias pesadas designadas α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As classes yea são ainda divididas em subclasses, por exemplo, os seres humanos expressam as seguintes subclasses: lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2. Os anticorpos lgG1 podem existir em várias variantes polimórficas denominadas alotipos (revisado em Jefferis e Lefranc 2009. mAbs Vol. 1 edição 4 1-7), que são adequados para uso em algumas das formas de realização neste documento. As variantes alotípicas comuns em populações humanas são aquelas designadas pelas letras a, f, n, z ou suas combinações. Em qualquer uma das formas de realização, o anticorpo pode compreender uma região Fc da cadeia pesada compreendendo uma região Fc do IgG humano. Em outras formas de realização, a região Fc do IgG humano compreende um lgG1 ou lgG4 humano. Em algumas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo lgG1. Em algumas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo lgG4. Em algumas formas de realização, o lgG4 humano compreende a substituição de aminoácido S228P, em que os resíduos de aminoácidos são numerados de acordo com o índice europeu (EU) como em Kabat. Em algumas formas de realização, o IgG 1 humano compreende a sequência de aminoácidos

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92/169 da SEQ ID N^Q: 78. Em algumas formas de realização, o lgG4 humano compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 79.

[00171] Em algumas formas de realização, é aqui fornecido um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 75; e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 76 e 77. Em algumas formas de realização, o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 87; e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 76. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-Siglec-8 induz a apoptose de eosinófilos ativados. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-Siglec-8 induz a apoptose de eosinófilos em repouso. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-Siglec-8 esgota os eosinófilos ativ ados e inibe a ativação de mastócitos. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-Siglec-8 esgota ou reduz os mastócitos e inibe a ativação de mastócitos. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-Siglec-8 esgota ou reduz o número de mastócitos. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-Siglec-8 mata os mastócitos por meio da atividade de ADCC. Em algumas formas de realização, o anticorpo esgota ou reduz os mastócitos que expressam a Siglec-8 em um tecido. Em algumas formas de realização, o anticorpo esgota ou reduz os mastócitos que expressam a Siglec-8 em um fluido biológico.

1. AFINIDADE DE ANTICORPOS

[00172] Em alguns aspectos, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito se liga à Siglec-8 humana com a mesma ou maior afinidade e/ou avidez superior em comparação ao anticorpo de camundongo 2E2 e/ou o anticorpo de camundongo 2C4. Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 fornecido neste documento tem uma constante

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93/169 de dissociação (Kd) de < 1 μΜ, < 150 nM, < 100 nM, < 50 ηΜ, < 10 ηΜ, < 1 ηΜ, < 0,1 ηΜ, < 0,01 ηΜ ou < 0,001 ηΜ (por exemplo, 10-8 Μ ou menos, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M). Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-

8 aqui descrito se liga	à Siglec-8 humana a uma afinidade de
aproximadamente	1,5	vezes,	aproximadamente	2	vezes,
aproximadamente	3	vezes,	aproximadamente	4	vezes,
aproximadamente	5	vezes,	aproximadamente	6	vezes,
aproximadamente	7	vezes,	aproximadamente	8	vezes,

aproximadamente 9 vezes ou aproximadamente 10 vezes maior do que o anticorpo de camundongo 2E2 e/ou o anticorpo de camundongo 2C4. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-Siglec-8 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 6 e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^Q: 16e21.

[00173] Em uma forma de realização, a afinidade de ligação do anticorpo anti-Siglec-8 pode ser determinada por um ensaio de ressonância plasmônica de superfície. Por exemplo, o Kd ou valor de Kd pode ser medido usando um BIAcore™-2000 ou um BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.) a 25 ° C com lascas de antígeno CM5 imobilizado a ~10 unidades de resposta (RU). Brevemente, lascas de biossensordextrano carboximetilado (CM5, BIAcore® Inc.) são ativadas com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. Anticorpos de captura (por exemplo, Fc de anti-humano) são diluídos com acetato de sódio a 10 mM, pH 4,8, antes da injeção a uma taxa de fluxo de 30 μΙ/minuto e ainda imobilizados com um anticorpo anti-Siglec-8. Para medições de cinética, duas diluições em

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94/169 série da Siglec-8 dimérica são injetadas em PBS com 0,05% de Tween 20 (PBST) a 25°C, a uma vazão de aproximadamente 25 μΙ/min. As taxas de Associação (k_on) e as taxas de dissociação (k_Oft) são calculadas usando um modelo simples de ligação Langmuir individual (BIAcore® Evaluation Software versão 3.2), ajustando simultaneamente os sensores de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como a razão koff/kon. Veja, por exemplo, Chen, Y., et a!., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881.

[00174] Em outra forma de realização, a interferometria de biocamada pode ser usada para determinar a afinidade dos anticorpos anti-Siglec-8 contra Siglec-8. Em um ensaio exemplificativo, a proteína marcada com Siglec-8-Fc é imobilizada em sensores de captura antihumanos, e incubada com concentrações crescentes de fragmentos Fab anti-Siglec-8 de camundongo, quiméricos ou anti-humanizados para obter medições de afinidade usando um instrumento como, por exemplo, o Octet Red 384 System (ForteBio).

[00175] A afinidade de ligação do anticorpo anti-Siglec-8 pode, por exemplo, também ser determinada pela análise de Scatchard descrita em Munson et a!., Anal. Biochem., 107:220 (1980) usando técnicas padrão bem conhecidas na arte relevante. Veja também Scatchard, G., Ann. N.Y. Acad. Anim. Sci. 51:660 (1947).

2. AVIDEZ DOS ANTICORPOS

[00176] Em uma forma de realização, a afinidade de ligação do anticorpo anti-Siglec-8 pode ser determinada por um ensaio de ressonância plasmônica de superfície. Por exemplo, o Kd ou o valor Kd pode ser medido usando um BIAcore T100. Os anticorpos de captura (por exemplo, Fc anti-humano de cabra e Fc anticamundongo de cabra) são imobilizados em uma lasca de CM5. As células de fluxo podem ser imobilizadas com anticorpos anti-humano ou anticamundongo. O ensaio é realizado a uma determinada temperatura e taxa de fluxo, por

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95/169 exemplo, a 25°C a uma taxa de fluxo de 30 μΙ/min. Siglec-8 dimérica é diluída em tampão de ensaio a diferentes concentrações, por exemplo, a uma concentração que varia de 15 nM a 1,88 pM. Os anticorpos são capturados e injeções de alto desempenho são conduzidas, seguidas por dissociações. As células de fluxo são regeneradas com um tampão, por exemplo, 50 mM de glicina a pH 1,5. Os resultados são blanked com uma célula de referência vazia e várias injeções de tampão de ensaio, e analisados com parâmetros de ajuste global a 1:1.

3. ENSAIOS DE COMPETIÇÃO

[00177] Os ensaios de competição podem ser usados para determinar se dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo ao reconhecer epítopos idênticos ou estericamente sobrepostos ou se um anticorpo inibe competitivamente a ligação de outro anticorpo ao antígeno. Esses ensaios são conhecidos na técnica. Normalmente, o antígeno ou células que expressam antígeno são imobilizadas em uma placa com vários poços, e a capacidade de anticorpos não marcados de bloquear a ligação de anticorpos marcados é medida. Os marcadores comuns para esses ensaios de competição são marcadores radioativos ou marcadores enzimáticos. Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito compete com um anticorpo 2E2 aqui descrito pela ligação ao epítopo presente na superfície celular de uma célula (por exemplo, um mastócito). Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito compete com um anticorpo compreendendo um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 1, e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 15 pela ligação ao epítopo presente na superfície celular de uma célula (por exemplo, um mastócito). Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito compete com um anticorpo 2C4 aqui descrito pela ligação ao epítopo

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96/169 presente na superfície celular de uma célula (por exemplo, um mastócito). Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec8 aqui descrito compete com um anticorpo compreendendo um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 2 (como encontrado na Patente US N^Q 8,207,305), e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 4 (como encontrado na Patente US N^Q8,207,305) pela ligação ao epítopo presente na superfície celular de uma célula (por exemplo, um mastócito).

4. ESTABILIDADE TÉRMICA

[00178] Em alguns aspectos, um anti-Siglec-8 aqui descrito tem uma temperatura de fusão (Tm) de pelo menos cerca de 70°C, pelo menos cerca de 71°C ou pelo menos cerca de 72°C em um ensaio de mudança térmica. Em um ensaio de mudança térmica exemplificativo, as amostras compreendendo um anticorpo anti-Siglec-8 humanizado são incubadas com um corante fluorescente (Sypro Orange) por 71 ciclos, com aumento de 1°C por ciclo em um termociclador para qPCR para determinar a Tm. Em algumas formas de realização, o anticorpo antiSiglec-8 tem uma Tm similar ou superior em relação ao anticorpo 2E2 de camundongo e/ou anticorpo 2C4 de camundongo. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-Siglec-8 compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 6 e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID N^QS: 16 e 21. Em algumas formas de realização, o anticorpo antiSiglec-8 tem a Tm igual ou superior em relação ao um anticorpo 2C4 quimérico. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-Siglec-8 tem a Tm igual ou superior em comparação a um anticorpo com uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 84; e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de

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97/169 aminoácidos da SEQ ID N^Q: 85.

5. ENSAIOS DE ATIVIDADE BIOLÓGICA

[00179] Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec8 aqui descrito esgota os mastócitos. Os ensaios para avaliação da apoptose de células são bem conhecidos na técnica, por exemplo, a coloração com Anexina V e o ensaio TUNNEL.

[00180] Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito induz a atividade de ADCC. Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito mata os mastócitos que expressam a Siglec-8 por meio da atividade de ADCC. Em algumas formas de realização, uma composição compreende anticorpos antiSiglec-8 não fucosilados (ou seja, afucosilados). Em algumas formas de realização, uma composição compreendendo os anticorpos anti-Siglec8 não fucosilados aqui descritos aumenta a atividade da ADCC em comparação a uma composição que compreende os anticorpos antiSiglec-8 parcialmente fucosilados. Os ensaios para avaliação da atividade da ADCC são bem conhecidos na técnica e aqui descritos. Em um ensaio exemplificativo, para medir a atividade da ADCC, são usadas células efetoras e células-alvo. Exemplos de células efetoras incluem células exterminadoras naturais (NK), grandes linfócitos granulares (LGL), células exterminadoras ativadas por linfocinas (LAK) e PBMC compreendendo NK e LGL, ou leucócitos tendo receptores Fc nas superfícies celulares, como neutrófilos, eosinófilos e macrófagos. As células efetoras podem ser isoladas a partir de qualquer fonte, incluindo indivíduos com doença de interesse (por exemplo, IBD). A célula-alvo é qualquer célula que expressa, na superfície da célula, antígenos que os anticorpos a serem avaliados podem reconhecer. Um exemplo de uma célula-alvo desse tipo é um mastócito que expressa a Siglec-8 na superfície da célula. Outro exemplo de uma célula-alvo desse tipo é uma linhagem de células (por exemplo, linhagem de células Ramos) que

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98/169 expressa a Siglec-8 na superfície da célula (por exemplo, Ramos 2C10)). As células-alvo podem ser marcadas com um reagente que permite a detecção da citólise. Exemplos de reagentes para marcação incluem uma substância radioativa, tal como cromato de sódio (Na2 ⁵¹CrO4). Veja, por exemplo, Immunology, 14, 181 (1968); J. Immunol. Methods., 172, 227 (1994); e J. Immunol. Methods., 184, 29 (1995).

[00181] Em outro ensaio exemplificativo para avaliar a ADCC e a atividade apoptótica de anticorpos anti-Siglec-8 sobre os mastócitos, os mastócitos são isolados de tecidos ou fluidos biológicos de acordo com os protocolos publicados (Guhl et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 2011, 75:382-384; Kulka et al., In Current Protocols in Immunology, 2001, (John Wiley & Sons, Inc.)) ou diferenciadosde células estaminais hematopoiéticas humanas, por exemplo, como descrito por Yokoi etal., J Allergy Clin Immunol., 2008, 121:499-505. Os mastócitos purificados são ressuspensos em meio RPMI completo em uma placa estéril de fundo em U com 96 poços e incubados na presença ou ausência de anticorpos anti-Siglec-8 por 30 minutos a concentrações que variam entre 0,0001 ng/ml e 10 μg/ml. As amostras são incubadas por 4 a 48 horas adicionais com e sem células exterminadoras naturais (NK) purificadas ou PBL fresco para induzir a ADCC. A morte celular por apoptose ou ADCC é analisada por citometria de fluxo, usando anticorpos conjugados fluorescentes para detectar os mastócitos (CD117 e FcsR1) e a Anexina-V e 7AAD para discriminar as células vivas e mortas ou coradas. A coloração com Anexina-V e 7DAA é realizada de acordo com as instruções do fabricante.

[00182] Em alguns aspectos, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito inibe as atividades mediadas por mastócitos. A triptase de mastócitos foi usada como um biomarcador para o total de número de mastócitos e ativação. Por exemplo, a triptase total e ativa, bem como histamina, Nmetil-histamina e 11-beta-prostaglandina F2 podem ser medidas no

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99/169 sangue ou na urina para avaliar a redução de mastócitos. Veja, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente US N^Q US 20110293631 para um ensaio exemplificativo da atividade dos mastócitos.

E. PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS

[00183] O anticorpo aqui descrito (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) é preparado usando técnicas disponíveis na arte para gerar anticorpos, métodos exemplares são descritos em mais detalhes nas seções a seguir.

1. FRAGMENTOS DE ANTICORPOS

[00184] A presente invenção abrange fragmentos de anticorpos. Os fragmentos de anticorpos podem ser gerados por meios tradicionais, como a digestão enzimática, ou por técnicas recombinantes. Em determinadas circunstâncias, há vantagens em usar fragmentos de anticorpos, em vez de anticorpos inteiros. Para uma revisão de determinados fragmentos de anticorpos, consulte Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134.

[00185] Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, esses fragmentos foram obtidos por digestão proteolítica de anticorpos intactos (veja, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). No entanto, esses fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos de anticorpos Fab, Fv eScFv podem ser, todos, expressos em e secretados a partir de E. coli, assim permitindo a fácil produção de grandes quantidades destes fragmentos. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados das bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, os fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)).

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100/169

De acordo com outra abordagem, os fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente da cultura de células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos Fab e F(ab')2 com aumento da meia-vida in vivo compreendendo resíduos do epítopo de ligação ao receptor de recuperação são descritos na Patente US N° 5.869.046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão aparentes para o especialista. Em algumas formas de realização, um anticorpo é um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Veja o Documento WO 93/16185; e as Patentes US N^Q 5.571.894 e 5.587.458. Fv e scFv são a única espécie com sítios de combinação intactos que são desprovidos de regiões constantes; assim, eles podem ser adequados para ligação não específica reduzida durante o uso in vivo. As proteínas de fusão scFv podem ser construídas para produzir a fusão de uma proteína efetora no terminal amino ou carbóxi de um scFv. Consulte Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, acima. O fragmento de anticorpos também pode ser um anticorpo linear, por exemplo, conforme descrito na Patente US N° 5.641.870, por exemplo. Esses anticorpos lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

2. ANTICORPOS HUMANIZADOS

[00186] A presente invenção abrange anticorpos humanizados. Vários métodos para a humanização de anticorpos não humanos são conhecidos na arte. Por exemplo, um anticorpo humanizado pode ter um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele a partir de uma fonte que não é humana. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são muitas vezes referidos como resíduos importados, que normalmente são tirados de um domínio variável importado. A humanização pode ser realizada essencialmente seguindo o método de Winter (Jones et al. (1986) Nature 32} .522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), substituindo-se as sequências da região hipervariável pelas sequências

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101/169 correspondentes de um anticorpo humano. Por conseguinte, esses anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos (Patente US N° 4.816.567), em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são normalmente anticorpos humanos em que alguns resíduos da região hipervariável e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores. [00187] A escolha dos domínios variáveis humanos, leves e pesados, a serem usados na fabricação dos anticorpos humanizados pode ser importante para redução da antigenicidade. De acordo com o método chamado best-fit, a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor (por exemplo, mouse) é tríada contra a biblioteca inteira de sequências de domínios variáveis humanas conhecidas. A sequência humana mais próxima dessa do roedor é, então, aceita como o framework humano para o anticorpo humanizado (Sims et ai (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia etaL (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Outro método usa um framework específico derivado da sequência consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo especial de cadeias leves ou pesadas. O mesmo framework pode ser usado para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623. [00188] É geralmente desejável que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir esse objetivo, de acordo com um método, anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências parentais e vários produtos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Modelos tridimensionais da imunoglobulina estão geralmente disponíveis e são comuns para

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102/169 aqueles com conhecimento na técnica. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. O exame dessas exibições permite a análise do provável papel dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, ou seja, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata se ligar a seu antígeno. Dessa forma, os resíduos FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências receptoras e de importação, de modo a alcançar a característica desejada do anticorpo, como o aumento na afinidade ao(s) antígeno(s)-alvo. Em geral, os resíduos da região hipervariável são direta e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antígeno.

3. ANTICORPOS HUMANOS

[00189] Os anticorpos anti-Siglec-8 da presente invenção podem ser construídos por combinação da(s) sequência(s) de domínio variável clone(s) de Fv selecionadas das bibliotecas de exibição de fagos derivadas de humanos com sequências(s) de domínio constante humana(s) conhecida(s). Como alternativa, os anticorpos anti-Siglec-8 monoclonais humanos da presente invenção podem ser produzidos pelo método do hibridoma. As linhagens de células do mieloma humano e heteromieloma de camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas, por exemplo, por Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et aí., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987); e Boerner et al., J. Immunol., 147:86(1991).

[00190] É possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir um repertório de anticorpos humanos na ausência da produção de

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103/169 imunoglobulinas endógenas. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigota do gene da região de união (JH) da cadeia pesada do anticorpo em camundongos mutantes quiméricos e da linhagem germinativa resulta em inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência da matriz gênica da imunoglobulina da linhagem germinativa humana nesses camundongos mutantes da linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos mediante desafio ao antígeno. Veja, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann etal., Year in Immunol., 7: 33 (1993). [00191] O embaralhamento gênico também pode ser usado para derivar anticorpos humanos de anticorpos não humanos (por exemplo, roedor), onde o anticorpo humano tem afinidades e especificidades similares o anticorpo não humano de partida. De acordo com esse método, que também é chamado de impressão de epítopo, a região variável da cadeia pesada ou leve de um fragmento de anticorpo não humano obtido por técnicas de exibição de fagos descritas neste documento é substituída por um repertório de genes humanos do domínio V, criando uma população de quimeras de scFv ou Fab da cadeia não humana ou humana. A seleção com antígeno resulta no isolamento de um scFv ou Fab quimérico da cadeia humana/cadeia não humana, em que a cadeia humana restaura o sítio de ligação ao antígeno destruído após a remoção da cadeia não humana correspondente no clone de exibição de fagos primário, ou seja, o epítopo governa a escolha do parceiro na cadeia humana. Quando o processo é repetido para substituir o restante da cadeia não humana, um anticorpo humano é obtido (veja o Documento PCT WO 93/06213 publicado em 1^Q de abril de 1993). Ao contrário da humanização tradicional de anticorpos não humanos por enxertia de CDR, essa técnica fornece anticorpos completamente humanos, que não têm

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104/169 resíduos FR ou CDR de origem não humana.

4· ANTICORPOS BIESPECÍFICOS

[00192] Os anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação a pelo menos dois antígenos diferentes. Em algumas formas de realização, anticorpos biespecíficos são anticorpos humanos ou humanizados. Em algumas formas de realização, uma das especificidades de ligação é à Siglec-8 e a outra é a qualquer outro antígeno. Em algumas formas de realização, os anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois epítopos diferentes da Siglec-8. Os anticorpos biespecíficos também podem ser usados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam a Siglec-8. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2).

[00193] Os métodos para produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Veja Milstein e Cuello, Nature, 305: 537 (1983), WO 93/08829 publicado em 13 de maio de 1993, e Traunecker et al., EMBO J., 10:3655 (1991). Para mais detalhes da geração de anticorpos biespecíficos, veja, por exemplo, Suresh etal., Methods in Enzymology, 121:210 (1986). Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou heteroconjugados. Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado podem ser acoplados à avidina, o outro à biotina. Os anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos usando qualquer método conveniente de reticulação. Agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica, e são descritos na Patente US N° 4.676.980, juntamente com uma série de técnicas de reticulação.

5. ANTICORPOS DE DOMÍNIO ÚNICO

[00194] Em algumas formas de realização, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo de domínio único. Um anticorpo de único domínio é uma única cadeia de polipeptídeos compreendendo todo ou

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105/169 uma parte do domínio variável da cadeia pesada ou todo ou uma parte do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Em algumas formas de realização, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, Mass.; veja, por exemplo, a Patente US N° 6.248.516 B1). Em uma forma de realização, um anticorpo de domínio único consiste em todo ou uma parte do domínio variável da cadeia pesada de um anticorpo.

6. VARIANTES DE ANTICORPOS

[00195] Em algumas formas de realização, são contempladas a(s) modificação(ões) da sequência de aminoácidos dos anticorpos descritos aqui. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As variantes da sequência de aminoácidos do anticorpo podem ser preparadas por introdução de alterações apropriadas à sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo, ou por síntese de peptídeos. Essas modificações incluem, por exemplo, exclusões de e/ou inserções a e/ou substituições de, resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de exclusão, inserção e substituição pode ser feita para se chegar ao construto final, desde que o construto final possua as características desejadas. As alterações de aminoácidos podem ser introduzidas à sequência de aminoácidos do anticorpo em questão no momento em que a sequência é feita.

[00196] Um método útil para identificação de determinados resíduos ou regiões de anticorpo que são locais preferidos para a mutagênese é chamado de mutagênese por triagem de alanina, como descrito por Cunningham e Wells (1989), Science 244:1081-1085. Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos-alvo é identificado (por exemplo, resíduos com carga como arg, asp, his, lys e glu) e substituído por um aminoácido de carga negativa ou neutra (por exemplo, alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com o antígeno. Esses locais de

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106/169 aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições são, então, refinados pela introdução de variantes novas ou adicionais em, ou para, os sítios de substituição. Assim, embora o sítio para introdução de uma variação da sequência de aminoácidos seja predeterminado, a natureza da mutação por si não precisa ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um determinado sítio, a mutagênese por triagem de ala ou aleatória é realizada no códon ou região-alvo e as imunoglobulinas expressas são tríadas para a atividade desejada.

[00197] As inserções às sequências de aminoácidos incluem fusões dos terminais amino e/ou carboxila que variam em comprimento de um resíduo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intrassequência de um ou vários resíduos de aminoácidos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionila do terminal N. Outras variantes insercionais da molécula de anticorpo incluem a fusão ao N-terminal ou C do anticorpo a uma enzima ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida sérica do anticorpo.

[00198] Em algumas formas de realização, os anticorpos monoclonais têm uma divagem do C-terminal na cadeia pesada e/ou cadeia leve. Por exemplo, 1,2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoácidos são clivados no C-terminal da cadeia pesada e/ou cadeia leve. Em algumas formas de realização, a divagem do C-terminal remove uma lisina do Cterminal da cadeia pesada. Em algumas formas de realização, os anticorpos monoclonais têm uma divagem do N-terminal na cadeia pesada e/ou cadeia leve. Por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoácidos são clivados no N-terminal da cadeia pesada e/ou cadeia leve. Em algumas formas de realização, formas truncadas de anticorpos monoclonais podem ser produzidas por técnicas recombinantes.

[00199] Em algumas formas de realização, um anticorpo da presente

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107/169 invenção é alterado para aumentar ou diminuir a medida na qual o anticorpo é glicosilado. A glicosilação de polipeptídeos é normalmente ser ligada a N ou ligada a O. Ligada a N se refere à fixação de uma porção de carboidratos à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-Xtreonina, em que X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para fixação enzimática da porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer uma dessas sequências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um potencial sítio de glicosilação. A glicosilação ligada a O se refere à fixação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um ácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possa ser usado.

[00200] A adição ou supressão de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente realizada por alteração da sequência de aminoácidos, de forma que uma ou mais das sequências tripeptídicas acima descritas (para sítidos de N-glicosilação ligados a N) é criada ou removida. A alteração também pode ser feita pela adição, supressão ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para sítios de glicosilação ligados a O).

[00201] Onde o anticorpo compreende uma região Fc, o carboidrato preso a ela pode ser alterado. Por exemplo, anticorpos com uma estrutura de carboidratos madura sem fucose presa a uma região Fc do anticorpo são descritos no Pedido de Patente US N^Q 2003/0157108 (Presta, L.). Veja também o Documento US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Os anticorpos com uma N-acetilglucosamina bissectada (GlcNAc) no carboidrato ligado a uma região Fc do anticorpo são referenciados no Documento WO 2003/011878, Jean-Mairet et al. e Patente US N° 6,602,684,Umana etal. Os anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo preso a uma região Fc do

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108/169 anticorpo são reportados no Documento WO 1997/30087, Patel et al. Veja, também, os Documentos WO 1998/58964 (Raju, S.) e WO 1999/22764 (Raju, S.) sobre anticorpos com carboidrato alterado preso à sua região FC. Veja também o Documento US 2005/0123546 (Umana et al.) sobre moléculas de ligação ao antígeno com glicosilação modificada.

[00202] Em algumas formas de realização, uma variante de glicosilação compreende uma região Fc, em que uma estrutura de carboidratos presa à região Fc carece de fucose. Essas variantes têm função ADCC melhorada. Opcionalmente, a região Fc inclui ainda uma ou mais substituições de aminoácidos, que melhoram ainda mais a ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração UE de resíduos). Exemplos de publicações relacionadas a anticorpos defucosilados ou deficientes em fucose incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US

2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US

2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; W02005/053742; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens de células que produzem anticorpos defucosilados incluem células CHO Led 3 deficientes na fucosilação de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Pedido de Patente US N^Q US 2003/0157108 A1, Presta, L; e WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente no Exemplo 11), e linhagens de células nocaute, como o gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO nocaute (Yamane-Ohnuki etal. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)), e células que sobre-expressam β1,4-Νacetilglicosminiltransferase III (GnT-lll) e Golgi μ-manosidase II (Manll). [00203] São contemplados neste documento anticorpos com fucose

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109/169 reduzida em relação à quantidade de fucose no mesmo anticorpo produzido em uma célula CHO do tipo selvagem. Por exemplo, o anticorpo tem uma quantidade menor de fucose do que teria se produzido por células CHO nativas (por exemplo, uma célula CHO que produz um padrão de glicosilação nativo, como uma célula CHO contendo um gene FUT8 nativo). Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui fornecido é aquele em que menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% dos seus glicanos N-ligados compreende fucose. Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-Siglec-8 aqui fornecido é aquele em que nenhum dos glicanos ligados a N compreende fucose, isto é, em que o anticorpo é completamente sem fucose, ou não tem fucose ou é não fucosilado ou afucosilado. A quantidade de fucose pode ser determinada calculandose a quantidade média de fucose dentro da cadeia de açúcar em Asn297, em relação à soma de todas as glicoestruturas presas ao Asn297 (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e de elevado teor de manose) medidas por espectrometria de massa MALDI-TOF, como descrito no Documento WO 2008/077546, por exemplo. Asn297 se refere ao resíduo de asparagina localizado próximo à posição 297 na região Fc (numeração UE de resíduos da região Fc); no entanto, o Asn297 também pode estar localizado a cerca de ± 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, ou seja, entre as posições 294 e 300, devido a pequenas variações de sequência nos anticorpos. Em algumas formas de realização, pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas de anticorpo é não fucosilada.

[00204] Em uma forma de realização, o anticorpo é alterado para melhorar a sua meia-vida sérica. Para aumentar a meia-vida sérica do anticorpo, pode-se incorporar um epítopo de ligação ao receptor de recuperação ao anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo), como descrito na Patente US N° 5,739,277, por exemplo. Como usado

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110/169 neste documento, o termo epítopo de ligação ao receptor de recuperação se refere a um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4) que é responsável por aumentar a meia-vida sérica in vivo da molécula de IgG (Documentos US 2003/0190311, Patente US N° 6.821.505; Patente US N° 6.165.745; Patente US N° 5.624.821; Patente US N° 5.648.260; Patente US N° 6.165.745; Patente US N° 5.834.597.

[00205] Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácidos. Essas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo substituído por um resíduo diferente. Os sítios de interesse para a mutagênese substitucional incluem as regiões hipervariáveis, mas as alterações do FR também são contempladas. As substituições conservadoras estão apresentadas na Tabela 5, sob o título substituições preferidas. Se essas substituições resultarem em uma mudança desejável na atividade biológica, então podem ser introduzidas alterações mais substanciais, denominadas substituições exemplificativas na Tabela 5, ou como descrito abaixo em referência a classes de aminoácidos, e os produtos selecionados.

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TABELA 5

Resíduo Original	Substituições Exemplificativas	Substituições Preferidas
Ala (A)	Vai; Leu; He	Vai
Arg (R)	Lys; Gin; Asn	Lys
Asn (N)	Gin; His; Asp, Lys; Arg	Gin
Asp (D)	Glu; Asn	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gin (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gin	Asp
Giy (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn; Gin; Lys; Arg	Arg
e (D	Leu; Vai; Met; Ala; Phe; Norleucina	Leu
Leu (L)	Norleucine; He; Vai; Met; Ala; Phe	He
Lys (K)	Arg; Gin; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; He	Leu
Phe (F)	Trp; Leu; Vai; He; Ala; Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Vai; Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Vai (V)	He; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina	Leu

[00206] Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são realizadas selecionando-se substituições que diferem significativamente em seu efeito sobre a manutenção de (a) a estrutura da espinha dorsal polipeptídica na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio-alvo, ou c) a maior parte da cadeia lateral. Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com

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112/169 semelhanças nas propriedades de suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, em Biochemistry, 2a ed., páginas 73-75, Worth Publishers, Nova Iorque (1975)):

(1) não polares: Ala (A), Vai (V), Leu (L), lie (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) (2) polares não carregados: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gin (Q) (3) ácidos: Asp (D), Glu (E) (4) básicos: Lys (K), Arg (R), His (H).

[00207] Como alternativa, os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em grupos, com base nas propriedades comuns da cadeia lateral:

(1) hidrofóbica: Norleucine, Met, Ala, Vai, Leu, lie;

(2) hidrofílica neutra: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;

(3) ácida: Asp, Glu;

(4) básica: His, Lys, Arg;

(5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro;

(6) aromática: Trp, Tyr, Phe

[00208] Substituições não conservadoras implicarão a troca de um elemento de uma dessas classes por outra classe. Esses resíduos substituídos também podem ser introduzidos aos sítios de substituição conservadora ou aos sítios restantes (não conservados).

[00209] Um tipo de variante substitucional envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo original (por exemplo, um anticorpo humano ou humanizado). Geralmente, a(s) variante(s) selecionada(s) para posterior desenvolvimento terá propriedades biológicas modificadas (por exemplo, melhoradas) em relação ao anticorpo original a partir do qual são geradas. Uma maneira conveniente de gerar essas variantes substitucionais envolve a

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113/169 maturação da afinidade usando a exibição de fagos. Brevemente, vários sítios da região hipervariável (por exemplo, 6-7) são mutados para gerar todas as possíveis substituições de aminoácidos em cada sítio. Os anticorpos assim gerados são exibidos a partir de partículas de fagos filamentosos como fusões a pelo menos parte de uma proteína capsidial de fago (por exemplo, o produto do gene III de M13) acondicionado dentro de cada partícula. As variantes exibidas em fagos são, então, tríadas quanto à sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação). A fim de identificar os sítios candidatos da região hipervariável para modificação, pode ser realizada a mutagênese por triagem (por exemplo, triagem de alanina) para identificar os resíduos da região hipervariável que contribuem significativamente para a ligação ao antígeno. Como alternativa, ou adicionalmente, pode ser vantajoso analisar a estrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Esses resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituição, de acordo com as técnicas conhecidas na arte, incluindo aqueles elaborados neste documento. Uma vez que essas variantes são geradas, o painel de variantes é submetido à triagem usando técnicas conhecidas na arte, incluindo aquelas aqui descritas, e anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para um desenvolvimento posterior.

[00210] As moléculas de ácido nucleico que codificam variantes da sequência de aminoácidos do anticorpo são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, mas não se limitam a, isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes da sequência de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por mutagênese mediada por oligonucleotídeos (ou sítiodirecionada), mutagênese em PCR, e mutagênese em cassete de uma

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114/169 variante anteriormente preparada ou uma versão não variante do anticorpo.

[00211] Pode ser desejável a introdução de uma ou mais alterações de aminoácidos em uma região Fc de anticorpos da presente invenção, assim gerando uma variante da região Fc. A variante da região Fc pode incluir uma sequência da região Fc humana (por exemplo, uma região Fc do lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4 humano) compreendendo uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos incluindo a de uma cisteína da charneira. Em algumas formas de realização, a variante da região Fc compreende uma região Fc do lgG4 humano. Em uma forma de realização, a região Fc do lgG4 humano compreende a substituição de aminoácido S228P, em que os resíduos de aminoácidos são numerados de acordo com o índice europeu (EU) como em Kabat.

[00212] De acordo com esta descrição e os ensinamentos da técnica, é previsto que, em algumas formas de realização, um anticorpo da presente invenção pode compreender uma ou mais alterações em comparação ao anticorpo homólogo do tipo selvagem, por exemplo, na região Fc. Esses anticorpos, no entanto, mantêm substancialmente as mesmas características exigidas para a utilidade terapêutica em comparação ao seu homólogo do tipo selvagem. Por exemplo, pensase que determinadas alterações podem ser feitas na região Fc, o que resultaria em ligação C1q e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) alterada (por exemplo, melhorada ou diminuída), por exemplo, como descrito no Documento WO99/51642. Veja também Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); Patente US N° 5.648.260; Patente US N° 5.624.821; e WO 94/29351 relativos a outros exemplos de variantes da região Fc. Os Documentos WO 00/42072 (Presta) e WO 2004/056312 (Lowman) descrevem variantes de anticorpos com ligação maior ou diminuída a FcRs. O conteúdo dessas publicações de patentes

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115/169 são especificamente aqui incorporados por referência. Veja, também, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). Anticorpos com meias-vidas maiores e melhor ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn), que é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), encontram-se descritos no Documento

US2005/00149341 (Hinton etal.). Esses anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições que melhoram a ligação da região Fc ao FcRn. Variantes de polipeptídeos com sequências de aminoácidos tendo a região Fc alterada e a capacidade de ligação a C1q aumentada ou diminuída são descritas na Patente US N^Q6,194,551 B1, WO99/51642. O conteúdo dessas publicações de patentes é especificamente aqui incorporado por referência. Veja, também, Idusogie etal. J. Immunol. (164): 4178-4184 (2000).

7. VETORES, CÉLULAS HOSPEDEIRAS E MÉTODOS RECOMBINANTES

[00213] Para a produção recombinante de um anticorpo da presente invenção, o ácido nucleico que o codifica é isolado e inserido em um vetor replicável para clonagem adicional (amplificação do DNA) ou para expressão. O DNA que codifica o anticorpo é facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligarem especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo). Muitos vetores estão disponíveis. A escolha de vetor depende, em parte, da célula hospedeira a ser usada. Em geral, as células hospedeiras são de origem procariótica ou eucariótica ou (em geral de mamíferos). Será apreciado que as regiões constantes de qualquer isotipo podem ser usadas para esse propósito, incluindo as regiões constantes IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, e que essas regiões podem ser obtidas de qualquer espécie humana ou animal.

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GERAÇÃO DE ANTICORPOS USANDO CÉLULAS HOSPEDEIRAS PROCARIÓTICAS:

A) CONSTRUÇÃO DO VETOR

[00214] As sequências polinucleotídicas que codificam componentes polipeptídicos do anticorpo da presente invenção podem ser obtidas usando técnicas recombinantes padrão. Sequências polinucleotídicas desejadas podem ser isoladas e sequenciadas a partir de células produtoras de anticorpos, como células do hibridoma. Alternativamente, os polinucleotídeos podem ser sintetizados usando sintetizador de nucleotídeo ou técnicas de PCR. Uma vez obtidas, as sequências que codificam os polipeptídeos são inseridas em um vetor recombinante capaz de replicar e expressar polinucleotídeos heterólogos em hospedeiros procarióticos. Muitos vetores que estão disponíveis e conhecidos na técnica podem ser usados para os fins da presente invenção. A seleção de um vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho dos ácidos nucleicos a serem inseridos no vetor e da célula hospedeira específica a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes, dependendo da sua função (amplificação ou expressão do polinucleotídeo heterólogo, ou ambos) e sua compatibilidade com a célula hospedeira em que ele reside. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não se limitam a uma origem de replicação, um gene marcador de seleção, um promotor, um sítio de ligação ao ribossomo (RBS), uma sequência sinal, a inserção de ácido nucleico heterólogo e uma sequência de terminação da transcrição.

[00215] Em geral, os vetores plasmidiais contendo replicon e sequências de controle que são derivados de espécies compatíveis com a célula hospedeira são usados em ligação com esses hospedeiros. O vetor normalmente porta um sítio de replicação, bem como sequências de marcação que são capazes de fornecer a seleção fenotípica em

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117/169 células transformadas. Por exemplo, E. coli é normalmente transformada usando pBR322, um plasmídeo derivado de uma espécie de E. coli. O pBR322 contém genes de codificação da resistência a ampicilina (Amp) e tetraciclina (Tet) e, portanto, fornece meios fáceis para a identificação de células transformadas. O pBR322, seus derivados ou outros plasmídeos microbianos ou bacteriófagos também podem conter, ou ser modificados para conter promotores que possam ser usados pelo organismo microbiano para expressão de proteínas endógenas. Exemplos de derivados do pBR322 usados para a expressão de determinados anticorpos são descritos em detalhes por Carter eta!., Patente US N° 5.648.237.

[00216] Além disso, vetores fágicos contendo replicon e sequências de controle que são compatíveis com o micro-organismo hospedeiro podem ser usados como vetores de transformação em conexão com esses hospedeiros. Por exemplo, bacteriófagos, como o ÀGEM.TM.-11, podem ser usados na produção de um vetor recombinante que possa ser usado para transformar células hospedeiras suscetíveis, como LE392 de E. coli.

[00217] O vetor de expressão da presente invenção pode compreender dois ou mais pares promotor-cístron, codificando cada um dos componentes do polipeptídeo. Um promotor é uma sequência regulatória não traduzida localizada a montante (5') de um cístron que modula sua expressão. Os promotores procarióticos geralmente se situam em duas classes, induzíveis e constitutivos. O promotor induzível é um promotor que inicia níveis aumentados de transcrição do cístron sob seu controle, em resposta a mudanças na condição da cultura, por exemplo, a presença ou ausência de um nutriente ou uma mudança de temperatura.

[00218] São bem conhecidos vários promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais. O promotor

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118/169 selecionado pode ser operativamente ligado ao DNA do cístron que codifica a cadeia pesada ou leve, removendo o promotor do DNA de origem via digestão com enzima de restrição e inserção da sequência promotora isolada ao vetor da presente invenção. Tanto a sequência promotora nativa quanto muitos promotores heterólogos podem ser usados para amplificação direta e/ou expressão dos genes-alvo. Em algumas formas de realização, são usados promotores heterólogos, visto que eles, em geral, permitem maior transcrição e rendimentos mais elevados do gene-alvo expresso em relação ao promotor do polipeptídio-alvo nativo.

[00219] Os promotores adequados para uso com hospedeiros procarióticos incluem o promotor PhoA, os sistemas promotores da βgalactamase e lactose, um sistema promotor do triptofano (trp) e promotores híbridos como o promotor tac ou trc. No entanto, outros promotores que são funcionais em bactérias (como outros promotores bacterianos ou fágicos conhecidos) também são adequados. Suas sequências nucleotídicas foram publicadas, assim permitindo que um versado na técnica as ligue operativamente a cístrons que codificam as cadeias leves e pesadas alvo (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269) usando ligantes ou adaptadores para fornecer quaisquer sítios de restrição necessários.

[00220] Em um aspecto da presente invenção, cada cístron dentro do vetor recombinante compreende um componente da sequência sinal de secreção que direciona a translocação dos polipeptídeos expressos através de uma membrana. Em geral, a sequência sinal pode ser um componente do vetor, ou pode ser uma parte do DNA do polipeptídeoalvo que é inserido no vetor. A sequência sinal selecionada para efeitos da presente invenção deve ser aquela que é reconhecida e transformada (isto é, clivada por uma peptidase sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas que não

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119/169 reconhecem e processam as sequências-sinal nativas aos polipeptídeos heterólogos, a sequência-sinal é substituída por uma sequência-sinal procariótica selecionada, por exemplo, do grupo que consiste na fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou enterotoxina termicamente estável II (STII) líder, LamB, PhoE, PelB, OmpA e MBP. Em uma forma de realização da presente invenção, as sequências sinal usadas em ambos os cístrons do sistema de expressão são sequências sinal STII ou suas variantes.

[00221] Em outro aspecto, a produção das imunoglobulinas de acordo com a presente invenção pode ocorrer no citoplasma da célula hospedeira e, portanto, não exige a presença de sequências sinal de secreção dentro de cada cístron. Nesse sentido, cadeias leves e pesadas da imunoglobulina são expressas, dobradas e montadas para formar imunoglobulinas funcionais dentro do citoplasma. Algumas cepas hospedeiras (por exemplo, as cepas trxB de E. coli) fornecem ao citoplasma condições que são favoráveis para a formação de ligação bissulfeto, assim permitindo o dobramento e a montagem adequados de subunidades proteicas expressas. Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995).

[00222] Os anticorpos da presente invenção também podem ser produzidos usando um sistema de expressão em que a razão quantitativa dos componentes do polipeptídeo expresso pode ser modulada de modo a maximizar o rendimento de anticorpos secretados e devidamente montados da presente invenção. Essa modulação é realizada, pelo menos em parte, por modulação simultânea de forças translacionais para os componentes do polipeptídeo.

[00223] Uma técnica para modulação da força translacional é divulgada em Simmons et al., Patente US n° 5,840,523. Ela usa variantes da região de início translacional (TIR) dentro de um cístron. Para uma dada TIR, uma série de variantes da sequência de

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120/169 aminoácidos ou de ácido nucleico pode ser criada com uma grande variedade de forças translacionais, assim proporcionando um meio conveniente para ajustar esse fator ao nível de expressão desejado da cadeia específica. Variantes da TIR podem ser geradas por técnicas convencionais de mutagênese que resultam em mudanças de códon que podem alterar a sequência de aminoácidos. Em algumas formas de realização, as alterações na sequência de nucleotídeos são silenciosas. As alterações na TIR podem incluir, por exemplo, alterações no número ou espaçamento das sequências Shine-Dalgarno, juntamente com alterações na sequência sinal. Um método para gerar sequências sinal mutantes é a geração de um banco de códons no início de uma sequência de codificação que não altera a sequência de aminoácidos da sequência sinal (ou seja, as mudanças são silenciosas). Isso pode ser feito alterando a posição do terceiro nucleotídeo de cada códon; além disso, alguns aminoácidos, como leucina, serina e arginina, têm várias primeira e segunda posições que podem adicionar complexidade à criação do banco. Esse método de mutagênese é descrito em detalhes em Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158.

[00224] Em uma forma de realização, é gerado um conjunto de vetores com uma gama de forças TIR para cada cístron nele. Esse conjunto limitado fornece uma comparação dos níveis de expressão de cada corrente, bem como o rendimento dos produtos de anticorpo desejados sob diferentes combinações de força TIR. As forças TIR podem ser determinadas por quantificação do nível de expressão de um gene repórter, como descrito em detalhes em Simmons et al. Patente US N° 5.840.523. Com base na comparação da força translacional, as TIRs individuais desejadas são selecionadas para serem combinadas nos construtos do vetor de expressão da presente invenção.

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[00225] Células hospedeiras procarióticas adequadas para expressar os anticorpos da presente invenção incluem Archaebacteria e Eubacteria, como os organismos Gram-negativos ou Gram-positivos. Exemplos de bactérias úteis incluem Escherichia (por exemplo, Escherichia coli), Bacilos (por exemplo, B. subtilis), espécies de Enterobactérias, Pseudomonas (por exemplo, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Phizobia, Vitreoscilla ou Paracoccus. Em uma forma de realização, são usadas células gram-negativas. Em uma forma de realização, células de E. coli são usadas como hospedeiras para a presente invenção. Exemplos de cepas de E. coli incluem W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, Vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), páginas 1190-1219; Depósito ATCC N° 27.325) e seus derivados, incluindo a cepa 33D3 com genótipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompTA(nmpc-fepE) degP41 kanR (Patente US N° 5.639.635). Também são adequados outras cepas e seus derivados, como E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coliÀ 1776 (ATCC 31,537) e E. coli RV308(ATCC 31,608). Esses exemplos são ilustrativos, não limitantes. Métodos para construção de derivados de qualquer das bactérias acima mencionadas com genótipos definidos são conhecidos na arte e descritos em, por exemplo, Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990). Geralmente, é necessário selecionar as bactérias adequadas levando em consideração a capacidade de replicação do replicon nas células de uma bactéria. Por exemplo, as espécies E. coli, Serratia ou Salmonella podem ser convenientemente usadas como o hospedeiro quando se usa plasmídeos bem conhecidos como pBR322, pBR325, pACYC177 ou pKN410 para fornecer o replicon. Tipicamente, a célula hospedeira deve secretar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas, e outros inibidores da protease podem ser desejavelmente incorporados à cultura celular.

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b) PRODUÇÃO DE ANTICORPOS

[00226] As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão acima descritos e cultivadas em meios nutrientes convencionais, conforme apropriado, para indução de promotores, seleção de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas.

[00227] Transformação significa introduzir DNA à célula hospedeira procariótica para que o DNA seja replicável, ou como um elemento extracromosômico ou por integrantes cromossômicos. Dependendo da célula hospedeira usada, a transformação é feita usando as técnicas padrão apropriadas para essas células. O tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio é geralmente usado para células bacterianas que contêm barreiras substanciais à parede celular. Outro método de transformação emprega polietileno glicol/DMSO. Outra técnica ainda usada é a eletroporação.

[00228] As células procarióticas usadas para produzir os polipeptídeos da presente invenção são cultivadas em meios conhecidos na técnica e adequadas para cultura das células hospedeiras selecionadas. Exemplos de meios adequados incluem caldo luria (LB), além de suplementos nutrientes necessários. Em algumas formas de realização, os meios também contêm um agente de seleção, escolhido com base na construção do vetor de expressão, para permitir seletivamente o crescimento de células procarióticas contendo o vetor de expressão. Por exemplo, a ampicilina é adicionada aos meios para o crescimento de células que expressam o gene de resistência à ampicilina.

[00229] Quaisquer suplementos necessários além das fontes inorgânicas de carbono, nitrogênio e fosfato também podem ser incluídos em concentrações adequadas introduzidas isoladamente ou em mistura com outro suplemento ou meio como uma fonte complexa

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123/169 de nitrogênio. Opcionalmente, o meio de cultura pode conter um ou mais agentes redutores selecionados do grupo que consiste em glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol.

[00230] As células hospedeiras procariotas são cultivadas em condições adequadas de temperatura. Em algumas formas de realização, para crescimento da E. coli, as temperaturas de crescimento variam de cerca de 20°C a cerca de 39°C; de cerca de 25°C a cerca de 37°C; ou cerca de 30°C. O pH do meio pode ser qualquer pH variando de cerca de 5 a cerca de 9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro. Em algumas formas de realização, para E. coli, o pH é de cerca de 6,8 a cerca de 7,4, ou cerca de 7,0.

[00231] Se um promotor induzível é usado no vetor de expressão da presente invenção, a expressão de proteínas é induzida em condições adequadas para a ativação do promotor. Em um aspecto da presente invenção, os promotores PhoA são usados para controlar a transcrição dos polipeptídeos. Por conseguinte, as células hospedeiras transformadas são cultivadas em um meio de limitação de fosfato para indução. Em algumas formas de realização, o meio de limitação de fosfato é o meio C.R.A.P. (veja, por exemplo, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147). Vários outros indutores podem ser usados, de acordo com a construção do vetor utilizado, como é conhecida na técnica.

[00232] Em uma forma de realização, os polipeptídeos expressos da presente invenção são secretados em e recuperados do periplasmo das células hospedeiras. A recuperação de proteínas normalmente envolve a ruptura do micro-organismo, geralmente por meios como choque osmótico, sonicação ou lise. Uma vez que as células são rompidas, restos celulares ou células inteiras podem ser removidas por centrifugação ou filtração. As proteínas podem ser ainda purificadas por afinidade, por exemplo, por cromatografia em resina por afinidade.

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Como alternativa, as proteínas podem ser transportadas para os meios de cultura e aí isoladas. As células podem ser removidas da cultura e o sobrenadante da cultura sendo filtrado e concentrado para posterior purificação das proteínas produzidas. Os polipeptídeos expressos podem ainda ser isolados e identificados usando métodos comumente conhecidos como a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e o ensaio Western blot.

[00233] Em um aspecto da presente invenção, a produção de anticorpos é conduzida em grande quantidade por um processo de fermentação. Vários procedimentos de fermentação de alimentação contínua em grande escala estão disponíveis para produção de proteínas recombinantes. As fermentações em grande escala têm pelo menos 1000 litros de capacidade e, em certas formas de realização, cerca de 1.000 a 100.000 litros de capacidade. Esses fermentadores usam impulsores agitadores para distribuir oxigênio e nutrientes, principalmente a glicose. A fermentação em pequena escala se refere, em geral, à fermentação em um fermentador que não tem mais do que cerca de 100 litros de capacidade volumétrica, e pode variar de cerca de 1 litro a cerca de 100 litros.

[00234] Em um processo de fermentação, a indução da expressão de proteínas é normalmente iniciada depois que as células foram cultivadas sob condições adequadas a uma densidade desejada, por exemplo, um OD550 de cerca de 180-220, fase na qual as células estão no início da fase estacionária. Vários outros indutores podem ser usados, de acordo com a construção do vetor utilizado, como é conhecido na técnica e descrito acima. As células podem ser cultivadas por períodos mais curtos antes da indução. As células são normalmente induzidas por cerca de 12-50 horas, embora um tempo de indução mais longo ou mais curto possa ser usado.

[00235] Para melhorar o rendimento da produção e a qualidade dos

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125/169 polipeptídeos da presente invenção, várias condições da fermentação podem ser modificadas. Por exemplo, para melhorar a montagem e a dobragem adequadas dos polipeptídeos do anticorpo secretado, vetores adicionais que sobre-expressam as proteínas chaperonas, como as proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD e/ou DsbG) ou FkpA (uma peptidilprolil cis, trans-isomerase com atividade chaperona), podem ser usados para cotransformar as células procarióticas hospedeiras. Foi demonstrado que as proteínas chaperonas facilitam a dobragem adequada e a solubilidade das proteínas heterólogas produzidas nas células bacterianas hospedeiras. Chen et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:19601-19605; Georgiou et al., Patente US N^Q6,083,715; Georgiou et al., Patente US N^Q 6,027,888; Bothmann e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie etal. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210.

[00236] Para minimizar a proteólise de proteínas heterólogas (especialmente aquelas que são proteoliticamente sensíveis), algumas cepas hospedeiras deficientes para enzimas proteolíticas podem ser usadas para a presente invenção. Por exemplo, as cepas da célula hospedeira podem ser modificadas para realizar mutação(ões) genética(s) nos genes que codificam as proteases bacterianas conhecida como Protease III, OmpT, DegP, Tsp, Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease VI e suas combinações. Algumas cepas de E. coli deficientes em protease estão disponíveis e descritas em, por exemplo, Joly et al. (1998), acima; Georgiou et al., Patente US N° 5.264.365; Georgiou et al., Patente US N° 5.508.192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).

[00237] Em uma forma de realização, cepas de E. coli deficientes para enzimas proteolíticas e transformada com plasmideos que sobreexpressam uma ou mais proteínas chaperonas são usadas como

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126/169 células hospedeiras no sistema de expressão da presente invenção.

c) PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS

[00238] Em uma forma de realização, a proteína do anticorpo produzida aqui é ainda purificada para a obtenção de preparações que são substancialmente homogêneas para outros ensaios e usos. Podem ser empregados métodos de purificação de proteínas padrão conhecidos na técnica. Os procedimentos a seguir são exemplificativos de procedimentos de purificação adequados: fracionamento em colunas de imunoafinidade ou de troca iônica, precipitação com etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em silica ou em uma resina de troca catiônica, como DEAE, cromatofoco, SDS-PAGE, precipitação com sulfato de amônio e filtração em gel usando, por exemplo, Sephadex G-75.

[00239] Em um aspecto, a proteína A imobilizada em uma fase sólida é usada para purificação por imunoafinidade dos produtos do anticorpo da presente invenção. A proteína A é uma proteína da parede celular de 41 kD do Staphylococcus aureas que se liga com alta afinidade à região Fc de anticorpos. Lindmark et al (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. A fase sólida à qual uma proteína é imobilizada pode ser uma coluna contendo uma superfície de vidro ou de silica, ou uma coluna de vidro de poros controlados ou uma coluna de ácido silícico. Em algumas aplicações, a coluna é revestida com um reagente, como glicerol, possivelmente para impedir a aderência não específica de contaminantes.

[00240] Como a primeira etapa da purificação, uma preparação derivada da cultura de células como descrito acima pode ser aplicada sobre uma fase sólida imobilizada da proteína A para permitir a ligação específica dos anticorpos de interesse à proteína A. A fase sólida, então, seria lavada para remover contaminantes não especificamente ligados à fase sólida. Finalmente, o anticorpo de interesse é recuperado da fase sólida por eluição.

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GERAÇÃO DE ANTICORPOS USANDO CÉLULAS HOSPEDEIRAS EUCARIÓTICAS:

[00241] Um vetor para uso em uma célula hospedeira eucariótica geralmente inclui um ou mais dos seguintes componentes não limitantes: uma sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição.

a) COMPONENTE SEQUÊNCIA SINAL

[00242] Um vetor para uso em uma célula hospedeira eucariótica também pode conter uma sequência sinal ou outros polipeptídeos com um sítio de divagem no N-terminal da proteína madura ou polipeptídeo de interesse. A sequência sinal heteróloga selecionada pode ser aquela que é reconhecida e processada (ou seja, clivada por uma peptidase sinal) pela célula hospedeira. Na expressão das células de mamíferos, estão disponíveis sequências sinal de mamíferos, bem como líderes secretores virais, por exemplo, o sinal gD do herpes simplex. O DNA para essa região precursora é ligado no quadro de leitura ao DNA que codifica o anticorpo.

b) ORIGEM DA REPLICAÇÃO

[00243] Geralmente, uma origem do componente de replicação não é necessária para os vetores de expressão de mamíferos. Por exemplo, a origem do SV40 pode normalmente ser usada apenas porque contém o promotor precoce.

c) COMPONENTE GENE DE SELEÇÃO

[00244] Os vetores de clonagem e de expressão podem conter um gene de seleção, também chamado de um marcador selecionável. Genes de seleção comuns codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, sempre que relevante, ou (c) fornecem nutrientes essenciais não disponíveis a partir dos meios do complexo.

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[00245] Um exemplo de um esquema de seleção usa um fármaco para deter o crescimento de uma célula hospedeira. As células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência ao fármaco e, portanto, sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos dessa seleção dominante usam os fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

[00246] Outro exemplo de marcadores selecionáveis adequados para células de mamíferos são aqueles que permitem a identificação de células competentes para capturar o ácido nucleico do anticorpo, como DHFR, timidina quinase, metalotioneína-l e -II, genes da metalotioneína de primatas, adenosina desaminase, ornitina descarboxilase, etc.

[00247] Por exemplo, em algumas formas de realização, as células transformadas com o gene de seleção DHFR são identificadas por cultura de todos os transformantes em um meio de cultura que contém o metotrexato (MTX), um antagonista competitivo do DHFR. Em algumas formas de realização, uma célula hospedeira apropriada, quando o DHFR do tipo selvagem é empregado, é a linhagem de células de ovários de hamster chinês (CHO) deficientes na atividade do DHFR (por exemplo, ATCC CRL-9096).

[00248] Alternativamente, as células hospedeiras (particularmente hospedeiras do tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ou cotransformadas com sequências de DNA que codificam um anticorpo, proteína DHFR do tipo selvagem, e outro marcador selecionável como aminoglicosídeo 3'-fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas por crescimento celular em meio contendo um agente de seleção para o marcador selecionável, como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina ou G418. Veja a Patente US n° 4,965,199. As células hospedeiras podem incluir NS0, CHOK1, CHOK1SV ou derivados, incluindo linhagens de células deficientes em glutamina sintetase (GS). Os métodos para o uso da GS

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129/169 como um marcador selecionável para células de mamíferos são descritos na Patente US N° 5,122,464 e Patente US N° 5,891,693.

d) COMPONENTE PROMOTOR

[00249] Os vetores de clonagem e de expressão normalmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é operativamente ligado ao ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de interesse (por exemplo, um anticorpo). Sequências promotoras são conhecidas para eucariotas. Por exemplo, praticamente todos os genes eucariotas possuem uma região rica em AT localizada a cerca de 25 a 30 bases a montante do sítio onde a transcrição é iniciada. Outra sequência encontrada a 70 a 80 bases a montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT, onde N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos 3 genes eucariotas, está uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para adição da cauda poli-A à extremidade 3' da sequência de codificação. Em algumas formas de realização, qualquer uma ou todas essas sequências podem ser devidamente inseridas a vetores de expressão eucariotas.

[00250] A transcrição de vetores em células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir dos genomas de vírus, como o vírus do polioma, vírus da varicela, adenovirus (como o Adenovirus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovirus, o vírus da hepatite B e o vírus símio 40 (SV40), de promotores heterólogos de mamíferos, por exemplo, o promotor da actina ou um promotor da imunoglobulina, de promotores de choque térmico, desde que esses promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.

[00251] Os promotores precoce e tardio do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição do SV40, que também contém a origem de replicação viral do SV40. O promotor

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130/169 precoce imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição Hindlll. Um sistema para expressão do DNA em hospedeiros mamíferos usando o vírus do papiloma bovino como um vetor é descrito na Patente US n° 4,419,446. Uma modificação desse sistema é descrita na Patente US n° 4,601,978. Veja também Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982), que descreve a expressão do cDNA para β-interferon humano em células de camundongo sob o controle de um promotor da timidina quinase do vírus herpes simplex. Alternativamente, a repetição terminal longa do vírus do Sarcoma de Rous pode ser usada como o promotor.

e) COMPONENTE ELEMENTO POTENCIADOR

[00252] A transcrição do DNA que codifica um anticorpo da presente invenção por eucariotas superiores é frequentemente aumentada por inserção de uma sequência potenciadora ao vetor. Muitas sequências potenciadoras são, agora, conhecidas a partir dos genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Normalmente, no entanto, será usado um potenciador de um vírus de células eucarióticas. Os exemplos incluem o potenciador do SV40 no lado tardio da origem de replicação (bp 100-270), o potenciador do promotor precoce do citomegalovírus humano, o potenciador do promotor precoce do citomegalovírus de camundongo, o potenciador do polioma no lado tardio da origem de replicação e potenciadores do adenovirus. Veja também Yaniv, Nature 297:17-18 (1982), que descreve os elementos potenciadores para ativação de promotores eucarióticos. O potenciador pode ser emendado no vetor a uma posição 5' ou 3' para a sequência de codificação do polipeptídeo do anticorpo, mas geralmente está localizado em um sítio 5' do potenciador.

f) COMPONENTE TERMINAÇÃO DA TRANSCRIÇÃO

[00253] Os vetores de expressão usados em células hospedeiras eucarióticas também podem conter sequências necessárias para a

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131/169 terminação da transcrição e para estabilização do mRNA. Essas sequências são comumente disponíveis a partir da 5' e, ocasionalmente, 3', regiões não traduzidas de DNAs ou cDNAs virais ou eucarióticos. Essas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos como fragmentos poliadenilados na parte não traduzida do mRNA que codifica um anticorpo. Um componente útil da terminação da transcrição é a região de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino. Veja o Documento WO 94/11026 e o vetor de expressão nele descrito.

g) SELEÇÃO E TRANSFORMAÇÃO DAS CÉLULAS HOSPEDEIRAS [00254] Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do DNA nos vetores neste documento incluem células eucarióticas superiores aqui descritas, incluindo as células hospedeiras de vertebrados. A propagação das células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) se tornou um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são linhagens do rim de macaco CV1 transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagens do rim embrionárias humanas (por exemplo, células 293 ou 293T subclonadas para o desenvolvimento em cultura de suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub etal., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 77:4216 (1980)); células de sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de Macaco Verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato e búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humanas (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et a!., Annals, N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; células FS4;

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132/169 células CH0K1; células CH0K1SV ou derivadas e uma linhagem do hepatoma humano (Hep G2).

[00255] As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou de clonagem acima descritos para produção de anticorpos e cultivadas em meios nutrientes convencionais, conforme apropriado para indução de promotores, seleção de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas.

h) CULTURA DAS CÉLULAS HOSPEDEIRAS

[00256] As células hospedeiras usadas para produzir um anticorpo da presente invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis como Ham's F10 (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio Eagle Modificado da Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para cultura das células hospedeiras. Além disso, quaisquer dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), as Patentes US N^QS 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655 ou 5,122,469; as Publicações WO 90/03430; WO 87/00195; ou a Patente US Re-examinada 30,985 podem ser usados como meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer desses meios pode ser suplementado, se necessário, com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (como HEPES), nucleotídeos (como adenosina e timidina), antibióticos (como o fármaco Gentamicina™), elementos traço (definidos como compostos inorgânicos geralmente presentes em concentrações finais no intervalo micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos podem também ser incluídos em concentrações adequadas, que seriam conhecidas para aqueles versados na técnica. As condições de cultura, como a temperatura, pH e similares, são aquelas usadas anteriormente com a

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133/169 célula hospedeira selecionada para expressão, e será aparente para aquele com conhecimentos comuns na técnica.

PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS

[00257] Ao usar técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, ou diretamente secretado no meio. Se o anticorpo é produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, as partículas residuais, células hospedeiras ou fragmentos lisados, podem ser removidas, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Quando o anticorpo é secretado no meio, sobrenadantes desses sistemas de expressão podem ser concentrados, primeiro, usando um filtro de concentração de proteína disponível no mercado, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor da protease, como PMSF, pode ser incluído em qualquer das etapas anteriores para inibir a proteólise, e antibióticos podem ser incluídos para evitar o crescimento de contaminantes acidentais.

[00258] A composição de anticorpos preparados a partir das células pode ser purificada usando, por exemplo, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise e cromatografia por afinidade, com a cromatografia por afinidade sendo uma técnica conveniente. A adequação da proteína A como um ligante de afinidade depende da espécie e isotipo de qualquer domínio Fc da imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A proteína pode ser usada para purificar anticorpos que se baseiam em cadeias pesadas γ1, γ2 ou γ4 (Lindmark et al., J. Immunol. Methods 62:1-13 (1983). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de camundongo e para γ3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986). A matriz à qual o ligante de afinidade se liga é a agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, como vidro com poros controlados ou poli(estirenodivinil)benzeno, permitem taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processamento mais curtos do que pode ser alcançado com

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134/169 agarose. Embora o anticorpo compreenda um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) é útil para purificação. Outras técnicas para a purificação de proteínas, como o fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação em etanol, HPLC de Fase Reversa, cromatografia em silica, cromatografia em heparina Sepharose™, cromatografia em uma resina de troca aniôca ou catiônica (como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofoco, SDS-PAGE e precipitação de sulfato de amônio também estão disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.

[00259] Após qualquer fase de purificação preliminar, a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e os contaminantes pode ser submetida à purificação adicional, por exemplo, por cromatografia de interação hidrofóbica a baixo pH utilizando um tampão de eluição a um pH entre cerca de 2,5-4.5, realizada a baixas concentrações de sal (por exemplo, de cerca de 0-0,25M de sal).

[00260] Em geral, várias metodologias para preparação de anticorpos para uso na pesquisa, teste e uso clínico são bem estabelecidas na técnica, consistente com as metodologias descritas acima e/ou como considerado adequado por aquele versado na técnica para um específico anticorpo de interesse.

PRODUÇÃO DE ANTICORPOS NÃO FUCOSILADOS

[00261] São aqui fornecidos métodos para a preparação de anticorpos com um reduzido grau de fucosilação. Por exemplo, os métodos contemplados neste documento incluem, mas não se limitam a, uso de linhagens de células deficientes na fucosilação de proteínas (por exemplo, células Led 3 CHO, células CHO com nocaute para o gene da alfa-1,6-fucosiltransferase, células que sobre-expressam a p1,4-N-acetilglicosminiltransferase III e ainda que sobre-expressam Golgi μ-manosidase II, etc.), e a adição de análogo(s) da fucose em um meio de cultura de células usado para a produção dos anticorpos. Veja

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Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Patente US N^Q US 2003/0157108 A1, Presta, L; WO 2004/056312 A1; YamaneOhnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); e a Patente US n° 8,574,907. Técnicas adicionais para reduzir o teor de fucose dos anticorpos incluem a tecnologia Glymaxx descrita na Publicação do Pedido de Patente US N^Q 2012/0214975. Técnicas adicionais para reduzir o teor de fucose dos anticorpos também incluem a adição de um ou mais inibidores da glicosidase em um meio de cultura de células usado para a produção dos anticorpos. Os inibidores da glicosidase incluem da α-glicosidase I, α-glicosidase II e a-manosidase I. Em algumas formas de realização, o inibidor da glicosidase é um inibidor da α-manosidase I (por exemplo, kifunensina).

[00262] Como usado neste documento, a fucosilação do núcleo se refere à adição de fucose (fucosilação) à N-acetilglucosamina (GlcNAc) no terminal redutor de um glicano ligado a N. Também são fornecidos anticorpos produzidos por esses métodos e composições.

[00263] Em algumas formas de realização, é reduzida a fucosilação das cadeias de açúcar complexas ligadas ao N-glicosídeo ligadas à região Fc (ou domínio). Como usado neste documento, uma cadeia de açúcar complexas ligada ao N-glicosídeo é normalmente ligada à asparagina 297 (de acordo com o número de Kabat), embora uma cadeia de açúcar complexa ligada ao N-glicosídeo também possa ser ligada a outros resíduos de asparagina. Uma cadeia de açúcar complexa ligada ao N-glicosídeo exclui um tipo de cadeia de açúcar com elevado teor de manose, na qual apenas a manose é incorporada ao terminal não redutor da estrutura do núcleo, mas inclui 1) um tipo complexo, no qual o lado terminal redutor da estrutura do núcleo possui uma ou mais ramificações da galactose-N-acetilglucosamina (também conhecida como gal-GIcNAc) e o lado terminal não redutor da GalGlcNAc opcionalmente possui um ácido siálico, que bifurca a N

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136/169 acetilglucosamina ou similar; ou 2) um tipo híbrido, no qual o lado terminal não redutor da estrutura do núcleo possui ambas as ramificações da cadeia de açúcar com elevado teor de manose ligada ao N-glicosídeo e a cadeia de açúcar complexa ligada ao N-glicosídeo. [00264] Em algumas formas de realização, a cadeia de açúcar complexa ligado a N-glicosídeo inclui um tipo complexo, no qual o lado terminal não redutor da estrutura do núcleo tem zero, uma ou mais ramificações da galactose-N-acetilglucosamina (também referida como gal-GIcNAc) e o lado terminal não redutor da Gal-GIcNAc tem ainda, opcionalmente, uma estrutura como um ácido siálico, que bifurca a Nacetilglucosamina ou similar.

[00265] De acordo com os presentes métodos, normalmente apenas uma pequena quantidade de fucose é incorporada à(s) cadeia(s) de açúcar complexa(s) ligada(s) ao N-glicosídeo. Por exemplo, em várias formas de realização, menos de cerca de 60%, menos de cerca de 50%, menos de cerca de 40%, menos de cerca de 30%, menos de cerca de 20%, menos de cerca de 15%, menos de cerca de 10%, menos de cerca de 5% ou menos de cerca de 1 % do anticorpo tem fucosilação do núcleo por fucose em uma composição. Em algumas formas de realização, substancialmente nenhum (ou seja, menos de aproximadamente 0,5%) anticorpo tem fucosilação do núcleo por fucose em uma composição. Em algumas formas de realização, mais de cerca de 40%, mais de cerca de 50%, mais de cerca de 60%, mais de cerca de 70%, mais de cerca de 80%, mais de cerca de 90%, mais de cerca de 91%, mais de cerca de 92%, mais de cerca de 93%, mais de cerca de 94%, mais de cerca de 95%, mais de cerca de 96%, mais de cerca de 97%, mais de cerca de 98% ou mais de cerca de 99% do anticorpo é não fucosilado em uma composição.

[00266] Em algumas formas de realização, é aqui fornecido um anticorpo em que substancialmente nenhuma (ou seja, menos de cerca

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137/169 de 0,5%) das cadeias de carboidratos ligadas ao N-glicosídeo contém um resíduo de fucose. Em algumas formas de realização, é aqui fornecido um anticorpo em que pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo é não fucosilada.

[00267] Como descrito acima, vários sistemas do vetor de expressão para hospedeiros mamíferos podem ser usados para expressar um anticorpo. Em algumas formas de realização, os meios de cultura não são suplementados com fucose. Em algumas formas de realização, uma quantidade eficaz de um análogo da fucose é adicionada ao meio de cultura. Nesse contexto, uma quantidade eficaz se refere a uma quantidade do análogo que seja suficiente para diminuir a incorporação de fucose a uma cadeia de açúcar complexa ligada ao N-glicosídeo de um anticorpo em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de 50%. Em algumas formas de realização, os anticorpos produzidos pelos presentes métodos compreendem pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de 50% de proteína não fucosilada em núcleo (por exemplo, sem fucosilação de núcleo), em comparação a anticorpos produzidos a partir das células hospedeiras cultivadas na ausência de um análogo da fucose.

[00268] O teor (por exemplo, a razão) das cadeias de açúcar nas quais a fucose não é ligada à N-acetilglucosamina na extremidade de redução da cadeia de açúcar versus as cadeias de açúcar nas quais a fucose é ligada à N-acetilglucosamina na extremidade de redução da cadeia de açúcar pode ser determinado, por exemplo, tal como descrito nos Exemplos. Outros métodos incluem a hidrazinólise ou a digestão enzimática (veja, por exemplo, Biochemical Experimentation Methods 23\ Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain (Japan Scientific Societies Press), editado por Reiko Takahashi (1989), marcação com

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138/169 fluorescência ou marcação com radioisótopo da cadeia de açúcar liberada e, em seguida, separação da cadeia de açúcar marcada por cromatografia. Além disso, as composições das cadeias de açúcar liberadas podem ser determinadas analisando as cadeias pelo método HPAEC-PAD (veja, por exemplo, J. Liq Chromatogr. 6:1557 (1983)). (Veja, em geral, a Publicação de Pedido de Patente US N^Q2004/0110282.

III. COMPOSIÇÕES

[00269] Em alguns aspectos, também são aqui fornecidas composições (por exemplo, composições farmacêuticas) compreendendo qualquer um dos anticorpos anti-Siglec-8 aqui descritos (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8). Em alguns aspectos, é aqui fornecida uma composição compreendendo um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito, em que o anticorpo compreende uma região Fc e cadeias de carboidratos ligadas ao N glicosídeo ligadas à região Fc, em que menos de 50% das cadeias de carboidratos ligadas ao N-glicosídeo contêm um resíduo de fucose. Em algumas formas de realização, o anticorpo compreende uma região Fc e cadeias de carboidratos ligadas ao N-glicosídeo ligadas à região Fc, em que menos de cerca de 45%, cerca de 40%, cerca de 35%, cerca de 30%, cerca de 25%, cerca de 20% ou cerca de 15% das cadeias de carboidratos ligadas ao N-glicosídeo contêm um resíduo de fucose. Em alguns aspectos, é aqui fornecida uma composição que compreende um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito, em que o anticorpo compreende uma região Fc e cadeias de carboidratos ligadas ao N-glicosídeo ligados à região Fc, em que praticamente nenhuma das cadeias de carboidratos ligadas ao N-glicosídeo contém um resíduo de fucose.

[00270] Formulações terapêuticas são preparadas para armazenamento por mistura do ingrediente ativo tendo o desejado grau de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes

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139/169 farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20^a Ed., Lippincott Williams & Wikiins, Pub., Gennaro Ed., Filadélfia, Pa. 2000). Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para os receptores às dosagens e concentrações usadas, e incluem tampões, antioxidantes incluindo ácido ascórbico, metionina, vitamina E, metabissulfito de sódio; conservantes, isotonicificantes, estabilizantes, complexos de metais (por exemplo, complexos Zn-protína); agentes quelantes como EDTA e/ou tensoativos não iônicos.

[00271] Os tampões podem ser usados para controlar o pH em um intervalo que otimiza a eficácia terapêutica, especialmente se a estabilidade for dependente do pH. Os tampões podem estar presentes a concentrações que variam de cerca de 50 mM a cerca de 250 mM. Agentes de tamponamento adequados para uso com a presente invenção incluem tanto os ácidos orgânicos quanto os inorgânicos e seus sais. Por exemplo, citrato, fosfato, succinato, tartarato fumarato, gluconato, oxalato, lactato, acetato. Além disso, os tampões podem ser compostos de sais de histidina e trimetilamina, como Tris.

[00272] Podem ser adicionados conservantes para prevenir o crescimento microbiano, e são tipicamente presentes em um intervalo de cerca de 0,2%-1,0% (p/v). Conservantes adequados para uso com a presente invenção incluem cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; halogenetos de benzalcônio (por exemplo, cloreto, brometo, iodeto), cloreto de benzetônio; timerosal, fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol, 3-pentanol e m-cresol.

[00273] Agentes de tonicidade, às vezes conhecidos como estabilizantes, podem estar presentes para ajustar ou manter a tonicidade do líquido em uma composição. Quando usados com grandes biomoléculas carregadas, como proteínas e anticorpos, eles

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140/169 são muitas vezes denominados estabilizantes porque podem interagir com os grupos carregados das cadeias laterais de aminoácidos, assim diminuindo o potencial para interações inter e intramoleculares. Agentes de tonicidade podem estar presentes em qualquer quantidade entre cerca de 0,1 % a cerca de 25% em peso, ou entre cerca de 1 a cerca 5% em peso, levando em conta as quantidades relativas dos outros ingredientes. Em algumas formas de realização, os agentes de tonicidade incluem álcoois de açúcar poli-hídricos, álcoois de açúcar trihídricos ou superiores, como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol.

[00274] Excipientes adicionais incluem os agentes que podem servir como um ou mais dos seguintes: (1) agentes de adensamento, (2) potenciadores da solubilidade (3) estabilizantes e (4) agentes de prevenção da desnaturação ou aderência à parede do recipiente. Esses excipientes incluem: álcoois de açúcar poli-hídricos (enumerados acima); aminoácidos como alanina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina, ornitina, leucina, 2-fenilalanina, ácido glutâmico, treonina, etc.; açúcares orgânicos ou álcoois de açúcar como sacarose, lactose, lactitol, trealose, estaquiose, manose, sorbose, xilose, ribose, ribitol, mioinisitose, mioinisitol, galactose, galactitol, glicerol, ciclitóis (por exemplo, inositol), polietileno glicol; agentes redutores contendo enxofre, como ureia, glutationa, ácido tióctico, tioglicolato de sódio, tioglicerol, a-monotioglicol e tio sulfato de sódio; proteínas de baixo peso molecular como albumina sérica humana, albumina sérica bovina, gelatina ou outras imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; monossacarídeos (por exemplo, xilose, manose, frutose, glicose; dissacarídeos (por exemplo, lactose, maltose, sacarose); trissacarídeos como rafinose; e polissacarídeos como dextrina ou dextrano.

[00275] Tensoativos não iônicos ou detergentes (também

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141/169 conhecidos como agentes umectantes) podem estar presentes para ajudar a solubilizar o agente terapêutico, bem como para proteger a proteína terapêutica contra a agregação induzida por agitação, que também permite à formulação ser exposta a estresse por superfície de cisalhamento sem causar desnaturação da proteína ou anticorpo terapêutico ativo. Tensoativos não iônicos estão presentes em um intervalo de cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml ou de cerca de 0,07 mg/ml a cerca de 0,2 mg/ml. Em algumas formas de realização, os tensoativos não iônicos estão presentes em um intervalo de cerca de 0,001 % a cerca de 0,1 % p/v, ou de cerca de 0,01 % a cerca de 0,1 % p/v, ou de cerca de 0,01% a cerca de 0,025% p/v.

[00276] Tensoativos não iônicos adequados incluem polissorbatos (20, 40, 60, 65, 80, etc.), polioxâmeros (184, 188, etc.), polióis PLURONIC® TRITON®, monoéteres de polioxietileno sorbitano (TWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.), lauromacrogol 400, estearato de polioxila 40, óleo de rícino hidrogenado de polioxietileno 10, 50 e 60, glicerol monoestearato, éster do ácido graxo e sacarose, metil celulose e carboximetil celulose. Detergentes aniônicos que podem ser usados incluem lauril sulfato de sódio, dioctil sulfosuccinato de sódio e dioctil sulfonato de sódio. Detergentes catiônicos incluem cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetônio.

[00277] Para que as formulações sejam usadas para administração in vivo, elas devem ser estéreis. A formulação pode ser tornada estéril por filtração através de membranas de filtração estéreis. As composições terapêuticas aqui são, em geral, colocadas em um recipiente com uma porta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou frasco de solução intravenosa com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.

[00278] A via de administração é de acordo com os métodos conhecidos e aceitos, por exemplo, por um único ou vários bólus ou

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142/169 infusão por um longo período de tempo de maneira adequada, por exemplo, injeção ou infusão por via subcutânea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, intralesional ou intraarticular, administração tópica, inalação ou por meio de liberação sustentada ou prolongada.

[00279] A formulação da invenção pode ainda conter mais de um composto ativo, conforme necessário, para a indicação particular sendo tratada, de preferência aqueles com atividades complementares sem efeito prejudicial mútuo. Esses compostos ativos são devidamente presentes em combinação, em quantidades que sejam eficazes para o fim pretendido.

IV. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO OU KITS

[00280] Em outro aspecto, é fornecido um artigo de fabricação ou kit que compreende um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8). O artigo de fabricação ou kit pode ainda incluir instruções para uso do anticorpo nos métodos da presente invenção. Assim, em algumas formas de realização, o artigo de fabricação ou o kit inclui instruções para o uso de um anticorpo antiSiglec-8 que se liga à Siglec-8 humana em métodos para tratamento e/ou prevenção de um distúrbio gastrointestinal inflamatório (por exemplo, IBD ou um EGID) em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antiSiglec-8 que se liga à Siglec-8 humana. Em algumas formas de realização, o artigo de fabricação compreende um medicamento contendo um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana e um folheto com instruções para administração do medicamento em um indivíduo em sua necessidade para tratar e/ou prevenir um distúrbio gastrointestinal inflamatório (por exemplo, IBD ou um EGID). Em algumas formas de realização, o folheto indica ainda que o tratamento é eficaz na redução de um ou mais sintomas no indivíduo com um distúrbio gastrointestinal

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143/169 inflamatório (por exemplo, IBD ou um EGID) em comparação a um nível basal anterior à administração do medicamento. Em algumas formas de realização, o indivíduo é diagnosticado com o distúrbio gastrointestinal inflamatório (por exemplo, IBD ou um EGID) antes da administração do medicamento que compreende o anticorpo. Em algumas formas de realização, o indivíduo é um ser humano.

[00281 ] O artigo de fabricação ou kit pode ainda incluir um recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, vidros, frascos (por exemplo, frascos com dupla câmara), seringas (como seringas de câmara única ou dupla) e tubos de ensaio. O recipiente pode ser formado a partir de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico. O recipiente contém a formulação.

[00282] O artigo de fabricação ou kit pode ainda incluir um rótulo ou um folheto, que fica sobre ou associada ao recipiente, pode indicar orientações para reconstituição e/ou uso da formulação. O rótulo ou o folheto pode ainda indicar que a formulação é útil ou destinada ao modo de administração subcutânea, intravenosa ou outros para tratar e/ou prevenir um distúrbio gastrointestinal inflamatório (por exemplo, IBD ou um EGID) em um indivíduo. O recipiente que contém a formulação pode ser um frasco de uso único ou um frasco de vários usos, que permite administrações repetidas da formulação reconstituída. O artigo de fabricação ou kit pode ainda incluir um segundo recipiente compreendendo um diluente adequado. O artigo de fabricação ou kit pode ainda incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial, terapêutico e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e folhetos com instruções de uso.

[00283] Em uma forma de realização específica, a presente invenção fornece kits para uma unidade de administração de dose única. Esses kits incluem um recipiente de uma formulação aquosa do anticorpo terapêutico, incluindo seringas já cheias de uma ou várias câmaras.

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Seringas já cheias exemplificativas estão disponíveis por Vetter GmbH, Stuttgart, Alemanha.

[00284] Em outra forma de realização, é aqui fornecido um artigo de fabricação ou kit compreendendo as formulações descritas aqui para administração em um dispositivo autoinjetor. Um autoinjetor pode ser descrito como um dispositivo de injeção que, mediante ativação, vai entregar seu conteúdo sem ação adicional necessária pelo paciente ou administrador. Eles são particularmente adequados para a automedicação de formulações terapêuticas quando a taxa de entrega deve ser constante e o tempo de entrega é maior do que alguns momentos.

[00285] Em outro aspecto, é fornecido um artigo de fabricação ou kit que compreende um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8). O artigo de fabricação ou kit pode ainda incluir instruções para uso do anticorpo nos métodos da presente invenção. Assim, em algumas formas de realização, o artigo de fabricação ou o kit inclui instruções para o uso de um anticorpo antiSiglec-8 que se liga à Siglec-8 humana em métodos para tratamento ou prevenção de um distúrbio gastrointestinal inflamatório (por exemplo, IBD ou um EGID) em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-Siglec-8 que se liga à Siglec-8 humana. Em algumas formas de realização, o artigo de fabricação ou kit compreende um medicamento contendo um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana e um folheto com instruções para administração do medicamento em um indivíduo em sua necessidade para tratar e/ou prevenir um distúrbio gastrointestinal inflamatório (por exemplo, IBD ou um EGID).

[00286] A presente invenção também fornece um artigo de fabricação ou kit que compreende um anticorpo anti-Siglec-8 aqui descrito (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8) em

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145/169 combinação com um ou mais medicamentos adicionais (por exemplo, um segundo medicamento) para tratar ou prevenir um distúrbio gastrointestinal inflamatório (por exemplo, IBD ou um EGID) em um indivíduo. O artigo de fabricação ou kit pode ainda incluir instruções para uso do anticorpo em combinação com um ou mais medicamentos adicionais nos métodos da presente invenção. Por exemplo, o artigo de fabricação ou kit aqui opcionalmente inclui ainda um recipiente contendo um segundo medicamento, em que o anticorpo anti-Siglec-8 é o primeiro medicamento, e cujo artigo ou o kit inclui ainda instruções no rótulo ou folheto para tratar o indivíduo com o segundo medicamento, em uma quantidade eficaz. Assim, em algumas formas de realização, o artigo de fabricação ou kit inclui instruções para o uso de um anticorpo antiSiglec-8 que se liga à Siglec-8 humana em combinação com um ou mais medicamentos adicionais, em métodos para tratar ou prevenir um distúrbio gastrointestinal inflamatório (por exemplo, IBD ou um EGID) em um indivíduo. Em algumas formas de realização, o artigo de fabricação ou kit inclui um medicamento contendo um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana (por exemplo, um primeiro medicamento), um ou mais medicamentos adicionais e um folheto com instruções para administração do primeiro medicamento em combinação com um ou mais medicamentos adicionais (por exemplo, um segundo medicamento). Em algumas formas de realização, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais pode incluir, mas não se limitada a, sulfassalazina, corticosteroide azatioprina, mercaptopurina, ciclosporina, um (por exemplo, budesonida, dexametasona, metilprednisolona, prednisolona ou predisona), hidrocortisona, infliximabe, adalimumabe, etrolizumabe, golimumabe, metotrexato, natalizumabe, vedolizumabe, ustequinumabe, certolizumabe pegol, antibiótico (por exemplo, ciprofloxacina, aminoglicosídeos, rifamixinaou metronidazol), inibidor de leucotrienos, anti-histamina, cromoglicato de

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146/169 sódio e um inibidor da bomba de prótons (PPI).

[00287] Fica entendido que os aspectos e as formas de realização descritos neste documento são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou alterações correspondentes serão sugeridas aos versados na técnica e devem ser incluídas no espírito e alcance deste pedido de patente e âmbito das reivindicações anexas.

EXEMPLOS

[00288] A presente invenção será entendida de forma mais abrangente por referência aos exemplos a seguir. Os exemplos não devem ser, no entanto, entendidos como limitantes do âmbito da presente invenção. Fica entendido que os exemplos e as formas de realização descritos neste documento são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou alterações correspondentes serão sugeridas aos versados na técnica e devem ser incluídas no espírito e alcance deste pedido de patente e âmbito das reivindicações anexas. EXEMPLO 1: Efeitos do tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 em um modelo de camundongo de inflamação gastrointestinal induzida por DSS

[00289] A fim de avaliar se o tratamento com o anticorpo anti-Siglec8 afeta a patologia complexa da IBD ou doença Gl eosinofílica, foi usado um modelo de camundongo in vivo de colite induzida por DSS. Esse modelo foi amplamente usado para estudo da IBD por causa de suas muitas semelhanças à IBD humana (veja Perse, M. e Cerar, A. (2012) J. Biomed. Biotechnol. 2012:718617). Na verdade, o modelo de camundongo da colite induzida por DSS foi validado como um importante modelo in vivo para testar os efeitos de vários agentes terapêuticos sobre a IBD (Melgar, S. etal. (2008) Int. Immunopharmacol. 8:836-844). Esse modelo também foi usado para estudo da colite eosinofílica crônica (Mishra, A. et al. (2013) J. Gastroenterol. Hepatol. Res. 2:845-853). O Exemplo a seguir relata a avaliação de um anticorpo

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147/169 anti-Siglec-8 como um potencial agente terapêutico para o tratamento da IBD nesse modelo in vivo estabelecido.

MATERIAIS E MÉTODOS

[00290] Modelo da IBD de camundongo induzida por DSS e tratamento com anti-Siglec-8

[00291] Camundongos C57BL/6 transgênicos para Siglec-8 receberam água potável comum ou foram expostos a DSS a 3,5% (36.000 - 50.000 PM) ad libitum em água potável por 5 dias, seguida de água potável comum por mais 4 dias. Os camundongos tratados com DSS foram administrados por via intraperitoneal (IP) no dia 2 após a administração do DSS com um mAb de controle do isotipo ou um mAb anti-Siglec-8 (m2E2 lgG1 tendo sequências dos domínios VH e VL da SEQ ID N^Q: 1 e SEQ ID N^Q: 15, respectivamente).

ÍNDICE DE ATIVIDADE DA DOENÇA (DAI)

[00292] O DAI foi medido em camundongos tratados como descrito acima pela metodologia padrão (ver Friedman, D.J. et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Anim. Sei. 106:16788-16793). Em resumo, a perda de peso, a consistência das fezes e o sangue visível nas fezes foram pontuados em uma escala de 0 - 4 por gravidade das categorias mencionadas acima.

CITOMETRIA DE FLUXO

[00293] Para análise da citometria de fluxo, a lâmina própria colônica foi isolada a partir de um pequeno segmento do cólon usando a digestão mecânica e enzimática com um desregulador GentleMACS™ (Miltenyi) e kit de dissociação da lâmina própria (Miltenyi), seguindo as instruções do fabricante. As estratégias de marcação de células imunes para a citometria de fluxo são as seguintes: neutrófilos (CD45+ 7DAA- Ly6G+ CD11b+); monócitos recrutados (CD45+ 7AAD- CD11b+ Ly6G- F480+ Ly6C+); macrófagos residentes (CD45+ 7DAA- CD11b+ Ly6G- F480+ Ly6C-). RESULTADOS

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[00294] Os camundongos transgênicos para Siglec-8 receberam água potável comum ou foram expostos a DSS a 3,5% ad libitum em água potável por 5 dias, seguida de água potável comum por mais 4 dias (Figura 1A). Os camundongos tratados com DSS foram administrados por via intraperitoneal (IP) com um mAb de controle de isotipo ou um mAb anti-Siglec-8 no dia 2 após a administração do DSS. Como mostrado na Figura 1B, os camundongos tratados com controle de isotipo que receberam DSS a 3,5% apresentaram significativa perda de peso com início no dia 2, que continuou durante o período do estudo, em comparação aos camundongos que receberam água potável comum. O tratamento com mAb anti-Siglec-8 no dia 2 reduziu significativamente a perda de peso corporal induzida por DSS durante 5 dias, em comparação aos camundongos tratados com controle de isotipo expostos ao DSS.

[00295] Para analisar em adição se o tratamento com anti-Siglec-8 melhora a patologia da IBD, a atividade da doença foi avaliada usando a metodologia DAI descrita acima. A exposição ao DSS aumentou significativamente a DAI, começando no dia 2, que continuou durante o período do estudo, em relação aos camundongos que receberam água potável comum (Figura 2). O tratamento com um mAb anti-Siglec-8 no dia 2 melhorou significativamente a DAI no dia 4 e nominalmente no dia 6 (p=0,06), em comparação aos camundongos tratados com controle de isotipo, demonstrando que a dosagem terapêutica de um mAb antiSiglec-8 reduz a atividade da doença na colite induzida por DSS.

[00296] Em seguida, foi analisado o peso do cólon. O aumento do peso do cólon em animais tratados com DSS representa um influxo na inflamação colônica (vejaLiu, E.S. etal. (2003) Carcinogênese 24:14071413). Os animais tratados com DSS + controle de isotipo apresentaram um aumento significativo no peso do cólon em comparação aos camundongos que receberam água potável comum (Figura 3). O

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149/169 tratamento com mAb anti-Siglec-8 no dia 2 reduziu significativamente a perda de peso do cólon tratado com DSS em comparação aos camundongos tratados com controle de isotipo. Esses resultados sugerem que o tratamento com mAb anti-Siglec-8 inibe a inflamação colônica.

[00297] Para examinar a infiltração de células imunes no modelo da IBD induzida por DSS, os camundongos foram analisados quanto à infiltração de células imunes na lâmina própria do cólon usando a citometria de fluxo como descrito acima. Em comparação aos camundongos que receberam água potável comum, os animais tratados com DSS + controle de isotipo exibiram um aumento significativo nos neutrófilos e monócitos pró-inflamatórios, bem como uma diminuição concomitante nos macrófagos residentes anti-inflamatórios (Figura 4). O tratamento com um mAb anti-Siglec-8 no dia 2 + exposição a DSS reduziu significativamente a inflamação induzida por DSS, em comparação aos animais tratados com controle de isotipo + DSS. Os camundongos tratados com mAb anti-Siglec-8 exibiram uma redução nominal nos neutrófilos pró-inflamatórios, uma diminuição significativa nos monócitos recrutados e um aumento na população de macrófagos residentes anti-inflamatórios. Esses dados demonstram que o tratamento terapêutico com um mAb anti-Siglec-8 melhora a inflamação induzida por DSS.

[00298] Tomados em conjunto, esses dados mostram que o tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 reduz a inflamação, a infiltração imune e a patologia da doença em um determinado modelo de camundongo, sugerindo que os anticorpos anti-Siglec-8 podem representar um eficaz agente terapêutico para o tratamento da IBD. Além disso, uma vez que o tratamento com anticorpos anti-Siglec-8 reduziu a inflamação no trato Gl, o tratamento com o anticorpo antiSiglec-8 também pode ser eficaz contra os EGIDs, como EOE, EG, EGE

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150/169 e EC.

EXEMPLO 2: Efeitos do tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 em um modelo de camundongo de gastroenterite eosinofílica (EGE) [00299] A seguir, foram examinados os efeitos do tratamento com anti-Siglec-8 em um modelo de camundongo da EGE.

MATERIAIS E MÉTODOS

[00300] Os camundongos transgênicos Siglec-8 foram sistematicamente sensibilizados com 100 pg de ovoalbumina (OVA) em alúmen através de injeção intraperitoneal (IP) no Dia 0 e Dia 14, seguido por desafio intragástrico com 50 mg de OVA em alúmen nos Dias 28, 30, 32, 34, 36 e 39 (Figura 5A). No Dia 32, os camundongos foram administrados terapeuticamente uma vez IP (100 pg/camundongo) com um anticorpo de controle com correspondência de isotipo ou mAb antiSiglec-8. O anticorpo anti-Siglec-8 foi o anticorpo de camundongo 2E2 com um isotipo lgG2a de murino, ou seja, um isotipo Fc ativo que esgota as células que expressam Siglec-8 (lgG2a 2E2 mAb anti-Siglec-8). No Dia 39, o estudo foi encerrado, seguido por análise de eosinófilos no sangue, eosinófilos e mastócitos no intestino delgado por citometria de fluxo.

RESULTADOS

[00301] A Figura 5A ilustra o esquema da sensibilização por OVA, desafio com OVA e o tratamento com anticorpo anti-Siglec-8 em camundongos transgênicos para Siglec-8. Os resultados do estudo estão mostrados na Figura 5B. Em comparação aos camundongos tratados com controle de isotipo, os camundongos tratados com lgG2a 2E2 mAb anti-Siglec-8 tiveram números significativamente reduzidos de eosinófilos no sangue. A administração de OVA aumentou significativamente os eosinófilos e mastócitos no intestino delgado em comparação ao tratamento com PBS. Em comparação aos camundongos tratados com isotipo, os camundongos tratados com

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151/169 lgG2a 2E2 mAb anti-Siglec-8 tiveram números significativamente reduzidos tanto de eosinófilos quanto de mastócitos no intestino delgado.

[00302] Esses dados demonstram que o tratamento com anti-Siglec8 reduz a inflamação intestinal, medida por eosinófilos e mastócitos, em um modelo de gastroenterite eosinofílica de camundongo induzida por OVA. Esses dados sugerem que os anticorpos anti-Siglec-8 podem representar um eficaz agente terapêutico para tratamento da GEE, como proposto no Exemplo 1 acima.

EXEMPLO 3: Tratamento com um anti-anticorpo Siglec-8 reduz a inflamação gastrointestinal eosinofílica em camundongos

[00303] A atividade de um anticorpo anti-Siglec-8 foi testada em um modelo de mouse de gastrite eosinofílica (EG) e gastroenterite (EGE). MATERIAIS E MÉTODOS

MODELO DE INFLAMAÇÃO Gl EOSINOFÍLICA

[00304] Como mostrado na Figura 6A, camundongos transgênicos (Tg) para siglec-8 foram sistematicamente sensibilizados com ovoalbumina (OVA) por 28 dias, seguido de 6 desafios com OVA intragástrica a cada 2 dias (veja Song DJ, Cho JY, Miller M, et al. O anticorpo anti-Siglec-F inibe a inflamação eosinofílica intestinal induzida por alérgenos do ovo por via oral em um modelo de camundongo. Clinical immunology (Orlando, Fia). 2009;131 (1):157-169. doi:10.1016/j.dim.2008.11.009 e Brandt EB, Strait RT, Hershko D, etal. Os mastócitos são necessários para diarréia experimental induzida por alérgenos por via oral. Journal of Clinical Investigation. 2003;112(11):1666-1677. doi:10.1172/JCI200319785). Os camundongos foram administrados (IP) com um mAb anti-Siglec-8 (mlgG2a) ou anticorpo de controle com correspondência de isotipo no dia 32.

Citometria de fluxo

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[00305] Os tecidos foram digeridos usando técnicas enzimáticas e mecânicas de acordo com os procedimentos padrão. As estratégias de marcação usadas para eosinófilos e mastócitos nos tecidos Gl são mostradas nas Figuras 6B e 6C, respectivamente. Sangue periférico foi coletado em tubos EDTA, seguido de lise de células vermelhas do sangue.

ANÁLISE POR POR QUANTITATIVO (qPCR)

[00306] Tecido do intestino delgado foi picado e usado para extração de RNA (Qiagen), seguida por síntese de cDNA (Applied Biosciences) e quantificação de transcritos usando SYBR Green.

ANÁLISE DE CITOCINAS

[00307] O soro foi isolado ao término do estudo e as citocinas foram medidas usando Luminex (Millipore).

ESTATÍSTICAS

[00308] Os dados plotados nas colunas representam grupos de 6-8 camundongos em média. Valores P de comparação do isotipo e grupos anti-Siglec-8 foram gerados usando o teste U de Mann Whitney em GraphPad Prism.

RESULTADOS

[00309] A atividade do tratamento com anticorpo anti-Siglec-8 foi testada em um modelo de camundongo de gastrite eosinofílica (EG) e gastroenterite (EGE), como ilustrado na Figura 6A. Os camundongos desenvolveram eosinofilia tecidual induzida por alérgenos no estômago e no intestino delgado após administração de OVA, similar a EG e EGE. Após encerramento do estudo, foram analisados os eosinófilos no sangue e tecidos, foram analisados os mastócitos nos tecidos, e foram analisadas as citocinas no soro e tecidos. O trabalho anterior usando esse modelo não havia indicado que a infiltração de eosinófilos ocorrería no estômago.

[00310] O tratamento com anticorpo anti-Siglec-8 monoclonal

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153/169 resultou em reduções na eosinofilia induzida por OVA tanto no estômago (Figura 7A) quanto no intestino delgado (Figura 7B). O tratamento com mAb anti-Siglec-8 reduziu significativamente a eosinofilia no estômago e intestino delgado (p < 0,05 versus controle de isotipo).

[00311] Os camundongos tratados com mAb anti-Siglec-8 também exibiram eosinofilia significativamente reduzida nos MLNs (p < 0,01 versus controle de isotipo; Figuras 8 e 9A), em conformidade com as reduções observadas no estômago e no intestino delgado. A redução da eosinofilia tecidual em camundongos tratados com mAb anti-Siglec8 foi também associada a uma redução significativa de eosinófilos no sangue (p<0,05 versus o controle de isotipo; Figura 9B). Esses resultados demonstram que o tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 reduziu a eosinofilia nos MLNs e diminui os eosinófilos no sangue.

[00312] Além da eosinofilia tecidual induzida por alérgenos, a infiltração de mastócitos também foi observada no estômago (Figuras 10 e 11 A), intestino delgado (Figura 11B) e MLNs (Figura 11C). Como mostrado nas Figuras 10-11C, o tratamento com mAb anti-Siglec-8 reduziu significativamente os mastócitos teciduais no estômago (p < 0,01), intestino delgado (p < 0,05) e MLNs (p < 0,05) em relação ao controle de isotipo. Esses resultados demonstraram surpreendentemente que o tratamento com anti-Siglec-8 inibe a infiltração de mastócitos no estômago, além do intestino delgado e MLNs.

[00313] A expressão de genes conhecidos por codificar os mediadores inflamatórios envolvidos no recrutamento de mastócitos e eosinófilos também foi analisada no tecido do intestino delgado (Figuras 12A-12E). Os camundongos exibiram expressão aumentada de conhecidas quimiocinas de eosinófilos e mastócitos no intestino delgado, coerente com a eosinofilia tecidual induzida por alérgenos e

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154/169 aumento da infiltração de mastócitos. Os camundongos administrados com mAb anti-Siglec-8 exibiram expressão significativamente reduzida de quimiocinas de eosinófilos e mastócitos e mediadores inflamatórios no intestino delgado (p < 0,05 versus o controle de isotipo para cada gene testado).

[00314] O tratamento com mAb anti-Siglec-8 também reduziu significativamente (p < 0,05 versus o isotipo de controle) os níveis sistêmicos de CCL2 (Figura 13A) e CXCL1 (Figura 13B) no soro. Os camundongos administrados com mAb anti-Siglec-8 também tiveram níveis similares de OVA-lgE em comparação aos camundongos tratados com controle de isotipo (Figura 13C). Essa observação sustenta fortemente a conclusão de que o tratamento com anti-Siglec-8 inibe a ativação de mastócitos dependente do IgE. Sem querer estar ligado à teoria, o fato de que a expressão de CCL2 tanto no intestino delgado quanto no soro foi reduzida mediante tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 sugere que ele pode encontrar o uso como um biomarcador, por exemplo, para atividade e/ou farmacodinâmica do anticorpo anti-Siglec-8.

[00315] Em conclusão, mostrou-se que a sensibilização sistêmica e o desafio intragástrico com OVA induzem a eosinofilia e a infiltração de mastócitos no trato Gl, similar a EG e EGE. Verificou-se que a administração terapêutica do mAb anti-Siglec-8 inibe significativamente a eosinofilia induzida por OVA e o acúmulo de mastócitos no estômago, intestino delgado e MLNs. Os camundongos tratados com anti-Siglec-8 exibiram expressão significativamente reduzida de proteínas granulares e mediadores inflamatórios no intestino delgado e no soro, mas não exibiram níveis alterados de IgE específico para OVA no soro. Esses resultados sugerem que o tratamento com mAb anti-Siglec-8 inibe os efeitos a jusante dependentes do IgE. De modo geral, esses dados confirmam que os eosinófilos e mastócitos são componentes essenciais

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155/169 em EGIDs e demonstram que a união da Siglec-8 com um anticorpo monoclonal representa uma nova abordagem para reduzir significativamente a inflamação Gl de mastócitos e eosinófilos induzida por alérgenos.

EXEMPLO 4: Estrutura de um estudo piloto aberto para avaliar a eficácia e a segurança do tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 em pacientes com Gastrite Eosinofílica (EG) com ou sem Gastrenterite Eosinofílica (EGE)

[00316] EG ± EGE representa um tipo raro de distúrbio gastrointestinal eosinofílico (EGID) e é caracterizado por inflamação crônica devido à infiltração desigual ou difusa de eosinófilos em camadas do estômago (EG-EGE) ou estômago e intestino delgado (EG + EGE). O diagnóstico é feito com base na apresentação clínica (sintomas gastrointestinais) combinada com o aumento de eosinófilos no tecido em amostras de biópsias do estômago e duodeno, sem qualquer outra causa para a eosinofilia. Os sintomas comumente incluem náuseas, vômitos, dor abdominal, diarréia, inchaço, saciedade precoce e perda de peso.

[00317] Não há tratamento aprovado pela FDA para EG ± EGE. As terapias atuais e a administração da doença incluem inibidores da bomba de prótons, dietas restritivas/elementares, corticosteroides sistêmicos ou orais, e ocasional uso off-label de substâncias biológicas imunomoduladoras. Os inibidores da bomba de prótons têm poucos a nenhum benefício em pacientes com EG ± EGE, embora benefício parcial possa ser observado em pacientes com esofagite eosinofílica (EoE). Dietas restritivas/elementares não são consideradas sustentáveis para tratamentos a longo prazo e são usadas mais para fornecer nutrição, apesar da continuidade dos sintomas. Os corticosteroides, sistêmicos ou orais, podem proporcionar alívio dos sintomas, mas não são uma solução para o tratamento a longo prazo

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156/169 devido aos seus inúmeros efeitos colaterais. Este estudo foi desenvolvido para testar a segurança e a eficácia do tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 em pacientes com EG ± EGE.

[00318] Um total de aproximadamente 60 indivíduos são administrados no estudo, em que 20 indivíduos recebem o anticorpo anti-Siglec-8 HEKA (IgG 1 não fucosilado) a uma dose de 0,3 mg/kg para a primeira dose, seguida de 0,3 mg/kg por 3 doses subsequentes, 20 indivíduos recebem o anticorpo anti-Siglec-8 HEKA (lgG1 não fucosilado) a uma dose de 0,3 mg/kg para a primeira dose, seguida de 1 mg/kg por 3 doses subsequentes, e 20 indivíduos recebem placebo, em um modo randomizado, duplo cego. As 4 doses do anticorpo antiSiglec-8 HEKA (IgG 1 não fucosilado) ou placebo são administradas por infusão venosa nos Dias 1,29 (±3), 57 (±3) e 85 (±3).

[00319] Os indivíduos são acompanhados por 56 (±3) dias após a última dose e uma Esôfago-Gastro-Duodenoscopia (EGD) repetida com biópsia é realizada 14 (± 3) dias após a administração da última dose.

[00320] Os pacientes com EG ± EGE são testados. Um Questionário de resultados reportados pelo paciente (PRO) é usado para avaliar sinais e sintomas associados à EG e EGE, e é preenchido por cada indivíduo diariamente (aproximadamente à mesma hora toda noite) durante os períodos de triagem, tratamento e acompanhamento. Os indivíduos classificam a sua qualidade de vida usando o questionário SF-36 Health Survey na visita de triagem, pré-dose nos Dias 1,29, 57 e 85 da infusão e nos Dias 113 e 141 do acompanhamento (ou Encerramento Antecipado).

[00321] Os critérios de inclusão incluem:

(a) idade (> 80 e < 18 anos de idade);

(b) diagnóstico prévio de EG ou EGE;

(c) antes da endoscopia, uma pontuação semanal média de > 3 (em uma escala de 0-10) registrada para dor abdominal, diarréia

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157/169 e/ou náuseas no questionário PRO durante pelo menos 2 das 3 semanas de coleta do PRO (ao menos quatro questionários devem ser concluídos a cada semana);

(d) eosinofilia das mucosas gástricas > 30 eosinófilos/campo de alta potência (HPF) em 5 HPFs da EGD realizados durante o período de triagem, sem qualquer outra causa para a eosinofilia gástrica (por exemplo, parasitária ou outra infecção ou malignidade);

(e) ter falhado ou não adequadamente controlado em tratamentos padrão de cuidados para EG (o que pode incluir PPIs, corticosteroides tópicos ou sistêmicos e/ou dieta, entre outros);

(f) se em outros tratamentos para EG, EGE ou EoE na inscrição, dose estável por pelo menos 8 semanas antes da triagem e vontade de continuar nessa dose pela duração do estudo (apenas 4 semanas antes da triagem para um inibidor da bomba de prótons (IBP); e (g) teste de gravidez negativo (sexo feminino).

[00322] Os critérios de exclusão incluem:

(a) diagnóstico de doença celíaca ou infecção por H. pylori, conforme determinado pela EGD da triagem ou histórico de doença celíaca diagnosticada por EGD prévia;

(b) histórico de malignidade; exceto carcinoma in situ do colo uterino, câncer da próstata em fase precoce ou cânceres de pele não-melanoma (cânceres em remissão por mais de 5 anos e considerados curados podem ser inscritos, com exceção do câncer de mama);

(c) tratamento com quimioterapia ou radioterapia nos últimos 6 meses;

(d) tratamento para infecção parasitária helmíntica dentro de 6 meses da triagem e/ou um teste positivo para Parasita/Ova na

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158/169 triagem;

(e) uso durante os 30 dias antes da triagem (ou 5 meiasvidas, o que for mais longo) ou uso durante o período de triagem de quaisquer medicamentos que possam interferir com o estudo, como fármacos imunomoduladores ou imunossupressores (incluindo azatioprina, 6- mercaptopurina, metotrexato, ciclosporina, tacrolimo, anti-TNF, anti-IL-5, receptor anti-IL-5, dupilumabe, anticorpos anti-lgE, omalizumabe) ou corticosteroides sistêmicos com uma dose diária > 10 mg de prednisona ou equivalente;

(f) vacinação com vacinas atenuadas vivas no prazo de 30 dias antes do início do tratamento em estudo, durante o período de tratamento, ou vacinação esperada dentro de 5 meias-vidas (4 meses) da administração do fármaco em estudo; e (g) participação em um estudo de intervenção concomitante com a última intervenção ocorrendo dentro de 30 dias antes da administração do fármaco em estudo (ou 90 dias ou 5 meiasvidas, o que for mais longo, para produtos biológicos).

[00323] A principal medida do resultado é a mudança no número de eosinófilos por campo de alta potência (HPF) em biópsias gástricas antes e após o tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 em comparação ao tratamento com placebo.

[00324] Medidas secundárias do resultado incluem mudança nos parâmetros a seguir antes e após o tratamento com anticorpo antiSiglec-8 em comparação ao tratamento com placebo:

(a) mudanças nos sintomas da EG e EGE em um Questionário de resultados reportados pelo paciente (PRO) (os sintomas consultados incluem dor abdominal, náuseas, vômitos, diarréia, saciedade precoce, perda de apetite, inchaço e cólicas abdominais);

(b) mudança na qualidade de vida, medida pelas

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159/169 pontuações no questionário (SF)-36 Health Survey;

(c) alteração na contagem de eosinófilos no sangue;

(d) alteração do número de eosinófilos por HPF no esôfago e por biópsias duodenais em pacientes com concomitante EoE e/ou EGE, respectivamente;

(e) alteração na avaliação morfológica de biópsias gástricas e duodenais, antes e após o tratamento (usando a Escala Sydney Systems);

(f) mudança nos mastócitos (células positivas para triptase) por HPF em biópsias gástricas e/ou duodenais, respectivamente;

(g) alteração no peso corporal; e (h) Alteração na proporção de pacientes com remissão histológica, como definido por < 30 eosinófilos/HPF em 5 HPFs, em biópsias gástricas.

[00325] Os objetivos exploratórios incluem a seguinte comparação em pacientes tratados com o anticorpo anti-Siglec-8 em relação ao tratamento com placebo:

(1) avaliação morfológica de biópsias gástricas e duodenais antes e após o tratamento usando a Escala Sydney System;

(2) alteração nos mastócitos (por exemplo, células positivas para triptase) por HPF em biópsias gástricas e/ou duodenais;

(3) alteração no peso corporal; e (4) proporção de pacientes em remissão histológica, como definido por < 30 eosinófilos/HPF em 5 HPFs em biópsias gástricas. [00326] Os desfechos farmacodinâmicos (DP) incluem alteração do número basal de eosinófilos na mucosa esofágica e/ou duodenal em pacientes com EoE e/ou EGE concomitantes e contagem de eosinófilos no sangue (absoluta).

SEQUÊNCIAS

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Todas as sequências polipeptídicas são apresentadas do Nterminal para o C-terminal, salvo indicação em contrário.

Todas as sequências de ácidos nucleicos são apresentadas 5' a 3', a menos que indicado de outra forma.

Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada do 2E2 de camundongo

QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVRQPP GKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQTDD TALYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTSVTVSS (SEQ ID N^Q: 1) Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada do 2E2 RHA

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQA PGKGLEWVSVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRA EDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID N^Q: 2) Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada do 2E2 RHB

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTIYGAHWVRQA PGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKNTVYLQMNSLRA EDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID N^Q: 3) Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada do 2E2 RHC

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTIYGAHWVRQA PGKGLEWVSVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRA EDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID N^Q: 4) Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada do 2E2 RHD

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTIYGAHWVRQA PGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKNTVYLQMNSLRA EDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID N^Q: 5) Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada do

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2E2 RHE

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQA PGKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRA EDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID N^Q: 6) Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada do 2E2 RHF

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTIYGAHWVRQA PGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKNTVYLQMNSLRA EDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID N^Q: 7) Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada do 2E2 RHG

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQA PGKGLEWVSVIWAGGSTNYNSALMSRFSISKDNSKNTVYLQMNSLRA EDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID N^Q: 8) Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada do 2E2 RHA2

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISIYGAHWIRQPPG KGLEWIGVIWAGGSTNYNSALMSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADT AVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTLVTVSS (SEQ ID N^Q: 9) Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada do 2E2 RHB2

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTIYGAHWVRQPP GKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKNQVSLKLSSVTAA DTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTLVTVSS (SEQ ID N^Q: 10) Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada mutante do 2E2 RHE S-G

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAP GKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAE DTAVYYCARDGSSPYYYGMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID N°: 11) Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada do

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2E2 RHE E-D

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQA PGKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRA EDTAVYYCARDGSSPYYYSMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID N^Q: 12) Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada do 2E2 RHE Y-V

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQA PGKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRA EDTAVYYCARDGSSPYYYSMEVWGQGTTVTVSS (SEQ ID N^Q: 13) Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada mutante tripla do 2E2 RHE

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQA PGKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRA EDTAVYYCARDGSSPYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID N^Q: 14) Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve do 2E2 de camundonqo

QIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTS PKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRS SYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID N^Q: 15) Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve do 2E2 RKA

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQ APRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSS YPFTFGPGTKLDIK (SEQ ID N^Q: 16)

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Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve do 2E2 RKB

EIILTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQ APRLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQR SSYPFTFGPGTKLDIK (SEQ ID N^Q: 17)

Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve do 2E2 RKAC

EIILTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQ APRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSS YPFTFGPGTKLDIK (SEQ ID N^Q: 18)

Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve do 2E2 RKD

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQ APRLWIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRS SYPFTFGPGTKLDIK (SEQ ID N^Q: 19)

Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve do 2E2 RKE

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQ APRLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRS SYPFTFGPGTKLDIK (SEQ ID N^Q: 20)

Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve do 2E2 RKF

EIVETQSPATESESPGERATESCSATSSVSYMHWFQQKPGQ APREEIYSTSNEASGIPARFSGSGSGTDYTETISSEEPEDFAVYYCQQRS SYPFTFGPGTKEDIK (SEQ ID N^Q: 21)

Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve do 2E2 RKG

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWYQQKPGQ APRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSS YPFTFGPGTKLDIK (SEQ ID N^Q: 22)

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Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve mutante do 2E2 RKA F-Y

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQ APRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSS YPYTFGPGTKLDIK (SEQ ID N^Q: 23)

Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve mutante do 2E2 RKF F-Y

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQ APRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRS SYPYTFGPGTKLDIK (SEQ ID N^Q: 24)

Sequência de aminoácidos da cadeia pesada do HEKA e cadeia pesada do HEKF

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQA PGKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRA EDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID N^Q: 75) Sequência de aminoácidos de cadeia leve do HEKA

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQ APRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSS YPFTFGPGTKLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N^Q: 76)

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Sequência de aminoácidos da cadeia leve do HEKF

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQ APRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRS SYPFTFGPGTKLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N^Q: 77)

Sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada do lqG1

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PG (SEQ ID N^Q: 78)

Sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada do lqG4

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDK RVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID N°: 79)

Sequência de aminoácidos da região constante da cadeia leve kappa do lqG1

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N^Q: 80)

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Sequência de aminoácidos da cadeia pesada do IqG 1 2C4 e 2E2 de murino

QVQLKRASGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVRQ PPGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQ TDDTALYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLA PGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLE SDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCK PCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSW FVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRV NSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDF FPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWE AGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG (SEQ ID N^Q: 81)

Sequência de aminoácidos da cadeia leve Kappa do 2C4 de murino

EIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGT SPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQ QRSSYPFTFGSGTKLEIKADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNN FYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDE YERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID N^Q: 82) Sequência de aminoácidos da cadeia leve Kappa do 2E2 de murino

QIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTS PKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRS SYPFTFGSGTKLEIKADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKD INVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHN SYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID N^Q: 83)

Sequência de aminoácidos da cadeia pesada do lqG1 2C4 e 2E2 quimérico

QVQLKRASGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVRQP PGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQTD DTALYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY

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SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID N^Q: 84)

Sequência de aminoácidos da cadeia leve kappa do 2C4 quimérico

EIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGT SPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQ QRSSYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N^Q: 85) Sequência de aminoácidos da cadeia leve kappa do 2E2 quimérico

QIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTS PKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRS SYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N^Q: 86)

Sequência de aminoácidos da cadeia pesada do lqG4 HEKA (lqG4 contém uma mutação P228S)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQA PGKGLEWVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRA EDTAVYYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPC SRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID N^Q: 87)

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Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada 1C3 de camundongo (os resíduos sublinhado compreendem CDRs H1 e H2 de acordo com a numeração de Chothia)

EVOVVESGGDLVKSGGSLKLSCAASGFPFSSYAMSWVROT PDKRLEWVAIISSGGSYTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSE DTAMYYCARHETAQAAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID N^Q: 106) Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada 1H10 de camundongo (os resíduos sublinhados compreendem CDRs H1 e H2 de acordo com a numeração de Chothia)

EVOLOOSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDYYMYWVKO RPEQGLEWIGRIAPEDGDTEYAPKFQGKATVTADTSSNTAYLHLSSLT SEDTAVYYCTTEGNYYGSSILDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID N^Q: 107) Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada 4F11 de camundongo (os resíduos sublinhado compreendem CDRs H1 e H2 de acordo com a numeração de Chothia)

QVQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYAFRSSWMNWVK QRPGKGLEWIGQIYPGDDYTNYNGKFKGKVTLTADRSSSTAYMQLS SLTSEDSAVYFCARLGPYGPFADWGQGTLVTVSA (SEQ ID N^Q: 108) Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve do 1C3 de camundongo

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKS GTSPKRWIYDTSKLAYGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYY CQQWSSNPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID N^Q: 109)

Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve do 1H10 de camundongo

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDITNYLNWYQQKP DGTVKLLIYFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC QQGNTLPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID N^Q: 110)

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Sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve do 4F11 de camundongo

QIVLTQSPAIVSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQRP GSSPRLLIYDTSSLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRIESEDAANYYC QQWNSDPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID N^Q: 111).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 a 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: uma região variável da cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 88, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 91, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 94; e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 97, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 100, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 103;

uma região variável da cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 89, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 92, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 95; e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 98, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 101, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 104; ou uma região variável da cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 90, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 93, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 96; e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 99, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 102, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 105.

(1) uma LC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 48;

(1) uma HC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 26;

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(1) uma LC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^QS: 48-49;

(1) uma HC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^QS: 26-29;

1. Método de tratamento ou prevenção de doença inflamatória intestinal (IBD) em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo que se liga ao Siglec-8 humano.

(2) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 64;

(2) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 61;

(2) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 64;

(2) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 61;

2/16 neutrófilos, eosinófilos, e/ou linfócitos em pelo menos uma parte do trato gastrointestinal, em comparação a um indivíduo sem IBD.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem colite ulcerativa, colite colagenosa, colite linfocítica, Doença de Crohn ou IBD colônica não classificada (IBD-U).

(3) uma LC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 51;

(3) uma HC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 34;

(3) uma LC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 51;

(3) uma HC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 34;

(3) uma LC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^QS: 51-53;

(3) uma HC-FR2 compreendendo a sequência de

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3/16 de uma composição compreendendo um anticorpo que se liga ao Siglec-8 humano.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem colite ulcerativa moderada a grave.

(4) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 65;

(4) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 62;

(4) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 65;

(4) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 62;

(4) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 65;

(4) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 62;

4/16 potência (HPF) em dois ou mais HPFs.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem propagação da doença colônica entre cerca de 5 cm e cerca de 40 cm.

(5) uma LC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 58;

(5) uma HC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 38;

(5) uma LC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 55;

(5) uma HC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 38;

(5) uma LC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^QS: 55-58;

(5) uma HC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^QS: 38-43;

5/16 antes da administração da composição.

5. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem colite ulcerativa aguda.

6) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 66; e (7) uma LC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 60.

(6) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 63; e (7) uma HC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 45; e/ou (b) uma região variável da cadeia leve compreendendo:

(6) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 66; e (7) uma LC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 60.

(6) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 63; e (7) uma HC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^QS: 45-46, e/ou (b) uma região variável da cadeia leve compreendendo:

6/16 glicosídeo do anticorpo na composição contêm um resíduo de fucose.

6. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem doença de Crohn ileal, doença de Crohn colônica ou doença de Crohn ileocolônica.

7/16

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que, antes da administração da composição, o indivíduo obteve insucesso em uma terapia de primeira linha para colite ulcerativa ou doença de Crohn.

8/16 aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^QS: 31-36;

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem inflamação aumentada em pelo menos uma parte do trato gastrointestinal, em comparação a um indivíduo sem IBD.

9/16 (2) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 61;

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem um aumento do número de mastócitos,

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10/16 (1) uma HC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 26;

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 9, caracterizado pelo fato de que uma biópsia do cólon do indivíduo mostra aumento da permeabilidade da mucosa, em comparação a uma biópsia obtida do cólon de um indivíduo sem IBD.

11/16

11 a 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 6 e/ou a região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 16 ou 21.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que uma amostra de urina obtida do indivíduo tem níveis aumentados de um ou mais dentre: N-metilhistamina, leucotrienos e prostaglandinas, em comparação a uma amostra de urina obtida de um indivíduo sem IBD.

12/16 uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q:106, e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q:109;

uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q:107; e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q:110; ou uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q:108; e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q:111.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que uma amostra de sangue obtida do indivíduo tem níveis aumentados de um ou mais dentre: IL-6, IL-8, TNFa, VEGF, PDGF e MCP-1, em comparação a uma amostra de sangue obtida de um indivíduo sem IBD.

13/16 no Domínio 2 ou Domínio 3 do Siglec-8 humano.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que um ou mais sintomas no indivíduo com IBD são reduzidos em comparação a um nível basal antes da administração da composição.

14/16 do sangue e inibe a ativação dos mastócitos.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que um ou mais dentre diarréia, inchaço, náusea, dor abdominal, sangue nas fezes, frequência de fezes líquidas, abscessos abdominais ou pélvicos, fistulas, perda de peso, fadiga, febre, suores noturnos e retardo de crescimento no indivíduo são reduzidos em comparação ao nível basal antes administração da composição.

15/16

N^Q: 75; e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 76 ou 77.

15. Método de tratamento ou prevenção de um distúrbio gastrointestinal eosinofílico (EGID) em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz

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16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem esofagite eosinofílica (EOE).

17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem gastrite eosinofílica (EG).

18. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem gastroenterite eosinofílica (EGE).

19. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem EGE e EG.

20. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem colite eosinofílica (EC).

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem eosinofilia no sangue periférico.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 21, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem um aumento do número de mastócitos, neutrófilos, eosinófilos, e/ou linfócitos em pelo menos uma parte do trato gastrointestinal, em comparação a um indivíduo sem EGID.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 21, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem infiltração eosinofílica aumentada em pelo menos uma parte do trato gastrointestinal, em comparação a um indivíduo sem EGID.

24. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que uma amostra obtida do trato gastrointestinal do indivíduo tem 15 ou mais eosinófilos por campo de alta potência (HPF).

25. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que uma amostra obtida do trato gastrointestinal do indivíduo tem uma média de 15 ou mais eosinófilos por campo de alta

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26. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que uma amostra obtida do trato gastrointestinal do indivíduo tem um pico da contagem de eosinófilos de 50 ou mais eosinófilos por campo de alta potência (HPF) em dois ou mais HPFs.

27. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que uma amostra obtida do trato gastrointestinal do indivíduo tem pelo menos cinco campos de alta potência (HPFs) que têm, cada um, uma contagem de eosinófilos de 30 ou mais eosinófilos por HPF.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 27, caracterizado pelo fato de que a amostra é de uma biópsia gástrica.

29. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que pelo menos cinco amostras obtidas do trato gastrointestinal do indivíduo têm uma contagem de eosinófilos de 30 ou mais eosinófilos por campo de alta potência (HPF).

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que as pelo menos cinco amostras são de biópsias gástricas.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 30, caracterizado pelo fato de que uma amostra do sangue periférico obtida do indivíduo tem 200 ou mais eosinófilos por μΙ_.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 31, caracterizado pelo fato de que uma amostra do sangue periférico obtida do indivíduo tem expressão aumentada de CCL2, em comparação a um valor de referência.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 32, caracterizado pelo fato de que um ou mais sintomas no indivíduo com EGDI são reduzidos em comparação a um nível basal

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34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 32, caracterizado pelo fato de que um ou mais dentre dor abdominal, disfagia, impactação alimentar, vômito, azia, náusea, falha no crescimento, problemas de alimentação, dispepsia, perda de peso, diarréia, obstrução gastrointestinal, sangramento gastrointestinal, ascite, má absorção, anemia, enteropatia com perda de proteína, espessamento colônico e obstrução colônica no indivíduo são reduzidos em comparação ao nível basal antes da administração da composição.

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 32, caracterizado pelo fato de que o número de eosinófilos por campo de alta potência (HPF) em uma amostra obtida do trato gastrointestinal do indivíduo é reduzido em comparação a um nível basal antes da administração da composição.

36. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que a amostra é de uma biópsia gástrica.

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 32, caracterizado pelo fato de que a expressão de CCL2é reduzida em comparação a um nível basal anterior à administração da composição.

38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada por infusão intravenosa.

39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada por injeção subcutânea.

40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região Fc e cadeias de carboidrato ligado a N-glicosídeo ligadas à região Fc, em que menos de 50% das cadeias de carboidrato ligado a N

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41. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que substancialmente nenhuma das cadeias de carboidrato ligado a N-glicosídeo do anticorpo na composição contém um resíduo de fucose.

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 63; e/ou em que a região variável da cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 64, (ii) a HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 66.

43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^QS: 67-70; e/ou em que a região variável da cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 71.

44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

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45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^QS: 11-14; e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^QS: 23-24.

46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^QS: 2-14; e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^QS: 16-24.

47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^QS: 2-10; e/ou uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID N^QS: 16-22.

48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende:

(a) região variável da cadeia pesada compreendendo:

49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende:

(a) região variável da cadeia pesada compreendendo:

50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende:

(a) região variável da cadeia pesada compreendendo:

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51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

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52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende:

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53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um Siglec-8 humano e a um Siglec-8 não humano de primata.

54. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o primata não humano é um babuíno.

55. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo no Domínio 1 do Siglec8 humano, em que o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 112.

56. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo no Domínio 3 do Siglec8 humano, em que o Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 114.

57. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga ao mesmo epítopo como anticorpo 4F11.

58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo

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59. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o Domínio 2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 113.

60. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga ao mesmo epítopo como anticorpo 1C3.

61. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 114.

62. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga ao mesmo epítopo como anticorpo 1H10.

63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo no Domínio 1 do Siglec-8 humano e compete com o anticorpo 4F11 pela ligação ao Siglec-8.

64. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não compete com anticorpo 2E2 pela ligação ao Siglec-8.

65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não é o anticorpo 2E2.

66. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N^Q: 112.

67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 66, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico.

68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 67, caracterizado pelo fato de que o anticorpo esgota os eosinófilos

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69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 68, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região Fc da cadeia pesada que compreende uma região Fc do IgG humano.

70. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que a região Fc do IgG humano compreende uma região Fc do lgG1 humano.

71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a região Fc do IgG 1 humano é não fucosilada.

72. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que a região Fc do IgG humano compreende uma região Fc do lgG4 humano.

73. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que a região Fc do lgG4 humano compreende a substituição de aminoácido S228P, em que os resíduos de aminoácidos são numerados de acordo com o índice europeu (EU) como em Kabat.

74. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 66, caracterizado pelo fato de que o anticorpo foi engenheirado para melhorar a atividade da citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC).

75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos na região Fc que melhora a atividade de ADCC.

76. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 68, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo é não fucosilada.

77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID

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78. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 77, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

79. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e 38 a 78, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais para tratamento ou prevenção da IBD.

80. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais para tratamento ou prevenção da IBD são selecionados dentre o grupo que consiste em sulfassalazina, azatioprina, mercaptopurina, ciclosporina, um corticosteroide, infliximabe, adalimumabe, etrolizumabe, golimumabe, metotrexato, natalizumabe, vedolizumabe, ustekinumabe, certolizumabe pegol e um antibiótico.

81. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e 38 a 80, caracterizado pelo fato de que, antes da administração da composição, o indivíduo foi submetido a uma cirurgia para tratamento da IBD.

82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 78, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais para tratamento ou prevenção do EGID.

83. Método, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais para tratamento ou prevenção do EGID são selecionados dentre o grupo que consiste em um corticosteroide, inibidor de leucotrienos, anti-histamina, cromoglicato de sódio, inibidor de bomba de prótons (PPI) e sulfassalazina.

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84. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 83, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.

85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 84, caracterizado pelo fato de que a composição é uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo e um veículo farmaceuticamente aceitável.

86. Artigo de fabricação, caracterizado pelo fato de que compreende um medicamento compreendendo uma composição compreendendo um anticorpo que se liga ao Siglec-8 humano e um folheto compreendendo instruções para administração do medicamento a um indivíduo em sua necessidade, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 85.