BR112019020373A2 - micropartículas revestidas com minerais para liberação sustentada de moléculas biologicamente ativas - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se às formulações para proporcionar um agente ativo. formulações incluem um veículo, incluindo, um agente ativo e micropartículas revestidas com minerais, em que um agente ativo é adsorvido ao mineral. outras formulações incluem um veículo, incluindo, micropartículas revestidas com minerais em que as micropartículas revestidas com minerais incluem um agente ativo. também são descritos métodos para transferência (liberação) sustentada de um agente ativo e métodos para tratamento de doenças inflamatórias utilizando uma formulação para proporcionar liberação sustentada de um agente ativo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MICROPARTÍCULAS REVESTIDAS COM MINERAIS PARA LIBERAÇÃO SUSTENTADA DE MOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS.

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica prioridade a Pedido Provisório dos Estados Unidos No. 62/480.710, depositado em 03 de abril de 2017, cuja descrição é incorporada neste relatório como referência em sua totalidade.

DECLARAÇÃO EM RELAÇÃO À PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADO FEDERALMENTE [002] Esta invenção foi realizada com suporte governamental sob HL093282 atribuída pelo Instituto Nacional de Saúde (National Institutes of Health). O governo tem certos direitos na invenção.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO [003] A presente invenção refere-se às formulações para proporcionar um agente ativo. Formulações incluem um veículo, incluindo, um agente ativo e micropartículas revestidas com minerais, em que um agente ativo é adsorvido ao revestimento mineral. Também descritos são métodos para liberação sustentada de um agente ativo e métodos para tratamento de doenças inflamatórias utilizando uma formulação para proporcionar liberação sustentada de um agente ativo. [004] Estratégias de transferência (liberação) de agentes ativos incluem transferência localizada e estratégias de liberação sustentada. Na transferência localizada, o agente ativo é apenas ativo no sítio de interesse e limita o efeito em regiões fora do sítio de interesse. Encapsulação em um sistema de veículo (géis, suportes (scaffolds), micropartículas), por exemplo, é utilizada para transferência localizada, onde o agente age localmente, mas limita a quantidade do agente que entra em circulação. Transferência de sistemas de liberação sustentada

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2/63 utiliza várias plataformas para manter faixas de concentrações terapêuticas, sistêmica ou localmente, liberando controladamente o agente ao longo do tempo. Estratégias para liberação sustentada que foram exploradas anteriormente podem resultar em um agente ativo que apresenta menos atividade, o que requer doses maiores para proporcionar um efeito terapêutico.

[005] Osteoartrite (OA) e artrite reumatoide (AR) são problemas clínicos significativos. Artrite é a principal causa de incapacidade nos Estados Unidos, afetando mais de 50 milhões de pessoas. Embora os custos de OA sejam consideráveis, a qualidade de vida do paciente permanece ruim. Nos Estados Unidos, AR apresenta uma prevalência de 1-2%, com custos médicos anuais de US $ 60.000 a US $ 120.000 por paciente nos Estados Unidos. Ambos são crônicos e progressivos e envolvem processos inflamatórios, mas uma diferença entre as duas condições é que se pensa que OA é localizada enquanto a AR é considerada uma doença sistêmica. Osteoartrite (OA) frequentemente leva à substituição da articulação, enquanto 1/3 dos pacientes com AR tornam-se gravemente incapacitados. Artrite degrada a cartilagem articular, o tecido que protege os ossos nas articulações diartrodiais a partir de forças concentradas de suporte de carga e da fricção induzida por movimento. Cartilagem articular possui capacidades limitadas de regeneração. Uma vez danificada, um loop de retroalimentação (feedback) positivo libera proteases da matriz que produzem produtos moleculares para impulsionar a patogênese crônica. Sinalização endógena é intensificada via indução de sinais inflamatórios na sinóvia, incluindo, fator de necrose tumoral oc (TNF-oc), interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6) e interferon-oc (IFN-oc).

[006] Atualmente, existem poucas terapêuticas disponíveis para tratar a OA, além de anti-inflamatórios não esteroides. Antes de substituição articular, vários procedimentos cirúrgicos podem ser

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3/63 usados para promover reparo da cartilagem. Esses proporcionam alívio temporário, mas resultam em tecidos de reparo mal organizado, mecanicamente inferiores e se rompem com o tempo. Para AR, metotrexato é comumente utilizado, mas 50% dos pacientes falham nesse tratamento. Inibidores de TNF são então prescritos. Estes são onerosos e ainda falham em muitos pacientes. Para ambos os pacientes com OA e AR, inibidores de IL-1 mostraram grande promessa e podem preencher uma importante lacuna no tratamento. Entretanto, manter concentrações terapêuticas in vivo através de liberação sustentada é um problema formidável que pode limitar seu uso clínico. A transferência de genes é uma nova estratégia para níveis sustentados de um inibidor de IL-1. Esse conceito, embora cientificamente apelativo, requer coleta de células sinoviais autólogas, transfectando-as viralmente para superexpressar IL-Ra e reimplantá-las na articulação sinovial do paciente, o que aumenta preocupações em relação à viabilidade e segurança clínica.

[007] lnterleucina-1 (IL-1) é um importante mediador de inflamação em muitas situações inflamatórias, incluindo, condições inflamatórias crônicas (tais como artrite reumatoide, osteoartrite e diabetes mellitus tipo 2), doenças neuropatológicas (tais como acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer), doença de Parkinson e epilepsia) e mais situações inflamatórias locais (tais como cicatrização de ferimento cutâneo e de ligamento). Quando interleucina-1 interage com seus receptores, cascatas de sinalização pró-inflamatória são iniciadas em vários tipos de células, incluindo, linfócitos, células endoteliais, macrófagos, fibroblastos e condrócitos. Antagonista do receptor de interleucina-1 (IL-Ra) é um antagonista que ocorre naturalmente de inflamação induzida por interleucina-1 pró-inflamatória (IL-1) que se liga ao receptor da IL-1, mas não inicia uma cascata inflamatória. Uma forma recombinante de IL-Ra é clinicamente aprovada para tratamento de

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4/63 artrite reumatoide. Utilizou-se também fora de indicação (off-label) em relação às outras indicações clínicas. IL-Ra possui propriedades únicas e desejáveis que a tornam um candidato ideal para controlar a inflamação, incluindo, sua alta afinidade de ligação e especificidade alvo com o receptor de IL-1, sua baixa toxicidade e seu baixo peso molecular (17kD) quando comparado com outras proteínas terapêuticas potenciais. Investigou-se como uma possível estratégia de tratamento para muitas das situações inflamatórias associadas à expressão de IL1.

[008] A meia-vida curta in vivo (4-6 horas) e altas doses (1 mg/kg) de IL-Ra necessárias para inibir atividade de IL-1 são desafios que limitaram a eficácia de tratamento com IL-Ra para muitas condições e criaram regimes de tratamento onerosos, tais como injeções subcutâneas diárias de altas doses (100 mg). Estratégias de transferência foram desenvolvidas anteriormente para prolongar a meiavida de IL-Ra, incluindo, fusão de IL-Ra com diferentes parceiros de proteínas e peptídeos. A fusão de IL-Ra com parceiros de proteínas e peptídeos prolonga sua meia-vida in vivo, impedindo degradação enzimática e filtração renal. Enquanto fusão com outros parceiros peptídicos melhorou a meia-vida de IL-Ra, até 20x mais, a atividade de algumas fusões é de 100-500 vezes inferior a IL-Ra. Pesquisadores também fundiram IL-Ra com polietilenoglicol (PEG) com PEGuilato de IL-Ra e prolongaram sua meia-vida. Após PEGuilação, o IL-Ra-PEG exibiu atividade de ligação significativamente reduzida com o receptor de IL-1. Embora alterações na estrutura de IL-Ra tenham conseguido melhorar a meia-vida de IL-Ra, a alteração de estrutura da IL-Ra e a interferência com ligação do receptor de IL-1 podem limitar seu uso em clínica. Além da fusão de IL-Ra com outras moléculas, os pesquisadores também tentaram transferir IL-Ra de maneira sustentada e localizada, encapsulando IL-Ra em microesferas de ácido poli(láctico-co-glicólico).

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Quando microesferas de PLGA foram administradas por meio de injeção subcutânea em camundongos BALB/c, níveis séricos de IL-Ra permanecem elevados por 8 dias, um aumento significativo quando comparado com injeção subcutânea em bolus de IL-Ra na qual nenhum IL-Ra foi detectável após 24 horas. Contudo, no mesmo estudo, demonstrou-se também que a atividade biológica de IL-Ra foi bastante prejudicada durante o processo de encapsulação e estimou-se que apenas 6% de IL-Ra aprisionada permaneceu biologicamente ativa. Encapsulação em microesferas de polímeros é frequentemente prejudicial à atividade biológica da proteína, devido aos ambientes de processamento adversos, ao uso de solventes necessários para encapsulação e agregação de proteínas causada por denso empacotamento de proteínas.

[009] As estratégias para prolongar o benefício de agentes ativos apresentando meias-vidas curtas resultaram em atividade reduzida e/ou exigiram doses mais altas. Consequentemente, existe a necessidade de sistemas de transferência alternativos que podem proporcionar liberação sustentada e/ou liberação local de moléculas biologicamente ativas.

BREVE DESCRIÇÃO [010] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma formulação para proporcionar um agente ativo. A formulação inclui um veículo em que o veículo compreende pelo menos um primeiro agente ativo; e uma micropartícula revestida com mineral compreendendo um revestimento de mineral; e pelo menos um segundo agente ativo. Em uma modalidade, o segundo agente ativo é absorvido ao mineral. Em uma modalidade, o segundo agente ativo é incorporado no mineral. Em uma modalidade, o segundo agente ativo é tanto absorvido ao mineral quanto incorporado no mineral.

[011] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma

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6/63 formulação para proporcionar um agente ativo. A formulação inclui um veículo em que o veículo compreende uma micropartícula revestida com mineral compreendendo um agente ativo absorvido ao mineral.

[012] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma formulação para liberar sustentável mente um agente ativo. A formulação inclui uma solução com um primeiro agente ativo; e uma micropartícula revestida com mineral adicionada à solução com o primeiro agente ativo. Em uma modalidade, o agente ativo absorve a micropartícula revestida com mineral sob adição na solução contendo o primeiro agente ativo. Em outra modalidade, um segundo agente ativo é incorporado na micropartícula revestida com mineral antes de ser adicionada à solução do primeiro agente ativo.

[013] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma micropartícula revestida com mineral compreendendo um agente ativo. Em uma modalidade, o segundo agente ativo é absorvido ao mineral. Em uma modalidade, o segundo agente ativo é incorporado no mineral. Em uma modalidade, o segundo agente ativo é tanto absorvido ao mineral quanto incorporado no mineral.

[014] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma micropartícula revestida com mineral, a micropartícula revestida com mineral compreendendo um revestimento mineral em camadas e pelo menos um agente ativo adsorvido em pelo menos uma camada do revestimento mineral.

[015] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para liberação imediata e sustentada de um agente ativo. O método inclui proporcionar uma formulação a um indivíduo com necessidade do mesmo, a formulação, incluindo, um veículo em que o veículo compreende pelo menos um primeiro agente ativo; e uma micropartícula revestida com mineral compreendendo um revestimento mineral; e pelo menos um segundo agente ativo. Em uma modalidade, o segundo

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7/63 agente ativo é adsorvido ao mineral. Em uma modalidade, o segundo agente ativo é incorporado no mineral. Em uma modalidade, o segundo agente ativo é tanto adsorvido ao mineral quanto incorporado no mineral.

[016] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para tratamento de uma doença inflamatória em um indivíduo com necessidade do mesmo. O método inclui administrar uma formulação ao indivíduo, em que a formulação compreende um veículo, em que o veículo compreende pelo menos um primeiro agente ativo, e uma micropartícula revestida com mineral compreendendo um revestimento de mineral; e pelo menos um segundo agente ativo. Em uma modalidade, o segundo agente ativo é adsorvido ao mineral. Em uma modalidade, o segundo agente ativo é incorporado no mineral. Em uma modalidade, o segundo agente ativo é tanto adsorvido ao mineral quanto incorporado no mineral.

[017] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para tratamento de inflamação pós-cirurgia em um indivíduo com necessidade do mesmo. O método inclui administrar uma formulação ao indivíduo, em que a formulação inclui um veículo que inclui um agente ativo e uma micropartícula revestida com mineral, em que a micropartícula revestida com mineral compreende um agente ativo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [018] FIGURA 1A é um SEM de baixa ampliação, mostrando uma morfologia semelhante à placa de micropartículas revestidas com minerais formadas em fluido corporal simulado modificado por carbonato de (FCSm) de 4,2 mM (baixo). FIGURA 1B é um SEM de alta ampliação mostrando uma morfologia semelhante à placa de micropartículas revestidas com minerais formadas em FCSm por carbonato de 4,2 mM (baixo). FIGURA 1C é um SEM de baixa

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8/63 ampliação mostrando uma morfologia semelhante à esferulita de micropartículas revestidas com minerais formadas em FCSm por carbonato 25 mM (médio). FIGURA 1D é um SEM de alta ampliação, mostrando uma morfologia semelhante à esferulita de micropartículas revestidas com minerais formadas em FCSm por carbonato 25 mM (médio). FIGURA 1E é um SEM de baixa ampliação mostrando uma morfologia semelhante à esferulita de micropartículas revestidas com minerais formadas em FCSm por carbonato de 100 mM (alto). FIGURA 1F é um SEM de alta ampliação mostrando uma morfologia semelhante à esferulita de micropartículas revestidas com minerais formadas em FCSm por carbonato de 100 mM (alto). FIGURA 1G é um gráfico que representa a liberação de cálcio por micropartículas revestidas com minerais formadas com baixo FCSm de HCOs' (·), médio FCSm de HCO3· (A) e alto mFCS de HCO3· (▼). FIGURA 1H é um gráfico que representa a ligação de BMP-2 com micropartículas revestidas com minerais formadas com baixo FCSm de HCOs', médio FCSm de HCOs' e alto FCSm de HCOs'. FIGURA 11 é um gráfico que representa a liberação de BMP-2 a partir de micropartículas revestidas com minerais formadas com baixo FCSm de HCOs' (), médio FCSm de HCOs' (·) e alto FCSm de HCO₃ (A).

[019] FIGURA 2A é um gráfico que representa a ligação de IL-Ra a diferentes formulações de micropartículas revestidas com minerais (por exemplo, micropartículas com alto teor de carbonato e baixo carbonato) e diferentes concentrações de agente ativo na solução de incubação.

[020] FIGURA 2B é um gráfico que representa a eficiência de ligação de IL-Ra por micropartículas de alto teor de carbonato e baixo carbonato e diferentes concentrações de agente ativo na solução de incubação.

[021] FIGURA 3 é um gráfico que representa a liberação

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9/63 sustentada de IL-Ra por micropartículas revestidas com minerais durante 7 dias.

[022] FIGURA 4A é um gráfico que representa IL-Ra liberado a partir de micropartículas revestidas com minerais foi ativo e inibiu produção de IL-6 em macrófagos estimulados com IL-1. A concentração média de IL-6 produzida por macrófagos incubados com micropartículas revestidas com minerais de 4,2 mM contendo IL-Ra, micropartículas revestidas com minerais de 100 mM contendo IL-Ra, IL-Ra solúvel, micropartículas não carregadas, e nenhum IL-Ra 12 horas após estimulação com IL-1 é representada.

[023] FIGURA 4B é um gráfico que representa IL-Ra liberado a partir de micropartículas revestidas com minerais foi ativo e inibiu produção de IL-6 em macrófagos estimulados com IL-1. A concentração média de IL-6 produzida por macrófagos incubados com micropartículas revestidas com macrófagos de 4,2 mM contendo IL-Ra, micropartículas revestidas com minerais de 100 mM contendo IL-Ra, IL-Ra solúvel, micropartículas não carregadas, e nenhum IL-Ra 24 horas após estimulação com IL-1 é representada.

[024] FIGURA 5 é um gráfico que representa a inibição de IL-1 induziu produção de IL-6 in vivo quando camundongos receberam uma única injeção subcutânea de PBS, micropartículas não carregadas, ILRa solúvel, ou micropartículas de IL-Ra (MPs incubadas em IL-Ra solúvel).

[025] FIGURA 6 é um gráfico que representa a atividade biológica de IL-Ra liberado a partir de micropartículas para reduzir proliferação induzida por IL-1 de linfócitos T de camundongos.

[026] FIGURA 7 é um diagrama temporal que representa cicatrização de MCL em ratos que consiste de 3 fases de sobreposições: a fase inflamatória, a fase proliferativa e a fase remodeladora. A fase inflamatória, durante a qual células inflamatórias

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10/63 infiltram o ligamento e níveis de IL-1 são elevados, períodos do dia de lesão para 5 dias pós-lesão.

[027] FIGURA 8A são imagens de ressonância magnética (IRM) mostrando diferentes concentrações de micropartículas revestidas com minerais marcadas com SPIO injetadas intramuscularmente utilizando IRM ponderada com T2 demonstrou área hipointensiva reduzida com redução de concentração de micropartículas.

[028] FIGURA 8B são imagens de ressonância magnética (IRM) mostrando micropartículas revestidas com minerais marcadas com SPIO na cura de MCL em ratos quando injetados após lesão.

[029] FIGURA 80 são imagens de ressonância magnética (IRM) mostrando que micropartículas revestidas com minerais permaneceram localizadas no MCL por pelo menos 15 dias após injeção.

[030] FIGURA 9A é um gráfico que representa indução de macrófagos M1 por micropartículas revestidas com minerais no tecido de granulação 7 dias após lesão sem induzir inflamação crônica 14 dias após lesão.

[031] FIGURA 9B é um micrógrafo de luz mostrando que micropartículas revestidas com minerais (MCMs) permaneceram localizadas no MCL por 7 dias pós-injeção conforme indicado por coloração vermelha de alizarina de cálcio, mas não impactou estrutura de ligamento ou causou edema adicional.

[032] FIGURA 9C é um micrógrafo de luz mostrando que micropartículas revestidas com minerais não mais presentes no MCL 21 dias pós-injeção e mostrando nenhum impacto na morfologia de ligamento ou calcificação do tecido.

[033] FIGURAS 10A-10D mostram que a massa de IL-Ra ligado a micropartículas (MPs) pode ser adaptada e as MPs liberam IL-Ra de maneira sustentada. FIGURA 10A é um esquema de fabricação de ILRa que envolve a adição de micropartículas a uma solução contendo IL

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Ra e incubação subsequente por 1 hora. FIGURA 10B representa que a massa de IL-Ra ligada por mg de micropartículas diminuiu quando incubada em concentrações decrescentes de IL-Ra durante carregamento. FIGURA 10C representa que a eficiência de ligação de IL-Ra com micropartículas (MPs) aumentou com concentrações decrescentes de IL-Ra durante carregamento. FIGURA 10D mostra que liberação cumulativa de IL-Ra de MPs no fluido corporal simulado durante 14 dias mostrou liberação sustentada por pelo menos 14 dias. Os dados representam média ± erro padrão.

[034] FIGURAS 11A-11E representam que IL-Ra liberado de MPs é biologicamente ativo in vitro. FIGURA 11A mostra que concentração celular foi elevada após linfócitos T de camundongo D10.G4.1 serem tratados com IL-1, e as MPs não carregadas não impactaram o aumento induzido por IL-1 na concentração celular. FIGURA 11B mostra que as MPs de IL-Ra reduziram significativamente a concentração celular após estimulação por IL-1 de linfócitos T de camundongo D10.G4.1 quando comparadas com células tratadas com IL-Ra ou PBS solúveis. FIGURA 11C representa que a concentração de IL-Ra no meio de cultura de linfócitos T de camundongo D10.G4.1 foi significativamente maior em meios tratados com IL-Ra solúvel quando comparado com MPs de ILRa e foi indetectável em meios tratados com PBS. FIGURA 11D é um esquema de cultura de THP-1 com MPs não carregadas ou MPs de ILRa em um sistema de cultura celular transwell. IL-1 foi adicionado ao meio de cultura 6 horas após tratamento. FIGURA 11E representa que tratamento com MPs de IL-Ra reduziu significativamente a concentração média de IL-6 em 18 e 30 horas após tratamento em culturas de células THP-1 estimuladas por IL-1, quando comparada com MPs não carregadas. Os dados representam média ± desvio padrão. Letras diferentes representam diferenças significativas entre os grupos (ANOVA, p <0,05), *representa diferença significativa entre os

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12/63 tratamentos comparados (Teste T de Student, p <0,05).

[035] FIGURAS 12A-12C representam que as MPs de IL-Ra aumentaram concentração sérica de IL-Ra por 14 dias e inibiram atividade in vivo de IL-1. FIGURA 12A é um esquema de tratamentos in vivo de IL-Ra MP, que envolve a adição de micropartículas a uma solução de IL-Ra que é então injetada. FIGURA 12B representa que a concentração de IL-Ra no soro coletado 1, 3, 5, 7 e 14 dias após tratamento permaneceu elevada por 14 dias. FIGURA 12C mostra que IL-6 no soro normalizou à concentração sérica de IL-6 em animais tratados com PBS coletado 2 horas após estimulação com IL-1. Valores inferiores a 1 representam uma diminuição na IL-6 sérica induzida por IL-1. Letras diferentes representam diferenças significativas entre os grupos p <0,05); * representa uma diferença significativa (p <0,05) entre tratamento e controle de PBS. N.D. representa não detectável.

[036] FIGURAS 13A-13E representam que MPs de IL-Ra em camadas ligaram mais IL-Ra, liberaram IL-Ra sob uma taxa mais lenta com uma liberação de explosão mais baixa e inibiram atividade in vivo de IL-1 por um período prolongado. FIGURA 13A é um esquema de fabricação de MP de IL-Ra em camadas. FIGURA 13B mostra que MPs de IL-Ra em camadas ligaram mais IL-Ra por mg de MP do que MPs de IL-Ra. FIGURA 13C mostra que MPs de IL-Ra em camadas liberaram uma porcentagem menor da IL-Ra carregada após 1 dia, em comparação com as MPs de IL-Ra e liberam IL-Ra de maneira sustentada por pelo menos 14 dias. FIGURA 13D mostra que as MPs de IL-Ra em camadas elevaram IL-Ra sérico para níveis acima detectáveis por 10 dias. FIGURA 13E mostra que MPs de IL-Ra em camadas reduziram concentração sérica de IL-6 em comparação com o controle de PBS após estimulação com IL-1 por pelo menos 14 dias.

[037] FIGURAS 14A-14C representam a formação de revestimento de micropartículas e carregamento de IL-Ra. FIGURA 14A

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13/63 mostra SEM de materiais do núcleo B-TCP não revestidos em ampliação mais baixa (superior) e mais alta (inferior). FIGURA 14B mostra SEM de micropartículas após 7 dias de revestimento em mFCS em ampliação mais baixa (superior) e mais alta (inferior). FIGURA 14C é um esquema de formação de revestimento de micropartículas e carregamento de IL-Ra.

[038] FIGURAS 15A-15C representam transferência local de IL-Ra por micropartículas. FIGURA 15A representa concentração tecidual de IL-Ra em MCLs homogeneizados. FIGURA 15B representa concentração sérica de IL-Ra. FIGURA 15C representa coloração vermelha de alizarina de MPs no MCL, 7 e 14 dias após tratamento. Os gráficos representam média ± erro padrão, * representa p <0,05 entre IL-Ra solúvel e MP de IL-Ra, ** representa p <0,05 entre MP de IL-Ra MP em 7 dias e MP de IL-Ra em 14 dias, N.D. representa não detectável.

[039] FIGURAS 16A-16C representam atividade anti-inflamatória de MPs de IL-Ra. FIGURA 16A representa concentração de macrófagos M1 no tecido de granulação de MCLs de 7 dias (barras mais escuras) e de 14 dias (barras claras) após lesão. O gráfico representa média ± erro padrão, * representa p <0,05 em comparação com o controle tratado com PBS. FIGURA 16B representa macrófagos M1 corados com ED1 (marrom) dentro do tecido de granulação MCL, 7 dias e 14 dias após lesão. A barra de escala representa 100 pm. FIGURA 16C representa macrófagos M1 corados com ED1 em torno de MPs não carregadas e MPs de IL-Ra 7 e 14 dias após lesão. A barra de escala representa 20 pm.

[040] FIGURAS 17A e 17B representam concentração de proteína inflamatória local no interior de MCL. FIGURA 17A representa a concentração de IL-1 α e FIGURA 17B representa a concentração de IL1 β, 7 e 14 dias após tratamento normalizado para a concentração total

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14/63 de proteína. Os gráficos representam média ± erro padrão, * representa p <0,05 enquanto # representa p <0,15 entre os grupos indicados.

[041] FIGURAS 18A-18C representam resposta in vivo para micropartículas. FIGURA 18A representa coloração por H&E de seções de MCL 7 e 14 dias após lesão. As barras de escala representam 500 μιτι. FIGURA 18B representa concentração de linfócitos T no tecido de granulação 7 e 14 dias após lesão. O gráfico representa média ± erro padrão, * representa p <0,05 entre os grupos indicados. FIGURA 18C representa coloração por H&E de micropartículas circundantes aos tecidos. Barras de escala representam 100 μιτι.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [042] A presente invenção refere-se às formulações para proporcionar um agente ativo. Em algumas modalidades, as formulações incluem um veículo, incluindo, um agente ativo e micropartículas revestidas com minerais, em que um agente ativo é adsorvido ao revestimento mineral. Em algumas modalidades, as formulações incluem um veículo, incluindo, um agente ativo e micropartículas revestidas com minerais em que um agente ativo é incorporado no revestimento mineral. Em algumas modalidades, as formulações incluem um veículo, incluindo, um agente ativo e micropartículas revestidas com minerais, em que um agente ativo é incorporado no revestimento mineral e em que um agente ativo é adsorvido no revestimento mineral. Agentes ativos incluídos no veículo proporcionam um efeito rápido após administração, visto que agente ativo adsorvido ao revestimento mineral e/ou incorporado no revestimento mineral proporciona uma transferência sustentada à medida que o revestimento mineral se degrada. Também descritos são métodos para transferência sustentada de um agente ativo e métodos para tratamento de doenças inflamatórias utilizando uma formulação para proporcionar transferência sustentada de um agente ativo.

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15/63 [043] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma formulação para proporcionar um agente ativo.

[044] Em uma modalidade, a formulação inclui um veículo em que o veículo compreende um agente ativo e uma micropartícula revestida com mineral, em que a micropartícula revestida com mineral compreende um núcleo; um revestimento mineral no núcleo; e um agente ativo adsorvido ao revestimento mineral.

[045] Em uma modalidade, a formulação inclui um veículo em que o veículo compreende um agente ativo e uma micropartícula revestida com mineral, em que a micropartícula revestida com mineral compreende um núcleo; um revestimento mineral no núcleo; e um agente ativo no revestimento mineral.

[046] Em uma modalidade, a formulação inclui um veículo em que o veículo compreende um agente ativo e uma micropartícula revestida com mineral, em que a micropartícula revestida com mineral compreende um núcleo; um revestimento mineral no núcleo; e pelo menos um agente ativo no revestimento mineral e pelo menos um agente ativo adsorvido ao revestimento mineral.

[047] Em uma modalidade, a formulação inclui um veículo em que o veículo compreende um agente ativo e uma micropartícula revestida com mineral, em que a micropartícula revestida com mineral compreende um núcleo, uma primeira camada de revestimento mineral no núcleo, um agente ativo adsorvido na primeira camada de revestimento mineral, uma segunda camada de revestimento mineral e um segundo agente ativo absorvido com a segunda camada de revestimento mineral.

[048] Em uma modalidade, a formulação inclui um veículo em que o veículo compreende um agente ativo e uma micropartícula revestida com mineral, em que a micropartícula revestida com mineral compreende um núcleo, uma pluralidade de camadas de revestimento

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16/63 mineral, e agentes ativos. As camadas de revestimento mineral podem ser as mesmas formulações de revestimento conforme descritas neste relatório. As camadas de revestimento mineral podem também ser diferentes formulações de revestimento conforme descritas neste relatório. Os agentes ativos podem ser absorvidos nas camadas de revestimento mineral após cada camada de revestimento mineral ser preparada conforme descrita neste relatório. Os agentes ativos podem ser incorporados nas camadas de revestimento mineral durante formação mineral conforme descrita neste relatório. Os agentes ativos podem ser o mesmo agente ativo conforme descritos neste relatório. Os agentes ativos podem ser diferentes agentes ativos conforme descritos neste relatório.

[049] O termo formulação, conforme utilizado neste relatório, indica genericamente o agente benéfico, e micropartículas revestidas com minerais são formuladas, misturadas, adicionadas, dissolvidas, suspensas, solubilizadas, formuladas em uma solução, veículo e/ou similares, em ou pelo fluido em uma forma físico-química aceitável para administração parenteral.

[050] Em uma modalidade, o agente ativo adsorvido ao revestimento mineral é o mesmo que o agente ativo no veículo. Em outra modalidade, o agente ativo adsorvido ao revestimento mineral é diferente do agente ativo no veículo. Em outro aspecto, pelo menos dois agentes ativos diferentes são adsorvidos ao revestimento mineral. Modalidades consideradas incluem adicionalmente 3, 4, 5 ou mais agentes ativos diferentes adsorvidos ao revestimento mineral. Em uma modalidade, o agente ativo incorporado no revestimento mineral é o mesmo que o agente ativo no veículo. Em outra modalidade, o agente ativo incorporado no revestimento mineral é diferente do agente ativo no veículo. Em outro aspecto, pelo menos dois agentes ativos diferentes são incorporados no revestimento mineral. Modalidades consideradas

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17/63 incluem adicionalmente 3, 4, 5 ou mais agentes ativos diferentes incorporados no revestimento mineral. Em outro aspecto, um agente ativo pode ser incorporado no revestimento mineral em combinação com um agente ativo adsorvido ao revestimento mineral. Formulações incluem 3, 4, 5 ou mais agentes ativos diferentes na solução de veículo. [051] Agentes ativos particularmente adequados podem ser um antagonista de IL-1; um antagonista do receptor de IL-1; abatacept; rituximab; tocilizumab; anaquinra; adalimumab; etanercept; infliximab; certolizumab; golimumab; e combinações dos mesmos. Um antagonista de IL-1 particularmente adequado é um antagonista de IL-1 recombinante. Abatacept é uma proteína de fusão composta do domínio extracelular de CTLA-4 com os domínios da articulação, CH2 e CH3 de lgG1 e atualmente aprovada para uso em pessoas com artrite reumatoide. Rituximab é um anticorpo monoclonal contra a proteína CD20, o qual é encontrado principalmente na superfície de células B do sistema imune e usado para tratar doenças autoimunes e tipos de cânceres. Rituximab é também aprovado para uso em combinação com metotrexato (MTX) para reduzir sinais e sintomas em pacientes adultos com artrite reumatoide (AR) moderada a severamente ativa. Tocilizumab é um fármaco imunossupressor, principalmente, para o tratamento de artrite reumatoide (AR) e artrite idiopática juvenil sistêmica, uma forma grave de artrite em crianças. É um anticorpo monoclonal humanizado contra o receptor de interleucina-6 (IL-6R). Anaquinra é um antagonista do receptor de interleucina 1 (IL1) usado no tratamento de artrite reumatoide. Adalimumab é um anticorpo monoclonal anti-inflamatório inibidor de TNF utilizado para tratar artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante, doença de Crohn, colite ulcerativa, psoríase crônica, hidradenite supurativa e artrite idiopática juvenil. Etanercept é uma proteína de fusão do receptor de TNF e a extremidade constante do anticorpo lgG1 que inibe TNF e é

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18/63 utilizada no tratamento de artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil e artrite psoriática, psoríase em placas e espondilite anquilosante. Infliximab é um anticorpo monoclonal quimérico que se liga ao TNF-oc e é utilizado para tratar doença de Crohn, colite ulcerativa, psoríase, artrite psoriática, espondilite anquilosante e artrite reumatoide. Certolizumab (e certolizumab pegol, um fragmento de Fab' PEGuilado de um anticorpo monoclonal humanizado inibidor de TNF) é um fragmento de um anticorpo monoclonal específico ao fator de necrose tumoral alfa (TNF-oc) e é utilizado no tratamento da doença de Crohn, artrite reumatoide, artrite psoriática e espondilite anquilosante. Golimumab é um anticorpo monoclonal humano que direciona o fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) e, portanto, é um inibidor de TNF, é usado como um tratamento para artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante e colite ulcerativa.

[052] Outros agentes ativos adequados podem ser antagonistas da família de citocinas IL-1. A família IL-1 é um grupo de 11 citocinas que induz uma complexa rede de citocinas pró-inflamatórias e regula e inicia respostas inflamatórias. As 11 citocinas incluem IL-1 a (IL-1F1), IL1b (IL-1F2), IL-Ra (IL-1 F3), IL-18 (IL-1F4), IL-36Ra (IL-1F5), IL-36oc (IL-1F6), IL-37 (IL-1F7), Ιί-36β (IL-1 F8), IL36y (IL-1 F9), IL-38 (IL-1F10) e IL-33 (IL-1 F11).

[053] Outros agentes ativos adequados podem ser antagonistas da família de receptores de interleucina-1 (IL-1 R). A família de receptores de IL-1 R é caracterizada por domínios extracelulares do tipo imunoglobulina e domínio intracelular de Toll/lnterleucina-1 R (TIR). É um grupo de proteínas estruturalmente homólogas, conservadas em todas as espécies, uma vez que foram identificadas de plantas a mamíferos. IL-1 Rs são envolvidas na defesa imune do hospedeiro e hematopoiese. A IL-1 R do tipo I (IL-1 RI) (também conhecida como CD121 a) é um receptor de IL-1 a, IL-1 β e IL-RA. Membros da família de

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IL-1 R incluem IL-1R1, IL-18Ra, IL-Rrp2 e ST2. IL-1 RH é predominantemente expressa em células linfoides e mieloides. IL-1 RH é um receptor de superfície capaz de se ligar a IL-1 a, IL-1 β e IL-1 RI e também constitui de uma forma solúvel slL-1 RH.

[054] Quando formulado em uma formulação, o agente ativo não ligado contido no veículo e o agente ativo adsorvido à micropartícula revestida com mineral apresenta perfis de ação que são idênticos ou substancialmente idênticos aos perfis de ação quando o agente ativo não ligado e o agente ativo adsorvido à micropartícula revestida com mineral são administrados em formulações separadas. Desse modo, o agente ativo não ligado funciona como uma administração em bolo (bolus) com perfil de ação rápida ou imediata, visto que o agente ativo ligado (adsorvido à micropartícula revestida com mineral) funciona como um perfil de ação de liberação sustentada.

[055] Conforme utilizada neste relatório, uma quantidade eficaz, uma quantidade terapeuticamente eficaz, uma quantidade profilaticamente eficaz e uma quantidade diagnosticamente eficaz é a quantidade do agente ativo não ligado e o agente ativo adsorvido à micropartícula revestida com mineral necessária para elicitar a resposta biológica desejada seguindo administração.

[056] Veículos adequados incluem água, solução salina, solução salina isotônica, solução salina tamponada fosfato, lactato do Ringer, e similares.

[057] Formulações podem também incluir outros componentes, tais como tensoativos, conservantes e excipientes. Os tensoativos podem reduzir ou impedir agregação induzida por superfície do agente ativo e das micropartículas revestidas com minerais. Vários tensoativos convencionais podem ser empregados, tais como ésteres e álcoois de ácidos graxos de polioxietileno e ésteres de ácidos graxos de polioxietileno sorbitol. Quantidades variam geralmente entre cerca de

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0,001 e cerca de 4% em peso da formulação. Conservantes farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, fenol, o-cresol, mcresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metila, p-hidroxibenzoato de propila, 2-fenoxietanol, p-hidroxibenzoato de butila, 2-feniletanol, álcool benzílico, clorobutanol, e tiomerosal, bronopol, ácido benzóico, imiduréia, cloroexidina, desidroacetato de sódio, clorocresol, phidroxibenzoato de etila, cloreto de benzetônio, clorfenesina (3-pclorfenoxipropano-1,2-diol) e misturas dos mesmos. O conservante pode estar presente em concentrações que variam cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml, incluindo, cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 10 mg/ml. A utilização de um conservante em composições farmacêuticas é bem conhecida daqueles versados no estado da técnica. Por conveniência, faz-se referência a Remington·. The Science and Practice of Pharmacy, 19-. edição, 1995. Formulações podem incluir tampões adequados, tais como acetato de sódio, glicilglicina, HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1 piperazinoetanossulfônico) e fosfato de sódio. Excipientes incluem componentes para ajuste de tonicidade, antioxidantes e estabilizadores como comumente utilizados na preparação de formulações farmacêuticas. Outros ingredientes inativos incluem, por exemplo, Lhistidina, monocloridrato de L-histidina monoidratado, sorbitol, polissorbato 80, citrato de sódio, cloreto de sódio e EDTA dissódico.

[058] Qualquer material adequado pode ser usado como o núcleo sobre o qual o revestimento mineral se forma. Materiais de núcleo particularmente adequados são aqueles que se sabe serem não tóxicos para humanos e animais. Materiais de núcleo particularmente adequados incluem também aqueles materiais conhecidos a se degradar e/ou dissolver em humanos e animais. Materiais de núcleo adequados incluem fosfato de β-tricálcio, hidroxiapatita, PLGA e combinações dos mesmos. Núcleos de fosfato β-tricálcio são particularmente adequados à medida que o fosfato β-tricálcio se

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21/63 degrada. Em outras modalidades, o material de núcleo pode ser dissolvido após formação do revestimento mineral. Em outras modalidades, o material de núcleo não é degradável.

[059] O revestimento mineral inclui cálcio, fosfato, carbonato e combinações dos mesmos. Para preparar uma micropartícula revestida com mineral, um material de núcleo é incubado em um fluido corporal simulado modificado. O fluido corporal simulado modificado inclui cálcio e fosfato, que formam o revestimento mineral na superfície do núcleo, o que resulta na micropartícula revestida com mineral. Diferentes morfologias do revestimento mineral podem ser alcançadas variando as quantidades e proporções de cálcio, fosfato e carbonato. Diferentes morfologias do revestimento mineral incluem, por exemplo, estrutura semelhante à placa, estrutura semelhante à esferulita. Alta concentração de carbonato resulta em um revestimento mineral que apresenta uma estrutura semelhante à placa. Baixa concentração de carbonato resulta em um revestimento mineral apresentando uma estrutura semelhante à esferulita. A morfologia do revestimento mineral também afeta adsorção do agente ativo.

[060] Materiais de núcleo adequados nos quais o revestimento mineral é formado incluem polímeros, cerâmicas, metais, vidro e combinações dos mesmos na forma de partículas. Partículas adequadas podem ser, por exemplo, contas de agarose, contas de látex, contas magnéticas, contas poliméricas, contas de cerâmica, contas metálicas (incluindo, contas metálicas magnéticas), contas de vidro e combinações das mesmas. A micropartícula inclui cerâmica (por exemplo, hidroxiapatita, fosfato beta-tricálcio (beta-TCP, β-TCP), magnetita, neodímio), plásticos (por exemplo, poliestireno, policaprolactona), hidrogéis (por exemplo, polietileno glicol; poli(ácido láctico co-glicólico), e similares, e combinações dos mesmos. Materiais de núcleo particularmente adequados são aqueles que se dissolvem in

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22/63 vivo, tais como, por exemplo, fosfato beta-tricálcio (beta-TCP, β-TCP). [061] Tamanhos adequados de micropartículas podem variar de cerca de 1 pm a cerca de 100 pm de diâmetro. Diâmetro das micropartículas pode ser medido por métodos conhecidos daqueles versados no estado da técnica, tais como, por exemplo, medições tiradas de imagens microscópicas (incluindo, imagens microscópicas de luz e elétrons), filtração através de um substrato de seleção de tamanho e similares.

[062] Os substratos de núcleo podem ser inicialmente revestidos com uma película de poli(éster oc-hidróxi), por exemplo. Poli (ésteres ochidróxi) particularmente adequados podem ser, por exemplo, poli(Llactídeo), poli(lactido-co-glicolídeo), poli(e-caprolactona) e combinações dos mesmos. Deve-se entender que, quando se elabora qualquer combinação das películas acima, as películas são tipicamente misturadas em solventes orgânicos adequados, como conhecidas no estado da técnica. Adicionalmente, diferenças em pesos moleculares, taxas de cristalização, temperaturas de transição vítrea, viscosidades e similares devem ser levadas em consideração, bem como entendidas no estado da técnica, para evitar separação de fases e falta de uniformidade nos substratos finais. Separação de fases e falta de uniformidade podem ainda ser evitadas alterando a razão de mistura das películas utilizadas no substrato.

[063] Após preparação de uma película de poli (éster oc-hidróxi) no substrato, a superfície do revestimento de película é hidrolisada sob condições alcalinas para criar uma superfície apresentando grupos COOH e OH. Após hidrólise da superfície, o substrato é incubado em um fluido corporal simulado contendo um material formador de mineral adequado para formar um revestimento mineral. Materiais formadores de minerais adequados podem ser, por exemplo, cálcio, fosfato, carbonato e combinações dos mesmos.

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23/63 [064] O fluido corporal simulado (SBF) para uso nos métodos da presente invenção inclui tipicamente íons de cálcio de cerca de 5 mM a cerca de 12,5 mM, incluindo, íons de cálcio de cerca de 7 mM a cerca de 10 mM e, incluindo, íons de cálcio de cerca de 8,75 mM; íons de fosfato de cerca de 2 mM a cerca de 12,5 mM, incluindo, íons de fosfato de cerca de 2,5 mM a cerca de 7 mM e, incluindo, íons de fosfato de cerca de 3,5 mM a cerca de 5 mM; e íons de carbonato de cerca de 4 mM a cerca de 100 mM.

[065] Em algumas modalidades, o SBF pode incluir cloreto de sódio de cerca de 141 mM, cloreto de potássio de cerca de 4 mM, sulfato de magnésio cerca de 0,5 mM, cloreto de magnésio cerca de 1 mM, cloreto de cálcio cerca de 5 mM, fosfato de potássio cerca de 2 mM e bicarbonate de sódio cerca de 4 mM, e tamponado a um pH de cerca de 6,8.

[066] Em algumas modalidades, o SBF pode incluir adicionalmente íons de sódio cerca de 145 mM, íons de potássio cerca de 6 mM a cerca de 9 mM, íons de magnésio cerca de 1,5 mM, íons de cloreto cerca de 150 mM a cerca de 175 mM, íons de HCOa' cerca de 4 mM, e íons de SCU²' cerca de 0,5 mM.

[067] O pH do SBF pode tipicamente variar de cerca de 4 a cerca de 7,5, incluindo, cerca de 5,3 a cerca de 6,8, incluindo, cerca de 5,7 a cerca de 6,2; e, incluindo, cerca de 5,8 a cerca de 6,1.

[068] SBF adequado pode incluir, por exemplo: íons de sódio cerca de 145 mM, íons de potássio cerca de 6 mM a cerca de 9 mM, íons de cálcio cerca de 5 mM a cerca de 12,5 mM, íons de magnésio cerca de 1,5 mM, íons de cloreto cerca de 150 mM a cerca de 175 mM, íons de HCOa' cerca de 4,2 mM, ions de HPO4²· cerca de 2 mM a cerca de 5 mM, e ions de SO4²· cerca de 0,5 mM. O pH do fluido corporal simulado pode ser de cerca de 5,3 a cerca de 7,5, incluindo, de cerca de 6 a cerca de 6,8.

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24/63 [069] Em uma modalidade, o SBF pode incluir, por exemplo: íons de sódio cerca de 145 mM, íons de potássio cerca de 6 mM a cerca de 17 mM, íons de cálcio cerca de 5 mM a cerca de 12,5 mM, íons de magnésio cerca de 1,5 mM, íons de cloreto cerca de 150 mM a cerca de 175 mM, íons de HCOs' cerca de 4,2 mM a cerca de 100 mM; íons de fosfato cerca de 2 mM a cerca de 12,5 mM, e íons de SCri²' cerca de 0,5 mM. O pH do fluido corporal simulado pode ser de cerca de 5,3 a cerca de 7,5, incluindo, cerca de 5,3 a cerca de 6,8.

[070] Em outra modalidade, o SBF inclui: íons de sódio cerca de 145 mM, íons de potássio cerca de 6 mM a cerca de 9 mM, íons de cálcio cerca de 5 mM a cerca de 12,5 mM, íons de magnésio cerca de

1.5 mM, íons de cloreto cerca de 60 mM a cerca de 175 mM, íons de HCOs' cerca de 4,2 mM a cerca de 100 mM, íons de fosfato cerca de 2 mM a cerca de 5 mM, ions de SO4²· cerca de 0,5 mM, e um pH cerca de 5,8 a cerca de 6,8, incluindo, cerca de 6,2 a cerca de 6,8.

[071] Em ainda outra modalidade, 0 SBF inclui: íons de sódio cerca de 145 mM, íons de potássio cerca de 9 mM, íons de cálcio cerca de

12.5 mM, íons de magnésio cerca de 1,5 mM, íons de cloreto cerca de 172 mM, HCOs' cerca de 4,2 mM, íons de fosfato cerca de 5 mM a cerca de 12,5 mM, íons de SO4²· cerca de 0,5 mM, CO3²· de cerca de 4 mM a cerca de 100 mM, e um pH de cerca de 5,3 a cerca de 6,0.

[072] Em modalidades que incluem um revestimento mineral em camadas, um núcleo é incubado em uma formulação de fluido corporal simulado modificado. A camada de revestimento mineral se forma no núcleo durante 0 período de incubação de minutos a dias. Em seguida a camada inicial de revestimento mineral é formada no núcleo, a micropartícula revestida com mineral pode ser removida do fluido corporal simulado modificado e lavada. Para formar uma pluralidade de camadas de revestimento mineral, uma micropartícula revestida com mineral é incubada em um segundo, terceiro, quarto, etc. fluido corporal

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25/63 simulado modificado até que o número desejado de camadas de revestimento mineral seja alcançado. Durante cada período de incubação, uma nova camada de revestimento mineral se forma na camada anterior. Essas etapas são repetidas até que o número desejado de camadas de revestimento mineral seja alcançado.

[073] Durante formação mineral, agentes ativos podem ser incluídos no fluido corporal simulado modificado para incorporar agentes ativos na camada de revestimento mineral durante formação mineral. Após formação de cada camada de mineral, a micropartícula revestida com mineral pode em seguida ser incubada em um veículo compreendendo pelo menos um agente ativo para adsorver o agente na camada de revestimento mineral. Após incorporação de um agente ativo dentro de uma camada de revestimento mineral e/ou adsorção de um agente ativo a uma camada de revestimento mineral, outra camada de revestimento mineral pode ser formada incubando a micropartícula em outra formulação de fluido corporal simulado modificado. Se desejado, as camadas de revestimento mineral podem incorporar um agente ativo no mineral, as camadas podem apresentar um agente ativo adsorvido à camada de mineral, a camada de revestimento mineral pode ser formada sem incorporar um agente ativo ou adsorver um agente ativo e combinações dos mesmos. Micropartículas revestidas com minerais apresentando diferentes camadas de revestimento mineral podem ser preparadas formando uma camada de mineral utilizando uma formulação de fluido corporal simulado modificado, em seguida, incubando a micropartícula revestida com mineral em uma formulação diferente de fluido corporal simulado modificado. Desse modo, as micropartículas revestidas com minerais podem ser preparadas para apresentar uma pluralidade de camadas de revestimento mineral em que cada camada é diferente. Também são consideradas modalidades que incluem duas ou mais camadas de revestimento mineral que são as

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26/63 mesmas combinadas com uma ou mais camadas de revestimento mineral que são diferentes.

[074] Adaptação da composição do revestimento mineral nas diferentes camadas permite vantajosamente a cinética de liberação sob medida do agente ativo ou agentes ativos de cada camada do revestimento mineral.

[075] Em modalidades, em que incorporação de um ou mais agentes ativos no revestimento mineral é desejado, o agente ativo está incluído no SBF. À medida que ocorre formação mineral, o agente ativo torna-se incorporado com o revestimento mineral.

[076] Em outras modalidades, material magnético pode ser incorporado nos revestimentos minerais. Por exemplo, óxido de ferro superparamagnético ligado a soroalbumina bovina pode ser incorporado em revestimentos minerais. Proteínas ligadas (por exemplo, soroalbumina bovina) pode adsorver no revestimento mineral para incorporar o material magnético com o revestimento mineral.

[077] Em algumas modalidades, o revestimento mineral inclui adicionalmente um dopante. Dopantes adequados incluem íons de halogênio, por exemplo, íons de fluoreto, íons de cloreto, íons de brometo e íons de iodeto. O(s) dopante(s) pode(podem) ser adicionado(s) com os outros componentes do SBF antes de incubação do substrato no SBF para formar o revestimento mineral.

[078] Em uma modalidade, os íons de halogênio incluem íons de fluoreto. íons de fluoreto podem ser proporcionados por agentes contendo de íons de fluoreto tais como sais de fluoreto solúveis em água, incluindo, por exemplo, sais alcalinos e fluoreto de amônio.

[079] O agente contendo íons de fluoreto é geralmente incluído no SBF para proporcionar uma quantidade de até íons de fluoreto de 100 mM, incluindo, íons de fluoreto de cerca de 0,001 mM a 100 mM, incluindo, cerca de 0,01 mM a cerca de 50 mM, incluindo, de cerca de

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0,1 mM a cerca de 15 mM; e, incluindo, cerca de 1 mM.

[080] Verificou-se que a inclusão de um ou mais dopantes no SBF resulta na formação de um revestimento mineral dopado de halogênio que intensifica significativamente a eficiência de transferência de biomolécula para células.

[081] Em ainda outras modalidades, materiais magnéticos, incluindo, magnetita, plásticos dopados de magnetita e neodímio, são utilizados para o material de núcleo de micropartícula. Incluindo, materiais magnéticos resulta na formação de MCM para os quais localização e/ou movimento/posicionamento do MCM por meio de aplicação de uma força magnética é permitida. O uso alternado de materiais de núcleos de micropartícula magnética permite controle espacial de onde transferência de biomolécula ocorre em sistemas de cultura, por exemplo, enquanto se analisa efeito biomolecular nas células.

[082] Os revestimentos minerais podem ser formados por meio de incubação do substrato com o SBF sob uma temperatura de cerca de 37°C por um período de tempo que varia de cerca de 3 dias a cerca de 10 dias.

[083] Após completar a preparação de revestimento mineral, os revestimentos minerais podem ser analisados para determinar a morfologia e composição dos revestimentos minerais. A composição dos revestimentos minerais pode ser analisada por meio de espectroscopia de raios X de energia dispersiva, espectrometria de infravermelho por transformada de Fourier, difratometria de raios X e combinações dos mesmos. Picos de difratometria de raios X adequados podem ser, por exemplo, a 26°e 31°, os quais corre spondem ao plano (0 0 2), ao plano (2 1 1), ao plano (1 1 2) e o plano (2 0 2) para fase mineral da hidroxiapatita. Os picos de difratometria de raios X particularmente adequados podem ser, por exemplo, a 26° e 31°, os

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28/63 quais correspondem ao plano (0 0 2), ao plano (1 1 2) e ao plano (3 0 0) para hidroxiapatita substituída por carbonato. Outros picos de difratometria de raios X adequados podem ser, por exemplo, a 16°, 24° e 33°, os quais correspondem à fase mineral de fosfato de octacálcio. Espectros adequados obtidos por análise de espectrometria de infravermelho por transformada de Fourier podem ser, por exemplo, um pico de 450-600 cm¹, o qual corresponde à flexão de O-P-O, e um pico de 900-1200 cm^-1, o qual corresponde ao estiramento assimétrico P-0 do grupo PO4³· de hidroxiapatita. Picos de espectros particularmente adequados obtidos por análise de espectrometria de infravermelho por transformada de Fourier podem ser, por exemplo, picos de 876 cm¹, 1.427 cnrr¹ e 1.483 cm^-1, os quais correspondem ao grupo carbonato (CO3²). O pico de HPO4²· pode ser influenciado por ajuste das concentrações de íons cálcio e fosfato do SBF usado para preparar 0 revestimento mineral. Por exemplo, 0 pico de HPCU²' pode ser elevado aumentando as concentrações de cálcio e fosfato do SBF. Alternativamente, 0 pico de HPO4²· pode ser reduzido diminuindo as concentrações de cálcio e fosfato do SBF. Outro pico adequado obtido por análise de espectrometria de infravermelho por transformada de Fourier pode ser, por exemplo, um pico obtido para a fase mineral de fosfato de octacálcio a 1.075 cm¹, 0 qual pode ser influenciado por ajuste das concentrações de íons cálcio e fosfato no fluido corporal simulado usado para preparar 0 revestimento mineral. Por exemplo, 0 pico de 1.075 cm^-1 pode ser produzido mais distinto aumentando as concentrações de íons cálcio e fosfato no fluido corporal simulado usado para preparar 0 revestimento mineral. Alternativamente, 0 pico de 1.075 cnrr¹ pode ser produzido menos distinto reduzindo as concentrações de íons cálcio e fosfato no fluido corporal simulado usado para preparar 0 revestimento mineral.

[084] Análise por espectroscopia de raios X de energia dispersiva

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29/63 pode também ser utilizada para determinar a razão de cálcio/fosfato do revestimento mineral. Por exemplo, a razão de cálcio/fosfato pode ser elevada por meio de redução das concentrações de íons de cálcio e fosfato no SBF. Alternativamente, a razão de cálcio/fosfato pode ser reduzida aumentando as concentrações de íons de cálcio e fosfato no SBF. Análise dos revestimentos minerais por meio de espectroscopia de raios X de energia dispersiva permite determinar o nível de substituição de carbonato (CO3² ) para PO4³· e incorporação de HPO4²· nos revestimentos minerais. Tipicamente, 0 SBF inclui íons de cálcio e fosfato em uma razão que varia de cerca de 10:1 a cerca de 0,2:1, incluindo, de cerca de 2,5:1 a cerca de 1:1.

[085] Adicionalmente, a morfologia dos revestimentos minerais pode ser analisada por meio de microscopia eletrônica de varredura, por exemplo. A microscopia eletrônica de varredura pode ser usada para visualizar a morfologia dos revestimentos minerais resultantes. A morfologia dos revestimentos minerais resultantes pode ser, por exemplo, uma microestrutura esferulítica, microestrutura semelhante à placa e/ou uma microestrutura semelhante à rede. Diâmetros médios adequados das esferulitas de uma microestrutura esferulítica podem variar, por exemplo, de cerca de 2 pm a cerca de 42 pm. Diâmetros médios particularmente adequados das esferulitas de uma microestrutura esferulítica podem variar, por exemplo, de cerca de 2 pm a cerca de 4 pm. Em outra modalidade, diâmetros médios particularmente adequados das esferulitas de uma microestrutura esferulítica podem variar, por exemplo, de cerca de 2,5 pm a cerca de 4,5 pm. Em outra modalidade, diâmetros médios particularmente adequados das esferulitas de uma microestrutura esferulítica podem variar, por exemplo, de cerca de 16 pm a cerca de 42 pm.

[086] Micropartículas revestidas com minerais podem ser armazenadas para utilização posterior, lavadas e armazenadas para

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30/63 uso posterior, lavadas e utilizadas imediatamente para a etapa de adsorção, ou utilizadas imediatamente, para a etapa de adsorção sem lavagem.

[087] Para adsorver o agente ativo à micropartícula revestida com mineral, as micropartículas revestidas com mineral são contatadas com uma solução contendo o agente ativo. Como utilizado neste relatório, agente ativo refere-se a materiais biologicamente ativos. O agente ativo pode ser contatado com a micropartícula revestida com mineral usando qualquer método conhecido no estado da técnica. Por exemplo, uma solução do agente ativo pode ser pipetada, derramada ou pulverizada sobre a micropartícula revestida com mineral. Alternativamente, a micropartícula revestida com mineral pode ser imersa em uma solução, incluindo, o agente ativo. O agente ativo adsorve-se ao revestimento mineral por meio de uma interação eletrostática entre o agente ativo e o revestimento mineral da micropartícula revestida com mineral. Agentes ativos adequados incluem moléculas biológicas. Agentes ativos particularmente adequados incluem um antagonista de interleucina-1 (IL-1; IL1F1); um antagonista de IL-1F2; um antagonista de IL-1F3; antagonista de IL1F4; antagonista de IL-1F5; antagonista de IL-1F6; antagonista de IL1F7; antagonista de IL-1F8; antagonista de IL-1F9; antagonista de IL1F10; antagonista de IL-1F11; abatacept; rituximab; tocilizumab; anaquinra; adalimumab; etanercept; infliximab; certolizumab; golimumab; e combinações dos mesmos. Um antagonista de IL-1 particularmente adequado é antagonista do receptor de IL-1 (IL-Ra), urn antagonista de ocorrência natural de IL-1 pró-inflamatória. IL-Ra particularmente adequado inclui anaquinra (por exemplo, KINERET®), que é uma forma recombinante de IL-Ra aprovada pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos para tratamento de inflamação crônica sistêmica.

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31/63 [088] Adsorção do agente ativo às micropartículas revestidas com minerais pode ser adaptada alterando os constituintes minerais (por exemplo, microesferas de alto teor de carbonato e baixo carbonato), alterando a quantidade de micropartículas revestidas com minerais incubada com o agente ativo, alterando a concentração de agente ativo na solução de incubação, e combinações dos mesmos.

[089] O agente ativo adsorvido ao revestimento mineral da micropartícula revestida com mineral é liberado à medida que o revestimento mineral se degrada. A degradação mineral pode ser controlada de tal modo que o revestimento mineral possa degradar-se rápida ou lentamente. Taxas de dissolução do revestimento mineral podem ser controladas alterando a composição do revestimento mineral. Por exemplo, revestimentos minerais que possuem maior substituição de carbonato degradam-se mais rapidamente. Revestimentos minerais que possuem menor substituição de carbonato degradam-se mais lentamente. Incorporação de dopantes, tais como íons fluoreto, pode também alterar cinética de dissolução. Alterações na composição de revestimento mineral podem ser obtidas alterando as concentrações de ions no fluido corporal simulado modificado durante formação do revestimento. O fluido corporal simulado modificado com concentrações mais altas de carbonato, carbonato a 100 mM, por exemplo, resulta em revestimentos que degradam mais rapidamente do que os revestimentos formados em fluido corporal simulado modificado com concentrações fisiológicas de carbonato (carbonato a 4,2 mM).

[090] Para incorporar o(s) agente(s) ativo(s) na micropartícula revestida com mineral, o(s) agente(s) ativo(s) é(são) incluído(s) no fluido corporal simulado durante o processo de revestimento mineral. Agentes ativos particularmente adequados incluem antagonista de interleucina1 (IL-1; IL1F1); um antagonista de IL-1F2; antagonista de IL-1F3; antagonista de IL-1F4; antagonista de IL-1F5; antagonista de IL-1F6;

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32/63 antagonista de IL-1F7; antagonista de IL-1F8; antagonista de IL-1F9; antagonista de IL-1F10; antagonista de IL-1F11; abatacept; rituximab; tocilizumab; anaquinra; adalimumab; etanercept; infliximab; certolizumab; golimumab; e combinações dos mesmos. Um antagonista de IL-1 particularmente adequado é antagonista do receptor de IL-1 (ILRa), um antagonista de ocorrência natural de IL-1 pró-inflamatória. ILRa particularmente adequado inclui anaquinra (por exemplo, KINERET®), que são formas recombinantes de IL-Ra aprovadas pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos para tratamento de inflamação crônica sistêmica.

[091] Para adsorver agentes ativos em diferentes camadas da micropartícula revestida com mineral, as micropartículas com revestimento mineral são incubadas em uma solução contendo o(s) agente(s) ativo(s) após a formação de cada camada. Algumas camadas podem não apresentar agente ativo adsorvido na superfície. Agentes ativos particularmente adequados incluem antagonista de interleucina1 (IL-1; IL1F1); um antagonista de IL-1F2; antagonista de IL-1F3; antagonista de IL-1F4; antagonista de IL-1F5; antagonista de IL-1F6; antagonista de IL-1F7; antagonista de IL-1F8; antagonista de IL-1F9; antagonista de IL-1F10; um antagonista de IL-1F11; abatacept; rituximab; tocilizumab; anaquinra; adalimumab; etanercept; infliximab; certolizumab; golimumab; e combinações dos mesmos. Um antagonista de IL-1 particularmente adequado é antagonista do receptor de IL-1 (ILRa), um antagonista de ocorrência natural de IL-1 pró-inflamatória. ILRa particularmente adequado inclui anaquinra (por exemplo, KINERET®), que são formas recombinantes de IL-Ra aprovadas pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos para tratamento de inflamação crônica sistêmica.

[092] Formulações da presente invenção podem em seguida ser preparadas por meio de adição de um veículo às micropartículas

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33/63 revestidas com minerais apresentando o agente ativo adsorvido ao revestimento mineral. Em uma modalidade, um veículo, incluindo, um agente ativo pode ser adicionado às micropartículas revestidas com minerais apresentando o agente ativo adsorvido ao revestimento mineral para preparar uma formulação, incluindo, agente ativo ligado (agente ativo adsorvido à micropartícula revestida com mineral) e agente ativo não ligado. Em outra modalidade, um veículo não, incluindo, um agente ativo pode ser adicionado às micropartículas revestidas com minerais apresentando o agente ativo adsorvido ao mineral para preparar uma formulação, incluindo, agente ativo ligado.

[093] Em modalidades de formulação particularmente adequada, as formulações incluem tanto agente ativo ligado quanto não ligado. Sem estar ligado por teoria, acredita-se que injeção de uma formulação, incluindo, micropartículas revestidas com mineral com agente ativo ligado e agente ativo não ligado permite que o agente ativo não ligado proporcione um efeito imediato, visto que o agente ativo ligado é sequestrado por sua adsorção à micropartícula revestida com mineral e proporcione um efeito sustentado à medida que o revestimento mineral degrada-se e libera o agente ativo.

[094] Em uma modalidade, o veículo é um veículo farmaceuticamente aceitável. Como entendido por aqueles versados no estado da técnica, veículos farmaceuticamente aceitáveis e, opcionalmente, outros ingredientes terapêuticos e/ou profiláticos devem ser aceitáveis no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação e não serem prejudiciais ao recipiente do mesmo. Soluções- veículo farmaceuticamente aceitáveis adequadas incluem água, solução salina, solução salina isotônica, solução salina tamponada com fosfato, lactato do Ringer e similares. As composições da presente invenção podem ser administradas a animais, de preferência, a mamíferos e, em particular, a humanos como terapêutica

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34/63 intrinsecamente, como misturas entre si ou na forma de preparações farmacêuticas, e as quais como componente ativo contêm uma dose eficaz do agente ativo, além dos excipientes e aditivos farmaceuticamente inócuos habituais.

[095] Formulações para administração parenteral (por exemplo, por meio de injeção, por exemplo, injeção em bolo ou infusão contínua) podem ser apresentadas em forma de dose unitária em ampolas, seringas preenchidas, infusão de pequeno volume ou em recipientes de doses múltiplas com e sem conservante adicionado. As formulações podem assumir tais formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, as micropartículas revestidas com minerais com agente ativo podem estar na forma em pó, obtidas por exemplo, por liofilização a partir de solução, para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril e livre de pirogênio, antes de uso.

[096] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma micropartícula revestida com mineral compreendendo pelo menos um agente ativo incorporado em um revestimento mineral e pelo menos um agente ativo adsorvido ao revestimento mineral.

[097] Conforme descrito neste relatório para incorporar o(s) agente(s) ativo(s) na micropartícula revestida com mineral, agente(s) ativo(s) são incluídos no fluido corporal simulado durante o processo de revestimento mineral. Agentes ativos particularmente adequados incluem aqueles descritos neste relatório.

[098] Conforme descrito neste relatório, o agente ativo pode ser adsorvido ao revestimento mineral. O agente ativo pode também ser incorporado no mineral da micropartícula revestida com mineral, conforme descrita neste relatório. O agente ativo pode adicionalmente

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35/63 ser adsorvido ao revestimento mineral e incorporado no mineral da micropartícula revestida com mineral, como descrita neste relatório. Como também aqui descritos, diferentes agentes ativos podem ser adsorvidos ou incorporados no mineral.

[099] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de liberação imediata e sustentada de um agente ativo. O método inclui proporcionar uma formulação a um indivíduo com necessidade da mesma, a formulação, incluindo, um veículo, em que o veículo compreende pelo menos um primeiro agente ativo; e uma micropartícula revestida com mineral compreendendo pelo menos um segundo agente ativo adsorvido ao revestimento mineral.

[100] Em uma modalidade, o agente ativo adsorvido ao revestimento mineral é o mesmo como o agente ativo no veículo. Em outra modalidade, o agente ativo adsorvido ao revestimento mineral é diferente do agente ativo no veículo. Em outro aspecto, pelo menos dois diferentes agentes ativos são adsorvidos ao revestimento mineral.

[101] Métodos adequados para administração de formulações da presente invenção são por vias parenterais (por exemplo, IV, IM, SC ou IP) e as formulações administradas geralmente, incluem quantidades eficazes de produto em combinação com diluentes aceitáveis, veículos e/ou adjuvantes. Diluentes-padrão tais como soroalbumina humana são considerados para composições farmacêuticas da invenção, como são veículos-padrão, tal como solução salina.

[102] Liberação sustentada do agente ativo pode ser determinada para obter valores de liberação do agente ativo que imitam níveis terapêuticos estabelecidos do agente ativo. A massa de micropartículas revestidas com minerais (com o agente ativo adsorvido) necessária para transferir uma concentração desejada do agente ativo durante um período de tempo pode ser calculada previamente. Por exemplo, uma injeção em bolo única do agente ativo que proporciona o efeito

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36/63 terapêutico desejado pode ser administrada de maneira sustentada durante o período de tempo desejado, obtendo-se os valores de liberação do agente ativo das micropartículas revestidas com minerais. Em seguida, pode-se calcular a massa de micropartículas revestidas com minerais necessária para transferir o agente ativo para proporcionar o efeito terapêutico de um período de tempo desejado. A plataforma de liberação localizada e sustentada oferece o benefício de níveis terapêuticos contínuos do agente ativo no sítio da lesão, sem a necessidade de múltiplas injeções.

[103] Espera-se que dosagens eficazes variem substancialmente, dependendo do(s) agente(s) ativo(s) utilizado(s) e da doença, distúrbio ou condição específica tratada. Devido à liberação rápida e sustentada dos agentes ativos contidos nas formulações da presente invenção, espera-se que as dosagens adequadas sejam inferiores às dosagens eficazes de agentes ativos transferidos por meio de injeções em bolo. Conforme aqui descritas, as micropartículas revestidas com minerais podem ser preparadas para transferir uma quantidade eficaz do agente ativo ao longo de vários dias. Desse modo, administração de formulações do presente pedido proporciona uma administração em bolo de agente ativo não ligado que apresenta um efeito rápido e a liberação sustentada do agente ativo durante degradação do revestimento mineral da micropartícula revestida com mineral apresente uma liberação sustentada do agente ativo para manter o efeito ao longo de horas a dias, conforme desejado.

[104] Formulações da presente invenção podem ser administradas a indivíduos com necessidade destas. Como utilizado neste relatório, um indivíduo (também referido, alternadamente, como um indivíduo e um paciente) refere-se a animais, incluindo, humanos e animais não humanos. Consequentemente, as composições, dispositivos e métodos aqui descritos podem ser utilizados para

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37/63 aplicações em humanos e veterinários, particularmente, em aplicações médicas humanas e veterinárias. Indivíduos adequados incluem hospedeiros de mamíferos de sangue quente, incluindo, humanos, animais de companhia (por exemplo, cães, gatos), vacas, cavalos, camundongos, ratos, coelhos, primatas e porcos, de preferência, um paciente humano.

[105] Conforme utilizado neste relatório, um indivíduo com necessidade do mesmo (também utilizado neste relatório alternadamente com um paciente com necessidade deste) refere-se a um indivíduo suscetível ou sob risco de uma doença, distúrbio ou condição especificada. Os métodos descritos neste relatório podem ser usados com um subconjunto de indivíduos suscetíveis ou com risco elevado de doenças e distúrbios inflamatórios. Como algumas das modalidades de método da presente invenção são direcionadas aos subconjuntos ou as subclasses específicas de indivíduos identificados (ou seja, o subconjunto ou subclasse de indivíduos com necessidade de assistência em abordar uma ou mais condições específicas aqui mencionadas), nem todos os indivíduos se enquadrarão no subconjunto ou subclasse de indivíduos, conforme descritos neste relatório, para certas doenças, distúrbios ou condições.

[106] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de uma doença inflamatória em um indivíduo com necessidade do mesmo. O método inclui administrar uma formulação ao indivíduo, em que a formulação inclui um veículo que inclui um agente ativo e uma micropartícula revestida com mineral, em que a micropartícula revestida com mineral compreende um agente ativo.

[107] Em algumas modalidades, o método é direcionado ao tratamento sistemicamente de artrite reumatoide. Em algumas modalidades, o método é direcionado ao tratamento localmente de osteoartrite.

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38/63 [108] Doenças inflamatórias incluem artrite e, em particular, artrite reumatoide e osteoartrite. Outras doenças inflamatórias adequadas incluem doenças associadas à interleucina-1, tais como diabetes tipo 2, doenças autoimunes, doença inflamatória multissistêmica de início neonatal e doenças neuropáticas (por exemplo, doença de Alzheimer), bem como, situações inflamatórias locais e agudas (por exemplo, cicatrização de feridas cutâneas e de ligamento).

[109] A formulação pode ser administrada por meio de injeção. Para osteoartrite, a formulação pode ser uma injeção sinovial.

[110] Em uma modalidade, o agente ativo adsorvido ao revestimento mineral é o mesmo como o agente ativo no veículo. Em outra modalidade, o agente ativo adsorvido ao revestimento mineral é diferente do agente ativo no veículo. Em outro aspecto, pelo menos dois agentes ativos diferentes são adsorvidos ao revestimento mineral.

[111] Agentes ativos adequados são descritos neste relatório. Agentes ativos particularmente adequados podem incluir antagonista de interleucina-1 (IL-1; IL1F1); um antagonista de IL-1F2; antagonista de IL-1 F3; antagonista de IL-1 F4; antagonista de IL-1 F5; antagonista de IL1F6; antagonista de IL-1F7; antagonista de IL-1F8; antagonista de IL1F9; antagonista de IL-1F10; um antagonista de IL-1F11; abatacept; rituximab; tocilizumab; anaquinra; adalimumab; etanercept; infliximab; certolizumab; golimumab; e combinações dos mesmos. Um antagonista de IL-1 particularmente adequado é antagonista do receptor de IL-1 (ILRa), um antagonista de ocorrência natural de IL-1 pró-inflamatória. ILRa particularmente adequado inclui anaquinra (por exemplo, KINERET®), que são formas recombinantes de IL-Ra aprovadas pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos para tratamento de inflamação crônica sistêmica.

[112] Métodos adequados para administração de formulações da presente invenção são por vias parenterais (por exemplo, IV, IM, SC ou

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IP) conforme descritas neste relatório.

[113] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de inflamação pós-cirurgia em um indivíduo com necessidade do mesmo. O método inclui administrar uma formulação ao indivíduo, em que a formulação inclui um veículo que inclui um agente ativo e uma micropartícula revestida com mineral, em que a micropartícula revestida com mineral compreende um agente ativo.

[114] Agentes ativos adequados são descritos neste relatório. Agentes ativos particularmente adequados podem incluir antagonista de interleucina-1 (IL-1; IL1F1); antagonista de IL-1F2; antagonista de IL1F3; antagonista de IL-1F4; antagonista de IL-1F5; antagonista de IL1F6; antagonista de IL-1F7; antagonista de IL-1F8; antagonista de IL1F9; antagonista de IL-1F10; um antagonista de IL-1F11; abatacept; rituximab; tocilizumab; anaquinra; adalimumab; etanercept; infliximab; certolizumab; golimumab; e combinações dos mesmos. Um antagonista de IL-1 particularmente adequado é antagonista do receptor de IL-1 (ILRa), um antagonista de ocorrência natural de IL-1 pró-inflamatória. ILRa particularmente adequado inclui anaquinra (por exemplo, KINERET®), que são formas recombinantes de IL-Ra aprovadas pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos para tratamento de inflamação crônica sistêmica.

[115] Métodos adequados para administração de formulações da presente invenção são por vias parenterais (por exemplo, IV, IM, SC ou IP) conforme descritos neste relatório.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1 [116] Neste exemplo, determinou-se ligação de IL-Ra a micropartículas revestidas com minerais.

[117] Micropartículas revestidas com minerais (referidas neste relatório alternadamente como MCM e MPs foram fabricadas por

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40/63 meio de incubação de micropartículas β-TCP em FCSm (2 X concentração de cálcio e fosfato de soro humano), refrescadas diariamente, por 7 dias, conforme descrito em Suárez-González e outros (Acta Biomater. 8 (2012)). Concentração de carbonato no FCSm variouse (4,2 mM ou 100 mM) para formar MCMs com diferentes composições de revestimentos. Eficiência de ligação ao IL-Ra foi determinada por incubação de MCMs em concentrações variáveis de IL-Ra em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Utilizou-se BCA para medir a concentração da proteína de IL-Ra na solução de ligação antes e após incubação com MCM. A diferença na concentração de proteína antes e após incubação com MCM foi utilizada para determinar a quantidade de proteína ligada à micropartícula. Um controle de MCM foi usado para determinar a quantidade de IL-Ra perdida para absorção de proteínas nas paredes do tubo durante a ligação. As MCMs carregadas com ILRa foram então incubados sob rotação contínua a 37°C em fluido corporal simulado (SBF) para determinar cinética de liberação de proteínas. O SBF foi alterado e coletado diariamente por 14 dias e micro BCA foi utilizado para determinar liberação de proteínas. Estudos iniciais de ligação e liberação foram conduzidos por múltiplas formulações de revestimento (concentrações variáveis de carbonato) para determinar o revestimento mineral que proporciona ligação e liberação de IL-Ra apresentando a maior eficiência de ligação, para reduzir a liberação de explosão, e proporcionar liberação sustentada na faixa terapêutica. Os resultados são proporcionados nas FIGS. 2 e 3. EXEMPLO 2 [118] Neste exemplo, determinou-se a atividade biológica de IL-Ra liberada de MCMs.

[119] Timócitos de camundongos D10.G4 expostos a IL-1 proliferaram e foram utilizados para estudos de bioatividade de IL-Ra. Os timócitos foram cultivados em meios de IL-1 contendo MCMs

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41/63 carregadas com IL-Ra, MCMs não carregadas ou apenas bolos de ILRa (FIGURA 6). Proliferação de timócitos foi determinada por contagem de células e ensaios de viabilidade celular de título azul. As MCMs carregadas com IL-Ra inibiram proliferação de timócitos induzida por IL1, demonstrando que IL-Ra transferido via MCMs permaneceu biologicamente ativo. Para explorar adicionalmente a atividade biológica de IL-Ra liberada a partir de MCMs, macrófagos THP-1 ativados por forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) foram cultivados com MCMs carregadas com IL-Ra ou MCMs não carregadas. A IL-1 induz a produção de muitas citocinas inflamatórias, incluindo, IL-6, por macrófagos THP-1 (FIGURA 4). Mediu-se a secreção dessas citocinas utilizando ELISA de IL-6 nos sobrenadantes da cultura de células. As MCMs carregadas com IL-Ra inibiram a produção de IL-6 por macrófagos THP-1 estimulados por IL-1 quando comparados com as MCMs não carregadas, 12 e 24 horas após estimulação com IL-1 (FIGS. 4A e 4B), o que demonstra adicionalmente que IL-Ra liberado de MCMs permanece biologicamente ativo.

EXEMPLO 3 [120] Neste exemplo, determinou-se o efeito de transferência sistêmica de IL-Ra via injeção subcutânea de MCMs carregadas com IL-Ra em uma solução de IL-Ra em inflamação induzida por IL-1.

[121] IL-Ra foi transferido através de uma injeção subcutânea de MCMs carregadas com IL-Ra ou IL-Ra em solução para inibir inflamação induzida por IL-1 em um modelo camundongo. Uma injeção de micropartículas não carregadas e controles de injeção de PBS foram examinados. Os camundongos (n = 5/tratamento) foram injetados por via subcutânea com 0,1 ml de PBS (PBS), 1 mg de MCMs de carbonato a 4,2 mM em 0,1 ml de PBS (MCM), 0,1 ml de IL-Ra solúvel em 10 mg/ml (IL-Ra ) ou 0,1 mg/ml de IL-Ra + 1 mg de MCMs de carbonato a 4,2 mM (IL-Ra + MCMs). Para o grupo de IL-Ra + MCM, MCMs foram

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42/63 incubadas na solução de IL-Ra por ~ 1 hora antes de injeção. Após 1 dia ou 3 dias pós-tratamento, os camundongos foram injetados com 10 ng de rhlL-1 Β I.P. para induzir produção de IL-1 por IL-6. Sangue foi coletado 2 horas pós-tratamento com IL-1 para examinar os níveis de IL-6 no plasma via ELISA. O tratamento eficaz de IL-Ra reduzirá os níveis séricos de IL-6 2 horas após administração de IL-1. Apenas ILRa + MCMs reduziram significativamente IL-6 sérica em 1 dia e 3 dias pós-tratamento, quando comparados com o controle de PBS (FIGURA 5).

EXEMPLO 4 [122] Neste exemplo, determinou-se o efeito de injeção intraligamento de MCMs em inflamação durante cicatrização de ligamento.

[123] Os estágios de cicatrização do MCL em rato foram mapeados e determinou-se que a fase inflamatória ocorre entre os dias 0-5 pós-lesão (FIGURA 7). Portanto, tratamento com fatores antiinflamatórios, tal como IL-Ra, é importante nos primeiros 5 dias após lesão, quando as populações de células inflamatórias e citocinas próinflamatórias atingem seus níveis mais altos. Para determinar a localização de MCMs em um MCL lesionado, os MCMs foram marcados com óxido de ferro superparamagnético (SPIO), o qual os tornou visíveis usando MRI ponderada em T2 (FIGS. 8A-8B). Determinou-se que a localização de MCM no MCL permaneceu no sítio de lesão por pelo menos 15 dias (FIGURA 8C). Para determinar potenciais efeitos adversos do sistema de transferência de MCM, utilizou-se histologia para determinar se MCMs causam uma resposta inflamatória prolongada ou calcificação do ligamento. Embora macrófagos próinflamatórios (M1) estejam localizados em torno dos MCMs precocemente durante a cicatrização do ligamento (FIGURA 8A), não houve uma resposta prolongada de M1. Coloração com vermelho de

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Alizarina mostrou que após dissolução do MCM, nenhum tecido de ligamento foi calcificado e os MCMs não pareciam efetuar arquitetura do ligamento (FIGS. 9B e 9C).

EXEMPLO 5 [124] Neste exemplo, determinou-se a liberação sustentada de ILRa a partir de micropartículas e capacidade de inibir atividade de IL-1 in vitro e in vivo.

[125] Micropartículas foram fabricadas por meio de incubação de núcleos (β-TCP) (Plasma Biotal Limited, Derbyshire, RU) que foram incubados em fluido corporal simulado modificado (FCSm) para formar micropartículas (MPs) revestidas com minerais de fosfato de cálcio (FCa). Preparou-se FCSm dissolvendo NaCI (141 mM), KCI (4,0 mM), MgSO₄ (0,5 mM), MgCI₂ (1,0 mM), CaCI₂ (5,0 mM), KH₂PO₄ (2,0 mM) e NaHCOs (4,2 mM) e tamponado a um pH de 6,8. Incubou-se β-TCP (100 mg) em 50 ml de FCSm por 7 dias sob rotação contínua a 37Ό para formar MPs. A solução de FCSm foi substituída diariamente para manter concentrações adequadas de íons cálcio e fosfato para crescimento contínuo do revestimento.

[126] Incubou-se 1 mg de MPs em 1 ml de concentrações variáveis de IL-Ra (Swedish Orphan Biovitrum, Stockholm, Suécia) (10, 5, 2, 1, 0,5 e 0,1 mg/ml) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 1 hora sob rotação contínua a 37Ό em tubos de 1,5 ml de Protein LoBind Eppendorf (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha), n = 3 amostras por condição, conforme representado na FIGURA 10A. As micropartículas foram então centrifugadas a 200 rcf por 5 minutos e o sobrenadante removido. Para examinar ligação da proteína com as MPs, 1 mg de micropartículas de IL-Ra foi dissolvido em 50 μΙ de HCI 2N. 20 μΙ da amostra de micropartícula (MP) de IL-Ra dissolvida ou padrão de IL-Ra foram misturados com 200 μΙ de fluoraldeído oftaldialdeído em uma placa preta de 96 poços. As amostras foram

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44/63 excitadas a 360 nm e a fluorescência foi lida a 460 nm para quantificar concentração de proteínas em solução (n = 3 por condição).

[127] MPs de IL-Ra usadas para todos os ensaios in vitro e in vivo foram criados por meio de incubação de MPs em 10 mg/ml de IL-Ra por 1 hora. O IL-Ra liberado de MPs foi examinado no FCS³⁵. 1 mg/ml de MPs de IL-Ra foi incubado em SBF sob rotação contínua a 37Ό em tubos de 1,5 ml de Protein LoBind Eppendorf. SBF foi alterado e coletado diariamente e um padrão de IL-Ra foi criado em SBF (n = 3 por condição). Utilizou-se um ensaio de fluoraldeído-o-ftaldialdeído para medir a concentração de proteína em solução, conforme descrito acima.

[128] Para ensaios de atividade de IL-Ra in vitro, propagaram-se monócitos humanos THP-1 (ATCC, Manassas, Virgínia). Foram plaqueadas 2 x 10⁵ células em 1 ml de RPMI 1640 com glutagro (Thermo Fisher Scientific, Hampton, NJ) com FBS a 10% (Gibco de Thermo Fisher Scientific) em placas transwell de 12 poços (Costar, Kennebunk, ME). Adicionou-se aos meios forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) 100 nM (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) para diferenciar as células dos macrófagos. Adicionou-se 3 dias após ativação de PMA, 1 mg de MPs de IL-Ra ou 1 mg de MPs não carregadas aos meios na inserção transwell (n = 6 poços por condição de tratamento). Adicionou-se 6 horas após tratamento, 2 pL de 5 pg/ml de IL-1 β humana (sistemas de R&D, Minneapolis, MN) ao meio de cultura, como representado na FIGURA 11 D. Foram removidos 200 pi de meios de cada poço 12 e 24 horas após a adição de IL-1. Um ELISA de IL-6 humana (R&D Systems, Minneapolis, MN) foi executado de acordo com as instruções do k/fpara examinar os níveis de IL-6 nas amostras dos meios.

[129] Linfócitos T de camundongo D10.G4.1 (ATCC) foram propagados de acordo com protocolo fornecido por ATCC. Foram plaqueadas 1,5 x 10⁵ células em 0,45 ml de RPMI com FBS a 10% e suplemento de cultura de células T a 10% (Corning, Corning, NI) em

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45/63 uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. As células foram tratadas com MPs de IL-Ra (0,5 mg), MPs não carregadas (0,5 mg), IL-Ra solúvel (50 pg) ou nenhum tratamento foi adicionado a cada poço (n = 6 poços/tratamento). Adicionou-se 6 horas após tratamento, IL-Ιβ recombinante (10 pg/ml) aos poços apropriados (n = 3 poços/grupo de tratamento). 48 horas após adição de IL-1 β, os números de células foram contados usando exclusão de azul de tripano. Meios também foram coletados e um ELISA de IL-Ra humana (Life Technologies, Carlsbad, CA) foi executado de acordo com as instruções do kit.

[130] Para transferência in vivo de IL-Ra, após aprovação pela University of Wisconsin-Madison Institutional Animal Care and Committee, camundongos C57BI6 machos de 12 a 13 semanas de idade (Envigo, Huntingdon, Reino Unido) foram administrados 100 μΙ por injeções subcutâneas (s.c.) de 4 tratamentos; 1 mg de MPs de ILRa na solução de carga (10 mg/ml de IL-Ra), 10 mg/ml de IL-Ra, 1 mg de MPs não carregadas em PBS, ou PBS (n = 10 animais/tratamento). As MPs de IL-Ra foram incubadas na solução de carregamento de 10 mg/ml de IL-Ra por 1 hora antes de injeção. Camundongos foram separados em 2 grupos de 5 animais/tratamento (Grupos A e B) para examinar concentrações e atividade sérica de IL-Ra em diferentes momentos. Animais no grupo A receberam uma injeção intraperitoneal (i.p.) de 100 μΙ de IL-1 β recombinante (100 ng/ml; sistemas de R&D, Minneapolis, MN) 1,5 e 14 dias após tratamento, enquanto animais no grupo B receberam injeções de IL-1 β, 3 e 7 dias após tratamento. 2 horas após cada injeção de IL-Ιβ, foram realizados sangramentos maxilares para coletar sangue em tubos de coleta de vermelho-cereja com um gel para separar o soro (Terumo, Elkton, MD). Animais com sinais de infecção no local do sangramento ou que não tiveram reação à IL-1 foram excluídos do estudo. As amostras de sangue foram centrifugadas e soro foi obtido para IL-6 Quantikine de camundongo

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46/63 (Sistemas R&D, Minneapolis, MN) e testes ELISAs de IL-Ra humana (Life Technologies, Carlsbad, CA) seguindo as instruções do kit. Os níveis de IL-6 foram normalizados com o grupo de controle de PBS coletado no mesmo dia.

[131] Micropartículas (MPs) de IL-Ra em camadas foram fabricadas por meio de incubação das MPs em uma solução contendo 1 mg/ml de IL-Ra por 1 hora por dia durante o processo de revestimento, como representado na FIGURA 13A. Após 7 dias de revestimento, as MPs em camadas foram incubadas em 10 mg/ml de IL-Ra por 1 hora para formar MPs de IL-Ra em camadas. Carga e liberação de proteínas foram realizadas conforme descritas para as MPs de IL-Ra. Transferência in vivo de IL-Ra MP em camadas também foi realizada como descrita anteriormente, exceto que foram administrados a camundongos injeções de 100 μΙ s.c. de MPs de IL-Ra em camadas na solução de carregamento (10 mg/ml) (n = 10) ou PBS (n = 10). Os animais receberam então 100 μΙ de injeções i.p. de IL-1 β (100 ng/ml) nos dias 1,3 e 7 (n = 5/tratamento) ou nos dias 5,10 e 14 pós-tratamento (n = 5/tratamento) e sangraram 2 horas após administração de IL-1 β conforme descrito para MPs de IL-Ra.

[132] Micropartículas (MPs) ligadas eficientemente a IL-Ra de maneira dependente da concentração. As MPs de IL-Ra foram fabricadas incubando núcleos de β-TCP em FCSm por 7 dias seguidos por 1 hora de incubação em uma solução de carregamento de IL-Ra em PBS, como representado na FIGURA 10A. As MPs incubadas com ILRa demonstraram um aumento dependente da concentração na massa de ligação a IL-Ra (FIGURA 10AB). Especificamente, as MPs incubadas em uma solução de carregamento contendo a maior concentração de IL-Ra (10 mg/ml de IL-Ra) ligaram 217,5 pg de IL-Ra por mg de MP, enquanto as MPs incubadas em uma solução de carregamento contendo a menor concentração de IL-Ra (0,1 mg/ml de IL-Ra) ligaram

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11,2 pg de IL-Ra por mg de MP. Além disso, a eficiência de ligação de IL-Ra a MPs foi inversamente relacionada à concentração de IL-Ra na solução de ligação (FIGURA 10C). A eficiência de ligação variou de 17,4% quando as MPs foram carregadas na concentração mais alta de IL-Ra, a 90,0% quando as MPs foram carregadas na menor concentração de IL-Ra.

[133] MPs liberaram IL-Ra durante um período de tempo estendido in vitro (FIGURA 10D). Uma liberação inicial de explosão de 26,2% da IL-Ra carregada (50,3 pg de IL-Ra/mg de MPs) foi seguida por uma taxa de liberação linear de ~ 5,6 pg de IL-Ra/mg de MPs/dia por 7 dias, após o qual a taxa de liberação reduziu em ~ 1,43 pg de IL-Ra/mg de MPs/dia. Por 14 dias, as MPs liberaram 70,3% da IL-Ra inicialmente carregada (70,25 pg de IL-Ra/mg de MPs).

[134] IL-Ra transferido via MPs foi biologicamente ativa, conforme medida pela capacidade de inibir atividade induzida por IL-1 in vitro. Avaliou-se a inibição da atividade de IL-1 em dois ensaios celulares; 1) inibição de proliferação induzida por IL-1 de linfócitos T de camundongo D10.G4.1 e 2) inibição da produção de IL-6 induzida por IL-1 por macrófagos humanos THP-1. Os experimentos com linfócitos T demonstraram que, independentemente da presença de MP, IL-1 aumentou a concentração celular de linfócitos T de camundongo D10.G4.1 (PBS: 3,51 x 10⁵ ± 0,63 x 10⁵ células/ml e MP não carregada: 3,56 x 10⁵ ± 0,28 x 10⁵ células/ml) quando comparada com células cultivadas sem IL-1 (PBS: 2,46 x 10⁵ ± 0,25 x 10⁵ células/ml e MP não carregada: 2,63 x 10⁵ ± 0,38 x 10⁵ células/ml) (FIGURA 11A). O aumento estimulado por IL-1 na concentração de linfócitos T foi inibido por MPs de IL-Ra (2,15 x 10⁵±0,35x 10⁵ células/ml) quando comparado com transferência em bolo de IL-Ra solúvel (3,4 x 10⁵ ± 0,18 x 10⁵ células/ml) ou PBS (3,51 x 10⁵± 0,63 x 10⁵ células/ml) (FIGURA 11B). IL-Ra no sobrenadante foi significativamente superior nas amostras

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48/63 tratadas com IL-Ra solúvel (quando comparado com a MP de IL-Ra (FIGURA 11C), e foi indetectável nos controles tratados com PBS (não mostrado) 2 dias após tratamento, o que indica que atividade de IL-Ra, e não concentração apenas, foi responsável por redução na concentração de linfócitos T quando transferidos com MPs comparados com IL-Ra solúvel. Em outro conjunto de experimentos, cultura de células THP-1 em um sistema de cultura transwell não permitiram o contato direto entre as células e as MPs (representadas na FIGURA 11 D) demonstraram que IL-Ra liberada pelas MPs foi biologicamente ativa. Especificamente, as MPs de IL-Ra reduziram significativamente produção de IL-6 estimulada por IL-1 por macrófagos THP-1 humanos por 2,8 e 3,0 vezes em 18 e 30 horas pós- tratamento, respectivamente, em comparação com as MPs não carregadas (FIGURA 11E). IL-6 foi indetectável em macrófagos não estimulados com IL-1.

[135] Injeção subcutânea de MPs de IL-Ra elevou concentrações séricas de IL-Ra por 14 dias. Camundongos receberam uma injeção subcutânea de MPs de IL-Ra suspensas na solução de carregamento de IL-Ra (representada na FIGURA 12A), IL-Ra solúvel, MPs não carregadas em PBS, ou PBS e a concentração sérica de IL-Ra para cada tratamento foi examinada durante o curso de 14 dias (FIGURA 12B). A IL-Ra sérica não foi detectada em quaisquer animais tratados com PBS apenas em nenhum momento do estudo, enquanto os animais tratados com MPs de IL-Ra, ou IL-Ra solúvel demonstraram níveis séricos elevados de IL-Ra 1 dia após tratamento (750,4 ± 10,8 pg/ml e 853,3 ± 40,37 pg/ml, respectivamente). O tratamento de IL-Ra solúvel inicialmente elevou as concentrações séricas de IL-Ra, mas os níveis de IL-Ra reduziram rapidamente ao longo do tempo de 5 dias antes de atingir níveis indetectáveis por 7 dias. Em contraste, concentrações séricas de IL-Ra foram significativamente maiores em animais tratados com MPs de IL-Ra quando comparados àqueles tratados com IL-Ra

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49/63 solúvel 5 dias após tratamento (102,9 ± 5,3 pg/ml e 52,1 ± 1,1 pg/ml, respectivamente). Adicionalmente, IL-Ra foi detectável no soro de animais tratados com MPs de IL-Ra durante os 14 dias de monitoramento após tratamento. Interessantemente, em 1 dia e 5 dias após o tratamento, os animais tratados apenas com MPs não carregadas apresentaram IL-Ra sérica elevada, embora em níveis significativamente inferiores a que as condições de MP de IL-Ra solúvel ou IL-Ra.

[136] MPs de IL-Ra inibiram a atividade de IL-1 in vivo por 7 dias. Os animais receberam administração sistêmica de IL-1 em 1, 3, 5, 7 e 14 dias após tratamento, a fim de examinar a capacidade de tratamentos com IL-Ra inibir a atividade de IL-1 in vivo. A concentração sérica de IL-6, que é elevada em resposta à atividade de IL-1, foi examinada 2 horas após administração de IL-1 e normalizada para os animais tratados com PBS para examinar inibição da atividade de IL-1 (FIGURA 12C). Um valor inferior a 1 indicou inibição da produção de IL6 induzida por IL-1. A concentração sérica de IL-6 foi significativamente reduzida por 61,8 ± 11%, 66,7 ± 13% e 81,5 ± 3% em 1, 3 e 5 dias, respectivamente, após o tratamento com MPs de IL-Ra quando comparada com animais tratados com PBS. IL-Ra solúvel ou tratamento com MPs não carregadas não causou impacto na concentração sérica de IL-6 nos mesmos pontos de tempo de tratamento com MP ou MP de IL-Ra reduziu níveis de IL-6 em 7 dias em comparação com os controles de PBS. Contudo, não houve diferença estatística observada entre as comparações de qualquer grupo de tratamento (IL-Ra solúvel, MPs não carregadas ou MPs de IL-Ra). Por 14 dias, não foi observada diferença significativa na IL-6 no soro entre quaisquer grupos (dados não mostrados).

[137] Sobreposição de IL-Ra em camadas ao longo do revestimento aumentou a quantidade de IL-Ra incorporada nas MPs e

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50/63 prolongou inibição de IL-1 por um período de tempo mais longo in vivo. As MPs foram incubadas em uma solução de IL-Ra a 1 mg/ml por 1 hora por dia durante o processo de revestimento (FIGURA 13A), seguido por uma incubação final de 1 hora em solução de IL-Ra a 10 mg/ml para formar as micropartículas (MPs) de IL-Ra em camadas. As MPs de ILRa em camadas incorporaram aproximadamente 3X mais IL-Ra (668,5 ± 30,2 pg de IL-Ra/mg de MP) do que as MPs de IL-Ra fabricadas tradicionalmente (217,0 ± 12,0 pg de IL-Ra/mg de MP; FIGURA 13B). Além disso, incubação de MPs de IL-Ra em camadas em SBF resultou em uma baixa liberação de explosão de IL-Ra (6,6% de IL-Ra incorporada) após 1 dia. Por conseguinte, IL-Ra liberou de maneira sustentada por pelo menos 14 dias in vitro (FIGURA 13C). Administração subcutânea de MPs de IL-Ra em camadas aumentou a concentração sérica de IL-Ra por 10 dias, e IL-Ra não foi detectável no soro 14 dias após tratamento (FIGURA 13D). É importante ressaltar que os animais tratados com MPs de IL-Ra em camadas e, em seguida, estimulados com IL-1 exibiram uma concentração sérica significativamente inferior a, de IL-6 do que os controles tratados com PBS 5, 7, 10 e 14 dias após tratamento.

[138] Os resultados proporcionados neste relatório demonstraram que as micropartículas (MPs) transferiram IL-Ra biologicamente ativo e inibiram com êxito atividade de IL-1 in vitro e in vivo por períodos de tempo mais longos do que IL-Ra solúvel isolado. IL-Ra solúvel apresenta uma meia-vida curta in vivo de apenas 4-6 horas e, porque IL-1 é uma potente molécula inflamatória, concentração de IL-Ra deve ser 100-1.000 x maior que a concentração de IL-1 a fim de inibir atividade de IL-1. Devido a essas propriedades, IL-Ra atualmente é aprovado para administração como uma injeção subcutânea diária autoadministrada de aproximadamente 1 mg de IL-Ra/kg. Embora a inibição de IL-1 tenha mostrado melhorar muitas doenças em estudos

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51/63 de caso e modelos animais, limitou-se o uso de IL-Ra em clínica a todos, exceto em alguns cenários clínicos. Liberação sustentada de IL-Ra biologicamente ativo pode expandir suas utilizações clínicas, mantendo uma concentração terapêutica por um período de tempo prolongado, o que podería melhorar tanto o regime de tratamento quanto a eficácia de IL-Ra para muitas doenças.

[139] Ao contrário de encapsulação polimérica, fabricação de MP de IL-Ra não exige um ambiente extremo ou processo complexo para carregamento de proteínas. Adicionalmente, a quantidade de IL-Ra carregado na micropartícula pode ser adaptada alterando a concentração de proteína na solução de carregamento. As MPs apresentavam uma capacidade de carregamento substancialmente superior (21,7% ± 1,2% de IL-Ra p/p de MPs) do que estudos anteriores de microesferas de PLGA que encapsulavam 2,5% - 7,5% de IL-Ra p/p de microesferas de PLGA.

[140] MPs de IL-Ra inibiram significativamente atividade de IL-1 em cenários em que uma dosagem igual de IL-Ra solúvel não apresentou efeito. As MPs de IL-Ra inibiram proliferação induzida por IL-1 de linfócitos T de camundongo, embora IL-Ra no sobrenadante (conforme detectado por ELISA) fosse aproximadamente 3 vezes menor que o sobrenadante de IL-Ra solúvel, o qual surpreendentemente não apresentou impacto observável sobre proliferação induzida por IL-1.

[141] Micropartículas (MPs) de IL-Ra podem transferir IL-Ra ativo in vivo. As MPs de IL-Ra foram injetadas subcutaneamente junto com a solução de ligação a IL-Ra enquanto os animais tratados com IL-Ra solúvel receberam uma injeção subcutânea de IL-Ra de massa de ILRa igual para assegurar que os animais receberam a mesma dose cumulativa de IL-Ra. Adicionalmente, a grande dose em bolo de IL-Ra a partir da solução de ligação pode ser benéfica para o regime de tratamento, proporcionando uma dose alta de IL-Ra que deve ser

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52/63 sequestrada por receptores de IL-1 inicialmente, seguido por uma liberação sustentada de IL-Ra a partir de MPs de IL-Ra para manter ocupação do receptor e inibição de IL-1. Enquanto os animais foram dosados com a mesma massa total de IL-Ra, após 1 dia pós-tratamento, os animais tratados com IL-Ra solúvel apresentavam uma concentração sérica significativamente superior a de IL-Ra do que os animais tratados com IL-Ra, o que pode ser atribuído ao IL-Ra que não tinha sido liberado das micropartículas (MPs). As MPs de IL-Ra aumentaram significativamente a concentração sérica de IL-Ra em pontos de tempo posteriores (5, 7 e 14 dias) quando comparadas com IL-Ra solúvel, indicando que as MPs foram capazes de liberar IL-Ra de maneira sustentável in vivo. Inesperadamente, IL-Ra também foi detectável em animais tratados com MPs não carregadas 1 e 5 dias após tratamento. Embora o teste ELISA de IL-Ra utilizado para detectar concentração sérica fosse de IL-Ra humana, a reatividade cruzada com IL-Ra endógena de camundongo, a qual compartilha 80% de homologia com IL-Ra humana, podia ser responsável por esse resultado. Entretanto, ILRa sérica foi significativamente maior nas MPs de IL-Ra do que as MPs não carregadas em cada ponto de tempo.

[142] Sobreposição em camadas de IL-Ra ao longo do revestimento melhorou a capacidade de carga e duração da atividade de IL-Ra em comparação com as MPs de IL-Ra tradicionalmente carregadas e prolongou a inibição da atividade de IL-1 por até duas semanas in vivo. Sobreposição em camadas de IL-Ra em todo o revestimento triplicou a capacidade de carga das MPs, reduziu a porcentagem de IL-Ra liberada em 1 dia (liberação de explosão) e reduziu a porcentagem de IL-Ra liberada em 14 dias, sugerindo que MPs de IL-Ra em camadas estende a liberação de IL-Ra em comparação com as MPs de IL-Ra. As MPs de IL-Ra em camadas também produziram concentrações séricas superiores às de IL-Ra do

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53/63 que as MPs de IL-Ra em pontes de tempo prematuros (1 dia e 3 dias), mas foram indetectáveisa em 14 dias, indicando que as sobreposições em camadas não estenderam a duração da liberação de IL-Ra in vivo. Interessantemente, contudo, as MPs de IL-Ra em camadas estenderam a atividade de IL-Ra, o que pode indicar que a maior concentração em pontos de tempo mais antecipados contribui para a inibição prolongada de IL-1.

[143] Micropartículas (MPs) de IL-Ra oferecem uma plataforma de liberação sustentada de IL-Ra com propriedades que excedem as plataformas tradicionais de transferência de encapsulamento polimérico. O IL-Ra pode ser eficientemente carregado, liberado de forma sustentável e transferido sistemicamente através de uma injeção subcutânea. Adicionalmente, a IL-Ra liberada das MPs de IL-Ra foi ativa e podia inibir atividade de IL-1. As MPs de IL-Ra proporcionam uma plataforma de transferência que pode ser administrada por via subcutânea que prolonga o tempo entre tratamentos e melhora a eficácia no tratamento de doenças mediadas por IL-1.

EXEMPLO 6 [144] Neste exemplo, determinou-se transferência localizada de antagonista do receptor de interleucina-1 (IL-Ra) em um modelo de ligamento colateral medial (LCM) lesionado em rato.

[145] Preparação de micropartículas e ligação de IL-Ra foram realizadas como descrito acima. As MPs de IL-Ra foram criadas incubando MPs liofilizadas em 25 mg/ml de IL-Ra em PBS por 1 hora sob rotação contínua a 37Ό em tubos de 1,5 ml de Protein LoBind Eppendorf. Para determinar a quantidade de IL-Ra ligado com as MPs, 1 mg de micropartículas (MPs) de IL-Ra foi dissolvido em 50 μΙ de HCI 2N. 20 μΙ da amostra de MP de IL-Ra dissolvidos ou padrão de IL-Ra foram misturados com 200 μΙ de fluoraldeído o-ftaldialdeído em uma placa preta de 96 poços. Amostras foram excitadas em 360 nm e

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54/63 fluorescência foi lida em 460 nm para quantificar a concentração de proteínas em solução (n = 3).

[146] Cirurgias em animais foram aprovadas pela University of Wisconsin Institutional Animal Care and Use Committee. Foram utilizados 36 ratos Wistar machos esqueleticamente maduros (320-340 g) como um modelo de lesão de ligamento colateral medial (LCM) extraarticular. Os animais foram divididos aleatoriamente em 4 grupos de tratamento, MPs de IL-Ra, IL-Ra solúvel, MPs não carregadas, ou PBS. Todos os ratos foram submetidos a uma transecção bilateral de ligamento colateral mediai (LCM) (dia 0) enquanto anestesiados via isofluorano. Realizou-se uma incisão na pele de 1 cm sobre o aspecto mediai dos joelhos esquerdo e direito. O tecido subcutâneo foi dissecado para expor o músculo sartório e o LCM subjacente. O ponto médio axial do LCM foi completamente seccionado. 0,25 mg de MPs de IL-Ra suspensos em 10 μΙ de 25 mg / ml de IL-Ra, 10 μΙ de 25 mg / ml de IL-Ra, 0,25 mg de MPs não carregadas em 10 μΙ de PBS ou 10 μΙ de PBS foram pipetados sobre cada uma das MCLs seccionadas (n = 9 animais por tratamento). Os animais receberam o mesmo tratamento bilateralmente. Após transecção e tratamento, as camadas de tecidos musculares, subcutâneos e subdérmicos foram cada uma fechada com sutura de Dexon 4-0. Todos os animais receberam movimento irrestrito da gaiola imediatamente após cirurgia. Três animais de cada condição de tratamento foram sacrificados 7 dias após cirurgia. Os 6 animais restantes por grupo de tratamento foram sacrificados 14 dias após cirurgia.

[147] Imediatamente, após sacrifício em 7 dias e 14 dias póscirurgia, o LCM direito foi imediatamente dissecado e congelado em nitrogênio líquido em tubos de Eppendorf e armazenado a -800 até análise. LCMs individuais (n = 3/condição/ponto no tempo) foram colocados em tubos do k/YLise Navy Bead contendo mistura de esferas

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55/63 de aço inoxidável de 0,9-2,0 mm e esferas de aço inoxidável de 3,2 mm. Foram adicionados 200 μΙ de solução de Lise Bio-Rad e cada tubo foi misturado sob velocidade 10 por 5 minutos. O sobrenadante foi coletado e transferido para um novo tubo de Eppendorf, submetido a um ciclo de congelamento-degelo, sonicado em gelo, centrifugado por 4 minutos em 4.500 g, e o sobrenadante foi novamente coletado. Um BCA foi processado em homogenatos de tecidos para determinar concentração da proteína de acordo com as instruções do kit. Utilizou-se um ensaio multíplice plexde 10 ratos luminexpara examinar a concentração de 10 citocinas de rato (IL-1 a, IL-1 β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, INF-gama, GM-CSF e TNF-oc) nos homogenatos de tecido de LCM (n = 3/condição/ponto de tempo) de acordo com as instruções do kit. Um teste ELISA de IL-Ra (Life Technologies) foi executado em homogenatos de LCM (n = 3/condição/ponto de tempo) de acordo com as instruções do kit. Todas as concentrações de proteína foram normalizadas para a concentração de proteína conforme medida pelo BCA. ANOVAs unidirecionais com uma análise post-hoc de LSD de Fischer foram realizadas usando caleidográfo (Kaleidograph) para avaliar diferenças estatísticas entre os grupos de tratamento. Um valor de p < 0,05 foi considerado significativo. Um valor de p < 0,15 foi considerado uma tendência no sentido de significância.

[148] Imediatamente após sacrifício em 7 dias e 14 dias póscirurgia, o LCM esquerdo de cada animal foi dissecado, medido, congelado instantaneamente no composto de temperatura de corte ideal (Optimal Cutting Temperature (OCT)), cortado em criosseções de 5 μιτι de espessura que foram montadas em lâminas de microscópio Superfrost Plus e mantidas a -700 para imuno-histoquímica futura (IHC) e histologia. Coloração com hematoxilina e eosina (H&E) foi realizada nas criosseções de tecido para observar a morfologia geral e tamanho do tecido de granulação dos ligamentos de cicatrização.

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Micrografias de cada seção de tecido foram tomadas usando um microscópio assistido por câmera (microscópio E6000 Nikon Eclipse equipado com uma câmera Olympus DP79) e as dimensões do tecido de granulação foram medidas usando a Imagem J para 3 seções de tecido por animal. Medições de comprimento foram realizadas no ponto médio longitudinal do ligamento. Medições da área da seção transversal do tecido de granulação não incluíram o tecido epiligamentar. As micropartículas foram identificadas nas seções de tecido através de coloração vermelha de alizarina para detecção de cálcio. Resumidamente, as seções foram fixadas em acetona fria, coradas por 5 minutos com uma solução de vermelho de Alizarina 40 mM a pH 4,1, enxaguadas com água Dl, desidratadas, cobertas com lâminas (coverslipped) e observadas por microscopia óptica, como descrito acima.

[149] Imuno-histoquímica (IHC) foi realizada em criosseções das amostras de LCM para identificar tipos de células específicos. Os tipos celulares foram caracterizados utilizando anticorpos monoclonais de camundongo para CD68 (macrófagos M1) e CD3 (linfócitos T). Esses anticorpos foram obtidos de Abcam-Serotec (Raleigh, NC) e foram utilizados sob uma diluição de 1:100. Para o IHC, as criosseções foram descongeladas, fixadas em acetona, incubadas em peróxido de hidrogênio a 3% para eliminar atividade endógena da peroxidase, bloqueadas com background buster (Innovex Biosciences, Richmond, CA) por 30 minutos e, em seguida, incubadas com o anticorpo de interesse por 2 horas. Após incubação primária do anticorpo e lavagem do anticorpo não ligado, as seções foram incubadas com biotina, seguidas por incubação em peroxidase de rábano silvestre conjugada com estreptavidina (kit de coloração Stat Q de Innovex Biosciences, Richmond, CA). Os anticorpos ligados foram visualizados com diaminobenzidina (DAB), desidratados, limpos e cobertos com lâminas (coverslipped) para microscopia óptica. Micrografias do tecido de

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57/63 granulação foram tiradas a 400X por 3 seções de cada animal. As células coradas positivamente foram contadas em cada micrografia para macrófagos M1 e linfócitos T. Contagens de células para 3 seções do mesmo animal foram calculadas em conjunto e expressas como células por área do ligamento. ANOVAs unidirecionais com uma análise post-hoc de LSD de Fischer foram realizadas usando o caleidográfo para avaliar diferenças estatísticas entre os grupos de tratamento. Um valor de p < 0,05 foi considerado significativo. Um valor de p < 0,15 foi considerado uma tendência no sentido de significância.

[150] Formou-se um revestimento nano-poroso uniforme na superfície da micropartícula, e a micropartícula revestida foi capaz de incorporar IL-Ra via ligação em solução. Micrografias eletrônicas de varredura das micropartículas β-TCP antes de revestimento mostram uma superfície lisa das partículas e aparência sinterizada (FIGURA 14A). Após 7 dias de incubação em FCSm, as micropartículas (MPs) apresentavam uma estrutura nanoporosa semelhante à placa (FIGURA 14B). Quando incubado em uma solução de 25 mg/ml de IL-Ra, conforme representado na FIGURA 14C, as micropartículas ligadas 104,4 ± 9,8 pg de IL-Ra/mg MP.

[151 ] Micropartículas elevaram com êxito concentração local de ILRa por pelo menos 14 dias em uma cicatrização de LCM em rato (FIGURA 15). Concentração tecidual de IL-Ra foi significativamente maior em LCMs tratados com MPs de IL-Ra (0,71 ± 0,07 pg de IL-Ra/pg de proteína total) em comparação com tratamento com IL-Ra solúvel (0,12 ± 0,07 pg de IL-Ra/pg de proteína total), MPs não carregadas (indetectáveis) ou controles tratados com PBS (indetectáveis) 7 dias após tratamento (FIGURA 15A). Adicionalmente, a concentração tecidual de IL-Ra 14 dias após tratamento foi significativamente superior em LCMs tratados com MP de IL-Ra (2,28 ± 0,06 pg de IL-Ra/pg de proteína total) em comparação com 7 dias após tratamento, indicando

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58/63 liberação sustentada das micropartículas por pelo menos 1 semana. Por 14 dias, nenhum IL-Ra foi detectado no LCM de qualquer animal. Encontrou-se coloração positiva vermelho de alizarina para MPs em todos os animais tratados com MPs não carregadas ou MPs de IL-Ra 7 e 14 dias após tratamento, indicando que as MPs permanecem no sítio da injeção 14 dias após administração (FIGURA 15C). Para examinar adicionalmente se IL-Ra permaneceu localizado no tecido quando transferido com MPs de IL-Ra, mediu-se a concentração sérica de ILRa. IL-Ra no soro foi significativamente elevado 1 dia após tratamento com MPs de IL-Ra (283,33 ± 174,62 pg/ml) em comparação com MPs não carregadas (indetectável; FIGURA 15B). Entretanto, não houve ILRa detectável no soro de qualquer animal em 7 e 14 dias após tratamento com MPs de IL-Ra.

[152] IL-Ra transferido com MPs foi biologicamente ativo e inibiu infiltração de células inflamatórias quando comparada com às micropartículas (MPs) não carregadas (FIGS. 16A-16C). Macrófagos pró-inflamatórios M1 foram elevados 7 dias após lesão em animais tratados com MPs não carregadas quando comparados com controles tratados com PBS, como esperado após injeção de um material estranho. Em contraste, concentração de macrófagos M1 em LCMs tratados com MPs carregadas de IL-Ra não foi significativamente diferente do que as de animais tratados com PBS, indicando que liberação de IL-Ra a partir das MPs foi capaz de inibir a infiltração induzida por MP de macrófagos M1. Administração local de IL-Ra solúvel isolado também diminuiu a concentração de macrófagos M1 em comparação com animais tratados com PBS. Por 14 dias póstratamento, não foram observadas diferenças na concentração de macrófagos M1 entre qualquer grupo de tratamento.

[153] Concentração tecidual de ambas das citocinas próinflamatórias IL-1 cz e IL-1 β foi maior (p < 0,05 para IL-1 oc e p < 0,15 para

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IL-1 β para todas as comparações) em animais tratados com MPs não carregadas em comparação com todos os outros grupos de tratamento 7 dias após lesão (FIGS. 17A e 17B). Em contraste, concentrações locais de IL-1oc e β em LCMs tratados com MP de IL-Ra não foram significativamente diferentes daqueles tratados com PBS ou IL-Ra solúvel 7 dias após tratamento. Por 14 dias, nenhuma diferença significativa foi observada na concentração de IL-1 β entre qualquer grupo de tratamento. IL-1 oc foi elevada em animais tratados com MPs de IL-Ra 14 dias após tratamento, quando comparados com animais tratados com MPs não carregadas (p = 0,03), IL-Ra solúvel (p = 0,04) e animais tratados com PBS (p = 0,06).

[154] Micropartículas não apresentavam impacto na formação de tecido de granulação, não induziram uma resposta imune adaptativa em comparação com IL-Ra solúvel e não induziram uma resposta sustentada de corpo estranho dentro do período de exame de 2 semanas. Coloração de H&E de seções de tecido (FIGURA 18A) demonstra que MPs não carregadas, IL-Ra solúvel e MPs de IL-Ra não apresentavam nenhum efeito na morfologia ou densidade do tecido de granulação e não afetaram o tamanho do tecido de granulação. O tecido de granulação e a área total do LCM foram menores 14 dias após lesão, em comparação com 7 dias após lesão em todos os grupos de tratamento.

[155] A densidade de linfócitos T de CD+ (FIGURA 18B) sugere que IL-Ra humana pode causar uma resposta imune adaptativa durante cicatrização de LCM em rato. O tratamento com IL-Ra solúvel humana em bolo no LCM em rato elevou significativamente a densidade de linfócitos T no tecido de granulação de LCM em comparação com todos os outros grupos de tratamento 7 dias após tratamento (FIGURA 18B). Interessantemente, as MPs não carregadas e as MPs de IL-Ra não apresentaram um impacto significativo na densidade de linfócitos T 7

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60/63 dias após tratamento. Por 14 dias, o tratamento de IL-Ra solúvel não apresentou efeito nos linfócitos T, entretanto, o tratamento com MPs de IL-Ra resultou em mais significativamente linfócitos T em comparação com os controles tratados com PBS 14 dias após tratamento.

[156] Micropartículas não induziram uma resposta sustentada detectável de corpo estranho em uma cicatrização de LCM em rato. Utilizou-se coloração de H&E para examinar células gigantes de corpos estranhos e células polinucleadas (PNCs) no tecido de granulação para cada tratamento (FIGURA 18C). Enquanto as micropartículas são evidentes na seção corada com H&E (partículas rosa-escuro), não foi observada localização de células gigantes de corpos estranhos e PNCs. Adicionalmente, não foi observado encapsulamento fibroso das micropartículas.

[157] Resultados apresentados neste relatório demonstraram que as micropartículas foram capazes de superar os desafios associados à transferência de IL-Ra, incluindo, a capacidade de transferir uma dose alta (104,98 pg de IL-Ra/mg de MP), elevar a concentração local de ILRa por pelo menos 2 semanas, enquanto se limita elevação sistêmica de IL-Ra e se mantém atividade anti-inflamatória da IL-Ra. Os resultados com transferência de IL-Ra em um ligamento curativo demonstram utilidade para tratamento de numerosas lesões e doenças inflamatórias locais.

[158] MPs de IL-Ra foram transferidas com uma dose solúvel em bolo de IL-Ra a partir da solução de ligação a fim de proporcionar uma alta dose inicial de IL-Ra que deve ser sequestrada por receptores de IL-1, seguido por uma liberação sustentada de IL-Ra a partir de MPs de IL-Ra para manter ocupação do receptor. Porque a massa total de ILRa administrada foi a mesma para grupos de tratamento de liberação em bolo e sustentada, uma concentração mais alta de IL-Ra nas MCLs tratadas com MPs de IL-Ra demonstra transferência prolongada de IL

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Ra a partir da MP. Adicionalmente, a concentração mais alta no LCM 14 dias após tratamento, quando comparada com 7 dias após tratamento, indica que as micropartículas continuam a transferir IL-Ra localmente após 7 dias in vivo.

[159] Em contraste com a concentração local, a IL-Ra no soro foi apenas detectável 1 dia após tratamento com MPs de IL-Ra. As micropartículas elevaram localmente IL-Ra no do tecido sem elevar a concentração sistêmica, o que pode eliminar os efeitos colaterais fora do alvo frequentemente associados à transferência terapêutica de proteínas para tratar patologias localizadas. Adicionalmente, as micropartículas permaneceram localizadas no LCM pela duração do estudo.

[160] Administração de micropartículas não carregadas aumentou significativamente a concentração de macrófagos M1 pró-inflamatórios em 7 dias, e colocalização de macrófagos nas micropartículas foi evidente (FIGURA 16C). Quando as micropartículas foram carregadas com IL-Ra, o aumento em macrófagos causado pelas próprias micropartículas foi melhorado e colocalização não foi observada, indicando que a IL-Ra transferida das micropartículas foi ativa e podia inibir localmente a inflamação. Ao mesmo tempo, o aumento de IL-1 α e IL-1 β a partir do tratamento com micropartículas não carregadas 7 dias após tratamento foi eliminado quando as micropartículas transferiram localmente IL-Ra.

[161] Micropartículas revestidas com minerais elevaram com êxito concentração de proteína local por um período de tempo prolongado quando comparada à aplicação da mesma quantidade de proteína solúvel isolada. Adicionalmente, a proteína transferida foi biologicamente ativa. Esses resultados demonstram a utilidade de micropartículas (MPs) transferir localmente proteína ativa para um tecido dinâmico, enquanto se limita a exposição sistêmica.

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62/63 [162] Os revestimentos minerais nanoestruturados de fosfato de cálcio descritos neste relatório proporcionam uma plataforma de liberação sustentada de agentes biologicamente ativos. As micropartículas revestidas com minerais oferecem um sistema de transferência injetável e localizada que pode reduzir a dose e os efeitos colaterais fora do alvo, quando comparadas com injeções em bolo de agentes ativos, particularmente, com agentes ativos apresentando meia-vida curta ou atividade reduzida quando modificadas, tais como por meio de encapsulação e/ou produzidas em proteínas de fusão. As formulações e os métodos descritos neste relatório permitem vantajosamente tanto efeito imediato do agente ativo que é transferido em sua forma não ligada, bem como, efeito sustentado do agente ativo por meio de adsorção do agente ativo a micropartículas revestidas com minerais que proporcionam liberação sustentada do agente ativo à medida que o revestimento mineral se degrada e libera o agente ativo.

[163] Micropartículas revestidas com minerais oferecem um sistema de transferência que pode liberar proteínas terapêuticas de maneira sustentável, enquanto se mantêm sua atividade biológica. Adicionalmente, essas micropartículas permanecem localizadas quando injetadas in vivo e oferecem um sistema de transferência de proteína localizado que pode permitir doses terapêuticas mais baixas quando comparadas à transferência sistêmica subcutânea ou intravenosa. A transferência localizada de proteínas terapêuticas pode também limitar seus efeitos fora do alvo. Propomos estudar a transferência de IL-Ra, uma proteína terapêutica que já se utiliza em clínica para tratar AR, mas que exige um regime de tratamento oneroso que limita seu uso como terapêutica de primeira linha para AR e outras aplicações clínicas em que pode ser possível benéfica, tal como inflamação localizada. Esperamos que transferência de IL-Ra usando micropartículas revestidas com minerais seja mais eficaz na inibição da

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63/63 inflamação induzida por IL-1 do que injeções subcutâneas em bolo de IL-Ra tanto em situações sistêmicas quanto localizadas. Liberação sustentada ou localizada de IL-Ra proporcionaria uso mais amplo desse promissor anti-inflamatório em muitas aplicações clínicas.

[164] Em vista do exposto acima, será observado que as diversas vantagens da invenção são obtidas e outros resultados vantajosos alcançados. Como várias alterações podem ser feitas nos métodos acima sem desviar-se do escopo da invenção, pretende-se que toda a matéria contida na descrição acima e mostrada nas figuras anexas seja interpretada como ilustrativa e não em um sentido limitante.

[165] Quando se introduz elementos da presente invenção ou várias versões, modalidade(s) ou aspectos da mesma, os artigos um, uma, o, a e referido pretendem significar que há um ou mais dos elementos. Os termos compreendendo, incluindo e apresentando pretendem ser inclusivos e significam que podem ser elementos adicionais diferentes dos elementos listados.

Claims (62)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Formulação para proporcionar um agente ativo, caracterizada pelo fato de que compreende:

   um veículo, em que o veículo compreende;

   pelo menos um primeiro agente ativo; e uma micropartícula revestida com mineral que compreende um revestimento mineral; e pelo menos um segundo agente ativo.
2. 2. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o segundo agente ativo é adsorvido ao revestimento mineral.
3. 3. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o segundo agente ativo é o mesmo como o primeiro agente ativo no veículo.
4. 4. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o segundo agente ativo adsorvido ao revestimento mineral é diferente do agente ativo no veículo.
5. 5. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro e o segundo agente ativo são adsorvidos ao revestimento mineral.
6. 6. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro agente ativo e o segundo agente ativo são: um antagonista de IL-1; antagonista de IL-1F2; um antagonista de IL-1 F3; um antagonista de IL-1 F4; um antagonista de IL1F5; um antagonista de IL-1F6; um antagonista de IL-1F7; um antagonista de IL-1 F8; um antagonista de IL-1 F9; um antagonista de IL1F10; um antagonista de IL-1 F11; um antagonista de IL-1 R; abatacept; rituximab; tocilizumab; anaquinra; adalimumab; etanercept; infliximab; certolizumab; golimumab; e combinações dos mesmos.
7. 7. Formulação, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o antagonista de IL-1 é um antagonista

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   2/8 de IL-1 recombinante.
8. 8. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o revestimento mineral compreende cálcio, fosfato, carbonato, e combinações dos mesmos.
9. 9. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o revestimento mineral compreende adicionalmente um halogênio.
10. 10. Formulação, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o halogênio é selecionado de flúor, cloro, bromo, iodo, estatina e combinações dos mesmos.
11. 11. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a micropartícula revestida com mineral compreende um núcleo escolhido de polímeros, cerâmicas, metais, vidro e combinações destes.
12. 12. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o segundo agente ativo é incorporado no revestimento mineral.
13. 13. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o veículo compreende pelo menos um do primeiro ou do segundo agentes ativos.
14. 14. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o segundo agente ativo é adsorvido ao revestimento mineral, incorporado no revestimento mineral, e combinações destes.
15. 15. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a micropartícula revestida com mineral compreende uma pluralidade de camadas de revestimento mineral.
16. 16. Formulação, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que as camadas de revestimento mineral são as mesmas da composição mineral.

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17. 17. Formulação, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que as camadas do revestimento mineral são diferentes das composições minerais.
18. 18. Formulação, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o segundo agente ativo é absorvido a uma camada do revestimento mineral, incorporado em uma camada do revestimento mineral, e combinações destes.
19. 19. Método de transferência (liberação) sustentada de pelo menos um agente ativo, caracterizado pelo fato de que compreende:

    administrar uma formulação compreendendo um veículo, em que o veículo compreende;

    pelo menos um primeiro agente ativo; e uma micropartícula revestida com mineral que compreende um revestimento mineral; e pelo menos um segundo agente ativo.
20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o segundo agente ativo é adsorvido ao revestimento mineral.
21. 21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o segundo agente ativo adsorvido ao revestimento mineral é o mesmo como a agente ativo no veículo.
22. 22. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o segundo agente ativo adsorvido ao revestimento mineral é diferente do primeiro agente ativo no veículo.
23. 23. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo agente ativo são adsorvidos ao revestimento mineral.
24. 24. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o primeiro agente ativo e o segundo agente ativo são: um antagonista de IL-1; antagonista de IL-1F2; um antagonista de IL1F3; um antagonista de IL-1F4; um antagonista de IL-1F5; um

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    4/8 antagonista de IL-1 F6; um antagonista de IL-1 F7; um antagonista de IL1F8; um antagonista de IL-1F9; um antagonista de IL-1F10; um antagonista de IL-1F11; um antagonista de IL-1 R; abatacept; rituximab; tocilizumab; anaquinra; adalimumab; etanercept; infliximab; certolizumab; golimumab; e combinações dos mesmos.
25. 25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o antagonista de IL-1 é um antagonista de IL-1 recombinante.
26. 26. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o revestimento mineral compreende cálcio, fosfato, carbonato, e combinações dos mesmos.
27. 27. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o revestimento mineral compreende adicionalmente um halogênio.
28. 28. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a micropartícula revestida com mineral compreende um núcleo escolhido de polímeros, cerâmicas, metais, vidro e combinações destes.
29. 29. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o segundo agente ativo é incorporado no revestimento mineral.
30. 30. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o veículo compreende pelo menos um do primeiro e do segundo agentes ativos.
31. 31. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o segundo agente ativo é adsorvido ao revestimento mineral, incorporado no revestimento mineral, e combinações destes.
32. 32. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a micropartícula revestida com mineral compreende uma pluralidade de camadas de revestimento mineral.

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33. 33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que as camadas de revestimento mineral são as mesmas da composição mineral.
34. 34. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que as camadas do revestimento mineral são diferentes das composições minerais.
35. 35. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o segundo agente ativo é absorvido a uma camada do revestimento mineral, incorporado em uma camada do revestimento mineral, e combinações destes.
36. 36. Método para tratamento de uma doença inflamatória em um indivíduo com necessidade deste, caracterizado pelo fato de que compreende:

    administrar uma formulação ao indivíduo, a qual compreende um veículo, em que o veículo compreende;

    pelo menos um primeiro agente ativo; e uma micropartícula revestida com mineral que compreende; um revestimento mineral; e pelo menos um segundo agente ativo.
37. 37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o segundo agente ativo é adsorvido ao revestimento mineral.
38. 38. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o segundo agente ativo e o primeiro agente ativo são os mesmos dos agentes ativos.
39. 39. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o segundo agente ativo e o primeiro agente ativo são diferentes.
40. 40. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o primeiro agente ativo e o segundo agente ativo é

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    6/8 escolhido de um antagonista de IL-1; antagonista de IL-1F2; um antagonista de IL-1 F3; um antagonista de IL-1 F4; um antagonista de IL1F5; um antagonista de IL-1F6; um antagonista de IL-1F7; um antagonista de IL-1 F8; um antagonista de IL-1 F9; um antagonista de IL1F10; um antagonista de IL-1 F11; um antagonista de IL-1 R; abatacept; rituximab; tocilizumab; anaquinra; adalimumab; etanercept; infliximab; certolizumab; golimumab; e combinações dos mesmos.
41. 41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o antagonista de IL-1 é um antagonista de IL-1 recombinante.
42. 42. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o revestimento mineral compreende cálcio, fosfato, carbonato, e combinações dos mesmos.
43. 43. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o revestimento mineral compreende adicionalmente um halogênio.
44. 44. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a micropartícula revestida com mineral compreende um núcleo escolhido de polímeros, cerâmicas, metais, vidro e combinações dos mesmos.
45. 45. Formulação, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que o segundo agente ativo é incorporado no revestimento mineral.
46. 46. Formulação, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que o veículo compreende um ou mais agentes ativos.
47. 47. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o segundo agente ativo é adsorvido ao revestimento mineral, incorporado no revestimento mineral, e combinações dos mesmos.

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48. 48. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a micropartícula revestida com mineral compreende uma pluralidade de camadas de revestimento mineral.
49. 49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que as camadas de revestimento mineral são as mesmas da composição mineral.
50. 50. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que as camadas do revestimento são diferentes das composições minerais.
51. 51. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o segundo agente ativo é absorvido a uma camada do revestimento mineral, incorporado em uma camada do revestimento mineral, e combinações destes.
52. 52. Micropartícula revestida com mineral, caracterizada pelo fato de que compreende um agente ativo, em que o agente ativo é adsorvido ao mineral, incorporado no mineral, e combinações destes.
53. 53. Micropartícula revestida com mineral, de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um núcleo.
54. 54. Micropartícula revestida com mineral, de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que o núcleo é escolhido de polímeros, cerâmicas, metais, vidro e combinações dos mesmos.
55. 55. Micropartícula revestida com mineral, de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que o revestimento mineral compreende cálcio, fosfato, carbonato e combinações dos mesmos.
56. 56. Micropartícula revestida com mineral, de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que o revestimento mineral compreende adicionalmente um halogênio.
57. 57. Micropartícula revestida com mineral, de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que a micropartícula

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    8/8 revestida com mineral compreende uma pluralidade de camadas de revestimento mineral.
58. 58. Micropartícula revestida com mineral, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que as camadas de revestimento mineral são as mesmas da composição mineral.
59. 59. Micropartícula revestida com mineral, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que as camadas do revestimento mineral são diferentes das composições minerais.
60. 60. Micropartícula revestida com mineral, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que o segundo agente ativo é absorvido a uma camada do revestimento mineral, incorporado em uma camada do revestimento mineral, e combinações dos mesmos.
61. 61. Método para tratamento de inflamação pós-cirurgia em um indivíduo com necessidade deste, o qual é caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma formulação ao indivíduo, em que a formulação inclui um veículo, incluindo, um agente ativo e uma micropartícula revestida com mineral, em que a micropartícula revestida com mineral compreende um agente ativo.
62. 62. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o agente ativo é escolhido de um antagonista de IL-1; antagonista de IL-1 F2; um antagonista de IL-1 F3; um antagonista de IL1F4; um antagonista de IL-1F5; um antagonista de IL-1F6; um antagonista de IL-1 F7; um antagonista de IL-1 F8; um antagonista de IL1F9; um antagonista de IL-1F10; um antagonista de IL-1F11; um antagonista de IL-1R; abatacept; rituximab; tocilizumab; anaquinra; adalimumab; etanercept; infliximab; certolizumab; golimumab; e combinações dos mesmos.