BR112019019440A2 - vacina contra febre tifoide a base de vesículas de membrana externa de duas cepas diferentes de espécies de salmonella tifoide - Google Patents
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Abstract
um novo produto usado como potente vacina para o tratamento de febre tifoide, compreendido de vesículas de membrana externa (omvs) isoladas tomadas de duas diferentes cepas de espécies de salmonella tifoide.
Description
VACINA CONTRA FEBRE TIFOIDE A BASE DE VESÍCULAS DE MEMBRANA EXTERNA DE DUAS CEPAS DIFERENTES DE ESPÉCIES DE SALMONELLA
TIFOIDE
Campo da invenção:
[0001] A presente invenção se refere a um novo produto para uma potente vacina para febre tifoide, compreendida de cepas especificas de Salmonella Typhi e Salmonella Paratyphi A em igual proporção.
[0002] A presente invenção também se refere a uma metodologia para o preparo do referido novo produto a base de vesículas de membrana externa (da expressão em inglês outer membrane vesicles - OMVs). Antecedentes e estado da técnica da invenção:
[0003] A febre tifoide, uma séria infecção bacteriana invasiva, causada por Salmonella enterica sorovar Typhi e Paratyphi A (doravante, S. Typhi e S. Paratyphi A, respectivamente) é um fardo global principal em países desenvolvidos e em desenvolvimento, como a índia. Embora a S. Typhi seja mais prevalente, afeta 21,7 milhões de casos e 200.000 mortes por ano ao redor do mundo, a S. Paratyphi (A, B e C) pode causar febre tifoide significativa especialmente na Ásia, bem como em viajantes que retornam destas áreas endêmicas (1, 2, 3). Hoje em dia, existem apenas duas vacinas licenciadas disponíveis contra S. Typhi; um mutante galE atenuado vivo e uma vacina de polissacarídeo Vi (4). Embora um tanto eficazes, elas apresentam suas limitações, tais como não fornecerem proteção a longo prazo em crianças e não fornecerem imunidade significativa a longo prazo em adultos também.
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2/33 [0004] No momento, o foco da pesquisa de vacinas está em vacinas acelulares devido as determinadas desvantagens dos imunógenos convencionais. Neste estado em mutação da pesquisa de vacinas, as vesículas de membrana externa (OMVs) ganharam importância significativa. A vacina licenciada a base de OMVs de Neisseria meningitis está, neste momento, disponível no mercado (5). Como as OMVs apresentam ambas LPS e proteínas, elas não necessitam de quaisquer adjuvantes artificiais (6).
[0005] Embora as OMVs sejam usadas no desenvolvimento de medicamentos contra diversos microrganismos, tais métodos são, muitas vezes, caros e complicados, uma vez que a maioria das técnicas empregam a infusão de diferentes proteínas externas.
[0006] Como a febre tifoide é mais predominante em países em desenvolvimento, a rentabilidade econômica deve ser a preocupação principal no campo do desenvolvimento de vacinas.
[0007] Além disso, a tecnologia convencional é, muitas vezes, desprovida de fornecer proteção substancial contra a febre tifoide causada por S. Typhi e também resulta em alguns efeitos colaterais prejudiciais em humanos.
[0008] Logo, sempre existe uma necessidade de fornecer uma formulação inovadora pelo uso de um processo a base de vesículas de membrana externa (OMV) as quais estão superando as desvantagens da prática convencional.
[0009] A presente invenção atende a necessidade sentida a muito tempo acima mencionada.
Objetivos da invenção:
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3/33 [0010] 0 principal objeto da presente invenção é fornecer um simples, porém eficaz produto compreendido de vesículas de membrana externa (OMVs) isoladas de Salmonella Typhi e Salmonella Paratyphi A em igual proporção.
[0011] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um produto o qual é eficaz no tratamento da febre tifoide.
[0012] Ainda, outro objetivo da presente invenção é fornecer um produto simples em que qualquer mutação ou deleção do gene não tenha sido adotada para fornecer o produto final.
[0013] Um objetivo adicional da presente invenção é fornecer um simples produto em que a mutação ou deleção do gene não está incorporada para reduzir a expressão de antígenos não protetores imune dominantes.
[0014] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um simples produto em que nenhum antibiótico ou quaisquer excipientes tenham sido usados.
[0015] Ainda, outro objetivo da presente invenção é fornecer um simples produto em que nenhuma proteína protetora externa seja incorporada.
[0016] Um objetivo adicional da presente invenção é fornecer um produto simples em que apenas OMVs isoladas de cepas de Salmonella são usadas, logo, é econômico e amigável para o meio ambiente.
Breve descrição das figuras anexas:
[0017] Deve ser notado que, no entanto, as figuras anexas ilustram apenas concretizações típicas da presente matéria e não devem, dessa forma, ser consideradas para a
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4/33 limitação do seu escopo, uma vez que a invenção pode admitir outras concretizações igualmente eficazes. A descrição detalhada é descrita com referência às figuras anexas.
[0018] Algumas concretizações do sistema ou métodos de acordo com as concretizações da presente matéria são agora descritos, para fins de exemplos, e com referência às figuras anexas, nas quais:
[0019] A Figura 1 e la ilustram uma micrografia eletrônica das OMVs ligadas à bactéria e OMVs isoladas e a caracterização das OMVs isoladas.
[0020] A Figura 2a ilustra a imunização de camundongos pelo produto.
[0021] A Figura 2b ilustra o regime de imunização e desafio em camundongos.
[0022] A Figura 3 ilustra uma análise representativa de ímmunoblot contra OMVs, a partir de duas cepas tifoidais.
[0023] A Figura 4 ilustra uma análise Dot blot contra LPSs extraídas a partir de duas cepas tifoidais.
[0024] A Figura 5 ilustra uma comparação de titulações de imunoglobulina sérica em soros imunizados separadamente medidos contra cada componente das OMVs de formulações de OMV bivalente e eliminadas por calor (HK) .
[0025] A Figura 5a ilustra titulações de imunoglobulina sérica em soros imunizados separadamente medidos contra cada componente das OMVs de formulações de OMV bivalente.
[0026] A Figura 6 ilustra que as BOMVs induzem a produção de citocinas de polarização Thl e Thl7 em BMDCs apresentadoras de antígeno e células esplênicas após o
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5/33 tratamento .
[0027] A Figura 7 ilustra que o soro de camundongos bivalentes imunizados inibe a motilidade da S. Typhi e S. Paratyphi A.
[0028] A Figura 8 ilustra que a imunização com as OMVs bivalentes fornece proteção em modelos de camundongos adultos.
[0029] A Figura 9 ilustra a colonização em isolados clínicos de Salmonella Typhi e Paratyphi A em OMVs monovalentes de camundongos imunizados com Salmonella Typhi.
[0030] A Figura 10 ilustra a colonização em isolados clínicos de Salmonella Typhi e Paratyphi A em OMVs monovalentes de camundongos imunizados com Salmonella Paratyphi A.
[0031] A Figura 11 ilustra a avaliação do efeito das OMVs isoladas de uma cultura de 24 horas.
[0032] A Figura 12a ilustra a classificação das proteínas associadas a OMVs de Salmonella Typhi com base em sua localização de aparecimento na bactéria.
[0033] A Figura 12b ilustra a classificação das proteínas associadas a OMVs de Salmonella Parathyphi A com base na sua posição na bactéria.
[0034] A Figura 12c ilustra proteínas associadas a OMVs .
Descrição detalhada da invenção:
[0035] A presente matéria se refere a uma nova formulação compreendida de vesículas de membrana externa isoladas de duas cepas de Salmonella tifoidal, tais como Salmonella Typhi C-6953 e Salmonella Paratyphi A C-6915.
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6/33 [0036] Nas referidas formulações, duas cepas de Salmonella são misturadas em uma proporção de 1:1, isto é, 50 % de Salmonella Typhi C-6953 e 50 % de Salmonella Paratyphi A C-6915.
[0037] A imunogenicidade e eficácia protetora foram estudadas em camundongos adultos após a imunização oral com a referida formulação.
[0038] A avaliação da geração de células humorais, bem como resposta imune mediada por células após imunização oral, pela medida de diferentes marcadores imunológicos bem como imunoglobulina especifica de soro antipolissacarídeo Vi e resposta de citocina específica Thl/Thl7 a partir de células esplênicas e CDs (células dendríticas) foram realizadas.
[0039] Esta vacina a base de OMVs bivalentes pode ser uma candidata a vacina humana ideal contra febre tifoide.
[0040] As cepas as quais são usadas na referida formulação são isolados clínicos e, dessa forma, não apresentam qualquer modificação ou mutação induzida nas mesmas.
[0041] A mutação de um gene específico para a superexpressão de antígenos protetores pode reduzir o antígeno não protetor imunodominante por mutação ou deleção. Além disso, as LPSs mutantes podem apresentar alguns efeitos adversos no produto final; isto é, as OMVs secretadas. A mutação de um gene também altera a composição genética bacteriana e pode eventualmente produzir um tipo específico de proteína que não é necessária. Muitas outras proteínas úteis podem ser perdidas no processo.
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7/33 [0042] Porém, a referida formulação não altera a composição genética do microrganismo e, dessa forma, nenhuma proteína indesejada é produzida.
[0043] Nenhum estresse foi induzido nas bactérias cultivadas na forma de antibióticos ou usando meio mínimo, o que eventualmente aumenta a relação custo-eficácia do produto final.
[0044] Além disso, a referida formulação não incorpora antibióticos na mesma. Logo, reduz as chances de disseminar resistência antimicrobiana.
[0045] Diferente da prática convencional, a presente invenção não adiciona qualquer proteína externa ou quaisquer outros excipientes tais como lactose, sacarose, gelatina, sorbitol, albumina humana sérica e, dessa forma, esta é livre de etapas de purificação após o isolamento.
[0046] A partir da análise do produto, foi descoberto que o produto ainda compreende um número substancialmente alto de proteínas externa, interna, periplasmática e citoplasmática, as quais não foram infundidas de fora, mas foram encontrados naturalmente presentes.
[0047] O mesmo ainda possui alto número de proteínas citosólicas (até mesmo proteínas tipo DNA polimerase III, helicase, primase).
[0048] Quaisquer cepas mutantes não foram usadas na nova formulação, a presente invenção apenas utiliza sua forma nativa para distribuir seu conteúdo natural no corpo do hospedeiro.
[0049] Além disso, uma agenda de imunização eficaz de curta duração pode ser alcançada pela nova formulação. A
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8/33 proteção pode permanecer por 3 a 6 meses sem quaisquer doses de reforço além do regime indicado.
[0050] O processo para o preparo do novo produto utilizou cultura de bactérias na fase logaritmica para isolar OMVs, assim, aumentando a quantidade de proteínas TTSS as quais são mais potentes na natureza como um imunógeno.
[0051] Além disso, de acordo com a presente invenção, as OMVs contêm o polissacarídeo Vi de Salmonella Typhi. O conteúdo do polissacarídeo Vi na formulação bivalente foi medido. A presença de polissacarídeo Vi nos constituintes da vacina tornam a vacina mais eficaz contra infecção por Salmonella Typhi, uma vez que a Salmonella Typhi está coberta com os polissacarídeos Vi, a presença de antibióticos antiVi no soro iria, certamente, elevar o nível de proteção. A presença de OMVs do Paratyphi A aumenta ainda mais sua natureza protetora contra o Paratyphi A.
[0052] O resultado detalhado foi fornecido abaixo:
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9/33 [0053] Proteínas hipotéticas encontradas após MALDITOF/TOF de OMVs de Salmonella Typhi C-6953:
| Sequência de aminoácidos | Proteínas hipotéticas encontradas após o BLAST de proteínas |
| IITNVFLNAK | Permease |
| LTASLLLIYAK | Proteína B induzível pelo paraquat |
| YEKNWFLPIVTIGK | Proteína B induzível pelo paraquat |
| MLTASLLLIYAKNNGITLLVTK | Permease |
| DDLLSRINR | Proteína hipotética (gammaproteobacteria) |
| GFSVPTPIQR | rRNA (citidina-2'-0)- metil transferase |
| GFSVPTPIQRK | Proteína TraB de transferência conjugal |
| FKPQE TIFE LGPKGK | Proteína não caracterizada |
| IQE ILVGI TFLIAIAFIVK | Aminopeptidase N |
| IQE ILVGI TFLIAIAFIVKK | Aminopeptidase N |
| MIQE ILVGI TFLIAIAFIVK | Endonuclease |
| MLLALARLK | Transportador MFS |
| PNILPTLPTLR | Subunidade redutase do nitrato respiratório |
| MPNILPTLPTLR | Transportador ABC C4dicarboxilato |
| PNILPTLPTLRILPTLPILR | Subunidade beta da DNA polimerase III |
| VLVIGDLR | Regulador GlrR da resposta |
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10/33
| do sistema de dois componentes | |
| VDKGIVSLDR | DNA primase |
| MVRLLLGDGK | Fosfatidil serina / Fosfatidil glicerofosfato / cardiolipina sintase |
| LVIQGFVKGVMHWWE GGK | Glutaminil-tRNA sintetase |
| ETPIQEEVKPLIEDILRTK | Metaloprotease dependente de ATP |
| MVEIAAVRGR | Fosfoglicerato mutase independente de 2,3bifosfoglicerato |
| VMELAKAALR | Enoil-[proteína carreadora de acil] redutase |
| ETIEAALAQR | Transglicosilase |
| DDIEARAIAK | Proteína repressora de f agos |
| QIEAAKPK | Integrase |
| ILTVGKYPLMTL | tRNA pseudouridina sintase |
| LLDGNGLYLYVPVSGK | Transportador de antibiótico putativo |
| KFFVTDK | Proteína que determina forma de bastão (ZapE) |
| ESLTLETVLK | Fosfoenol piruvato carboxilase |
| EIETLLTVQAPR | Enzima de restrição tipo II (subunidade metilase) |
| SEPLWRTLIGIR | Cadeia A de ATPase transportadora de potássio |
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11/33
| DKIYGILGLLNEK | Carboxi-S-adenosil-Lmetionina sintase CmoA |
| DGD TIAIIAGMGRAAILR | Dihidroxi ácido desidratase |
| VPITYHGFLMHSRGTIHIR | Regulador transcripcional AsnC |
| GFAGVATPMIRDGDTIAIIAGMGR | Proteína do sistema de secreção tipo II GspE |
| AFYMHLPAAGK | Regulador transcripcional da família AbrB |
| KLLTILNAMLR | Transportador da família glicosídeo - pentosídeo hexuronídeo |
| LLTILNAMLRK | Transportador de açúcar |
| MAALWTWFNPVIKAFYMHLPAAGK | Asparaginil-tRNA sintetase |
| IDWIASQIR | Proteína da cauda do fago |
| KIDWIASQIR | Proteína da cauda do fago |
| QLNDLLKIIFFNVIR | Symporter glutamato / aspartato:próton GltP |
| GIVDPDLR | Transposase |
| MVELLDLIR | Proteína de efluxo de magnésio e cobalto CorC |
| VASE SRAWLQVDSLLK | Proteína SI ribossomal 30S |
| LLVTVALAFLLVLVMAIFSIRSVMR | Permease (transportador ABC) |
| LSASADLLRR | Subunidade F da enterobactina sintase |
| MLQSIFTALLGR | 3-desidroquinato sintase |
| LQSIFTALLGRLSASADLLR | Subunidade F da enterobactina sintase |
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12/33
| DDEILDLLR | Helicase |
| ENGIKTWNK | Proteína de repetição de domínio tipo Ig |
| IITNVFLNAK | Permease (permease de nucleosídeo) |
| LTASLLLIYAK | Permease (transportador MFS) |
| YEKNWFLPIVTIGK | Subunidade redutase do nitrato respiratório |
| MLTASLLLIYAKNNGITLLTK | Permease |
| DGQDLVISVR | Fosfatase da proteína Ser / Thr |
| IVAPTQRIDSR | Proteína estrutural |
| QLLRDVSHELR | Sensor de histidina quinase do sistema de dois componentes cpxa |
| LQALIGSQRQLLR | Helicase de restrição tipo III |
| LPLAGPASRTSDDLASH | Isocorismato sintase EntC |
| APGQTAAGHGLGLAIARR | Sensor de histidina quinase do sistema de dois componentes |
| DHGPGVADEHLPQLSEPFFRAPGQ TAAGHGLGLAI | Sensor de histidina quinase do sistema de dois componentes PhoR |
| YFDAARSYGR | Glicosidade da família 31 |
| VGLSLSGPQQAAVLR | Quitinase secretada |
| GMAEAPQVYWTTR | Prepilina peptidase |
| PHTLGNSGPAGTSLGLGLAALGRP | Nenhuma correspondência de |
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13/33
| GYITLGRAGDMGPDR | sequência encontrada |
| AALLIMLYSGK | Transportador MFS |
| NNMQQLAKPEK | ATPase T6SS da família ClpVl |
| ME IAE SIEATRQSVIR | Proteína contendo o domínio diguanilato fosfodiesterase cíclico (EAL) |
| MFQVLERAALLIMLYSGK | Isocorismatase |
| NNMQQLAKPE KVYLDNMNLMYA LSSSADIGNIR | Nenhuma correspondência de sequência encontrada |
| TLLDGDLQHRIR | Transportador de peptídeo |
| ATNNLAAT TE AVAAGADR | Dipeptidase não específica do citosol |
| D PLGGPGKPVWAE WSVWAK | Oxidoredutase |
| D PLGGPGKPVWAE WSVWAKATN NLAAT TE AVAAGADR | Nenhuma correspondência de sequência encontrada |
| LGVSVATIER | Regulador transcripcional GalR |
| AVLIEAIEQIDR | Proteína de membrana interna |
| LTYPEIALRLGVSVATIER | Regulador transcripcional da família LysR |
| LPSRADAEDVTSE TFAQWENK | Subunidade 2aminoetilfosfonato da permease do transportador ABC |
| AYLQSLMLMPEASVLS PE E RAVLI EAIEQIDR | Nenhuma correspondência de sequência encontrada |
| ETLEGVINAR | Lipoproteína SsaJ T3SS |
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14/33
| ETLEGVINARAK | Proteína de secreção do anel da membrana interna tipo III da família EscJ / YsedJ / HrcJ |
| LMVWERYPELK | Regulador transcripcional |
| GIVDPDLR | N-acetil-D-glicosamina quinase |
| MVELLDLIR | Proteína de efluxo de magnésio e cobalto CorC |
| VSRGIVALSNGMNALAK | Proteína de ligação de DNA |
| LLVTVALAFLLVLVMAIFSIRSVMR | Permease do transportador ABC de aminoácido |
| ILSTTVPVYGR | Sensor de histidina quinase do sistema de dois componentes |
| QGVFKMSYHIR | Proteína formadora de canal Tsx específica para nucleosídeo |
| RIAYDVHGQALYAI SR | Glicosidase periplasmática |
| IVEFFEKNFPGITPDLIPTDNLQK | Proteína ligante de ATP do transportador ABC |
| DNLSLSYAMQQKELPDTPQAIVED YLEQYTK | Nenhuma correspondência de sequência encontrada |
| HTVTALSR | Proteína hipotética (proteína de quimiotaxia que aceita metil) |
| VAIVGAGGTVGSFLAAALLKTGK | Permease CysW transportadora de sulfato |
| AGVPYIMPNGYAGDIE HVKFGQD | Nenhuma correspondência de |
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15/33
| VMLGPVAQANR | sequência encontrada |
| MFAE TVI GAPHGI LVSR | Proteína efetora SseC da ilha de patogenicidade 2 |
| FAE TVI GAPHGI LVSRITVYLSNAK | Proteína de membrana interna |
| MFAE TVI GAPHGI LVSRI TVYLSNAK | Proteína de membrana interna (proteína GntR/RmiB) |
| IQEILVGITFLIAIAFIVK | Aminopeptidase N |
| RGQPALSR | Proteína de divisão celular FtsN |
| GQPALSRR | Subunidade A da dimetil sulfóxido redutase aeróbica |
| CRLQQATLTD | Proteína PqiB induzível pelo paraquat |
| LVITLRDYGR | Arginina descarboxilase |
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16/33 análise de Salmonella
Paratyphi A OMV <C\ s ,^χΟ'
[0054] Proteínas hipotéticas encontradas após MALDITOF/TOF de OMVs de Salmonella Typhi A C-6915:
| Sequência de aminoácidos | Proteínas hipotéticas encontradas após o BLAST de proteínas |
| LDCTEGLDYCCICCPK | Proteína moduladora de transposon tn21 (putativa) |
| MIGHCKLDCTEGLDYCCICCPK | Hidrolase dependente de metal ou nucleosidase AMP |
| WQHLINDLQNDRSVDDEPGTYR | Fosfotriesterase ou proteína ligante de substrato do transportador ABC |
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17/33
| MSEQLHGNMHYLLTSETYNGILVR | Fumarato hidratase FumA |
| MDEWMDGRQSLAEE TSM | Proteína ligante de ATP do transportador ABC de açúcar |
| ILALYCVTVMEAHEIVGVEWGMNR | Enterohemolisina |
| LLLIAHK | Proteína do aparelho de exportação do sistema de secreção tipo III da família EscV/YscV/HrcV |
| HNSTSSSTTPNQREGGPLSGIFLSFGK | Fator de virulência SrfB |
| TAGQLINWGMPTLAAEMLNALDCQR | Quinolinato sintase |
| IAVSWAMPWL TQYD SVMATVMGD S | Helicase dependente de ATP |
| IKEANEALIDAHNTQTGMLTEEAR | Chaperone molecular DnaJ |
| EANE LSMQQTMMLIMNAGNAKAFAK | Proteína hipotética IT63_07870 ou proteína hipotética SSPA0931 ou proteína hipotética GZSPA 0913 |
| LWYCMMFGVTVATIYGAALILMV | Ribosídeo transportador de nicotinamida PnaC |
| GDPSAAVTIADIAMRAHDAGDLPE GIE GG | Proteína de defesa do estresse oxidativo (Lidonato-5-desidrogenase) |
| MD IMINAS FLPH TD PE ASLA.FYR | Subunidade K da oxidoredutase NADHquinona |
| VQASGAEVMQE PTDQPWGARDCAFR | Molibdopterina molibdênio transferase MoeA |
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18/33
| YRSAPQAASAGSPTSPPASMQPTPSTSAS | Proteína da família do symporter sódio:soluto |
| ELRNSFIMDQDNQAAFINTHYK | Endonuclease ou guanosina monofosfato redutase |
| SLHEDTIDPIENEADHLFIIRNSK | UDP-4-amino-4-desoxi-L- arabinose oxoglutarato aminotransferase |
| DNVQCAPSGKAAITVSFVLEMDFR | Hidrolase putativa / dobra da hidrolase |
| MNSRPPFPSTSSPPSQPSPYRYLGR | Aspartato racemase |
| QRAGAGNGE TGASGVGEQQANPLFNLK | Proteína fimbrial SthA |
| THE EAYAAAVE E FEANPPQVQRGK | Proteína de supressão SecY/SecA |
| GKKPLKPYEGDMPFFDNGDGTTTFK | Glicosil transferase putativa |
| LICKASSAQGCSPS TTLNQNFMQK | Proteína de recaptação do potássio da família TrkH |
| AS SAQGCS PS T TLNQNFMQKGILE CR | Proteína gancho flagelar FlgE |
| ALLGKMER | Proteína de divisão celular ZapB |
| FFRGSSQQSSGNPATDFFTVASPLPAAN | Proteína usher de membrana externa |
| ΗICFEIE SYMFRIAFHDFFLPS | Permease ABC transportadora de maltose MalF |
| MILLHKYSIPACSCFQNIYALNTK | L-serina desidratase I |
| MACWSHQENQDCASLTPE TFLPR | Subunidade da ferredoxina H formato desidrogenase |
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19/33
| VEAARSER | Succinil-diamino pimelato desuccinilase |
| MACSE QE GVGS PDE E ALFASQE GVK | Tirosina recombinase XerC |
| NLCTQPDGGYLTDEGIQMAER | Proteína da família ImpE |
| VDGYTWWDPE TDMWWAGGR | Receptor dependente de TonB |
| MRIPSTGR | Transglicosilase lítica |
| LAVSAWLLAALSVQGVR | Symporter do próton Glu/Asp GltP |
| MEPSNVLK | Proteína efetora SseD da ilha de patogenicidade 2 |
| VIAEQEGADSFVCQLAAWLHDLADDK | Proteína da família DedA ou proteína de membrana putativa |
| MGHME RS FVSE DWAGLASWR | Permease do transportador ABC de molibdato |
| S FVSE DWAGLASWRC TC TDVDLGLR | Proteína hipotética(MdtB) |
| MAPWERK | Proteína de membrana (permease) |
| NALFTPVR | Proteína ligante de substrato do transportador ABC |
| QMTAGMADIMGTSGLAWHQWK | Proteína de montagem de haste flagelar / muramidase FlgJ ou Lfuculoquinase |
| MITQRLR | Proteína de ligação do ATP do transportador ABC de cisteína / glutationa |
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20/33
| / permease CydC | |
| MPLAEGVTGEGRDTQSRPVGDDLDLTR | Glicerato 2-quinase |
| KILTEDYVNLVK | Subunidade B do DNA topoisomerase IV |
| SQLNFYDTSVYNFIKSLDYAEVER | Helicase ou repressor transcripcional RbsR |
| NQCNILR | Helicase associada a CRISPR / endonuclease Cas3 |
| MLFFYQLPFIIPIPSMQGNTFSR | Proteína de quebra flagelar |
Cepas bacterianas e condições da cultura [0055] Antigenos de OMV foram preparados a partir de S. Typhi C-6953 e S. Paratyphi A C-6915, e S. Typhi C-6946 e S. Paratyphi A BCR 148 foram coletadas para o estudo de desafio a partir do banco de cultura do Instituto Nacional de Cólera e Doenças Entéricas (NICED). Todas as cepas foram mantidas em 20 % de glicerol em caldo de infusão cérebro coração (Difco, USA) a 80 °C. Antes da experimentação, cada cepa foi crescida em caldo de Tryptic Soy (TSB; Difco, USA) a 37 °C sob condições de agitação (100 rpm) ou em placas em ágar Tryptic Soy (TSA; Difco, USA) .
Preparo de OMVs [0056] As OMVs foram preparadas a partir de duas cepas de Salmonella entenca com leves modificações, em que as células foram crescidas a 37 °C sob condição de agitação seguida de centrifugação a 8000 rpm por 40 minutos a 4 °C. Após a filtração em filtros bacterianos de 0.22 pm (Millipore, USA), as OMVs foram subsequentemente purificadas
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21/33 por ultra centrifugação (4 h, 140.000 x g, 4 °C) usando um rotor Sorvall T-865 e ressuspendidas em salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7.4). A concentração da proteína foi determinada pelo kit de ensaio de proteína Lowry (Pierce, USA) . A concentração do LPS O-Ag foi determinada por um método usado por Dubois et al.
[0057] A Figura 1 ilustra a micrografia eletrônica de OMVs ligadas à bactéria e OMVs isoladas e a caracterização das OMVs isoladas. A. i. OMVs ligadas à bactéria S. Typhi e A. ii. OMVs isoladas de S. Typhi. B. i. OMVs ligadas à bactéria S. Paratyphi A e B. ii. OMVs isoladas de S. Paratyphi A.
[0058] A Figura la ilustra C. Tamanho das OMVs isoladas. As OMVs de S. Typhi mostraram-se ser muito maiores do que as OMVs de S. Paratyphi A.
Coloração negativa das OMVs e bactérias que secretam OMVs [0059] Uma alíquota de 5 pL de OMVs secretadas foi posicionada em uma grade revestida de carbono e deixada por 1 minuto para a absorção adequada. A grade foi, então, lavada com duas gotas de tampão Tris-HCl. Após a secagem do fluido em excesso, a amostra foi corada com 2 % de solução aquosa de uranil acetato. No caso de coloração negativa OMVs secretoras de bactérias, o mesmo procedimento foi seguido com células bacterianas vivas em fase logarítmica. Ambas as OMVs negativamente coradas e OMVs secretoras de bactérias foram observadas na Tecnai 12 (tal como dado na Figura 1).
[0060] A Figura 2a ilustra os camundongos BALB/c que foram imunizados por gavagem oral no dia 0 e, depois, duas
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22/33 doses subsequentes de reforço seguem como indicado. Os camundongos foram desafiados no dia 35 através de um modelo de desafio intraperitoneal.
[0061] A partir da Figura 2b, os regimes de imunização e desafio em camundongos pode ser claramente entendido. Os camundongos foram imunizados nos dias 0, 14 e 28 e desafiados em 35 dias após a Ia imunização. O sangue
| foi coletado a [0062] | partir dos dias Os experimentos | indicados. | |||
| os quais | foram realizados | são | |||
| dados abaixo: Animais [0063] | Camundongos BALB/c com 7 | semanas de | idade | de | |
| ambos os sexos | foram tomados da | divisão | de recurso | animal | do |
NICED, Kolkata. Camundongos machos e fêmeas foram enjaulados separadamente em grupos de 10 e mantidos em uma temperatura de 25 °C com umidade de 75%. Os camundongos foram alimentados com comida e água estéril. Todos os experimentos animais foram conduzidos seguindo o procedimento operacional padrão conforme delineado pelo Comitê de Propósito de Controle e Supervisão de Experiências em Animais (sigla em inglês CPCSEA), Ministério do Meio Ambiente e Floresta, Governo da índia. O protocolo experimental animal foi aprovado pelo Comitê Institucional de Ética Animal do NICED com a aprovação do projeto n° PRO/108, maio de 2014 - julho de 2017.
Imunização oral [0064] Camundongos BALB/c fêmeas com 7 semanas de idade foram mantidas de estômago vazio 24 horas antes da data da imunização, água ad libitum. Os camundongos foram imunizados oralmente nos dias 0, 14 e 28 (Figura 2) com 25
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23/33 pg de OMVs de S. Typhi e S. Paratyphi A (1:1) purificadas em 200 pL de PBS seguindo o protocolo tal como previamente explicado .
Coleta de soro e fezes [0065] O sangue foi coletado a partir da veia caudal lateral em diferentes intervalos de tempo nos dias 0, 14, 21, 28, 35, 78 e 90 da primeira imunização oral. O sangue coletado foi tomado em BD Mícrotaíner (BD, NJ, USA) seguido de centrifugação (1000 rpm, 10 min e 4 °C) . As fezes dos camundongos imunizados e não imunizados foram coletadas em um Eppendorf asséptico por pressão da região abdominal. As fezes foram, então, homogeneizadas por um homogeneizador plástico e centrifugadas a 10000 x g por 10 min para remover os detritos. O sobrenadante foi coletado e armazenado.
[0066] Os resultados da análise ímmunoblot representativa contra as OMVs de duas cepas tifoidais são dadas na figura 3. A. perfil SDS-PAGE das OMVs extraídas de duas cepas de Salmonella tifoide. Linha M: marcador de baixo peso molecular (Bangalore GeNei), Linha 1: S. Typhi, Linha 2: S. Paratyphi A.B. ímmunoblot contra cada componente das OMVs da formulação bivalente sondada com OMVs antibivalentes de soro de camundongos de 28 dias. Linha M: marcador de baixo peso molecular pré-corado (Bangalore Genei), Linha 1: S. Typhi, Linha 2: OMVs de S. Paratyphi A.
SDS-PAGE e ímmunoblot [0067] O teor de proteína das OMVs recuperadas a partir das cepas de Salmonella foram determinadas tal como descrito anteriormente neste documento. 80 pg de proteínas foram fervidas em 5x de tampão SDS-PAGE e carregadas em um
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24/33 gel de 12 % de SDS-PAGE. 0 gel foi, então, corado tanto por Coomassie ou coloração com prata. Para o ensaio immunoblot, o gel foi transferido em uma membrana de nitrocelulose (BioRad, USA) pelo uso do aparelho de blot ATTO AE-6687 (Japão). 0 anticorpo policlonal aumentou em camundongos e o IgG secundário anti-camundongo de coelho conjugado ao HRP foi usado para detectar as proteínas que eram imunogênicas.
[0068] A Figura 4 ilustra análises dot blot contra LPSs extraídos de duas cepas tifoidais. Linha 1: LPS de S. Typhi, Linha 2: LPS de S. Paratyphi A.
[0069] Aqui, 1, 2 e 3 denota três diferentes concentrações de LPSs contra os quais a análise dot blot foi realizada. Ensaios Dot blot [0070] A análise Dot blot foi realizada tal como descrito previamente. Brevemente, as LPSs das duas cepas foram tomadas e coradas em uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi, então, lavada com salina tamponada com Tris (TBS) contendo 0.1 % de Tween-20. A membrana foi, então, incubada com anticorpos primário e secundário sucessivamente, em que o soro dos camundongos imunizados com OMVs atuou como um anticorpo primário e a coloração foi, então, finalmente desenvolvida por quimiluminescência.
ELISA [0071] Diferentes imunoglobulinas; por exemplo, IgG e seus subtipos (IgGl, IgG2a, IgG3) e IgA, slgA e IgM foram medidos por ELISA tal como indicado por Keren (23). Brevemente, poços de micro titulação de poliestireno descartáveis (Nunc, Dinamarca) foram separadamente
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25/33 revestidos com OMVs (5pg/poço) a partir tanto de cepas de imunógenos (Tabela 1) e incubados por 18h a 4 °C. Os poços foram lavados e bloqueados com albumina de soro bovino (BSA; Sigma Chemical, EUA) . Após a lavagem dos poços com PBS-T (PBS com 0.5 % de Tween-20, Sigma Chemicals, EUA) e incubadas com amostras de soro diluídas serialmente, 100 pL de imunoglobulina de cabra anti-camundongo conjugada com HRP foi adicionada e incubada. Após a lavagem com PBS, o substrato O-fenil-diamina (OPD) foi adicionado a cada poço seguida pela parada da reação após 10 min pela adição de 100 pL de ácido sulfúrico 2N. OD492 foi tomado. Os experimentos foram repetidos três vezes para cada imunoglobulina, com o soro imunizado e não imunizado, coletado de camundongos individuais, antes, durante e após a imunização. O mesmo procedimento foi realizado quando o ELISA foi feito contra o polissacarídeo Vi de S. Typhi.
[0072] A titulação da imunoglobulina sérica em soro imunizado foi separadamente medida contra cada componente OMVs de formulações de OMV bivalente e inativadas por calor (HK). A. IgG (i), IgGl (ii), IgG2a (iii), IgG3 (iv) séricas; B. IgA sérica; C. Resposta da IgM sérica contra cada uma das duas OMVs e imunógenos inativados por calor na pré imunização, imunização e pós imunização. O eixo horizontal indica os dias da coleta de sangue. Os dados aqui representados são os valores médios +/- desvio padrão (DP) de três experimentos independentes. As diferenças na resposta recomendada no dia após a imunização de cada um dos anticorpos estudados contra cada um dos dois OMVs foram altamente significativas (P valor < 0.005) (mostradas na
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Figura 5).
[0073] A Figura 5a ilustra soro de IgG anti-Vi; E. IgA secretória; F. i. ii. Resposta ao soro de IgGl e IgG3 contra cada uma das duas OMVs, Salmonella Typhi e Paratyphi A, respectivamente nos períodos de pré-imunização, imunização e pós-imunização. A alta titulação de IgG3 sérica contra a titulação de IgGl sérica indica alta resposta imune mediada por célula Thl em soro de camundongos adultos após três doses de imunização. O eixo horizontal indica os dias da coleta de sangue. Os dados aqui representados são os valores médios +/- desvio padrão (DP) de três experimentos independentes. As diferenças na resposta recomendada no dia após a imunização de cada um dos anticorpos estudados contra cada um dos dois OMVs foram altamente significativas (P valor < 0.005) .
Estudos ex vivo em células dendríticas isoladas [0074] Células dendríticas da medula óssea de camundongos BALB/c não imunizados foram cultivadas durante 7 dias em RPMI completo contendo 10% de FBS na presença de 20 ng/mL de GM-CSF (Tonbo). As células foram, então, tratadas com 100 ng/ml de OMV bivalente e incubadas a 37 °C durante 24 horas na presença de 5% de CO2. Diferentes citocinas, a saber, ΙΕΝ-γ, IL-4, IL-12p70, IL-Ιβ e IL-23 foram, então, medidas (ver Figura 6A) pelo kit ELISA para citocinas.
Ensaio de reestimulação do esplenócito [0075] Após 2 semanas do final da última imunização, células esplênicas de camundongos BALB/c imunizados foram cultivadas por 2 horas em RPMI completo contendo 10 % de FBS. As células foram, então, tratadas com 100 ng/ml de OMV
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27/33 bivalente e incubadas a 37 °C por 24 horas na presença de 5% de C02. Diferentes citocinas, a saber, IFN-γ, IL-6 e IL-17 foram, então, medidas (Figura 6B) pelo kit ELISA de citocinas (Invitrogen, USA) (8).
[0076] A Figura 7 ilustra que o soro de camundongos imunizados bivalentes inibe a motilidade de S. Typhi e S. Paratyphi A. Ensaio de motilidade [0077] O ensaio de motilidade foi realizado como previamente descrito, com modificações. Brevemente, as amostras de soro imunizadas e não imunizadas foram misturadas com PBS em uma concentração de 1:400 e despejadas em placas com ágar macio (0.3 %) . As placas foram mantidas por uma hora para obter o soro misturado com PBS embebido na placa. Depois que as placas ficaram secas, as bactérias na fase logaritmica (OD600 = 0.8) foram picadas no meio da placa. As placas foram, então, incubadas a 37 °C durante 24 horas. Após 24 horas, os resultados foram observados tal como na Figura 7 .
[0078] A Figura 8 ilustra que uma imunização com as OMVs bivalentes fornece proteção em modelo de camundongos adultos. Os camundongos foram imunizados com uma mistura 1:1 de OMVs tifoidais usando 25 pg do total de OMVs por dose e uma imunização em três doses. Os camundongos foram, então, desafiados com 1 x 106 UFC/ml de cada cepa desafio intraperitonealmente e observadas pelo período de sobrevivência de 12 dias. A., B. O peso corporal foi medido para cada camundongo até o 9o dia após a infecção e C, D. o percentual de sobrevivência foi calculado. E., F. Os
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28/33 camundongos foram, ainda, desafiados com 2 x 108 UFC/ml de cepas heterólogas de bactéria desafio e a infecção sistêmica da bactéria nestes camundongos foi determinada por diluição seriada do baço e fígado.
OMVs de S. Typhi e S. Paratyphi A bívalentes protegem camundongos adultos do desafio contra S. Typhi e S. Paratyphi A.
[0079] Após quatro imunizações orais sucessivas com a formulação de OMVs bivalente, a eficácia protetora foi observada em modelo intraperitoneal de camundongos adultos (Figura 8) . Em 9 DPI (dias após a infecção), foi observado que 1 x 105 1 x 106 UFC/gm de baço em camundongos não imunizados, enquanto, 2 x 102 UFC/gm de baço foi a colonização mais alta encontrada em baços de camundongos imunizados.
[0080] Homogenatos de tecido do fígado revelam apenas 10 - 100 organismos/gm no caso dos camundongos imunizados, enquanto, em camundongos não imunizados, uma habilidade de colonização 5-log vezes maior foi observada.
[0081] Ambos os camundongos imunizados e não imunizados foram desafiados com 2 x 106 UFC/ml intraperitonealmente e mantidos por 12 dias para ensaio de sobrevivência. No caso de camundongos não imunizados, todos os camundongos morreram dentro de 14 dias. Porém, 80 % e 100% dos camundongos imunizados ainda estavam vivos. Este resultado sugere que nossa formulação bivalente está inibindo a infecção sistêmica de Salmonella tifoide em camundongos e ela, de fato, protege os camundongos de uma infecção letal.
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29/33 [0082] Na maioria dos casos, os dados apresentados não são normalmente distribuídos devido a variação biológica. Sendo assim, testes não paramétricos foram usados para todas as análises de dados. A comparação entre duas variáveis categóricas foi feita usando o teste t de Student bicaudal.
[0083] A comparação entre múltiplas variáveis categóricas foi feita usando o teste t de Student unicaudal. Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes. Um P valor de < 0.05 ou < 0.01 foi considerado significativo. O GraphPad Prism 5 para Windows OS foi usado para todas as análises estatísticas.
[0084] A eficácia de ambas as OMVs de Salmonella Typhi e Paratyphi A foram estudadas ao longo de vários experimentos.
[0085] Quando os camundongos foram imunizados com OMVs de Salmonella Typhi, eles estavam protegidos de infecção por Salmonella Typhi (avaliada a partir da contagem bacteriana do baço e fígado 3 dias após a infecção). Porém, quando os mesmos camundongos imunizados com OMVs de Salmonella Typhi foram desafiados com Salmonella Paratyphi A, uma quantidade muito menor de proteção foi encontrada. A mesma tendência foi observada quando OMVs monovalentes de Salmonella Paratyphi A são usadas para imunizar camundongos. Eles foram protegidos da infecção por Salmonella Paratyphi A, porém não foram protegidos da infecção por Salmonella Typhi. Os resultados são os seguintes:
[0086] A Figura 9 ilustra o primeiro painel que mostra a colonização de isolado clínico de Salmonella Typhi
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30/33 em camundongos imunizados com OMVs de Salmonella Typhi. Por outro lado, o segundo painel mostra a colonização de isolado clínico de Salmonella Paratyphi A em camundongos imunizados com OMVs de Salmonella Typhi. Uma colonização pelo menos 2 vezes maior foi observada quando camundongos imunizados com OMVs de Salmonella Typhi foram desafiados com isolado clínico de Salmonella Paratyphi A em vez de Salmonella Typhi. A proteção homóloga foi observada, porém nenhuma proteção heteróloga ou cruzada foi observada.
[0087] A Figura 10 ilustra o primeiro painel que mostra a colonização de isolado clínico de Salmonella Typhi em camundongos imunizados com OMVs de Salmonella Paratyphi A. Por outro lado, o segundo painel mostra a colonização de isolados clínicos de Salmonella Paratyphi A em camundongos imunizados com OMVs de Salmonella Paratyphi A. Uma colonização de pelo menos 2 vezes maior foi observada quando os camundongos imunizados com Salmonella Paratyphi A foram desafiados com Salmonella Typhi em vez de isolado clínico de Salmonella Paratyphi A. A proteção homóloga foi observada, porém, nenhuma proteção heteróloga ou cruzada foi também observada neste caso.
[0088] O efeito das OMVs isoladas de uma cultura de 24 horas foi avaliado. Embora este resultado mostre que os camundongos imunizados estão significativamente protegidos do desafio, porém o nível de proteção é muito maior nos casos em que o isolado de OMVs é isolado a partir de uma cultura de 5 horas (refere-se às figuras 8E e F do pedido de patente) (tal como mostrado na figura 11).
[0089] As OMVs da bactéria da cultura da fase
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31/33 logaritmica causaram muito menos colonização no baço e fígado e são substancialmente muito mais eficazes do que quaisquer outras formulações. É rico em muitas proteínas que foram relatadas como secretadas por meio de OMVs até recentemente (Fig. 12) .
[0090] As OMVs de duas cepas de bactérias tal como reivindicadas contém proteínas de diferentes tamanhos, bem como LPS nas mesmas. A análise Western blot indica a presença de uma forte resposta imune contra os imunógenos presentes nas BOMVs. A análise dot blot tem a finalidade de provar que este imunógeno é eficaz e imunogênico contra as LPSs dessas duas cepas. Três doses da imunização oral desta formulação de BOMVs em camundongos induz um aumento significativo no nível de imunoglobulinas específicas para as OMVs isoladas. A presença de slgA contra a formulação de OMVs e IgG específica para o polissacarídeo Vi de S. Typhi mostra a potência da nossa formulação bivalente contra a infecção por S. Typhi.
[0091] Como o polissacarídeo Vi é a cobertura externa da S. Typhi, as imunoglobulinas presentes contra este componente indicam a presença de polissacarídeos Vi nas BOMVs. Devido a sua natureza intracelular, ambos S. Typhi e S. Paratyphi A podem apenas ser erradicados do hospedeiro na presença de resposta imune significativa mediada por célula Thl junto com resposta imune humoral. Uma resposta imune influenciada por Thl foi observada nos dados do ELISA.
[0092] Ainda, uma regulação positiva significativa no nível de ΙΕΝ-γ, IL-6, IL-12p70, IL-Ιβ e IL-23 dos BMDCs isolados e ΙΕΝ-γ, IL-6 e IL-17 dos esplenócitos mostram que
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32/33 a resposta induzida foi um resultado de uma resposta imune mediada principalmente pelas células Thl e Thl7. Além disso, tal como verificado pelo soro e experimentos de transferência de esplenócitos adotivos, o efeito protetor da vacinação com BOMVs foi dependente de ambas as imunidades humoral e celular. Assim, ambos os braços humoral bem como celular do sistema imune do hospedeiro estão sendo ativados pela exposição das BOMVs em camundongos. 0 soro dos nossos camundongos imunizados com BOMVs pode também inibir a motilidade das cepas do tipo selvagem da Salmonella tifoide. A inibição da motilidade significa que a bactéria não mais será capaz de encontrar seus receptores para a ligação no epitélio humano, logo, tornando-as incapazes de causar infecção. 0 ensaio MTT foi realizado para verificar a reatogenicidade das BOMVs. Constatou-se que as BOMVs eram menos reatogênicas do que os imunógenos inativados por calor e lisado de célula inteira convencionais.
[0093] A inibição para causar infecção em camundongos foi ainda confirmada por ensaios anticolonização e de sobrevivência. Em nosso ensaio de anticolonização, os camundongos imunizados foram desafiados com cepas circulantes de Salmonella tifoide por meio da via intraperitoneal. O aumento significativo no nível de sobrevivência no grupo imunizado com BOMVs foi observado. Ainda, a presença de Salmonella tifoide no baço e fígado mostraram-se significativamente menores em camundongos imunizados. Tomadas juntas, estas descobertas nos sugeriram que os BOMVs podem ser usados como um novo candidato de vacina não viva humana contra infecções de S. Typhi e S.
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Paratyphi A no futuro.
Análise estatística [0094] Na maioria dos casos, os dados apresentados não estão normalmente distribuídos devido à variação biológica. Sendo assim, testes não paramétricos foram usados para todas as análises de dados. A comparação entre duas variáveis categóricas foi feita usando o teste t de Student bicaudal. A comparação entre múltiplas variáveis categóricas foi feita usando o teste t de Student unicaudal. Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes. Um P valor de < 0.05 ou < 0.01 foi considerado significativo. O GraphPad Prism 5 para Windows OS foi usado para todas as análises estatísticas.
[0095] As vantagens não limitativas são fornecidas abaixo:
• O produto consiste em OMVs (BOMVs) juntas como um imunógeno e contém proteínas de diferentes tamanhos e LPSs dentre outros constituintes.
• O referido produto induz, de forma significativa, a resposta imune após três doses de imunização oral em camundongos. A análise Western blot garante sua imunogenicidade. A análise Dot blot mostra a habilidade da indução da imunogenicidade contra LPSs de cepas circulantes.
• O aumento significativo de IgG, IgM, IgA, slgA séricos foi observado após três doses de imunização oral. Altos níveis de IgG3 sérico, em vez de IgGl sérico, indica uma resposta imune influenciada por Thl. Uma alta titulação contra o polissacarídeo Vi de S. Typhi foi observada. Isto indica a indução de uma resposta imune humoral nos
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34/33 camundongos.
• 0 tratamento de BMDCs isolados com o referido produto resulta na elevação de citocinas influenciadas por Thl. 0 aumento das citocinas influenciadas por Thl e Thl7 foi observado em esplenócitos isolados de camundongos imunizados. Isto indica a indução de uma forte imunidade mediada por células Thl em camundongos.
• 0 referido soro de camundongos imunizados com o produto pode, de forma significativa, inibir a motilidade das cepas circulantes do tipo selvagem de Salmonella tifoide. A inibição da motilidade torna a bactéria ineficaz na indução da sua virulência.
• A referida formulação é muito menos reatogênica do que imunógenos inativado por calor e lisado de célula total convencionais.
• Os camundongos imunizados com a formulação estavam protegidos contra cepas circulantes do tipo selvagem de Salmonella tifoide. 0 nível de colonização no baço e no fígado também se mostrou menor, de forma significativa, do que aquele dos camundongos não imunizados.
Claims (8)
- REIVINDICAÇÕES1. Novo produto caracterizado pelo fato de ser usado como potente vacina para o tratamento de febre tifoide, compreendida de vesículas de membrana externa (OMVs) isoladas tomadas de duas diferentes cepas de espécies de Salmonella tifoide.
- 2. Produto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de as cepas de Salmonella serem Salmonella Typhi C-6953 e Salmonella Paratyphi A C-6915.
- 3. Produto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de as referidas cepas de Salmonella serem misturadas em uma proporção de 1:1, isto é, 50 % de Salmonella Typhi C-6953 e 50 % de Salmonella Paratyphi A C6915.
- 4. Produto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ainda compreender um alto número de proteínas externas, internas, periplasmáticas e citoplasmáticas, dentre outras.
- 5. Produto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ainda compreender um alto número de proteínas citosólicas tais como DNA, polimerase, helicase e primase as quais nunca foram abordadas para serem secretadas através de OMVs.
- 6. Método para o preparo de vesículas de membrana externa (OMVs) conforme definidas na reivindicação 1 caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:i) crescimento de células a 37 °C, sob condição de agitação seguida por centrifugação em uma condição adequada;ii) submissão a filtração por filtração bacteriana aPetição 870190093451, de 18/09/2019, pág. 27/292/20,22 pm seguida por purificação através de ultracentrifugação em uma condição adequada pelo uso de um rotor;iii) ressuspensão em salina tamponada com fosfato em pH 7.4.
- 7. Método para o preparo de vesículas de membrana externa, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de a centrifugação ocorrer a 8000 rpm por 40 min a 4 °C.
- 8. Método para o preparo de vesículas de membrana externa (OMVs), de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de a ultracentrifugação ocorrer por 4 horas a 140000 x g a 4 °C.
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2018
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