BR112019018566A2 - método para sequestro diferenciado de substâncias de diferentes grupos de substância a e b em um hidrogel sulfatado e/ou sulfonado, material de hidrogel covalentemente reticulado, material de hidrogel fisicamente reticulado, e uso de hidrogéis - Google Patents

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Dr. Carsten Werner Prof.
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Abstract

a invenção refere-se a um método para o sequestro diferenciado de substâncias de diferentes grupos de substância a e b em um hidrogel sulfatado e/ou sulfonado e redução de substâncias do grupo de substância a de um biofluido enquanto libera simultaneamente substâncias do grupo de substância a ou b do hidrogel sulfatado e/ou sulfonado de uma maneira diferente no biofluido e/ou à redução da ligação das substâncias do grupo de substância b no hidrogel sulfatado e/ou sulfonado. o hidrogel sulfatado e/ou sulfonado é selecionado dentre um grupo de hidrogéis do tipo 1, tipo 2, tipo 3 ou tipo 4, e os hidrogéis consistem em componentes não carregados e componentes carregados. de acordo com a invenção, os componentes carregados são caracterizados por um parâmetro, que é calculado a partir do número de grupos sulfato e/ou sulfonato por unidade de repetição dividido pela massa molar da unidade de repetição, para tipo 1 de 0,0040 a 0,0060 mol/g, para tipo 2 de 0,0025 a 0,0040 mol/g, para tipo 3 de 0,0005 a 0,0025 mol/g e para tipo 4 de 0,0040 a 0,0100 mol/g. os hidrogéis inchados têm um módulo de armazenamento menor que 20 kpa, e as propriedades dos hidrogéis inchados têm uma concentração de grupos sulfato ou sulfonato em mmol/ml de 0,09 a 0,20 para tipo 1, de 0,05 a 0,18 para tipo 2, de 0,01 a 0,12 para tipo 3 e de 0,16 a 0,08 para tipo 4. a concentração de substâncias do grupo de substância a e de substâncias do grupo de substância b no biofluido é influenciada pela seleção do tipo de hidrogéis.

Description

MÉTODO PARA SEQUESTRO DIFERENCIADO DE SUBSTÂNCIAS DE
DIFERENTES GRUPOS DE SUBSTÂNCIA A Ε B EM UM HIDROGEL SULFATADO
E/OU SULFONADO, MATERIAL DE HIDROGEL COVALENTEMENTE
RETICULADO, MATERIAL DE HIDROGEL FISICAMENTE RETICULADO, E USO
DE HIDROGÉIS [001] A invenção refere-se a um método para sequestro diferenciado de substâncias de diferentes grupos de substância A e B com o auxílio de hidrogéis que contêm componentes sulfatados e/ou sulfonados e à redução das substâncias do grupo de substância A a partir de um biofluido com liberação diferenciada simultânea no biofluido de substâncias do grupo de substância A ou B do hidrogel que contém componentes sulfatados e/ou sulfonados e/ou à ligação reduzida das substâncias do grupo de substância B no hidrogel que contém componente sulfatado ou sulfonado. A invenção se refere adicionalmente a hidrogéis que podem ser sinteticamente obtidos com base em ácido poli (4-estirenossulfônico-comaleico) como um componente de rede e moléculas reticuladoras que contêm amina ou tiol como outro componente de rede, e que podem ser caracterizados e usados para o método acima como um material para o sequestro diferenciado de substâncias de diferentes grupos de substâncias. Os grupos de substância A e B não são grupos de substância quimicamente definidos, porém, podem conter, dependendo do tipo de hidrogel, diferentes substâncias que provocam, na constelação e composição correspondentes, o sequestro diferenciado, de acordo com a invenção, dentro do sistema geral. Os grupos de substância A e B são, assim, definidos por seu comportamento no sistema geral.
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2/61 [002] O campo de aplicação da invenção está no campo de biotecnologia e medicina, onde determinadas substâncias são seletivamente removidas de um biofluido em um nível molecular e sequestradas em um hidrogel e onde, por outro lado, outras substâncias não são especificamente sequestradas, porém, são seletivamente liberadas do hidrogel no biofluido. Assim, em um sentido mais amplo, é um processo de separação a nível molecular. Em um sentido mais amplo, o campo de aplicação da invenção está no uso de hidrogéis classificados negativamente carregados para aplicações da técnica, biomédicas e biológicas, por exemplo para o cultivo de células de mamíferos ou um acabamento antibacteriano de superfícies.
[003] Hidrogéis com componentes sulfatados, por exemplo, hidrogéis de glicosaminociclo de PEG em estrela, são conhecidos na técnica a partir do documento n° WO 2010/060485 Al e são investigados pelo uso nas aplicações biotecnológicas ou como implante ou materiais de substituição de tecido para uso em terapias regenerativas.
[004] Um recurso importante desses materiais está nas interações resultantes entre grupos sulfato em cadeias de polímero de um componente dos hidrogéis com proteínas solúveis, tal como, por exemplo, proteínas que controlam o metabolismo, funções de transporte e sinalização, tal como enzimas e moléculas de sinalização, em que as últimas incluem, por exemplo, proteases, lipolases, amilases e as últimas incluem, por exemplo, hormônios, neurotransmissores, citocinas, fatores de crescimento e quimiocinas.
[005] As interações cruciais para a afinidade com essas proteínas são com base, principalmente, em forças eletrostáticas entre os grupos sulfato ou ácido sulfônico dos
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3/61 hidrogéis que são negativamente carregados sob condições de aplicação e cadeias laterais de aminoácidos de proteínas que são positivamente carregadas.
[006] Esse princípio já é amplamente usado na técnica para o desenvolvimento de hidrogéis que contêm açúcares sulfatados (glicosaminoglicanos = GAGs) para liberação prolongada de moléculas de sinalização, por exemplo, para os fatores de crescimento VEGF (Fator de Crescimento Endotelial Vascular) e FGF-2 (Fator de Crescimento de Fibroblasto 2) . Adicionalmente, a liberação de FGF-2 e VEGF podería ser aumentada gradualmente reduzindo-se o grau de sulfatação nos hidrogéis de GAG de PEG em estrela adjacentes. Polímeros sintéticos que contêm grupos ácido sulfônico, por exemplo, ácido polistirenossulfônico (PSS), J. Phys. Chem. B, 2007, 111 (13), páginas 3.391 a 3.397, DOI: 10.1021/jp067707d9., ou ácido 2-acrilamido-2-metilpropanossulfônico (documentos de Patente n° U.S. 5.451.617 e 5.011.275 e Pedido de Patente n° U.S. 2008/011412) foram usados com um componente sulfonado para produzir hidrogéis, por exemplo, para uso com lentes de contato.
[007] No entanto, não há, atualmente, nenhuma rede polimérica hidratada covalentemente reticulada conhecida que carrega grupos ácido sulfônico, isto é, hidrogéis, em que os grupos carboxila de ácido poli(4-estirenossulfônico-comaleico) foram usados como grupos funcionais para reticulação com reticuladores curtos que contêm grupo amina ou polímeros que contêm grupo amina.
[008] Outra desvantagem é que as interações entre hidrogéis que contêm componentes sulfatados ou sulfonados (ou elementos de base), e proteínas foram, assim,
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4/61 estudadas na maior parte apenas a partir de soluções com uma a duas moléculas de sinalização e frequentemente não sob as condições fisiologicamente relevantes. No entanto, no contexto biológico relevante, biofluidos com uma variedade de diferentes proteínas estão presentes em diferentes concentrações, em que as moléculas de sinalização estão presentes em biofluidos apenas em baixos níveis na faixa de 100 pg/ml a 2.000 ng/ml, enquanto outras proteínas, tal como albumina, estão presentes em altas concentrações de cerca de 60 mg/ml.
[009] Aqui, as forças atrativas eletrostáticas primárias entre domínios positivamente carregados de moléculas de sinalização e os grupos negativamente carregados sulfato ou sulfonato no hidrogel têm um papel importante, em que o ponto isoelétrico (IEP) de uma proteína pode ser frequentemente usado para sua estimativa. Adicionalmente à carga líquida sob condições fisiológicas que podem ser estimadas com base no IEP, no entanto, a distribuição da carga, por exemplo, a presença de aglomerados de carga positivamente carregados, assim como interações secundárias, que são influenciadas por tamanho de proteína e estrutura de proteína e pela formação de forças não iônicas intermoleculares mais fracas, tais como, por exemplo, interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio ou interações dipolo, têm um papel, de modo que não tem sido, assim, possível prever a ligação absoluta ou relativa das proteínas aos hidrogéis. Adicionalmente, existem processos de competição adicionais que foram frequentemente negligenciados, por exemplo devido às interações das proteínas-alvo com albumina, gue é responsável pelo controle de pressão osmótica e pela regulação de processos de transporte, assim como
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5/61 interações entre albumina com o hidrogel. Ademais, as constantes de ligação usadas na literatura para prever as interações moleculares entre polímeros e proteínas carregados são adequadas apenas para descrever a interação de complexos de molécula e proteína individuais em solução, enquanto nos hidrogéis as cadeias poliméricas adjacentes e a distribuição tridimensional da carga ou centros de afinidade na rede polimérica têm uma forte influência sobre as interações resultantes e, assim, sobre a ligação de proteínas no hidrogel.
[010] Consequentemente, a seletividade de ligação entre hidrogéis que contêm componentes sulfatados e/ou sulfonados (elementos de base) e componentes moleculares de biofluidos complexos podería, até o momento, não ser elucidada. Consequentemente, os métodos e processos estabelecidos têm capacidade para controlar seletivamente os níveis de moléculas de sinalização apenas, até um limitado grau, através de hidrogéis que contêm componentes sulfatados ou sulfonados (elementos de base) em biofluidos de aplicação relevante.
[011] É o objetivo da invenção propor um método que permita influenciar intencionalmente a concentração de determinadas substâncias em biofluidos.
[012] O objetivo é alcançado através de um método e um material que tem os recursos de acordo com as reivindicações independentes. Como um material adequado para realizar o processo, um sistema de hidrogel completamente sintético com base em ácido poli(4-estirenossulfônico-comaleico) foi usado como um componente sintético que é negativamente carregado sob condições fisiológicas e, portanto, afinam para biomoléculas carregadas de maneira parcialmente positiva para o sequestro diferenciado de
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6/61 substâncias dos vários grupos de substância. Desenvolvimentos adicionais do método e do material são citados nas reivindicações dependentes. 0 termo completamente sintético significa que nenhum componente de origem biológica é necessário para hidrogelação. Portanto, o risco de reações imunogênicas adversas pode ser excluído.
[013] O sequestro de substâncias dos grupos de substância A e B no contexto da invenção se refere à ligação dessas substâncias, tais como moléculas de sinalização, fatores ou enzimas, com centros de afinidade em um material de hidrogel e, assim, se reduz a concentração ou a remoção completa dessas substâncias de um biofluido em contato direto com o hidrogel. O hidrogel consiste em elementos de base que são carregados ou não carregados.
[014] A invenção inclui, como hidrogéis que contêm grupos sulfato e/ou sulfonato, hidrogéis que têm as seguintes propriedades e a seguinte composição: Redes poliméricas formadas por reticulação covalente (química) ou reticulação física, por exemplo, de acordo com o documento n° WO 2014040591 A2, entre dois componentes de hidrogel ou elementos de base de hidrogéis. O primeiro elemento de base ou componente do hidrogel é uma molécula que não é carregada sob condições fisiológicas, também denominado elemento de base não carregado (UGB) e que tem, preferencialmente, uma massa molar de 20 g/mol a 100.000 g/mol. As moléculas não carregadas são vantajosamente selecionadas ou derivadas da classe de polietilenoglicóis, poli(2-oxazolinas), polivinilpirrolidonas (PVP), álcoois polivinílicos (PVA) e/ou poliacrilamidas (PAM) ou uma molécula reticuladora bifuncional curta. Ademais, o UGB tem pelo menos dois grupos funcionais, preferencialmente de 4
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7/61 a 8 grupos funcionais, que são particularmente vantajosos para reticulação. Funcionalidades adequadas para reticulação (no GB ou UGB) podem incluir amina, tiol, carboxila, anidrido, maleimida, vinilsulfona, acrilato, hidroxila, isocianato, epóxido e aldeído, ou grupos que têm capacidade para formar ligações não covalentes com base em forças eletrostáticas, interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio, interações dipolo. 0 segundo elemento de base (componente) consiste em um polímero que tem grupos (sulfurosos) sulfato ou sulfonato, que é, assim, negativamente carregado sob condições fisiológicas (elemento de base carregado, GB) (que tem opcionalmente uma massa molar de 2.000 a 250.000 g/mol), que tem capacidade para ligar proteínas na rede de hidrogel principalmente por meio das interações eletrostáticas (iônica) e, em um grau menor, por meio de ligações mais fracas, tais como forças de van der Waals, ligações de hidrogênio ou interações hidrofóbicas. De acordo com a invenção, os centros de afinidade, que determinam significativamente a ligação de proteínas, são os grupos sulfato ou ácido sulfônico que são carregados de maneira bastante negativa sob condições fisiológicas. Polímeros sulfatados ou sulfonados são glicosaminoglicanos sulfatados obtidos a partir de fontes naturais, tais como heparina e heparinas seletivamente dessulfatadas, sulfato de condroitina, sulfato de heparan, sulfato de queratan, ácido hialurônico sulfatado, assim como glicopolímeros sulfatados com base em manose, lactose, dextrano e compostos polissulfonados que podem ter como monômeros que contêm enxofre, por exemplo, ácido estirenossulfônico (SS), ácido vinilsulfônico (VS), ácido 2acrilamido-2-metilpropanossulfônico (AMPS), ácido aminopropanossulfônico (APS) ou ácido anetolsulfônico (AS)
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8/61 (também em copolímeros com unidades que contêm os grupos de reticulação mencionados acima).
[015] Os centros de afinidade, grupos sulfato ou sulfonato negativamente carregados, são distribuídos intencionalmente apenas ao longo do GB, enquanto o UGB é um componente que minimiza adsorção de proteína. Quaisquer grupos carboxila presentes no GB e não usados para a reação de reticulação são considerados irrelevantes para a ligação das proteínas no hidrogel devido aos grupos sulfato ou sulfonato significativamente mais ácidos e, portanto, preferencialmente desprotonados do GB.
[016] Condições fisiológicas são soluções aquosas que em tecido que tem um valor de pH e uma força iônica que corresponde exatamente a uma salinidade fisiológica para tecido humano e, assim, são ajustadas para pH 7,4 e cerca de 0,9% de NaCl com um tampão de fosfato.
[017] Um biofluido, de acordo com a invenção, é uma solução aquosa que tem um teor de sal variável, preferencialmente uma salinidade fisiológica, e uma mistura de proteínas.
[018] O teor de proteína pode variar e consistir principalmente em proteínas globulares solúveis em água, por exemplo, moléculas de sinalização, enzimas ou fatores, em baixos níveis em uma faixa de 100 pg/ml a 2.000 ng/ml e albuminas que regulam a pressão osmótica e processos de transporte no corpo e estão presentes, por exemplo, em alta concentração de cerca de 60 mg/ml.
[019] De acordo com o conceito da invenção, diferenças de proteínas que controlam a ligação da função de metabolismo, transporte e sinalização (por exemplo, moléculas
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9/61 e enzimas de sinalização) com componentes sulfatados ou sulfonados (GB) que contêm hidrogéis são significativamente determinadas, por um lado, pelas interações eletrostáticas entre GB e proteínas, assim como pelo tamanho e pela estrutura das proteínas (por exemplo, a presença de domínios de proteína característicos) e, por outro lado, pelos parâmetros de rede dos hidrogéis. Conforme determinado parâmetros de rede foram medidos: (1) a concentração de sulfato ou sulfonato no hidrogel inchado (mmol de sulfato ou sulfonato por ml) no hidrogel inchado sob condições fisiológicas; e (2) o número de grupos sulfato ou sulfonato por unidade de repetição do GB dividido pela massa molar das unidades de repetição do GB (número de grupos/(g/mol)) como um tamanho característico para a carga do GB. 0 parâmetro (1) é correlacionado com o número de centros de interação (que correspondem a grupos sulfato ou sulfonato negativamente carregados) na rede de hidrogel tridimensionalmente inchado e, portanto, determinará significativamente a ligação de proteínas (moléculas de sinalização, enzimas) no hidrogel. Esse parâmetro inclui interações intermoleculares (isto é, interações de cadeias poliméricas adjacentes) do GB com proteínas (moléculas de sinalização, enzimas). 0 parâmetro (2), por outro lado, descreve a densidade e a distribuição dos centros de interação (que correspondem a grupos sulfato ou sulfonato negativamente carregados) ao longo dos diferentes GBs e determinará, assim, as interações das proteínas com os respectivos GBs individuais e, assim, inclui também interações específicas por meio da modulação espacial dos centros de carga da cadeia polimérica que são conhecidos, por exemplo, para interações de proteína glicosaminoglicana (consultar Capila, I. Linhardt, RJ Angew
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10/61
Chem Int Ed Engl 2002, 41 (3), 391 a 412). O comportamento de ligação e liberação dos hidrogéis para proteínas (moléculas de sinalização) é determinado de acordo com a invenção através de uma superimposição das propriedades de rede de hidrogel resultantes de ambos os parâmetros (1) e (2) e pode, assim, ser quantitativamente descrito especificando-se esses parâmetros (consultar também os resultados para as modalidades exemplificativas UGB1-GB1 01 a UGB1-GB4 04).
[020] Adicionalmente, efeitos esféricos devem ser considerados, pois a ligação e o sequestro de acessibilidade esférica de proteínas da rede de hidrogel devem ser garantidos, isto é, o tamanho das proteínas não deve exceder o tamanho de malha dos hidrogéis, por exemplo, estimado a partir do módulo de armazenamento dos hidrogéis por meio da teoria de elasticidade de borracha com relação ao material e aos métodos.
[021] Colocando-se biofluidos em contato com hidrogéis gue podem ser seletivamente classificados por sua estrutura de rede e seu grau de sulfatação ou sulfonação, a concentração de moléculas de sinalização relevantes no biofluido pode ser ajustada através de uma seletividade característica da ligação de moléculas de sinalização ao hidrogel e pode ser consequentemente controlada em uma aplicação biológica ou biotecnológica. A aplicação biológica pode, no contexto médico, se referir à modulação de moléculas de sinalização solúveis para o controle de angiogênese, brotamento de vasos sanguíneos, a resposta imunológica, inter alia, para curar doenças neurodegenerativas e autoimunes e câncer, diabetes, em cicatrização de ferida cutânea e regeneração óssea, para inibir proliferação tumoral e para
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11/61 tratamento antisséptico e antimicrobiano dentro ou sobre o corpo. Aplicações biotecnológicas incluem cultura de órgão e célula in vitro de células-tronco embrionárias (ES), célulastronco pluripotentes induzidas (iPS) e outras células-tronco e progenitoras não associadas a ES e iPS, células primárias derivadas de paciente, linhas celulares imortalizadas, assim como tecido cardíaco, muscular, renal, hepático e nervoso, assim como no enriquecimento ou redução, e assim a separação de misturas de proteína, em particular misturas de molécula de sinalização ou misturas de enzima.
[022] Outro aspecto da invenção se refere, conforme já mencionado, a um material de hidrogel covalentemente reticulado para realizar o método acima, com base em elementos de base carregados na forma de ácido poli(4estirenossulfônico-co-maleico) e elementos de base não carregados na forma de grupos amina ou grupos tiol que contêm polímeros ou moléculas reticuladoras que têm pelo menos dois grupos amino ou tiol. Os elementos de base carregados e não carregados são reticulados para formar uma rede polimérica que pode ser obtida ativando-se os grupos carboxila do ácido poli(4-estirenossulfônico-co-maleico) com l-etil-3-(3dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDC)/Nhidroxissulfossuccinimida (sulfo-NHS) e reticulação direta com polímeros que contêm os grupos amina ou as moléculas reticuladoras que têm os pelo menos dois grupos amino, cada um com formação de amida ou uma funcionalização dos grupos carboxila ativados por meio de moléculas reticuladoras bifuncionais, em que cada uma tem um grupo amino e um grupo que tem capacidade para adição do tipo Michael, e a reticulação subsequente com os polímeros que contêm grupos tiol ou as
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12/61 moléculas reticuladoras que têm os pelo menos dois grupos tiol, cada um por meio de uma respectiva adição do tipo Michael. 0 grupo que tem capacidade para uma adição do tipo Michael é preferencialmente selecionado dentre grupos maleimida, vinilsulfona e acrilato. Os polímeros que contêm grupos amina ou tiol como elementos de base não carregados são preferencialmente selecionados dentre a classe de polietilenoglicóis (PEG), poli(2-oxazolinas) (POX), polivinilpirrolidona (PVP), álcoois polivinílicos (PVA) e/ou poliacrilamidas (PAM) . Os grupos amina ou tiol alternativamente usados que contêm moléculas reticuladoras curtas são moléculas reticuladoras bifuncionais preferencialmente não poliméricas. Ácido poli (4estirenossulfônico-co-maleico) como um elemento de base carregado é vantajosamente selecionado com razões molares variáveis de ácido 4-estirenossulfônico para ácido maleico na faixa de 6:1 a 1:6 e massas molares na faixa de 5.000 a 100.000 g/mol. De acordo com uma modalidade particularmente preferencial da invenção, polímeros com peptídeos enzimaticamente cliváveis para formação de rede polimérica são usados como elementos de base não carregados. Esses peptídeos enzimaticamente cliváveis têm, preferencialmente, como um aminoácido reativo na sequência peptídica, lisina, com um grupo amino na cadeia lateral, ou cisteína, com um grupo tiol na cadeia lateral. Os peptídeos enzimaticamente cliváveis são vantajosamente cliváveis com o auxílio de proteases humanas ou bacterianas, em particular metaloproteinases de matriz responsivas (MMPs), tais como PQGIWGQ, IPVSLRSG ou VPMSMRGG, responsivas à catepsina, tal como VPMSMRGG, responsivas à elastase, tais como AAPV ou APEEIMDRQ, responsivas à enzima de
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13/61 coagulação sanguínea, tal como ácido pipecólico GGF responsive de trombina RYSWGCG ou cicloexilalanina GG, ARSWGCG, responsivas à FXa, tal como GGIEGRMGGWCG, responsivas à calicreína, tal como CGGGPFRIGGWCG ou responsivas à protease bacteriana, tal como responsiva à aureolisina ADVFEA ou AAEAA, responsivas à elastase AAPV ou a sequência responsiva à protease IV MKATKLVLGAVILGSTLLAG. Hidrogéis construídos dessa maneira permitem liberação autorreguladora e mecanismos de degradação. De acordo com outra modalidade da invenção, moléculas bioativas e/ou antiadesivas que têm um grupo amino ou carboxila e/ou peptídeos de modificação celular, em particular selecionadas dentre KCWG-RGDSP, KCWG-EIDGIELT, KCWG-IKLLI, KGCWGGRNIAEIIKDI, KGCWGGSDPGYIGSRSDDSA, KGCWGGPQVTRGDVFTMP, KGCWGGKGGNGEPRGDTYRAY são ligadas, por meio de lisina ou cisteina na sequência, ao elemento de base carregado ácido poli (4-estirenossulfônico-co-maleico) ou seus derivados com grupos que têm capacidade para adição do tipo Michael na rede de hidrogel formando-se uma ligação covalente. As moléculas bioativas podem ser substâncias antimicrobianas, por exemplo, antibióticos ou antissépticos, ou agentes farmacêuticos. As moléculas antiadesivas são preferencialmente polietilenoglicóis (PEG) ou poli(2-oxazolinas) (POX). Os peptídeos de modificação celular são preferencialmente peptídeos derivados de proteínas estruturais e funcionais da matriz extracelular, por exemplo, peptídeos derivados de colágeno, laminina, tenascina, fibronectina e vitronectina. De acordo com uma modalidade vantajosa, os peptídeos bioativos e/ou antiadesivos e/ou de modificação celular são covalentemente acoplados às redes de hidrogel por meio de sequências de peptídeo enzimaticamente cliváveis. Os peptídeos
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14/61 enzimaticamente cliváveis são, conforme já mencionado, preferencialmente sensíveis a proteases humanas ou bacterianas, por exemplo MMPs, catepsinas, elastases, enzimas de coagulação sanguínea. Hidrogéis desse tipo permitem liberação autorreguladora e mecanismos de degradação mesmo ao reter a rede de hidrogel. Preferencialmente, o material de hidrogel tem um módulo de armazenamento de 0,2 a 22 kPa. A concentração de sulfonato na rede inchada e o número de grupos sulfonato por unidade de repetição (WE) dividido pela massa molar (MW) da unidade de repetição em (g/mol) pode ser variado independentemente de um do outro, de acordo com as faixas definidas na Tabela 5.1 (consultar abaixo).
[023] Assim, a invenção fornece um hidrogel altamente hidratado completamente sintético, que carrega centros de afinidade para que grupos de substância sejam separados por meio dos grupos sulfonato de ácido poli(4estirenossulfônico-co-maleico) como um elemento de base carregado (GB), com propriedades físicas e bioquímicas intencionalmente graduáveis. O ácido poli(4estirenossulfônico-co-maleico) é usado aqui como um elemento de base carregado (GB) no sentido do material de hidrogel anteriormente descrito. Esse material oferece a possibilidade de mapear todas as funções importantes da matriz extracelular natural (ECM) de uma maneira modular, isto é, amplamente independentemente uma das outras. Detalhadamente, essas funções são o quadro, suporte e a função de proteção para cultivar células como a primeira função, o controle de adesão celular como a segunda função, o sequestro classificado e a liberação reversível de moléculas de sinalização terapeuticamente relevantes como a terceira função, e a
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15/61 possibilidade de reorganização sob demanda por células de crescimento interno como a quarta função. As propriedades físicas, tais como rigidez e hidratação do material, são ajustáveis sobre uma ampla faixa. De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, hidrogéis covalentemente reticulados foram preparados com esse propósito reagindo-se grupos carboxila do ácido poli (4-estirenossulfônico-co-maleico) ativado com l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDC)/N-hidroxissulfossuccinimida (sulfo-NHS) e grupos amino terminais de um polietilenoglicol ramificado em estrela ou linear como um elemento de base não carregado por meio de grupos amida estáveis. Em uma modalidade alternativa, que é preferencial ao incorporar células vivas, em uma primeira etapa, os grupos carboxila ácido poli (4-estirenossulfônico-comaleico) ativado com l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC)/N- hidroxissulfossuccinimida (sulfo-NHS) são classificados por meio da molécula reticuladora bifuncional curta N-(2-aminoetil)maleimida, isto é, funcionalizada com 6 a 10 moléculas de N-(2-aminoetil)maleimida por molécula de ácido poli (4-estirenossulfônico-co-maleico) e, então, purificados e isolados. Esses derivados do ácido poli(4estirenossulfônico-co-maleico) com N-(2-aminoetil)maleimida permitem, então, a reação bio-ortogonal espontânea quando misturados em soluções aquosas ou em um biofluido complexo com células vivas e biomoléculas sem sua alteração funcional por meio de uma adição do tipo Michael entre os grupos maleimida dos derivados de ácido poli(4-estirenossulfônico-co-maleico) funcionalizados e os grupos tiol das moléculas reticuladoras bifuncionais que contêm grupo tiol ou polímeros que contêm grupos tiol como elementos de base não carregados no
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16/61 significado da estrutura de hidrogel anteriormente descrita. Esses elementos de base podem, por exemplo, ser peptídeos enzimaticamente ciiváveis que têm em sua sequência o aminoácido cisteína (que tem um grupo tiol na cadeia lateral) e que foi anteriormente conjugado com um ou mais braços de um polietilenoglicol (PEG) de quatro braços, conforme descrito em Tsurkan et al. , 2013 (Adv. Mater. 2013, 25, 2.606 a 2.610) . Esse tipo de reticulação tem a vantagem de que, devido à reação rápida das maleimidas com os grupos tiol livres, uma reação direta ocorre sem reações laterais indesejadas com outras biomoléculas ou com proteínas das superfícies celulares, de modo que a adição do tipo Michael possa ser usada como uma reação de reticulação bio-ortogonal para células de polimerização. Os hidrogéis também podem ser funcionalizados por meio dos grupos maleimida dos derivados de ácido poli(4estirenossulfônico-co-maleico) por meio de peptídeos de modificação celular, por exemplo, a sequência de aminoácidos CWGRGDSP. Adicionalmente, os materiais de hidrogel podem ser funcionalizados com substâncias antimicrobianas, por exemplo, com antibióticos positivamente carregados.
[024] Como uma alternativa ao material de hidrogel covalentemente reticulado, um material de hidrogel fisicamente reticulado pode ser aplicado para realizar o método mencionado acima. Esse material de mesma forma completamente sintético é com base em interações físicas entre elementos de base carregados na forma de ácido poli(4-estirenossulfônicoco-maleico) com elementos de base não carregados na forma de polímeros, em que sequências peptídicas altamente carregadas positivamente são conjugadas nos polímeros. As sequências peptídicas carregadas de maneira fortemente positiva
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17/61 compreendem, preferencialmente, pelo menos dez repetições de lisina ou arginina ou pelo menos cinco repetições de motivos dipeptídicos com lisina e alanina, ou com arginina e alanina.
[025] Detalhes, recursos e vantagens adicionais das modalidades da invenção se tornarão aparentes a partir da seguinte descrição de modalidades exemplificativas, que também são descritas e sustentadas pelas Tabelas e Figuras representadas. A Figura 1 mostra imagens microscópicas de luz representativas de culturas celulares com células endoteliais humanas cultivadas em hidrogéis após 24 horas.
[026] Outras razões de concentração vantajosas também podem ser definidas variando-se deliberadamente as propriedades de rede, e o método proposto também torna possível controlar a concentração dessas espécies em qualquer biofluido estendendo-se a análise às moléculas de sinalização adicionais.
Tabela 1: Descrição modalidades 01 a 26: reação carboxila ativado com grupo química e física dos hidrogéis, de reticulação 1 (VN1) : grupo amino, reação de reticulação 2 (VN2): grupo maleimida com grupo tiol
Mistura de hidrogel durante reticulação, desinchado Propriedades de hidrogel sob condição fisiológica, inchado VN
Nome Concentração de UGB em mmol/ml Concentração de GB em mmol/ml Razão Molar UGB:GB Inchaço Concentração de GB em mmol/ml Concentração de sulfato/sulfonato em mmol/ml Módulo de armazenamento em
Valor médio SD Valor médio SD
UGB1-GB1 01 0,0091 0,0030 3 1,77 1,70 0,0018 0,12 1,9 1,9 1
UGB1-G62 02 0,0079 0,0040 2 1,62 0,03 0,0025 0,12 4,0 1,1 1
UGB1-G83 03 0,0073 0,0045 1,5 1,71 0,04 0,0027 0,06 2,3 0,0 1
UGB1-GB4 04 0,0057 0,0038 1,5 1,23 0,01 0,0031 0,28 7,9 1,9 1
UGB1-GB4 05 0,0079 0,0026 3 1,54 0,54 0,0017 0,15 14,5 1,6 1
UGB1-GB4 06 0,0030 0,0020 1,5 1,54 0,05 0,0013 0,12 7,3 0,2 1
UGB1-0134 07 0,0041 0,0014 3 1,12 0,03 0,0012 0,11 13,7 0,5 1
UGB1-GB4 08 0,0052 0,0009 6 0,95 0,03 0,0009 0,08 19,6 2,0 1
UGB1-GB4 09 0,0021 0,0014 1,5 1,25 0,18 0,0011 0,1 4,8 0,6 1
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Mistura de hidrogel durante reticulação, desinchado Propriedades de hidrogel sob condição fisiológica, inchado VN
Nome Concentração de UGB em mmol/ml Concentração de GB em mmol/ml Razão Molar UGB:GB Inchaço Concentração de GB em mmol/ml Concentração de sulfato/sulfonato em mmol/ml Módulo de armazenamento em
Valor médio SD Valor médio SD
UGB1-GB4 10 0,0030 0,0010 3 1,01 0,12 0,0010 0,09 8,1 0,7 1
UGB1-GB4 11 0,0037 0,0006 6 0,86 0,11 0,0007 0,06 8,5 0,4 1
UGB1-G85 12 0,0057 0,0038 1,5 1,68 35,00 0,0023 0,09 8,5 1,7 1
UGB1-GB5 13 0,0079 0,0026 3 1,48 0,23 0,0018 0,13 15,3 0,7 1
LIGB1-GB5 14 0,0030 0,0020 1,5 1,81 0,04 0,0011 0,08 5,5 1,4 1
UGB1-G85 15 0,0041 0,0014 3 1,28 0,08 0,0011 0,08 12,5 1,2 1
UGB1-GB5 16 0,0052 0,0009 6 0,99 0,04 0,0009 0,06 21,8 0,8 1
UGB1-GB5 17 0,0021 0,0014 1,5 1,58 0,08 0,0009 0,07 3,0 0,2 1
UGB1-G65 18 0,0030 0,0010 3 1,05 0,10 0,0009 0,07 6, 9 0,7 1
UGB1-GB5 19 0,0037 0,0006 6 0,90 0,04 0,0007 0,05 8,0 1,3 1
UGB2-GB4 20 0,0015 0,0022 1,5 1,22 0,03 0,0018 0,16 3,7 0,5 2
UGB2-GB4 21 0,0015 0,0015 1 1,62 0,20 0,0009 0,08 1,1 0,2 2
UGB2-GB4 22 0,0015 0,0011 0,75 2,20 0,19 0,0005 0,05 0,2 0,1 2
UGB2-GB5 23 0,0015 0,0022 1,5 1,19 0,17 0,0018 0,14 4,6 1,5 2
UGB2-GB5 24 0,0015 0,0015 1 1,56 0,07 0,0010 0,07 1,2 0,2 2
UGB2-GB5 25 0,0015 0,0011 0,75 1,95 0,72 0,0006 0,04 0,3 0,0 2
UGB2-UGB3 26 0,0018 0,0000 1 1,26 0,25 0,0000 0 4,4 0,5 2
Tabela 2: Propriedades fisico-quimicas dos elementos de base (componentes) de hidrogel de polímero; MWP: massa molar do polímero, MWWE: massa molar da unidade de repetição:
Polímero Abreviação MWP em g/mol MWWE em g/lmol Número de Sulfato/Sulfonato por WE Número de Sulfato/Sulfonato por molécula de polímero
Heparina (HEP) GBl 14,000 540 2,7 70,2
Heparina N-dessulfatada (N-DSH) GB2 13,600 523 1,8 48,4
60, Heparina N- dessulfatada (6ON-DSH) GB3 12,320 474 0,9 23,4
Ácido poli(4estirenossulfônico-comaleico), razão molar de ácido sulfônico para ácido maleico: 3:1 GB4 20,000 660 3,0 90,0
Ácido poli(4estirenossulfônico-comaleico), razão molar de ácido sulfônico: 1:1 GB5 20,000 265 1,0 75,0
4-braço-PEG, terminado em amina UGB1 10,000 44 0,0 0,0
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Polímero Abreviação MWP em g/mol MWWE em g/lmol Número de Sulfato/Sulfonato por WE Número de Sulfato/Sulfonato por molécula de polímero
4-braço-PEG, terminado em tiol UGB2 10,000 44 0,0 0,0
4-braço-PEG, terminado em maleimida UGB3 10,000 44 0,0 0,0
4-braço-PEG, terminado com uma sequência peptidica enzimaticamente clivável UGB4 15,600 44 0,0 0,0
Tabela 3: Propriedades físico-químicas das moléculas de sinalização, ligação ou sequestro das proteínas no hidrogel dos tipos UGB1-GB1 01, UGB1-GB2 02, UGB1-GB5 23, UGB1-GB3 03,
UGB1-GB4 04, UGB2-GB4 20 e o UGB2-UGB3 26 de hidrogel não carregado (como um controle negativo)
Nome ID da Uni pro t Propriedad es físicoquimicas Propried ades estrutur ais Ligação de proteínas em % de hidrogel com nome
Peso mole cuia r em Dalt on IE P Nú me ro de ca rg a po si va Famílias de sequênci a PROSITE UGB1- GB1 01 Valor médio SD UGB1- GB2 02 Valor médio SD UGB2-GB5 23 Valor médio SD UGB1-GB3 03 Valor médio SD UGB1-GB4 04 Valor médio SD UGB2-GB4 20 Valor médio SD UGB2-UGB3 26 Valor médio SD
Fator es de cresc iment o FGF- 2 P09 038 1640 7,6 9, 6 28 P800247 31,0 0% 3, 20 5,40 θ, 70 0,00% 19,70
TGF bl P01 137 1279 4,7 0, 6 15 PS00250 18,0 4, 20 0,00 2, 00 0,00% 5,90%
bNGF P01 138 1349 4,2 9, 0 21 P500248 83,5 7, 30 78,5 0% 4, 50 86,80 0,9% 71,40 3,80% 97,30% 2,2 0% 100,0% 0,00%
EGO P01 133 6222 , o 4, 8 7 PS50026 7,20 5, 10 8,10 3, 00 11,60 9,90% 11,5% 0,90% 28,30% 3,0 0% 36,60% 3,40%
HGF P14 210 5368 3,7 7, 7 78 PS50070 41,7 0% 4, 00 48,3 0% 5, 20 49,6% 14,60 20,60 1,50% 41,30% 11, 80% 60,20% 4,00%
POGF -BB P01 127 1229 4,4 9, 4 19 PS50278 100, 80% 10 , 1 0% 100, 0% 6, 50 82,90 8,50% 100,0 0%. 2,2% 100,00 5,5 0% 100,00 2,00% 19,70% 23,10
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Nome ID da Uni pro t Propriedad es fisicoquímicas Propried ades estrutur ais Ligação de proteinas em % de hidrogel com nome
Peso mole cuia r em Dalt on IE P Nú me ro de ca rg a po si va Familias de sequênci a PROSITE UGB1- GB1 01 Valor médio SD UGB1- GB2 02 Valor médio SD UGB2-GB5 23 Valor médio SD UGB1-GB3 03 Valor médio SD UGB1-GB4 04 Valor médio SD UGB2-GB4 20 Valor médio SD UGB2-UGB3 26 Valor médio SD
PLGF P49 763 2278 5,9 θ, 4 31 PS50279 2,30 3, 30 6, 90 5, 3% 7,70% 1,1% 25,00% 1,7 0%
VEGF -A P16 692 2389 4,4 9, 2 47 PS50280 90,0 0% 1, 10 85,6 0% 1, 1% 96, 3% 2,30% 69,40 4,50% 93,40% 1,3 0% 93,70% 2,9% 1,90% 4,7%
Quimi ocina s Eota xina P51 571 8364 , θ 9, 9 16 PS00472 100, 00% o, 00 98,0 0% o, 40 98,40 1,00% 91,90 2,30% 100,0% 0,0 0% 9,20% 0,20% < 0,1% 5,10%
GROalfa P09 341 7865 , 1 9, 5 12 PS00471 98,4 0% o, 50 79,3 0% 0, 90 96, 8% 2,10% 57,90 2,7% 100,0% 0,0 0% 97,30% 1,70% < 0,1% 8,5%
IL-8 P10 145 8922 , 3 9, 2 17 PS00471 94,20 % 1, 30 89,6 2, 10 94,8% 7,30% 44,70 2,5% 99,00% 0,6 0% 97,60% 1,70% < 0,1% 1,0%
IP- 10 P02 778 8646 ,2 10 ,2 17 P500471 98,2 0, 50 92,7 0% 2, 3% 94,7% 4,10% 85,50 1 7,7% 98,00% 0,6 0% 93,70% 1,50% 16,10% 16,40
MCP- 1 P13 500 868, 9 9, 4 14 PS00472 94,6 0% 1, 60 88,4 0% 0, 7% 99,8% 1,80% 45,30 4,30% 98,70% 0,7 0% 97,40% 1,4% < 9,1% 8,3%
M1P- 1 alfa P10 147 7716 , 5 4, 8 6 PS00472 58,2 2, 70 41,1 0% 1, 20 1,80% 12,1% 28,70 3,70% 97,80% 0,9 0% 94,8% 2,00% < 0,1% 1,70%
MIP- 1 beta P13 236 7818 , 7 4, 8 6 P500472 56, 1 2, 20 38,0 0% 2, 70 78,00 15,70 23,30 3,10% 98,40% 0,7 0% 94,0% 4' 0,2% 1,90%
RANT ES P13 501 7503 , 6 9, 3 11 P500472 99,0 0% 0, 20 95,2 0% 0, 60 94,70 2,40% 90,20 0,50% 99,50% 0,2 0% 97,00% 1,30% < 0,1% 1,50%
SDF- 1 alfa P48 061 8525 , 1 10 , 1 17 PS00471 98,6 0% 0, 30 90,5 0, 60 99,9% 1,90% 80,60 1,5% 99,70% 0,3 0% 97,20% 1,60% < 0,1% 2,9%
Citoc inas GM- CSF P04 141 1447 7,4 5, 2 15 PS00702 6,40 2, 10 3,90 1, 0% 7,50% 14,10 41,10 2,5% 24,20% 1,7 0% 36, 0% 4,50% 1,3% 4,2%
IFN- garna P01 579 1617 7,3 9, 5 28 99,5 o, 10 92,6 0% 2, 00 75,80 14,00 99,00% 0,9 0%
IL-1 beta P01 584 1737 6, 7 59 19 PS00253 27,0 001. 3, 70 25,2 0, 60 6, 50% 8,101 26,20 31% 72,00% 1,90 % 59,6% 5,001. < 0,1% 5,40%
IL- 10 P22 301 1864 7,2 7, 6 25 PS00520 32,7 0% 9, 70 14,7 0% 6, 10 15,70 11,80 16, 50 5,00% 98,80. 0,9 0% 95,40% 4,50% < 0,1% 2,00%
Petição 870190088102, de 06/09/2019, pág. 28/178
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Nome ID da Uni pro t Propriedad es físicoquímicas Propried ades estrutur ais Ligação de proteínas em % de hidrogel com nome
Peso mole cuia r em Dalt on IE P Nú me ro de ca rg a po si va Famílias de sequênci a PROSITE UGB1- GB1 01 Valor médio SD UGB1- GB2 02 Valor médio SD UGB2-GB5 23 Valor médio SD UGB1-GB3 03 Valor médio SD UGB1-GB4 04 Valor médio SD UGB2-GB4 20 Valor médio SD UGB2-UGB3 26 Valor médio SD
IL12p4 0 P2 9 460 3469 6, 6 5, 4 43 59,9 0% 5, 10 85,1 0% 1, 80 45,80 1,30% 92,50% 1,3 0%
IL-4 P05 112 1496 3,0 9, 3 26 P500838 98,5 0% o, 30 82,4 2, 00 95,9% 7,30% 72,60 0,7% 99,10% 0,5 0% 96,80% 2,60% < 0,1% 2,0%
IL-6 P05 231 2081 2,5 6, 2 25 PS00254 24,3 0% 4, 80 7,90 4, 9% 49,4% 20,70 17,30 7,8% 89,50% 1,9 0% 88,20% 4,60% < 0,1% 1,0%
TNFalfa P01 375 1735 2,5 7, 0 18 PS00251 38,9 3, 50 24,7 0% 3, 3% 24,80 3,7% 97,60% 1,1 0%
Escl eros tina O9B QB4 2152 2,1 9, 6 38 65,0 3, 10 42,0 0% 11 ,2 0% 0,00% 8,60%
DKKl 094 907 2577 7,6 θ, 7 42 84,0 6, 20 78,0 0% 3, 20 36, 00 10,10
Classificados como TIPO de acordo com a Tabela 5.1 TIPO 1 TIPO 2 TIPO 2 TIPO 3 TIPO 4 TIPO 4 TIPO 5
Tabela 4: Tempo de ativação dos grupos carboxila de
GB 1 a 5 em min, volume de gel usado para os estudos de ligação
Tempo de ativação Volume de gel para estudos de ligação
UGB1-GB1 01 15 minutos 12,14 μΐ
UGB1-GB2 02 10 min 12,38 μΐ
UGB1-GB3 03 45 min 8,56 μΐ
UGB1-GB 5 a 19 1 min 12,00 μΐ
UGB2-GB4 20 a UGB2- UGB3 26 0 min 10,00 μΐ
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Tabela 5.1 Tipos de gel com faixas de parâmetro
A B C D
Tipo 1 0,0040 a 0,0060 0,09 a 0,20 < 20 não carregado
Tipo 2 0,0025 a 0,0040 0,05 a 0,18 < 20 não carregado
Tipo 3 0,0005 a 0,0025 0,01 a 0,12 < 20 não carregado
Tipo 4 0,0040 a 0,0100 0,16 a 0,80 < 20 não carregado
Tipo 5 0 0 < 20 não carregado
Tabela 5.2 Tipos de gel de modalidades preferenciais
A B C D
Tipo 1 (UGB1-GB1 01) 0,0050 0, 12 < 20 não carregado
Tipo 2 (UGB1-GB2 02) 0,0035 0, 12 < 20 não carregado
Tipo 2 (UGB2-GB5 23) 0,0038 0, 14 < 20 não carregado
Tipo 3 (UGB1-GB3 03) 0,0019 0, 06 < 20 não carregado
Tipo 4 (UGB1-GB4 04) 0,0045 0,28 < 20 não carregado
Tipo 4 (UGB2-GB4 20) 0,0045 0,16 < 20 não carregado
Tipo 5 (UGB2-UGB3 26) 0 0 < 20 não carregado
Tabela 6.1
e F G C D
Tipo 1 60 a 80 0,0015 a 0,0025 0, 09 a 0,20 < 20 não carregado
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23/61
Tipo 2 30 a 75 0,0015 a 0,0030 0, 05 a 0,18 < 20 não carregado
Tipo 3 10 a 30 0,0010 a 0,0040 0, 01 a 0, 12 < 20 não carregado
Tipo 4 80 a 120 0,0018 a 0,0050 0,16 a 0, 80 < 20 não carregado
Tipo 5 0 0 0 < 20 não carregado
Tabela 6.2
e F G C D
Tipo 1 (UGB1-GB1 01) 70,2 0,0018 0, 12 < 20 não carregado
Tipo 2 (UGB1-GB2 02) 48,4 0,0025 0, 12 < 20 não carregado
Tipo 2 (UGB2-GB5 23) 75, 0 0,0018 0, 14 < 20 não carregado
Tipo 3 (UGB1-GB3 03) 23,4 0,0027 0, 06 < 20 não carregado
Tipo 4 (UGB1-GB4 04) 90, 0 0,0031 0,28 < 20 não carregado
Tipo 4 (UGB2-GB4 20) 90, 0 0,0018 0,16 < 20 não carregado
Tipo 5 (UGB2-UGB3 26) 0 0 0 < 20 não carregado
[027] Nas Tabelas de grupos sulfato ou sulfonato dividido pela massa molar (MW)
5.1, 5.2, 6.1 e 6.2, o número por unidade de repetição (WE) da WE é indicado na coluna A
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24/61 como uma propriedade das unidades carregadas em [mol/g]. Como propriedades dos hidrogéis inchados, a concentração dos grupos sulfato ou sulfonato em mmol/ml é dada na coluna B e o módulo de armazenamento em kPa é dado na coluna C. A coluna D lista as propriedades dos elementos de base não carregados.
[028] A coluna E indica a concentração molar dos grupos sulfato ou sulfonato por mol de polímero (em mol/mol) do elemento de base carregado. A coluna F mostra as propriedades dos hidrogéis como concentração de GB em mmol/ml, a coluna G mostra a concentração de grupos sulfato ou sulfonato em mmol/ml e a coluna C como o módulo de armazenamento.
[029] O módulo de armazenamento de 20 kPa corresponde, de acordo com as suposições listadas nos métodos, a um tamanho de malha de aproximadamente 6 nm e, assim, deve permitir acessibilidade estérica de todas as moléculas de sinalização estruturalmente similares abordadas no presente documento nos hidrogéis.
Tabela 7
Nome Concentração/pg/ml
FGF-2 550
TGFbl 4047
bNGF 29500
EGF 11986
HGF 30600
PDGF-BB 26000
PIGF 9971
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25/61
Nome Concert tr ação/pg/ml
VEGF-A 48290
eotaxina 2500
GRO-alfa 9500
IL-8 12386
IP-10 8800
MCP-1 6500
MIP-1 alfa 6400
MIP-1 beta 13500
RANTES 3600
SDF-1 alfa 39800
GM-CSF 41000
IFN-gama 50700
IL-1 beta 8250
IL-10 9250
IL-12p40 13500
IL-4 36200
IL-6 44368
TNF-alfa 31363
esclerostina 13300
DKK1 864
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26/61 [030] A Tabela 7 lista substâncias dos grupos de substância A e B em concentrações relevantes nos biofluidos.
[031] A invenção será explicada agora com referência às modalidades exemplificativas (AB) nas Tabelas mostradas acima.
[032] Por exemplo, os hidrogéis de UG B1-GB1 01 na Tabela 1 (AB1) se provaram particularmente vantajosos para ajustar as concentrações de diferentes moléculas de sinalização (consultar a Tabela 3).
[033] A classe de quimiocinas tem uma alta similaridade estrutural com a estrutura terciária, que é estabilizada pela interação de quatro cisteínas através de pontes de dissulfeto (que corresponde à ID da PROSITE: PS00471 e PS00472) . Ademais, quimiocinas são caracterizadas por um forte IEP de carga positiva liquida > 9 ou domínios positivamente carregados, tais como MTPl-alfa e MTPl-beta e uma massa molar menor que 10 kDa (consultar a Tabela 3) e são fortemente ligadas no hidrogel por esse tipo de hidrogel e, assim, reduzidas a partir de biofluidos adjacentes (ligação de MTPl-alfa e MTPl-beta de aproximadamente 60%, as outras quimiocinas eotaxina, GRO-alfa, IL-8, IP-10, MCP-1, RANTES e SDF-1 alfa estão > 95% ligadas (Tabela 3), enquanto, surpreendentemente, as seguintes moléculas de sinalização altamente carregadas positivamente FGF-2 (IEP 9,58) e TGFbl (IEP 8,59) associadas à classe de fatores de crescimento e proteínas estruturalmente similares da família FGF (que corresponde à ID da PROSITE: PS00247) e da família TGFbl (que corresponde à ID da PROSITE: PS00250) estão ligadas apenas muito fracamente com 31% e 18%, PLGF (IEP 8,37) com uma ligação
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27/61 < 10% ainda menor (Tabela 3), e as moléculas de sinalização associadas à classe de citocinas com um IEP levemente básico, tal como IL-10 (IEP 7,65), assim como moléculas de sinalização com um IEP na faixa neutra (pH 5,5 a 7), tal como ILl-beta, IL6 e TNF-alfa e proteínas estruturalmente similares da proteína IL-l-beta na família (que corresponde à ID da PROSITE: PS00253), na família de proteína IL-10 (que corresponde à ID da PROSITE: PS00520), na família interleucina-6/GM-CSF/MGF (que corresponde à ID da PROSITE: PS00254) e família de proteína TNF-alfa (que corresponde à ID da PROSITE: PS00251) são ligadas apenas fracamente d 30% (Tabela 3) a partir do biofluido complexo (ligação de TNF-alfa de cerca de 38%) e estão, assim, presentes no biofluido em concentrações quase não alteradas. Ademais, o fator de crescimento com uma carga líquida levemente negativa EGF (IEP 4,8) e ligação menor que 10% é quase não ligado. Como resultado, fatores de sinalização essenciais para a sobrevivência das células, tais como EGF, FGF-2, TGFp ou PLGF, permanecem não afetados pelo sequestro realizado por meio dos hidrogéis mencionados acima.
[034] As citocinas fortemente básicas IFN-gama (IEP 9,52), IL-4 (IEP 9,25), os antagonistas de WNT e BMP esclerostina (9,57) e DKK1 (8,72), assim como proteínas estruturalmente similares da família IL-4/IL-13 (que corresponde à ID da PROSITE: PS00838) e a família semelhante a esclerostina (que corresponde à ID da InterPro: IPR008835) e os fatores de crescimento fortemente básicos bNGF (IEP 9,00), PDGF (IEP 9,4) e VEGF (IEP 9,2) e proteínas estruturalmente similares da família NGF (que corresponde à ID da PROSITE: PS00248) e da família PDGF (que corresponde à ID da PROSITE: PS00250) e IL-12p40 estão fortemente ligadas em > 59,9%
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28/61 conforme esperado (Tabela 3) e, portanto, reduzidas do biofluido.
[035] Colocando-se um biofluido em contato com um hidrogel com a carga especificada e a característica de rede do tipo 1 de acordo com Tabela 5.1, uma seleção seletiva de fatores de crescimento que têm proteínas estruturalmente similares a DKK1, bNGF, PDGF-BB, VEGF, assim como quimiocinas (por exemplo, eotaxina, Gro-alfa, IL-8, IP-10, MCP-1 alfa, MIP1 beta, Rantes, SDF1 alfa) e citocinas com proteínas estruturalmente similares a IFN-gama, IL4 e esclerostina, de acordo com motivos de sequência anotados e famílias de proteína podem ser reduzidas a partir do biofluido ou sua concentração no biofluido pode ser aumentada pré-carregando-se o hidrogel, enquanto deixa vantajosamente quase inalterada a concentração das moléculas de sinalização EGF, FGF-2, TGFbl, PLGF, IL-10, IL1 beta, IL6 e TNF alfa mencionadas acima. Adicionalmente, esse hidrogel tem uma interação do GB1 com as enzimas trombina e antitrombina importante para coagulação sanguínea de acordo com Uwe Freudenberg et al., Journal of Controlled Release, Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society 220, n° Parte A (28 de dezembro de 2015): 79 a 88, doi: 10.1016/j.jconrel.2015.10.028 .
[036] Outra modalidade exemplificativa particularmente vantajosa (AB2) consiste no hidrogel tipo UGB1-GB2 02 (consultar a Tabela 2) que tem um modelo de ligação ou sequestro que é quase idêntico ao hidrogel tipo UGB1:GB1 01 (consultar a Tabela 3), exceto pela ligação mais fraca das duas quimiocinas MIP-1 alfa e MIP-1 beta e esclerostina (cada uma de cerca de 40%, Tabela 3) e a ligação ainda mais fraca de IL-10 (15%), IL-6 (8%), TNF alfa (25%), consultar a Tabela 3,
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29/61 e a ligação quase não existente mais vantajosa de FGF-2 (5%) e TGFbl (0%), e a falta de interação de GB2 com as enzimas de coagulação sanguínea trombina e antitrombina (consultar Uwe Freudenberg et al., Journal of Controlled Release, Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society 220, n° Parte A (28 de dezembro de 2015) : 79 a 88, doi: 10.1016/j.jconrel.2015.10.028) . Outra modalidade exemplificativa vantajosa é UGB2-GB5 23 (AB 23, consultar a Tabela 1) , que tem uma característica de carga que também pode, assim como AB2, ser atribuída ao tipo 2 em conformidade com a Tabela 5.1, porém, que tem um teor de sulfonato levemente diferente de 0,14 mmol/ml (Tabela 1 ou Tabela 5.2, coluna B) e um número levemente diferente de grupos sulfonato por unidade de repetição (WE) dividido pelo peso molar (MW) da WE em [mol/g] de 0,0038, no entanto, com ambos os parâmetros na faixa dada na Tabela 5.1 para um hidrogel tipo 2. O hidrogel, no entanto, foi formado a partir de outro elemento de base de gel sintético carregado (GB5) com uma reação de reticulação diferente (reticulação tipo 2, Tabela 1) e tem modelos de ligação ou sequestro quase idênticos ao AB2 (consultar a Tabela 3) exceto pela ligação um pouco mais forte das duas quimiocinas MIP-1 alfa e MIP-1 beta. Isso confirma a classificação dos hidrogéis com os modelos de carga característicos de acordo com a Tabela 5.1 e também representa um modelo de sequestro particularmente vantajoso.
[037] Outra modalidade exemplificativa vantajosa (AB3) é representada pelo hidrogel tipo UGB1-GB3 03 (consultar a Tabela 2), que tem uma ligação significativamente mais fraca com diversas proteínas (moléculas de sinalização) devido à concentração significativamente inferior de grupos sulfato ou
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30/61 sulfonato no hidrogel (Tabela 5.2, coluna Β, 0,06 em comparação com 0,12 mmol/ml para AB1 ou AB2) e também ao número inferior de grupos sulfato ou sulfona por WE dividido pela massa molar da WE de 0,0019 em comparação com 0,005 ou 0,0035 para AB 1 ou AB2 (consultar a Tabela 5.2, coluna A) em comparação com ο AB1 e AB2. Para esse tipo de hidrogel, bNGF, PDGF-BB, e VEGF A, eotaxina, GRO-alfa, IP-10, Rantes, SDF-1 alfa, IFN-gama e IL4 estão mais que 50% ligados pelo hidrogel e, portanto, reduzidos a partir de um biofluido. Por outro lado, IL-8, MCP1 e IL-12p40 estão ligados apenas pelo hidrogel em cerca de 45% (consultar a Tabela 3), HGF, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, IL-1 beta, IL-10, IL-6, TNF alfa e DKK1 em 16 a 36% apenas fracamente (consultar a Tabela 3), e FGF-2, TGFbl, EGF, PLGF, GM-CSF e esclerostina quase não ligados (< 12%) (consultar a Tabela 3) e a maior parte das moléculas de sinalização é, portanto, significativamente menor do que para AB1 e AB2. Com esse tipo de gel, por exemplo, uma separação amplamente seletiva de bNGF, PDGF-BB e VEGF A, eotaxina, GRO-alfa, IP-10, Rantes, SDF-1 alfa, IFN-gama e IL-4 de biofluidos arbitrários é possivel.
[038] Outra modalidade vantajosa é o hidrogel UGB1-GB4 04 (consultar a Tabela 1), que devido à alta concentração de grupos sulfato ou sulfonato de 0,28 mmol/ml no hidrogel (Tabela 5.2, coluna B) e um número igualmente alto de grupos sulfonato por WE dividido pela massa molar de WE de 0, 0045 mol/g, com a exceção de HGF, PLGF, GM-GSF e EGF, se liga a todos os fatores investigados com uma alta eficiência (entre 72 a 100%, consultar a Tabela 3) no hidrogel e, assim, reduz os mesmos do biofluido (consultar a Tabela 3).
[039] Em particular, com esse hidrogel, uma redução de todos os fatores investigados e estruturalmente
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31/61 similares (IEP e a presença de similaridades estruturais) de biofluidos adjacentes ocorre, particularmente a classe de quimiocinas, que têm alta similaridade estrutural da estrutura terciária que resulta da interação de quatro cisteínas por pontes de dissulfeto (que corresponde à ID da PROSITE: PS00471 e PS00472) e que são caracterizadas por um IEP de carga liquida fortemente positiva > 9 ou domínios positivamente carregados como em MIP1 alfa e MIP1 beta e um peso molecular menor que 10 kDa (consultar a Tabela Propriedades de proteína), FGF-2 (IEP 9,58), TGFbl (IEP 8,59) e proteínas de família FGF estruturalmente similares (que corresponde à ID da PROSITE: PS00247), a família TGF (que corresponde à ID da PROSITE: PS00250) e a classe de moléculas de sinalização associada às citocinas que têm IEP levemente básico, tal como IL-10 (IEP 7,65) assim como moléculas de sinalização com um IEP na faixa neutra (pH 5,5 a 7), tal como ILIB, IL6 e TNF, e proteínas estruturalmente similares da família de proteína IL-Ιβ (que corresponde à ID da PROSITE: PS00253) e da família de proteína IL-10 (que corresponde à ID da PROSITE: PS00520) . Outra modalidade exemplificativa vantajosa, UGB2-GB4 20 (consultar a Tabela 1), que com uma característica de carga que também pode, de acordo com a Tabela 5.1, ser associada ao tipo 4 como AB4, que tem o mesmo GB 5, consultar a Tabela 5.1, coluna A: 0,0045, porém, uma concentração de sulfonato inferior de 0,16 mmol/ml (consultar a Tabela 1 e a Tabela 5.1) que ainda é atribuível ao tipo 4, porém, foi formada com uma reação de reticulação diferente (VN: 2 na Tabela 1), tem um modelo de ligação ou sequestro quase idêntico ao UGB1-GB4 04 (consultar a Tabela 3) . Esse resultado, assim, também confirma o poder preditivo eficaz da característica de carga dos tipos 1 a 5,
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32/61 de acordo com a Tabela 5.1, para o sequestro diferenciado de substâncias ou grupos de substâncias.
[040] Outra modalidade exemplificativa é o hidrogel não carregado (UGB2-UGB3 26) formado a partir de UGB1 e UGB3 que, como esperado, liga como um controle negativo quase nenhuma das moléculas de sinalização do biofluido. Exceto pelo sequestro menor de PDGF-BB de 19,7 ± 23,1% e IP 10 de 16,1 ± 16,4%, que não pode ser classificado como significativo devido aos grandes desvios padrão, nenhum sequestro (< 1,3% para todas as moléculas de sinalização testadas, consultar a Tabela 3) ocorre para esse hidrogel. Esse resultado pode ser claramente atribuído à ausência de centros de afinidade carregados e, assim, à ausência das interações de carga abordadas acima. O módulo de armazenamento e também, portanto, o tamanho de malha de rede, no entanto, de 4,4 kPa (Tabela 1) são quase idênticos aos módulos de armazenamento de UGB1-GB2 02, UGB2-GB4 20 e UGB2-GB5 23, isto é, as interações esféricas com as modalidades exemplificativas carregadas as moléculas de sinalização são comparáveis. Esses resultados, em particular pela falta de interações (isto é, a ausência de efeitos de ligação e sequestro) do hidrogel não carregado (UGB2-UGB3 26) com as moléculas de sinalização, fundamentam as reivindicações para sequestro diferenciado de acordo com a Tabela 5.1.
[041] Ao mesmo tempo, fatores individuais podem ser liberados no biofluido pré-carregando-se seletivamente os hidrogéis dos tipos 1 a 3 da Tabela 5, em paralelo e independentemente do sequestro e, portanto, redução dos outros fatores. Assim, com os vários tipos de hidrogéis, quase nenhum nível de moléculas de sinalização individuais nos biofluidos complexos pode ser ajustado através pré-carga alvejada dos
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33/61 hidrogéis ou do sequestro quase quantitativo (redução) de moléculas de sinalização (por exemplo, aplicação para separar moléculas de sinalização de qualquer solução que contém proteína).
[042] Com base nas modalidades exemplificativas em UGB1-GB1 01 a UGB2-UGB3 26, as seguintes relações entre propriedades de proteína, propriedades de hidrogel e ligação de proteínas na rede de hidrogel importantes para a descrição da invenção são evidentes: Uma forte ligação das moléculas de sinalização, de acordo com a Tabela 3, se correlaciona no lado das proteínas com uma carga liquida positiva (e aqui com um IEP básico e alto como o parâmetro correspondente) assim como com o inverso do peso molecular (alto IEP e pequeno peso molecular intensificam a ligação, consultar a Tabela 3, as quimiocinas altamente carregadas positivamente e relativamente pequenas (< 9 kDa) estão mais fortemente ligadas e no lado da rede de hidrogel, (1) uma alta concentração de grupos sulfato ou sulfonato no hidrogel (Tabela 1 e 5.2, coluna B), e (2) um alto número de grupos sulfato ou sulfonato por WE dividido pela massa molar da WE intensifica a ligação das moléculas de sinalização. Proporcional a esses parâmetros, a seguinte ordem sequencial para os hidrogéis a partir da ligação mais forte até a ligação mais fraca: UGB1-GB4 04 « UGB2-GB4 20 < UGB1-GB1 01 < UGB1-GB2 02 « UGB2-GB5 23 < UGB1-GB3 03 « UGB2-UGB3 26. Esse resultado é sustentado pelos valores de ligação experimentalmente encontrados (consultar a Tabela 3) . Adicionalmente, com diferentes combinações dos parâmetros de rede de hidrogel mencionados acima (1) e (2), as fortes interações conhecidas na literatura como interações específicas - isto é, uma correspondência espacial dos
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34/61 diferentes centros de interação, entre proteínas e polieletróütos negativamente carregados (por exemplo, aminoglicanos de glicose) podem ser ajustadas, e outras propriedades estruturais adicionalmente ao peso molecular e carga líquida também podem, assim, ser usadas no lado de proteína para modular a ligação aos hidrogéis. Essas correlações explicam também a baixa ligação das moléculas de sinalização fortemente básicas e relativamente pequenas ΡΟΕΣ, TGFbl e PLGF aos tipos de hidrogel UGB1-GB1 01, UGB1 GB202, GB3 UGB1-03 e UGB1-GB4 04.
[043] As possibilidades adicionais para controlar os níveis de moléculas de sinalização solúveis são com base no uso sequencial ou combinado dos diferentes tipos de hidrogel de modo a ajustar precisamente uma ampla variedade de propriedades de sequestro e liberação específicas. Através de variação alvejada das propriedades de rede (em particular, os parâmetros anteriormente descritos (1) e (2) e também a combinação de micropartícuias de hidrogel de composição diferente (por exemplo, carregamento com moléculas de sinalização individuais) em denominados materiais de hidrogel multifásicos (isto é, misturando-se tipos de hidrogel de diferentes tipos ou pré-carregando-se com moléculas de sinalização ou proteínas)), outras razões de concentração vantajosas também podem ser definidas em biofluidos adj acentes.
[044] Estendendo-se a análise a moléculas de sinalização adicionais, o método proposto também permite o controle da concentração dessas substâncias em qualquer tipo de biofluidos.
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35/61 [045] De modo a ter capacidade para controlar de maneira eficaz as funções biológicas complexas de moléculas de sinalização, por exemplo para conceitos terapêuticos, um gerenciamento ativo de diferentes moléculas de sinalização a partir do ambiente biológico imediato das células ou a aplicação biológica é necessária adicionalmente à liberação prolongada de moléculas de sinalização individuais do hidrogel pré-carregado com as moléculas de sinalização. As interações com um grande número de moléculas de sinalização relevantes devem, portanto, ser consideradas. Quando hidrogéis que contêm componentes sulfatados ou sulfonados são carregados, por exemplo, com uma molécula de sinalização para liberação prolongada, outras moléculas terapeuticamente importantes do ambiente biológico podem ser simultaneamente sequestradas e, assim, inativadas simultaneamente com a liberação terapeuticamente desejada das moléculas de sinalização, assim se representa um efeito colateral indesejado. Por outro lado, no entanto, também é possível sequestrar especificamente e, assim, inativar moléculas de sinalização terapeuticamente indesejadas em hidrogel que carrega os grupos sulfatados ou sulfonados. Em geral, situações de liberação e sequestro muito complexas são possíveis, que decidem em sua totalidade sobre o efeito biológico, em particular as propriedades de separação molecular dos materiais.
[046] Modalidades mais vantajosas da invenção incluem o uso de hidrogéis, de acordo com os tipos 1 a 4 da Tabela 5 para modular a concentração ou níveis de proteínas biologicamente ativas em baixos níveis totais.
[047] Uma vantagem essencial do método está na universalidade de suas possibilidades de aplicação. O método
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36/61 pode ser vantajosamente usado tanto para purificação biotecnológica quanto para separação de misturas de proteína de ou em biofluidos com o uso de hidrogéis com componentes sulfatados ou sulfonados.
[048] Em um sentido exemplificativos mais restrito, o método para gerenciamento de fator pode ser usado in vivo para controlar a angiogênese, doenças imunológicas, diabetes, doenças neurodegenerativas e cicatrização de ferida.
[049] Em cicatrização de ferida, a maior parte de quimiocinas de atuação pró-inflamatória (por exemplo, eotaxina, GRO-a, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-3, MCD, Rantes e SDF1) são sequestradas dentro dos hidrogéis, enquanto fatores pró-regenerativos (por exemplo, EGF, FGF-2, TGFbl, IL-10, HGF e PLGF) permanecerão amplamente não afetados.
[050] Um campo de aplicação particularmente importante da invenção é o controle das concentrações de substâncias em biofluidos, que são responsáveis por decidir o destino das células in vitro e in vivo. A desregulação de quimiocinas de atuação pró-inflamatória e a inflamação crônica associada é a causa do desenvolvimento de várias doenças, tais como doença de Crohn, colite ulcerosa, esclerose múltipla, asma ou artrite reumatoide. A modulação colite ulcerosa da concentração desses fatores inflamatórios de biofluidos através da aplicação de diferentes hidrogéis com componentes sulfatados ou sulfonados, de acordo com a invenção, representa uma possível situação de aplicação.
[051] Em um sentido mais amplo, a aplicação dos hidrogéis com componentes sulfatados ou sulfonados, de acordo com a invenção, permite uma purificação alvejada das moléculas de sinalização aqui investigadas ou estruturalmente similares
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37/61 das misturas de proteína complexas. Os sistemas de gel descritos podem, assim, ser biotecnologicamente usados para a purificação alvejada de proteínas a partir de lisados celulares de origem microbiana ou eucariótica. Nesse caso, esses lisados celulares são induzidos por hidrogéis, de acordo com a invenção, a ligar as moléculas de sinalização. Em uma segunda etapa, as substâncias ligadas podem ser removidas novamente dos hidrogéis para uso adicional enxaguando-se com soluções salinas altamente concentradas ou polieletrólitos positivamente carregados (por exemplo, quitosana) e, assim, separadas. Ademais, uma seleção negativa para a separação das moléculas de sinalização, que estão sob essas condições fracamente ligadas aos hidrogéis dos tipos 1 a 3 de ligação exemplificativa. EGF, FGF-2, TGF-.beta., IL-10, HGF e PLGF, é possível com o uso de sobrenadantes após 24 h de ligação.
[052] Uma vantagem prática relevante da invenção é que a ligação de uma variedade de moléculas de sinalização biologicamente relevantes em hidrogéis sulfatados ou sulfonados com característica de carga classificada alvejada e estrutura de rede é realizada mesmo em altas concentrações de albumina de 1 mg/ml a 45 mg/ml em níveis simultaneamente baixos de moléculas de sinalização de 100 pg/ml a 2.000 ng/ml em um eletrólito fisiológico como um biofluido, e que como resultado, as diferenças de seletividade na ligação das moléculas de sinalização individuais para os diferentes tipos de hidrogel podem ser empregadas.
[053] As modalidades exemplificativas de UGB1GB1 01 a UGB1-GB4 011 dadas na Tabela 1 são hidrogéis covalentemente reticulados de acordo com a reação de reticulação 1, em que 6 a 24 grupos carboxila (dependendo da
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38/61 razão molar de 1,5 a 6 em PEG estrela de quatro braços) de uma molécula de GB4 (ácido poli(4-estirenossulfônico-co-malico), razão molar de ácido estirenossulfônico:ácido maleico de 3: 1, Tabela 1) foram ativados com EDC/sulfo-NHS e reagidos diretamente com o UGB1 terminado em amina de quatro braços para render um hidrogel (consultar a Tabela 1), que resulta em hidrogéis com uma concentração de sulfonato variável de 0,28 a 0,06 mmol/ml e módulos de armazenamento variável de 4,8 a 19,6 kPA (consultar a Tabela 1).
[054] As modalidades exemplificativas dadas na Tabela 1, UGB1-GB5 12 a UGB1-GB5 19 são hidrogéis covalentemente reticulados de acordo com o princípio de reticulação 1 no qual 6 a 24 grupos carboxila (dependendo da razão molar de 1,5 a 6 em PEG estrela de quatro funções) de uma molécula de ácido poli(4-estirenossulfônico-co-maleico) com a razão molar de ácido estirenossulfônico para ácido maleico de 1:1 (GB5), foram ativados por EDC/SN HS e convertidos diretamente em um hidrogel por meio do UGB1 terminado em amina de quatro braços (consultar a Tabela 1), que resulta em hidrogéis com uma concentração de sulfonato variável de 0,13 a 0,05 mmol/ml e módulos de armazenamento variáveis de 3 a 21,8 kPA (consultar a Tabela 1).
[055] As modalidades exemplificativas UGB2-GB4 20 a UGB2-GB4 22 são hidrogéis covalentemente reticulados de acordo com o princípio de reticulação 2, no qual oito dentre os grupos carboxila do GB4 (ácido poli (4-estirenossulfônicoco-maleico) com a razão molar de ácido estirenossulfônico:ácido maleico de 3: 1) e ativados com EDC/sulfo-NHS estão em uma primeira etapa funcionalizados com a molécula reticuladora bifuncional curta N- (2Petição 870190088102, de 06/09/2019, pág. 46/178
39/61 aminoetil)maleimida e, depois disso, são purificados e isolados. Esses derivados de GB4 foram então convertidos em um hidrogel misturando-se em solução salina fisiológica (ou soro) com o UGB-2 (PEG de quatro braços terminado em tiol), que resulta em hidrogéis com uma gradação na concentração de grupos sulfonato de 0,16 a 0,05 mmol/ml e os módulos de armazenamento de 3,7 a 0,2 kPa.
[056] As modalidades exemplificativas UGB2-GB5 23 a UGB2-GB5 25 são hidrogéis covalentemente reticulados de acordo com o princípio de reticulação 2 (VN2, Tabela 1), no qual oito dentre os grupos carboxila do GB5 (ácido poli (4estirenossulfônico-co-maleico) com a razão molar de ácido estirenossulfônico:ácido maleico de 1: 1) e ativados com EDC/sulfo-NHS são funcionalizados em uma primeira etapa através da molécula reticuladora bifuncional curta N-(2aminoetil)maleimida e subsequentemente purificados e isolados. Esses derivados de GB5 foram então convertidos em um hidrogel misturando-se em solução salina fisiológica (ou soro) com o UGB-2 (PEG de quatro braços terminado em tiol), que resulta em hidrogéis com uma gradação na concentração de grupos sulfonato de 0,14 a 0,04 mmol/ml e os módulos de armazenamento de 4,6 a 0,3 kPa.
[057] A modalidade exemplificativa UGB2-UGB3 26 é um hidrogel de PEG não carregado no qual, de acordo com o princípio de reticulação 2, PEG de quatro braços terminado em tiol (UGB-2) foi reagido com um PEG de quatro braços terminado em maleimida (UGB-3). Esse hidrogel serviu nos experimentos de sequestro como um controle negativo não carregado.
[058] Surpreendentemente, hidrogéis completamente sintéticos que têm uma grande faixa de
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40/61 propriedades e combinações vantajosas de propriedades e sem reações imunogênicas desvantajosas podem ser preparados com base nas modalidades exemplificativas 04 a 5. Assim, uma concentração ampla de grupos sulfonato no hidrogel inchado de 0,04 a 0,28 mmol/ml e com uma variação igualmente grande do módulo de armazenamento 0,2 a 21,8 kPa é amplamente ajustável, independente uma da outra. Por exemplo, os hidrogéis UGB2-GB4 21, UGB1-GB5 14, UGB1-GB5 15 e UGB1-GB4 08 têm uma concentração constante de grupos sulfonato no hidrogel inchado de 0,08 mmol/ml, porém, ao mesmo tempo módulos de armazenamento crescentes de 1,1, 5,5, 12,5 e 19,6 kPa, isto é, a concentração de sulfonato e a rigidez dos hidrogéis podem ser moduladas independentemente uma das outras sobre uma ampla faixa. Além disso, com a seleção de UGB1-GB5 19 que tem uma concentração de sulfonato de 0,05, UGB1-GB4 11 que tem uma concentração de sulfonato de 0,06 e UGB1-GB4 10 que tem uma concentração de sulfonato de 0,09 com um módulo de armazenamento quase constante de 8,0 a 8,5 kPa, a concentração de sulfonato pode ser variada independentemente da rigidez dos hidrogéis (consultar a Tabela 1) . Adicionalmente, com uma variação adicional das razões molares UGB:GB nas faixas entre 1,5 e 3 e entre 3 e 6 para o VN1 e entre 0,5 e 0,75 e 1 e entre 1,5 e
1,5 e 2 para o VN2 e uma variação adicional da concentração do GB e UGB, diversas outras combinações de propriedades podem ser produzidas.
[059] Surpreendentemente, através de reticulação do ácido poli(4-estirenossulfônico-co-maleico), estrelando-se com a ativação de EDC/sulfoNHS de um dos grupos ácidos mais próximos adjacentes no ácido maleico, que são influenciados de uma maneira imprevisível em sua reatividade não apenas através
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41/61 do grupo carboxila adjacente, porém, especialmente através dos grupos sulfonato e das unidades de estireno hidrofóbicas, materiais de hidrogel definidos com elementos de base não carregados poderíam ser sintetizados com as propriedades amplamente graduáveis mencionadas acima. Aqui, uma formação de rede precisa (para VN1) ou derivatização (para VN2) foi atingida com o uso de um tempo de ativação surpreendentemente muito curto de 1 min, isto é, o tempo durante o qual o EDC/sulfoNHS foi adicionado em ácido poli(4estirenossulfônico-co-maleico), consultar a Tabela 4, depois disso uma molécula que carrega grupo amino foi reagida
misturando-se com o ácido poli ( 4-estirenossulfônico-co-
maleico) então ativado e uma mistura interna muito intensiva
dos reagentes.
[060] Em outra modalidade exemplificativa,
hidrogéis dos tipos UGB1-GB1 01, UGB1-GB4 20, UGB1-GB5 23 e UGB1-GB3 26 foram funcionalizados com o peptídeo de adesão CWRGDSP e pré-carregados com VEGF-A e FGF-2, e usados na superfície de gel em um meio de cultura celular livre de soro para o cultivo de células endoteliais humanas. A morfologia das células aderentes foi analisada após um período de cultivo de 24 h, conforme mostrado na Figura 1 para UGB1-GB1 01, UGB2GB4 20, UGB2-GB5 23, e UGB2-UGB3 26. As células endoteliais assumiram uma morfologia diferente nos hidrogéis diferentes, descritível pelos dois parâmetros razão de aspecto e circularidade. Uma alta razão de aspecto e baixa circularidade corresponde à morfologia de célula endotelial alongada desejada, a primeira etapa na formação das estruturas tubulares biologicamente desejadas. A razão de aspecto das células endoteliais cultivadas em UGB1-GB1 01, UGB2-GB4 20 e UGB2-GB5
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42/61 foi 3,4 ± 1,0, 4,1 ± 1,1 e 4,9 ± 1,6, enquanto os géis de referência não carregados UGB2-UGB3 26 tiveram uma razão de aspecto significativamente inferior de 2,1 ± 1,2. A circularidade foi correspondentemente o inverso com 0,5 ± 0,1, 0,4 ± 0,1, 0,3 ± 0,1 e 0,7 ± 0,3 para células endoteliais nos hidrogéis UGB1-GB1 01, UGB1-GB4 20 e UGB1-GB5 23 e UGB1-GB3 26. Essas diferenças foram altamente significativas estatisticamente. Consequentemente, as células endoteliais de acordo com a Tabela 5.1 se comportam significativamente diferentes dos hidrogéis com as propriedades de carga e sequestro diferentes do tipo 1 (UGB1-GB1 01), do tipo 4 (UGB2GB4 20), do tipo 2 (UGB2-GB5 23) e do tipo 5 não carregado (UGB1-GB3 26). No hidrogel não carregado, as células mostram razões de aspecto curtas indesejáveis e alta circularidade, enquanto a morfologia desejada aumenta na ordem de UGB1-GB1 01 < UGB1-GB4 20 < UGB2-GB5 23. O hidrogel UGB2-GB5 23 do tipo 2 mostra os melhores resultados nesse experimento. Essa classificação confirma, assim, uma influência direta das propriedades de carga e modelos de sequestro na cultura de células endoteliais humanas.
[061] Em outra modalidade exemplificativa, hidrogéis do tipo 1 (UGB1-GB1 01), do tipo 4 (UGB1-GB4 20), do tipo 2 (UGB1-GB5 23) e do tipo 5 não carregado (UGB1-UGB3 26) foram usados para polimerização de células do estroma mesenquimais humanas. Os hidrogéis foram responsivos de célula, isto é, adicionalmente à funcionalização dos hidrogéis com o peptídeo de mediação de adesão CWGRGDSP, a sequência peptídica clivável GCGGPQGIWGQGGCG enzimaticamente clivável pelas metaloproteases de matriz secretadas por essas células foi preconjugada no respectivo elemento de base não carregado
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43/61 e usada para reticulação de acordo com VN2. A atividade metabólica das células incorporadas foi caracterizada após 24 horas por um teste PrestoBlue® como evidência de disponibilidade. A atividade metabólica, medida como unidades de fluorescência relativa, das células do estroma mesenquimais humanas polimerizadas dentro do hidrogel do tipo 1 foi de 7112 ± 3924, do tipo 2 de 3704 ± 2945, do tipo 4 de 3160 ± 6023 e do tipo 5 não carregado de 2316 ± 446, respectivamente. Consequentemente, células do estroma mesenquimais humanas mostraram a atividade metabólica mais elevada quando incorporadas nos géis Tipo 2 e a atividade metabólica mais baixa quando incorporadas em géis do gel de referência não carregado. Os hidrogéis, especialmente do tipo 2, provaram, assim, ser particularmente vantajosos para o cultivo de células do estroma mesenquimais humanas vivas em 3D.
[062] Em outra modalidade exemplificativa vantajosa, UGB1-GB1 01, UGB2-GB4 20, UGB2-GB5 23, e UGB2-UGB3 26 foram funcionalizados por sequestro diferenciado com o antibiótico gentamicina que carrega grupos positivamente carregados. A inibição foi, então, medida liberando-se a gentamicina dos hidrogéis diferentes com o uso das duas cepas bacterianas patogênicas relevantes Escherichia coli (E. coli) e Staphylococcus epidermidis (Staph. Epidermidis). A atividade antimicrobiana foi medida através do tamanho da zona de inibição (distância do hidrogel na placa de cultura, consultar Materiais e Métodos). Nenhuma zona de inibição foi detectável para os hidrogéis dos tipos UGB1-GB101, UGB2-GB420, UGB2GB523, e UGB2-UGB3 26 sem sequestro de gentamicina anterior, isto é, os hidrogéis não tiveram um efeito antimicrobiano. No caso de um sequestro diferenciado anterior de gentamicina pelos
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44/61 hidrogéis, as seguintes zonas de inibição classificadas foram medidas: UGB1-GB1 01: 3,08 ± 0,33 mm, UGB2-GB4 20 E. coli: 3,08 ± 0,33 mm, S epidermidis: 2,94 ± 0,35 mm, UGB2-GB4 20: E. coli: 1,78 ± 0,27 mm, S. epidermidis: 1,76 ± 0,45 mm; UGB2-GB5 23 E. coli: 2,18 ± 0,38 mm, S. epidermidis: 1,81 ± 0,51 mm, e para o gel de referência não carregado UGB2 UGB3-26 E. coli: 0,48 ± 0,36 mm, S. epidermidis: 0,90 ± 0,28 mm. Consequentemente, conforme esperado, apenas quantidades muito pequenas de gentamicina são sequestradas, não especificamente para os géis de referência não carregados UGB2-UGB3 26 e subsequentemente liberados novamente. Para os outros hidrogéis, uma ação antimicrobiana classificada poderías ser encontrada na ordem UGB2-GB420 < UGB2-GB523 < UGB1-GB1 01. Esse resultado sustenta as reivindicações para o sequestro diferenciado de moléculas de fármaco positivamente carregadas. Adicionalmente, efeitos antimicrobianos diferentes também podem ser estabelecidos variando-se a concentração de sulfurização de gentamicina.
Material e métodos:
Dessulfatação seletiva de região de heparina (produzida a partir de GB2 e GB3 de GB1) [063] Para a síntese de dessulfatação seletiva de região de heparina (GB2 e GB3), heparina (MW 14,000, Merck Millipore, n° do fabricante: 375095, Alemanha, GB1) foi primeiro dissolvida em água ultrapura desionizada e dessalinizado com o auxílio de uma coluna de troca iônica Amberlite IR-120H+ (Sigma-Aldrich, Alemanha). Através da adição de piridina (Sigma-Aldrich, Alemanha) na solução de heparina até que fosse alcançado pH 6, um sal de heparina e piridina foi formado, o qual, enriquecido por evaporação de
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45/61 solvente em um evaporador giratório B-490 (Büchi, Alemanha) , foi subsequentemente liofilizado a -80 °C (GEA Lyovac GT2,
Alemanha) e armazenado a -20 °C até o processamento adicional.
[064] Para preparar heparina N-dessulfatada (NDSH, GB2), 1 g/l de heparina e piridina foi dissolvido em uma mistura de DMSO e água ultrapura desionizada (95: 5) e incubado a 50 °C por 1,5 horas. A solução resultante foi diluída 1:1 com água ultrapura desionizada e ajustada para pH 9 com solução de hidróxido de sódio a 1 M (Sigma-Aldrich, Alemanha) . Após dialisar a solução (Spectrum Labs, Alemanha, MWCO = 8 kDa) contra água ultrapura desionizada por três dias, acetilação de N de heparina dessulfatada foi realizada. Com essa finalidade, 10% em v/v de metanol (Sigma-Aldrich, Alemanha) e 50 mM de carbonato de sódio (Sigma-Aldrich, Alemanha) foram adicionados na solução. A reação de acetilação foi conduzida por três horas com resfriamento à 4 °C e agitação constante a 400 rpm através da adição de 400 μΐ de anidrido acético (Sigma-Aldrich, Alemanha) por 1 mg de heparina a cada meia hora e ajuste subsequente do pH em 7,5 através da adição de uma solução de carbonato de sódio a 2 M.
[065] Para preparar heparina 60-N-dessulfatada (6ON-DSH, GB 3), 1 g/l de heparina e piridina foi dissolvido em uma mistura de DMSO e água ultrapura desionizada (95: 5) e incubado a 90°C por 24 horas. A solução resultante foi diluída 1: 1 com água ultrapura desionizada e ajustada para pH 9 com solução de hidróxido de sódio a 1 M (Sigma-Aldrich, Alemanha). Após dialisar em uma tubulação dialítica (Spectrum Labs, Alemanha, MWCO = 8 kDa) contra água ultrapura desionizada por três dias, a heparina 60-N-dessulfatada foi enriquecida
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46/61 através de evaporação de solvente B-490 (Büchi, Alemanha) e depois disso liofilizada (GEA Lyovac GT2, Alemanha).
Caracterização de GB e UGB (consultar a Tabela 2):
[066] O peso molecular de GB1 a GB3 foi determinado através de difusão de luz de múltiplos ângulos a 690 nm em um Dawn HELEOS II (Wyatt Technology Europe, Alemanha). Os valores dn/dc necessários para a determinação de peso molecular foram determinados com um detector de RI (Optilab T-rEX, Wyatt, Alemanha) em um comprimento de onda de λ = 690 nm. Os incrementos de RI, dn/dc, de 0,1351 ml»g-l para GB1, GB2 e GB3 foram necessários para a avaliação dos experimentos de difusão de luz. A avaliação dos resultados de difusão de luz para determinar a massa molar foi conduzida com o software Astra, versão 6.1 (Wyatt Technology, E.U.A.).
[067] O grau de sulfatação dos derivados de heparina (GB1 a GB3) foi determinado por análise elementar (Elementar, Vario MICRO cube, Alemanha) com base na razão molar de S:N. Devido a cada unidade de dissacarídeo conter exatamente um átomo de N, o grau de sulfatação de GB1, GB2 e GB3 (número de grupos sulfato/unidade de repetição) foi determinado pela razão molar de S:N. Ademais, a massa molar da unidade de repetição foi determinada a partir disso. O número de grupos sulfato por unidade de repetição ou por mol de polímero foi calculado com base nisso.
[068] O peso molecular e o número de grupos sulfonato por unidade de repetição ou por mol de polímero de GB4 e GB5 (ácido poli(4-estirenossulfônico-co-maleico)) são com base nas informações do fabricante (Sigma-Aldrich, n° do fabricante: 434566, Alemanha).
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47/61 [069] 0 peso molecular e a estrutura de UGB1, UGB2, UGB3, PEG de quatro braços terminado em amino, tiol ou maleimida são com base em informações do fabricante (Jenkem Technology, E.U.A.). A massa molar e a estrutura de UGB4 (PEG com quatro braços terminado em peptídeo enzimaticamente clivável) foram produzidas e usadas de acordo com o processo descrito por Tsurkan et al. 2013 (Adv. Mater. 2013, 25, 2.606 a 2.610) .
Preparação dos hidrogéis com base em heparina ou derivados de heparina (consultar também a Tabela 1):
[070] Para preparar os hidrogéis, heparina (GB1) (Merck-Millipore, n° do fabricante: 375095, Alemanha), derivados de heparina dessulfatada com base em GB1 foram dissolvidos por métodos anteriormente descritos de acordo com o tipo de hidrogel (consultar a Tabela 2) como o componente carregado (GB), consultar dessulfatação seletiva de região, para GB2 e GB3) em água ultrapura desionizada a 4 °C por 30 segundos a 500 rpm com um misturador de vórtex (IKA, Alemanha) . Adicionalmente, PEG terminado em amina de quatro braços (MW 10,000, Jenkem Technology, E.U.A.), l-etil-3-(3dimetilaminopropil)carbodi-imida (EDC; Sigma-Aldrich, Alemanha) e N-hidroxissulfossuccinimida (sulfo-NHS, SigmaAldrich, Alemanha) foram dissolvidos da mesma maneira para todos os tipos de hidrogéis como UGB1. De modo a assegurar a solução completa dos elementos de base de hidrogel, essas soluções foram adicionalmente tratadas por 5 min a 4 °C com um banho ultrassônico (RK 100H, Bandelin, Alemanha).
[071] Para ativar o GB1 a GB 3, EDC e sulfo-NHS (razão de 2:1 de EDC:sulfo-NHS) foram adicionados ao GB dissolvido (4 mol de sulfo-NHS, 8 mol de EDC por mol de UGB1
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48/61 da mistura de reação final) e incubados a 4 °C de acordo com os tempos listados na Tabela 4. Após o tempo de ativação de
GB1, GB2, GB3, o PEG de 4 braços terminado em amino dissolvido (UGB1) foi adicionalmente adicionado e misturado por 30 segundos a 500 rpm com um misturador de vórtex (IKA, Alemanha) .
Preparação dos hidrogéis com base em ácido poli(4estirenossulfônico-co-maleico) após reação de reticulação 1 (VN1, consultar também a Tabela 1):
[072] Ácido poli(4-estirenossulfônico-comaleico) com a razão molar de ácido 4-estirenossulfônico:ácido maleico de 3:1 (Sigma-Aldrich, n° do fabricante: 434566, Alemanha, GB4, consultar a Tabela 2) e com a razão molar de ácido 4-estirenossulfônico: ácido maleico de 1:1, SigmaAldrich, n° do fabricante: 434558, Alemanha, GB5, consultar a Tabela 2) e o UGB1 (PEG tetravalente terminado em amina, MW 10,000, Jenkem Technology, E.U.A.) foram usados para preparar hidrogéis covalentemente reticulados da seguinte maneira: GB4 ou GB5 e UGB1 foram, cada um, dissolvidos em um terço do volume total da mistura de hidrogel em água ultrapura desionizada com a concentração de 3 vezes, conforme mostrado na Tabela 1, e adicionalmente tratados por 5 min a 4 °C com um banho ultrassônico (RK 100H, Bandelin, Alemanha). Depois disso, todas as soluções foram temperadas a 4 °C, durante as etapas adicionais: l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (EDC, Sigma-Aldrich, Alemanha) e N-hidroxissulfossuccinimidas (sulfo-NHS; Sigma-Aldrich, Alemanha) também foram dissolvidas em um sexto da mistura de reação total e temperadas a 4 °C. A razão molar de UGB1: EDC:sulfoNHS é de 1:8:4 (1: 2: 1 para cada grupo amino de UGB1). Na próxima etapa, a EDC e a sulfoNHS foram adicionadas ao GB4 ou GB5 e misturadas através de
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49/61 pipetação, e após um tempo de espera de 30 segundos a mistura de reação foi misturada no agitador de vórtex (VWR, Alemanha) por 10 segundos, seguido por outra espera de 20 segundos. Após esse procedimento, com um tempo de ativação total de 1 min, o UGB1 no agitador de vórtex foi pipetado no GB4 ou GB5 ativado e, então, misturado com o agitador de vórtex por mais 10 seg. A mistura de reação final (as concentrações de UGB1 e GB4 ou GB5 agora correspondem às concentrações dadas na Tabela 1) podería ser agora despejada pipetando-se em formas arbitrárias, em que a gelificação ocorre através de polimerização durante um período de 12 horas. Subsequentemente, os hidrogéis foram completamente inchados em solução salina tamponada de fosfato através de troca de solução repetida durante muitas horas antes do uso ou caracterização adicional dos hidrogéis.
Preparação dos hidrogéis para a cultura celular com células endoteliais humanas:
[073] Para a cultura de células endoteliais humanas, géis ligados à superfície que têm uma espessura final de cerca de 100 pm foram formados pipetando-se 11 μΐ da mistura de reação final/cm2 em lamelas de vidro. As lamelas de vidro foram anteriormente revestidas com um fino filme de anidrido poli (etileno-velho-maleico) de acordo com o procedimento de Pompe et. al. Biomacromolecules 2003, 4, 1.072 a 1.079 para assegurar a ligação covalente do hidrogel. Para modificação com peptídeos RGD, os hidrogéis conformados inchados em solução salina tamponada de fosfato com EDC/sulfo-NHS foram dissolvidos em uma concentração de 50 mM de EDC e 25 mM de sulfo-NHS em solução salina tamponada de fosfato a 1/15 M a 4 °C e os grupos carboxila restantes de GB4 ou GB5 foram ativados
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50/61 por 20 min e, então, enxaguados com tampão de borato (100 mM, pH 8,0, 4 °C). Subsequentemente, os hidrogéis ativados foram reagidos com uma solução que tem uma concentração de 50 mg/ml da sequência peptídica H2N-GWGGRGDSP-CONH2 (Peptides International, Louisville, KY, E.U.A.) dissolvida em tampão de borato (100 mM, pH 8,0) em temperatura ambiente por 2 horas e, então, lavados excessivamente com solução salina tamponada de fosfato.
Cultura celular:
[074] Células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs, Lonza, Alemanha) foram passadas em Promocell C-22010 complementado com Promocell C-22010 (PromoCell GmbH, Alemanha) a 37 °C e 5% de CO2 em frascos de cultura celular revestidos com fibronectina até alcançar 80% de confluência. Células da passagem 2 a 6 foram usadas em experimentos subsequentes.
[075] Os hidrogéis ligados à superfície funcionalizados por RGD foram incubados com VEGF-A e FGF-2 a uma concentração de 0,565 pg por 2 cm de superfície de hidrogel a RT por 18 horas e, então, lavados 2x com solução salina tamponada de fosfato.
[076] 50.000 células/cm2 foram cultivadas nos hidrogéis funcionalizados com RGD e VEGF-165 e FGF-2 em meio Promocell sem a mistura complementar. Após 24 horas de cultivo, as células foram lavadas, fixadas e caracterizadas por microscopia de luz (microscópio invertido Olympus 1X73, Hamburgo, Alemanha). A razão de aspecto foi determinada após medição de células individuais com software de processamento de imagem Fiji dividindo-se o comprimento de célula pela largura de célula. A circularidade foi determinada por meio do
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51/61 software de processamento de imagem Fiji de acordo com a seguinte fórmula: circularidade = 4*7t*área de célula/perimetro)2. Em todo caso, 20 células por imagem foram medidas em amostras independentes de n = 10. Avaliação estatística com o software GraphPad Prism e um teste Anova de uma via revelou diferenças significativas para todas as condições estudadas.
Preparação dos hidrogéis com base em ácido poli(4estirenossulfônico-co-maleico) após reação de reticulação 2 (VN2, consultar também a Tabela 1):
Derivação de ácido poli(4-estirenossulfônico-comaleico) com grupos maleimida:
[077] Para a formação de hidrogéis, de acordo com a reação de reticulação 2, o GB4 ou GB5 deve ser primeiro funcionalizado com trifluoroacetato de N- (2aminoetil)maleimida (Sigma, Alemanha). Com esse propósito, 500 mg (25 pmol) do respectivo GB4 ou GB5 foram dissolvidos em 2,7 ml de água ultrapura desionizada e agitados em gelo por 10 min. O recipiente de amostra é um vidro de cobertura por pressão de 25 ml. Subsequentemente, 65,14 mg de NHS (0,30 mmol) foram dissolvidos em 400 μΐ e 115,02 mg (0,60 mmol) de EDC dissolvidos em 200 μΐ de água ultrapura desionizada gelada foram adicionados à solução de GB4 ou GB5 e esperou-se 5 min. Na próxima etapa, 76,25 mg (0,30 mmol) de trifluoroacetato de N-(-2-aminoetil)maleimida dissolvidos em 200 μΐ de água MilliQ foram adicionados gota a gota durante 40 segundos após o tempo de ativação completo para GB4 ou GB5 ativado. A mistura de reação é agitada em gelo por mais 10 min. Finalmente, o banho de gelo é removido e a mistura é agitada de um dia para o outro em temperatura ambiente. O produto é colocado em uma tubulação
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52/61 dialítica com um tamanho de exclusão de MWCO = 5 kDa. A diálise ocorre durante dois dias; no primeiro dia, a diálise é realizada contra 2,5 litros de solução de cloreto de sódio monomolar por 6 h. Aqui, a solução é trocada após cada 2 horas. Após 6 h, a diálise é, então, conduzida de um dia para o outro contra água ultrapura desionizada. No segundo dia, a diálise é conduzida por 8 h contra água ultrapura desionizada, sendo que a água é trocada após cada 2 horas. Na última etapa, a solução é liofilizada.
Cromatografia por exclusão de tamanho para caracterização de derivados de maleimida GB4/GB5:
[078] A cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) é usada para determinar o número de grupos maleimida por molécula de GB4 ou GB5. Com esse propósito, o peptídeo RGD-SP (M = 990 g/mol) é acoplado aos derivados de maleimida GB4/GB5 em vários excessos. Os excessos RGD-SP molares examinados são, nesse caso, 6,8, 10 ou 12 com relação ao GB4 ou GB5. Inicialmente, uma calibragem é realizada misturando-se 35 μΐ da respectiva concentração RGD-SP com 35 μΐ de solução salina tamponada de fosfato em um vaso de amostra.
[079] Para esse estudo, uma coluna BioSEP-SEC S2000 da Phenomnex (Alemanha) usada, na qual o sistema de HPLC Agilent 1100 (Alemanha) é inserido. O eluente é solução salina tamponada de fosfato em uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min. O volume de injeção é 50 μΐ.
[080] Nas mesmas condições de eluição, a determinação dos grupos maleimida também é conduzida. Em todo caso, 35 μΐ de uma concentração RGD são misturados com 35 μΐ da solução de derivados de maleimida GB4/GB5 no vaso de
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53/61 amostra. 0 método permite uma determinação exata da conversão de maleimida com GB4 ou GB5.
Preparação dos hidrogéis com base em derivados de ácido poli(4-estirenossulfônico-co-maleico) após reação de reticulação 2 (VN2, consultar também a Tabela 1):
[081] Derivados de maleimida GB4/GB5 e PEG terminado em tiol de quatro braços (UGB2, Mw = 10.000 Da, Jenchem, E.U.A., Tabela 2) são dissolvidos em solução salina tamponada de fosfato duas vezes a concentração mencionada na Tabela 1. Depois disso, volumes iguais de ambos os componentes são pipetados em um vaso de micro reação e agitados por 10 s no agitador de vórtex. Subsequentemente, um volume definido da mistura de reação é removido e colocado em uma lamela de vidro de 9 mm de diâmetro revestida com Sigma Cote®. Outra lamela, revestida com Sigma Cote®, é colocada na gota. As lamelas são removidas após 30 minutos e a fatia de gel é inchada por 12 horas em solução salina tamponada de fosfato. Em altas concentrações de UGB2, o pH do UGB2 pode ser ajustado entre pH 5 e 7 com 1M de HCI para atingir gelificação ideal.
Produção dos hidrogéis para cultura celular com células do estroma mesenquimais humanas em 3D:
[082] Hidrogéis cliváveis em metaloprotease de matriz (MMP) foram preparados com o uso de UGB4 (Tabela 4, sintetizado de acordo com o procedimento descrito por Tsurkan et al., Adv. Mater. 2013, 25 (18), 2.606 a 2.610) no lugar de UGB2 de acordo com o método mencionado acima.
[083] Com esse propósito, as células foram suspensas no derivado de GB4 ou GB5, e os hidrogéis foram formados misturando-se depois do método descrito acima, e
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54/61 inchados imediatamente após 5 min de tempo de gelificação em solução salina tamponada de fosfato e meio de cultura celular.
Cultura celular:
[084] Células-tronco mesenquimais (MSCs, ATCC, isoladas do tecido adiposo, Alemanha) foram cultivadas em DMEM com 10% de soro de vitelo fetal e 1% de penicilina/estreptomicina sob condições de cultura padrão (5% de CO2 e 37 °C) . MSCs das passagens 2 a 4 foram usadas nos experimentos.
[085] Derivados de GB-4 ou GB-5 e UGBs foram misturados com 1 mol de CGWGGRGDSP por mol de GB e dissolvidos em solução salina tamponada de fosfato (a concentração de derivados de GB4 ou GB5 foi 3 vezes a concentração mostrada na Tabela 1) . Após mistura, a solução foi incubada por 10 a 15 min a 37 °C, e uma suspensão celular concentrada foi, então,
misturada em um terço do volume de gel final com 6x10 6
células/ml extrapoladas na mistura de reação final. UGB4
(concentração de 3 vezes da Tabela 1 ) foi dissolvido em outro
teço do volume de gel total em solução salina tamponada de fosfato e adicionado na mistura de derivados de GB4/5 com células e intermisturado através de pipetação. Após gelificação por 5 min, o meio de cultura celular descrito acima foi adicionado e os hidrogéis foram incubados por 24 h a 37 °C conforme descrito anteriormente.
[086] Teste PrestoBlue®: O teste PrestoBlue® é realizado após um tempo de incubação de 24 h depois de cultivo das células nos hidrogéis. Com essa finalidade, 10% de solução do corante PrestoBlue® dissolvido em meio de cultura celular é adicionado em cada amostra de hidrogel e incubado em placas de microtitulação por 1 h a 37 °C. Subsequentemente, a
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55/61 fluorescência é medida no fotômetro de microplaca (Tecan Spark®, Alemanha). 0 comprimento de onda de excitação é de 560 nm e a fluorescência foi medida em um comprimento de onda de 590 nm. A atividade metabólica das células foi indicada pelos valores de fluorescência relativa (RFUs). 10 experimentos independentes com 4 determinações individuais (n = 40) foram avaliados e diferenças significativas (One Way Anova) foram encontradas para todas as condições.
Ensaio de Zona de Inibição Antibacteriana:
[087] Discos de hidrogel (60 μΐ) foram incubados em 1 ml de 50 pg/ml de gentamicina (Sigma Aldrich, Alemanha) por 18 horas e então lavados duas vezes com solução salina tamponada de fosfato. A atividade antimicrobiana dos hidrogéis carregados com gentamicina foi determinada por um ensaio de zona de inibição. Com esse propósito, placas de ágar de caldo de Luria (LB) (Sigma Aldrich, Munique, Alemanha) foram preparadas de acordo com as instruções do fabricante. Culturas de Escherichia coli K12 DH5 (DSMZ, Alemanha) e staphylococcus epidermidis PCI 1200 (ATCC, E.U.A.) após 12 h de cultivo foram diluídas em 0,1 a 600 nm e a densidade óptica (OD) foi medida. 250 μΐ dessas suspensões bacterianas foram aplicados nas respectivas placas. Um pano de algodão estéril foi usado para distribuir as bactérias uniformemente. Hidrogéis UGB1-GB1 01, UGB2-GB4 20 e UGB2-GB5 23 assim como UGB2-UGB3 26, cada um carregado ou não carregado com gentamicina, foram colocados nos quatro cantos na placa de AGAR e as placas foram incubadas de um dia para o outro a 37 °C. Depois disso, a zona de inibição foi medida com um calibrador digital. 10 experimentos independentes com 3 definições individuais (n = 30) foram
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56/61 avaliados e diferenças significativas (One Way Anova) foram encontradas para todas as condições.
Determinação das propriedades físico-químicas dos hidrogéis:
[088] Para determinar as propriedades físicas dos vários tipos de hidrogel, 67 μΐ de solução de hidrogel não polimerizada foram, em todo caso, polimerizados entre duas lâminas de vidro de 9 mm (Menzel Glaser, Alemanha) tratadas com Sigmacote (Sigma-Aldrich, Alemanha) por 16 h em temperatura ambiente e as fatias de gel resultantes foram, então, removidas das lâminas de vidro. O diâmetro das fatias de gel foi determinado opticamente com uma digitalizado do tipo FLA-3100 (Fujitsu, Japão) (diâmetro no estado desinchado). Depois disso, as fatias de gel foram inchadas em solução salina tamponada de fosfato (PBS), 0,9% de NaCl tamponado para pH 7,4 (Sigma-Aldrich, Alemanha), por 24 h (condições fisiológicas) e novamente medidas com o digitalizador do tipo FLA. 3100 (Fujitsu, Japão) (diâmetro no estado inchado). O inchaço dos hidrogéis foi determinado a partir dos diâmetros determinados de acordo com a seguinte equação:
Inchaço = diâmetro do hidrogel inchadoA3/diâmetro do hidrogel desinchadoA3 (diâmetro do hidrogel inchado)3
Inchaço = -----------------------------(diâmetro do hidrogel desinchado)3 consultar a Tabela 1.
[089] Os dados relatados são, cada um, obtidos promediando-se (MW) a partir de pelo menos quatro amostras independentes. Adicionalmente, o desvio padrão (SD) foi especificado.
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57/61 [090] Ademais, o módulo de armazenamento e módulo de perda dos hidrogéis foram determinados através de reometria oscilatória (em quilopascais) com o uso de um reômetro de cisalhamento do tipo Ares da TA Instruments, Reino Unido. Com esse propósito, fatias de 8 mm foram perfuradas de hidrogéis inchados sob condições fisiológicas (solução salina tamponada de fosfato (PBS, 0,9% de NaCl tamponado em pH 7,4 (Sigma-Aldrich, Alemanha) ) por 24 h e medidas em uma configuração de medição de placa a placa de 9 mm com frequência crescente de 1 a 100 rad/s em temperatura ambiente com baixa deformação (2%), e o valor médio foi determinado sobre a faixa de frequência inteira (1 valor de medição por amostra). Os valores relatados são os valores médios de quatro discos de hidrogel independentemente preparados e ± do desvio padrão são dados. O módulo de armazenamento dos quatro tipos de hidrogel foi dado na Tabela 1, e o módulo de perda foi menor por muitas ordens de magnitude (dados não mostrados).
[091] A Tabela 1 mostra as propriedades fisicoquímicas dos hidrogéis.
[092] O tamanho de malha dos hidrogéis pode ser derivado do módulo de armazenamento experimentalmente determinado com base na teoria de elasticidade de borracha com o uso da seguinte fórmula (Polymer Physics, Michael Rubinstein e Ralph H. Colby, 2006, Oxford University Press, Oxford):
/ · \-i« e pvJ ς RT ) em que G' é o módulo de armazenamento medido, NA é a constante de Avogadro, R é a constante de gás universal e T é a temperatura (em Kelvin).
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58/61 [093] Para determinar as propriedades de ligação dos diferentes tipos de hidrogel, soluções de hidrogel não polimerizadas foram polimerizadas por 16 h em temperatura ambiente entre duas lâminas de vidro de 5 mm tratadas com Sigmacote (Sigma-Aldrich, Alemanha) (Menzel Glasses) e subsequentemente inchadas por 24 h em solução salina tamponada de fosfato (PBS), 0,9% de NaCl tamponada em pH 7,4 (SigmaAldrich, Alemanha). O volume total foi ajustado consequentemente para assegurar quantidades molares iguais de GB1, GB2, GB3, e GB4 nos quatro tipos de hidrogel (consultar a Tabela 4) . Para os estudos de ligação (sequestro), os respectivos discos de hidrogel foram incubados por 24 h em vasos de reação LoBind de proteina de 0,5 ml (Eppendorf Tubes, Alemanha) em que a mistura de proteina corresponde à da Tabela 3 dissolvida em 400 μΐ de PBS com 1% (m/v) de albumina de soro bovino (Sigma-Aldrich, Alemanha) e 0,05% (m/v) de Proclina 300 (Sigma-Aldrich, Alemanha) (corresponde à solução após incubação 2) . Para preparar a mistura de proteina, Padrão ProcartaPlex A, B e C (ebioscience, Alemanha) foi dissolvido de acordo com as instruções do fabricante e complementado com as proteínas DKK1 (n° do fabricante: 120-30, Peprotech, Alemanha), esclerostina (n° do fabricante: 1406-ST, Peprotech, Alemanha) e TGFbl (fabricante: 100-21, Peprotech, Alemanha). As concentrações individuais são mostradas na Tabela 7 (corresponde à solução antes da incubação 1).
[094] As soluções 1 e 2 foram armazenadas a -80 °C até que a concentração de proteína fosse medida. Para determinar as concentrações de proteína nas soluções 1 e 2, as amostras foram medidas de acordo com as instruções do fabricante com o Painel de Quimiocina Humana da ProcartaPlex
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59/61 (ebioscience, Alemanha) em combinação com os kits simplex
ProcarteaPlex correspondentes em um dispositivo do tipo
Bioplex 200 (Biorad, Alemanha).
[095] A ligação (sequestro) das moléculas de sinalização foi determinada a partir das determinadas concentrações de solução 1 e 2, de acordo com a seguinte equação: ligação em % = (1 concentração em solução 2 (após incubação)/concentração em solução 1 (antes da incubação)) χ 100 .
[096] A Tabela 4 mostra o tempo de ativação dos grupos carboxila de GB1 a 4 em min e o volume de gel usado para os estudos de ligação.
[097] Os hidrogéis sulfatados ou sulfonados são caracterizados por sua distribuição de carga no elemento de base carregado (GB) em grupos sulfato ou sulfonato molares por mol de polímero, e pela concentração de grupos sulfato ou sulfonato no volume de hidrogel inchado sob condições fisiológicas em mmol de sulfato ou sulfonato/ml de hidrogel, e o número de grupos sulfato ou sulfonato por WE dividido pela massa molar da WE nas regiões especificadas. O cálculo foi conduzido com base nas concentrações molares dos elementos de base de hidrogel durante hidrogelação (consultar a Tabela 1) e o inchaço de volume (Tabela 1), que assume que os elementos de base de hidrogel estão quantitativamente embutidos nas rede.
[098] A concentração de grupos sulfato ou sulfonato no hidrogel não inchado foi calculada a partir da concentração dos GBs no hidrogel desinchado x número de unidades de repetição x número de grupos sulfato ou sulfonato por unidade de repetição. A concentração de sulfato ou sulfonato no gel inchado (Tabela 1) foi calculada a partir da
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60/61 concentração de grupos sulfato ou sulfonato no hidrogel desinchado dividido pelo inchaço (consultar a Tabela 1) .
[099] Experimentos de extração não renderam nenhuma eluição mensurável dos componentes de gel, de modo que a suposição da incorporação completa dos componentes de gel seja considerada justificada.
[0100] A Tabela 3 mostra a porcentagem de quantidades ligadas de moléculas de sinalização nos hidrogéis normalizados na concentração de fatores solúveis antes da incubação, conforme anteriormente abordado. As porcentagens se referem à porcentagem em massa.
[0101] O tamanho molecular das substâncias, que também são denominadas substâncias de sinal ou fatores, é expressa em quilodaltons (kDa).
[0102] As proteínas (moléculas de sinalização) são unicamente atribuídas por meio de abreviações (Tabela 3) e dos números de identificação da UniProt (ID da Uniprot) do banco de dados de recurso de proteínas universal (UniProt; http://www.uniprot.org/).
[0103] O ponto isoelétrico (IEP) e a massa molar foram determinados com base na sequência de aminoácidos completamente processada biologicamente com o uso do programa ExPASy ProtParm (http://web.expasy.org/protparam/; referência: Gasteiger, E. et al., The Proteomics Protocols Handbook 571 a 607 (2005)).
[0104] Os parâmetros estruturais das proteínas foram determinados com o uso dos bancos de dados ExPASy PROSITE com base nos números de identificação da UniProt (http://prosite.expasy.org/; Sigrist, C.J.A. et al., New and continuing developments at ExPASy PROSITE; Referências: (1)
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61/61
Nucleic Acids Res 41, (2013); (2) Sigrist, C.J. A. et al.,
PROSITE: a documented database using patterns and profiles as motif descriptors., Brief. Bioinform., 3, 265 a 274 (2002)).

Claims (11)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. MÉTODO PARA SEQUESTRO DIFERENCIADO DE SUBSTÂNCIAS DE DIFERENTES GRUPOS DE SUBSTÂNCIA A Ε B EM UM HIDROGEL SULFATADO E/OU SULFONADO, e para redução de substâncias do grupo de substância A de um biofluido com liberação diferenciada simultânea de substâncias do grupo de substância A ou B do hidrogel sulfatado e/ou sulfonado no biofluido ou na ligação reduzida de substâncias do grupo de substância B no hidrogel sulfatado e/ou sulfonado, em que o hidrogel sulfatado e/ou sulfonado é selecionado dentre um grupo de hidrogéis de tipo 1, tipo 2, tipo 3 ou tipo 4 e os hidrogéis são compostos por elementos de base não carregados e elementos de base carregados que são caracterizados pelos elementos de base carregados serem um parâmetro calculado a partir do número de grupo sulfato e/ou sulfonato por unidade de repetição dividido pela massa molar da unidade de repetição de 0,0040 a 0,0060 mol/g para tipo 1, de 0,0025 a 0,0040 mol/g para tipo 2, de 0,0005 a 0,0025 mol/g para tipo 3 e de 0,040 a 0,0100 mol/g para tipo 4 e os hidrogéis inchados têm um módulo de armazenamento menor que 20 kPa e as propriedades dos hidrogéis inchados têm uma concentração de grupos sulfato ou sulfonato em mmol/ml entre 0,09 e 0,20 em tipo 1, entre 0,05 e 0,18 para tipo 2, entre 0,01 e 0,12 para tipo 3 e entre 0,16 e 0,8 para tipo 4, e que uma influência sobre a concentração de substâncias do grupo de substância A e de substâncias do grupo de substância B no biofluido é determinada pela escolha do tipo do hidrogel.
  2. 2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos elementos de base carregados dos hidrogéis terem um número de grupos sulfato e/ou sulfonato por unidade
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    2/11 de repetição dividido pela massa molar da unidade de repetição de 0,0050 mol/g para tipo 1, de 0,0035 mol/g ou 0,0038 mol/g para tipo 2, de 0,0019 mol/g para tipo 3 e de 0, 0045 mol/g para tipo 4, e que as propriedades dos hidrogéis inchados têm uma concentração de sulfato ou sulfonato em mmol/ml de 0,12 para tipo 1 e de 0,12 ou 0,14 para tipo 2 e de 0,06 para tipo 3 e de 0,28 ou 0,16 para tipo 4.
  3. 3. MÉTODO PARA O SEQUESTRO DIFERENCIADO DE SUBSTÂNCIAS DE DIFERENTES GRUPOS DE SUBSTÂNCIA A Ε B EM UM HIDROGEL SULFATADO E/OU SULFONADO, e redução de substâncias do grupo de substância A de um biofluido com liberação diferenciada simultânea de substâncias do grupo de substância B do hidrogel sulfatado e/ou sulfonado no biofluido ou ligação reduzida de substâncias do grupo de substância B no hidrogel sulfatado e/ou sulfonado, em que o hidrogel sulfatado e/ou sulfonado é selecionado dentre um grupo de hidrogéis do tipo 1, tipo 2, tipo 3 ou tipo 4 e os hidrogéis são compostos por elementos de base não carregados e elementos de base carregados que são caracterizados pelos elementos de base carregados terem uma concentração de grupos sulfato ou sulfonato molares por mol de polímero de 60 a 80 em tipo 1, de 30 a 75 em tipo 2, de 10 a 30 em tipo 3 e de 80 a 120 em tipo 4, e que os elementos de base carregados no hidrogel têm uma concentração de GB em mmol/ml de 0,0015 a 0,0025 em tipo 1, de 0,0015 a 0,0030 em tipo 2, de 0,0010 a 0,0040 em tipo 3, e de 0,0018 a 0,0050 em tipo 4, e que os hidrogéis inchados têm um módulo de armazenamento menor que 20 kPa, com a concentração dos grupos sulfato ou sulfonato em mmol por ml no hidrogel de tipo 1 entre 0,09 e 0,20, em tipo 2 entre 0,05 e 0,18, em tipo 3 entre 0,01 e 0,12 e em tipo 4 entre 0,16 e 0,80, e que a concentração de
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    3/11 substâncias do grupo de substância A e de substâncias do grupo de substância B no biofluido é influenciada pela escolha do tipo de hidrogéis.
  4. 4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelos elementos de base carregados terem uma concentração de grupos sulfato ou sulfonato molares por mol de polímero de 70,2 em tipo 1 e de 48,4 ou 75,0 em tipo 2 e de
    23,4 em tipo 3 e de 90,0 em tipo 4, e pelos elementos de base carregados no hidrogel terem uma concentração de GB em mmol/ml de 0,0018 para tipo 1, de 0,0025 ou 0,0018 para tipo 2, de 0,0027 para tipo 3, e de 0,0031 ou 0,0018 para tipo 4, e pelos hidrogéis inchados terem um módulo de armazenamento menor que 20 kPa, em que a concentração de grupos sulfato ou sulfonato em mmol por ml no hidrogel é 0,12 para tipo 1, 0,12 ou 0,14 para tipo 2, 0,06 para tipo 3 e 0,28 ou 0,16 para tipo 4.
  5. 5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela reticulação dos elementos de base com o hidrogel ocorrer através de reação dos grupos funcionais adequados nos GB e/ou UGB da classe de aminas, tióis, carboxilas, anidridos, maleimidas, vinilsulfonas, acrilatos, hidroxilas, isocianatos, epóxidos e aldeídos, ou grupos que têm capacidade para formar ligações não covalentes com base em forças eletrostáticas ou interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio ou interações dipolo.
  6. 6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela reticulação dos elementos de base carregados com o hidrogel ocorrer através de reticulação direta por meio de uma pequena molécula de reticulação bifuncional que tem uma massa molar de UGB < 500 g/mol.
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    4/11
  7. 7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelos glicosaminoglicanos sulfatados obtidos a partir de fontes naturais, tais como heparina e heparinas dessulfatadas seletivas, sulfato de condroitina, sulfato de heparan, sulfato de queratan, ácido hialurônico sulfatado, assim como glicopolimeros sulfatados com base em manose, lactose, dextrano e compostos polissulfonados que carregam ácido estirenossulfônico (SS), ácido vinilsulfônico (VS), ácido 2-acrilamido-2metilpropanossulfônico (AMPS), ácido aminopropanossulfônico (APS) ou ácido anetolsulfônico (AS) como monômeros que contêm enxofre e também em copolimeros com unidades que contêm os grupos ligantes mencionados acima serem selecionados como elementos de base carregados, e pelos polietilenoglicóis, poli (2-oxazolinas), polivinilpirrolidona (PVP), álcoois polivinilicos (PVA) e/ou poliacrilamidas (PAM) ou uma molécula reticuladora bifuncional curta serem selecionados como elementos de base não carregados.
  8. 8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por em hidrogéis de tipo 1 pelo menos uma dentre as substâncias bNGF, PDGF-BB, VEGF-A, eotaxina, GRO-alfa, IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, Rantes, SDFl-alfa, IFN-gama, IL-12p40, IL-4, esclerostina e/ou DKK1 ser selecionada como a substância do grupo de substância A, em que as substâncias são reduzidas em mais que 50% da concentração inicial da solução do biofluido e sequestradas no hidrogel.
  9. 9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por em hidrogéis de tipo 1 pelo menos uma dentre as substâncias FGF-2, TGFbl, EGF, HGF,
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    PLGF, GM-CSF, IL-1 beta, IL-10, IL-6 e/ou TNF-alfa ser selecionada como a substância do grupo de substância B, em que as substâncias são ligadas apenas até 50% da concentração inicial da solução no hidrogel ou liberadas da mesma.
  10. 10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por em hidrogéis de tipo 2 pelo menos uma dentre as substâncias bNGF, PDGF-BB, VEGF-A, eotaxina, GRO-alfa, IL-8, IP-10, MCP-1, Rantes, SDFl-alfa, IFN-gama, IL-12p40, IL-4 e/ou DKK1 ser selecionada como a substância do grupo de substância A, em que as substâncias são reduzidas em mais que 50% da concentração inicial da solução do biofluido e sequestradas no hidrogel.
    11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por em hidrogéis de tipo 2 pelo menos uma dentre as substâncias FGF-2, TGFbl, EGF, HGF, PLGF, GM-CSF, IL-1 beta, IL-10, IL-6, TNF-alfa e/ou
    esclerostina ser selecionada como a substância do grupo de substância B, em que as substâncias são ligadas apenas até 50% da concentração inicial da solução no hidrogel ou liberadas da mesma.
    12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por em hidrogéis de tipo 3 pelo menos uma dentre as substâncias bNGF, PDGF-BB, VEGF-A, eotaxina, GRO-alfa, IP-10, Rantes, SDFl-alfa, IFN-gama e/ou IL-4 ser selecionada como a substância do grupo de substância A, em que as substâncias são reduzidas em mais que 50% da concentração inicial da solução do biofluido e sequestradas no hidrogel.
    13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por em hidrogéis do tipo
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    6/11
    3 pelo menos uma dentre as substâncias FGF-2, TGFbl, EGF, HGF, PLGF, IL-8, MCP-1, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, GM-CSF, IL-1 beta, IL-10, IL-12p40, IL-6, TNF-alfa, esclerostina e/ou DKK1 ser selecionada como a substância do grupo de substância B, em que as substâncias são ligadas apenas até 50% da concentração inicial da solução no hidrogel ou liberadas da mesma.
    14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por em hidrogéis do tipo
    4 pelo menos uma dentre as substâncias bNGF, PDGF-BB, VEGF-A, eotaxina, GRO-alfa, IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, Rantes, SDFl-alfa, IFN-gama, IL-1 beta, IL-10, IL-12p40, IL4, IL-6 e/ou TNF-alfa ser selecionada como a substância do grupo de substância A, em que as substâncias são reduzidas em mais que 60% da concentração inicial da solução do biofluido e sequestradas no hidrogel.
    15. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por em hidrogéis do tipo 4 pelo menos uma dentre as substâncias EGF, PLGF e/ou GM-CSF ser selecionada como substância do grupo de substância B, em que as substâncias são ligadas apenas até 40% da concentração inicial da solução no hidrogel ou liberadas da mesma.
    16. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por hidrogéis do tipo 1, tipo 2, tipo 3 ou tipo 4 serem pré-carregados com pelo menos uma substância do grupo de substância A e/ou B em alta concentração, depois disso essas substâncias são liberadas do hidrogel em paralelo e independentemente à alteração na concentração no biofluido.
    17. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelos hidrogéis serem
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    7/11 formados a partir de materiais multifásicos, isto é, a partir de misturas dos diferentes tipos 1 a 4 dos materiais de hidrogel ou diferentes formas de processamento (micropartículas e hidrogéis grossos) ou são pré-carregadas com diferentes substâncias ou quantidades de substâncias.
    18. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pela liberação diferenciada de substâncias do grupo de substância A ou B do hidrogel sulfatado e/ou sulfonado no biofluido e a ligação reduzida das substâncias do grupo de substância B no hidrogel sulfatado e/ou sulfonado ocorrerem simultaneamente.
    19. MATERIAL DE HIDROGEL COVALENTEMENTE RETICULADO, caracterizado por ser para realizar um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, com base em elementos de base carregados na forma de ácido poli(4estirenossulfônico-co-maleico) e elementos de base não carregados na forma de polímeros ou moléculas reticuladoras que contêm grupos amina ou grupos tiol com pelo menos dois grupos amino ou grupos tiol, em que os elementos de base carregados e não carregados são reticulados em uma rede polimérica que pode ser obtida ativando-se os grupos carboxila do ácido poli(4-estirenossulfônico-co-maleico) com EDC/sulfoNHS e por reticulação direta com polímeros que contêm os grupos amino ou com as moléculas reticuladoras que têm os pelo menos dois grupos amino, em cada caso com a formação de amida ou uma funcionalização dos grupos carboxila ativados por meio de moléculas reticuladoras bifuncionais que contêm, cada uma, um grupo amino e um grupo que tem capacidade para adição do tipo Michael, e a reticulação subsequente com os polímeros que contêm os grupos tiol ou as moléculas de reticulação com os
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    8/11 pelo menos dois grupos tiol em cada caso por meio de uma adição do tipo Michael.
    20. MATERIAL DE HIDROGEL COVALENTEMENTE RETICULADO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo grupo que tem capacidade para adição do tipo Michael ser selecionado dentre grupos maleimida, grupos vinilsulfona ou grupos acrilato.
    21. MATERIAL DE HIDROGEL COVALENTEMENTE RETICULADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 ou 20, caracterizado pelos polímeros que contêm grupos amina e tiol serem selecionados como elementos de base não carregados da classe de polietilenoglicóis (PEG), poli(2-oxazolinas) (POX), polivinilpirrolidonas (PVP), álcoois polivinilicos (PVA) e/ou poliarilamidas (PAM), e pelas moléculas reticuladoras que contêm grupos amina ou tiol serem moléculas reticuladoras bifuncionais não poliméricas.
    22. MATERIAL DE HIDROGEL COVALENTEMENTE RETICULADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo ácido poli (4-estirenossulfônico-comaleico) com razões molares variáveis de ácido 4estirenossulfônico para ácido maleico em uma faixa de 6:1 a 1:6 e massas molares em uma faixa de 5.000 a 100.000 g/mol ser selecionado como o elemento de base carregado.
    23. MATERIAL DE HIDROGEL COVALENTEMENTE RETICULADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizado por polímeros com peptídeos enzimaticamente ciiváveis conjugados que têm lisina ou cisteína como aminoácido reativo na sequência peptídica serem usados como elementos de base não carregados para formar a rede polimérica.
    24. MATERIAL DE HIDROGEL COVALENTEMENTE RETICULADO,
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    9/11 de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelos peptídeos enzimaticamente cliváveis serem cliváveis por proteases humanas ou bacterianas, em particular MMPs, catepsinas, elastases, aureolisina e/ou enzimas de coagulação sanguínea.
    25. MATERIAL DE HIDROGEL COVALENTEMENTE RETICULADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 ou 24, caracterizado por moléculas bioativas e/ou antiadesivas que têm um grupo amino ou carboxila e/ou peptídeos de instrução celular serem ligados à rede de hidrogel por meio de lisina ou cisteína na sequência ao elemento de base carregado ácido poli(4-estirenossulfônico-co-maleico) ou aos derivados do mesmo que tem grupos com capacidade de adição do tipo Michael formando-se uma ligação covalente.
    26. MATERIAL DE HIDROGEL COVALENTEMENTE RETICULADO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelas moléculas bioativas serem substâncias antimicrobianas, por exemplo, antibióticos ou antissépticos, ou ingredientes ativos farmacêuticos.
    27. MATERIAL DE HIDROGEL COVALENTEMENTE RETICULADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 ou 26, caracterizado pelas moléculas antiadesivas serem polietilenoglicóis (PEG) ou poli(2-oxazolinas) (PCX).
    28. MATERIAL DE HIDROGEL COVALENTEMENTE RETICULADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pelos peptídeos de instrução celular serem peptídeos derivados de proteínas estruturais e funcionais da matriz extracelular, tal como colágeno, laminina, tenascina, fibronectina e vitronectina.
    29. MATERIAL DE HIDROGEL COVALENTEMENTE RETICULADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 28,
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    10/11 caracterizado pelos peptídeos de indução celular e/ou antiadesivos e/ou bioativos serem covalentemente ligados às redes de hidrogel por meio de sequências de peptideo enzimaticamente cliváveis.
    30. MATERIAL DE HIDROGEL COVALENTEMENTE RETICULADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 29, caracterizado pelo material de hidrogel ter um módulo de armazenamento de 0,2 a 22 kPa.
    31. MATERIAL DE HIDROGEL FISICAMENTE RETICULADO, caracterizado por ser para realizar um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, com base em interações físicas entre elementos de base carregados na forma de ácido poli(4-estirenossulfônico-co-maleico) e elementos de base não carregados na forma de polímeros, em que sequências peptídicas carregadas fortemente positivas são conjugadas nos polímeros.
    32. MATERIAL DE HIDROGEL FISICAMENTE RETICULADO, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelas sequências peptídicas carregadas de maneira fortemente positiva compreenderem pelo menos dez repetições de lisina ou arginina ou pelo menos cinco repetições de motivos dipeptídicos com lisina e alanina, ou com arginina e alanina.
    33. USO DE HIDROGÉIS, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelos hidrogéis serem usados para gerenciamento de fator ín vivo para controlar angiogênese, doenças imunológicas, cânceres, diabetes, doenças neurodegenerativas, doença de Crohn, colite ulcerosa, esclerose múltipla, asma, artrite reumatoide ou cicatrização de ferida cutânea e regeneração óssea.
    34. USO, de acordo com a reivindicação 33,
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  11. 11/11 caracterizado por, para cicatrização de ferida cutânea, um hidrogel de tipo 2 ser usado para sequestro de pelo menos uma dentre a eotaxina de quimiocinas pró-inflamatórias, GRO-a, IL8, IP-10, MCP-1, MCP-3, MCD, Rantes e SDF-l-alfa dentro dos hidrogéis, em por pelo menos um dentre os fatores próregenerativos EGF, FGF-2, TGFbl, IL-10, HGF e PLGF permanecer não afetado ou amplamente não afetado no biofluido.
    35. USO DE HIDROGÉIS, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado por ser para a purificação alvejada de proteínas a partir de lisados celulares de origem microbiana ou eucariótica.
    36. USO DE HIDROGÉIS, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado por ser para a seleção negativa e separação de moléculas de sinalização EGF, FGF-2, TGF-β, IL-10, HGF e PLGF, que se ligam fracamente aos hidrogéis dos tipos 1 a 3, dos biofluidos.
    37. USO de hidrogéis, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado por ser para cultura de órgão e célula in vitro a partir de células-tronco embrionárias (ES), células-tronco pluripotentes induzidas (1PS-), e outras células-tronco e progenitoras não associadas às células primárias, ES e iPS obtidas de pacientes, linhas celulares imortalizadas, assim como tecidos cardíaco, muscular, renal, hepático e nervoso.
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WO (1) WO2018162009A2 (pt)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102017105195A1 (de) * 2017-03-10 2018-09-13 Leibniz-Institut Für Polymerforschung Dresden E.V. Verfahren zur differenzierten Sequestrierung von Stoffen verschiedener Stoffgruppen mit Hilfe von sulfatierte oder sulfonierte Komponenten enthaltenden Hydrogelen
DE102020131536A1 (de) 2020-11-27 2022-06-02 Leibniz-Institut Für Polymerforschung Dresden E.V. Konfigurierbares Hydrogelmaterial und Verfahren zur Konfiguration von Hydrogelmaterialien für die Sequestrierung und/oder Freigabe von bioaktiven Substanzen
DE102020131547A1 (de) 2020-11-27 2022-06-02 Leibniz-Institut Für Polymerforschung Dresden E.V. Verfahren und Material zur Erfassung und Beeinflussung einer Aufnahme und/oder Freigabe von bioaktiven Substanzen mit Hilfe von elektrisch leitfähigen Hydrogelen
WO2022170179A1 (en) * 2021-02-05 2022-08-11 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Genetically engineered recombinant proteins for functional regenerative tissue scaffolds
GB2618832A (en) * 2022-05-19 2023-11-22 Univ Stellenbosch Polymer system for forming a hydrogel

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5011275A (en) 1988-07-05 1991-04-30 Ciba-Geigy Corporation Dimethylacrylamide-copolymer hydrogels with high oxygen permeability
DE69216100T2 (de) 1991-09-12 1997-06-12 Bausch & Lomb Inc., Rochester, N.Y. Benetzungsfaehige silikon-hydrogel-zusammensetzungen und verfahren zu deren herstellung
JP4509666B2 (ja) 2004-06-25 2010-07-21 リンテック株式会社 シート剥離装置及び剥離方法
WO2010060485A1 (de) 2008-11-28 2010-06-03 Zetascience Gmbh Bioaktives hydrogel
DE102012108560B4 (de) 2012-09-13 2018-12-20 Leibniz-Institut Für Polymerforschung Dresden E.V. Nichtkovalente selbstorganisierende Hydrogelmatrix für biotechnologische Anwendungen
DE102017105195A1 (de) * 2017-03-10 2018-09-13 Leibniz-Institut Für Polymerforschung Dresden E.V. Verfahren zur differenzierten Sequestrierung von Stoffen verschiedener Stoffgruppen mit Hilfe von sulfatierte oder sulfonierte Komponenten enthaltenden Hydrogelen

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