BR112019015140A2

BR112019015140A2 - indução de imunidade protetora contra antígenos

Info

Publication number: BR112019015140A2
Application number: BR112019015140A
Authority: BR
Inventors: Curtiss Roy Iii; Wang Shifeng
Original assignee: Univ Florida
Priority date: 2017-01-23
Filing date: 2018-01-23
Publication date: 2020-04-14
Also published as: JP2020505036A; US20190382717A1; MA47317A; MX2019008645A; US20210284955A1; WO2018136938A1; AU2018210554A1; RU2019126659A3; EP3571288A4; RU2019126659A; WO2018136938A8; CN110462020A; EP3571288A1; US10988729B2; CA3050724A1; US11788056B2; CN110462020B; JP7121016B2

Abstract

são aqui descritas composições e métodos para preparar e usar bactérias recombinantes que são capazes de atenuação regulada e/ou expressão regulada de um ou mais antígenos de interesse.

Description

INDUÇÃO DE IMUNIDADE PROTETORA CONTRA ANTÍGENOS PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório US N° 62/449.228, depositado em 23 de janeiro de 2017 e o Pedido Provisório US N° 62/541.293, depositado em 4 de agosto de 2017. Todo o conteúdo de cada um dos requerimentos anteriores é expressamente incorporado aqui por referência.

[002] A listagem de sequências para este pedido está rotulada como Seq-List. txt, que foi criada em 23 de janeiro de 2018 e tem 31 KB. Todo o conteúdo da listagem de sequências é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[003] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob os n^os de concessões AI093348, AI056289 e AI126712, concedidos pelo National Institutes of Health. O governo tem certos direitos na invenção.

FUNDAMENTOS [004] Salmonella enterica causa doenças altamente carregadas em humanos em todo o mundo. S. Typhi e Paratyphi A, B e C causam febre entérica (1) e são grandes preocupações de saúde pública (2-4). Estima-se que S. Typhi cause mais de 20,6 milhões de casos, 433.000 mortes em todo o mundo a cada ano (5, 6) e 12,2 milhões de anos de vida ajustados por incapacidade (7) . Além desses sorotipos, a Salmonella não tifoide (NTS) é cada vez mais reconhecida como importante causa de doenças invasivas (2, 8, 9), tais como sepse e meningite, com 93,8 milhões de casos e 681.300 mortes anualmente no mundo (10, 11). A NTS também é uma das principais causas de hospitalização e morte por doenças

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2/168 transmitidas por alimentos nos EUA (12), 1,2 milhões de casos de doença diarreica inflamatória por ano, resultando em 23.000 hospitalizações e 450 mortes (12, 13) com uma perda econômica de aproximadamente US$3,31 bilhões devido à mortalidade prematura, incapacidade, custos médicos e de produtividade e uma perda anual de 16.7 82 anos de vida ajustados pela qualidade (14). Entre as crianças<5 anos de idade, a NTS é o principal agente patogênico bacteriano e causa 4.670 internações e 38 mortes (15). A doença por NTS nos EUA é contabilizada principalmente por sorovares pertencentes a três sorovares B, D e C (16) . Serovares Enteritidis, Typhimurium, Newport e Heidelberg são os surtos mais comuns nos EUA (17). Embora a grande maioria dos pacientes desenvolva gastroenterite autolimitada, caracterizada por diarréia inflamatória, a NTS também pode causar doenças sistêmicas e é a causa mais comum de morte por doenças transmitidas por alimentos associadas a vírus, parasitas ou bactérias nos EUA, principalmente em pessoas imunocomprometidas (18). Em crianças pequenas e indivíduos infectados por HIV, a NTS frequentemente causa infecção

sistêmica que está	associada à	alta	mortalidade (19).	0
aumento da AIDS em	muitas partes	do	mundo, notadamente	na
África Subsariana,	resultou em	um	aumento dramático	na

frequência de infecção sistêmica associada a NTS (20, 21). A bacteremia é o sintoma mais grave e a mortalidade em crianças com bacteremia que atingem uma clínica pode ser de quase 25% (18, 21). Febre entérica e NTS tornam-se cada vez mais difíceis de tratar com antibióticos devido ao aumento de Salmonella com resistência a múltiplos fármacos (22, 23), levando ao risco de um número crescente de casos

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3/168 intratáveis (24, 25).

[005] A febre entérica pode ser evitada com várias vacinas (26, 27). As preparações de células inteiras mortas de sorovares Typhi e Paratyphi foram eficazes na diminuição da incidência em áreas endêmicas (28), mas foram descontinuadas devido a reações adversas frequentes (2 9) . Uma cepa de S. Typhi viva atenuada Ty21a, gerada por mutagênese quimica, confere apenas um nivel moderado de proteção por até três anos contra o sorovar Typhi, mas não com outros sorovares relevantes (29, 30). Cepas adicionais de Salmonella geneticamente modificadas foram testadas em ensaios clinicos com algum sucesso, mas nenhuma delas foi aprovada. O carboidrato capsular purificado Vi de sorovar Typhi induz imunidade protetora ao longo de vários anos contra Typhi e, possivelmente, Paratyphi C, mas não contra Paratyphi A e B ou Typhimurium, todos carecem dessa cápsula (31) . Conjugação de Vi com um antigeno de proteina melhora respostas imunológicas em crianças, uma das principais populações suscetíveis à febre entérica.

[006] Para cobrir o importante sorovar Paratyphi A, os esforços atuais concentram-se na ligação de antígeno O, a parte carboidrato do lipopolissacarídeo (LPS), com um antígeno de proteína (27) . Essas duas vacinas comerciais são usadas principalmente para o mercado de vacinas para viajantes e nenhuma nova vacina para uso generalizado foi licenciada desde a década de 1990 (26) . Embora três tipos de vacinas contra S. Typhi estejam atualmente disponíveis comercialmente, infelizmente, ainda não existe uma única vacina licenciada disponível contra S. Paratyphi A, com muito pouca ou nenhuma proteção cruzada provida pelas

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4/168 vacinas disponíveis contra S. Typhi. Existem vacinas contra os sorovares de NTS Enteritidis e Typhimurium que são eficazes em animais de criação, tipo aves domésticas e suínos (32), mas não disponíveis em humanos (33) . Isso representa uma limitação significativa nas estratégias de prevenção existentes. Portanto, o tratamento para salmonelose sistêmica tem se tornado cada vez mais difícil, e as atuais vacinas contra Salmonella provêm apenas níveis moderados, duração limitada de proteção, e cobertura limitada de sorovares clinicamente relevantes. Essas situações geram uma necessidade médica urgente de vacinas melhoradas contra Salmonella.

[007] O uso de vacinas recombinantes de Salmonella atenuada (RASVs) como uma vacina ou sistema de dispensação de antígeno heterólogo tem sido estudado devido a sua capacidade de estimular respostas imunológicas sistêmicas e mucosas no local e locais distais e vantagens como vetores para produzir e apresentar antígenos de vacina recombinantes. As RASVs podem ser usadas para uma infinidade de aplicações, incluindo, mas não se limitando a, vacinação contra patógenos que causam doenças, câncer, doenças respiratórias crônicas e doenças cardíacas. Recentemente, as RASVs atenuadas atrasadas reguladas (RASVs RDA) foram desenvolvidas para intensificar as respostas imunológicas a RASVs e ao antígeno protetor transportado. RASVs RDA são projetados de modo que os genes para os principais fatores de virulência sejam sob o controle de um promotor induzível ParaBAD, induzido por arabinose não encontrada no hospedeiro mamífero. As RASVs RDA são desenvolvidas in vitro na presença de arabinose, de modo

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5/168 que os genes que medeiam o fenótipo patogênico sejam expressados e as RASVs apresentam características do tipo selvagem para invadir os hospedeiros. A expressão dos genes patogênicos cessa devido à ausência de arabinose in vivo, com produtos gênicos diluídos devido à replicação, produzindo um fenótipo atenuado sem causar doença. Uma vez que se replicam inicialmente com total virulência, colonizam os tecidos linfoides a níveis mais altos para provocar respostas imunológicas mais potentes do que um RASV constitutivamente atenuado.

[008] A síntese de proteína atrasada regulada (RDPS) também foi desenvolvida para intensificar a imunogenicidade. Os níveis síntese de antígenos aumentados ajudam a aumentar a chance de que as células T cognatas interajam com as células de apresentação de antígenos (APCs), levando à proliferação e à produção eficazes de moléculas efetoras e à proliferação de células T in vivo. No entanto, a síntese de antígenos de alto nível impõe demandas metabólicas que prejudicam a capacidade das cepas de colonizar os tecidos linfoides efetores. Um sistema de RDPS torna a produção de antígeno de vacina recombinante somente após a RASV colonizar os tecidos linfoides à medida que as células de RASV se multiplicam in vivo. Essa estratégia não é influenciada pelo modo de atenuação.

[009] Embora o uso de Salmonella recombinante como vacinas vivas para produzir uma resposta imunológica em indivíduos seja promissor, os organismos são vivos e às vezes patogênicos. Por conseguinte, é necessário introduzir sistemas reguladores nas bactérias para atenuar e controlar a expressão de antígenos que são expressados pelas

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6/168 bactérias. Os meios de atenuação atualmente usados tornam as cepas de vacinas vivas suscetíveis a estresses ambientais in vivo. Consequentemente, menos bactérias são capazes de colonizar a célula hospedeira a fim de alcançar um nível desejável de imunogenicidade. Assim, existe uma necessidade de novas cepas de microrganismos recombinantes que podem ser desenvolvidas para uso como vacinas vivas, que são menos susceptíveis a estresses ambientais in vivo e que podem colonizar células hospedeiras de modo a alcançar melhores níveis de imunogenicidade. Existe também a necessidade de novos meios para intensificar a segurança de vacinas atenuadas vivas in vivo.

SUMÁRIO [0010] A presente revelação provê cepas de bactérias recombinantes, incluindo Salmonella, que dependem de três açúcares para regular o fenótipo de virulência das bactérias, controlando a expressão de múltiplos genes de virulência e de um antígeno de interesse, bem como um fenótipo de lise atrasada regulada, permitindo a contenção biológica e a intensificação das propriedades imunogênicas. Outros atributos que podem ser regulados por um ou mais de açúcares incluem tolerância a ácido durante (por exemplo, durante a imunização oral) como descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. N° 2014/0370057, cujos conteúdos inteiros são expressamente incorporados aqui por referência. A dependência de três açúcares intensifica a segurança das bactérias recombinantes, dada a improbabilidade de os organismos encontrarem todos os três açúcares em um ambiente de ocorrência natural. Surpreendentemente, a presente invenção demonstra que três

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7/168 açúcares distintos podem ser usados com sucesso para regular atributos das bactérias recombinantes (por exemplo, a expressão de genes que codificam um antígeno de interesse, fenótipo de lise atrasada e/ou expressão gênica de virulência) sem interferência cruzada de qualquer um açúcar na atividade reguladora de açúcar de qualquer outro açúcar pela repressão catabólica.

[0011] Os organismos podem ser usados para a dispensação segura e altamente eficaz de compostos antigênicos a um indivíduo, a fim de montar respostas imunológicas protetoras eficazes. Tais bactérias recombinantes podem manipular antígenos protetores que sintetizam a superfície celular e podem induzir respostas imunológicas protetoras a múltiplos serovares de Salmonella. As bactérias recombinantes podem ser usadas para intensificar a sobrevivência das bactérias para hospedar estresses de defesa, tais como, ácido estomacal; para conferir atenuação atrasada regulada; para conferir a lise atrasada regulada in vivo (por exemplo, pelo controle da expressão do gene asdA e murA com liberação de um antígeno de interesse ou de uma vacina de DNA que codifica o mesmo); ou para habilitar a fusão de polímeros de carboidratos com carboidratos e/ou proteínas.

[0012] Especificamente, são reveladas na presente invenção as cepas da Vacina de Salmonella Atenuada Recombinante (RASV) reguladas por açúcar triplo. Estas cepas dispensam múltiplos antígenos protetores de superfície/secretados de Salmonella conservados com suas conformações naturais para induzir imunidade protetora contra múltiplos sorovares de Salmonella virulentos. Como

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8/168 um exemplo, as RASVs podem ter uma síntese de antígeno 0 regulada por ramnose, combinada com uma síntese de cadeia lateral de antígeno 0 regulada por manose para expor núcleo interno conservado, e uma produção regulada por arabinose de Módulos Generalizados para Antígenos de Membrana (GMMA), ou vesículas da membrana externa, in vivo para intensificar a produção de proteínas da membrana externa conservadas (OMPs). As RASVs podem ser construídas em dois serovares de Salmonella, de S. Typhimurium do grupo Be S. Enteritidis do no grupo D, para expressar genes imunogênicos conservados e para maximizar respostas imunológicas antiSalmonella humoral, celular e da mucosa. As RASVs reveladas possuem características de projeto racionais diferentes de outras RASVs que intensificam o sucesso. Especificamente, as RASVs reveladas provêm vacinas de Salmonella seguras e altamente eficazes com baixo custo e podem ser usadas para desenvolver RASVs de S. Typhi ou S. Paratyphi A para uso humano.

[0013] Em um aspecto, a revelação provê um derivado recombinante de uma bactéria patogênica compreendendo: a.) um primeiro gene regulado por um primeiro açúcar que confere um primeiro fenótipo; b.) um segundo gene regulado por um segundo açúcar que confere um segundo fenótipo; e c.) um terceiro gene regulado por um terceiro açúcar que confere um terceiro fenótipo; em que o primeiro, o segundo e o terceiro fenótipos são selecionados do grupo que consiste em: 1. uma atenuação atrasada regulada; 2. uma expressão com atraso regulado de um antígeno de interesse;

3. uma lise atrasada regulada in vivo; 4. uma síntese regulada de antígeno O; 5. uma síntese regulada de uma

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9/168 cadeia lateral de antígeno 0; 6. uma produção regulada de Módulos Generalizados para Antígenos de Membrana (GMMA); 7. sobrevivência intensificada regulada para uma condição de estresse do hospedeiro; e 8. uma produção regulada de vesículas da membrana externa (OMVs).

[0014] Em um aspecto, a revelação provê um derivado recombinante de uma bactéria patogênica compreendendo: a) um primeiro gene regulado por um primeiro açúcar que confere um primeiro fenótipo; b.) um segundo gene regulado por um segundo açúcar que confere um segundo fenótipo; e c.) um terceiro gene regulado por um terceiro açúcar que confere um terceiro fenótipo; em que o primeiro, o segundo e o terceiro fenótipos são selecionados do grupo que consiste em: 1. uma atenuação atrasada regulada; 2. uma expressão com atraso regulado de um antígeno de interesse; 3. uma lise atrasada regulada in vivo; 4. uma síntese regulada de antígeno 0; 5. uma produção regulada de Módulos Generalizados para Antígenos de Membrana (GMMA); 6. sobrevivência intensificada regulada para uma condição de estresse do hospedeiro; e 7. uma produção regulada de vesículas da membrana externa (OMVs).

[0015] Em uma modalidade, cada um do primeiro açúcar, do segundo açúcar e do terceiro açúcar é açúcar diferente. Em uma modalidade, o primeiro açúcar, o segundo açúcar ou o terceiro açúcar não interfere com a regulação de um gene regulado por um açúcar diferente.

[0016] Em uma modalidade, o primeiro açúcar é selecionado do grupo que consiste em arabinose, manose, xilose, galactose, ramnose e maltose. Em uma modalidade, o segundo açúcar é selecionado do grupo que consiste em

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10/168 arabinose, manose, xilose, galactose, ramnose e maltose. Em uma modalidade, o terceiro açúcar é selecionado do grupo que consiste em arabinose, manose, xilose, galactose, ramnose e maltose.

[0017] Em uma modalidade, o primeiro gene é operacionalmente ligado a um primeiro promotor regulável por açúcar. Em uma modalidade, o segundo gene é operativamente ligado a um segundo promotor regulável por açúcar. Em uma modalidade, o terceiro gene é operativamente ligado a um terceiro promotor regulável por açúcar.

[0018] Em uma modalidade, um gene é modificado para permitir uma sintese reversível de uma molécula contendo açúcar que confere um fenótipo regulável por açúcar. Em uma modalidade, o gene modificado é pmi. Em uma modalidade, o gene modificado é galE.

[0019] Em uma modalidade, a bactéria é uma bactéria Gram-negativa. Em uma modalidade, a bactéria pertence à familia Enterobacteriaceae.

[0020] Em uma modalidade, o fenótipo é atenuado com atraso regulado, e o gene que confere o fenótipo é fur. Em uma modalidade, o fenótipo é expressão com atraso regulado de um antigeno de interesse, e o gene que confere o fenótipo codifica um antigeno de interesse. Em uma modalidade, o fenótipo é a lise com atraso regulado in vivo, em que a lise é permitida ocorrer em um citosol devido à mutação em um gene sifA. Em uma modalidade, o fenótipo é a síntese regulada do antígeno O, e o gene que confere o fenótipo é selecionado do grupo que consiste em waaG, rfaH, waaJ, wbaP, wzy, waaP, waaO, waaf, waaP, waaC, waaA, waaL e wbaP. Em uma modalidade, o fenótipo é a

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11/168 produção de Módulos Generalizados para Antígenos de Membrana (GMMA) ou vesículas da membrana externa, e o gene que confere o fenótipo é selecionado do grupo que consiste em ybgC, tolQ, tolA, tolR, tolB, pai e ybgF.

[0021] Em uma modalidade, o fenótipo é uma síntese regulada da cadeia lateral do antígeno O, e o gene que confere o fenótipo é tolR. Em uma modalidade, o primeiro fenótipo é a síntese de antígeno O regulada e o segundo fenótipo é GMMA ou vesículas da membrana externa.

[0022] Em uma modalidade, a bactéria compreende adicionalmente um gene que codifica um antígeno de interesse não operativamente ligado a um promotor regulável por açúcar.

[0023] Em uma modalidade, a bactéria compreende uma eliminação de um gene de síntese de antígeno O endógeno. Em uma modalidade, a eliminação no gene de síntese de antígeno O endógeno compreende uma eliminação parcial do gene. Em uma modalidade, a eliminação no gene de síntese de antígeno O endógeno compreende uma eliminação de comprimento total do gene. Em uma modalidade, o gene de síntese do antígeno O é waaL ou wbaP.

[0024] Em uma modalidade, a bactéria compreende uma eliminação em um gene de fosfomanose isomerase endógeno. Em uma modalidade, a eliminação no gene de fosfomanose isomerase endógeno compreende uma eliminação parcial do gene. Em uma modalidade, a eliminação no gene de fosfomanose isomerase endógeno compreende uma eliminação de comprimento total do gene. Em uma modalidade, o gene fosfomanose isomerase é pmi.

[0025] Em uma modalidade, a bactéria compreende uma

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12/168 eliminação em um gene do sistema tol-pal endógeno. Em uma modalidade, a eliminação no gene do sistema tol-pal endógeno compreende uma eliminação parcial do gene. Em uma modalidade, a eliminação no gene do sistema tol-pal endógeno compreende uma eliminação de comprimento total do gene. Em uma modalidade, o gene do sistema tol-pal endógeno é selecionado do grupo que consiste em ybgC, tolQ, tolA, tolR, tolB, pai e ybgF.

[0026] Em uma modalidade, o primeiro gene, o segundo gene e/ou o terceiro gene está(ão) localizado (s) em um plasmídeo na bactéria. Em uma modalidade, o primeiro gene, o segundo gene e/ou terceiro gene está(ão) localizado(s) em um cromossomo na bactéria.

[0027]	Em uma modalidade,	o primeiro, o	segundo ou o
terceiro	promotor regulável	por açúcar é	um promotor
regulável regulável	por ramnose. Em por ramnose é rhaSR	uma modalidade, P rhaBAD ·	o promotor
[0028]	Em uma modalidade,	o primeiro, o	segundo ou o
terceiro	promotor regulável	por açúcar é	um promotor
regulável regulável	por arabinose. Em uma modalidade por arabinose é araC ParaBAD.	, o promotor

[0029] Em uma modalidade, a bactéria compreende adicionalmente uma eliminação em um gene relA endógeno. Em uma modalidade, a eliminação do gene relA endógeno é uma eliminação parcial do gene. Em uma modalidade, a eliminação do gene relA endógeno é uma eliminação de comprimento total do gene.

[0030] Em uma modalidade, a bactéria compreende adicionalmente um ácido nucleico que codifica um repressor LacI. Em uma modalidade, o repressor LacI é codificado por

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13/168 um gene lad. Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifica o repressor LacI é localizado em um plasmídeo na bactéria. Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifica o repressor LacI é localizado em um cromossomo na bactéria.

[0031] Em uma modalidade, a bactéria compreende adicionalmente uma eliminação em um promotor Pf_Ur endógeno.

[0032] Em uma modalidade, o gene fur é operativamente ligado a um promotor regulável por arabinose. Em uma modalidade, o gene fur é localizado em um plasmídeo na bactéria. Em uma modalidade, o gene fur é localizado em um cromossomo na bactéria.

[0033] Em uma modalidade, a bactéria compreende adicionalmente uma eliminação no gene que codifica um aspartato-semialdeído desidrogenase. Em uma modalidade, o gene que codifica o aspartato-semialdeído desidrogenase compreende um gene asd. Em uma modalidade, o gene que codifica o aspartato-semialdeído desidrogenase compreende um gene asdA.

[0034] Em uma modalidade, o gene que codifica o antígeno de interesse é localizado em um plasmídeo na bactéria. Em uma modalidade, o plasmídeo compreende adicionalmente um ácido nucleico que codifica uma aspartato-semialdeído desidrogenase. Em uma modalidade, a aspartato-semialdeído desidrogenase compreende asdA. Em uma modalidade, o plasmídeo é um plasmídeo de baixo número de cópias. Em uma modalidade, o plasmídeo é um plasmídeo de muitas cópias. Em uma modalidade, o plasmídeo é selecionado do grupo que consiste em pYA4589, pYA4595, pYA4763, pG8R15, pG8R16, pG8R17, pG8R18, pGRlll, pG8R112, pG8R113 e pG8R114.

[0035] Em uma modalidade, o gene que codifica o

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14/168 antígeno de interesse é localizado em um cromossomo na bactéria.

[0036] Em uma modalidade, a bactéria compreende adicionalmente uma eliminação em um gene pagL. Em uma modalidade, a eliminação do gene pagL é uma eliminação parcial do gene. Em uma modalidade, a eliminação do gene pagL é uma eliminação de comprimento total do gene. Em uma modalidade, a mutação é AwaaL/ApagL: : TT rhaSR PrhaBAD waaL.

[0037] Em uma modalidade, a bactéria compreende adicionalmente um antígeno de interesse operacionalmente ligado a um promotor regulável por repressor. Em uma modalidade, o promotor é um promotor regulável por lactose. Em uma modalidade, o promotor regulável por lactose é um promotor regulável por LacI. Em uma modalidade, o promotor regulável por LacI é selecionado do grupo que consiste em Ptrc, P lac, Pz72ac, Ptac, P ompA lacO θ P Ipp lacO.

[0038] Em uma modalidade, o antígeno de interesse é um antígeno derivado de um agente infeccioso. Em uma modalidade, o antígeno de interesse é derivado de um agente infeccioso selecionado do grupo que consiste em um vírus, uma bactéria, um protozoário, um príon, um fungo e um helminto. Em uma modalidade, o antígeno de interesse é derivado de uma bactéria. Em uma modalidade, o antígeno de interesse é um antígeno de Salmonella. Em uma modalidade, o antígeno de Salmonella é selecionado do grupo FliC, F1ÍC180, OmpC, OmpD, OmpF, SseB e Ssel. Em uma modalidade, o antígeno de interesse é um antígeno de uma bactéria Clostridium. Em uma modalidade, o antígeno é um antígeno de C. perfringens. Em uma modalidade, o antígeno compreende NetB, PlcC, fragmentos antigênicos do mesmo, proteínas de

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15/168 fusão compreendendo os referidos antigenos, ou proteínas de fusão compreendendo fragmentos antigênicos de antigenos.

[0039] Em uma modalidade, o antígeno de interesse é um antígeno viral. Em uma modalidade, o antígeno de interesse é um antígeno de influenza. Em uma modalidade, o antígeno de influenza é hemaglutinina ou neuraminidase.

[0040] Em uma modalidade, o antígeno de interesse é um antígeno associado a câncer. Em uma modalidade, o antígeno associado a câncer é selecionado do grupo que consiste em MAGE-A, MAGE-CI, BAGE, GAGE, CAGE, XAGE, NY-ESO1, LAGE1 e survivina.

[0041] Em uma modalidade, o antígeno é um antígeno de proteína codificada por um códon de sequência de ácidos nucleicos otimizado para expressão na referida bactéria.

[0042] Em uma modalidade, a bactéria compreende adicionalmente uma eliminação em um gene sifA. Em uma modalidade, a eliminação do gene sifA é uma eliminação parcial do gene. Em uma modalidade, a eliminação do gene sifA é uma eliminação de comprimento total do gene. Em uma modalidade, o gene sifA é operacionalmente ligado a um promotor regulável por arabinose.

[0043] Em uma modalidade, a bactéria compreende adicionalmente uma eliminação em um gene recF. Em uma modalidade, a eliminação do gene recF é uma eliminação parcial do gene. Em uma modalidade, a eliminação do gene recF é uma eliminação de comprimento total do gene.

[0044] Em uma modalidade, a bactéria compreende adicionalmente uma eliminação em um gene recJ. Em uma modalidade, a eliminação do gene recJ é uma eliminação parcial do gene. Em uma modalidade, a eliminação do gene

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16/168 recJ é uma eliminação de comprimento total do gene.

[0045] Em uma modalidade, a bactéria é do gênero Salmonella. Em uma modalidade, a bactéria é uma bactéria Salmonella enterica. Em uma modalidade, a bactéria é uma Salmonella enterica subsp. bactéria enterica sorovar Paratyphi A, uma bactéria Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Enteritidis, uma bactéria Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi, uma bactéria Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium, Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Dublin, ou Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis.

[0046] Em outro aspecto, é revelada aqui uma composição farmacêutica que compreende uma bactéria recombinante revelada aqui, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0047] Em outro aspecto, é revelado na presente invenção um método para provocar uma resposta imunológica contra um antígeno de interesse em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica revelada na presente invenção documento.

[0048] Outros aspectos e outras iterações da invenção são descrito(a)s mais detalhadamente abaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0049] A Figura 1. representa três vetores contendo os cassetes regulados por açúcar araC ParaBAD, rhaRS-PrhaBAD e xylR-PxyiA para permitir a construção de um derivado de vetor suicida para gerar fusões de um cassete de regulação de açúcar para um gene de interesse para a substituição do promotor nativo desse gene de interesse.

[0050] A Figura 2 representa três plasmídeos nos quais

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17/168 a síntese de GFP é regulada por três açúcares diferentes.

[0051] As Figuras. 3A, 3B e 3C ilustram a mutação insensível à galactose Δ(galE-ybhC)-851.

[0052] As Figuras. 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G e 4H descrevem curvas de crescimento de cepas de Salmonella com diferentes mutações galE no caldo Nutriente com concentrações variáveis de galactose.

[0053] A Figura 5 representa a colonização de mutantes galE.

[0054] As Figuras. 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6F, 6G, 6H, 61, 6J, 6K, 6L, 6M, 6N, 60, 6P, 6Q e 6R representam curvas de crescimento de cepas de Salmonella χ12341 (pYA4763) e χ3761 durante 24 h em meios de crescimento com concentrações variadas de açúcar como indicado.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0055] Para que a revelação possa ser mais prontamente entendida, certos termos são primeiro definidos. Estas definições devem ser lidas à luz do restante da revelação e como são entendidas por uma pessoa técnica no assunto. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por uma pessoa técnica no assunto. Definições adicionais são estabelecidas ao longo do relatório descritivo detalhado.

[0056] Como aqui usado, o termo bactéria recombinante refere-se a uma célula bacteriana que foi geneticamente modificada a partir do seu estado nativo. Por exemplo, uma bactéria recombinante pode compreender uma ou mais inserção(ões) de nucleotídeos, eliminações de nucleotídeos, rearranjos de nucleotídeos e modificações de nucleotídeos.

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Estas modificações genéticas podem ser introduzidas no cromossomo da bactéria ou, alternativamente, estar presentes em um ácido nucleico extracromossômico (por exemplo, um plasmídeo). Bactérias recombinantes do relatório descritivo aqui revelado podem compreender um ácido nucleico localizado em um plasmídeo. Alternativamente, as bactérias recombinantes podem compreender um ácido nucleico localizado no cromossomo bacteriano (por exemplo, incorporado de forma estável nas mesmas). Em algumas modalidades, a bactéria recombinante é avirulenta. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante exibe uma virulência reduzida. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante é não virulenta. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante é patogênica. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante é atenuada. Em uma outra modalidade, a bactéria recombinante é um derivado

recombinante de uma	bactéria usado,	patogênica. o termo gene	refere-se a	um
[0057]	Como aqui
fragmento	de ácido nucleico	que codifica uma	proteína ou	um
fragmento	da mesma,	ou uma	molécula de RNA funcional	ou
estrutural	, e pode	opcionalmente incluir	uma sequência

reguladora que precede (sequências não codificadoras 5') e depois da sequência de codificação do ácido nucleico (sequências não codificadoras 3'). Em algumas modalidades, um gene não inclui sequências reguladoras que precedem e seguem a sequência de codificação.

[0058] Em uma modalidade, o gene é um gene heterólogo. Em uma outra modalidade, o ácido nucleico é um ácido nucleico heterólogo. Como aqui usado, os termos gene heterólogo ou ácido nucleico heterólogo referem-se a um

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19/168 gene ou a uma sequência de ácidos nucleicos presente em uma célula recombinante, por exemplo, bactéria, que não é normalmente encontrada na célula tipo selvagem, por exemplo, bactéria, na natureza. Em algumas modalidades, o gene heterólogo ou ácido nucleico heterólogo é exogenamente introduzido em uma determinada célula. Em algumas modalidades, um gene heterólogo pode incluir um gene, ou fragmento do mesmo, introduzido em uma célula hospedeira não nativa. Em algumas modalidades, o termo gene heterólogo inclui uma segunda cópia de um gene nativo, ou fragmento do mesmo, que foi introduzido na célula hospedeira em adição ao gene nativo correspondente. Um ácido nucleico heterólogo também pode incluir, em algumas modalidades, uma sequência genética que é encontrada naturalmente em uma dada célula mas que foi modificada, por exemplo, por regulação por uma sequência promotora diferente, para expressar uma quantidade não natural do ácido nucleico e/ou do polipeptídeo que codifica; e/ou duas ou mais sequências de ácidos nucleicos que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza.

[0059] Como aqui usado, o termo gene endógeno refere-

se a um gene	nativo que	está presente	na sua	localização
natural no genoma de cromossomo bacteriano).	um organismo	(por	exemplo, um
[0060] Um	promotor,	como é aqui	usado,	refere-se a

uma sequência de ácidos nucleicos que é capaz de controlar a expressão de uma sequência ou um gene de codificação. Um promotor pode compreender uma ou mais sequência(s) reguladora(s) transcricionais especificas para intensificar adicionalmente a expressão e/ou para alterar a expressão

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20/168 espacial e/ou a expressão temporal de um ácido nucleico. Por exemplo, um promotor pode incluir um ou mais ácido(s) nucleico (s) que é(são) especificamente reconhecido(s) por uma proteína ativadora da transcrição (por exemplo, um elemento intensificador), uma proteína repressora de transcrição, uma polimerase e semelhantes. O termo operacionalmente ligado, como aqui usado, significa que a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos está sob o controle de um promotor com o qual está espacialmente conectado. Um promotor pode ser posicionado em 5' (a montante) da sequência de ácidos nucleicos sob o seu controle. A distância entre o promotor e uma sequência de ácidos nucleicos a ser expressada pode ser aproximadamente a mesma que a distância entre esse promotor e a sequência de ácidos nucleicos nativa que controla. Como é conhecido na técnica, a variação nesta distância pode ser acomodada sem perda da função do promotor. As sequências de ácidos nucleicos dos promotores descritos na presente invenção são conhecidas na técnica, e métodos para ligar operativamente estes promotores a um gene (por exemplo, um gene que codifica um repressor) são conhecidos na técnica.

[0061] Em algumas modalidades, o promotor para uso como descrito aqui pode ser regulado direta ou indiretamente por um açúcar. Por exemplo, em algumas modalidades, o promotor é responsive ao nível de arabinose, de outro modo referido aqui como um promotor regulável por arabinose. De um modo geral, a arabinose pode estar presente durante o crescimento in vitro de uma bactéria, enquanto tipicamente ausente do tecido hospedeiro. Em uma modalidade, o promotor é derivado de um sistema araC-P_araBAD de Escherichia coli. O

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21/168 sistema araC ParaBAD é um sistema de expressão fortemente regulado, que demonstrou funcionar como um forte promotor induzido pela adição de baixos níveis de arabinose. 0 promotor araC-araBAD é um promotor bidirecional que controla a expressão das sequências de ácidos nucleicos de araBAD em uma direção, e a sequência de ácidos nucleicos de araC na outra direção.

[0062] Por conveniência, a porção do promotor araCaraBAD que medeia a expressão das sequências de ácidos nucleicos araBAD, e que é controlada pelo produto da sequência de ácidos nucleicos araC, é aqui referida como ParaBAD. Para uso como descrito na presente invenção, um cassete com a sequência de ácidos nucleicos araC e o promotor araC-araBAD pode ser usado. Este cassete é referido neste relatório descritivo como araC ParaBAD. A proteína AraC é um regulador positivo e negativo de ParaBAD. Na presença de arabinose, a proteína AraC é um elemento regulador positivo que permite a expressão de ParaBAD. Na ausência de arabinose, a proteína AraC reprime a expressão do ParaBAD. Outras bactérias entéricas contêm sistemas reguladores de arabinose homólogos ao sistema araC-araBAD de E. coli, incluindo, por exemplo, S. Typhimurium. Por exemplo, a proteína AraC de E. coli ativa somente ParaBAD de E. coli (na presença de arabinose) e não ParaBAD de S. Typhimurium. Assim, um promotor regulado por arabinose pode ser usado em uma bactéria recombinante que possua um operon de arabinose semelhante, sem interferência substancial entre os dois, se o promotor e o operon forem derivados de duas espécies diferentes de bactérias. De um modo geral, a concentração de arabinose necessária para induzir a

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22/168 expressão é tipicamente menor que cerca de 2% (p/p) em um meio de cultura. Em algumas modalidades, a concentração é menor que cerca de 1,5%, 1%, 0,5%, 0,2%, 0,1% ou 0,05% (p/p) em um meio de cultura. Em outras modalidades, a concentração é de 0,05% ou inferior, por exemplo, cerca de 0,04%, 0,03%, 0,02% ou 0,01% (p/p) . Em uma modalidade de exemplo, a concentração de cerca de 0,05% (p/p) em um meio de cultura.

[0063] Em outras modalidades, o promotor pode ser responsive ao nível de maltose no ambiente, de outro modo referido aqui como um promotor regulável por maltose. Em algumas modalidades, as bactérias recombinantes descritas na presente invenção são cultivadas em um meio compreendendo maltose. O gene malT codifica MalT, um regulador positivo de quatro promotores responsivos à maltose (Ppq, Pefg, Pkbm e Ps) . A combinação de malT e um promotor mal cria um sistema de expressão fortemente regulado que demonstrou funcionar como um forte promotor induzido na presença de maltose. Ao contrário do sistema araC-ParaBAD, a expressão de malT é regulada por um promotor (isto é, Pt) que é funcionalmente não relacionado com os outros promotores de mal. Pt não é regulado pelo MalT. O promotor malEFG-malKBM é um promotor bidirecional que controla a expressão das sequências de ácidos nucleicos malKBM em uma direção, e as sequências de ácidos nucleicos malEFG na outra direção. Por conveniência, a porção do promotor malEFG-malKBM que medeia a expressão da sequência de ácidos nucleicos de malKBM e que é controlada por MalT, é aqui referida como Pkbm, e a porção do promotor malEFGmalKBM que medeia a expressão da sequência de ácidos

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23/168 nucleicos malEFG, e que é controlada por Mali, é aqui referida como Pefg· A indução completa de Pkbm requer a presença dos locais de ligação de MalT de Pefg· Para uso nos vetores e sistemas descritos na presente invenção, um cassete de genes que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica MalT e um promotor mal é usado. Este cassete de genes é referido neste relatório descritivo como malT-Pmai· Na presença de maltose, o MalT é um elemento regulador positivo que permite a expressão mediada por P_mai · De um modo geral, a concentração de maltose necessária para induzir a expressão é tipicamente menor que cerca de 1% (p/p) em um meio de cultura. Em algumas modalidades, a concentração é menor que cerca de 1,0%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3% 0,2%, 0,1% ou 0,05% (p/p) em um meio de cultura. Em outras modalidades, a concentração é de 0,05% ou abaixo, por exemplo, cerca de 0,04%, 0,03%, 0,02% ou 0,01% (p/p) · Em uma modalidade de exemplo, a concentração é de cerca de 0,2% a cerca de 0,4% (p/p) em um meio de cultura.

[0064] Em ainda outras modalidades, o promotor aqui usado é responsive ao nível de ramnose no ambiente, de outro modo referido aqui como um promotor regulável por ramnose. Análogo ao sistema araC-P_araBAD descrito acima, o sistema promotor do ativador rhaRS-P ^haB é rigidamente regulado por ramnose. A expressão do promotor ramnose (Prha) é induzida a níveis altos na presença de ramnose. Em algumas modalidades, as bactérias são cultivadas na presença de ramnose. A ramnose é comumente encontrada em bactérias, mas raramente encontrada em seres humanos. O operon rhaBAD é controlado pelo promotor PrhaBAD. Este

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24/168 promotor é regulado por dois ativadores, RhaS e RhaR, e as sequências de ácidos nucleicos correspondentes pertencem a uma unidade de transcrição que está localizada na direção oposta das sequências de ácidos nucleicos rhaBAD. Na presença de L-ramnose, o RhaR liga-se ao promotor PrhaRs e ativa a produção de RhaR e RhaS. RhaS em conjunto com Lramnose, por sua vez, ligam-se aos promotores PrhaBAD e PrhaT e ativam a transcrição das sequências de ácidos nucleicos estruturais. A indução completa dos promotores regulados por arabinose, maltose e ramnonse descritos na presente invenção requer a ligação do complexo Crp-cAMP, que é um regulador chave da repressão catabólica.

[0065] Embora a L-arabinose e a L-ramnose atuem diretamente como indutores da expressão de regulons que medeiam o seu catabolismo, diferenças importantes existem no que se refere a mecanismos reguladores. A L-arabinose atua como um indutor com o ativador AraC no controle positivo do regulon de arabinose. No entanto, o regulon de L-ramnose é sumbmetido a uma cascata reguladora e, portanto, é sumbmetido a um controle ainda mais rigido do

que o	sistema	araC-ParaBAD .	L-Ramnose	atua como	um	indutor
com o	ativador	RhaR para a	síntese de	RhaS, que	por	sua vez
atua	como um	ativador no	controle	positivo	do	regulon

ramnose. No presente relatório descritivo, a ramnose pode ser usada para interagir com a proteína RhaR e depois a proteína RhaS pode ativar a transcrição de uma sequência de ácidos nucleicos operativamente ligada ao promotor PrhaBAD.

[0066] Em ainda outras modalidades, o promotor pode ser responsive ao nível de xilose no ambiente, referido aqui como um promotor regulável por xilose. Geralmente,

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25/168 concentrações de xilose entre 0,0002% e 0,63% (p/p) no ambiente ativam a expressão de um promotor induzível por xilose descrito na presente invenção (ver, por exemplo, Bhavsar et al. (2001) App . Environ. Microbiol. 67 (1): 40310 (34)) . O sistema xylR-P_xyiA é outro sistema promotor do ativador induzível bem estabelecido. A xilose induz operons específicos da xilose (por exemplo, xylE, xylFGHR e xylAB) que são regulados por XylR e o sistema AMP-Crp cíclico. A proteína XylR serve como um regulador positivo por ligação a duas regiões distintas dos promotores da sequência de ácidos nucleicos xyl. Tal como com o sistema araC-P_araBAD descrito acima, os sistemas reguladores xyl.R-P_xyiAB e/ou xylR-P_xyiFGH podem ser usados. Nestas modalidades, a xilose que interage com a proteína XylR ativa a transcrição de sequências de ácidos nucleicos operativamente ligadas a qualquer um dos dois promotores P_xyi.

[0067] Como aqui usado, o termo exógeno refere-se a uma substância (por exemplo, um ácido nucleico ou polipeptídeo) presente em uma célula diferente da sua fonte nativa. O termo exógeno pode se referir a um ácido nucleico ou a uma proteína que foi introduzida por um processo envolvendo a mão do homem em um sistema biológico, tal como uma célula ou um organismo na(o) qual ela(e) não é normalmente encontrada(o) ou na(o) qual é encontrada(o) em quantidades indetectáveis. Uma substância pode ser considerada exógena se for introduzida em uma célula ou um precursor da célula que herda a substância. Em contraste, o termo endógeno refere-se a uma substância que é nativa ao sistema biológico ou a uma célula.

[0068] Uma composição farmacêutica, como aqui usada,

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26/168 refere-se a uma composição compreendendo um ingrediente ativo (por exemplo, uma bactéria recombinante descrita na presente invenção) com outros componentes, tais como, um carreador e/ou excipiente fisiologicamente adequado.

[0069] Como aqui usado, o termo carreador farmaceuticamente aceitável ou excipiente farmaceuticamente aceitável refere-se a um material, uma composição ou um carreador farmaceuticamente aceitável, tal como, um enchimento, diluente, excipiente, auxiliar de fabricação liquido ou sólido (por exemplo, lubrificante, talco de magnésio, estearato de cálcio ou zinco ou ácido estérico), ou material encapsulante de solvente, envolvido no carreador ou transporte do composto em questão de um órgão, ou porção do corpo, para outro órgão, ou porção do corpo. Cada carreador deve ser aceitável no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não prejudicial para o paciente. Alguns exemplos de materiais que podem servir como carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) açúcares, tais como, lactose, glucose e sacarose; (2) amidos, tais como, amido de milho e amido de batata; (3) celulose e seus derivados, tais como, carboximetil celulose de sódio, metilcelulose, etil celulose, celulose microcristalina e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) agentes lubrificantes, tais como, estearato de magnésio, laurel sulfato de sódio e talco; (8) excipientes, tais como, manteiga de cacau e ceras para supositórios; (9) óleos, tais como, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de cártamo, óleo de gergelim, azeite, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, tal

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27/168 como propileno glicol; (11) polióis, tais como, glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol (PEG); (12) ésteres, tais como, oleato de etila e laurato de etila; (13) ágar; (14) agentes tamponantes, tais como, hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água isenta de pirogênio; (17) solução salina isotônica (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (PBS)); (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções com tampão de pH; (21) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; (22) agentes de volume, tais como, componente do soro de polipeptídeos e aminoácidos (23), tais como, albumina do soro, HDL e LDL; (24) álcoois C2-C12, tal como etanol; e (25) outras substâncias compatíveis não tóxicas empregadas em formulações farmacêuticas. Agentes umectantes, agentes colorantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes desintegrantes, aglutinantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes perfumantes, inibidores de protease, plastificantes, emulsificantes, agentes estabilizantes, agentes de aumento da viscosidade, agentes formadores de película, agentes solubilizantes, tensoativos, conservantes e antioxidantes também podem estar presentes na formulação. Os termos tais como excipiente, carreador, excipiente farmaceuticamente aceitável ou semelhantes, são aqui usados indistintamente.

[0070] Um plasmídeo ou vetor inclui uma construção de ácido nucleico projetada para dispensação a uma célula hospedeira ou transferência entre diferentes células hospedeiras. O ácido nucleico incorporado no plasmídeo pode ser operativamente ligado a uma sequência de controle da

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28/168 expressão, quando a sequência de controle da expressão controla e regula a transcrição e tradução dessa sequência de polinucleotídeos.

[0071] Como aqui usado, os termos proteína e polipeptideo são aqui usados indistintamente para designar uma série de resíduos de aminoácidos, conectados entre si por ligações peptídicas entre os grupos alfa-amino e carboxi de resíduos adjacentes. Os termos proteína e polipeptideo referem-se a um polímero de aminoácidos, incluindo aminoácidos modificados (por exemplo, fosforilados, glicados, glicosilados, etc.) e análogos de aminoácidos, independentemente do seu tamanho ou sua função. Os termos proteína e polipeptídeo como aqui usados referem-se a polipeptídeos grandes e a peptídeos pequenos. Os termos proteína e polipeptídeo são aqui usados indistintamente quando se refere a um produto gênico e fragmentos do mesmo. Assim, polipeptídeos ou proteínas de exemplo incluem produtos gênicos, proteínas de ocorrência natural, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos e outros equivalentes, variantes, fragmentos e análogos dos anteriores.

[0072] Um ácido nucleico ou sequência de ácidos nucleicos pode ser qualquer molécula, de preferência, uma molécula polimérica, incorporando unidades de ácido ribonucleico, ácido desoxirribonucleico ou um análogo dos mesmos. O ácido nucleico pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla. Um ácido nucleico de cadeia simples pode ser uma cadeia de ácido nucleico de um DNA de cadeia dupla desnaturado. Alternativamente, pode ser um ácido nucleico de cadeia simples não derivado de qualquer DNA de cadeia

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29/168 dupla. Em um aspecto, o ácido nucleico pode ser DNA. Em outro aspecto, o ácido nucleico pode ser RNA. Moléculas de ácido nucleico adequadas são DNA, incluindo DNA genômico ou cDNA. Outras moléculas de ácido nucleico adequadas são RNA, incluindo mRNA, rRNA e tRNA.

[0073] As alterações da sequência de aminoácidos nativa podem ser realizadas por qualquer uma de várias técnicas conhecidas de um técnico no assunto. As mutações podem ser introduzidas, por exemplo, em locais particulares por síntese de oligonucleotídeos contendo uma sequência mutante, flanqueada por locais de restrição permitindo a ligação a fragmentos da sequência nativa. Após a ligação, a sequência reconstruída resultante codifica um análogo tendo a inserção, substituição ou eliminação de aminoácidos desejada. Alternativamente, podem ser empregues procedimentos de mutagênese específica do local direcionada por oligonucleotídeos para prover uma sequência de nucleotídeos alterada tendo determinados códons alterados de acordo com a substituição, eliminação ou inserção necessária. As técnicas para preparar tais alterações estão muito bem estabelecidas e incluem, por exemplo, aquelas reveladas por Walder et al. (35); Bauer et al. (36); Craik (37); Smith et al. (38); e Pat. US Nos. 4.518.584 e 4.737.462, que são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Qualquer resíduo de cisterna não envolvido na manutenção da conformação adequada do polipeptídeo também pode ser substituído, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir a reticulação aberrante. Inversamente, a(s) ligação(ões) de cisterna pode(m) (m) ser adicionada(s) ao polipeptídeo para

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30/168 melhorar a sua estabilidade ou facilitar a oligomerização.

[0074] O termo estatisticamente significativo ou significativamente refere-se à significância estatística e geralmente significa um desvio padrão de dois (2DP) ou uma diferença maior.

[0075] Como aqui usado, o termo célula hospedeira refere-se a uma célula em um organismo ao qual a bactéria recombinante está sendo administrada de modo a, por exemplo, provocar uma resposta imunológica. Em uma modalidade, um hospedeiro é uma ave, equino ou humano e uma célula hospedeira refere-se, respectivamente, a uma célula de ave, uma célula equina ou uma célula humana.

[0076] Exceto nos exemplos operativos, ou quando indicado de outro modo, todos os números que expressam quantidades de ingredientes ou condições reacionais aqui usados devem ser entendidos como modificados em todos os casos pelo termo cerca de. O termo cerca de quando usado em conexão com porcentagens pode significar ±1%.

[0077] Os artigos um e uma, como usados aqui, devem ser entendidos como significando pelo menos um, a menos que claramente indicado em contrário.

[0078] A expressão e/ou, quando usada entre elementos em uma lista, pretende significar (1) que apenas um único elemento listado está presente, ou (2) que mais de um elemento da lista está presente. Por exemplo, A, B e/ou C indica que a seleção pode ser A sozinho; B sozinho; C sozinho; A e B; A e C; Be C; ou A, B e C. A expressão e/ou pode ser usada de forma intercambiável com pelo menos um ou um ou mais de elementos de uma lista.

[0079] As faixas aqui providas são entendidas como

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31/168 sendo abreviadas para todos os valores dentro da faixa. Por exemplo, uma faixa de 1 a 50 é entendida como incluindo qualquer número, combinação de números ou subfaixa do grupo

que	consiste	: em	1,	2, 3, 4,	5, 6, 7, 8,	9, 10, 11,	12,	13
14,	15,	16,	17,	18,	19, 20,	21, 22, 23,	24, 25, 26,	27,	28
29,	30,	31,	32,	33,	34, 35,	36, 37, 38,	39, 40, 41,	42,	43
44,	45,	46,	47,	48,	49 ou 50

I. Bactérias Recombinantes [0080] A presente revelação provê, em algumas modalidades, uma bactéria recombinante capaz de expressão regulada de pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um antígeno de interesse. A bactéria recombinante descrita na presente invenção é particularmente eficaz em provocar uma resposta imunológica (por exemplo, imunidade protetora) contra o antígeno de interesse porque a bactéria compreende múltiplos sistemas reguladores recombinantes que permitem que a bactéria se replique por administração e colonize tecidos linfoides em um indivíduo de modo a provocar respostas imunológicas potentes. No entanto, após vários ciclos de replicação in vivo, a bactéria exibe, em última análise, um fenótipo atenuado que permite a administração segura a um indivíduo, por exemplo, como uma composição de vacina. Os sistemas reguladores recombinantes das bactérias descritas na presente invenção dependem, em parte, de múltiplos elementos reguladores genéticos que respondem a um ou mais açúcares (por exemplo, arabinose, ramnose, manose, maltose, xilose e galactose) que não estão disponíveis para a bactéria in vivo. Assim, o uso do fenótipo das bactérias recombinantes descritas na presente invenção pode ser

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32/168 alterado na administração a um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo é administrado com um ou mais açúcares antes, após ou concorrentemente com a administração de uma bactéria recombinante descrita na presente invenção, a fim de ativar e/ou reprimir um sistema regulador responsive a açúcar da bactéria. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita na presente invenção compreende pelo menos três sistemas reguladores, cada um dependente de um açúcar diferente, o que facilita a invasão inicial de uma célula hospedeira no indivíduo, atenuação atrasada e imunogenicidade melhorada.

[0081] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita na presente invenção pode ser regulada para atenuação atrasada in vivo. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita na presente invenção é capaz de expressão atrasada regulada de um ácido nucleico que codifica um antígeno de interesse. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita na presente invenção exibe a produção regulada de Módulos Generalizados para Antígenos de Membrana (GMMA), ou de vesículas da membrana externa, in vivo, que podem conduzir à produção intensificada de proteínas de membrana externa conservadas presentes na bactéria e, finalmente, imunogenicidade melhorada. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita na presente invenção é capaz de expressão regulada de pelo menos um ácido nucleico que codifica pelo menos um antígeno de interesse e de atenuação regulada. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita na presente invenção é capaz de expressão regulada de pelo menos um ácido nucleico que codifica pelo menos um antígeno de

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33/168 interesse e de produção regulada de GMMA, ou vesículas da membrana externa, in vivo. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita na presente invenção é capaz da produção regulada de GMMA, ou vesículas da membrana externa, in vivo, de atenuação regulada. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita na presente invenção é capaz de expressão regulada de pelo menos um ácido nucleico que codifica pelo menos um antígeno de interesse, atenuação regulada, e produção regulada de GMMA, ou vesículas da membrana externa, in vivo. Em algumas modalidades, cada uma destas propriedades é regulada direta ou indiretamente pela abundância de pelo menos um açúcar (por exemplo, arabinose, ramnose, manose, xilose, maltose e galactose).

[0082] Em algumas modalidades, a bactéria descrita na presente invenção é uma bactéria Gram negativa. Em algumas modalidades, a bactéria é uma bactéria patogênica. Em algumas modalidades, a bactéria é uma bactéria avirulenta. Em algumas modalidades, a bactéria pertence a Enterobaceteriaceae. Em algumas modalidades, a bactéria pertence a um gênero selecionado de: Alterococcus, Aquamonas, Aranicola, Arsenophonus, Brenneria, Budvicia, Buttiauxella, Candidatus Phlomobacter, Cedeceae, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Ewingella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Leclercia, Leminorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pectobacterium, Photorhabdus, Plesiomonas, Pragia, Proteus, Providencia, Rahnella, Raoultella, Salmonella, Samsonia, Serratia, Shigella, Sodalis, Tatumella, Trabulsiella, Wigglesworthia,

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Xenorhbdus, ou Yersinia, Yokenella. Em algumas modalidades, a bactéria é uma espécie patogênica de Enterobaceteriaceae. Em algumas modalidades, a bactéria é selecionada do grupo que consiste em Escherichia coll, Shigella, Edwardsiella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Morganella, Providencia e Yersinia. Em algumas modalidades, a bactéria é do gênero Salmonella. Em algumas modalidades, a bactéria é do gênero Yersinia. Em algumas modalidades, a bactéria é do gênero Edwardsiella. Em algumas modalidades, a bactéria é de um gênero, uma espécie ou uma cepa habitualmente usado(a) como vacina viva ou atenuada.

[0083] Algumas modalidades da presente revelação compreendem uma espécie ou subespécie do gênero Salmonella (por exemplo, S. enterica ou S. bongori) . Por exemplo, a bactéria recombinante pode ser um serovar de Salmonella enterica, incluindo, por exemplo, Paratyphi A, Enteritidis, Typhi, e Typhimurium. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante é do sorovar S. Typhimurium, S. Typhi, S. Paratyphi, S. Gallinarum, S. Enteritidis, S. Choleraesius,

S. Arizonae, S. Newport, S. Heidelberg, S. Infantis, S. Cholerasiuis, ou S. Dublin.

[0084] Uma bactéria recombinante derivada de Salmonella pode ser particularmente adequada para usar como vacina. Por exemplo, a infecção oral de um hospedeiro com uma cepa de Salmonella conduz tipicamente à colonização do tecido linfoide associado ao intestino (GALT) ou das placas de Peyer, o que leva à indução de uma resposta imunológica da mucosa generalizada para a bactéria recombinante. A penetração adicional da bactéria nos linfonodos

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35/168 mesentéricos, no fígado e no baço pode aumentar a indução de respostas imunológicas sistêmicas e celulares direcionadas contra a bactéria. Assim, o uso de Salmonella recombinante para imunização oral estimula todos os três ramos do sistema imunológico, o que é particularmente importante para a imunização contra agentes de doenças infecciosas que colonizam e/ou invadem através de superfícies mucosas. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita na presente invenção é usada para provocar uma resposta imunológica em aves domésticas (por exemplo, como uma vacina). Quando usada em aves domésticas, a bactéria recombinante pode ser administrada por pulverização em curso e, assim, inocular o tecido linfoide associado à conjuntiva (CALT) através da exposição ocular, o tecido linfoide associado ao nariz (NALT) e tecido linfoide associado a brônquios (BALT) via exposição respiratória e o GALT via exposição oral. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita na presente invenção é administrada a pintos recém-nascidos.

A. Atenuação [0085] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita na presente invenção é modificada de modo que a expressão de um ou mais genes, por exemplo, genes de virulência, possa ser regulada de uma maneira responsiva a açúcar. Em algumas modalidades, um ou mais genes endógenos, por exemplo, genes de virulência, são eliminados do cromossomo bacteriano. Em algumas modalidades, a eliminação é uma eliminação parcial do gene endógeno. Em algumas modalidades, a eliminação é uma eliminação de comprimento total do gene endógeno. Em algumas modalidades, o gene, por

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36/168 exemplo, o gene de virulência, é geneticamente alterado para evitar a transcrição e/ou tradução do gene que codifica a proteína. Em algumas modalidades, o gene endógeno é geneticamente alterado para inserir um terminador de transcrição na fase de leitura aberta do gene. Em algumas modalidades, uma região reguladora do gene, por exemplo, gene de virulência, é geneticamente modificada para alterar (por exemplo, diminuir) a expressão do gene. Em algumas modalidades, o promotor de um gene, por exemplo, gene de virulência, é alterado para incluir um ou mais elemento(s) regulador(es) (por exemplo, um promotor responsive a açúcar).

[0086] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita na presente invenção é modificada para compreender um ácido nucleico que compreende um gene. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante é modificada para compreender um ácido nucleico que compreende um gene, pelo qual uma cópia endógena do gene no cromossomo bacteriano foi alterada e/ou eliminada. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86 %, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntico a um gene endógeno no cromossomo bacteriano que foi eliminado e/ou alterado. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos

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84%, pelo menos 85%, pelo menos 86 %, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% homóloga a um gene endógeno no cromossomo bacteriano que foi eliminado e/ou alterado. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene de uma espécie bacteriana, subespécie, sorovar ou cepa que é diferente das espécies bacterianas da bactéria recombinante.

[0087] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene de uma espécie bacteriana, subespécie, sorovar, ou cepa que é o mesmo que as espécies bacterianas da bactéria recombinante. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene que é operacionalmente ligado a um promotor regulável (por exemplo, um promotor regulável por açúcar). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene que é operacionalmente ligado a um promotor regulável por ramnose, um promotor regulável por xilose, um promotor regulável por galactose, um promotor regulável por arabinose, um promotor regulável por manose

ou um promotor regulável p	Or maltose.	Em	algumas
modalidades,	o	ácido nucleico	compreendendo	o	gene é
localizado em	um plasmideo	na bactéria.	Em	algumas
modalidades,	o	ácido nucleico	compreendendo	o	gene é
localizado	no	cromossomo	bacteriano. Em	algumas
modalidades,	o	ácido nucleico	compreendendo	o	gene é
localizado no	local cromossômico	correspondente	ao	local de

um gene endógeno que foi eliminado ou alterado no cromossomo bacteriano. Em algumas modalidades, o ácido

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38/168 nucleico é otimizado por códon (por exemplo, para melhorar a expressão do ácido nucleico na bactéria recombinante).

1. Genes de síntese de antígeno O [0088] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende uma eliminação em um gene de síntese de antígeno O endógeno. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende uma eliminação em um gene de ligase de antígeno O endógeno. Em algumas modalidades, a eliminação é uma eliminação parcial do gene de ligase de antígeno O endógeno. Em algumas modalidades, a eliminação é uma eliminação de comprimento total do gene de ligase de antígeno O endógeno. Em algumas modalidades, o gene de ligase de antígeno O endógeno é geneticamente alterado para inserir um terminador de transcrição na fase de leitura aberta do gene. Em algumas modalidades, uma região reguladora do gene de ligase de antígeno O endógeno é geneticamente modificada para alterar (por exemplo, diminuir) a expressão do gene. Em algumas modalidades, o promotor de um gene de ligase de antígeno O endógeno é alterado para incluir um ou mais elemento (s) regulador (es) (por exemplo, um promotor responsive a açúcar) . Em algumas modalidades, o promotor de um gene de ligase de antígeno O endógeno é alterado para aumentar o espaçamento entre a sequência Shine-Delgarno e o códon de partida do gene. Em algumas modalidades, o promotor de um gene de ligase de antígeno O endógeno é alterado para diminuir o espaçamento entre a sequência Shine-Delgarno e o códon de partida do gene. Em algumas modalidades, a sequência Shine-Delgarno (SD), o códon de partida, o segundo códon e/ou os terceiros códons do gene de ligase de antígeno O é(são) alterado(s)

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39/168 para aumentar a frequência das nucleobases adenina de forma a aumentar a frequência das nucleobases adenina de modo a intensificar a eficiência do gene. Em algumas modalidades, a sequência Shine-Delgarno (SD) , o códon de partida, o segundo códon e/ou os terceiros códons do gene de ligase de antígeno 0 é(são) alterado(s) para reduzir a frequência das nucleobases adenina, de modo a diminuir a eficiência da tradução do gene. Em algumas modalidades, o gene de ligase de antígeno 0 é waaL (também conhecido como rfaL) . A ligase de antígeno 0 WaaL é necessária para ligar o polissacarídeo a porção de núcleo A-LPS de lipídeo. A eliminação de waaL resulta em um núcleo A-LPS de lipídeo intacto, sem antígeno 0 ou açúcares individuais afixados ao mesmo. Em algumas modalidades, o gene de ligase de antígeno 0 é selecionado do grupo que consiste em waaG (também conhecido como rfaG) , waal (também conhecido como rfal), rfaH, waaJ (também conhecido como rfaJ) , wbaP (também conhecido como rfbP) , wzy (também conhecido como rfc) , waaP, waaQ, waaP, waaP, waaC e waaA.

[0089] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita na presente invenção é modificada para compreender um ácido nucleico que compreende um gene de ligase de antígeno O. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene de ligase de antígeno O é localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene de ligase de antígeno O é localizado em um cromossomo da bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene de ligase de antígeno O é localizado no local cromossômico correspondente ao local de um gene de ligase de antígeno O

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40/168 endógeno que foi eliminado ou alterado no cromossomo bacteriano. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante é modificada para compreender um ácido nucleico que compreende um gene de ligase de antígeno O, pelo qual uma cópia endógena do gene no cromossomo bacteriano foi alterada e/ou eliminada. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene de ligase de antígeno O de Salmonella.

[0090] A sequência de ácidos nucleicos de um gene exemplifreativo de Salmonella waaL é provida abaixo: atgctaaccacatcattaacgttaaataaagagaaatggaagccgatctggaataaagc gctggtttttctttttgttgccacgtattttctggatggtattacgcgttataaacatt tgataatcatacttatggttatcaccgcgatttatcaggtctcacgctcaccgaaaagt ttcccccctcttttcaaaaatagcgtattttatagcgtagcagtattatcattaatcct tgtttattccatactcatatcgccagatatgaaagaaagtttcaaggaatttgaaaata cggtactggagggcttcttattatatactttattaattcccgtactattaaaagatgaa acaaaagaaacggttgcgaaaatagtacttttctcctttttaacaagtttaggacttcg ctgccttgcagagagtattctgtatatcgaggactataataaagggattatgccattca taagctatgcgcatcgacatatgtccgattccatggttttcttatttccagcattattg aatatttggctgtttagaaaaaatgcaattaagttggtttttttggtgcttagcgccat ctaccttttctttatcctgggaaccctatcgcgaggggcatggttggcggtgcttatag taggtgttctgtgggcaatactgaaccgccaatggaagttaataggagttggtgccatt ttattagccattatcggcgctttggttatcactcaacataataacaaaccagacccaga acatttactgtataaattacagcagacagatagctcatatcgttatactaacggaaccc agggcaccgcgtggatactgattcaggaaaacccgatcaagggctacggctatggtaat gatgtgtatgatggtgtttataataaacgcgttgtcgattatccaacgtggacctttaa agaatctatcggtccgcataataccattctgtacatctggtttagtgcaggcatattgg gtctggcgagcctggtctatttatatggcgctatcatcagggaaacagccagctctacc ctcaggaaagtagagataagcccctacaatgctcatctcttgctatttttatctttcgt cggtttttatatcgttcgtggcaattttgaacaggtcgatattgctcaaattggtatca

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41/168 ttaccggttttctgctggcgctaagaaatagataa (SEQ ID NO: 1).

[0091] A sequência de aminoácidos da proteína WaaL codificada pelo ácido nucleico da SEQ ID NO: 1 é provida abaixo : MLTTSLTLNKEKWKPIWNKALVFLFVATYFLDGITRYKHLIIILMVITAIYQVSRSPKS FPPLFKNSVFYSVAVLSLILVYSILISPDMKESFKEFENTVLEGFLLYTLLIPVLLKDE TKETVAKIVLFSFLTSLGLRCLAESILYIEDYNKGIMPFISYAHRHMSDSMVFLFPALL NIWLFRKNAIKLVFLVLSAIYLFFILGTLSRGAWLAVLIVGVLWAILNRQWKLIGVGAI LLAIIGALVITQHNNKPDPEHLLYKLQQTDSSYRYTNGTQGTAWILIQENPIKGYGYGN DVYDGVYNKRWDYPTWTFKESIGPHNTILYIWFSAGILGLASLVYLYGAIIRETASST LRKVEISPYNAHLLLFLSFVGFYIVRGNFEQVDIAQIGIITGFLLALRNR (SEQ ID NO: 2) .

[0092] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene waaL de Salmonella (provido como SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene waaL, em que o gene waaL compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos

84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos

95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o nucleico ácido compreende um gene waaL, em que o gene waaL compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85% %, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos

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94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% homóloga à sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 1.

[0093] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma ligase de antígeno O, em que a referida ligase de antígeno O compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma ligase de antígeno O, em que a referida ligase de antígeno O compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% homóloga à sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 2.

[0094] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene de ligase de antígeno O de uma espécie bacteriana, subespécie, sorovar, ou cepa que é diferente da espécie bacteriana da bactéria recombinante. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene de ligase

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43/168 de antígeno 0 de uma espécie bacteriana, subespécie, sorovar ou cepa que é o mesmo que a espécie bacteriana da bactéria recombinante.

[0095] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene de ligase de antígeno O que é operativamente ligado a um promotor regulável (por exemplo, um promotor regulável por açúcar). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene de ligase de antígeno O (por exemplo, waaL) que é operacionalmente ligado a um promotor regulável por açúcar. Vantajosamente, as cepas bacterianas recombinantes compreendendo um ácido nucleico que compreende um gene de ligase de antígeno O (por exemplo, waaL) que é operacionalmente ligado a um promotor regulável por açúcar sintetizarão LPS normal na presença do açúcar (por exemplo, ramnose) in vitro, mas formará LPS bruto in vivo, devido à ausência do açúcar que ativa o promotor e, portanto, a expressão da ligase de antígeno O. Sem querer estar vinculado a qualquer teoria particular, usando esta estratégia, a bactéria irá expor o oligossacarídeo do núcleo de LPS conservado e terá uma produção intensificada de proteínas de membrana externa conservadas (OMPs; por exemplo, porinas) que podem levar à imunogenicidade melhorada e podem auxiliar na produção de uma resposta imunológica de proteção cruzada contra um antígeno de interesse sintetizado na bactéria in vivo. Em algumas modalidades, o promotor regulável por açúcar exibe atividade aumentada (por exemplo, transcrição aumentada) na presença de um açúcar específico e atividade diminuída na ausência de um açúcar. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene de ligase de antígeno O que é

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44/168 operativamente ligado a um promotor regulável por ramnose (por exemplo, um promotor regulável por açúcar). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene de ligase de antígeno 0 que é operativamente ligado a um promotor regulável por arabinose (por exemplo, um promotor regulável por açúcar) . Em algumas modalidades, o uso de um promotor regulável por ramnose (por exemplo, rhaSR PrhaBAo) pode ser preferível a um promotor regulável por arabinose porque é necessária uma concentração relativamente maior para ativar um promotor regulável por arabinose em comparação com um promotor regulável por ramnose (ver, por exemplo, Giacalone et al., (2006)BioTechniques 40(3):355-366 (39), cujos conteúdos inteiros são aqui incorporados por referência). Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende a mutação AwaaL/ApagL: : TT rhaSR PrhaBAD waaL.

2. Genes de lipídeo A desacilase [0096] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende uma eliminação em um gene de lipídeo A desacilase endógeno. Em algumas modalidades, a eliminação é uma eliminação parcial do gene de lipídeo A desacilase endógeno. Em algumas modalidades, a eliminação é uma eliminação de comprimento total do gene de lipídeo A desacilase endógeno. Em algumas modalidades, o gene de lipídeo A desacilase endógeno é geneticamente alterado para inserir um terminador da transcrição na fase de leitura aberta do gene. Em algumas modalidades, uma região reguladora do gene de lipídeo A desacilase endógeno é geneticamente modificada para alterar (por exemplo, diminuir) a expressão do gene. Em algumas modalidades, o promotor de um gene de lipídeo A desacilase endógeno é

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45/168 alterado para incluir um ou mais elemento (s) regulador (es) (por exemplo, um promotor responsive a açúcar) . Em algumas modalidades, o gene de liprdeo A desacilase é pagL. Verificou-se que a bactéria que compreende uma eliminação do gene de liprdeo A desacilase pagL produziu quantidades aumentadas de vesículas da membrana externa (ver, por exemplo, Elhenawy et al. (2016) mBio 7 (4) : e00940-16 (40)) . A eliminação do gene pagL de Salmonella não prejudica a virulência bacteriana (ver, por exemplo, Man et al. Proc. Nat'l. Acad. Sei. EUA 111: 7403-8(41)). Sem querer estar vinculado por qualquer teoria particular, em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita na presente invenção compreende uma ou mais modificações genéticas que resultam em aumento da vesiculação (isto é, produção de vesículas aumentada) que pode ser particularmente vantajosa na indução de uma resposta imunológica no hospedeiro contra um antígeno de interesse que é expressado pela bactéria.

3. Genes de Fosfomanose isomerase [0097] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende uma eliminação em um gene de fosfomanose isomerase endógeno. Fosfomanose isomerase, também conhecida como manose-6 fosfato isomerase, catalisa a interconversão reversível de frutose 6-fosfato em manose 6-fosfato. A manose 6-fosfato é então convertida em GDP-manose e usada para a síntese de cadeias laterais de antígeno O. As bactérias com eliminações do gene de isomerase da fosfomanose pmi não são sensíveis à manose e são parcialmente atenuadas (ver, por exemplo, Collins et al. (1991) Infect. Immun. 59(3): 1079-85(42)). Estes mutantes

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46/168 pmi sintetizam níveis tipo selvagem de cadeias laterais de antígeno 0 de LPS quando crescidos em meios contendo manose, e são ambos atenuados, mas altamente imunogênicos (ver, por exemplo, Curtiss et al., 2007) . Induction of host immune responses using Salmonella-vectored vaccines. Em: Brogden KA, Minion FC, Cornick N, Stanton TB, Zhang Q, Nolan LK, Wannemuehler MJ, ed. Virulence Mechanisms of Bacterial Pathogens. 4^a ed. Washington DC: ASM Press (43)) . Em algumas modalidades, a eliminação do gene de fosfoisomerase endógeno é uma eliminação parcial. Em algumas modalidades, a eliminação do gene de fosfomanose isomerase endógeno é uma eliminação de comprimento total. Em algumas modalidades, o gene de fosfomanose isomerase endógeno é geneticamente alterado para inserir um terminador de transcrição na fase de leitura aberta do gene. Em algumas modalidades, uma região reguladora do gene de fosfomanose isomerase endógeno é geneticamente modificada para alterar (por exemplo, diminuir) a expressão do gene de fosfomanose isomerase. Em algumas modalidades, o promotor de um gene de fosfomanose isomerase endógeno é alterado para incluir um ou mais elemento(s) regulador(es) (por exemplo, um promotor responsive a açúcar). Em algumas modalidades, o gene de fosfomanose isomerase é pmi.

[0098] Em algumas modalidades, a bactéria compreende uma eliminação de um gene pmi. Em algumas modalidades, a bactéria compreende uma mutação Lpmi-242 6. Uma bactéria compreendendo uma mutação Lpmi-2426, crescida na presença de manose, é capaz de sintetizar um antígeno O de LPS completo. A manose não fosforilada, que é a forma requerida para a absorção bacteriana, não está disponível in vivo.

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Assim, uma bactéria compreendendo uma mutação Bpmi-242 6 perde a capacidade de sintetizar cadeias laterais específicas de sorotipo de antígeno 0 de LPS in vivo e o número de cadeias laterais de antígeno 0 ligadas ao núcleo de LPS diminui em cerca de metade após cada divisão celular in vivo. 0 LPS que é sintetizado compreende uma estrutura nuclear que é substancialmente similar em todos os sorotipos de Salmonella enterica, exceto S. Arizona. Isso resulta em uma bactéria que é capaz de provocar uma resposta imunológica contra pelo menos dois sorotipos de Salmonella sem induzir substancialmente uma resposta imunológica específica para o sorotipo do vetor bacteriano. Em algumas modalidades, a bactéria é capaz de provocar uma resposta imunológica contra todos os sorotipos de Salmonella sem induzir substancialmente uma resposta imunológica específica para o sorotipo do vetor bacteriano.

[0099] Uma bactéria recombinante descrita na presente invenção que compreende uma eliminação em uma mutação pmi pode também compreender outras mutações que asseguram que a manose disponível para a bactéria durante o crescimento in vitro é usada para a síntese de antígeno O de LPS. Por exemplo, uma bactéria pode compreender uma mutação A(gmdfcl)-26. Esta mutação elimina duas sequências de ácidos nucleicos que codificam enzimas para conversão de GDPmanose em GDP-fucose, garantindo que a manose disponível para a bactéria durante o crescimento in vitro é usada para a síntese de antígeno O de LPS e não para produção de ácido colânico. De modo semelhante, uma bactéria pode compreender a mutação Δ(wcaM-wza)-8, que elimina todas as 20 sequências de ácidos nucleicos necessárias para a produção de ácido

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48/168 colânico, e também impede a conversão de GDP-manose em GDPfucose.

4. Genes da epimerase UDP-galactose [00100] O UDP-Gal é o precursor para a montagem das cadeias laterais de antígeno O de LPS, o núcleo externo de LPS, para ácido colânico e outros polímeros polissacarídicos tendo galactose como um constituinte (44). A UDP-Gal é sintetizada pela conversão da glicose-l-P em UDP-Glu pela enzima glicose-l-P-uridililtransferase codificada pelo gene da galU com UDP-Glu convertido em UDPGal pela enzima UDP-galactose epimerase codificada pelo gene galE (45, 46). Cepas crescidas na presença de galactose podem sintetizar UDP-Gal por uma via diferente na qual a galactose após a captação é convertida em galactose1-P pela galactose quinase codificada pelo gene galK que por sua vez é convertido em UDP-Gal pela enzima UDP-Gal transferase codificada pelo gene galT (45) . As cepas com uma mutação galE são incapazes de sintetizar o núcleo externo de LPS e o antígeno O de LPS a menos que a galactose seja abastecida no meio de crescimento (47) . Devido a estes fatos e propriedades, as cepas de Salmonella com mutações galE podem sintetizar LPS quando crescidas com galactose e são invasivas para colonizar tecidos linfoides,

mas perdem esta	capacidade	in	vi vo	devido	à
indisponibilidade	de galactose	livre	de	modo	que
gradualmente soltem	componentes de	LPS	à medida que	se

multiplicam o hospedeiro animal infectado ou imunizado.

Assim como os mutantes pmi, eles gradualmente se tornam atenuados devido à crescente suscetibilidade à citotoxicidade mediada por complemento e à fagocitose

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49/168 intensificada e à morte de meus macrófagos. No entanto, o abastecimento de galactose a tais mutantes galE pode levar à morte celular por lise, uma vez que o acúmulo de Gal-l-P e UDP-Gal é tóxico (30, 48, 49). Por causa disso, o crescimento de mutantes galE na presença de galactose seleciona mutações em genes para captação de galactose ou nos genes galK e galT, de modo que produtos tóxicos não sejam sintetizados. Infelizmente, esses mutantes resistentes à galactose não são mais capazes de preparar LPS e são totalmente atenuados, não invasivos e não imunogênicos (30, 50) . Para contornar esses problemas para permitir o uso de mutações galE em cepas de vacinas contra Salmonella, criamos um meio de gerar mutantes galE com o potencial de síntese reversível de LPS dependente da presença ou ausência de galactose que são resistentes a galactose sem seleção de mutantes incapaz de sintetizar UDP-Gal para síntese de LPS.

5. Genes reguladores de aquisição de ferro [00101] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende uma eliminação no promotor endógeno Pf_Ur, que regula a expressão do gene fur. Ά pele reprime a transcrição de genes envolvidos na aquisição de ferro na presença de ferro livre. Quando as concentrações de ferro se tornam baixas na bactéria, Fur deixa de ser sintetizado o que leva à expressão constitutiva dos genes que codificam as proteínas de aquisição de ferro (por exemplo, proteínas de membrana externa reguladas por ferro (IROMPs). Em algumas modalidades, a eliminação é uma eliminação parcial do promotor de Pf_Ur endógeno. Em algumas modalidades, a eliminação é uma eliminação de comprimento total do

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50/168 promotor de Pf_Ur endógeno. Em algumas modalidades, o promotor Pf_Ur endógeno é geneticamente modificado para alterar (por exemplo, diminuir) a expressão do gene fur. Em algumas modalidades, o promotor Pf_Ur endógeno é geneticamente alterado para compreender um terminador de transcrição.

[00102] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene fur (por exemplo, um gene fur da mesma espécie bacteriana como a bactéria recombinante).

[00103]	Em	algumas	modalidades, o	ácido	nucleico	que
compreende	um	gene fur é localizado	em um	plasmídeo	na
bactéria.	Em	algumas	modalidades, o	ácido	nucleico	que
compreende	um	gene fui	r é localizado	em um	cromossomo	da
bactéria.	Em	algumas	modalidades, o	ácido	nucleico	que
compreende	um	gene fur	é localizado no local	cromossômico

correspondente ao local de um gene fur endógeno que foi eliminado ou alterado no cromossomo bacteriano. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante é modificada para compreender um ácido nucleico que compreende um gene fur, pelo qual uma cópia endógena do gene fur no cromossomo bacteriano foi alterada e/ou eliminada.

[00104] A sequência de ácidos nucleicos de um exemplo do gene fur de Salmonella é provida abaixo: atgactgacaacaataccgcattaaagaaggctggcctgaaagtaacgcttcctcgttt aaaaattctggaagttcttcaggaaccagataaccatcacgtcagtgcggaagatttat acaaacgcctgatcgacatgggtgaagaaatcggtctggcaaccgtataccgtgtgctg aaccagtttgacgatgccggtatcgtgacccgccataattttgaaggcggtaaatccgt ttttgaactgacgcaacagcatcatcacgaccatcttatctgccttgattgcggaaaag tgattgaatttagtgatgactctattgaagcgcgccagcgtgaaattgcggcgaaacac

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51/168 ggtattcgtttaactaatcacagcctctatctttacggccactgcgctgaaggcgactg ccgcgaagacgagcacgcgcacgatgacgcgactaaataa (SEQ ID NO: 3).

[00105] A sequência de aminoácidos da proteína Fur codificada pelo ácido nucleico da SEQ ID NO: 3 é provida abaixo :

MTDNNTALKKAGLKVTLPRLKILEVLQEPDNHHVSAEDLYKRLIDMGEEIGLATVYRVL NQFDDAGIVTRHNFEGGKSVFELTQQHHHDHLICLDCGKVIEFSDDSIEARQREIAAKH GIRLTNHSLYLYGHCAEGDCREDEHAHDDATK (SEQ ID NO: 4).

[00106] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene fur de Salmonella (provido como SEQ ID NO: 3). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene fur, em que o gene fur compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o nucleico ácido compreende um gene fur, em que o gene fur compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% homóloga à sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que

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52/168 codifica uma proteína Fur, em que a referida proteína Fur compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína Fur, em que a referida proteína Fur compreende uma sequência de aminoácidos que pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% homologa à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 .

[00108] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene fur de uma espécie bacteriana, subespécie, sorovar, ou cepa que é o mesmo que as espécies bacterianas da bactéria recombinante.

[00109] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene fur que é operacionalmente ligado a um promotor regulável (por exemplo, um promotor regulável por açúcar). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene fur que é operacionalmente ligado a um promotor regulável por açúcar. Em algumas modalidades, o

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53/168 promotor regulável por açúcar exibe atividade aumentada (por exemplo, transcrição aumentada) na presença de um açúcar específico e atividade diminuída na ausência de um açúcar. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene fur que é operacionalmente ligado a um promotor regulável por ramnose (por exemplo, um promotor regulável por açúcar). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene fur que é operativamente ligado a um promotor regulável por arabinose (por exemplo, um promotor regulável por açúcar). Em algumas modalidades, o promotor regulável por arabinose é araC ParaBAD. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende a mutação AP_fur::TT araC ParaBAD fur.

6. Genes de captação de colicina [00110] Salmonella libera espontaneamente 50 a 90 nm de partículas semelhantes a bolha da membrana da parede celular externa denominadas Módulos Generalizados para Antígenos de Membrana (GMMA) ou vesículas da membrana externa, que constituem uma fonte enriquecida de antígenos associados à membrana externa que retêm a sua confirmação nativa e sua orientação adequada. A Salmonella pode ser geneticamente modificada para produzir mais GMMAs, ou vesículas da membrana externa (por exemplo, por eliminação de um gene tolR) que pode ser prontamente purificada (por exemplo, por centrifugação e filtração na ausência de detergente). Os GMMAs, ou vesículas da membrana externa, contêm múltiplos padrões moleculares associados a patógenos (PAMPS), incluindo ligantes do receptor semelhate a Toll (TLR), que podem atuar como autoadjuvantes ao provocar respostas imunológicas. Bactérias recombinantes que não

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54/168 expressam tolR produzem mais GMMA, ou vesiculas da membrana externa, que podem ser particularmente vantajosas no aumento da apresentação de proteínas conservadas para ajudar a induzir, por exemplo, anticorpos que reagem de forma cruzada com OMPs de outros serovares de Salmonella. Além disso, sem querer estar limitado por qualquer teoria particular, o aumento da produção e a liberação de GMMA, ou vesículas da membrana externa, conduzirá também à apresentação melhorada de um antígeno de interesse que é expressado pela bactéria recombinante como descrita na presente invenção. Em algumas modalidades, o antígeno de interesse é um antígeno secretado.

[00111] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende uma eliminação em um gene endógeno que codifica uma proteína de captação de colicina. Dois tipos de colicinas foram descritos. As colicinas do Grupo A são colicinas dependentes de Tol e as colicinas do Grupo B são colicinas dependentes de TonB (ver, por exemplo, Cascales et al. (2007) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 71(1): 158-229 (51), cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência). Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende uma eliminação no promotor endógeno PtolR, que regula a expressão do gene tolR. Esta eliminação fará com que o gene tolR endógeno não seja expressado pela bactéria recombinante compreendendo a eliminação. Em algumas modalidades, o promotor PtolR endógeno é geneticamente modificado para alterar (por exemplo, diminuir) a expressão do gene tolR. Em algumas modalidades, o promotor PtolR endógeno é geneticamente alterado para compreender um terminador de transcrição.

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55/168 [00112] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita na presente invenção é modificada para compreender um ácido nucleico que compreende um gene tolR. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene tolR é localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene tolR é localizado em um cromossomo da bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene tolR é localizado no local cromossômico correspondente ao local de um tolR endógeno que foi eliminado ou alterado no cromossomo bacteriano. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante é modificada para compreender um ácido nucleico que compreende um gene tolR, pelo qual uma cópia endógena do gene tolR no cromossomo bacteriano foi alterada e/ou eliminada.

[00113] A sequência de ácidos nucleicos de um exemplo do gene tolR de Salmonella é provida abaixo: atgactgacaacaataccgcattaaagaaggctggcctgaaagtaacgcttcctcgttt aaaaattctggaagttcttcaggaaccagataaccatcacgtcagtgcggaagatttat acaaacgcctgatcgacatgggtgaagaaatcggtctggcaaccgtataccgtgtgctg aaccagtttgacgatgccggtatcgtgacccgccataattttgaaggcggtaaatccgt ttttgaactgacgcaacagcatcatcacgaccatcttatctgccttgattgcggaaaag tgattgaatttagtgatgactctattgaagcgcgccagcgtgaaattgcggcgaaacac ggtattcgtttaactaatcacagcctctatctttacggccactgcgctgaaggcgactg ccgcgaagacgagcacgcgcacgatgacgcgactaaataa (SEQ ID NO: 5).

[00114] A sequência de aminoácidos da proteína TolR codificada pelo ácido nucleico da SEQ ID NO: 5 é provida abaixo: MTDNNTALKKAGLKVTLPRLKILEVLQEPDNHHVSAEDLYKRLIDMGEEIGLATVYRVL NQFDDAGIVTRHNFEGGKSVFELTQQHHHDHLICLDCGKVIEFSDDSIEARQREIAAKH

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GIRLTNHSLYLYGHCAEGDCREDEHAHDDATK (SEQ ID NO: 6) .

[00115] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene tolR de Salmonella (provido como SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene tolR, em que o gene tolR compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene tolR, em que o gene tolR compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% homóloga à sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 5.

[00116] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína TolR, em que a referida proteína TolR compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo

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57/168 menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína TolR, em que a referida proteína TolR compreende uma sequência de

aminoácidos que	pelo	menos	75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos
81%,	pelo	menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo
menos	85%,	pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,
pelo	menos	89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos
92%,	menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos
96%,	pelo	menos	97%,	pelo	menos 98%	, pel<	d menos 99	%, ou

100% homóloga à sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:

6.

[00117] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene tolR de uma espécie bacteriana, subespécie, sorovar, ou cepa que é diferente do que a espécie bacteriana da bactéria recombinante. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene tolR de uma espécie bacteriana, subespécie, sorovar ou cepa que é o mesmo que a espécie bacteriana da bactéria recombinante.

[00118] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene tolR que é operacionalmente ligado a um promotor regulável (por exemplo, um promotor regulável por açúcar). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene tolR que é operativamente ligado a um promotor regulável por açúcar. Em algumas modalidades, o promotor regulável por açúcar exibe atividade aumentada (por exemplo, transcrição aumentada) na presença de um açúcar específico e atividade diminuída na ausência de um

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58/168 açúcar. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene tolR que é operacionalmente ligado a um promotor regulável por ramnose (por exemplo, um promotor regulável por açúcar). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene tolR que é operativamente ligado a um promotor regulável por arabinose. Em algumas modalidades, o promotor regulável por arabinose é Pbad. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende a mutação ÚPtolR · í TT araC* ParaBAD tolR.

7. Genes de escape endossomal [00119] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante foi geneticamente alterada de modo que a bactéria seja capaz de escapar do compartimento endossomal de uma célula hospedeira. Uma bactéria recombinante pode exibir um atraso temporal no escape de um endossoma após a invasão da célula hospedeira. Os métodos para detectar o escape de um compartimento endossomal de uma célula hospedeira são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, análise microscópica.

[00120] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende uma eliminação em um gene sifA endógeno. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende uma mutação que altera a função de SifA. SifA é uma proteína efetora necessária para a formação de filamentos induzidos por Salmonella e para a manutenção da membrana vacuolar que encerra a bactéria. Bactérias compreendendo uma eliminação de sifA são capazes de escapar do endossoma da célula hospedeira (também chamado de vesícula contendo Salmonella, ou SCV) após invasão celular. Em algumas modalidades, a eliminação do gene sifA endógeno é uma eliminação parcial.

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Em algumas modalidades, a eliminação do gene sifA endógeno é uma eliminação de comprimento total. Em algumas modalidades, o gene sifA endógeno é geneticamente alterado para inserir um terminador transcricional na fase de leitura aberta do gene. Em algumas modalidades, uma região reguladora do gene sifA endógeno é geneticamente modificada para alterar (por exemplo, diminuir) a expressão do gene sifA. Em algumas modalidades, o promotor de um gene sifA endógeno é alterado para incluir um ou mais elemento(s) regulador(es) (por exemplo, um promotor responsive a açúcar).

[00121] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita na presente invenção é modificada para compreender um ácido nucleico que compreende um gene sifA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene sifA é localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene sifA é localizado em um cromossomo da bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene sifA é localizado no local cromossômico correspondente ao local de um sifA endógeno que foi eliminado ou alterado no cromossomo bacteriano. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante é modificada para compreender um ácido nucleico que compreende um gene sifA, pelo qual uma cópia endógena do gene sifA no cromossomo bacteriano foi alterada e/ou eliminada.

[00122] A sequência de ácidos nucleicos de um exemplo do gene sifA de Salmonella é provida abaixo: atgccgattactatagggaatggttttttaaaaagtgaaatccttaccaactccccaag gaatacgaaagaagcatggtggaaagttttatgggaaaaaattaaagacttcttttttt

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60/168 ctactggcaaagcaaaagcggaccgttgtctacatgagatgttgtttgccgaacgcgcc cccacacgagagcggcttacagagattttttttgagttgaaagagttagcctgcgcatc gcaaagagatagatttcaggttcataatcctcatgaaaatgatgccaccattattcttc gcatcatggatcaaaacgaagagaacgaattgttacgtatcactcaaaataccgatacc tttagctgtgaagtcatggggaatctttattttttaatgaaagatcgcccggatatttt aaaatcgcatccacaaatgacggccatgattaagagaagatatagcgaaatcgtagact accccctcccttcgacattatgtctcaatcctgctggcgcgccgatattatcggttcca ttagacaacatagaggggtatttatatactgaattgagaaaaggacatttagatgggtg gaaagcgcaagaaaaggcaacctacctggcagcgaaaattcagtctgggattgaaaaga caacgcgcattttacaccatgcgaatatatccgaaagtactcagcaaaacgcattttta gaaacaatggcgatgtgtggattaaaacagcttgaaataccaccaccgcatacccacat acctattgaaaaaatggtaaaagaggttttactagcggataagacgtttcaggcgttcc tcgtaacggatcccagcaccagccaaagtatgttagctgagatagtcgaagccatctct gatcaggtttttcacgccatttttagaatagacccccaggctatacaaaaaatggcgga agaacagttaaccacgctacacgttcgctcagaacaacaaagcggctgtttatgttgtt ttttataa (SEQ ID NO: 7).

[00123] A sequência de aminoácidos da proteína SifA codificada pelo ácido nucleico da SEQ ID NO: 7 é provida abaixo :

MPITIGNGFLKSEILTNSPRNTKEAWWKVLWEKIKDFFF STGKAKADRCLHEMLFAERA PTRERLTEIFFELKELACASQRDRFQVHNPHENDATIILRIMDQNEENELLRITQNTDT FSCEVMGNLYFLMKDRPDILKSHPQMTAMIKRRYSEIVDYPLPSTLCLNPAGAPILSVP LDNIEGYLYTELRKGHLDGWKAQEKATYLAAKIQSGIEKTTRILHHANISESTQQNAFL ETMAMCGLKQLEIPPPHTHIPIEKMVKEVLLADKTFQAFLVTDPSTSQSMLAEIVEAIS DQVFHAIFRIDPQAIQKMAEEQLTTLHVRSEQQSGCLCCFL (SEQ ID NO: 8).

[00124] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene sifA de Salmonella (provido como SEQ ID NO: 7). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene sifA, em que o gene sifA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%,

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61/168 pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene sifA, em que o gene sifA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% homóloga à sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 7.

[00125] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína SifA, em que a referida proteína SifA compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína SifA, em que a referida proteína SifA compreende uma sequência de

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aminoácidos que	pelo	menos	75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos
81%, pelo menos	82%,	pelo	menos	83%,	pelo	menos	84%,	pelo
menos 85%, pelo	menos	86%,	pelo	menos	87%,	pelo	menos	88%,
pelo menos 89%,	pelo	menos	90%,	pelo	menos	91%,	pelo	menos
92%, pelo menos	93%,	pelo	menos	94%,	pelo	menos	95%,	pelo
menos 96%, pelo	menos	97%,	pelo	menos	98%,	pelo	menos	99%,

ou 100% homóloga à sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 8 .

[00126] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene sifA de uma espécie bacteriana, subespécie, sorovar, ou cepa que é diferente do que as espécies bacterianas da bactéria recombinante. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene sifA de uma espécie bacteriana, subespécie, sorovar ou cepa que é o mesmo que a espécie bacteriana da bactéria recombinante.

[00127] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene sifA que é operacionalmente ligado a um promotor regulável (por exemplo, um promotor regulável por açúcar). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene sifA que é operativamente ligado a um promotor regulável por açúcar. Em algumas modalidades, o promotor regulável por açúcar exibe atividade aumentada (por exemplo, transcrição aumentada) na presença de um açúcar especifico e atividade diminuída na ausência de um açúcar. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene sifA que é operativamente ligado a um promotor regulável por ramnose (por exemplo, um promotor regulável por açúcar). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene sifA que é operativamente ligado a um promotor regulável por arabinose. Em algumas modalidades, o

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63/168 promotor regulável por arabinose é Pbad. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende a mutação fsifA: : TT araC Pbad sifA. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende a mutação APsíía::TT araC ParaBAD sifA. Quando a expressão do ácido nucleico que compreende um gene sifA está sob o controle de um promotor regulado por arabinose, o escape bacteriano do endossoma hospedeiro pode ser atrasado. Uma vez que a arabinose está ausente nas células hospedeiras, a arabinose não pode induzir a expressão do gene sifA. Assim, se a bactéria recombinante for cultivada na presença de arabinose antes da administração ao indivíduo, a expressão de sifA diminuirá gradualmente com cada ciclo de divisão celular bacteriana permitindo deste modo escapar da bactéria do endossoma da célula hospedeira durante os ciclos de divisão celular iniciais. Mutações similares de escape atrasado podem ser construídas usando outros promotores reguláveis, tais como, a partir dos sistemas promotores reguláveis por xilose ou reguláveis por ramnose.

8. Genes de GTP pirofosfoquinase [00128] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende uma eliminação em um gene relA endógeno, que codifica a GTP pirofosfoquinase RelA. A inclusão de uma eliminação de relA na bactéria recombinante desacopla a ocorrência de lise dependente do crescimento para a necessidade de síntese de proteína continuada. Em algumas modalidades, a eliminação do gene relA endógeno é uma eliminação parcial. Em algumas modalidades, a eliminação do gene relA endógeno é uma eliminação de comprimento total.

9. Outros métodos de atenuação

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64/168 [00129] Outros métodos de atenuação são conhecidos na técnica. Por exemplo, a atenuação pode ser conseguida alterando (por exemplo, eliminando) sequências de ácidos nucleicos nativas encontradas na bactéria tipo selvagem. Por exemplo, se a bactéria é Salmonella, exemplos não limitativos de sequências de ácidos nucleicos que podem ser usadas para atenuação incluem: uma sequência de ácidos nucleicos pab, uma sequência de ácidos nucleicos pur, uma sequência de ácidos nucleicos aro, asd, uma sequência de

ácidos	nucleicos	dap,	nadA,	pn cB,	galE,	pmi,	fur,	rpsL,
ompR,	htrA, hemA,	cdt,	cya,	crp,	dam,	phoP,	phoQ,	rfc,
poxA,	galU, mviA,	sodC,	recA,	ssrA,	sirA, inv,	hilA,	rpoE,

flgM, tonB, slyA e qualquer combinação dos mesmos. Mutações atenuantes de exemplo podem ser aroA, aroC, aroD, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, ompR, galE e htrA.

[00130] Em certas modalidades, as sequências de ácidos nucleicos acima referidas podem ser colocadas sob o controle de um promotor regulado por açúcar, em que o açúcar está presente durante o crescimento in vitro da bactéria recombinante, mas substancialmente ausente em um hospedeiro animal ou humano. A cessação na transcrição das sequências de ácidos nucleicos listadas acima resultaria então em atenuação e na incapacidade da bactéria recombinante para induzir sintomas da doença.

B. Mutações Adicionais [00131] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende uma eliminação em um gene recF endógeno, que codifica a replicação de DNA e reparar a proteína RecF. Em algumas modalidades, a eliminação do gene recF endógeno é uma eliminação parcial. Em algumas modalidades, a

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65/168 eliminação do gene recF endógeno é uma eliminação de comprimento total. Em algumas modalidades, o gene recF endógeno é geneticamente alterado para inserir um terminador de transcrição na fase de leitura aberta do gene.

[00132] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende uma eliminação em um gene recJ endógeno, que codifica a exonuclease RecJ. Em algumas modalidades, a eliminação do gene recJ endógeno é uma eliminação parcial. Em algumas modalidades, a eliminação do gene recJ endógeno é uma eliminação de comprimento total. Em algumas modalidades, o gene recJ endógeno é geneticamente alterado para inserir um terminador de transcrição na fase de leitura aberta do gene.

[00133] A bactéria também pode ser modificada para criar um sistema equilibrado de vetor-hospedeiro letal, embora outros tipos de sistemas também possam ser usados (por exemplo, criando heterozigotos de complementação) . Para o sistema equilibrado de vetor-hospedeiro letal, a bactéria pode ser modificada pela manipulação de sua capacidade de sintetizar vários constituintes essenciais necessários para a síntese da camada rígida de peptidoglicano de sua parede celular. Em um exemplo, o constituinte é ácido diaminopimélico (DAP). Várias enzimas são envolvidas na eventual síntese de DAP.

[00134] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende uma eliminação em um gene asd endógeno. Em algumas modalidades, a eliminação do gene asd endógeno é uma eliminação parcial. Em algumas modalidades, a eliminação do gene asd endógeno é uma eliminação de

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66/168 comprimento total. Em algumas modalidades, o gene asd endógeno é geneticamente alterado para inserir um terminador de transcrição na fase de leitura aberta do gene. Em algumas modalidades, o promotor de um gene asd endógeno é alterado para incluir um ou mais elemento(s) regulador(es) (por exemplo, um promotor responsive a açúcar). Em um exemplo, a bactéria é modificada usando uma mutação BasdA para eliminar a capacidade da bactéria de produzir β-aspartato semialdeído desidrogenase, uma enzima essencial para a síntese de DAP. Outras mutações que resultam na supressão da síntese de DAP incluem, mas não estão limitadas a,dapA, dapB, dapC, dapD, dapE, dapF, e asd (ver, por exemplo, Patente US N° 6.872.547, aqui incorporada por referência). Outras modificações que podem ser empregadas incluem modificações na capacidade de uma bactéria sintetizar D-alanina ou sintetizar ácido Dglutâmico (por exemplo, mutações Amurl) , que são ambos constituintes únicos da camada de peptidoglicano da parede celular bacteriana.

[00135] De modo semelhante, várias modalidades podem compreender o cassete do gene araC ParaBAD c2 inserida na sequência de ácidos nucleicos de asd que codifica aspartato semialdeído desidrogenase. Uma vez que a sequência de ácidos nucleicos araC é transcrita em uma direção que poderia conduzir à interferência na expressão de sequências de ácidos nucleicos adjacentes e afetar adversamente o desempenho da cepa da vacina, uma sequência de terminação da transcrição (TT) é geralmente inserida em 3' na sequência de ácidos nucleicos araC. A sequência cromossômica de ácidos nucleicos asd é tipicamente

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67/168 inativada para permitir o uso de vetores plasmidicos que codificam a sequência de ácidos nucleicos asd tipo selvagem no sistema equilibrado letal de hospedeiro-vetor. Isto permite a manutenção estável de plasmídeos in vivo na ausência de quaisquer atributos de resistência a fármacos que não sejam permissíveis em vacinas bacterianas vivas. Em algumas destas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos asd tipo selvagem pode ser codificada pelo vetor descrito na presente invenção. 0 vetor permite a expressão regulada de uma sequência de codificação de antígeno através do promotor reprimível.

C. Sistemas Reguladores Repressores [00136] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico (por exemplo, um gene) que é operativamente ligado a um promotor regulável por repressor para facilitar a expressão regulável do gene. Assim, em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que compreende um gene que codifica um repressor. Em algumas modalidades, o gene que codifica o repressor é operativamente ligado a um promotor regulável. Os métodos de integração cromossômica de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um repressor operacionalmente ligado a um promotor regulável são conhecidos na técnica e detalhados nos exemplos. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica um repressor não está integrada em um local cromossômico de modo que a capacidade da bactéria para colonizar uma célula hospedeira seja interrompida. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que codifica um repressor que está integrado no local relA do cromossomo

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68/168 bacteriano. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que codifica um repressor que está integrado no local endA do cromossomo bacteriano. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um repressor. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis ou mais ácidos nucleicos que codificam um repressor. Em

algumas	modalidades,	o	ácido	nucleico	que	codifica	o
repressor	' está presente	em um	plasmideo	na	bactéria.	Em
algumas	modalidades,	o	ácido	nucleico	que	codifica	o

repressor é localizado no cromossomo bacteriano. Se houver mais do que uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um repressor, cada sequência de ácidos nucleicos que codifica um repressor pode ser operativamente ligada a um promotor regulável, de modo que cada promotor seja regulado pelo mesmo composto ou condição. Alternativamente, cada sequência de ácidos nucleicos que codifica um repressor pode ser operativamente ligada a um promotor regulável, cada um dos quais é regulado por um composto ou uma condição diferente.

[00137] Como usado aqui, um repressor refere-se a uma biomolécula que reprime a atividade transcricional de um promotor. Em algumas modalidades, o repressor é sintetizado pela bactéria recombinante em quantidades suficientemente altas durante a cultura in vitro, de modo que a transcrição de um ácido nucleico que é operativamente ligado a um promotor regulável pelo repressor seja reprimida. Isto pode ser particularmente vantajoso se, por exemplo, a expressão

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69/168 do produto codificado pelo referido ácido nucleico impedir o crescimento in vitro da bactéria e/ou a capacidade da bactéria para infectar e/ou colonizar um indivíduo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que é operativamente ligado ao promotor regulável pelo repressor expressa um antígeno de interesse. Em algumas modalidades, a concentração do repressor dentro da célula diminui gradualmente com cada ciclo de divisão celular após a transcrição do gene que codifica o repressor diminui ou cessa (por exemplo, in vivo) . 0 uso de um repressor particular, como descrito na presente invenção, pode depender, em parte, da espécie, subespécie, cepa ou serovar da bactéria recombinante sendo usada. Em algumas modalidades, o repressor é derivado da mesma espécie (por exemplo, a mesma espécie bacteriana ou o mesmo fago) a partir do qual o promotor regulável pelo repressor é derivado. Em algumas modalidades, o repressor não é derivado das mesmas espécies bacterianas que as espécies bacterianas nas quais o repressor é expressado. Por exemplo, em algumas modalidades, o repressor é derivado de E. coli se a bactéria recombinante for do gênero Salmonella. Outros repressores adequados incluem repressores derivados de um bacteriófago.

[00138] Uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um promotor repressor e regulável detalhado acima pode ser modificada de modo a otimizar o nível de expressão da sequência de ácidos nucleicos que codifica o repressor. O nível ideal de expressão da sequência de ácidos nucleicos que codifica o repressor pode ser estimado, ou pode ser determinado por experimentação. Tal determinação deve levar

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70/168 em consideração se o repressor atua como um monômero, dímero, trímero, tetrâmero ou múltiplo superior, e também deve levar em consideração o número de cópias do vetor que codifica o antígeno de interesse. Em uma modalidade de exemplo, o nível de expressão é otimizado de modo que o repressor seja sintetizado enquanto em um ambiente permissivo (isto é, crescimento in vitro) a um nível que inibe substancialmente a expressão do ácido nucleico que codifica um antígeno de interesse, e substancialmente não é sintetizada em um ambiente não permissivo, permitindo assim a expressão do ácido nucleico que codifica um antígeno de interesse.

[00139] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante descrita na presente invenção é modificada para compreender um ácido nucleico que compreende um gene lacl, que codifica a proteína repressora lacl. A expressão do repressor codificado por lacl na bactéria recombinante descrita na presente invenção pode ser usada para regular a expressão de um gene que codifica um antígeno de interesse expressado pela bactéria. Por exemplo, em algumas modalidades, a expressão do gene lacl é regulada por um promotor regulável por açúcar (por exemplo, um promotor regulável por arabinose). Quando cultivada na presença de arabinose, a bactéria recombinante irá sintetizar a proteína repressora Lacl, que por sua vez reprimirá a expressão de um gene que codifica um antígeno de interesse que é operativamente ligado a um promotor responsive a Lacl (por exemplo, Ptrc, Piac, PT?iac e Ptac) · Após administração ao indivíduo e na ausência de uma fonte de arabinose, a síntese do repressor Lacl cessa, levando à des-repressão do promotor responsive

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71/168 a LacI e à subsequência causando a expressão do antígeno de interesse. A concentração de LacI na célula diminui em cerca de metade em cada divisão celular in vivo, conduzindo a um nível gradualmente diminuído de repressão e síntese de aumento gradual do antígeno de interesse.

[00140] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene lacl é localizado em um plasmídeo na bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene lacl é localizado em um cromossomo da bactéria. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que compreende um gene lacl é localizado no local cromossômico correspondente ao local de um gene relA endógeno que foi eliminado ou alterado no cromossomo bacteriano. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante modificada para compreender um ácido nucleico que compreende um gene lacl, pelo qual uma cópia endógena do gene lacl no cromossomo bacteriano foi alterada e/ou eliminada.

[00141] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene lacl de Escherichia coli. A sequência de ácidos nucleicos do gene lacl de E. coli é provida abaixo: gtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgt ttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaag cggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaa cagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaat tgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatgg tagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgc gtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagc tgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaaca gtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattg ggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcg

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72/168 tctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacggg aaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggc atcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgc cattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgata ccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctg ctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaaggg caatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgc aaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcc cgactggaaagcgggcagtga (SEQ ID NO: 9).

[00142] A sequência de aminoácidos da proteína LacI de E. coll codificada pelo ácido nucleico de SEQ ID NO: 9 é provida abaixo: MKPVTLYDVAEYAGVSYQTVSRWNQASHVSAKTREKVEAAMAELNYIPNRVAQQLAGK QSLLIGVATSSLALHAPSQIVAAIKSRADQLGASVWSMVERSGVEACKAAVHNLLAQR VSGLIINYPLDDQDAIAVEAACTNVPALFLDVSDQTPINSIIFSHEDGTRLGVEHLVAL GHQQIALLAGPLSSVSARLRLAGWHKYLTRNQIQPIAEREGDWSAMSGFQQTMQMLNEG IVPTAMLVANDQMALGAMRAITESGLRVGADISWGYDDTEDSSCYIPPLTTIKQDFRL LGQTSVDRLLQLSQGQAVKGNQLLPVSLVKRKTTLAPNTQTASPRALADSLMQLARQVS RLESGQ (SEQ ID NO: 10).

[00143] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene lacl, em que o gene lacl compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos

87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93% , pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos

98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades o ácido nucleico compreende um gene lacl, em que o gene lacl

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compreende	uma	sequência	de ácidos	nucleicos c	jue é	pelo
menos 75%,	pelo	menos 80%,	pelo menos	81%, pelo	menos	82%,
pelo menos	83%,	pelo menos	84%, pelo	menos 85%,	pelo	menos
86%, pelo	menos	87%, pelo	menos 88%,	pelo menos	89%,	pelo
menos 90%,	pelo	menos 91%,	pelo menos	92%, pelo	menos	93%,
pelo menos	94%,	pelo menos	95%, pelo	menos 96%,	pelo	menos
97%, pelo	menos	98%, pelo	menos 99%	, ou 10 0%	homóloga à
sequência [00144	de ácidos nucleicos da SEQ ] ] Em algumas modalidades,	CD NO: 9. o ácido	nucleico

compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína LacI, em que a referida proteína LacI compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína LacI, em que a referida proteína LacI compreende uma sequência de

ou 100% homóloga à sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID

NO: 10.

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74/168 [00145] Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene lacl que é operacionalmente ligado a um promotor regulável (por exemplo, um promotor regulável por açúcar). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene lacl que é operativamente ligado a um promotor regulável por açúcar. Em algumas modalidades, o promotor regulável por açúcar exibe atividade aumentada (por exemplo, transcrição aumentada) na presença de um açúcar específico e atividade diminuída na ausência de um açúcar. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene lacl que é operativamente ligado a um promotor regulável por ramnose (por exemplo, um promotor regulável por açúcar). Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende um gene lacl que é operacionalmente ligado a um promotor regulável por arabinose. Em algumas modalidades, o promotor regulável por arabinose é ParaBAD. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende a mutação Arei A: : araC ParaBAD lacl TT.

D. Antígenos [00146] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que codifica um antígeno de interesse. Como usado aqui, antígeno refere-se a uma biomolécula capaz de provocar uma resposta imunológica em um hospedeiro. Em algumas modalidades, um antígeno pode ser uma proteína ou um fragmento de uma proteína. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico (por exemplo, um plasmídeo) que codifica um antígeno de interesse, em que o ácido nucleico é expressado pela célula hospedeira (por exemplo, uma vacina de DNA). Em uma modalidade de exemplo, o antígeno provoca uma resposta

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75/168 imunológica protetora em um indivíduo.

[00147] Como usado aqui, protetor significa que a resposta imunológica contribui para a diminuição de quaisquer sintomas associados à infecção de um hospedeiro com o patógeno do qual o antígeno foi derivado ou projetado para provocar uma resposta contra. Por exemplo, um antígeno protetor de um patógeno, tal como Salmonella, pode provocar uma resposta imunológica que ajuda a melhorar os sintomas associados à infecção por Salmonella ou reduzir a morbidade e a mortalidade associadas à infecção com o patógeno ou pode reduzir a capacidade de Salmonella infectar e colonizar o hospedeiro. O uso do termo protetor nesta revelação não requer necessariamente que o hospedeiro esteja completamente protegido dos efeitos do patógeno.

[00148] Em algumas modalidades, o antígeno de interesse é um antígeno derivado de um agente infeccioso. Em algumas modalidades, o antígeno de interesse é derivado de um agente infeccioso selecionado ir do grupo que consiste em um vírus, uma bactéria, um protozoário, um príon, um fungo e um helminto. Em algumas modalidades, o antígeno de interesse é derivado de uma bactéria. Em algumas modalidades, o antígeno de interesse é um antígeno de Salmonella. Em algumas modalidades, o antígeno de Salmonella é selecionado do grupo FliC, F1ÍC180, OmpC, OmpD, OmpF, SseB e Ssel. Em algumas modalidades, o antígeno de interesse é um antígeno viral. Em algumas modalidades, o antígeno de interesse é um antígeno de influenza. Em algumas modalidades, o antígeno de influenza é hemaglutinina ou neuraminidase, se dispensado por uma vacina de DNA. Em algumas modalidades, o antígeno de

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76/168 interesse é um antígeno associado ao câncer. Em algumas modalidades, o antígeno associado ao câncer é selecionado do grupo que consiste em MAGE-A, MAGE-CI, BAGE, GAGE, XAGE, NY-ESO1 (também conhecido como CTAG1B e LAGE2), LAGE1 (também conhecido como CTAG2) e survivina.

[00149] Alternativamente, os antígenos podem ser derivados de gametas, desde que sejam gameta específico, e podem ser projetados para bloquear a fertilização. Em outra alternativa, antígenos podem ser antígenos tumorais, e podem ser projetados para diminuir o crescimento do tumor. É especificamente contemplado que os antígenos de organismos recentemente identificados ou recentemente associados a uma doença ou condição patogênica, ou patógenos novos ou emergentes de animais ou humanos, incluindo os agora conhecidos ou identificados no futuro, possam ser expressados por uma bactéria detalhada na presente invenção. Além disso, os antígenos não estão limitados aos de organismos patogênicos.

[00150] A imunogenicidade da bactéria pode ser aumentada e/ou modulada pela construção de cepas que também expressam sequências para citocinas, adjuvantes e outros imunomoduladores.

[00151] Alguns exemplos de microrganismos úteis como uma fonte de antígeno estão listados abaixo. Estes podem incluir microrganismos para o controle da peste causada por Yersinia pestis e outras espécies de Yersinia, tais como Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica, para o controle da gonorreia causada por Neisseria gonorrhoea, para o controle da sífilis causada por Treponema pallidum, e para o controle de doenças venéreas, bem como infecções oculares

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77/168 causadas por Chlamydia trachomatis. Espécies de Streptococcus do grupo A e do grupo B, como aquelas que causam dor de garganta ou doenças cardíacas, Streptococcus equi, que causa estrangulamento em equinos, Streptococcus mutans, que causa cavidades, e Streptococcus pneumoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Neisseria meningitidis, Mycoplasma pneumoniae e outras espécies de Mycoplasma, Hemophilus influenza, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, e outras espécies de Bordetella, Escherichia coll, Brucella abortus, Pasteurella hemolytica e P. multocida, Vibrio cholera, espécies de Shigella, espécies de Borrellia, espécies de Bartonella, Heliobacter pylori, espécies de Campylobacter, espécies de Pseudomonas, espécies de Moraxella, espécies de Brucella, espécies de Francisella, espécies de Aeromonas, espécies de Actinobacillus, espécies de Clostridium (tal como C. perfringens), espécies de Rickettsia, espécies de Bacillus, espécies de Coxiella, espécies de Ehrlichia, espécies de Listeria, e Legionella pneumophila são exemplos adicionais de bactérias dentro o escopo desta revelação a partir do qual podem ser obtidas sequências de ácidos nucleicos de antígeno.

[00152] Antígenos virais podem também ser usados. Os antígenos virais podem ser usados em microrganismos de dispensação de antígenos direcionados contra vírus, de vírus de DNA ou RNA, por exemplo, das classes Papovavírus, Adenovirus, Herpesvirus, Poxvirus, Parvovirus, Reovírus, Picornavírus, Myxovírus, Paramyxovirus, Flavivírus ou Retrovirus. Os antígenos também podem ser derivados de fungos patogênicos, protozoários e parasitas. No entanto,

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78/168 os meios de dispensação de antígeno ou sequências que codificam o antígeno dependem do tipo de antígeno e/ou vírus.

[00153] Em certas modalidades, um antígeno pode compreender um epitopo de célula B ou um epitopo de célula T. Alternativamente, um antígeno ao qual é desejada uma resposta imunológica pode ser expressado como uma fusão a uma proteína carreadora que contém um epitopo de célula T promíscuo forte e/ou serve como um adjuvante e/ou facilita a apresentação do antígeno para intensificar, em todos os casos, a resposta imunológica ao antígeno ou à sua parte componente. Isto pode ser realizado por métodos conhecidos na técnica. A fusão ao fragmento de toxina do tétano C, CTB, LT-B e ao núcleo do vírus da hepatite B, particularmente útil, para estas finalidades, embora outros sistemas de apresentação de epitopos sejam bem conhecidos na técnica.

[00154] Em outras modalidades, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um antígeno pode compreender um sinal de secreção.

[00155] Como afirmado acima, o nível de síntese de um antígeno de interesse pode ser otimizado, modificando a sequência de ácidos nucleicos que codifica o repressor e/ou promotor. Como aqui usado, modificar refere-se a uma alteração da sequência de ácidos nucleicos do repressor e/ou promotor que resulta em uma alteração no nível de transcrição da sequência de ácidos nucleicos que codifica o repressor, ou que resulta em uma alteração no nível de síntese do repressor. Por exemplo, em uma modalidade, a modificação pode referir-se à alteração do códon de partida da sequência de ácidos nucleicos que codifica o repressor.

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De um modo geral, um códon de partida GTG ou TTG, em oposição a um códon de partida ATG, pode diminuir dez vezes a eficiência da tradução. Em uma outra modalidade, a modificação pode referir-se à alteração da sequência ShineDalgarno (SD) da sequência de ácidos nucleicos que codifica o repressor. A sequência SD é um local de ligação ribossômica localizado geralmente a 6-7 nucleotideos a montante do códon de partida. A sequência de consenso SD é AGGAGG, e variações da sequência de consenso podem alterar a eficiência da tradução. Ainda em uma outra modalidade, a modificação pode referir-se à alteração da distância entre a sequência SD e o códon de partida. Ainda em uma outra modalidade, a modificação pode referir-se a alterar a sequência 35 para o reconhecimento da RNA polimerase. Em uma modalidade semelhante, a modificação pode referir-se à alteração da sequência 10 para a ligação da RNA polimerase. Em uma modalidade adicional, a modificação pode referir-se à alteração do número de nucleotideos entre as sequências de 35 e 10. Em uma modalidade alternativa, a modificação pode referir-se à otimização dos códons da sequência de ácidos nucleicos que codifica o repressor para alterar o nivel de tradução do mRNA que codifica o repressor. Por exemplo, códons não ricos em A, inicialmente após o códon de partida da sequência de ácidos nucleicos que codifica o repressor, podem não maximizar a tradução do mRNA que codifica o repressor. De um modo semelhante, os códons da sequência de ácidos nucleicos que codifica qualquer uma das proteínas descritas na presente invenção pode ser otimizados por códon, isto é, alterados de modo a imitar os códons das proteínas altamente sintetizadas de um organismo

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80/168 particular. Em uma outra modalidade, a modificação pode referir-se à alteração do teor de GC da sequência de ácidos nucleicos que codifica o repressor para alterar o nivel de tradução do mRNA que codifica o repressor. Métodos de modificação de uma sequência de ácidos nucleicos são conhecidos na técnica.

[00156] Em algumas modalidades, mais de uma modificação ou um tipo de modificação pode ser realizada(o) para otimizar o nivel de expressão de um ácido nucleico descrito na presente invenção (por exemplo, um ácido nucleico que codifica um repressor ou antígeno de interesse). Por exemplo, pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou nove modificações, ou tipos de modificações, podem ser realizados para otimizar o nível de expressão de um ácido nucleico descrito na presente invenção. A título de exemplo não limitativo, quando o repressor é LacI, então a sequência de ácidos nucleicos de LacI e o promotor podem ser alterados de modo a aumentar o nível de síntese de LacI. Em uma modalidade, o códon de partida do repressor LacI pode ser alterado de GTG para ATG. Em uma outra modalidade, a sequência SD pode ser alterada de AGGG para AGGA. Ainda em uma outra modalidade, os códons de lacl podem ser otimizados de acordo com a utilização de códons para proteínas altamente sintetizadas de Salmonella. Em uma outra modalidade, o códon de partida de lacl pode ser alterado, a sequência SD pode ser alterada, e os códons de lacl podem ser otimizados.

[00157] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante compreende um ácido nucleico que é localizado em um plasmídeo ou vetor. Como aqui usado, vetor refere-se a

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81/168 uma unidade de ácido nucleico que se replica autonomamente. A presente revelação pode ser praticada com qualquer tipo de vetor conhecido, incluindo vetores virais, cosmídeos, fasmídeos e plasmídeos. 0 tipo de vetor mais preferido é um vetor de plasmídeo. Em algumas modalidades, o plasmídeo ou vetor é um plasmídeo de várias cópias. Em algumas modalidades, o plasmídeo ou vetor é um plasmídeo ou vetor de poucas cópias.

[00158] Como é bem conhecido na técnica, os plasmídeos e outros vetores podem possuir uma ampla matriz de promotores, múltiplas sequências de clonagem, terminadores de transcrição, etc. e vetores podem ser selecionados de modo a controlar o nível de expressão da sequência de ácidos nucleicos que codifica um antígeno controlando o número relativo de cópias do vetor. Em alguns casos, em que o vetor pode codificar uma adesina localizada na superfície como o antígeno, ou um antígeno capaz de estimular a imunidade das células T, pode ser preferível usar um vetor com um baixo número de cópias, tais como, pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez cópias por célula bacteriana. Um exemplo não limitativo de um vetor com poucas cópias pode ser um vetor compreendendo o pSClOl ori.

[00159] Em algumas modalidades, o plasmídeo compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um gene aspartato-semialdeído desidrogenase (por exemplo, asdA). Estes plasmídeos podem ser vantajosamente usados para complementar uma bactéria que compreende uma mutação do gene aspartato-semialdeído desidrogenase (por exemplo, asdA). Em algumas modalidades, o plasmídeo é selecionado a

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82/168 partir do grupo que consiste em pYA3342, pYA3337 e pYA3332.

[00160] Em outros casos, um vetor de número de cópias intermediário pode ser ótimo para induzir respostas imunológicas desejadas. Por exemplo, um vetor número de

cópias	intermediário pode ter	pelo	menos	10,	11,	12,	13,
14,	15,	16, 17, 18, 19, 20, 21,	22,	23, 24,	25,	26,	27,	28,
29	ou	30 cópias por célula	bacteriana.	Um	exemplo	não

limitativo de um vetor de número de cópias intermediário pode ser um vetor compreendendo o pl5A ori.

[00161] Em outros casos ainda, um vetor de muitas cópias pode ser ideal para a indução de respostas máximas de anticorpos. Um vetor de muitas cópias pode ter pelo menos 31, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 cópias por célula bacteriana. Em algumas modalidades, um vetor de muitas cópias pode ter pelo menos 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375 ou 400 cópias por célula bacteriana. Exemplos não limitativos de vetores de muitas cópias podem incluir um vetor compreendendo o pBR ori ou o pUC ori.

[00162] Adicionalmente, o número de cópias de vetores pode ser aumentado pela seleção de mutações que aumentam o número de cópias do plasmídeo. Essas mutações podem ocorrer no cromossomo bacteriano, mas são mais prováveis de ocorrer no vetor de plasmídio.

[00163] De preferência, os vetores aqui usados não compreendem marcadores de resistência a antibióticos para selecionar a manutenção do vetor.

[00164] Os promotores para uso nas modalidades descritas na presente invenção são conhecidos na técnica. Um técnico no assunto reconhecerá que a seleção de um

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83/168 repressor dita, em parte, a seleção do promotor a ser usado para regular a expressão de um ácido nucleico descrito na presente invenção. Por exemplo, se o repressor for LacI, então o promotor pode ser selecionado do grupo que consiste em promotores responsivos a LacI, tais como Ptrc, Piac, PT7iac, Ptac, P_OmpA laco e Pi_pp laco. Se o repressor for C2, então o promotor pode ser selecionado do grupo que consiste em promotores responsivos a C2, tais como promotores P22 Pl e Pr. Se o repressor for Cl, então o promotor pode ser selecionado do grupo que consiste em promotores responsivos a Cl, tais como os promotores λ Pl e Pr.

[00165] Em cada modalidade na presente invenção, o promotor regula a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, o promotor compreende uma sequência reguladora controlada por um repressor, de modo que a expressão da sequência de ácidos nucleicos seja reprimida quando o repressor é sintetizado (por exemplo, durante o crescimento in vitro da bactéria), mas a expressão da sequência de ácidos nucleicos que codifica um antígeno é alta quando o repressor não é sintetizado (por exemplo, in vivo) . De um modo geral, a concentração do repressor diminuirá a cada divisão celular após a expressão do gene, que codifica o repressor, cessar. Em algumas modalidades, a concentração do repressor diminui de modo que niveis altos de expressão da sequência de ácidos nucleicos que está sendo regulada sejam alcançados após cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 divisões da bactéria. Em uma modalidade de exemplo, a concentração do repressor diminui o suficiente para permitir expressão de alto nivel da sequência de ácidos nucleicos que codifica um

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84/168 antígeno após cerca de 5 divisões da bactéria in vivo.

[00166] Em certas modalidades, o promotor pode compreender outros elementos reguladores. Por exemplo, o promotor pode compreender lacO se o repressor for LacI. Este é o caso do promotor da lipoproteína Pi_pp iaco que é regulado por LacI, uma vez que possui o domínio de ligação lacO a LacI. Em uma modalidade, o repressor é um repressor LacI e o promotor é P trc · [00167] Em algumas modalidades, a expressão da sequência de ácidos nucleicos regulada por um repressor é reprimida in vivo. Ά expressão pode ser reprimida ou parcialmente reprimida quando é de cerca de 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% ou mesmo menos de 1% da expressão sob condições não reprimidas. Assim, embora o nível de expressão sob condições de repressão completa possa ser excessivamente baixo, é provável que seja detectável usando métodos muito sensíveis, uma vez que a repressão nunca pode ser absoluta.

[00168] Em contrapartida, a expressão da sequência de ácidos nucleicos que codifica o antígeno deve ser alta quando a expressão do repressor é reprimida. Por exemplo, se o repressor não for sintetizado durante o crescimento da bactéria recombinante em um hospedeiro, a expressão do ácido nucleico sob o controle do repressor será alta. Como aqui usada, a expressão de alto nível refere-se a expressão que é forte o suficiente para provocar uma resposta imunológica ao antígeno. Consequentemente, o número de cópias que se correlaciona com níveis altos de expressão pode e irá variar dependendo do antígeno e do tipo de resposta imunológica desejada. Os métodos para

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85/168 determinar se um antigeno provoca uma resposta imunológica tal como medindo os níveis de anticorpo ou populações de células T dependentes de antígeno ou níveis de citocina dependentes de antígeno são conhecidos na técnica, e métodos de medir níveis de expressão de sequências que codificam antígeno medindo níveis de mRNA transcrito ou por quantificação do nível de expressão de uma proteína são também conhecidos na técnica.

[00169] Em cada uma das modalidades acima, uma bactéria recombinante capaz de expressão regulada também pode ser atenuada. Atenuado refere-se ao estado da bactéria, em que a bactéria foi enfraquecida de sua aptidão do tipo selvagem por alguma forma de manipulação física ou recombinante. Isso inclui alterar o genótipo da bactéria para reduzir sua capacidade de causar doenças. No entanto, a capacidade da bactéria colonizar o intestino (no caso de Salmonella) e induzir respostas imunológicas, de preferência, não é substancialmente comprometida.

[00170] Em uma modalidade de exemplo, uma bactéria recombinante pode ser atenuada como descrito acima. Nesse caso, a atenuação regulada e a expressão regulada de uma sequência de codificação de antígeno podem ser dependentes de um sistema regulável por açúcar. Consequentemente, a concentração de açúcar (por exemplo, arabinose) necessária para a expressão ótima da sequência de codificação de antígeno regulada pode não ser a mesma que a concentração para expressão ótima de atenuação. Em uma modalidade de exemplo, a concentração de arabinose para a otimização da atenuação regulada e expressão regulada das sequências que codificam o antígeno será substancialmente a mesma.

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86/168 [00171] Por conseguinte, o promotor e/ou a sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína de atenuação pode ser modificado(a) para otimizar o sistema. Métodos de modificação são detalhados acima. Resumidamente, por exemplo, a sequência de ligação a ribossoma de SD pode ser alterada, e/ou o códon de partida pode ser alterado de ATG para GTG para as sequências de ácidos nucleicos fur e phoPQ, de modo que os niveis de produção de Fur e PhoPQ sejam ótimos para fenótipo de atenuação regulado e expressão regulada ao crescer as cepas com uma determinada concentração de arabinose. Um técnico no assunto apreciará que outras sequências de ácido nucleico, para de fur e phoPQ, também podem ser alteradas como descrito na presente invenção em combinação com outros protocolos bem conhecidos. Além disso, estas sequências de ácidos nucleicos atenuantes podem ser reguladas por outros sistemas, usando protocolos bem estabelecidos conhecidos de um técnico no assunto. Por exemplo, eles podem ser regulados usando promotores dependentes da adição de maltose, ramnose ou xilose em vez de arabinose.

II. Composições Farmacêuticas [00172] Uma bactéria recombinante pode ser administrada a um hospedeiro como uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode ser usada como uma vacina para provocar uma resposta imunológica à bactéria recombinante, incluindo quaisquer antigenos que possam ser sintetizados e dispensados pela bactéria. Em uma modalidade de exemplo, a resposta imunológica é protetora. As respostas imunológicas a antigenos são bem estudadas e amplamente relatadas.

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87/168 [00173] As composições farmacêuticas podem ser administradas a qualquer hospedeiro capaz de montar uma resposta imunológica. Tais hospedeiros podem incluir todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos, incluindo animais domésticos, animais agrícolas, animais de laboratório e humanos, e várias espécies de aves, incluindo aves domésticas e aves de importância agrícola. De preferência, o hospedeiro é um animal de sangue quente. Em uma modalidade, o hospedeiro é uma vaca. Em algumas modalidades, o hospedeiro é um equino. Em outra modalidade, o hospedeiro é uma ave. Em uma outra modalidade, o hospedeiro é um humano. A composição farmacêutica pode ser administrada ao indivíduo como profilático ou para finalidades de tratamento.

[00174] Em algumas modalidades, a bactéria recombinante está viva quando administrada a um hospedeiro em uma composição farmacêutica descrita na presente invenção. Formulações de composição de vacina e métodos de administração adequados são detalhados abaixo.

[00175] Uma composição farmacêutica que compreende uma bactéria recombinante pode opcionalmente compreender um ou mais aditivos possíveis, tais como, carreadores, conservantes, estabilizantes, adjuvantes e outras substâncias.

[00176] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende um adjuvante. Adjuvantes são opcionalmente adicionados para aumentar a capacidade da vacina para desencadear, intensificar ou prolongar uma resposta imunológica. Em modalidades de exemplos, o uso de uma bactéria recombinante atenuada viva pode atuar como um

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88/168 adjuvante natural. Em algumas modalidades, a bactéria recombinante sintetiza e secreta um modulador imunológico. Materiais adicionais, tais como, citocinas, quimiocinas, e sequências de ácidos nucleicos bacterianos encontradas naturalmente em bactérias, tipo CpG, também são adjuvantes de vacinas potenciais.

[00177] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende solução salina tamponada (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (PBS)).

[00178] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um produto alimenticio.

[00179] Em outra modalidade, o produto farmacêutico pode compreender um carreador farmacêutico (ou excipiente). Um tal carreador pode ser qualquer solvente ou material sólido para encapsulação que não é tóxico para o hospedeiro inoculado e compatível com a bactéria recombinante. Um carreador pode dar forma ou consistência, ou atuar como um diluente. Os carreadores farmacêuticos adequados podem incluir carreadores líquidos, tais como, solução salina normal e outros sais não tóxicos nas ou perto das concentrações fisiológicas, e carreadores sólidos não usados para humanos, tais como, talco ou sacarose, ou ração para animais. Os carreadores também podem incluir agentes estabilizantes, agentes umectantes e emulsificantes, sais para variar a osmolaridade, agentes encapsulantes, tampões e intensificadores de penetração na pele. Carreadores e excipientes, bem como formulações para dispensação parentérica e não parentérica de fármacos são apresentados em Remington's Pharmaceutical Sciences 19^a Ed. Mack Publishing (1995). Quando usado para administração através

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89/168 dos tubos brônquicos, a composição farmacêutica é, de preferência, apresentada na forma de um aerossol.

[00180] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é dispensada a um animal de fazenda (por exemplo, aves domésticas). Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é dispensada como uma pulverização em curso (por exemplo, para uso em incubadoras para dispensação a aves domésticas). Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é dispensada na água potável.

[00181] Deve-se ter cuidado ao usar aditivos para que a bactéria recombinante viva não seja morta, ou tenha sua capacidade de colonizar efetivamente tecidos linfoides, tais como, GALT, NALT e BALT, comprometidos pelo uso de aditivos. Estabilizantes, tal como, lactose ou glutamato monossódico (MSG), podem ser adicionados para estabilizar a composição farmacêutica contra uma variedade de condições, tais como, variações de temperatura ou um processo de liofilização. A bactéria recombinante pode também ser coadministrada com glutamato e/ou arginina como descrito na presente invenção.

[00182] As dosagens de uma composição farmacêutica podem e irão variar dependendo da bactéria recombinante, do antígeno regulado e do hospedeiro pretendido, como será apreciado por um técnico no assunto. De um modo geral, a dosagem necessita apenas de ser suficiente para provocar uma resposta imunológica protetora na maioria dos hospedeiros. A experimentação de rotina pode prontamente estabelecer a dosagem necessária. As dosagens iniciais típicas da vacina para administração oral podem ser de cerca de 1 x 10⁷ a 1 x 10¹⁰ UFC, dependendo da idade do

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90/168 hospedeiro a ser imunizado. A administração de múltiplas doses também pode ser usada conforme necessário para prover o nível desejado de imunidade protetora.

[00183] De modo a estimular uma resposta preferida das células GALT, NALT ou BALT, é preferida a administração da composição farmacêutica diretamente no intestino, na nasofaringe ou no brônquio, tal como por administração oral, administração intranasal, intubação gástrica ou na forma de aerossóis, embora outros métodos de administração da bactéria recombinante, tais como dispensação por injeção intravenosa, intramuscular, subcutânea ou intramamária, intrapenial, intra-retal, vaginal ou outras vias parentéricas sejam possíveis, por exemplo, para aplicações anticâncer.

[00184] Em algumas modalidades, estas composições são formuladas para administração por injeção (por exemplo, via intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intradérmica, intramuscular, etc.).

[00185] Em uma outra modalidade, a revelação provê um método para provocar uma resposta imunológica contra um antígeno em um hospedeiro. O método compreende administrar ao hospedeiro uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica que compreende uma bactéria recombinante descrita na presente invenção.

[00186] Em ainda outra modalidade, uma bactéria recombinante pode ser usada em um método para provocar uma resposta imunológica contra um patógeno em um indivíduo em necessidade do mesmo. O método compreende administrar ao hospedeiro uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica que compreende uma bactéria recombinante como

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91/168 descrita na presente invenção. Em uma outra modalidade, uma bactéria recombinante descrita na presente invenção pode ser usada em um método para melhorar um ou mais sintoma(s) de uma doença infecciosa em um hospedeiro em necessidade do mesmo. 0 método compreende administrar uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica que compreende uma bactéria recombinante como descrita na presente invenção.

EXEMPLOS [00187] A presente invenção é ilustrada adicionalmente pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitantes de qualquer forma. O conteúdo de todas as referências citadas, incluindo referências de literatura, patentes concedidas, e pedidos de patente publicados, como citado ao longo deste pedido, são aqui expressamente incorporados por referência. Deve ainda ser entendido que o conteúdo de todas as figuras e tabelas anexadas no presente pedido também são expressamente incorporadas no presente pedido por referência.

Exemplo 1: Fundamentos [00188] A imunidade protetora para Salmonella depende da ação combinada de anticorpos específicos, respostas imunológicas adquiridas por células B e células T (52-56). A depuração eficaz da infecção primária requer uma resposta Thl, com a ajuda de anticorpo que limita bacteremia (55, 57). As respostas dos anticorpos são importantes para obter proteção contra a infecção por Salmonella (58-60), como visto para proteção contra S. Typhi em camundongos (61) e humanos (62-64). As RASVs induzem todos os três ramos do sistema imunológico (isto é, anticorpo da mucosa e respostas celulares, e respostas celular e de anticorpo

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92/168 sistêmicas). Todos os três ramos do sistema imunológico são importantes para conferir imunidade protetora à Salmonella e a todos os patógenos que colonizam ou invadem a superfície da mucosa.

[00189] Salmonella possui um número de antígenos de reação cruzada imunologicamente relacionados. Estes incluem o polissacarídeo do núcleo de LPS que é o mesmo na maioria, senão em todos, os sorovares de S. enterica (65, 66), exceto para S. Arizonae (67, 68) . Além disso, as OMPs, embora possuam micro-heterogeneidade, compartilham determinantes antigênicos (69), bem como proteínas de membrana externa reguladas por ferro (IROMPs) (70) que são necessárias para a aquisição de ferro (70), uma função importante essencial para sucesso do patógeno dentro de um animal infectado.

[00190] As vacinas contra Salmonella podem ser usadas para exibir os determinantes antigênicos de superfície tipo selvagem in vitro e durante a fase inicial da infecção através de superfícies mucosas no hospedeiro imunizado oralmente e então cessar de sintetizar as cadeias laterais antígeno O de LPS por uma mutação íipmi (71-74) e para sintetizar constitutivamente IROMPs em órgãos internos (75, 76) por uma mutação de eliminação-inserção de ÁPf_Ur::TT araC ParaBAD fur (APf_Ur) (77) . As cepas de S. Typhimurium com a mutação íipmi não são completamente atenuadas, mas têm alta imunogenicidade, eficácia em intensificar a indução de altos títulos de anticorpos para OMPs, IROMPs de proteção cruzada (76) e núcleo de LPS conservado (78, 79). No entanto, o núcleo de LPS não está totalmente exposto porque ainda há dois açúcares afixados ao núcleo de LPS. As cepas

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93/168 com a mutação fpm! também intensificam a produção de vesículas da membrana externa (OMVs) que podem dispensar antigenos protetores recombinantes para imunidade protetora intensificada (80). A mutação APf_Ur permite que a expressão do gene fur seja exclusivamente dependente da presença de arabinose (75, 81, 82) e é cega para a concentração de ferro para alcançar in vivo um alto nivel de sintese constitutiva de todos os componentes para aquisição de ferro incluindo IROMPs de reação imunologicamente cruzada. As respostas imunológicas a IROMPs altamente imunogênicas são eficazes na prevenção da infecção septicêmica com enteropatógenos (83) . Anticorpos induzidos a IROMPs de um sorotipo bacteriano podem reconhecer IROMPs sintetizadas por outros sorotipos (84). Duas vacinas inativadas com base na superprodução de IROMP são licenciadas para proteger contra a salmonelose em aves domésticas (85, 86).

[00191] A Salmonella viva que dispensa os polissacarideos de superficie e as OMPs ao sistema imunológico são mais imunogênicas do que as vacinas de glicoconjugados. Salmonella espontaneamente libera 50 a 90 nm de partículas semelhantes a bolha da membrana da parede celular externa (87-89). Essas bolhas, chamados GMMA (Módulos Generalizados para Antigenos de Membrana) ou vesículas da membrana externa, constituem uma fonte enriquecida de antigenos associados à membrana externa em sua conformação nativa e orientação correta. GMMA ou vesículas da membrana externa provêm vantagens significativas sobre proteínas recombinantes porque elas contêm múltiplos padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), incluindo ligantes de TLR, que têm o potencial de

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94/168 atuar como autoadjuvantes nas respostas imunológicas que eles provocam (90-95). GMMA ou vesículas da membrana externa também são diferentes das OMPs extraídas de detergente que perdem vários componentes da membrana externa, como lipoproteínas, e assim resultam em imunogenicidade reduzida. GMMA ou vesículas da membrana externa estão atualmente sendo explorados como vacinas para o meningococo (96, 97), Shigella (87) e Salmonella (27) . Estudos pré-clínicos com vacinas candidatas com GMMA ou vesículas da membrana externa indicam boa imunogenicidade e ampla imunidade de proteção cruzada contra uma variedade de cepas (98). Um protótipo de GMMA meningocócico ou de vesículas da membrana externa foi testado em um ensaio clínico de Fase 1 sem efeitos adversos (99) e um protótipo de GMMA de Shigella ou de vesícula da membrana externa está planejada para um ensaio de Fase 2. A produção de GMMA ou de vesículas da membrana externa pode ser intensificada por eliminação do gene tolR (87, 100, 101), como observado em mutantes tolR de Salmonella e Shigella (87, 102) . Eliminações de genes, tais como, htrB (88) e msbB (103) para modificação do lipídio A, podem reduzir a reatogenicidade. Embora as novas vacinas de GMMA ou de vesículas da membrana externa tenham um número reduzido de etapas de purificação porque são liberadas espontaneamente por cepas de semente bacterianas de vacinas apropriadas, procedimentos a jusante, como filtragem complexa de fluxo tangencial, para purificação de GMMA ou vesículas da membrana externa ainda são necessários (87, 104, 105) . Em contraste, a presente revelação provê um sistema de produção in vivo de GMMA ou de vesículas de membrana

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95/168 externa para omitir os procedimentos de purificação a jusante sem comprometer a eficiência.

[00192] Entre os antígenos protetores expostos à superfície ou secretados em Salmonella, 6 antígenos, FliC, OmpC, OmpD, OmpF, SseB e Ssel, podem ser usados (106-113). Esses antígenos não são as proteínas mais abundantes em Salmonella (106). A síntese de FliC é ainda desregulada em locais sistêmicos (114-116). Estudos pré-clínicos em camundongos demonstraram que a imunização com aqueles acima dos antígenos podería proteger contra o desafio com Salmonella (57, 111, 117-120) . OmpC e F induzem respostas de anticorpos de longa duração em camundongos (121) e foram considerados seguros e imunogênicos quando testados em um estudo de Fase 1 em humanos (122) . A OmpD é um alvo chave para uma resposta de anticorpo de célula Blb independente das células T (57, 111) e é conservada em todos os sorovares de Salmonella, exceto o sorovar Typhi (123, 124) . A subunidade de translocon SPI-2 SseB desempenha a função crítica para a secreção de efetor de T3SS e replicação de Salmonella na célula (125) . É um alvo serodominante de imunidade adaptativa em crianças com bacteremia por Salmonella (120) e abrange múltiplos epitopos para imunidade de células T CD4 em voluntários humanos (108, 120, 126) . Outro efetor de SPI-2, o Ssel, desempenha um papel na modulação da migração de células infectadas, e é necessário para a infecção sistêmica a longo prazo (127— 131) . Preservar a conformação correta de tais antígenos é fundamental, como revelado pela falha de porinas de Salmonella recombinantes em proteger os camundongos (132) . A RASV habilita a dispensação desses antígenos em sua

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96/168 correta conformação e orientação com altos niveis de produção, combinados com as propriedades autoadjuvantes de Salmonella que dispensam sinais inatos através de ligantes TLR e outras PAMPs para induzir imunidade de células B e células T especificas para Salmonella.

[00193] Na presente invenção é aqui revelada uma plataforma de RASV inovadora para produzir em excesso antigenos protetores de Salmonella in vivo. Este sistema é um sistema único regulado por açúcar triplo, duplo fechamento de sintese de antígeno O por ramnose e manose e superprodução de vesículas de GMMA ou de membrana externa por arabinose. Também incorporará os sistemas de RDA e RDPS. Esses sistemas não aumentarão a virulência (pela introdução desses autoantigenos) porque a maioria dos genes do antígeno não é altamente expressada in vivo (10 6) . A sobrexpressão de genes de antígeno também atenua a cepa (133, 134), como mostrado pela sobrexpressão do gene da flagelina (133, 135) . A virulência de cepas com ou sem mutações cromossômicas para esses genes de antigenos ao transportar plasmídeos de expressão de genes de antigenos também pode ser avaliada, como discutido mais adiante. No caso do plasmídeo de expressão aumentar a virulência alta o suficiente para causar doença, a cepa ou o plasmídeo pode ser modificada(o) para garantir os atributos de atenuação. Os níveis de expressão genica podem ser modificados de modo positivo e negativo, como necessário, mudando os promotores regulados por açúcar, alterando o promotor e a sequência de nucleotídeos Shine-Dalgarno e o espaçamento entre estes elementos e o códon de partida do gene regulado.

Exemplo 2: Materiais e Métodos

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97/168 [00194] Cepas bacterianas, meio e crescimento bacteriano: A construção da cepa é realizada na cepa virulenta S. Typhimurium χ3761 (75) e S. Enteritidis χ3550 (136) . Serovares diferentes de Salmonella tipo selvagem virulento, incluindo S. Typhimurium χ3761 (B) , S. Enteritidis χ3550 (D), S. Heidelberg χ3749 (B) (137), S. Choleraesuis χ3246 (Cl) (138), S. Infantis χ3213 (Cl) (139) , S. Newport χ3240 (C2) (139), S. Dublin χ12323 (D) (140) , são usados para desafios. Os LDsos da maioria dessas cepas estão entre 10³ e 10⁵ em camundongos e frangos, exceto que S. Heidelberg, S. Infantis e S. Newport não costumam causar doença letal em camundongos ou frangos. Meios de LB ou placas com suplementos apropriados quando necessários são usados para o crescimento de Salmonella (141, 142) .

[00195] Procedimentos moleculares e genéticos. Métodos para manipulações de DNA e PCR são padrão (143) . A análise da sequência de DNA realizada no laboratório de sequência de DNA de UFL, enquanto a síntese de segmentos de oligonucleotídeos e/ou de gene será obtida comercialmente. A construção de eliminações ou eliminação/inserções em Salmonella é realizada usando vetores suicidas ou transdução com P22 (144-146).

[00196] Caracterização de cepa. As cepas de vacinas são totalmente caracterizadas em cada etapa de sua construção e antes de estudos de imunização para a presença de todos os fenótipos e genótipos. Atributos genéticos são confirmados por PCR com sondas apropriadas e/ou análises de fenótipos. O método de influxo de corante fluorescente é usado para avaliar a permeabilidade da membrana mutante. As cepas são

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98/168 comparadas com cepas de controle de vetores para estabilidade de manutenção de plasmídeos e síntese de antígenos quando cepas são cultivadas na presença de arabinose ou outros açúcares e/ou DAP ao longo de um período de 50 gerações (147) . O LPS é verificado por coloração com prata (148). Curvas de crescimento serão determinadas para cada cepa. Outros experimentos incluem a determinação dos perfis de OMP (147) e IROMPs (149), caracterização de OMV (80) e GMMA (87, 150, 151), soro (152), resistência a bílis e peptídeos microbianos (136) e ligação/invasão a células INT-407 epiteliais (153, 154) . Cada cepa com o plasmídeo que especifica o antígeno é avaliada para a síntese do antígeno heterólogo por western blot.

[00197] Preparação de antígeno. Antígenos protetores, FliC, OmpC, OmpD, OmpF, SseB e Ssel, com etiqueta de polihistidina C-terminal, são clonados em vetores pBAD-His ou pET para a síntese em E. coli ToplO ou BL21 e isolados por cromatografia com níquel (Sigma). Proteínas purificadas são usadas para ensaios de ELISA e ELISPOT e para preparação de anti-soro em coelhas fêmeas da Nova Zelândia. Os antígenos O de LPS de Salmonella são obtidos comercialmente. As proteínas da membrana externa de S. Typhimurium (SOMPs) são purificadas a partir da cepa χ9424 que foi manipulada para ser incapaz de produzir flagelos, todos os antígenos de pilus expressados in vitro, antígeno O de LPS e várias cápsulas. Outras OMPs de Salmonella são purificadas dos correspondentes mutantes de antígeno O (147) .

[00198] Estatística: O programa SAS é usado para fazer testes estatísticos e análise de energia para avaliar

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Exemplo 3: Construção de plasmídeos com síntese de GFP regulada por açúcar para permitir a determinação de se uma cepa incapaz de metabolizar um açúcar é capaz de absorver esse açúcar para permitir a regulação de um gene ou sequência genética dentro dessa cepa.

[00199] A Figura 1 ilustra três plasmídeos pYA3700, pYA5351 e pG8R74 que possuem os cassetes araC ParaBAD, rhaRSPrhaB e xyl.R-PxyiA, respectivamente, como fontes de DNA que codificam esses cassetes para permitir a geração de vetores suicidas com fusão de um cassete regulador selecionado para um gene de escolha no lugar do promotor para esse gene. Estas manipulações são descritas no Exemplo 1 e as cepas com mutações de eliminação-inserção resultantes com expressão genética regulada por açúcar são descritas nos exemplos seguintes.

[00200] A sequência de nucleotídeos do cassete rhaRSPrhaB em pYA5351 é a seguinte: GGGCGAATTCGAGCTCGGTACCCTCGAGGCTGAATTTCATTACGACCAGTCTAAAAAGC GCCTGAATTCGCGACCTTCTCGTTACTGACAGGAAAATGGGCCATTGGCAACCAGGGAA AGATGAACGTGATGATGTTCACAATTTGCTGAATTGTGGTGATGTGATGCTCACCGCAT TTCCTGAAAATTCACGCTGTATCTTGAAAAATCGACGTTTTTTACGTGGTTTTCCGTCG AAAATTTAAGGTAAGAACCTGACCTCGTGATTACTATTTCGCCGTGTTGACGACATCAG GAGGCCAGTATGACCGTATTACATAGTGTGGATTTTTTTCCGTCTGGTAACGCGTCCGT GGCGATAGAACCCCGGCTCCCGCAGGCGGATTTTCCTGAACATCATCATGATTTTCATG AAATTGTGATTGTCGAACATGGCACGGGTATTCATGTGTTTAATGGGCAGCCCTATACC ATCACCGGTGGCACGGTCTGTTTCGTACGCGATCATGATCGGCATCTGTATGAACATAC CGATAATCTGTGTCTGACCAATGTGCTGTATCGCTCGCCGGATCGATTTCAGTTTCTCG CCGGGCTGAATCAGTTGCTGCCACAAGAGCTGGATGGGCAGTATCCGTCTCACTGGCGC GTTAACCACAGCGTATTGCAGCAGGTGCGACAGCTGGTTGCACAGATGGAACAGCAGGA

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AGGGGAAAATGATTTACCCTCGACCGCCAGTCGCGAGATCTTGTTTATGCAATTACTGC TCTTGCTGCGTAAAAGCAGTTTGCAGGAGAACCTGGAAAACAGCGCATCACGTCTCAAC TTGCTTCTGGCCTGGCTGGAGGACCATTTTGCCGATGAGGTGAATTGGGATGCCGTGGC GGATCAATTTTCTCTTTCACTGCGTACGCTACATCGGCAGCTTAAGCAGCAAACGGGAC TGACGCCTCAGCGATACCTGAACCGCCTGCGACTGATGAAAGCCCGACATCTGCTACGC CACAGCGAGGCCAGCGTTACTGACATCGCCTATCGCTGTGGATTCAGCGACAGTAACCA CTTTTCGACGCTTTTTCGCCGAGAGTTTAACTGGTCACCGCGTGATATTCGCCAGGGAC GGGATGGCTTTCTGCAATAACGCGAATCTTCTCAACGTATTTGTACGCCATATTGCGAA TAATCAACTTCGTTCTCTGGCCGAGGTAGCCACGGTGGCGCATCAGTTAAAACTTCTCA AAGATGATTTTTTTGCCAGCGACCAGCAGGCAGTCGCTGTGGCTGACCGTTATCCGCAA GATGTCTTTGCTGAACATACACATGATTTTTGTGAGCTGGTGATTGTCTGGCGCGGTAA TGGCCTGCATGTACTCAACGATCGCCCTTATCGCATTACCCGTGGCGATCTCTTTTACA TTCATGCTGACGATAAACACTCCTACGCTTCCGTTAACGATCTGGTTTTGCAGAATATT ATTTATTGCCCGGAGCGTCTGAAGCTGAATCTTGACTGGCAGGGGGCGATTCCGGGATT TAACGCCAGCGCAGGGCAACCACACTGGCGCTTAGGTAGCATGGGGATGGCGCAGGCGC GGCAGGTTATCGGTCAGCTTGAGCATGAAAGTAGTCAGCATGTGCCGTTTGCTAACGAA ATGGCTGAGTTGCTGTTCGGGCAGTTGGTGATGTTGCTGAATCGCCATCGTTACACCAG TGATTCGTTGCCGCCAACATCCAGCGAAACGTTGCTGGATAAGCTGATTACCCGGCTGG CGGCTAGCCTGAAAAGTCCCTTTGCGCTGGATAAATTTTGTGATGAGGCATCGTGCAGT GAGCGCGTTTTGCGTCAGCAATTTCGCCAGCAGACTGGAATGACCATCAATCAATATCT GCGACAGGTCAGAGTGTGTCATGCGCAATATCTTCTCCAGCATAGCCGCCTGTTAATCA GTGATATTTCGACCGAATGTGGCTTTGAAGATAGTAACTATTTTTCGGTGGTGTTTACC CGGGAAACCGGGATGACGCCCAGCCAGTGGCGTCATCTCAATTCGCAGAAAGATTAATC TAGATAAATAAAAG CAGTTTACAACTCC TAGAAT T G T GAATATAT TAT CACAAT T C TAG GATAGAATAATAAAAGATCTCTGCAGGCATGCAAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCT AAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCA CAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGA

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TGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAA AAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAG AAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGT CTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGT CACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGG GTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGA GTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAG GCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTT CGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACG CCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTC ACTATA (SEQ ID NO: 11).

[00201] A sequência de nucleotideeos do cassete xylRPxyiA em pG8R7 4 é a seguinte: GGGCGAATTCGAGCTCGGTACCCTCGAGTCCATAATCAGGTAATGCCGCGGGTGATGGA TGATGTCGTAATATTGGGCACTCCCTTTCAGTTGCTCAATTATGTTATTTCACACTGCT ATTGAGATAATTCACAAGTGTGCGCTCGCTCGCAAAATAAAATGGAATGATGAAACTGG GTAATTCCGCTAGCttttgataaaaattttctcaaagccggttacgtattaccggtttt gagtttttgcatgattcagcaggaaaagaaccatgtttactaaacgtcaccgcatcaca ttactgttcaatgccaataaagcctatgaccggcaggtagtagaaggcgtaggggaata tttacaggcgtcacaatcggaatgggatattttcattgaagaagatttccgcgcccgca ttgataaaatcaaggactggttaggagatggcgtcattgccgacttcgacgacaaacag atcgagcaagcgctggctgatgtcgacgtccccattgttggggttggcggctcgtatca ccttgcagaaagttacccacccgttcattacattgccaccgataactatgcgctggttg aaagcgcatttttgcatttaaaagagaaaggcgttaaccgctttgctttttatggtctt ccggaatcaagcggcaaacgttgggccactgagcgcgaatatgcatttcgtcagcttgt cgccgaagaaaagtatcgcggagtggtttatcaggggttagaaaccgcgccagagaact ggcaacacgcgcaaaatcggctggcagactggctacaaacgctaccaccgcaaaccggg attattgccgttactgacgcccgagcgcggcatattctgcaagtatgtgaacatctaca tattcccgtaccggaaaaattatgcgtgattggcatcgataacgaagaactgacccgct atctgtcgcgtgtcgccctttcttcggtcgctcagggcgcgcggcaaatgggctatcag

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103/168 gcggcaaaactgttgcatcgattattagataaagaagaaatgccgctacagcgaatttt ggtcccaccagttcgcgtcattgaacggcgctcaacagattatcgctcgctgaccgatc ccgccgttattcaggccatgcattacattcgtaatcacgcctgtaaagggattaaagtg gatcaggtactggatgcggtcgggatctcgcgctccaatcttgagaagcgttttaaaga agaggtgggtgaaaccatccatgccatgattcatgccgagaagctggagaaagcgcgca gtctgctgatttcaaccaccttgtcgatcaatgagatatcgcaaatgtgcggttatcca tcgctgcaatatttctactctgtttttaaaaaagcatatgacacgacgccaaaagagta tcgcgatgtaaatagcgaggtcatgttgtaatTCTAGAtaaataaaagcagtttacaac tcctagaattgtgaatatattatcacaattctaggatagaataataaaagatctctgca gGCATGCAAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCA

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ACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGT AGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGA GACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGA GCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGG AAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACA GGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACG ATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTC CTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCA CTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTA CTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGT CAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAA CGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTA ACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGT GAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGT TGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCT CATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCA CATTTCCCC GAAAAG TGCCACCTGACGTC TAAGAAAC CATTATTATCATGACATTAACC TATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGA

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105/168 bacterianas por seleção para resistência à ampicilina e depois triados quanto à síntese de GFP na presença do açúcar de interesse e cessação da síntese de GFP na ausência do açúcar. Se a síntese de GFP é observada, então é possível construir cepas mutantes nas quais um promotor para um gene de interesse foi eliminado e substituído por um cassete ParaBAD, rhaRS-P _rhaB ou xylR-P_xyiA de modo que a expressão gênica seja agora dependente da presença de arabinose ou ramnose ou xilose, respectivamente. Deve ser notado que esta capacidade é muito útil quando a cepa bacteriana ou espécie de interesse é incapaz de metabolizar ou crescer em arabinose, ramnose ou xilose, de modo que se desconhece se estes açúcares podem ser transportados para as células bacterianas que seriam necessárias é se é para usar a presença desse açúcar para a expressão de genes nessa cepa ou espécie bacteriana.

Exemplo 4: Isolamento e caracterização de cepas com mutações galE para permitir a sintese reversível funcional de LPS dependente da presença de galactose livre. Construção de cepas de vetor de vacina com mutações galE para permitir a sintese regulada de UDP-Gal necessária para a sintese de cadeias laterais de antígeno O de LPS e o núcleo externo de LPS e permitir o crescimento na presença de galactose sem toxicidade e seleção potencial de variantes resistentes à galactose para reduzir imunogenicidade.

[00203] O gene galE codifica UDP-galactose 4-epimerase, que interconverte UDP-galactose e UDP-glicose. Como parte do catabolismo da galactose, galE estava relacionado com a síntese e a degradação da galactose. Todo o lipossacarídeo

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106/168 da superfície (LPS) da espécie Salmonella contém unidades de galactose, no núcleo de LPS e na cadeia lateral do antígeno O de LPS. Como a UDP-galactose é o precursor das unidades de galactose em LPS, o mutante galE sintetiza LPS com núcleo defeituoso ou áspero, a menos que seja provida galactose exógena (47) . O mutante galE de S. Typhimurium é avirulento e confere proteção contra o desafio de S. Typhimurium virulento em camundongo (47, 50, 155). Alguns dos mutantes galE de S. Choleraesius também são avirulentos (156, 157) . A única vacina bacteriana com atenuação viva aprovada para uso humano é S. Typhi Ty21a com uma mutação galE bem como outras mutações (30, 158, 159) . O S. Typhi Ty21a foi apenas parcialmente atenuado e confere imunidade protetora moderada contra a febre tifoide em ensaios de campo humano (30, 47, 160-163).

[00204] No entanto, uma única mutação galE em S. Typhi ainda permite virulência para humanos e só provê proteção moderada contra a febre tifóide (30, 47, 161, 163, 164), como também observado com os mutantes galE de S. Choleraesuis (165) . Além disso, os mutantes galE de Salmonella são sensíveis à galactose para induzir a lise in vitro (48, 166, 167). Mesmo uma eliminação definida de galE em S. Typhimurium confere sensibilidade à lise induzida por galactose, o que é um atributo indesejável para a vacina. A cepa licenciada Ty21a também tem esse atributo desfavorável. Os mutantes galE não possuem a enzima UDP galactose 4-epimerase, mas mantêm a capacidade de absorver galactose de fontes exógenas através de transportadores de galactose (168, 169). Quando crescida na presença de galactose, a galactoquinase e a galactose-l-fosfato

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107/168 uridiltransferase, codificadas pelos genes galK e galT, respectivamente, podem sintetizar UDP-galactose a partir de galactose via galactose-l-fosfato e levar à parada do crescimento celular e até mesmo lise. O mecanismo litico exato é desconhecido, mas a morte está correlacionada com o crescimento e o acúmulo intracelular de metabólitos de galactose, especialmente o acúmulo de galactose 1-fosfato e UDP-galactose devido à atividade da galactoquinase (30, 48). O acúmulo de UDP-D-galactose leva à parada do crescimento devido à baixa disponibilidade de CTP e UTP, o que resulta na redução da síntese de RNA (49) . Os mutantes galE crescem pouco e a sua viabilidade é significativamente reduzida por liofilização (50). A avirulência dos mutantes galE é principalmente devida ao lipopolissacarídeo de parede celular incompleta à lise de célula bacteriana induzida por galactose (30) . Ele selecionará para resistência a galactose e fenótipo Gal⁺ (170) . A lise pode ocorrer em concentrações de galactose tão baixas quanto 0,002% (166). A lise induzida por galactose ocorre na cepa Ty21a in vitro a ú 6 mM de galactose (30, 47) enquanto Ty2 com uma mutação galE definida é ainda mais sensível a > 0,06 mM de galactose (50, 163) . O crescimento de mutantes galE na presença de galactose também seleciona cepas resistentes à galactose que perdem a capacidade de mostrar a variação reversível de rugosa a lisa, dependendo do suprimento de galactose (170). A glicose pode proteger as cepas galE sensíveis à galactose da lise por repressão catabólica, na medida em que os níveis de lise dos intermediários de galactose não podem acumular (167, 171). Diminuir a atividade da galactoquinase também pode dar

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108/168 resistência de cepa à galactose (48, 166, 167). Assim, para vencer este problema e estender o uso de mutações galE conferindo uma variação rugosa-suave reversível que serve como um meio de atenuação atrasada regulada para vacinas, construímos uma cepa com uma nova mutação galE com resistência aumentada à galactose e ainda exibindo a atenuação regulada dependente da presença de galactose adicionada, que não está disponível in vivo. Em seguida, avaliamos a inclusão dessa mutação em cepas de vacinas contra S. Typhimurium.

[00205] Três cepas com diferentes mutações galE foram geradas. A cepa χ40 94 tem uma mutação galE496 sensível à galactose, como se observa com a maioria dos mutantes galE. A cepa χ4700 tem uma mutação de eliminação não caracterizada Δ(galE-uvrB)-1005 que permite que as cepas sejam insensíveis à galactose. A cepa χ9792 tem uma mutação insensível à galactose Δ(galE-ybhC)-851, que elimina 11 sequências genéticas de galE a ybhC (Figura 3A) . A cepa requer galactose 0,001% em meio de crescimento para formar o complexo LPS antígeno O (Figura 3B) em caldo Nutriente ou caldo LB.

[00206] Para determinar se a adição de galactose afeta o crescimento de cepas de Salmonella com diferentes mutações galE, experimentos de crescimento foram realizados. O primeiro experimento avaliou ODs finais de culturas de um dia para o outro com concentrações variáveis de galactose em caldo LB ou caldo NB. Deve ser notado que o caldo NB é desprovido de todos os açúcares, de modo que não possa haver interferência nos resultados devido a vestígios de galactose. Em meio LB, ODs da cultura de um dia para o

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109/168 outro de χ4094 έ 1,088 com galactose 0,001%, mas baixam para 0,159 com galactose 0,01%. Os ODs de χ4700 e χ9792 não foram significativamente afetados por concentrações variáveis de galactose. Observaram-se tendências semelhantes quando os mutantes galE foram crescidos em caldo NB com concentrações variáveis de galactose (Figura 3C) . No geral, os dados confirmam que χ9792 (Δ (galE-ybhC) 851)) não é tão sensível à galactose como χ4094.

[00207] Um segundo experimento avaliou o crescimento das cepas durante um período de 7 horas em meios de crescimento com concentrações variáveis de galactose (Figuras. 4A-4H). Uma cultura durante a noite de cada cepa foi crescida em caldo NB sem galactose. Uma subcultura foi feita por diluição a 1:100 em 3 ml de caldo NB pré-aquecido com concentrações percentuais variáveis de galactose (0, 0,001; 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5). As culturas foram incubadas a 37 °C com agitação. As densidades ópticas foram medidas e registradas a cada 1 hora. Sem galactose, todas as cepas crescem de forma semelhante. A cepa χ4094 tem a mutação galE496 sensível à galactose. A cepa x4094tem a mutação Δ(galE-uvrB)-1005 insensível à galactose. A cepa χ9792 tem a mutação Δ(galE-ybhC)-851 insensível à galactose. A cepa χ11015 tem a mutação Δ(galE-ybhC)-851 AgalP211 insensível à galactose. A cepa χ11141 tem a mutação Δ(galE-ybhC)-851 AgalP211 AmglBAC insensível à galactose. AS Figuras. 4A-4H mostraram que as mutações AgalP211 e AmglBAC ajudam a cepa a alcançar ODs mais altos.

[00208] Como mostrado na Figura 4B, a cepa χ4094 cresce por 2 horas e, em seguida, começa a lisar mesmo com galactose 0,001%. Com as concentrações crescentes de

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110/168 galactose, o tempo de partida para a lise foi reduzido. Ambas as cepas χ4700 e χ9792 e podem tolerar galactose tão alta quanto 0,5% sem comprometer o crescimento (ver Figuras. 4A-4H). Estes resultados demonstram que altas concentrações de galactose não inibem o crescimento e a colonização de uma cepa com a mutação Δ (galE-ybhC) . A tolerância à galactose melhorada permite que a cepa exiba uma maior colonização tecidular do que a cepa com a mutação galE496 sensível no dia 6 (Figura 5) após inoculação oral de camundongos. Os dados confirmam que a mutação Á(galEybhC) -851 pode ser usada em cepas de vacinas para permitir um fenótipo rugoso-suave reversível, dependente da presença de galactose no meio de crescimento e conferirá um meio adicional de atenuação in vivo atrasada regulada já que a galactose livre não fosforilada não está presente nos tecidos animais.

Exemplo 5: Construção e avaliação de cepas de S. Typhimurium RASV do grupo B com síntese de antígeno O atrasada regulada por ramnose, síntese de cadeia lateral de antígeno O regulada por manose e produção de GMMA ou vesículas da membrana externa regulada por arabinose, sintetizando antigenos protetores in vivo.

[00209] Ligase de antígeno O WaaL é necessária para ligar polissacarídeo à porção do núcleo do lipídeo A. A mutação de waaL resulta em um núcleo intacto, sem nenhum antígeno O afixado ao mesmo (172, 173) . Excluímos o waaL no operon e colocamos o waaL regulado por ramnose (APrhaBAD waaL) no gene pagL, uma vez que a mutação pagL não prejudica a virulência de Salmonella (174) . A ramnose substituirá a arabinose para conseguir uma regulação

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111/168 negativa da síntese do antígeno 0 in vivo, porque é necessária uma concentração relativamente alta de ramnose para ativar este promotor (175). As cepas de RASV com waaL regulada por ramnose sintetizarão LPS normal na presença de ramnose in vitro, mas formarão LPS rugoso devido à ausência de ligase de antígeno 0 in vivo. Essa estratégia expõe o oligossacarídeo conservado do núcleo de LPS e intensifica a produção de OMPs conservadas, incluindo porinas (176, 177), resultando em apresentação mais efetiva de OMPs conservadas ao sistema imunológico do hospedeiro para intensificar a imunogenicidade e auxiliar na produção de uma resposta imunológica de proteção cruzada contra bactérias heterólogas (173) .

[00210] A cepa mutante é atenuada para 10⁹ UFC e provê proteção contra o desafio de S. Typhimurium e S. Enteritidis a 10⁹ UFC (Tabela 1). No entanto, esta mutação não é totalmente atenuada, uma vez que ainda causa a morte em 10⁹. Portanto, uma mutação hpmi também é incluída como duplo corte da síntese de antígeno O na cepa χ12339. As RASVs com as mutações ÚPrhaBAD waaL e /\pmi precisam de ramnose e manose para formar o antígeno O completo. Para aumentar ainda mais a proteção, uma mutação APf_Ur é incluída para regular positivamente IROMPs in vivo para intensificar a indução de imunidade de proteção cruzada aos patógenos entéricos, como foi feito na cepa χ12362.

Tabela 1. Imunização oral de camundongos BALB/c (6-8 semanas) com cepa χ12337 (AwaaL LpagL: :TT rhaSR PrhaBAD waaL) e com sobreviventes desafiados por via oral com 10⁹ de S. Typhimurium tipo selvagem %3761^a e S. Enteritidis %3550^b 30 dias depois.

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Cepa bacteriana para imunização	Dados de imunização	Dados do desafio
Dose (UFC)	N° de sobreviventes/ n° total de camundongos	N° de sobreviventes/ n° total de camundongos
S. Typhimurium X12337	1,46 x 10⁹	4/5	4/4^a
1,64 x 10⁵	5/5	4/5^a
	1,46-1,64 x 10⁸	10/10	10/10*
	1, 64 x 10⁷	5/5	3/5*
	1, 64 x 10⁶	5/5	3/5*

* A cepa foi cultivada em caldo LB com ramnose 0,1%.

[00211] Todas as mutações são dedicadas a aumentar a apresentação de proteínas conservadas para auxiliar na indução de imunidade de proteção cruzada e alcançar atenuação atrasada regulada. Como uma mutação tolR pode aumentar a produção de vesículas de GMMA ou de membrana externa (100, 101), RASVs candidatos foram modificados pela introdução de uma mutação tolR regulada por arabinose (APtoiR::TT araC ParaBAD tolR, simplificada como APtoiR depois) para adicionalmente regular positivamente vesículas de GMMA ou de membrana externa in vivo para induzir ao máximo anticorpos reativos de forma cruzada com as OMPs de outros sorovares de Salmonella. Além disso, os plasmídeos que codificam os antígenos protetores serão introduzidos nas cepas de vacina para avaliar a imunidade protetora. Como os

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113/168 genes de antígenos candidatos são reprimidos ou expressados em baixos níveis in vivo (106), a superprodução desses antígenos facilitará sua apresentação (106, 108).

[00212] A cepa final necessitará de arabinose, manose e ramnose para se comportar como tipo selvagem e atingir gradualmente a atenuação in vivo (Tabela 2) . Genes regulados por ramnose e manose perderão sua função primeiro, para expor antígenos de superfície, e então os genes regulados por arabinose desligados aumentarão as vesículas de GMMA ou de membrana externa.

Tabela 2. Fenótipos associados a mutações chave em cepas de RASV

Observação: Δ = Eliminação da sequência genética; P = Promotor para reconhecimento e ligação da RNA polimerase; :: = inserção de DNA ou sequência genética; TT = Terminador de transcrição.

Mutação

Fenótipo

LwaaL/LpagL::TT rhaSR Pbad waaL

A eliminação do gene ligase de antígeno 0 waaL, a inserção da posição do gene waaL para pagL regulada por ramnose e a eliminação do gene pagL, permitem a síntese de WaaL dependente da presença de ramnose em meio de crescimento para LPS normal como tipo selvagem in vitro e deixa de ser sintetizado in vivo devido à ausência de ramnose, resultando na síntese e na atenuação de antígeno 0 incompletas.

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Lpmi

Eliminação do gene de fosfomanose isomerase para converter frutose em manose necessária para a síntese de cadeias laterais de antigeno 0 de LPS. 0 antigeno 0 de LPS pode ser sintetizado durante o crescimento in vitro por manose exógena no meio de crescimento para exibir atributos quase tipo selvagem para sobrevivência e colonização de tecidos linfoides no momento da imunização e perdido após cinco a dez divisões celulares in vivo e torna-se avirulento devido à incapacidade de sintetizar as cadeias laterais de antigeno 0 de LPS pela ausência de manose livre não fosforilada e também torna-se sensível à citotoxicidade mediada pelo complemento e suscetível à fagocitose por macrófagos.

AP_fur::TT araC Pbad fur

0 gene fur codifica um repressor que reprime todos os genes envolvidos na aquisição de ferro na presença de ferro livre. Quando as concentrações de ferro se tornam baixas, como nos tecidos hospedeiros animais além da barreira da parede intestinal,

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	o Fur deixa de ser sintetizado e a síntese constitutiva de IROMPs começa. Esta mutação permite ativar o gene fur com arabinose in vitro e desligar na ausência de arabinose in vivo para sobrexpressão de IROMPs in vivo e leva à atenuação.
RPtolR::TT tolR	araC	Pbad	A mutação de eliminação-inserção elimina a síntese de TolR e regula positivamente GMMA ou vesículas da membrana externa in vivo devido à ausência de arabinose.
RrelA::araC TT	Pbad	lacl	A mutação de eliminação-inserção elimina o RelA que governa a síntese do ppGpp e acopla o crescimento à síntese de proteínas. A inserção araC Pbad lacl provoca uma síntese dependente de arabinose do repressor Lacl in vitro, que governa a expressão de genes que codificam antígenos de proteína protetores codificados em plasmídeos, e permite a produção de antígeno in vivo devido à eliminação de Lacl in vivo.
RasdA	Para o sistema letal equilibrado e mantém a sensibilidade completa

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	de RASV a todos os antibióticos.
Δ (wza-wcaM)	Elimina vinte enzimas necessárias para sintetizar vários exopolissacarídeos que promovem a formação e a sintese de biopelícula de GDP-fucose necessária para a síntese de ácido colânico (178), que protege as células que sofrem morte por ausência da parede celular a partir da lise (179)
Δ (galE-ybhC)	Eliminação do gene de UDP-glicose 4-epimerase para a interconversão de UDP-galactose e UDP-glicose necessária para a síntese do núcleo de antígeno 0 de LPS. 0 antígeno 0 de LPS pode ser sintetizado durante o crescimento in vitro por galactose exógena no meio de crescimento para exibir atributos quase tipo selvagem para sobrevivência e colonização de tecidos linfoides no momento da imunização e perdido após várias divisões celulares in vivo e torna-se avirulento devido à incapacidade de sintetizar o núcleo de antígeno 0 de LPS devido à ausência de galactose não fosforilada livre e também

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torna-se sensível à citotoxicidade mediada por complemento e suscetível à fagocitose por macrófagos. Mutantes com essa mutação podem tolerar alta concentração de galactose a 0,5%

[00213] Construção de cepa. A cepa χ12470 é gerada usando ο χ12337 da cepa e subsequentemente adicionando as mutações Apmi, APf_Ur e APtoiR sequencialmente (Tabela 2) . As mutações frelA: : araC ParaBAD lad TT (ArelA) para RDPS (180), HasdA para o sistema letal equilibrado e H (wza-wcaM) para eliminar a síntese de exopolissacarídeos (Tabela 2) são introduzidas resultando em cepa χ12465 para facilitar seu uso como vetor. Uma mutação APtoiR é adicionada para gerar a cepa χ12473. Após confirmação da cepa final por análise fenotípica e PCR, os plasmídeos Asd⁺ portando um gene de antígeno individual são introduzidos na cepa. O gene do antígeno correspondente será eliminado usando um vetor suicida (144, 181) do cromossomo para evitar potencial recombinação entre genes no cromossomo e plasmídeo. A integridade da membrana, a produção de OMVs (101), a presença e a estabilidade de todas as características fenotípicas de cepas são minuciosamente investigadas. Os promotores regulados por açúcar ou SD ou códon de partida podem ser trocados para regular a produção de ligase de antígeno O, Fur, TolR in vitro para equilibrar a imunogenicidade e a atenuação (75) .

[00214] Construção de plasmídeos. Uma vez que todos os antigenos são expostos à superfície ou secretados, as

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118/168 sequências genéticas naturais são expressadas usando o vetor Asd⁺ letal equilibrado pYA3342 (Ptrc, pBR ori) (147) . A presença de RDPS irá reprimir a expressão genética do antígeno in vitro por arabinose, mas regular positivamente in vivo (180) . Um deslocamento para um plasmídeo de poucas cópias pYA3337 (Ptrc, pSClOl ori) (182) ou pYA3332 (Ptrc, pl5A ori) (183) é realizado se a superprodução levar a uma carga metabólica como indicado pelo crescimento significativamente mais lento.

[00215] Todos os genes, exceto fliC, são usados de acordo com a sua sequência natural. Um F1ÍC180 truncado, que elimina os 180 aminoácidos que codificam o domínio hipervariável específico de serovar antigenicamente variável do antígeno de flagelina, é usado para reduzir a indução de títulos de anticorpos para antígenos específicos de serovar e para aumentar a proteção cruzada contra domínio conservado de flagelina. A proteína F1ÍC180 retém as regiões N e C terminais conservadas que interagem com TLR5 para recrutar/estimular respostas imunológicas inatas (184, 185) e os epitopos de célula T dependentes de CD4 (186) . O antígeno individual é testado primeiro, seguido pelo teste de múltiplos antígenos usando plasmídeo que codifica vários antígenos como um operon (183, 187, 188) ou com múltiplos genes que são regulados independentemente (189-193). A mutação recF será incorporada para reduzir a recombinação entre os antígenos no plasmídeo (194).

[00216] Avaliação in vitro de RASVs que expressam genes de antígenos protetores. A capacidade das cepas de RASV para sintetizar e secretar antígeno protetor é analisada por conduzir estudos de fracionamento de células para

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119/168 determinar a quantidade de antígeno presente no citoplasma, frações de periplasma e sobrenadante por Western blot. As cepas são cultivadas em caldo Luria (LB) até uma ODgoo de 0,8 a 37 °C e centrifugadas. O fluido sobrenadante é guardado para análise de proteínas secretadas. As frações periplasmáticas e citoplasmáticas são preparadas por um método de choque osmótico com lisozima (147, 195, 196).

Volumes iguais de frações periplasmáticas, citoplasmáticas e de sobrenadantes e amostras de lisado total são analisadas através de Western blots sondadas com anticorpo correspondente. Experimentos de cultura de tecidos são realizados para avaliar a translocação de antígeno em linhagens de células semelhantes a macrófagos de camundongos, J774.A e/ou P388D1 por western blots e imunofluorescência (197-199).

[00217] Experimentos com animais. Camundongos fêmeas BALB/c, com seis a oito semanas de idade, são usados e alojados em contenção BSL2 com gaiolas cobertas com tampa de filtro. Experimentos típicos incluem grupos de quinze camundongos para desafio (repetir uma vez) (200) . Camundongos adicionais são usados para determinar a colonização e para colher baços para análises imunológicas. A colonização e a imunogenicidade são avaliadas para todas as construções que sintetizam antígenos protetores conservados em Salmonella.

[00218] Os camundongos são imunizados oralmente no dia 0 com uma dose de ~ 10⁹ UFC de RASVS, reforçados com a mesma dose 1 semana depois, e oralmente desafiados na semana 4 com 100 x LD50 de cepa de Salmonella virulenta de acordo com procedimentos padrão (200). LD50S de cepas do

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120/168 tipo selvagem são conhecidas ou são avaliadas. Morbidade e mortalidade são registradas diariamente. Primeiro, as cepas que portam cada antígeno individual com controle de PBS contra o desafio de S. enteritidis são comparadas. Se a proteção é observada neste teste, estudos subsequentes são feitos para determinar a proteção cruzada contra outros sorovares de Salmonella. Sangue, PP, fígado e baço são colhidos de camundongos desafiados para enumeração de Salmonella em tecidos para determinar a cinética de eliminação de Salmonella viável em função do tempo após o desafio e monitorar respostas imunológicas pós-desafio.

[00219] Medição de respostas imunológicas conferidas por RASVs sintetizando antígenos protetores. As respostas de IgG de soro e e de SigA de mucosa das lavagens vaginais em camundongos imunizados são avaliadas por ELISA usando antígenos protetores, OMPs, IROMPs e LPS de diferentes sorovares em 2 e 4 semanas, bem como títulos de IgGl e IgG2a para distinguir entre respostas Thl e Th2. Em 4 semanas após a imunização, as respostas de esplenócitos à estimulação com antígenos de Salmonella purificados ou Salmonella são determinadas para medição da imunidade de células T por ELISPOT para determinar o perfil de células T CD4 que produzem IL-4, IFN-γ e IL-17 (201) . Uma vez que a quantidade de IgA secretada obtida nas lavagens vaginais pode não refletir com precisão a resposta da mucosa no intestino, o número de células secretoras de IgA presentes na própria lâmina do intestino é medido por ELISPOT de IgA específico de antígeno. Os soros são coletados para ensaios de citocina usando um ensaio de multiplexação a 24, 48 e 72 horas após o desafio usando o Sistema de Arranjo de

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Proteína Bio-plex (BIO-RAD) de acordo com as instruções do fabricante (202) . As citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL17A, IFN-y, TNF-α, IL-21 e IL-23 são medidas como um resultado de coculturas dos linfócitos T com antígenos de Salmonella para determinar as vias de diferenciação de células T entre Thl/Th2/Thl7/Tfh usando um ensaio Bioplex (202-204). Especialmente, IL-Ιβ e IL-18 são monitoradas quanto à multiplicação bacteriana no fígado e no baço (41, 205, 206), TNF-α e IL-6 para citocinas induzidas por LPS (207, 208) . Citometria de fluxo é usada para determinar a distribuição das células B e T de memória em PBMCs e tecidos de camundongo (209, 210) e proliferação de células T por coloração com CFSE (211-218).

Exemplo 6: Construção e avaliação de cepas de S.Ertisidis de RASV do grupo D com síntese de antígeno O atrasada regulada por ramnose, síntese de cadeia lateral de antígeno O regulada por manose e produção de GMMA ou vesículas da membrana externa regulada por arabinose que sintetizam antígenos protetores in vivo.

[00220] Cepas de Enteritidis de RASV com as mesmas características dos antígenos protetores sintetizadores de Typhimurium de RASV serão construídas e avaliadas em paralelo com Typhimurium de RASV como uma estratégia complementar. Os vetores suicidas usados para S. Typhimurium podem ser usados para S. Enteritidis devido à alta homologia entre os dois sorovares. Como não há modelo animal para S. Typhi, este trabalho também facilita a tradução dos resultados para S. typhi porque ambos são de Salmonella do grupo D. Também pode ajudar a usar como vacina bivalente ou para imunização de primeira dosePetição 870190094140, de 20/09/2019, pág. 128/191

122/168 reforço contra a maioria das infecções por NTS (219) .

Construção de cepas de vacina contra o Enteritidis de RASV [00221] Estratégias similares são usadas para construir cepas de S. enteritidis com as mutações, HwaaL, APrhaBAD waaL, Hpmi, APf_Ur e APtoiR, derivadas de S. enteritidis χ3550, para gerar a cepa de vacina BI. Uma mutação APtoiR será adicionada à cepa χ12457, derivada da cepa χ3550 com as mutações HwaaL, APrhaBAD waaL, Hprni e APf_Ur, para gerar a cepa de vacina Bl. A virulência da cepa resultante é avaliada em camundongos BALB/c. Mutações para reduzir a toxicidade do lipídio A são introduzidas se a cepa ainda for virulenta (220, 221) . Provendo que a cepa é atenuada como esperado, os camundongos imunizados são desafiados oralmente com 10 0 x LD50 da cepa de S. Typhimurium tipo selvagem χ3761. Se a proteção é observada, estudos posteriores determinam a proteção cruzada contra outros sorovares de Salmonella. Assumindo que a cepa seja adequadamente atenuada e proveja alguma proteção, UrelA e o HasdA são introduzidos para gerar a cepa B2 para facilitar seu uso como vetor.

Avaliação in vitro do vetor de dispensação do antígeno de Enteritidis de RASV.

[00222] O melhor vetor do Exemplo 3 é introduzido na cepa B2. A cepa recombinante resultante é avaliada quanto à sintese do antígeno, estabilidade do plasmídeo e outros caracteres in vitro e in vivo essencialmente como descrito no Exemplo 3.

Experimentos em animais e medição de respostas imunológicas conferidas por antigenos protetores sintetizando Enteritidis de RASV.

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123/168 [00223] Procedimentos e testes similares são realizados como no Exemplo 3, exceto que S. Typhimurium será desafiado primeiro, e depois outros sorovares.

Exemplo 7. Desempenho melhorado de RASV contra enterite necrótica induzida por Clostridium perfringens em frangos de corte com cepas que exibem o fenótipo in vivo de lise atrasada regulada e outros atributos de sintese de antigeno protetor e atenuação dependentes de duas versus três propriedades reguladas por açúcar [00224] Para determinar os efeitos protetores de uma cepa bacteriana recombinante ou RASV compreendendo três sistemas de atributos reguláveis por açúcar versus dois sistemas de atributos reguláveis por açúcar, os seguintes experimentos foram realizados.

I. Imunogenicidade comparativa e imunidade protetora de χ11802 versus χ12341 [00225] Os frangos de corte foram imunizados por via oral com uma das seguintes cepas entéricas de Salmonella·.

[00226] χ11802 AP_murA25: : araC Pbad murA HasdA27::II araC Pbad c2 Apmi-2426 A(wza-wcaM) -8 ArelAl 98: : araC Pbad lad TT ÁrecF126 (fenótipos reguláveis por arabinose e manose) compreendendo pYA5112 (descrito em Jiang et al. (2015) Avian Diseases 59:475-85 (188), cujo conteúdo integral é aqui incorporado por referência) que codifica um operon para sintese de PlcC e uma fusão NetB como antigenos protetores de C. perfringens.

[00227] χ12341 AP_murA25::TT araC Pbad murA HasdA27::II araC Pbad c2 Apmi-2426 AwaaL46 ApagL64: : TT rhaRS PrhaBAD waaL Δ ( wza~ wcaM) — 8 HrelA197 ·. '.araC Pbad lacl TT ÁrecF126 ÁSÍfA2 6 (fenótipos reguláveis por arabinose, manose e ramnose)

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124/168 compreendendo pYA3681 como o vetor vazio de controle ou pYA5112 que codifica um operon para a síntese de PlcC e uma fusão NetB como antígenos protetores de C. perfringens.

[00228] O estudo consistiu em 48 gaiolas começando com 384 pintos. Os tratamentos foram replicados em 6 blocos de 8 gaiolas cada. O estudo começou quando as aves foram colocadas (dia da incubação) (PONTO 0), no momento em que foram alocadas às gaiolas experimentais. Nenhuma ave foi substituída durante o estudo.

Tabela 3. Grupos de Tratamento

Tratamento		Desafio Coccidial	Clostrídíum perfríngens	Gaio- las/ Trt
TI	Não medicado	PONTO 14	Não	8
T2	Não medicado	PONTO 14	PONTO 19,20 e 21	8
T3	Vacina 1*	PONTO 14	PONTO 19,20 e 21	8
T4	Vacina 2*	PONTO 14	PONTO 19,20 e 21	8
T5	χ12341 compreendendo pYA3681(Vetor de Controle)*	PONTO 14	PONTO 19,20 e 21	8
T6	BMD 50 g/t	PONTO 14	PONTO 19,20 e 21	8

* Gavagem oral no PONTO 0. Vacina 1: χ11802 (pYA5112);

Vacina 2: χ12341 (pYA5112)

Administração de ração Experimental [00229] Uma ração inicial de frango não medicado composto de artigos alimentícios comumente usados nos

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Estados Unidos foi formulado. A dieta foi representativa de uma formulação comercial local e as análises calculadas atenderam ou excederam os requisitos de ração inicial do frango NRC. A formulação da dieta foi incluída nos dados de origem. Alimentos experimentais foram preparados a partir desta ração inicial basal. Quantidades de todos os alimentos basais e artigos de teste usados para preparar lotes de tratamento foram documentados. Os alimentos de tratamento foram misturados para assegurar uma distribuição uniforme do respectivo artigo de teste. 0 misturador foi lavado para evitar contaminação cruzada. 0 alimento foi transferido para a Construção #2 e distribuído entre as gaiolas do mesmo tratamento. Na colocação, as aves foram alimentadas com as rações de tratamento. Esta administração de ração (na forma de massa) foi alimentada durante o estudo. 0 alimento foi pesado no PONTO 0 e a ração restante foi pesada no PONTO 14, 21 e 28.

Amostras de rações [00230] Um de cada início, meio e fim de cada lote de dieta de tratamento foi coletado e misturado para formar uma amostra compósita. Uma amostra foi retirada do compósito para cada tratamento e retida por um período de seis (6) meses após a conclusão do estudo para análise potencial de ração.

Animais [00231] Dia do nascimento, os pintos de corte machos foram obtidos de Cobb-Vantress, Cleveland, GA. A cepa era Cobb 500. A informação do floco reprodutor foi registrada. Na incubação, as aves foram sexadas e receberam vacinas de rotina. Apenas pintos com aparência saudável foram usados

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126/168 no estudo. Cada jaula começou com 8 pintos (PONTO 0). Todas as aves foram pesadas no PONTO 0, 14, 21 e 28.

Administração de cepa [00232] As cepas bacterianas foram administradas no PONTO 0 a cada pinto nos Grupos de Tratamento 3, 4 e 5 por gavagem oral com ~ 5x1O⁸ UFC/pinto em um volume de 0,1 mL. Indução de doença [00233] No PONTO 14, todas as aves foram inoculadas por via oral com ~ 5.000 oocistos de E. maxima.

[00234] A partir do PONTO 19 todas as aves (exceto tratamento 1) receberam um caldo de cultura de C. perfringens ~ 10⁸ UFC/ml. Não houve alimentação removida neste estudo. As aves foram administradas com 0,1 ml por gavagem oral de uma cultura de caldo fresco uma vez por dia durante 3 dias (em PONTOS 19, 20 e 21).

Crescimento do desafio de Clostridium perfringens [00235] A cepa de desafio usada foi Clostridium perfringens #6 (Hofacre, et al., 1998) (222) . Foi inoculado em um (1) litro de caldo de tioglicolato suplementado com extrato de carne 5% e incubado a 37°C por 15 horas.

Pontuação de Lesão Intestinal por Enterite Necrótica [00236] A classificação da lesão intestinal por enterite necrótica foi realizada como descrito em Hofacre, et al., 1998 (222) . No PONTO 21, três aves de cada gaiola quatro (4) horas após o terceiro desafio de Clostridium perfringens foram selecionadas, sacrificadas, pesadas e examinadas quanto ao grau de presença de lesões de Enterite Necrótica. A classificação foi baseada em uma classificação de 0 a 3, com 0 sendo normal e 3 sendo a mais grave.

Análise de dados

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127/168 [00237] Foram calculadas as análises estatísticas do ganho de peso da gaiola, consumo de ração, conversão de ração, classificações de lesão e mortalidade por NE. Os resultados do experimento são mostrados abaixo na Tabela 4.

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Tabela 4. Determinação do melhor genótipo de cepa de vacina

Conversão Ganho Conversão Ganho

Tratamentos	da Ração	de Peso DO-21	(kg) D14-21	da Ração	De Peso DO-28	(kg) D14-28	NE Lesões	% NE Mortalidade
DO-21	D14-21	DO-28	D14-28
1. Sem aditivo, Sem CP	2,054b	1,626c	0, 286a	0,164a	1,958b	1,706b	0,657a	0,535a	0, Od	0, 0a
2. Sem aditivo, CP 3.	2,585a	2,053ab	0, 226b	0,125b	2,241a	1,875ab	0,506b	0,405b	0, 9a	6, 3a
χ11802 (pYA5112),	2,340ab	2,093a	0,270ab	0,142ab	2,106ab	1,888a	0,627ab	0,499ab	0, 8a	6, 3a
CP
4 .
χ12341 (pYA5112),	2,161b	1,826bc	0,294a	0,154a	1,937b	1,698b	0,709a	0,570a	0, 3cd	0, 0a
CP 5. Vetor de Controle, CP	2,316ab	2,043ab	0,276ab	0,153a	2,060ab	1,854ab	0,649a	0,527a	0, 6ab	4, 7a
6. BMD 50 g/t, CP	2,235b	1,889ab	0,268ab	0, 152a	1,981b	1,742ab	0,642a	0,526a	0, 5bc	1, 6a
				•	a: b:	c: d:

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Tabela 5: Determinação do efeito of doses variáveis de RASV %12341(pYA5112)

Conversão Ganho Conversão

Ganho

NE % NE da Ração de Peso (kg) da Ração de Peso (kg)

Tratamentos	DO-21	D14-21	DO-21	D14-21	DO-28	D14-28	DO-28	D14-28	Lesões	Mortalidade
1. Sem	aditivo, Sem CP	1,714c	1,842d	0,509a	0,223a	1,807b	1,917c	0,710a	0,423a	0, lb	0, 0c
2 . Sem	aditivo, CP	2,329a	3,188a	0,354c	0,119e	2,210a	2,517a	0,501c	0,266d	0,4ab	15, 6a
3. Titulo	χ12341(pYA5112), Original, CP	2,264ab	2,197cd	0,399b	0,179b	2,164a	2,066bc	0,602b	0,382ab	0, 4a	1, 6bc
4 .	χ12341(pYA5112),
Título	Intermediário,	2,240ab	2,444bc	0,390bc	0, 149cd	2,121a	2,172bc	0,570bc	0,329bcd	0, 5a	1, 6bc
CP 5. título	χ12341(pYA5112), baixo, CP	2,386a	2,415bc	0,375bc	0, 159bcd	2,231a	2,134bc	0,571bc	0,355abc	0, 5a	6, 3b
6. Vetor de Controle, CP	2,307a	2,754b	0,378bc	0,137de	2,165a	2,286ab	0,537bc	0,296cd	0, 5a	4, 7bc
7 . BMD	50 g/t, CP	2,040b	2,142cd	0,407b	0,166bc	2,039a	2,098bc	0,591bc	0,351abc	0, 5a	1, 6bc

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130/168 [00238] Como mostrado na Tabela 4, χ12341 (pYA5112) foi superior a χ11802 (pYA5112) (e o vetor de controles e controles não imunizados) na eficiência de conversão de ração e ganho de peso e com menores classificações de lesão e mortalidade. II. Efeito de dose de RASV χ!2341 (pYA5112) [00239] Para avaliar o efeito da dosagem de RASV χ12341 (pYA5112), o seguinte experimento foi realizado usando baixo titulo (5 X 10⁷ UFC); titulo intermediário (1,5 x 10⁸UFC) ou o título original (como descrito acima; 5 x 10⁸UFC) da cepa bacteriana RASV χ12341 (pYA5112). Materiais e Métodos

A. Ração Experimental [00240] Foi formulado uma ração inicial de frango não medicado, composto com artigos alimentícios comumente usados nos Estados Unidos. A dieta foi representativa de uma formulação comercial local e as análises calculadas atenderam ou excederam os requisitos de ração inicial de frango NRC. Alimentos de tratamento experimentais foram preparados a partir desta ração inicial. Quantidades de todos os alimentos basais e artigos de teste usados para preparar lotes de tratamento foram documentados. As alimentações de tratamento foram misturadas para assegurar uma distribuição uniforme do respectivo artigo de teste. O misturador foi lavado para evitar contaminação cruzada. A ração foi dispensada entre gaiolas do mesmo tratamento. Esta administração de ração (na forma de massa) foi alimentada durante o estudo.

B. Animais [00241] No dia de incubação, os pintos de corte machos

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131/168 foram obtidos de Cobb-Vantress, Cleveland, GA. A cepa foi Cobb 500. A informação do floco reprodutor foi registrada. Na incubação, as aves foram sexadas e receberam vacinas de rotina. Apenas pintos com aparência saudável foram usados no estudo. A disposição de todas as aves não usadas para alocação foi documentada. Papéis ou suabes do fundo de todas as caixas de pintos foram cultivados para a presença de Salmonella.

Procedimentos

a. Alocação de aves e randomização de gaiolas [00242] O estudo começou quando as aves foram colocadas (dia da incubação) (PONTO 0), no momento em que foram alocados às gaiolas experimentais. Nenhuma ave foi substituída durante o estudo.

b. Administração de Vacina [00243] Cepas bacterianas foram administradas em PONTO 0 para cada pinto nos Grupos de Tratamento 3, 4, 5 e 6 por via oral com gavagem com ~ 5xl0⁸ UFC/pinto em um volume de 0,1 mL.

c. Pesos na gaiola [00244] Todas as aves foram pesadas no PONTO 0, 14, 21 e 28. A alimentação foi pesada no PONTO 0 e a alimentação restante foi pesada no PONTO 14, 21 e 28.

d. Indução de doença [00245] No PONTO 14, todas as aves foram inoculadas oralmente com ~ 5.000 oocistos de E. maxima. Começando em PONTO 19 todas as aves (exceto Tratamento 1) receberam um caldo de cultura de C. perfringens ~ 10⁸ UFC/ml. Nenhuma ração foi removida neste estudo. As aves foram administradas com 0,1 ml por gavagem oral de uma cultura de

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132/168 caldo fresco uma vez por dia durante 3 dias (em PONTOS 19, 20 e 21) .

e. Crescimento do desafio de Clostridium perfringens [00246] A cepa de desafio usada foi Clostridium perfringens #6 (como descrito em Hofacre, et al., 1998 (222)). Foi inoculado em um (1) litro de caldo de tioglicolato suplementado com extrato de carne a 5% e incubado a 37°C por 15 horas.

f. Classificação de Lesão Intestinal de Enterite Necrótica [00247] No PONTO 21, três aves de cada gaiola quatro (4) horas após o terceiro desafio de Clostridium perfringens foram selecionados, sacrificados, pesados e examinados para o grau de presença de lesões de enterite necrótica. A classificação foi baseada em uma classificação de 0 a 3, com 0 sendo normal e 3 sendo o mais grave. Todas as três aves com classificação de lesão foram sangradas para armazenamento de soro.

g. Análise de Dados e Resultados [00248] Análise estatística do ganho de peso da gaiola, consumo de ração, conversão de ração, classificações de lesão e mortalidade foram calculados. Os resultados do experimento são mostrados abaixo na Tabela 5. Como mostrado na Tabela 5, as doses de RASV original e intermediária foram superiores à dose baixa ou aos controles.

III. Efeito da via de imunização.

[00249] Para determinar o efeito da via de administração de RASV χ12341 (pYA5112), os pintos foram imunizados com uma dose alta (5 X 10⁸ UFC) ou dose média (1 X 10⁸ UFC) da cepa bacteriana χ 12341 (pYA5112) por sonda oral, pulverização ou por via oral (em água potável) .

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Resumidamente, no PONTO 0, cada pinto foi submetido oralmente a gavagem com 0,1 ml da cepa bacteriana, ~5xl0⁸UFC/pinto; No PONTO 14, todas as aves foram inoculadas oralmente com ~5.000 oocistos de E. maxima. Começando no PONTO 19 todas as aves (exceto Tratamento 1) receberam um caldo de C. perfringens (CP) ~10⁸ UFC/ml uma vez ao dia por 3 dias (nos PONTOS 19, 20 e 21). No PONTO 21, três aves de cada gaiola quatro (4) horas após o terceiro desafio de Clostridium perfringens foram examinadas quanto ao grau de presença de lesões de Enterite Necrótica. A classificação foi baseada em uma classificação de 0 a 3, com 0 sendo normal e 3 sendo o mais grave.

[00250] Como mostrado na Tabela 6, todas as rotas de imunização foram superiores ao grupo controle não vacinado. Além disso, o grupo de imunização por pulverização resultou em desempenho satisfatório em comparação com os grupos de gavagem oral. Isto é comercialmente importante, uma vez que a imunização por pulverização em incubadoras é o meio de imunização preferido e mais econômico para aves domésticas.

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Tabela 6: Efeitos da via de imunização de χ12341(pYA5112)

Tratamentos	Conversão de ração	Ganho de Peso (kg)	Conversão de ração	Ganho	NE Lesões	%NE Mortalidade
de Peso DO-28	(kg) D14-28
DO-21	D14-21	DO-21	D14-21	DO-28	D14-28
1. Sem aditivo, Sem CP	1,683d	1,883d	0,524a	0,240a	1,765c	1,937d	0,836a	0,552a	0, 0c	0,0c
2. Sem aditivo, CP	1,984a	2,729a	0,445bc	0,164d	2,212a	3,271a	0,635c	0,353c	0, 9a	40, 6a
3. χ12341(pYA5112)-Alta taxa de gavagem, CP	1,958ab	2,540ab	0,436c	0,172cd	1,975bc	2,361bc	0,664bc	0,400bc	0,7ab	20, 3b
4. χ12341(pYA5112)- Média taxa de gavagem, CP	1,814bcd	2,213c	0,468bc	0,191bc	1,835bc	2,115bcd	0,770ab	0,496ab	0,4bc	12,5bc
5. χ12341 (pYA5112)-Alta dose de pulverização, CP	1,905abc	2,493b	0,451bc	0,173bcd	1,855bc	2,189bcd	0,773ab	0,478ab	0, 9a	20, 3b
6. χ12341 (pYA5112)- Alta dose de H₂0 potável, CP	1,904abc	2,574ab	0,467bc	0,169cd	1,978b	2,508b	0,789a	0,491ab	0,8ab	20, 3b
7. BMD 50 g/t, CP	1,760cd	2,114c	0,487ab	0,197b	1,805bc	2,071cd	0,832a	0,542a	0,4bc	17,2b

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Exemplo 8. Incapacidade de concentrações altas de um açúcar para interferir com a capacidade de outros dois açúcares em baixas concentrações para regular genes necessários para a sobrevivência de cepas de RASV com a lise atrasada regulada em fenótipo in vivo [00251] χ12341 (pYA4763) tem um requisito obrigatório para que a arabinose sobreviva, uma vez que possui genes murA regulados por araC ParaBAD, no cromossomo e no plasmídeo pYA4763. Uma vez que o produto da enzima codificada pelo gene murA é fosforilado e uma vez que a Salmonella não pode absorver açúcares fosforilados, a cepa χ12341 (pYA4763) constitui uma construção letal dependente de arabinose. Assim, qualquer açúcar exógeno que bloquearia a capacidade da arabinose para ser absorvido por χ12341 (pYA4763) ou para causar a transcrição do gene murA por ativação do promotor ParaBAD resultaria em letalidade de células χ12341 (pYA4763). Determinar se a adição de altas concentrações (isto é, 1,0%) de qualquer um dos três açúcares usados por χ12341 (pYA4763) interfere nas atividades dos outros dois açúcares em concentrações mais baixas (isto é, 0,1% ou menos) para permitir a sobrevivência ou exibição do fenótipo regulado, os seguintes experimentos foram realizados. Os experimentos de crescimento foram realizados usando caldo roxo tamponado (para evitar qualquer alteração de pH devido à utilização de açúcar).

[00252] Resumidamente, o crescimento das cepas de Salmonella χ12341 (pYA4763) e χ3761 foi avaliado durante um período de 24 h em meio de crescimento com concentrações de açúcar variadas. Resumidamente, uma cultura durante a noite de cada cepa foi crescida em caldo roxo tamponado +

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136/168 arabinose 0,05% + ramnose 0,1% + manose 0,1%. Uma subcultura foi feita diluindo-se a 1:100 (Figuras. 6A, 6B, 6G, 6H, 6M e 6N) , 1:1.000 (Figuras. 6C, 6D, 61, 6J, 60 e 16P), ou 1:10.000 (Figuras. 6E, 6F, 6K, 6L, 6Q e 6R) em caldo roxo tamponado pré-aquecido com concentrações variadas de arabinose, ramnose e manose. 200 J_LL de cada cultura foi adicionada a um poço individual em uma placa de 100 poços em duplicata para cada cepa e condição de açúcar. A placa foi inserida no Sistema de Análise de Curva de Crescimento de Microbiologia Automatizada Bioscreen C a 37°C e foi deixada em incubação, com agitação, durante 24

h. As densidades ópticas foram medidas a cada 30 min e comparadas a um branco para confirmar a pureza. As figuras apresentam os dados com todas as condições (Figuras. 6A6F) , comparando as condições que tinham 1% de um dos três açúcares (Figuras. 6G-6L) e comparando várias concentrações de arabinose (Figuras. 6M-6R).

[00253] Como mostrado nas Figuras 6A-6R, a cepa bacteriana χ12341 (pYA47 63) cresce tão bem como a cepa de S. Typhimurium UK-1 tipo selvagem independente da presença de qualquer um açúcar a uma concentração de 1,0% e os outros dois açúcares a 0,1% ou concentrações mais baixas. Deve ser notado que o caldo Roxo é desprovido de todos os açúcares, de modo que não possa haver interferência nos resultados devido a vestígios de arabinose, manose ou ramnose. Estes resultados demonstram que altas concentrações de ramnose ou manose não inibem a capacidade de baixas concentrações de arabinose para causar expressão do gene murA uma vez que não foi observada morte celular.

[00254] A análise de Western blot pode ser realizada

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137/168 para analisar a expressão de genes que codificam produtos regulados por um dos promotores reguláveis por açúcar na cepa χ12341 (pYA4763).

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Derivado recombinante de uma bactéria patogênica, caracterizado pelo fato de compreender:

a. um primeiro gene regulado por um primeiro açúcar que confere um primeiro fenótipo;

b. um segundo gene regulado por um segundo açúcar que confere um segundo fenótipo; e

c. um terceiro gene regulado por um terceiro açúcar que confere um terceiro fenótipo;

em que o primeiro, segundo e terceiro fenótipos são selecionados do grupo que consiste em:

1. uma atenuação com atraso regulada;
2. uma expressão com atraso regulada de um antigeno de interesse;
3. uma Use com atraso regulada in vivo;
4. uma sintese regulada de antigeno 0;
5. uma sintese regulada de uma cadeia lateral de antigeno 0;
6. uma produção regulada de Módulos Generalizados para Antigenos de Membrana (GMMA);
7. sobrevida intensificada regulada para uma condição de estresse do hospedeiro; e
8. uma produção regulada de vesículas da membrana externa (OMVs).

2. Bactéria, de acordo com a reivindicação1, caracterizada pelo fato de cada um do primeiro açúcar,do segundo açúcar e do terceiro açúcar ser um açúcar diferente.

3. Bactéria, de acordo com a reivindicação2, caracterizada pelo fato de qualquer um do primeiro açúcar,

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2/13 do segundo açúcar ou do terceiro açúcar não interferir com a regulação de um gene regulado por um açúcar diferente.

4. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de o primeiro açúcar ser selecionado do grupo que consiste em arabinose, manose, xilose, galactose, ramnose e maltose.

5. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de o segundo açúcar ser selecionado do grupo que consiste em arabinose, manose, xilose, galactose, ramnose e maltose.

6. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de o terceiro açúcar ser selecionado do grupo que consiste em arabinose, manose, xilose, galactose, ramnose e maltose.

7. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de o primeiro gene ser operativamente ligado a um primeiro promotor regulável por açúcar.

8. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de o segundo gene ser operativamente ligado a um segundo promotor regulável por açúcar.
9. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de o terceiro gene ser operativamente ligado a um terceiro promotor regulável por açúcar.

10. Bactéria, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de um gene ser modificado para permitir uma sintese reversível de uma molécula contendo açúcar que confere um fenótipo regulável por açúcar.

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11. Bactéria, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de o gene modificado ser pmi. 12 . Bactéria, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de o gene modificado ser galE. 13. Bactéria, de acordo com qualquer uma das

reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de a bactéria ser uma bactéria Gram-negativa.

14. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de a bactéria pertencer à familia Enterobacteriaceae.

15. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de o fenótipo ser atenuação com atraso regulada, e o gene que confere o fenótipo ser fur.

16. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de o fenótipo ser expressão com atraso regulada de um antigeno de interesse, e o gene que confere o fenótipo codifica um

antigeno de interesse. 17 . Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de o fenótipo ser a lise com atraso regulada in vivo, em que a lise é permitida para ocorrer em um citosol devido à mutação > em um gene sifA. 18 . Bactéria, de acordo com qualquer uma das

reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de o fenótipo ser uma sintese regulada de antigeno 0, e o gene que confere o fenótipo ser selecionado do grupo que consiste em waaG, rfaH, waaJ, wbaP, wzy, waaP, waaO, waaF, waaP, waaC, waaA, waaL e wbaP.

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19. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de o fenótipo ser a produção de Módulos Generalizados para Antigenos de Membrana (GMMA) ou vesículas de membrana externa, e o gene que confere o fenótipo ser selecionado do grupo que consiste em ybgC, tolQ, tolA, tolR, tolB, pai e ybgF.

20 . Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de o fenótipo ser uma síntes e regulada da cadeia lateral de antígeno 0, e o gene que confere o fenótipo é tolR. 21. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de o primeiro fenótipo ser síntese de antígeno 0 regulada c 3 o segundo fenótipo ser produção de GMMA ou de vesículas da membrana externa. 22 . Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de a bactéria compreender adicionalmente um gene que codifica um antígeno de interesse não operativamente ligado a um promotor regulável por açúcar. 23. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de a bactéria compreender uma eliminação de um gene endógeno de síntese < de antígeno 0 I 24 . Bactéria, de acordo com a reivindicação 23,

caracterizada pelo fato de a eliminação no gene endógeno de síntese de antígeno 0 compreender uma eliminação parcial do gene.

25. Bactéria, de acordo com a reivindicação 23,

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5/13 caracterizada pelo fato de a eliminação no gene endógeno de síntese de antígeno 0 compreender uma eliminação de comprimento total do gene.

26. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizada pelo fato de o gene de síntese de antígeno 0 ser waaL ou wbaP.

27. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo fato de a bactéria compreender uma eliminação em um gene endógeno de fosfomanose isomerase.

28. Bactéria, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de a eliminação no gene endógeno de fosfomanose isomerase compreender uma eliminação parcial do gene.

29. Bactéria, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de a eliminação no gene endógeno de fosfomanose isomerase compreende uma eliminação de comprimento total do gene.

30. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizada pelo fato de o gene da fosfomanose isomerase ser pmi.

31. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizada pelo fato de a bactéria compreender uma eliminação em um gene endógeno do sistema tol-pal.

32. Bactéria, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de a eliminação no gene endógeno do sistema tol-pal compreender uma eliminação parcial do gene.

33. Bactéria, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de a eliminação no gene endógeno do

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6/13 sistema tol-pal compreender uma eliminação de comprimento total do gene.

34. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizada pelo fato de o gene endógeno do sistema tol -pal ser selecionado do grupo que consiste em ybgC, tolQ, tolA, tolR, tolB, pal e ybgF. 35. Bactéria, de acordo com qualquer uma das

reivindicações 1 a 34, caracterizada pelo fato de o primeiro gene, o segundo gene e/ou o terceiro gene ser(em) localizado(s) em um plasmideo na bactéria.

36. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizada pelo fato de o primeiro gene, o segundo gene e/ou o terceiro gene ser(em) localizado(s) em um cromossomo na bactéria.

37. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de o primeiro, o segundo ou o terceiro promotor regulável por açúcar ser um promotor regulável por ramnose.

38. Bactéria, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de o promotor regulável por ramnose é P rhaBAD rhaSR.

39. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de o primeiro, o segundo ou o terceiro promotor regulável por açúcar ser um promotor regulável por arabinose.

40. Bactéria, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de o promotor regulável por arabinose ser araC ParaBAD.

41. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizada pelo fato de

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7/13 compreender adicionalmente uma eliminação em um gene relA endógeno.

42. Bactéria, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de a eliminação do gene relA endógeno ser uma eliminação parcial do gene.

43. Bactéria, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de a eliminação do gene relA endógeno ser uma eliminação de comprimento total do gene.

44. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um ácido nucleico que codifica um repressor Lacl.

45. Bactéria, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de o repressor Lacl ser codificado por um gene lacl.

46. Bactéria, de acordo com a reivindicação 44 ou 45, caracterizada pelo fato de o ácido nucleico que codifica o repressor Lacl ser localizado em um plasmídeo na bactéria.

47. Bactéria, de acordo com a reivindicação 44 ou 45, caracterizada pelo fato de o ácido nucleico que codifica o repressor Lacl ser localizado em um cromossomo na bactéria.

48. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente uma eliminação em um promotor Pfur endógeno.

49. Bactéria, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de o gene fur ser operativamente ligado a um promotor regulável por arabinose.

50. Bactéria, de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de o gene fur ser localizado em um

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8/13 plasmídeo na bactéria.

51. Bactéria, de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de o gene fur ser localizado em um cromossomo na bactéria.

52. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 51, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente uma eliminação no gene que codifica uma aspartato semialdeído desidrogenase.

53. Bactéria, de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de o gene que codifica o aspartato semialdeído desidrogenase compreende um gene asd.

54. Bactéria, de acordo com a reivindicação 52 ou 53, caracterizada pelo fato de o gene que codifica o aspartato semialdeído desidrogenase compreender um gene asdA.

55. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 54, caracterizada pelo fato de o gene que codifica o antígeno de interesse ser localizado em um plasmídeo na bactéria.

56. Bactéria, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de o plasmídeo compreender adicionalmente um ácido nucleico que codifica uma aspartato semialdeído desidrogenase.

57. Bactéria, de acordo com a reivindicação 56, caracterizada pelo fato de o aspartato semialdeído desidrogenase compreende AsdA.

58. Plasmídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 57, caracterizada pelo fato de o plasmídeo ser um plasmídeo com baixo número de cópias.

59. Plasmídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 57, caracterizada pelo fato de o

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9/13 plasmídeo ser um plasmídeo de alto número de cópias.

60. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 59, caracterizada pelo fato de o plasmídeo ser selecionado do grupo que consiste em pYA4589, pYA4595, pYA4763, pG8R15, pG8R16, pG8R17, pG8R18, pGRlll, pG8R112, pG8R113 e pG8R114.

61. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60, caracterizada pelo fato de o gene que codifica o antígeno de interesse ser localizado em um cromossomo na bactéria.

62. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 61, caracterizada pelo fato de a bactéria compreender adicionalmente uma eliminação em um gene pagL.

63. Bactéria, de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de a eliminação do gene pagL é uma eliminação parcial do gene.

64. Bactéria, de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de a eliminação do gene pagL ser uma eliminação de comprimento total do gene.

65. Bactéria, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de compreender a mutação de LwaaL/LpagL: : TT rhaSR PrhaBAD waaL.

66. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de a bactéria compreender adicionalmente um antígeno de interesse operativamente ligado a um promotor regulável por repressor.

67. Bactéria, de acordo com a reivindicação 66, caracterizada pelo fato de o promotor ser um promotor

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10/13 regulável por lactose.

68. Bactéria, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de o promotor regulável por lactose ser um promotor regulável por LacI.

69. Bactéria, de acordo com a reivindicação 65 ou 66, caracterizada pelo fato de o promotor regulável por LacI ser selecionado do grupo que consiste em Ptrc, Piac, Pz/iac, Ptac, P ompA lacO e PIpp lacO.

70. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 69, caracterizada pelo fato de o antigeno de interesse ser um antígeno derivado de um agente infeccioso.

71. Bactéria, de acordo com a reivindicação 70, caracterizada pelo fato de o antígeno de interesse ser derivado de um agente infeccioso selecionado do grupo consistindo em um vírus, uma bactéria, um protozoário, um prion, um fungo e um helminto. 72. Bactéria, de acordo com a reivindicação 71, caracterizada pelo fato de o antígeno de interesse ser derivado de uma bactéria. 73. Bactéria, de acordo com a reivindicação 72,

caracterizada pelo fato de o antígeno de interesse ser um antígeno de Salmonella.

74. Bactéria, de acordo com a reivindicação 73, caracterizada pelo fato de o antígeno de Salmonella ser selecionado do grupo FliC, F1ÍC180, OmpC, OmpD, OmpF, SseB e Ssel.

75. Bactéria, de acordo com a reivindicação 71, caracterizada pelo fato de o referido antígeno de interesse ser um antígeno de uma bactéria Clostridium.

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76. Bactéria, de acordo com a reivindicação 75, caracterizada pelo fato de o referido antígeno ser um antígeno de C. perfringens.

77. Bactéria, de acordo com a reivindicação 76, caracterizada pelo fato de o referido antígeno compreender NetB, PlcC, fragmentos antigênicos do mesmo, proteínas de fusão compreendendo os referidos antígenos, ou proteínas de fusão compreendendo fragmentos antigênicos de antígenos.

78. Bactéria, de acordo com a reivindicação 71, caracterizada pelo fato de o antígeno de interesse ser um antígeno viral.

79. Bactéria, de acordo com a reivindicação 78, caracterizada pelo fato de o antígeno de interesse ser um antígeno de influenza.

80. Bactéria, de acordo com a reivindicação 79, caracterizada pelo fato de o antígeno de influenza ser hemaglutinina ou neuraminidase.

81. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 69, caracterizada pelo fato de o antígeno de interesse ser um antígeno associado a câncer.

82. Bactéria, de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pelo fato de o antígeno associado a câncer ser selecionado do grupo que consiste em MAGE-A, MAGE-C1, BAGE, GAGE, CAGE, XAGE, NY-ESO1, LAGE1 e survivina.

83. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 82, caracterizada pelo fato de o referido antígeno ser um antígeno de proteína codificado por um códon de sequência de ácido nucleico otimizado para expressão na referida bactéria.

84. Bactéria, de acordo com qualquer uma das

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12/13 reivindicações 1 a 83, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente uma eliminação em um gene sifA.

85. Bactéria, de acordo com a reivindicação 84, caracterizada pelo fato de a eliminação do gene sifA ser uma eliminação parcial do gene.

86. Bactéria, de acordo com a reivindicação 84, caracterizada pelo fato de a eliminação do gene sifA ser uma eliminação de comprimento total do gene.

87. Bactéria, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de o gene sifA ser operativamente ligado a um promotor regulável por arabinose.

88. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 87, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente uma eliminação em um gene recF.

89. Bactéria, de acordo com a reivindicação 88, caracterizada pelo fato de a eliminação do gene recF ser uma eliminação parcial do gene.

90. Bactéria, de acordo com a reivindicação 88, caracterizada pelo fato de a eliminação do gene recF ser uma eliminação de comprimento total do gene.

91. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 90, caracterizada pelo fato de adicionalmente uma eliminação em um gene recJ.

92. Bactéria, de acordo com a reivindicação 91, caracterizada pelo fato de a eliminação do gene recJ ser uma eliminação parcial do gene.

93. Bactéria, de acordo com a reivindicação 91, caracterizada pelo fato de a eliminação do gene recJ ser uma eliminação de comprimento total do gene.

94. Bactéria, de acordo com qualquer uma das

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13/13 reivindicações 1 a 93, caracterizada pelo fato de a bactéria ser do gênero Salmonella.

95. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 94, caracterizada pelo fato de a bactéria ser uma bactéria Salmonella enterica.

96. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 95, caracterizada pelo fato de a bactéria ser uma bactéria Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A, uma bactéria Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis, uma bactéria Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi, uma bactéria Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin, ou Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis.

97. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender a bactéria recombinante, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 96, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

98. Método para induzir uma resposta imunológica contra um antigeno de interesse em um indivíduo, o método caracterizado pelo fato de compreender administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 97.