BR112019014707A2

BR112019014707A2 - peptídeo mimético apoc-ii isolado, composição farmacêutica, e, métodos para tratar hipertrigliceridemia e para fabricar o peptídeo.

Info

Publication number: BR112019014707A2
Application number: BR112019014707A
Authority: BR
Inventors: Thomas Remaley Alan; Wolska Anna; Lo Chih-Hung; O Sviridov Denis; N Devalaraja Madhav; Shanker Ghosh Soumitra
Original assignee: Corvidia Therapeutics Inc; The Us Secretary Department Of Health & Human Services
Priority date: 2017-01-19
Filing date: 2018-01-19
Publication date: 2020-04-07
Also published as: CN110831957A; IL268093A; WO2018136803A8; TW202130652A; US11827690B2; EP3571216A1; US20200140522A1; TWI788323B; JP2023116739A; SG11201906422VA; JP2020511425A; SG10201911974UA; US20210324043A1; CN110831957B; IL279831A; NZ755599A; JP7353973B2; MX2019008529A; AU2018210404B2; KR20190121305A

Abstract

a divulgação provê peptídeos miméticos de apolipoproteína c-ii (apoc-ii) e métodos para tratar hipertrigliceridemia em um paciente com uma quantidade eficaz de um peptídeo mimético de apoc-ii.

Description

PEPTÍDEO MIMÉTICO APOC-II ISOLADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODOS PARA TRATAR HIPERTRIGLICERIDEMIA E PARA FABRICAR O PEPTÍDEO DECLARAÇÃO CONCERNENTE À PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADOS PELO GOVERNO FEDERAL [001] Esta invenção foi criada na execução do Acordo Cooperativo de Pesquisa e Desenvolvimento No. HL-CR-16-005 com o National Institutes of Health, uma Agência do Department of Health and Human Services. O Governo dos Estados Unidos tem certos direitos nesta invenção.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA [002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi submetida por intermédio de EFS-Web e é aqui por meio deste incorporada por referência na sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada no Mês XX, 2018, é denominada XXXXXUS_sequencelisting.txt, e tem X.XXX.XXX bites no tamanho.

FUNDAMENTOS [003] A hipertrigliceridemia é tipicamente definida como níveis séricos de triglicerídeo acima de 150 mg/dL (Berglund et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 97: 2969-2989, 2012). Pacientes com aumentos moderados nos triglicerídeos estão em risco para doença cardiovascular (Budoff, Am J Cardiol 118: 138-45, 2016). Pacientes com hipertrigliceridemia severa estão adicionalmente em risco para pancreatite aguda (Viljoen e Wierzbicki, Expert Rev Cardiovasc Ther 10: 505-514, 2012).

[004] A hipertrigliceridemia é mais habitualmente secundária à obesidade, diabete melito, gravidez, álcool e uma ampla variedade de fármacos (Anderson et al., Pancreatology 9: 252-257, 2009; DominguezMunoz et al., Int. J. Pancreatol. 10: 261-267, 1991). Os triglicerídeos são

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2/95 enriquecidos em quilomícrons e lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL), e a lipólise pela lipoproteína lipase (LPL) é uma etapa crítica no catabolismo destas partículas de lipoproteína ricas em triglicerídeo. Raramente, a hipertrigliceridemia é o resultado de defeitos genéticos na LPL ou apoC-II, um ativador obrigatório de LPL (Fojo et al., J. Intern. Med. 231: 669-677, 1992) ou em outros genes.

[005] Fibratos e suplementos ricos em ácidos graxos ômega-3 poliinsaturados, tais como óleos de peixe, são o tratamento principal para hipertrigliceridemia (Berglund et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 97: 29692989, 2012). Entretanto, não foi claramente demonstrado que estes agentes fossem eficazes na diminuição dos riscos associados com triglicerídeos elevados, tais como doença cardiovascular (Budoff, Am J Cardiol 118: 13845, 2016).

[006] Existe, portanto, uma necessidade quanto a novos agentes terapêuticos para o tratamento de hipertrigliceridemia, tanto as formas comuns de hipertrigliceridemia quanto a hipertrigliceridemia causada pelos defeitos genéticos.

SUMÁRIO [007] Nós planejamos e produzimos peptídeos miméticos de apoC-II que possuem a capacidade para diminuir o nível de triglicerídeo tanto in vitro quanto in vivo. Estes peptídeos podem ser usados para tratar hipertrigliceridemia.

[008] Nas modalidades típicas, o peptídeo mimético de apoC-II é um peptídeo multihelicoidal em que um ou mais dos domínios helicoidais é anfipático, conferindo ao peptídeo a capacidade de ligar aos lipídeos e/ou à superfície das lipoproteínas, e um outro dos domínios helicoidais ativa a LPL. Em certas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II é um peptídeo bihelicoidal compreendendo um primeiro domínio helicoidal, uma região de dobradiça, e um segundo domínio helicoidal na ordem do terminal N para o

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3/95 terminal C, em que o primeiro domínio helicoidal é anfipático e o segundo domínio helicoidal ativa a LPL. Nós verificamos que uma variedade de hélices anfipáticas é adequada, com algumas modeladas em hélices anfipáticas de apolipoproteínas conhecidas, tal como apoC-II. Nós também verificamos que a capacidade dos peptídeos de diminuir os triglicerídeos não é limitada à ativação da LPL, permitindo seu uso em distúrbios nos quais o LPL é diminuído ou ausente, e que que esse possa deslocar a apoC-III da superfície das lipoproteínas, permitindo seu uso em distúrbios em que os níveis de apoC-III são elevados.

[009] Portanto, em um primeiro aspecto, é aqui fornecido um peptídeo mimético de apoC-II isolado de não mais do que 50 aminoácidos, compreendendo do terminal N para o terminal C: um primeiro domínio helicoidal, uma região de dobradiça, e um segundo domínio helicoidal, em que o primeiro domínio helicoidal é anfipático, em que o peptídeo mimético de apoC-II não é um peptídeo da SEQ ID NO: 56.

[0010] Em algumas modalidades, o primeiro domínio do peptídeo mimético de apoC-II isolado é hélice nativa 1 de apoC-II. Em outras modalidades, o primeiro domínio do peptídeo mimético de apoC-II isolado é uma variante da hélice 1 de apoC-II. Em algumas modalidades, o primeiro domínio do peptídeo mimético de apoC-II isolado é a hélice nativa 2 de apoCII. Em outras modalidades, o primeiro domínio do peptídeo mimético de apoC-II isolado é uma variante da hélice 2 de apoC-II.

[0011] Em algumas modalidades, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende alongamento da hélice 2 de apoC-II. Em várias modalidades, a hélice 2 de apoC-II é alongada em 1 a 10 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é alongada em 1 aminoácido no terminal N. Em algumas destas modalidades, o aminoácido é ácido aspártico. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é alongada em 2 aminoácidos no terminal N. Em algumas destas modalidades, os aminoácidos são lisina e

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4/95 alanina do terminal N para o terminal C. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é alongada em 5 aminoácidos no terminal N. Em algumas destas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é alongada na sequência de aminoácidos nativa a montante de apoC-II humana, ou uma mutante da sequência de aminoácidos nativa a montante de apoC-II humana. Nas modalidades específicas, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende um ácido aspártico na posição 40. Nas modalidades específicas, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende uma tirosina ou um triptofano na posição 41. Nas modalidades específicas, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende uma leucina na posição 42. Nas modalidades específicas, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende uma lisina ou uma arginina na posição 43. Nas modalidades específicas, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende uma alanina ou um ácido glutâmico na posição 44. Nas modalidades particulares, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende um ácido aspártico na posição 40, uma tirosina na posição 41, uma leucina na posição 42, uma lisina na posição 43, e um ácido glutâmico na posição 44.

[0012] Em algumas modalidades, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende a truncamento da hélice 2 de apoC-II. Em algumas destas modalidades, os resíduos dos aminoácidos de 45 a 46 da hélice nativa 2 de apoC-II são excluídos. Em algumas destas modalidades, os resíduos dos aminoácidos de 45 a 48 da hélice nativa 2 de apoC-II são excluídos. Em algumas destas modalidades, os resíduos dos aminoácidos de 45 a 49 da hélice nativa 2 de apoC-II são excluídos. Em algumas destas modalidades, os resíduos dos aminoácidos de 45 a 50 da hélice nativa 2 de apoC-II são excluídos. Em algumas destas modalidades, os resíduos dos aminoácidos de 45 a 53 da hélice nativa 2 de apoC-II são excluídos.

[0013] Em algumas modalidades, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende pelo menos uma mutação da hélice 2 de apoC-II. Em algumas destas modalidades, a mutação é uma substituição de aminoácido. Em certas

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5/95 modalidades, um aminoácido original da hélice 2 de apoC-II é substituído por um aminoácido natural. Em certas modalidades, um aminoácido original da hélice 2 de apoC-II é substituído por um aminoácido não natural. Em certas modalidades, um aminoácido original da hélice 2 de apoC-II é substituído por um análogo de aminoácido. Nas modalidades específicas, a substituição de aminoácido está na posição 45. Em algumas destas modalidades, a valina na posição 45 é substituída por fenilalanina. Nas modalidades específicas, a substituição de aminoácido está na posição 46. Em algumas destas modalidades, o ácido aspártico na posição 46 é substituído por uma fenilalanina. Em algumas destas modalidades, o ácido aspártico na posição 46 é substituído por uma lisina. Em algumas destas modalidades, o ácido aspártico na posição 46 é substituído por um ácido aminoisobutírico. Nas modalidades específicas, a substituição de aminoácido está na posição 48. Em algumas destas modalidades, a lisina na posição 48 é substituída por uma arginina. Nas modalidades específicas, a substituição de aminoácido está na posição 49. Em algumas destas modalidades, a leucina na posição 49 é substituída por uma lisina. Nas modalidades específicas, a substituição de aminoácido está na posição 50. Em algumas destas modalidades, a arginina na posição 50 é substituída por uma lisina. Nas modalidades específicas, a substituição de aminoácido está na posição 53. Em algumas destas modalidades, a tirosina na posição 53 é substituída por uma leucina. Nas modalidades específicas, a substituição de aminoácido está na posição 54. Em algumas destas modalidades, a serina na posição 54 é substituída por um ácido glutâmico. Em algumas destas modalidades, a serina na posição 54 é substituída por uma lisina. Em algumas destas modalidades, a serina na posição 54 é substituída por um ácido aspártico. Nas modalidades específicas, a substituição de aminoácido está na posição 55. Em algumas destas modalidades, a lisina na posição 55 é substituída por uma arginina. Nas modalidades específicas, a substituição de aminoácido está na posição 56. Em

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6/95 algumas destas modalidades, a serina na posição 56 é substituída por uma fenilalanina. Em algumas destas modalidades, a serina na posição 56 é substituída por uma lisina. Em algumas destas modalidades, a serina na posição 56 é substituída por uma alanina. Em algumas destas modalidades, a serina na posição 56 é substituída por um ácido aminoisobutírico. Nas modalidades específicas, a substituição de aminoácido está na posição 57. Em algumas destas modalidades, a treonina na posição 57 é substituída por uma fenilalanina. Nas modalidades específicas, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende três substituições de aminoácido, em que as substituições de aminoácido estão na posição 46, posição 54, e posição 56. Em algumas destas modalidades, o ácido aspártico na posição 46 é substituído por uma fenilalanina, a serina na posição 54 é substituída por um ácido glutâmico, e a serina na posição 56 é substituída por uma fenilalanina.

[0014] Em algumas modalidades, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende pelo menos uma modificação química. Em certas modalidades, a modificação química é uma ligação covalente de um ácido graxo. Em várias modalidades, o ácido graxo compreende de 4 a 26 carbonos. Nas modalidades

específicas,	ácido graxo	compreende	10 carbonos.	Nas	modalidades
específicas,	ácido graxo	compreende	12 carbonos.	Nas	modalidades
específicas,	ácido graxo	compreende	14 carbonos.	Nas	modalidades
específicas,	ácido graxo	compreende	16 carbonos.	Nas	modalidades
específicas,	ácido graxo	compreende	18 carbonos.	Nas	modalidades

ácido graxo compreende 20 carbonos. Em algumas o

específicas, modalidades, o ácido graxo é saturado. Em certas modalidades, o ácido graxo é insaturado. Em certas modalidades, o ácido graxo é ligado ao aminoácido de terminal N. Em algumas modalidades, o ácido graxo é ligado a um grupo lateral de aminoácido. Em certas modalidades, o ácido graxo é ligado à εamina de um resíduo de lisina.

[0015] Em algumas modalidades, a região de dobradiça do peptídeo

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7/95 mimético de apoC-II isolado compreende de 5 a 10 aminoácidos. Em certas modalidades, a região de dobradiça compreende 7 aminoácidos. Nas modalidades específicas, a região de dobradiça compreende uma prolina. Em algumas destas modalidades, a região de dobradiça compreende uma prolina na posição 58. Nas modalidades específicas, a região de dobradiça compreende uma alanina. Em algumas destas modalidades, a região de dobradiça compreende uma alanina na posição 58. Nas modalidades específicas, a região de dobradiça compreende uma norleucina. Em algumas destas modalidades, a região de dobradiça compreende uma norleucina na posição 60. Nas modalidades específicas, a região de dobradiça compreende uma lisina. Em algumas destas modalidades, a região de dobradiça compreende uma lisina na posição 60. Nas modalidades específicas, a região de dobradiça compreende uma valina. Em algumas destas modalidades, a região de dobradiça compreende uma valina na posição 60. Nas modalidades específicas, a região de dobradiça compreende uma leucina. Em algumas destas modalidades, a região de dobradiça compreende uma leucina na posição 60. Nas modalidades específicas, a região de dobradiça compreende uma metionina. Em algumas destas modalidades, a região de dobradiça compreende uma metionina na posição 60.

[0016] Em algumas modalidades, a região de dobradiça compreende pelo menos uma modificação química. Em certas modalidades, a modificação química é uma ligação covalente de um ácido graxo. Em várias modalidades, o ácido graxo compreende de 4 a 26 carbonos. Nas modalidades específicas, o ácido graxo compreende 10 carbonos. Nas modalidades específicas, o ácido graxo compreende 12 carbonos. Nas modalidades específicas, o ácido graxo compreende 14 carbonos. Nas modalidades específicas, o ácido graxo compreende 16 carbonos. Nas modalidades específicas, o ácido graxo compreende 18 carbonos. Nas modalidades específicas, o ácido graxo compreende 20 carbonos. Em algumas modalidades, o ácido graxo é saturado.

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8/95

Em outras modalidades, o ácido graxo é insaturado. Em certas modalidades, o ácido graxo é ligado a um grupo lateral de aminoácido. Em certas modalidades, o ácido graxo é ligado à ε-amina de um resíduo de lisina.

[0017] Em várias modalidades, a região de dobradiça permite que o primeiro domínio helicoidal e o segundo domínio helicoidal retenham uma configuração quase reta, em que o segundo domínio se afasta do primeiro domínio em um ângulo de não mais do que cerca de 20°.

[0018] Em algumas modalidades, o segundo domínio do peptídeo mimético de apoC-II isolado é uma hélice nativa 3 de apoC-II. Em outras modalidades, o segundo domínio do peptídeo mimético de apoC-II isolado é uma variante da hélice 3 de apoC-II.

[0019] Em algumas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende alongamento da hélice 3 de apoC-II. Em várias modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 1 a 10 aminoácidos no terminal C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 4 aminoácidos no terminal C. Nas modalidades específicas, a hélice 3 de apoC-II é alongada em aminoácidos lisina, glicina, ácido glutâmico, e ácido glutâmico do terminal N para o terminal C.

[0020] Em algumas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende pelo menos uma mutação da hélice 3 de apoC-II. Em algumas destas modalidades, a mutação é uma substituição de aminoácido. Em certas modalidades, um aminoácido original da hélice 3 de apoC-II é substituído por um aminoácido natural. Em certas modalidades, um aminoácido original da hélice 3 de apoC-II é substituído por um aminoácido não natural. Em certas modalidades, um aminoácido original da hélice 3 de apoC-II é substituído por um análogo de aminoácido. Nas modalidades específicas, a substituição de aminoácido está na posição 70. Em algumas destas modalidades, a glutamina na posição 70 é substituída por uma arginina. Em algumas destas modalidades, a glutamina na posição 70 é substituída por uma lisina.

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9/95 [0021] Em algumas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende pelo menos uma modificação química. Em certas modalidades, a modificação química é uma ligação covalente de um ácido graxo. Em várias modalidades, o ácido graxo compreende de 4 a 26 carbonos. Nas modalidades

ácido graxo compreende o

carbonos. Em algumas ácido graxo é saturado. Em outras modalidades, o ácido graxo específicas, modalidades, o é insaturado. Em certas modalidades, o ácido graxo é ligado ao aminoácido de terminal C. Em certas modalidades, o ácido graxo é ligado a um grupo lateral de aminoácido. Em certas modalidades, o ácido graxo é ligado ao ε-amina de um resíduo de lisina. Em certas modalidades, o aminoácido de terminal C é modificado por uma amida de terminal C.

[0022] Em várias modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado compreende ainda uma etiqueta de purificação. Em algumas destas modalidades, a etiqueta de purificação é uma etiqueta de poli-histidina, uma etiqueta de myc, ou uma etiqueta de HA.

[0023] Em várias modalidades, o primeiro domínio do peptídeo mimético de apoC-II tem uma afinidade para a ligação às lipoproteínas. Em várias modalidades, o segundo domínio é capaz de ativar lipoproteína lipase (LPL). Em algumas modalidades, o peptídeo é capaz de ativar lipólise pela LPL. Em algumas modalidades, o peptídeo é capaz de deslocar apoC-III em lipoproteínas. Em algumas modalidades, o peptídeo é capaz de reduzir o nível de triglicerídeo (TG) in vivo. Em algumas destas modalidades, o peptídeo é capaz de reduzir o nível de TG elevado causado pela deficiência de LPL. Em algumas destas modalidades, o peptídeo é capaz de reduzir o nível de TG

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10/95 elevado causado pela apoC-III elevada. Em algumas destas modalidades, o peptídeo é capaz de reduzir o nível de TG elevado causado pela deficiência de apoC-II. Em algumas destas modalidades, o peptídeo é capaz de reduzir nível pós-prandial de TG elevado.

[0024] Nas modalidades específicas, o peptídeo tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6.

[0025] Nas modalidades específicas, o peptídeo tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9.

[0026] Em um outro aspecto, é aqui fornecido um peptídeo mimético de apoC-II isolado de não mais do que 30 aminoácidos, consistindo de uma variante da hélice 3 de apoC-II.

[0027] Em algumas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende o alongamento da hélice 3 de apoC-II. Em várias modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 1 a 10 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 6 aminoácidos no terminal N. Nas modalidades específicas, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende uma lisina ou metionina na posição 60. Em várias modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 1 a 10 aminoácidos no terminal C. Em algumas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 4 aminoácidos no terminal C. Nas certas específicas, a hélice 3 de apoC-II é alongada em aminoácidos lisina, glicina, ácido glutâmico, e ácido glutâmico do terminal N para o terminal C.

[0028] Em algumas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende pelo menos uma mutação da hélice 3 de apoC-II. Em algumas destas modalidades, a mutação é uma substituição de aminoácido. Em certas modalidades, um aminoácido original da hélice 3 de apoC-II é substituído por um aminoácido natural. Em certas modalidades, um aminoácido original da hélice 3 de apoC-II é substituído por um aminoácido não natural. Em certas modalidades, um aminoácido original da hélice 3 de apoC-II é substituído por

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11/95 um análogo de aminoácido.

[0029] Em algumas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende pelo menos uma modificação química. Em certas modalidades, a modificação química é uma ligação covalente de um ácido graxo. Em várias modalidades, o ácido graxo compreende de 4 a 26 carbonos. Nas modalidades

específicas,	ácido graxo compreende	10 carbonos. Nas modalidades
específicas,	ácido graxo compreende	12 carbonos. Nas modalidades
específicas,	ácido graxo compreende	14 carbonos. Nas modalidades
específicas,	ácido graxo compreende	16 carbonos. Nas modalidades
específicas,	ácido graxo compreende	18 carbonos. Nas modalidades
específicas,	ácido graxo compreende 20 carbonos. Em algumas

modalidades, o ácido graxo é saturado. Em certas modalidades, o ácido graxo é insaturado. Em certas modalidades, o ácido graxo é ligado ao aminoácido de terminal N. Em certas modalidades, o ácido graxo é ligado ao aminoácido de terminal C. Em certas modalidades, o ácido graxo é ligado a um grupo lateral de aminoácido. Em algumas modalidades, o ácido graxo é ligado ao ε-amina de um resíduo de lisina.

[0030] Em várias modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado compreende ainda uma etiqueta de purificação. Em algumas destas modalidades, a etiqueta de purificação é uma etiqueta de poli-histidina, uma etiqueta myc, ou uma etiqueta HA.

[0031] Em várias modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II tem uma afinidade para a ligação às lipoproteínas. Em várias modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II é capaz de ativar a lipoproteína lipase (LPL). Em algumas modalidades, o peptídeo é capaz de ativar a lipólise pela LPL. Em algumas modalidades, o peptídeo é capaz de deslocar a apoC-III nas lipoproteínas. Em algumas modalidades, o peptídeo é capaz de reduzir o nível de triglicerídeo (TG) in vivo. Em algumas destas modalidades, o peptídeo é capaz de reduzir o nível de TG elevado causado pela deficiência de LPL. Em

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12/95 algumas destas modalidades, o peptídeo é capaz de reduzir o nível de TG elevado causado pela apoC-III elevada. Em algumas destas modalidades, o peptídeo é capaz de reduzir o nível de TG elevado causado pela deficiência de apoC-II. Em algumas destas modalidades, o peptídeo é capaz de reduzir nível pós-prandial de TG elevado.

[0032] Em um outro aspecto, é aqui fornecida uma composição farmacêutica compreendendo o peptídeo mimético de apoC-II e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é adequada para a injeção subcutânea.

[0033] Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método para tratar hipertrigliceridemia em um paciente, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz do peptídeo mimético de apoC-II ou a composição farmacêutica compreendendo o peptídeo mimético de apoC-II. Em algumas modalidades, a hipertrigliceridemia está associada com obesidade. Em algumas modalidades, a hipertrigliceridemia está associada com diabete melito. Em algumas modalidades, a hipertrigliceridemia está associada com consumo de álcool. Em algumas modalidades, a hipertrigliceridemia está associada com medicação.

[0034] Em algumas modalidades, a hipertrigliceridemia é causada pela deficiência de LPL. Em certas modalidades, a hipertrigliceridemia é deficiência familiar da lipoproteína lipase. Em algumas modalidades, a deficiência de LPL é causada por uma mutação do gene LPL. Em certas modalidades, a mutação leva à atividade da enzima LPL. Em algumas modalidades, a mutação leva à atividade de enzima LPL ausente. Em certas modalidades, a deficiência de LPL é diagnosticada pela ausência de atividade de LPL no soro do paciente. Em algumas modalidades, a mutação é detectada pela análise de sequência de DNA. Em algumas modalidades, a hipertrigliceridemia é causada pela deficiência de apoC-II. Em algumas modalidades, a hipertrigliceridemia é causada pela apoC-III elevada.

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13/95 [0035] Em certas modalidades, a concentração sérica de triglicerídeo (TG) do paciente no pré-tratamento é entre 150 mg/dL e 199 mg/dL. Em certas modalidades, a concentração sérica de triglicerídeo (TG) do paciente no pré-tratamento é entre 200 mg/dL a 499 mg/dL. Em certas modalidades, a concentração sérica de triglicerídeo (TG) do paciente no pré-tratamento é entre 500 mg/dL a 999 mg/dL. Em certas modalidades, a concentração sérica de triglicerídeo (TG) do paciente no pré-tratamento é entre 1000 mg/dL e 1999 mg/dL. Em certas modalidades, a concentração sérica de triglicerídeo (TG) do paciente no pré-tratamento é igual ou maior do que 2000 mg/dL.

[0036] Nas modalidades específicas, o paciente desenvolveu ou está em risco para pancreatite aguda. Nas modalidades específicas, o paciente desenvolveu ou está em risco para doença cardiovascular aguda.

[0037] Em um outro aspecto, também é aqui fornecido um método para fabricar o peptídeo mimético de apoC-II, compreendendo produzir o peptídeo de modo recombinante.

[0038] Ainda em outro aspecto, também é aqui fornecido um método para fabricar o peptídeo mimético de apoC-II, compreendendo produzir o peptídeo através da síntese química.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0039] Estas e outras características, aspectos, e vantagens da presente invenção se tomarão mais bem entendidas com relação à seguinte descrição, e figuras anexas, onde:

A FIG. 1 mostra a homologia of resíduos de aminoácidos de 40 a 58 da proteína apoC-II humana madura em várias espécies.

[0040] As FIG. 2A e FIG. 2B apresentam representações gráficas de rodas helicoidais dos resíduos de aminoácidos de 40 a 57 de apoC-II nativa e uma variante Delta4’, com a FIG. 2A representando a apoC-II nativa e a FIG. 2B representando a variante, Delta4’. O tamanho e a cor das bolas indicam o grau de carga e hidrofobicidade. O primeiro número no centro da roda

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14/95 helicoidal indica o momento hidrofóbico. O segundo número no centro da roda helicoidal e a seta indicam o ângulo do momento hidrofóbico.

[0041] As FIG. 3A e FIG. 3B apresentam representações gráficas de rodas helicoidais de resíduos de aminoácidos de 40 a 57 da apoC-II nativa e uma variante Delta5’, com a FIG. 3 A representando a apoC-II nativa e a FIG. 3B representando a variante, Delta5’.

[0042] As FIG. 4A e FIG. 4B apresentam as representações gráficas de rodas helicoidais dos resíduos de aminoácidos de 40 a 57 da apoC-II nativa e uma variante Deltaó’, com a FIG. 4A representando a apoC-II nativa e a FIG. 4B representando a variante, Deltaó’.

[0043] A FIG. 5 mostra os exemplos de modificação química da variante Delta4’. Mono-acil-Delta4’ inclui um terminal N modificado com ácido esteárico. Di-acil-Delta4’ inclui um terminal N modificado com ácido esteárico e um resíduo de leucina modificado com ácido esteárico na posição 49.

[0044] A FIG. 6 apresenta os resultados do ensaio de LPL in vitro dos peptídeos miméticos de apoC-II exemplares e as variantes com modificações químicas usando o soro do paciente deficiente em apoC-II como substrato. A proteína apoC-II humana de comprimento total nativa foi usada como controle.

[0045] A FIG. 7 apresenta os resultados do ensaio de LPL in vitro dos peptídeos miméticos de apoC-II exemplares e as variantes com modificações químicas usando Intralipid como substrato. A proteína apoC-II humana de comprimento total nativa foi usada como controle.

[0046] A FIG. 8 apresenta os resultados do ensaio de LPL in vitro do peptídeo mimético de apoC-II Delta4 exemplar, as variantes de Delta4, e as variantes da terceira hélice de apoC-II usando o soro do paciente deficiente em apoC-II como substrato.

[0047] A FIG. 9 mostra os resultados do ensaio de LPL in vitro das

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15/95 variantes da terceira hélice de apoC-II usando o soro do paciente deficiente em apoC-II como substrato.

[0048] A FIG. 10 mostra os resultados dos ensaios de LPL in vitro das variantes do peptídeo mimético de apoC-II exemplar Delta4 usando o soro do paciente deficiente em apoC-II como substrato.

[0049] A FIG. 11 mostra os resultados do ensaio de LPL in vitro das variantes do peptídeo mimético de apoC-II exemplar Delta4 usando o soro do paciente deficiente em apoC-II como substrato.

[0050] A FIG. 12 apresenta os resultados do ensaio de LPL in vitro do peptídeo mimético de apoC-II exemplar Delta4 e suas variantes usando o soro do paciente deficiente em apoC-II como substrato. A concentração de peptídeo mimético de apoC-II varia de 100 pM a 10 μΜ. A proteína apoC-II humana de comprimento total nativa foi usada como controle.

[0051] A FIG. 13 apresenta os resultados do ensaio de LPL in vitro das variantes de truncamento do peptídeo mimético de apoC-II exemplar Delta4 usando o soro do paciente deficiente em apoC-II como substrato. A concentração de peptídeo mimético de apoC-II varia de 10 pM a 100 μΜ.

[0052] A FIG. 14 apresenta os resultados do ensaio de LPL in vitro das variantes de peptídeo mimético de apoC-II exemplar Delta5 e o peptídeo mimético de apoC-II exemplar Deltaó, usando o soro do paciente deficiente em apoC-II como substrato. A concentração de peptídeo mimético de apoC-II varia de 100 pM a 10 μΜ.

[0053] As FIG. 15A, FIG. 15B, FIG. 15C, e FIG. 15D mostram a faixa em porcentagem da atividade de LPL em um ensaio de LPL in vitro do peptídeo mimético de apoC-II exemplar Deltaó e suas variantes usando o soro do paciente com hipertrigliceridemia como substrato. A concentração de triglicerídeos no soro do paciente na EIG. 15A, EIG. 15B, EIG. 15C, e EIG. 15D são de 1084 mg/dL, 1224 mg/dL, 1442 mg/dL, e 1669 mg/dL respectivamente.

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16/95 [0054] A FIG. 16 apresenta o nível de triglicerídeo (TG) no soro de camundongos nocautes em apoC-II depois da injeção subcutânea de peptídeo mimético de apoC-II Delta4. Solução salina foi usada como controle.

[0055] A FIG. 17 apresenta o nível de colesterol total (TC) de camundongos nocautes em apoC-II depois da injeção subcutânea de peptídeo mimético de apoC-II Delta4. Solução salina foi usada como controle.

[0056] A FIG. 18 apresenta o nível de triglicerídeo (TG) no soro de camundongos nocautes em apoC-II depois da injeção intraperitoneal de peptídeo mimético de apoC-II Delta4. Solução salina foi usada como controle. [0057] A FIG. 19 apresenta o nível de colesterol total (TC) de camundongos nocautes em apoC-II depois da injeção intraperitoneal de peptídeo mimético de apoC-II Delta4. Solução salina foi usada como controle. [0058] A FIG. 20 mostra a faixa em porcentagem do nível de triglicerídeo (TG) no soro dos camundongos tipo selvagem depois da gavagem de óleo vegetal na presença ou ausência de injeção intraperitoneal de peptídeo mimético de apoC-II. Os peptídeos miméticos apoC-II testados incluem Delta4, Delta4b e Delta4b-3. A solução salina foi usada como controle.

[0059] A FIG. 21 apresenta o nível de triglicerídeo (TG) no soro de camundongos nocautes em apoC-II depois da injeção intraperitoneal de peptídeo mimético de apoC-II Delta6. Solução salina foi usada como controle. [0060] A FIG. 22 apresenta o nível de colesterol total (TC) de camundongos nocautes em apoC-II depois da injeção intraperitoneal de peptídeo mimético de apoC-II Delta6. Solução salina foi usada como controle. [0061] A FIG. 23 apresenta o nível de triglicerídeo (TG) no soro de camundongos nocautes em apoC-II depois da injeção intraperitoneal de diferentes doses de peptídeo mimético de apoC-II Delta6. Solução salina foi usada como controle. A porcentagem do nível no soro TG em diferentes pontos de tempo depois da injeção comparada com o nível de TG no soro na

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17/95 hora da injeção foi calculada.

[0062] A FIG. 24 apresenta a faixa em porcentagem de triglicerídeo (TG) no soro de camundongos nocautes em apoC-II depois da injeção intraperitoneal de variantes de Delta6. Solução salina foi usada como controle. A faixa em porcentagem do TG no soro se comparado à TG no soro na hora da injeção foi calculada.

[0063] A FIG. 25 mostra o deslocamento de apoC-III pelo peptídeo mimético de apoC-II Delta6 em VLDL e quilomicrons isolados do plasma humano.

[0064] A FIG. 26 mostra o deslocamento de apoC-III pelas variantes do peptídeo mimético de apoC-II Delta6 em VLDL isolado do plasma humano.

[0065] A FIG. 27 mostra os resultados do ensaio de LPL in vitro dos peptídeos miméticos de apoC-II Delta4 e Delta6 usando soro do paciente com hipertrigliceridemia com altos níveis de apoC-III como substrato.

[0066] A FIG. 28 mostra o deslocamento de apoC-III através de peptídeo de apoC-II-a em um VLDL isolado do plasma humano (TG = 291mg/dL).

[0067] As FIG. 29A e FIG. 29B mostram o deslocamento dependente de dose de apoC-III através de um peptídeo de apoC-II-a analisado pela espectrometria de massa MALDI-TOF), com a FIG. 29A mostrando que a seletividade de apoC-II-a desloca a apoC-III e apoC-I, mas não apoC-II, e a FIG. 29B mostrando que a ligação de um peptídeo de apoC-II-a ao VLDL é aproximadamente proporcional à sua concentração.

[0068] A FIG. 30 mostra o deslocamento de apoC-III através de um peptídeo de ApoC-II-a em quilomicrons isolados do plasma humano.

[0069] A FIG. 31 apresenta resultados de um ensaio de ativação de LPL com Intralipid como substrato e apoC-III recombinante como um inibidor. O peptídeo de apoC-II-a supera a inibição pelo apoC-III.

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18/95 [0070] A FIG. 32 apresenta resultados de um ensaio de ativação de LPL com plasma humano com alto teor de TG como substrato e apoC-III recombinante como um inibidor. O peptídeo de apoC-II-a supera a inibição por apoC-III.

[0071] A FIG. 33 representa graficamente os resultados de um ensaio de ativação de LPL usando plasma de camundongos apoC-III transgênico (tg) como substrato. As concentrações de TG dos camundongos apoC-III tgl, ApoC-III tg2, e ApoC-III tg3 são de 323 mg/dL, 497 mg/dL, e 478 mg/dL, respectivamente. O peptídeo de ApoC-II-a supera o efeito inibidor da expressão elevada de apoC-III em todas as três amostras plasmáticas de camundongos transgênicos.

[0072] As FIG. 34A e FIG. 34B mostram níveis de TG pós-prandiais do soro em 24 horas em camundongos depois de uma gavagem oral com óleo vegetal na presença ou ausência do inibidor de LPL Triton WR1339, e na presença ou ausência de um peptídeo de ApoC-II-a, com a EIG. 34A focando na faixa de concentração de TG de 0 a 100 mg/dL, e a EIG. 34B mostrando a faixa de concentração de TG de 0 a 4500 mg/dL.

[0073] As FIG. 35A e FIG. 35B mostram a faixa em porcentagem do nível de TG no soro de camundongos tipo selvagem depois da injeção de Intralipid com ou sem a injeção intraperitoneal do peptídeo DeltaóPV na presença ou ausência do inibidor de LPL Triton, com a EIG. 35A mostrando a linha de tempo da injeção e EIG. 35B mostrando a faixa em porcentagem do nível de TG no soro depois da injeção intraperitoneal de DeltaóPV na presença ou ausência de Triton. Solução salina foi usada como controle.

[0074] As FIG. 36A, FIG. 36B, e FIG. 36C mostram a faixa em porcentagem do nível de TG no soro de camundongos nocautes em apoC-II depois da injeção de peptídeo mimético de apoC-II DeltaóPV, com a FIG. 36A mostrando a linha de tempo da injeção, a FIG. 36B mostrando a faixa em porcentagem do nível de TG no soro depois da injeção intraperitoneal de

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DeltaóPV, e a FIG. 36C mostrando a faixa em porcentagem do nível de TG no soro depois da injeção subcutânea do DeltaóPV. Solução salina foi usada como controle. SM representa as condições onde DeltaóPV foi misturado com esfingomielina (SM), um componente da membrana celular.

[0075] As FIG. 37A e FIG. 37B mostram a faixa em porcentagem do nível de TG no soro de camundongos nocautes em apoC-II depois da injeção de Intralipid com ou sem a injeção intraperitoneal do peptídeo DeltaóPV, com a FIG. 37A mostrando a linha do tempo da injeção e a FIG. 37B mostrando a faixa em porcentagem do nível de TG no soro depois da injeção intraperitoneal de DeltaóPV a 5 pmole/kg e 10 pmole/kg (B. W.). Solução salina foi usada como controle.

[0076] As FIG. 38A e FIG. 38B mostram a faixa em porcentagem do nível de TG no soro de camundongos transgênicos apoC-III depois da injeção de peptídeo mimético de apoC-II DeltaóPV, com a FIG. 38A mostrando a linha do tempo da injeção, a FIG. 38B mostrando a faixa em porcentagem do nível de TG no soro depois da injeção intraperitoneal de DeltaóPV a 1 pmole/kg, 5 pmole/kg, e 10 pmole/kg (B. W.). Solução salina foi usada como controle.

[0077] A FIG. 39 mostra a faixa em porcentagem do nível de TG no soro de camundongos transgênicos apoC-III depois da injeção de Intralipid com ou sem a injeção intraperitoneal de peptídeo DeltaóPV a 5 pmole/kg e 10 pmole/kg (B. W.). Solução salina foi usada como controle.

[0078] A FIG. 40 mostra a faixa em porcentagem do nível de TG no soro de camundongos nocautes em apoC-II depois de injeções múltiplas de peptídeo mimético de apoC-II DeltaóPV a 0,25 pmole/kg e 1 pmole/kg (B. W.). As setas indicam os pontos de tempo da injeção de DeltaóPV. Solução salina foi usada como controle.

[0079] A FIG. 41 apresenta os resultados da separação de SEC-FPLC de várias frações lipídicas nos camundongos nocautes em apoC-II

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20/95 administrados com 1 pmole/kg (B. W.) de DeltaóPV. O nível de partículas de lipoproteína é representado pelo fosfolipídeo.

[0080] A FIG. 42 apresenta os resultados da separação por SECFPLC de várias frações lipídicas nos camundongos nocautes em apoC-II administrados com 1 pmole/kg de DeltaóPV. O nível de partículas de lipoproteína é representado por TG.

[0081 ] As FIG. 43A e FIG. 43B mostram a faixa em porcentagem do nível de TG no soro de camundongos transgênicos apoC-III depois das injeções múltiplas de peptídeo mimético de apoC-II DeltaóPV, com a FIG. 43A mostrando a linha do tempo da injeções e a FIG. 43B mostrando a faixa em porcentagem do nível de TG no soro depois da injeção intraperitoneal de DeltaóPV a 5 pmole/kg (B. W.). As setas indicam os pontos de tempo da injeção de DeltaóPV. Solução salina foi usada como controle.

[0082] A FIG. 44 mostra a faixa em porcentagem do nível de TG no soro de camundongos transgênicos apoC-III depois de injeções múltiplas de peptídeo mimético de apoC-II DeltaóPV a 5 pmole/kg (B. W.). As setas indicam os pontos de tempo da injeção de DeltaóPV. A solução salina foi usada como controle.

[0083] As FIG. 45A e FIG. 45B mostram o nível de apoC-III depois das injeções de DeltaóPV nos camundongos transgênicos apoC-III, como medido por ELISA, com a FIG. 45A mostrando o nível de apoC-III nas partículas de VLDL no Dia 1 e Dia 5 antes e 3 horas depois da injeção e a FIG. 45B mostrando o nível de apoC-III nas partículas de HDL no Dia 1 e Dia 5 antes e 3 horas depois da injeção.

[0084] As FIG. 46A e FIG. 46B mostram a faixa em porcentagem do nível de TG no soro de camundongos tipo selvagem depois da injeção de Intralipid com ou sem as injeções intraperitoneais múltiplas de peptídeo DeltaóPV, com a FIG. 46A mostrando a linha do tempo da injeção e a FIG. 46B mostrando a faixa em porcentagem do nível de TG no soro depois da

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21/95 injeção intraperitoneal de DeltaóPV a 0,25 pmole/kg e 1 pmole/kg (B. W.). Solução salina foi usada como controle.

[0085] A FIG. 47 mostra a razão de TG no soro no modelo de macaco obeso com ou sem a injeção intravenosa de peptídeo de DeltaóPV a 1 mg/kg e 5 mg/kg (B. W.) se comparado ao nível de linha de base. Solução salina foi usada como controle.

[0086] As FIG. 48A, FIG. 48B e FIG. 48C mostram as porcentagens do VLDL, LDL, e HDL nos modelos de macaco obeso com ou sem a injeção intravenosa de peptídeo DeltaóPV a 1 mg/kg e 5 mg/kg (B. W.) se comparado aos níveis de linha de base, com a FIG. 48A mostrando a porcentagem de VLDL nos modelos de macaco obeso se comparado ao nível de linha de base, a FIG. 48B mostrando a porcentagem do LDL nos modelos de macaco obeso se comparado ao nível de linha de base, e a FIG. 48C mostrando a porcentagem de HDL nos modelos de macaco obeso se comparado ao nível de base.

[0087] A FIG. 49 mostra um deslocamento de apoC-III pelo peptídeo DeltaóPV no VLDL isolado do plasma humano.

[0088] A FIG. 50 apresenta os resultados de um ensaio de ativação de LPL com plasma humano de alto TG como substrato e apoC-III recombinante como um inibidor. O peptídeo DeltaóPV supera a inibição de apoC-III.

[0089] A FIG. 51 representa os resultados do ensaio de LPL in vitro dos peptídeos Deltaó e DeltaóPV usando o soro do paciente deficiente em apoC-II como substrato.

[0090] A FIG. 52 representa os resultados do ensaio de LPL in vitro dos peptídeos miméticos de apoC-II DeltaóPV, Deltaó-T18F-PV, DeltaóT18F-PV-AIB7, 17 e Deitai 3-31-PV usando o soro do paciente deficiente em apoC-II como substrato.

[0091] A FIG. 53 apresenta a faixa em porcentagem do TG no soro em camundongos nocautes em apoC-II depois da injeção intraperitoneal das

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22/95 variantes Deltaó, DeltaóPV e Delta6-T18F-PV. Solução salina foi usada como controle. A faixa em porcentagem do TG no soro se comparado ao TG no soro na hora da injeção foi calculada.

[0092] As FIG. 54A, FIG. 54B, e FIG. 54C apresentam uma roda helicoidal e plotagens de rede do peptídeo mimético de apoC-II, apoC-II-a. A FIG. 54A é uma representação gráfica da roda helicoidal da hélicel8A. O tamanho e a cor das bolas indicam o grau de carga e hidrofobicidade (amarelo, não polar; verde, polar/não carregado; rosa, ácido; azul, básico). A FIG. 54B é uma representação gráfica da roda helicoidal da terceira hélice de apoC-II. A FIG. 54C é uma representação gráfica da rede helicoidal do peptídeo de ApoC-II-a. O ApoC-II-a tem a sequência de DWLKAFYDKVAEKLKEAFPAMSTYT-GIFTDQVLSVLKGEE (SEQ ID NO: 56). A região central indica a posição da face hidrofóbica.

[0093] A FIG. 55 mostra o projeto de estudo para testar a hipertrigliceridemia pós-prandial em camundongos.

[0094] A FIG. 56 mostra o projeto de estudo para testar a hipertrigliceridemia pós-prandial em camundongos na presença do inibidor de LPL.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Definições [0095] A menos que de outro modo definido, todo os termos técnicos e científicos aqui usados têm o significado comumente entendido por aquele versado na técnica à qual a invenção pertence.

[0096] O termo “aminoácido” refere-se aos aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais, e análogos de aminoácido. A menos que de outro modo indicado, o termo “aminoácido” inclui os estereoisômeros tanto D quanto L se a respectiva estrutura permite tais formas estereoisoméricas.

[0097] Os aminoácidos naturais incluem alanina (Ala ou A), arginina (Arg ou R), asparagina (Asn ou N), ácido aspártico (Asp ou D), cisteína (Cys

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23/95 ou C), glutamina (Gin ou Q), ácido glutâmico (Glu ou E), glicina (Gly ou G), histidina (His ou H), isoleucina (lie ou I), leucina (Leu ou L), Lisina (Lys ou K), metionina (Met ou M), fenilalanina (Phe ou F), prolina (Pro ou P), serina (Ser ou S), treonina (Thr ou T), triptofano (Trp ou W), tirosina (Tyr ou Y) e valina (Vai ou V).

[0098] Os aminoácidos não naturais, ou aminoácidos não naturais incluem, mas não são limitados a, ácido azetidinocarboxílico, ácido 2aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, naftilalanina (“naf”), ácido aminopropiônico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6aminocapróico, ácido 2-aminoheptanóico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3aminoisbutírico, ácido 2-aminopimélico, butilglicina ternária (“tBuG”), ácido 2,4-diaminoisobutírico, desmosina, ácido 2,2’-diaminopimélico, ácido 2,3diaminopropiônico, N-etilglicina, N-etilasparagina, homoprolina (“hPro” ou “homoP”), hidroxilisina, alo-hidroxilisina, 3-hidroxiprolina (“3Hyp”), 4hidroxiprolina (“4Hyp”), isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilalanina (“MeAla” ou “Nime”), N-alquilglicina (“NAG”) incluindo N-metilglicina, Nmetilisoleucina, N-alquilpentilglicina (“NAPG”) incluindo Nmetilpentilglicina. N-metilvalina, naftilalanina, norvalina (“Norval”), norleucina (“Norleu”), octilglicina (“OctG”), omitina (“Om”), pentilglicina (“pG” ou “PGly”), ácido pipecólico, tioprolina (“TioP” ou “tPro”), homoLisina (“hLys”), e homoArginina (“hArg”).

[0099] O termo “análogo de aminoácido” refere-se a um aminoácido natural ou não natural onde um ou mais de grupo carbóxi de terminal C, grupo amino de terminal C e grupo funcional de cadeia lateral foram quimicamente bloqueados, reversível ou irreversivelmente, ou de outro modo modificados para um outro grupo funcional. Por exemplo, ácido aspártico(éster beta-metílico) é um análogo de aminoácido do ácido aspártico; Netilglicina é um análogo de aminoácido de glicina; ou alanino carboxamida é um análogo de aminoácido da alanina. Outros análogos de aminoácidos

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24/95 incluem sulfóxido de metionina, metionino sulfona, S-(carboximetil)-cisteína, sulfóxido de S-(carboximetil)cisteína e S-(carboximetil)-cisteíno sulfona.

[00100] Como aqui usado, o termo “peptídeo” refere-se a um polímero curto de aminoácidos ligados juntos por ligações peptídicas. Ao contrário dos outros peptídeos de polímeros de aminoácidos (por exemplo, proteínas, polipeptídeos, etc.), são de cerca de 75 aminoácidos ou menos em extensão. Um peptídeo pode compreender aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais, análogos de aminoácidos, e/ou aminoácidos modificados. Um peptídeo pode ser uma subsequência de proteína de ocorrência natural ou uma sequência não natural (sintético).

[00101] Como aqui usado, o termo “peptídeo mutante” refere-se a uma variante de um peptídeo tendo uma sequência de aminoácido distinta da variante mais comum que ocorre na natureza, aludida como a sequência do “tipo selvagem”. Um peptídeo mutante pode compreender uma ou mais substituições, deleções, ou inserção de aminoácido, se comparado a sequência do tipo selvagem. Um peptídeo mutante pode ser uma subsequência de uma proteína ou polipeptídeo mutantes (por exemplo, uma subsequência de uma proteína de ocorrência natural que não é a sequência mais comum na natureza), ou pode ser um peptídeo que não é uma subsequência de uma proteína ou polipeptídeo de ocorrência natural. Por exemplo, um “peptídeo de ApoC-II mutante” pode ser uma subsequência de uma versão mutante de apoC-II ou pode ser uma sequência distinta não verificada nas proteínas apoC-II de ocorrência natural.

[00102] Como aqui usado, o termo “peptídeo sintético” refere-se a um peptídeo tendo uma sequência de aminoácido distinta daquela verificada nos peptídeos e/ou proteínas naturais. Uma proteína sintética não é uma subsequência de uma proteína de ocorrência natural, seja do tipo selvagem (isto é, mais abundante) ou versões mutantes desta. Por exemplo, um “peptídeo de apoC-II sintético” não é uma subsequência de apoC-II de

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25/95 ocorrência natural. Um “peptídeo sintético,” como aqui usado, pode ser produzido ou sintetizado através de qualquer método adequado (por exemplo, expressão recombinante, síntese química, síntese enzimática, etc.).

[00103] Os termos “peptídeo mimético” ou “peptidomimético” se referem a uma molécula semelhante a peptídeo que emula uma sequência derivada de uma proteína ou peptídeo. Um peptídeo mimético ou peptidomimético pode conter aminoácidos e/ou componentes que não de aminoácido. Os exemplos de peptidomiméticos incluem peptídeos quimicamente modificados, peptóides (grupos laterais são anexados ao átomo de nitrogênio da estrutura do peptídeo, ao invés dos a-carbonos), β-peptídeos (grupo amino ligado ao carbono β ao invés do carbono a), etc. A modificação química inclui uma ou mais modificações no grupo lateral de aminoácidos, átomos de α-carbono, grupo amina terminal, ou grupo carbóxi terminal. Uma modificação química pode ser adicionar porções químicas, criando novas ligações, ou removendo as porções químicas. As modificações no grupo lateral de aminoácidos incluem, sem limitação, acilação do ε-grupo de amino lisina, N-alquilação de arginina, histidina, ou lisina, alquilação de grupos carboxílicos do ácido glutâmico ou aspártico, formação de lactama por intermédio da ciclização dos ε-grupos amino lisina com grupos carboxila do grupo lateral do ácido glutâmico ou aspártico, “grampeamento” de hidrocarboneto (por exemplo, para estabilizar as configurações de alfahélice), e desamidação da glutamina ou asparagina. As modificações do grupo terminal amina incluem, sem limitação, a desamina, alquila N-inferior, alquila N-di-inferior, alquilas constrangidas (por exemplo alquilas constrangidas) e as modificações de N-acila. As modificações do grupo carbóxi terminal incluem, sem limitação, a amida, alquil amida inferior, alquilas constrangidas (por exemplo alquilas constrangidas) alquila, dialquil amida, e modificações do éster alquílico inferior. A alquila inferior é alquila C1-C4. Além disso, um ou mais grupos laterais, ou grupos terminais, podem ser protegidos por grupos de

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26/95 proteção conhecidos ao químico comumente versado em peptídeos. O acarbono de um aminoácido pode ser mono- ou dimetilado.

[00104] Como aqui usado, uma substituição de aminoácido “conservativa” refere-se à substituição de um aminoácido em um peptídeo ou polipeptídeo com um outro aminoácido tendo propriedades químicas similares, tais como tamanho ou carga. Para os propósitos da presente divulgação, cada um dos seguinte oito grupo contém aminoácidos que são substituições conservativas uns para os outros:

1) Alanina (A) e Glicina (G);

2) Ácido aspártico (D) e Ácido glutâmico (E);

3) Asparagina (N) e Glutamina (Q);

4) Arginina (R) e Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), e Valina (V);

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), e Triptofano (W);

7) Serina (S) e Treonina (T); e

8) Cisteína (C) e Metionina (M).

[00105] Os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em classes com base em propriedades de grupo lateral comum, por exemplo: positivo polar (histidina (H), lisina (K), e arginina (R)); negativo polar (ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E)); polar neutro (serina (S), treonina (T), asparagina (N), glutamina (Q)); alifático não polar (alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M)); não polar aromático (fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W)); prolina e glicina; e cisteína. Como aqui usado, uma substituição de aminoácido “semiconservativa” refere-se à substituição de um aminoácido em um peptídeo ou polipeptídeo com um outro aminoácido dentro da mesma classe.

[00106] Em algumas modalidades, a menos que de outro modo especificado, uma substituição de aminoácido conservativa ou semiconservativa também pode abranger os resíduos de aminoácidos que não

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27/95 de ocorrência natural que têm propriedades químicas similares ao resíduo natural. Estes resíduos não naturais são tipicamente incorporados pela síntese química de peptídeos ao invés da síntese em sistemas biológicos. Estes incluem, mas não são limitados a peptidomiméticos e outras formas revertidas ou invertidas de porções de aminoácido. As modalidades aqui contidas incluem aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais, e análogos de aminoácidos. Por exemplo, norleucina pode ser usada para substituir a metionina.

[00107] As substituições não conservativas podem envolver a mudança de um membro de uma classe para um membro de uma outra classe.

[00108] Como aqui usado, o termo “identidade de sequência” refere-se ao grau no qual duas sequências poliméricas (por exemplo, peptídeo, polipeptídeo, ácido nucléico, etc.) têm a mesma composição sequencial das subunidades monoméricas. O termo “similaridade de sequência” refere-se ao grau com o qual as duas sequências poliméricas (por exemplo, peptídeo, polipeptídeo, ácido nucléico, etc.) diferem apenas pelas substituições de aminoácido conservativas e/ou semiconservativas. A “identidade de sequência em por cento” (ou “similaridade de sequência em por cento”) é calculada por: (1) comparar duas sequências otimamente alinhadas sobre uma janela de comparação (por exemplo, a extensão da sequência mais longa, a extensão da sequência mais curta, uma janela especificada, etc.), (2) determinar o número de posições contendo monômeros idênticos (ou similares) (por exemplo, os mesmos aminoácidos ocorrem em ambas as sequências, os aminoácidos similares ocorrem em ambas as sequências) para produzir o número de posições emparelhadas, (3) dividir o número de posições emparelhadas pelo número total de posições na janela de comparação (por exemplo, a extensão da sequência mais longa, a extensão da sequência mais curta, uma janela especificada), e (4) multiplicar o resultado por 100 para produzir a identidade de sequência percentual ou a similaridade de sequência percentual. Por

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28/95 exemplo, se os peptídeos A e B têm ambos 20 aminoácidos em extensão e possuem aminoácidos em todas exceto na posição 1, então o peptídeo A e o peptídeo B têm 95 % de identidade de sequência. Se os aminoácidos na posição não idêntica compartilharam as mesmas características biológicas (por exemplo, ambos foram ácidos), então o peptídeo A e o peptídeo B teriam 100 % de similaridade de sequência. Como outro exemplo, se o peptídeo C é de 20 aminoácidos de extensão e o peptídeo D é de 15 aminoácidos de extensão, e 14 dos 15 aminoácidos no peptídeo D são idênticos àquele de uma porção de peptídeo C, então os peptídeos C e D têm 70 % de identidade de sequência, mas o peptídeo D tem 93,3 % de identidade de sequência para uma janela de comparação ótima do peptídeo C. Para o propósito de calcular a “identidade de sequência em porcento” (ou “similaridade de sequência em por cento”) aqui, qualquer intervalo nas sequências alinhadas são tradados como mal emparelhamento na posição.

[00109] Como aqui usado, o termo “resíduos agrupados” refere-se a um conjunto de aminoácidos dentro de um peptídeo, polipeptídeo, ou proteína que estão fisicamente posicionados juntos no espaço tridimensional. Os resíduos agrupados podem ser sequenciais ou não na sequência primária do peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Os resíduos podem ser agrupados em um domínio globular, podem estar presentes na mesma superfície, ou podem ser apresentados na mesma terminação ou lado de uma estrutura secundária (por exemplo, hélice alfa) ou estrutura ternária dentro de um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Em algumas modalidades, além de estarem fisicamente posicionados juntos, os resíduos agrupados também apresentam algum grau de similaridade nas características de resíduo (por exemplo, tamanho, carga de polaridade, etc.).

[00110] Como aqui usado, “hidrofóbico (μη)” refere-se a uma medida da anfipaticidade de uma hélice. O grau de anfipaticidade (isto é, grau de assimetria de hidrofobicidade) nos peptídeos ou análogos de peptídeo de

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29/95 domínios múltiplos pode ser quantificado calculando-se o momento hidrofóbico (μκ) de cada um dos domínios anfipáticos a-helicoidais. Os métodos para calcular μκ para uma sequência de peptídeo em particular são bem conhecidos na técnica, e são descritos, por exemplo, em Eisenberg et al., Faraday Symp. Chem. Soc,lT. 109-120, 1982; Eisenberg et al., PNAS 81:140144, 1984; e Eisenberg et al., J. Mal. Biol. 179:125-142, 1984. A μκ real obtida para uma sequência de peptídeo particular dependerá do número total de resíduos de aminoácidos compondo o peptídeo. As anfipaticidades dos peptídeos de diferentes extensões podem ser diretamente comparadas por via da média hidrofóbica. A média hidrofóbica por resíduo por si pode ser obtida dividindo-se μκ pelo número de resíduos no peptídeo.

[00111] A menos que de outro modo especificado, “apoC-II” (sinonimamente, “apoC2”) refere-se à apolipoproteína C-II humana. Os resíduos são aqui numerados de acordo com sua posição na forma de 79 aminoácidos maduros da proteína apoC-II humana após a clivagem da sequência de sinal. A proteína de apolipoproteína C-II madura é uma proteína de 79 aminoácidos que inclui três hélices: hélice 1, resíduos de 17 a 38; hélice 2, resíduos de 45 a 57; e hélice 3, resíduos de 65 a 74/75 (Zdunek et al., Biochemistry 42: 1872-1889, 2003). A região de ativação de lipase de apoC-II foi previamente localizada no domínio da sequência do de terminal C, de cerca do resíduo 56, ao passo que o domínio de terminal N (resíduos de 1 a 50) da sequência está envolvido na ligação lipídica. O ácido nucléico e as sequências de proteínas para os ortólogos de apoC-II de uma variedade de espécies estão publicamente disponíveis. O número acessão GenBank NCBI para o precursor apoC-II humano é NP_000474. As sequências de aminoácido da apoC-II humana madura, dos resíduos de aminoácidos de 40 a 79 de apoCII humana, e das hélices nativas de 1 a 3 da apoC-II humana são mostradas na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1
Nome	Sequência	SEQ ID NO
ApoC-II nativa	TQQPQQDEMPSPTFLTQVKESLSSYWESAKTAAQNLYE	SEQ ID NO: 1

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Tabela 1
Nome	Sequência	SEQ ID NO
(comprimento total)	KTILPAVDEKLRDLYSKSTAAMSTYTGIFTDQVLSVLKG EE
ApoC-II nativa (a.a. 40 - a.a. 79)	TILPAVDEKLRDLYSKSTAAMSTYTGIFTDQVLSVLKGE E	SEQ ID NO: 2
ApoC-II (hélice 1)	nativa	QVKESLSSYWESAKTAAQNLYE	SEQ ID NO: 3
ApoC-II (hélice 2)	nativa	VDEKLRDLYSKST	SEQ ID NO: 4
ApoC-II (hélice 3)	nativa	GIFTDQVLSVL	SEQ ID NO: 5

[00112] A menos que de outro modo especificado, “LPL” refere-se a uma lipoproteína lipase. O número de acessão GenBank NCBI para a proteína LPL humana é NP_000228.

[00113] Como aqui usado, o termo “sujeito” refere-se amplamente a qualquer animal, incluindo, mas não limitado a, seres humanos e animais não humanos (por exemplo, cães, gatos, vacas, cavalos, ovelhas, porcos, aves domésticas, peixes, crustáceos, etc.). Como aqui usado, o termo “paciente” tipicamente refere-se a um sujeito que está sendo tratado para uma doença ou condição.

[00114] Como aqui usado, o termo “quantidade eficaz” refere-se à quantidade de uma composição (por exemplo, um peptídeo sintético) suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens e não é intencionada ser limitada a uma formulação ou via de administração particular.

[00115] Como aqui usado, os termos “administração” e “administrar” se referem ao ato de fornecer um fármaco, pró-fármaco ou outro agente, ou tratamento terapêutico (por exemplo, peptídeo sintético) a um paciente ou células, tecidos, e órgãos in vivo, in vitro, ou ex vivo. As vias exemplares de administração ao corpo humano podem ser através do espaço sob a membrana aracnóide do cérebro ou medula espinal (intratecal), os olhos (oftálmica), boca (oral), pele (tópica ou transdérmica), nariz (nasal), pulmões (inalantes), mucosa oral (bucal ou lingual), orelha, retal, vaginal, através de injeção (por

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31/95 exemplo, intravenosamente, subcutaneamente, intratumoralmente, intraperitonealmente, etc.) e outros.

[00116] Como aqui usado, os termos “coadministração” e “coadministrar” se referem à administração de pelo menos dois agentes (por exemplo, peptídeo sintético múltiplo ou um peptídeo sintético e outro agente terapêutico) ou terapias a um sujeito. Em algumas modalidades, a coadministração de dois ou mais agentes ou terapias é simultânea. Em outras modalidades, um(a) primeiro(a) agente/terapia é administrado(a) antes de um(a) segundo(a) agente/terapia. Aqueles habilitados na técnica entendem que as formulações e/ou vias de administração dos vários agentes ou terapias usados podem variar. A dosagem apropriada para a coadministração pode ser prontamente determinada por aquele habilitado na técnica. Em algumas modalidades, quando os agentes ou terapias são coadministrados, os respectivos agentes ou terapias são administrados em dosagens menores do que apropriado para sua administração sozinhos. Assim, a coadministração é especialmente desejável em modalidades onde a coadministração dos agentes ou terapias diminui o requisito de dosagem de agente(s) potencialmente nocivo(s) (por exemplo, tóxicos), e/ou quando a coadministração de dois ou mais agentes resulta na sensibilização de um sujeito aos efeitos benéficos de um ou dos agentes por intermédio da coadministração do outro agente.

[00117] Como aqui usado, o termo “tratamento” significa um método para obter um resultado clínico benéfico ou intencionado. O resultado clínico benéfico ou intencionado pode incluir o alívio dos sintomas, uma redução na gravidade da doença, inibição de uma causa subjacente de uma doença ou condição, doenças estabilizadas em um estado não avançado, atrasando o progresso de uma doença, e/ou melhora ou alívio das condições da doença.

[00118] Como aqui usado, o termo “composição farmacêutica” referese à combinação de um agente ativo (por exemplo, peptídeo mimético de apoC-II) com um carregador, inerte ou ativo, tomando a composição

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32/95 especialmente adequada para o uso terapêutico ou de diagnóstico in vitro, in vivo ou ex vivo.

[00119] Os termos “farmaceuticamente aceitável” ou “farmacologicamente aceitável,” como aqui usado, se refere às composições que não produzem substancialmente reações adversas, por exemplo, reações tóxicas, alérgicas, ou imunológicas, quando administradas a um sujeito.

[00120] Como aqui usado, o termo “carreador farmaceuticamente aceitável” refere-se a qualquer um dos carregadores farmacêuticos padrão incluindo, mas não limitado a, solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões (por exemplo, tais como emulsões de óleo/água ou água/óleo), glicerol, glicóis de polietileno líquido, solventes apróticos tais como sulfóxido de dimetila, N-metilpirrolidona e misturas destes, e vários tipos de agentes de umectação, agentes de solubilização, antioxidantes, agentes de volume, carregadores protéicos tais como albuminas, qualquer e todos os solventes, meio de dispersão, revestimentos, lauril sulfato de sódio, agentes isotônicos e de atraso de absorção, desintegrantes (por exemplo, amido de batata ou glicolato de amido sódico), e os semelhantes. As composições também podem incluir estabilizadores e conservantes. Para exemplos de carregadores, estabilizadores e adjuvantes, ver, por exemplo, Martin, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 21- Ed., Mack Publ. Co., Easton, Pa. (2005), aqui incorporada por referência na sua totalidade.

1.1 Peptídeo mimético de apoC-II [00121] Em um primeiro aspecto, é aqui divulgado um peptídeo mimético de apoC-II isolado.

[00122] Em algumas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado é um peptídeo multihelicoidal compreendendo uma pluralidade de domínios helicoidais. Em algumas modalidades multihelicoidais, um ou mais dos domínios helicoidais são anfipáticos e podem ligar aos lipídeos e/ou à superfície das lipoproteínas. Em certas modalidades, o peptídeo mimético de

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33/95 apoC-II isolado é um peptídeo bihelicoidal compreendendo dois domínios helicoidais. Em algumas modalidades bihelicoidais, pelo menos um domínio helicoidal é anfipático. Em algumas modalidades bihelicoidais, um domínio helicoidal é anfipático, e o outro domínio helicoidal é a hélice Tipo G verificada nas proteínas globulares.

[00123] Em algumas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado é um peptídeo helicoidal único. Em algumas destas modalidades, o domínio helicoidal é anfipático. Em outra destas modalidades, o domínio helicoidal é a hélice Tipo G.

[00124] Em várias modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado é de não mais do que 75 aminoácidos. Em certas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado é de não mais do que 70 aminoácidos. Em certas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado é de não mais do que 60 aminoácidos. Em certas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado é de não mais do que 50 aminoácidos. Em certas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado é de não mais do que 40 aminoácidos. Em certas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado é de não mais do que 30 aminoácidos. Em certas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado é de não mais do que 20 aminoácidos.

[00125] Nas modalidades típicas, o peptídeo mimético de apoC-II isolado compreende um primeiro domínio helicoidal, uma região de dobradiça, e um segundo domínio helicoidal.

[00126] Em algumas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado compreende um primeiro domínio helicoidal, uma região de dobradiça, e um segundo domínio helicoidal na ordem do terminal N para o terminal C. Em algumas destas modalidades, o primeiro domínio helicoidal é anfipático. Em algumas destas modalidades, o segundo domínio helicoidal forma uma hélice globular. Em certas destas modalidades, o primeiro domínio helicoidal é anfipático e o segundo domínio helicoidal forma uma hélice

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34/95 globular.

[00127] Em algumas modalidades, o primeiro domínio tem uma afinidade para a ligação às lipoproteínas. Em algumas modalidades, o segundo domínio é capaz de ativar a lipoproteína lipase (LPL). Em certas modalidades, o primeiro domínio tem uma afinidade para a ligação às lipoproteínas, e o segundo domínio é capaz de ativar a lipoproteína lipase (LPL).

[00128] Em certas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado é capaz de ativar a lipólise pela LPL. Em certas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado é capaz de deslocar a apoC-III das lipoproteínas.

[00129] Em várias modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado é capaz de reduzir o nível de triglicerídeo (TG) in vivo. Em algumas destas modalidades, o peptídeo é capaz de reduzir o nível de TG elevado causado pela deficiência de LPL. Em algumas destas modalidades, o peptídeo é capaz de reduzir o nível de TG elevado causado pela apoC-III elevada. Em algumas destas modalidades, o peptídeo é capaz de reduzir o nível de TG elevado causado pela deficiência de apoC-II. Ainda em algumas destas modalidades, o peptídeo é capaz de reduzir o nível pós-prandial de TG elevado.

[00130] Em várias modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado tem uma sequência de aminoácido apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 52 (Tabela 2). Em algumas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado tem 90 % de similaridade de sequência para uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 52. Em algumas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado tem 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, ou 95 % de similaridade de sequência para uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 52. Em algumas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado tem

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35/95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de similaridade de sequência para uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 52.

1.1.1 O Primeiro Domínio Helicoidal [00131] Em várias modalidades, o primeiro domínio helicoidal tem uma afinidade para a ligação para lipoproteínas. Em algumas modalidades, o primeiro domínio helicoidal é anfipático. Em certas destas modalidades, o domínio helicoidal tem uma contagem hidrofóbica de cerca de 6 a cerca de 15, tal como cerca de 7 a cerca de 15, cerca de 8 a cerca de 15, cerca de 9 a cerca de 15, cerca de 10 a cerca de 15, cerca de 11 a cerca de 15, cerca de 12 a cerca de 15, cerca de 13 a cerca de 15, cerca de 14 a cerca de 15, cerca de 8 a cerca de 14, cerca de 9 a cerca de 14, cerca de 10 a cerca de 14, cerca de 11 a cerca de 14, cerca de 12 a cerca de 14, cerca de 13 a cerca de 14, cerca de 8 a cerca de 13, cerca de 9 a cerca de 13, cerca de 10 a cerca de 13, cerca de 11 a cerca de 13, cerca de 12 a cerca de 13, cerca de 8 a cerca de 12, cerca de 9 a cerca de 12, cerca de 10 a cerca de 12, cerca de 11 a cerca de 12, cerca de 8 a cerca de 11, cerca de 9 a cerca de 11, cerca de 10 a cerca de 11, cerca de 8 a cerca de 10, cerca de 9 a cerca de 10, ou cerca de 8 a cerca de 9. O momento hidrofóbico do peptídeo pode ser calculado com ferramentas online, tal como em rzlab .ucr.edu/scripts/wheel/ wheel .cgi.

[00132] Em algumas modalidades, o primeiro domínio helicoidal do peptídeo mimético de apoC-II isolado é a hélice nativa 1 da proteína apoC-II. A hélice 1 da proteína apoC-II consiste nos resíduos de aminoácidos de 17 a 38 (SEQ ID NO: 3), numerados de acordo com sua posição na proteína apoCII de 79 aminoácidos madura. Em outras modalidades, o primeiro domínio helicoidal do peptídeo mimético de apoC-II isolado é uma variante da hélice 1 da proteína apoC-II.

[00133] Em algumas modalidades, o primeiro domínio helicoidal do peptídeo mimético de apoC-II isolado é hélice nativa 2 de proteína apoC-II. A hélice 2 de proteína apoC-II consiste nos resíduos dos aminoácidos de 45 a 57

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36/95 (SEQ ID NO: 4), numerada de acordo com sua posição na proteína apoC-II de 79 aminoácidos madura. Em outras modalidades, o primeiro domínio helicoidal do peptídeo mimético de apoC-II isolado é uma variante da hélice 2 da proteína apoC-II. Em certas modalidades, a variante da hélice 2 da proteína apoC-II compreende pelo menos uma modificação da hélice nativa 2 da proteína apoC-II. Em certas modalidades, a variante da hélice 2 de proteína apoC-II compreende uma pluralidade de modificações da hélice nativa 2 de proteína apoC-II. Em várias modalidades, cada modificação é independentemente selecionada de alongamentos, truncagens, mutações, e/ou modificações químicas.

[00134] Em outras modalidades, o primeiro domínio helicoidal do peptídeo mimético de apoC-II isolado é uma variante de uma hélice anfipática verificada nas apolipoproteínas outras que não apoC-II, ou de outras proteínas que podem ligar lipídeos.

1.1.1.1 Alongamento da hélice 2 de apoC-II [00135] Em certas modalidades, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende um alongamento da hélice 2 de apoC-II. Em várias modalidades, o alongamento aumenta a anfipaticidade da variante da hélice 2 de apoC-II comparado à hélice nativa 2 de apoC-II. Em algumas modalidades, o alongamento aumenta a afinidade da variante da hélice 2 de apoC-II para ligar às lipoproteínas.

[00136] Em algumas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é alongada no terminal N. Em várias modalidades, a hélice 2 de apoC-II é alongada em 1 a 20 aminoácidos no terminal N. Em algumas destas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é alongada em 1 a 10 aminoácidos no terminal N. Em algumas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é alongada em 1 aminoácido no terminal

N. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é alongada em 2 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é alongada em 3 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 2

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37/95 de apoC-II é alongada em 4 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é alongada em 5 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é alongada em 6 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é alongada em 7 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é alongada em 8 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é alongada em 9 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é alongada em 10 aminoácidos no terminal N.

[00137] Nas modalidades específicas, quando a hélice 2 de apoC-II é alongada em 1 aminoácido no terminal N, o aminoácido de alongamento é ácido aspártico.

[00138] Nas modalidades específicas, quando a hélice 2 de apoC-II é alongada em 2 aminoácidos no terminal N, os aminoácidos de alongamento são lisina e alanina, do terminal N para o terminal C.

[00139] Nas modalidades típicas, a hélice 2 de apoC-II é alongada em 5 aminoácidos no terminal N. Em algumas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é alongada na sequência de aminoácidos nativa a montante de apoC-II humana. Em algumas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é alongada em um mutante da sequência de aminoácidos nativa a montante de apoC-II humana. Em algumas modalidades, os aminoácidos estão nas posições 40 a 44, numeradas de acordo com sua posição na proteína apoC-II humana de 79 aminoácidos madura. Em algumas modalidades, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende um ácido aspártico na posição 40. Em algumas modalidades, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende uma tirosina ou um triptofano na posição 41. Em algumas modalidades, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende uma leucina na posição 42. Em algumas modalidades, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende uma lisina ou uma arginina na posição 43. Em algumas modalidades, a variante da hélice 2 de apoC-II

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38/95 compreende uma alanina ou um ácido glutâmico na posição 44.

[00140] Nas modalidades específicas, quando a hélice 2 de apoC-II é alongada em 5 aminoácidos no terminal N, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende um ácido aspártico na posição 40, uma tirosina na posição 41, uma leucina na posição 42, uma lisina na posição 43, e um ácido glutâmico na posição 44.

[00141] Nas modalidades específicas, quando a hélice 2 de apoC-II é alongada em 5 aminoácidos no terminal N, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende um ácido aspártico na posição 40, uma tirosina na posição 41, uma leucina na posição 42, uma lisina na posição 43, e uma alanina na posição 44.

1.1.1.2 Truncamento da hélice 2 de apoC-II [00142] Em certas modalidades, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende uma truncamento da hélice 2 de apoC-II. Em várias modalidades, a truncamento aumenta a anfipaticidade da variante da hélice 2 de apoC-II se comparado à hélice nativa 2 de apoC-II. Em algumas modalidades, a truncamento aumenta a afinidade da variante da hélice 2 de apoC-II para ligar às lipoproteínas.

[00143] Em algumas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é truncada no terminal N. Em várias modalidades, a hélice 2 de apoC-II é truncada por de 1 a 12 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoCII é truncada por 1 aminoácido no terminal N. Em algumas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é truncada por 2 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é truncada por 3 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é truncada por 4 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é truncada por 5 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é truncada por 6 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é truncada por 7 aminoácidos no terminal

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N. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é truncada por 8 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é truncada por 9 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é truncada por 10 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é truncada por 11 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 2 de apoC-II é truncada por 12 aminoácidos no terminal N.

[00144] Nas modalidades específicas, quando a hélice 2 de apoC-II é truncada por 2 aminoácidos no terminal N, os resíduos dos aminoácidos de 45 a 46 da hélice nativa 2 de apoC-II são excluídos.

[00145] Nas modalidades específicas, quando a hélice 2 de apoC-II é truncada por 4 aminoácidos no terminal N, os resíduos dos aminoácidos de 45 a 48 da hélice nativa 2 de apoC-II são excluídos.

[00146] Nas modalidades específicas, quando a hélice 2 de apoC-II é truncada por 5 aminoácidos no terminal N, os resíduos dos aminoácidos de 45 a 49 da hélice nativa 2 de apoC-II são excluídos.

[00147] Nas modalidades específicas, quando a hélice 2 de apoC-II é truncada por 6 aminoácidos no terminal N, os resíduos dos aminoácidos de 45 a 50 da hélice nativa 2 de apoC-II são excluídos.

[00148] Nas modalidades específicas, quando a hélice 2 de apoC-II é truncada por 9 aminoácidos no terminal N, os resíduos dos aminoácidos de 45 a 53 da hélice nativa 2 de apoC-II são excluídos.

[00149] 1.1.1.3 Mutação da hélice 2 de apoC-II [00150] Em certas modalidades, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende pelo menos uma mutação da hélice 2 de apoC-II. Em várias modalidades, a mutação aumenta a anfipaticidade da variante da hélice 2 de apoC-II se comparado à hélice nativa 2 de apoC-II. Em algumas modalidades, a mutação aumenta a afinidade da variante da hélice 2 de apoC-II para ligar às lipoproteínas.

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40/95 [00151] Em certas modalidades, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende uma mutação da hélice 2 de apoC-II. Em certas modalidades, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende duas mutações da hélice 2 de apoC-II. Em certas modalidades, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende três mutações da hélice 2 de apoC-II. Em certas modalidades, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende quatro mutações da hélice 2 de apoC-II. Em certas modalidades, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende cinco mutações da hélice 2 de apoC-II. Em certas modalidades, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende mais do que cinco mutações da hélice 2 de apoC-II.

[00152] Em algumas modalidades, a mutação é uma substituição de aminoácido. Em algumas modalidades, a mutação é uma inserção de aminoácido. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção aminoácido. [00153] Em algumas modalidades, um aminoácido original da hélice 2 de apoC-II é substituído por um aminoácido natural. Em algumas modalidades, um aminoácido original da hélice 2 de apoC-II é substituído por um aminoácido não natural. Em algumas modalidades, um aminoácido original da hélice 2 de apoC-II é substituído por um análogo de aminoácido. Em algumas modalidades, um aminoácido original da hélice 2 de apoC-II é substituído por um aminoácido quimicamente modificado.

[00154] Em várias modalidades, a substituição de aminoácido é uma substituição conservativa ou semiconservativa. Em algumas modalidades, a substituição de aminoácido tem impacto mínimo na atividade e/ou estrutura do peptídeo resultante. Em certas modalidades, a substituição de aminoácido mantém a estrutura do peptídeo na área de substituição, por exemplo, como uma configuração helicoidal. Em certas modalidades, a substituição de aminoácido mantém a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo. Em certas modalidades, a substituição de aminoácido mantém a massa do grupo lateral de aminoácido.

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41/95 [00155] Em várias modalidades, a substituição de aminoácido é uma substituição não conservativa. Em algumas modalidades, a substituição de aminoácido produz mudanças significantes na propriedade do peptídeo. Em certas modalidades, um resíduo hidrofílico é substituído por um resíduo hidrofóbico. Em certas outras modalidades, um resíduo hidrofóbico é substituído por um resíduo hidrofílico. Em certas modalidades, uma cisteína ou prolina é substituída por um outro resíduo. Em certas outras modalidades, uma não cisteína ou não prolina são substituídas por uma cisteína ou prolina. Em certas modalidades, um resíduo tendo um grupo lateral eletropositivo é substituído por um resíduo eletronegativo. Em certas outras modalidades, um resíduo tendo um grupo lateral eletronegativo é substituído por um resíduo eletropositivo. Em certas modalidades, um resíduo tendo um grupo lateral volumoso é substituído por um resíduo que não tem um grupo lateral. Em certas outras modalidades, um resíduo não tendo um grupo lateral é substituído por um resíduo tendo um grupo lateral volumoso.

[00156] Em certas modalidades, a substituição de aminoácido está na posição 45. Em algumas modalidades, a valina na posição 45 é substituída por uma fenilalanina.

[00157] Em certas modalidades, a substituição de aminoácido está na posição 46. Em algumas modalidades, o ácido aspártico na posição 46 é substituído por uma fenilalanina. Em algumas modalidades, o ácido aspártico na posição 46 é substituído por uma lisina. Em algumas modalidades, o ácido aspártico na posição 46 é substituído por um ácido aminoisobutírico.

[00158] Em certas modalidades, a substituição de aminoácido está na posição 47.

[00159] Em certas modalidades, a substituição de aminoácido está na posição 48. Em algumas modalidades, a lisina na posição 48 é substituída por uma arginina.

[00160] Em certas modalidades, a substituição de aminoácido está na

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42/95 posição 49. Em algumas modalidades, a leucina na posição 49 é substituída por uma lisina. Em algumas destas modalidades, a lisina é modificada por ácido graxo.

[00161] Em certas modalidades, a substituição de aminoácido está na posição 50. Em algumas modalidades, a arginina na posição 50 é substituída por uma lisina.

[00162] Em certas modalidades, posição 51.

[00163] Em certas modalidades, posição 52.

[00164] Em certas modalidades, a substituição de aminoácido está na a substituição de aminoácido está na a substituição de aminoácido está na posição 53. Em algumas modalidades, a tirosina na posição 53 é substituída por uma leucina.

[00165] Em certas modalidades, a substituição de aminoácido está na posição 54. Em algumas modalidades, a serina na posição 54 é substituída por um ácido glutâmico. Em algumas modalidades, a serina na posição 54 é substituída por uma lisina. Em algumas modalidades, a serina na posição 54 é substituída por um ácido aspártico.

[00166] Em certas modalidades, a substituição de aminoácido está na posição 55. Em algumas modalidades, a lisina na posição 55 é substituída por uma arginina.

[00167] Em certas modalidades, a substituição de aminoácido está na posição 56. Em algumas modalidades, a serina na posição 56 é substituída por uma fenilalanina. Em algumas modalidades, a serina na posição 56 é substituída por uma lisina. Em algumas modalidades, a serina na posição 56 é substituída por uma alanina. Em algumas modalidades, a serina na posição 56 é substituída por um ácido aminoisobutírico.

[00168] Em certas modalidades, a substituição de aminoácido está na posição 57. Em algumas modalidades, a treonina na posição 57 é substituída

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43/95 por uma fenilalanina.

[00169] Nas modalidades específicas, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende duas substituições de aminoácido, e as substituições de aminoácido estão na posição 46 e na posição 56. Em algumas destas modalidades, o ácido aspártico na posição 46 é substituído por uma fenilalanina e a serina na posição 56 é substituída por uma fenilalanina.

[00170] Nas modalidades específicas, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende três substituições de aminoácido, e as substituições de aminoácido estão na posição 46, posição 54, e posição 56. Em algumas destas modalidades, o ácido aspártico na posição 46 é substituído por uma fenilalanina, a serina na posição 54 é substituída por um ácido glutâmico, e a serina na posição 56 é substituída por uma fenilalanina.

1.1.1.4 Modificação Química da Variante da Hélice 2 de ApoC-II [00171] Em certas modalidades, a variante da hélice 2 de apoC-II compreende pelo menos uma modificação química. Em várias modalidades, a modificação química aumenta a anfipaticidade da variante da hélice 2 de apoC-II comparada com a hélice nativa 2 de apoC-II. Em algumas modalidades, a modificação química aumenta a afinidade da variante da hélice 2 de apoC-II para ligação às lipoproteínas.

[00172] Em algumas modalidades, a modificação química é no terminal N do primeiro domínio. Em várias modalidades, a extremidade amino do terminal N pode ser modificada pela conjugação com vários grupos funcionais. A neutralização da carga terminal de imitações sintéticas de peptídeo de apolipoproteínas foi mostrada aumentar a sua afinidade lipídica (Yancey et al., Biochem. 34: 7955-7965, 1995; Venkatachalapathi et al., Protein: Structure, Function and Genetics 15: 349-359, 1993). Por exemplo, a acetilação da extremidade de terminal amino de peptídeos anfipáticos aumenta a afinidade lipídica do peptídeo (Mishra et al., J. Biol. Chem. 269: 7185-7191, 1994). Outras modificações possíveis de extremidade são

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44/95 descritas, por exemplo, em Brouillette et al., Biochem. Biophys. Acta 1256: 103-129, 1995; Mishra et al., J. Biol. Chem. 269: 7185-7191, 1994; e Mishra et al., J. Biol. Chem. 270: 1602-1611, 1995.

[00173] Em algumas modalidades, a modificação química está em um grupo lateral de aminoácidos do primeiro domínio. Modificações em grupos laterais de aminoácidos incluem, sem limitação, acilação de grupos ε-amino da lisina, N-alquilação da arginina, histidina ou lisina, alquilação de grupos de ácido glutâmico ou aspártico carboxílico, formação de lactama por intermédio da ciclização de grupos ε-amino da lisina com grupos carboxila do grupo lateral de ácido glutâmico ou aspártico, “grampeamento” de hidrocarboneto (por exemplo, para estabilizar conformações de hélice alfa), e desamidação de glutamina ou asparagina. Em algumas modalidades, o primeiro domínio é modificado pela substituição de um ou mais grupos laterais com outros grupos laterais tais como alquila, alquila inferior, alquila cíclica de 4, 5, 6 a 7 membros, amida, amida alquila inferior, amida di(alquila inferior), alcóxi inferior, hidróxi, carbóxi e os derivados de éster inferiores dos mesmos, e com heterocíclicos de 4, 5, 6 a 7 membros. Por exemplo, análogos de prolina podem ser fabricados em que o tamanho do anel do resíduo de prolina é mudado de um anel de 5 membros para um anel de 4, 6 ou 7 membros. Os grupos cíclicos podem ser saturados ou insaturados, e se insaturados, podem ser aromáticos ou não aromáticos. Os grupos heterocíclicos podem conter um ou mais heteroátomos de nitrogênio, oxigênio e/ou enxofre. Os exemplos de tais grupos incluem grupos furazanila, furila, imidazolidinila, imidazolila, imidazolinila, isotiazolila, isoxazolila, morfolinila (por exemplo, morfolino), oxazolila, piperazinila (por exemplo, 1-piperazinila), piperidila (por exemplo, 1-piperidila, piperidino), piranila, pirazinila, pirazolidinila, pirazolinila, pirazolila, piridazinila, piridila, pirimidinila, pirrolidinila (por exemplo, 1pirrolidinila), pirrolinila, pirrolila, tiadiazolila, tiazolila, tienila, tiomorfolinila (por exemplo, tiomorfolino), e triazolila. Estes grupos heterocíclicos podem

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45/95 ser substituídos ou não substituídos. Onde um grupo é substituído, o substituinte pode ser alquila, alcóxi, halógeno, oxigênio ou fenila substituído ou não substituído. Peptídeos, assim como análogos e miméticos de peptídeo, também podem ser covalentemente ligados a um ou mais de uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol ou polioxialquenos, como descrito nas Pat. U.S. Nos. 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192, e 4.179.337.

[00174] Em certas modalidades, a modificação química é uma modificação não covalente. Em certas outras modalidades, a modificação química é covalentemente ligada ao aminoácido modificado. Em várias modalidades, a modificação química pode ser fosforilação, glicosilação ou lipidação.

[00175] Em algumas modalidades, a modificação química é uma ligação covalente de um ácido graxo. Em certas modalidades, o ácido graxo é saturado. Em certas outras modalidades, o ácido graxo é insaturado.

[00176] Em várias modalidades, o ácido graxo compreende 2 a 30 carbonos, tais como 4 a 26 carbonos, 6 a 24 carbonos, 10 a 20 carbonos, 12 a 18 carbonos, e 14 a 16 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 6 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 7 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 8 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 9 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 10 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 11 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 12 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 13 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 14 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 15 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 16 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 17 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 18 carbonos. Em certas modalidades, o ácido

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46/95 graxo compreende 19 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 20 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 21 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 22 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 23 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 24 carbonos.

[00177] Em algumas modalidades, o ácido graxo insaturado tem 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ligações duplas. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido araquidônico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido linoléico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido oléico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido palmitoléico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido linolênico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido eicosapentaenóico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido docosahexaenóico.

[00178] Em modalidades específicas, o ácido graxo é ácido palmítico. Em modalidades específicas, o ácido graxo é ácido esteárico.

[00179] Em certas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado compreende um ácido esteárico covalentemente ligado ao aminoácido de terminal N. Em algumas destas modalidades, o aminoácido de terminal N é ácido aspártico.

[00180] Em certas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado compreende um ácido esteárico covalentemente ligado ao grupo lateral de um resíduo de lisina. Em modalidades específicas, quando o peptídeo mimético de apoC-II isolado compreende uma lisina na posição 46, o ácido esteárico é covalentemente ligado ao resíduo de lisina na posição 46. Em modalidades específicas, quando o peptídeo mimético de apoC-II isolado compreende uma lisina na posição 49, o ácido esteárico é covalentemente ligado ao resíduo de lisina na posição 49. Em modalidades específicas, quando o peptídeo mimético de apoC-II isolado compreende uma lisina na posição 56, o ácido esteárico é covalentemente ligado ao resíduo de lisina na

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47/95 posição 56.

1.1.2. A Região de Dobradiça [00181] Em algumas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado compreende uma região de dobradiça conectando o primeiro domínio helicoidal e o segundo domínio helicoidal. Em certas modalidades, a região de dobradiça funcionalmente separa o primeiro domínio helicoidal e o segundo domínio helicoidal. Em várias modalidades, a região de dobradiça ajuda o segundo domínio, que tem a atividade de ativação de LPL, a fixar a si mesmo à superfície da micela de lipoproteína. Em certas modalidades, a região de dobradiça permite que o primeiro domínio helicoidal e o segundo domínio helicoidal retenham uma conformação quase reta, em que o segundo domínio se afasta do primeiro domínio em um ângulo de não mais do que cerca de 20°, tal como não mais do que cerca de 15°, não mais do que cerca de 10° ou não mais do que cerca de 5^o.

1.1.2.1. Composição de Aminoácido da Região de Dobradiça [00182] Em várias modalidades, a região de dobradiça compreende 3 a 15 aminoácidos, tal como 4 a 12 aminoácidos, 5 a 10 aminoácidos, 6 a 9 aminoácidos ou 7 a 8 aminoácidos. Em certas modalidades, a região de dobradiça compreende 3 aminoácidos. Em certas modalidades, a regiãode dobradiça compreende 4 aminoácidos. Em certas modalidades, a regiãode dobradiça compreende 5 aminoácidos. Em certas modalidades, a regiãode dobradiça compreende 6 aminoácidos. Em certas modalidades, a regiãode dobradiça compreende 7 aminoácidos. Em certas modalidades, a regiãode dobradiça compreende 8 aminoácidos. Em certas modalidades, a regiãode dobradiça compreende 9 aminoácidos. Em certas modalidades, a regiãode dobradiça compreende aminoácidos. Em certas modalidades, a região de dobradiça compreende 11 aminoácidos.

dobradiça compreende 12 aminoácidos.

dobradiça compreende 13 aminoácidos.

Em certas modalidades, a região de

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48/95 dobradiça compreende 14 aminoácidos. Em certas modalidades, a região de dobradiça compreende 15 aminoácidos.

[00183] Em algumas modalidades, a região de dobradiça compreende um aminoácido natural. Em algumas modalidades, a região de dobradiça compreende um aminoácido não natural. Em algumas modalidades, a região de dobradiça compreende um análogo de aminoácido.

[00184] Em várias modalidades, a região de dobradiça compreende uma prolina. Em algumas modalidades, a região de dobradiça compreende uma hidroxil prolina. Outros aminoácidos adequados (tais como glicina, serina, treonina e alanina) que funcionalmente separam os dois domínios helicoidais também podem ser usados.

[00185] Em algumas modalidades, a região de dobradiça compreende uma prolina. Em algumas destas modalidades, a região de dobradiça compreende uma prolina na posição 58. Em certas modalidades, a região de dobradiça compreende uma alanina. Em algumas destas modalidades, a região de dobradiça compreende uma alanina na posição 58. Em algumas destas modalidades, a região de dobradiça compreende uma alanina na posição 59. Em algumas modalidades, a região de dobradiça compreende uma norleucina. Em algumas destas modalidades, a região de dobradiça compreende uma norleucina na posição 60. Em algumas modalidades, a região de dobradiça compreende uma lisina. Em algumas destas modalidades, a região de dobradiça compreende uma lisina na posição 60. Em algumas modalidades, a região de dobradiça compreende uma metionina. Em algumas destas modalidades, a região de dobradiça compreende uma metionina na posição 60. Em algumas modalidades, a região de dobradiça compreende uma serina. Em algumas destas modalidades, a região de dobradiça compreende uma serina na posição 61. Em algumas modalidades, a região de dobradiça compreende uma treonina. Em algumas destas modalidades, a região de dobradiça compreende uma treonina na posição 62. Em algumas destas

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49/95 modalidades, a região de dobradiça compreende uma treonina na posição 64. Em algumas modalidades, a região de dobradiça compreende uma tirosina. Em algumas destas modalidades, a região de dobradiça compreende uma tirosina na posição 63.

1.1.2.2. Modificação Química da Região de Dobradiça [00186] Em certas modalidades, a região de dobradiça compreende pelo menos uma modificação química.

[00187] Em algumas modalidades, a modificação química está em um grupo lateral de aminoácidos da região de dobradiça. Modificações em grupos laterais de aminoácidos incluem, sem limitação, acilação de grupos ε-amino da lisina, N-alquilação da arginina, histidina ou lisina, alquilação de grupos de ácido glutâmico ou aspártico carboxílico, formação de lactama por intermédio da ciclização de grupos ε-amino da lisina com grupos carboxila do grupo lateral de ácido glutâmico ou aspártico, “grampeamento” de hidrocarboneto (por exemplo, para estabilizar conformações de hélice alfa), e desamidação de glutamina ou asparagina. Em algumas modalidades, a região de dobradiça é modificada pela substituição de um ou mais grupos laterais com outros grupos laterais tais como alquila, alquila inferior, alquila cíclica de 4, 5, 6 a 7 membros, amida, amida alquila inferior, amida di(alquila inferior), alcóxi inferior, hidróxi, carbóxi e os derivados de éster inferiores dos mesmos, e com heterocíclicos de 4, 5, 6 a 7 membros. Por exemplo, análogos de prolina podem ser fabricados em que o tamanho do anel do resíduo de prolina é mudado de um anel de 5 membros para um anel de 4, 6 ou 7 membros. Os grupos cíclicos podem ser saturados ou insaturados, e se insaturados, podem ser aromáticos ou não aromáticos. Os grupos heterocíclicos podem conter um ou mais heteroátomos de nitrogênio, oxigênio e/ou enxofre. Os exemplos de tais grupos incluem grupos furazanila, furila, imidazolidinila, imidazolila, imidazolinila, isotiazolila, isoxazolila, morfolinila (por exemplo, morfolino), oxazolila, piperazinila (por exemplo, 1-piperazinila), piperidila (por exemplo,

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1-piperidila, piperidino), piranila, pirazinila, pirazolidinila, pirazolinila, pirazolila, piridazinila, piridila, pirimidinila, pirrolidinila (por exemplo, 1pirrolidinila), pirrolinila, pirrolila, tiadiazolila, tiazolila, tienila, tiomorfolinila (por exemplo, tiomorfolino), e triazolila. Estes grupos heterocíclicos podem ser substituídos ou não substituídos. Onde um grupo é substituído, o substituinte pode ser alquila, alcóxi, halógeno, oxigênio ou fenila substituído ou não substituído. Os peptídeos, assim como análogos e miméticos de peptídeo, também podem ser covalentemente ligados a um ou mais de uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol ou polioxialquenos, como descrito nas Pat. U.S. Nos. 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192, e 4.179.337.

[00188] Em certas modalidades, a modificação química é uma modificação não covalente. Em certas outras modalidades, a modificação química é covalentemente ligada. Em várias modalidades, a modificação química pode ser fosforilação, glicosilação ou lipidação.

[00189] Em algumas modalidades, a modificação química é uma ligação covalente de um ácido graxo. Em certas modalidades, o ácido graxo é saturado. Em certas outras modalidades, o ácido graxo é insaturado.

[00190] Em várias modalidades, o ácido graxo compreende 2 a 30 carbonos, tal como 4 a 26 carbonos, 6 a 24 carbonos, 10 a 20 carbonos, 12 a 18 carbonos, e 14 a 16 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 6 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 7 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 8 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 9 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 10 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 11 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 12 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 13 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 14 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 15 carbonos.

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Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 16 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 17 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 18 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 19 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 20 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 21 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 22 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 23 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 24 carbonos.

[00191] Em algumas modalidades, o ácido graxo insaturado tem 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ligações duplas. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido araquidônico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido linoléico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido oléico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido palmitoléico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido linolênico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido eicosapentaenóico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido docosahexaenóico.

[00192] Em modalidades específicas, o ácido graxo é ácido palmítico. Em modalidades específicas, o ácido graxo é ácido esteárico.

[00193] Em certas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado compreende um ácido palmítico covalentemente ligado ao grupo lateral do resíduo de lisina. Em modalidades específicas, quando o peptídeo mimético de apoC-II isolado compreende uma lisina na posição 60, o ácido palmítico é covalentemente ligado ao resíduo de lisina na posição 60.

1.1.3. O Segundo Domínio Helicoidal [00194] Em algumas modalidades, o segundo domínio helicoidal do peptídeo mimético de apoC-II isolado é a hélice nativa 3 da proteína apoC-II. A hélice 3 da proteína apoC-II consiste nos resíduos de aminoácido 65 a 74/75 (SEQ ID NO: 5), numerados de acordo com a sua posição na proteína apoC-II madura de 79 aminoácidos. Em algumas outras modalidades, o

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52/95 segundo domínio helicoidal do peptídeo mimético de apoC-II isolado é uma variante da hélice 3 da proteína apoC-II.

[00195] Em certas modalidades, a variante da hélice 3 da proteína apoC-II compreende modificações da hélice nativa 3 da proteína apoC-II. Em várias modalidades, as modificações incluem alongamentos, truncagens, mutações e modificações químicas.

1.1.3.1. Alongamento da Hélice 3 de ApoC-II [00196] Em certas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende alongamento da hélice 3 de apoC-II. Em algumas modalidades, o alongamento aumenta a capacidade da variante da hélice 3 de apoC-II para ativar a lipólise pela LPL.

[00197] Em algumas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada no terminal C. Em várias modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 1 a 20 aminoácidos no terminal C. Em algumas destas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 1 a 10 aminoácidos no terminal C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 1 aminoácido no terminal

C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 2 aminoácidos no terminal C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 3 aminoácidos no terminal C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 4 aminoácidos no terminal C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 5 aminoácidos no terminal

C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 6 aminoácidos no terminal C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 7 aminoácidos no terminal C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 8 aminoácidos no terminal C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 9 aminoácidos no terminal C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 10 aminoácidos no terminal C.

[00198] Em modalidades específicas, quando a hélice 3 de apoC-II é

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53/95 alongada em 4 aminoácidos no terminal C, os aminoácidos são lisina, glicina, ácido glutâmico, e ácido glutâmico do terminal N para o terminal C.

[00199] Em modalidades específicas, quando a hélice 3 de apoC-II é alongada em 4 aminoácidos no terminal C, os aminoácidos são arginina, glicina, ácido glutâmico, e ácido glutâmico do terminal N para o terminal C.

1.1.3.2. Mutação da Hélice 3 de ApoC-II [00200] Em certas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende pelo menos uma mutação da hélice 3 de apoC-II. Em algumas modalidades, a mutação aumenta a capacidade da variante da hélice 3 de apoC-II para ativar a lipólise pela LPL.

[00201] Em certas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende uma mutação da hélice 3 de apoC-II. Em certas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende duas mutações da hélice 3 de apoC-II. Em certas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende três mutações da hélice 3 de apoC-II. Em certas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende quatro mutações da hélice 3 de apoC-II. Em certas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende cinco mutações da hélice 3 de apoC-II. Em certas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende mais do que cinco mutações da hélice 3 de apoC-II.

[00202] Em algumas modalidades, a mutação é uma substituição de aminoácido. Em algumas modalidades, a mutação é uma inserção de aminoácido. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção de aminoácido.

[00203] Em algumas modalidades, um aminoácido original da hélice 3 de apoC-II é substituído por um aminoácido natural. Em algumas modalidades, um aminoácido original da hélice 3 de apoC-II é substituído por um aminoácido não natural. Em algumas modalidades, um aminoácido original da hélice 3 de apoC-II é substituído por um análogo de aminoácido.

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54/95 [00204] Em várias modalidades, a substituição de aminoácido é uma substituição conservativa ou semiconservativa. Em algumas modalidades, a substituição de aminoácido tem impacto mínimo sobre a atividade e/ou estrutura do peptídeo resultante. Em certas modalidades, a substituição de aminoácido mantém a estrutura da cadeia principal do peptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação helicoidal. Em certas modalidades, a substituição de aminoácido mantém a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo. Em certas modalidades, a substituição de aminoácido mantém a maior parte do grupo lateral de aminoácidos.

[00205] Em várias modalidades, a substituição de aminoácido é uma substituição não conservativa. Em algumas modalidades, a substituição de aminoácido produz mudanças significantes na propriedade do peptídeo. Em certas modalidades, um resíduo hidrofílico é substituído por um resíduo hidrofóbico. Em certas outras modalidades, um resíduo hidrofóbico é substituído por um resíduo hidrofílico. Em certas modalidades, uma cisteína ou prolina são substituídas por um outro resíduo. Em certas outras modalidades, uma não cisteína ou não prolina são substituídas por uma cisteína ou prolina. Em certas modalidades, um resíduo tendo um grupo lateral eletropositivo é substituído por um resíduo eletronegativo. Em certas outras modalidades, um resíduo tendo um grupo lateral eletronegativo é substituído por um resíduo eletropositivo. Em certas modalidades, um resíduo tendo um grupo lateral volumoso é substituído por um resíduo não tendo um grupo lateral. Em certas outras modalidades, um resíduo não tendo um grupo lateral é substituído por um resíduo tendo um grupo lateral volumoso.

[00206] Em certas modalidades, a substituição de aminoácido está na posição 70. Em algumas destas modalidades, a glutamina na posição 70 é substituída por uma arginina. Em algumas outras destas modalidades, a glutamina na posição 70 é substituída por uma lisina.

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1.1.3.3. Modificação Química da Variante da Hélice 3 de ApoC-II [00207] Em certas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende pelo menos uma modificação química. Em algumas modalidades, a modificação química aumenta a capacidade da variante da hélice 3 para ativar a lipólise pela LPL.

[00208] Em algumas modalidades, a modificação química é no terminal C do segundo domínio. Em várias modalidades, a extremidade carboxila do terminal C pode ser modificada pela conjugação com vários grupos funcionais. A neutralização da carga terminal de imitações sintéticas de peptídeo de apolipoproteínas foi mostrada aumentar a sua afinidade lipídica (Yancey et al., Biochem. 34: 7955-7965, 1995; Venkatachalapathi et al., Protein: Structure, Function and Genetics 15: 349-359, 1993). Por exemplo, a acetilação da extremidade de terminal amino de peptideos anfipáticos aumenta a afinidade lipídica do peptídeo (Mishra et al., J. Biol. Chem. 269: 7185-7191, 1994). Outras modificações possíveis de extremidade são descritas, por exemplo, em Brouillette et al., Biochem. Biophys. Acta 1256: 103-129, 1995; Mishra et al., J. Biol. Chem. 269: 7185-7191, 1994; e Mishra et al., J. Biol. Chem. 270: 1602-1611, 1995.

[00209] Em algumas modalidades, a modificação química está em um grupo lateral de aminoácidos de um aminoácido no segundo domínio. Modificações em grupos laterais de aminoácidos incluem, sem limitação, a acilação de grupos ε-amino da lisina, N-alquilação da arginina, histidina ou lisina, alquilação de grupos de ácido glutâmico ou aspártico carboxílico, formação de lactama por intermédio da ciclização de grupos ε-amino da lisina com grupos carboxila do grupo lateral de ácido glutâmico ou aspártico, “grampeamento” de hidrocarboneto (por exemplo, para estabilizar conformações de hélice alfa), e desamidação de glutamina ou asparagina. Em algumas modalidades, o segundo domínio é modificado pela substituição de um ou mais grupos laterais com outro grupos laterais tais como alquila,

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56/95 alquila inferior, alquila cíclica de 4, 5, 6 a 7 membros, amida, amida alquila inferior, amida di(alquila inferior), alcóxi inferior, hidróxi, carbóxi e os derivados de éster inferiores dos mesmos, e com heterociclicos de 4, 5, 6 a 7 membros. Por exemplo, análogos de prolina podem ser fabricados em que ο tamanho do anel do resíduo de prolina é mudado de um anel de 5 membros para um anel de 4, 6 ou 7 membros. Grupos cíclicos podem ser saturados ou insaturados, e se insaturados, podem ser aromáticos ou não aromáticos. Grupos heterociclicos podem conter um ou mais heteroátomos de nitrogênio, oxigênio e/ou enxofre. Os exemplos de tais grupos incluem grupos furazanila, furila, imidazolidinila, imidazolila, imidazolinila, isotiazolila, isoxazolila, morfolinila (por exemplo, morfolino), oxazolila, piperazinila (por exemplo, 1piperazinila), piperidila (por exemplo, 1-piperidila, piperidino), piranila, pirazinila, pirazolidinila, pirazolinila, pirazolila, piridazinila, piridila, pirimidinila, pirrolidinila (por exemplo, 1-pirrolidinila), pirrolinila, pirrolila, tiadiazolila, tiazolila, tienila, tiomorfolinila (por exemplo, tiomorfolino), e triazolila. Estes grupos heterociclicos podem ser substituídos ou não substituídos. Onde um grupo é substituído, o substituinte pode ser alquila, alcóxi, halógeno, oxigênio ou fenila substituído ou não substituído. Peptídeos, assim como peptídeo análogos e miméticos, também podem ser covalentemente ligados a um ou mais de uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol ou polioxialquenos, como descrito nas Pat. U.S. Nos. 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192, e 4.179.337.

[00210] Em certas modalidades, a modificação química é uma modificação não covalente. Em certas outras modalidades, a modificação química é covalentemente ligada. Em várias modalidades, a modificação química pode ser fosforilação, glicosilação ou lipidação.

[00211] Em algumas modalidades, a modificação química é uma ligação covalente de um ácido graxo. Em certas modalidades, o ácido graxo é

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57/95 saturado. Em certas outras modalidades, o ácido graxo é insaturado.

[00212] Em várias modalidades, o ácido graxo compreende 2 a 30 carbonos, tal como 4 a 26 carbonos, 6 a 24 carbonos, 10 a 20 carbonos, 12 a 18 carbonos, e 14 a 16 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 6 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 7 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 8 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 9 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 10 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 11 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 12 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 13 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 14 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 15 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 16 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 17 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 18 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 19 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 20 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 21 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 22 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 23 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 24 carbonos.

[00213] Em algumas modalidades, o ácido graxo insaturado tem 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ligações duplas. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido araquidônico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido linoléico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido oléico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido palmitoléico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido linolênico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido eicosapentaenóico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido docosahexaenóico.

[00214] Em modalidades específicas, o ácido graxo é ácido palmítico.

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Em modalidades específicas, o ácido graxo é ácido esteárico.

[00215] Em certas modalidades, o aminoácido de terminal C é modificado por uma amida de terminal C. Em algumas destas modalidades, o aminoácido de terminal C é ácido glutâmico.

1.1.4. Peptídeo Mimético de ApoC-II de Domínio Único [00216] Em algumas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II consiste em um domínio helicoidal. Em algumas destas modalidades, o domínio helicoidal é anfipático. Em algumas outras destas modalidades, o domínio helicoidal é uma hélice globular. Em certas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II é hélice nativa 3 da proteína apoC-II. A hélice 3 da proteína apoC-II consiste nos resíduos de aminoácido 65 a 74/75 (SEQ ID NO: 5), numerados de acordo com a sua posição na proteína apoC-II madura de 79 aminoácidos. Em certas outras modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II é uma variante da hélice 3 de apoC-II.

[00217] Em algumas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II não é maior do que 40 aminoácidos, tal como não maior do que 30 aminoácidos ou não maior do que 20 aminoácidos. Em algumas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende modificações da hélice nativa 3 de apoC-II. Em várias modalidades, as modificações incluem alongamentos, truncagens, mutações, e modificações químicas.

1.1.4.1. Alongamento de Hélice 3 de ApoC-II [00218] Em algumas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende alongamento da hélice 3 de apoC-II. Em algumas modalidades, o alongamento aumenta a afinidade da variante da hélice 3 para ligação às lipoproteínas. Em algumas modalidades, o alongamento aumenta a capacidade da variante da hélice 3 de apoC-II para ativar lipólise pela LPL.

[00219] Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada no terminal N. Em várias modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 1 a 20 aminoácidos no terminal N. Em certas destas modalidades, a hélice 3 de

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59/95 apoC-II é alongada em 1 a 10 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 1 aminoácido no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 2 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 3 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 4 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 5 aminoácidos no terminal N. Em algumas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 6 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 7 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 8 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 9 aminoácidos no terminal N. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 10 aminoácidos no terminal N.

[00220] Em algumas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada no terminal C. Em várias modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 1 a 20 aminoácidos no terminal C. Em certas destas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 1 a 10 aminoácidos no terminal C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 1 aminoácido no terminal C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 2 aminoácidos no terminal C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 3 aminoácidos no terminal C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 4 aminoácidos no terminal C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 5 aminoácidos no terminal C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 6 aminoácidos no terminal C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 7 aminoácidos no terminal C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 8 aminoácidos no terminal C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 9 aminoácidos no terminal

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C. Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada em 10 aminoácidos no terminal C.

[00221] Em certas modalidades, a hélice 3 de apoC-II é alongada tanto no terminal N quanto no terminal C. Em modalidades específicas, a hélice 3 de apoC-II é alongada no terminal N em 6 aminoácidos e no terminal C em 4 aminoácidos. Em algumas destas modalidades, quando a hélice 3 de apoC-II é alongada em 4 aminoácidos no terminal C, os aminoácidos são arginina, glicina, ácido glutâmico, e ácido glutâmico do terminal N para o terminal C. Em algumas destas modalidades, quando a hélice 3 de apoC-II é alongada em 6 aminoácidos no terminal N, os aminoácidos são alanina, metionina, serina, treonina, tirosina, e treonina do terminal N para o terminal C. Em algumas outras destas modalidades, quando a hélice 3 de apoC-II é alongada em 6 aminoácidos no terminal N, os aminoácidos são alanina, lisina, serina, treonina, tirosina, e treonina do terminal N para o terminal C.

1.1.4.2. Mutação da Hélice 3 de ApoC-II [00222] Em certas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende pelo menos uma mutação da hélice 3 de apoC-II. Em algumas modalidades, a mutação aumenta a afinidade da variante da hélice 3 para ligação às lipoproteínas. Em algumas modalidades, a mutação aumenta a capacidade da variante da hélice 3 de apoC-II para ativar lipólise pela LPL.

[00223] Em certas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende uma mutação da hélice 3 de apoC-II. Em certas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende duas mutações da hélice 3 de apoC-II. Em certas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende três mutações da hélice 3 de apoC-II. Em certas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende quatro mutações da hélice 3 de apoC-II. Em certas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende cinco mutações da hélice 3 de apoC-II. Em certas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende mais do que cinco mutações da

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61/95 hélice 3 de apoC-II.

[00224] Em algumas modalidades, a mutação é uma substituição de aminoácido. Em algumas modalidades, a mutação é uma inserção de aminoácido. Em algumas modalidades, a mutação é uma deleção de aminoácido.

[00225] Em algumas modalidades, um aminoácido original da hélice 3 de apoC-II é substituído por um aminoácido natural. Em algumas modalidades, um aminoácido original da hélice 3 de apoC-II é substituído por um aminoácido não natural. Em algumas modalidades, um aminoácido original da hélice 3 de apoC-II é substituído por um análogo de aminoácido.

[00226] Em várias modalidades, a substituição de aminoácido é uma substituição conservativa ou semiconservativa. Em algumas modalidades, a substituição de aminoácido tem impacto mínimo sobre a atividade e/ou estrutura do peptídeo resultante. Em certas modalidades, a substituição de aminoácido mantém a estrutura da cadeia principal do peptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação helicoidal. Em certas modalidades, a substituição de aminoácido mantém a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo. Em certas modalidades, a substituição de aminoácido mantém a maior parte do grupo lateral de aminoácidos.

[00227] Em várias modalidades, a substituição de aminoácido é uma substituição não conservativa. Em algumas modalidades, a substituição de aminoácido produz mudanças significantes na propriedade do peptídeo. Em certas modalidades, um resíduo hidrofílico é substituído por um resíduo hidrofóbico. Em certas outras modalidades, um resíduo hidrofóbico é substituído por um resíduo hidrofílico. Em certas modalidades, uma cisteína ou prolina são substituídas por um outro resíduo. Em certas outras modalidades, uma não cisteína ou não prolina são substituídas por uma cisteína ou prolina. Em certas modalidades, um resíduo tendo um grupo

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62/95 lateral eletropositivo é substituído por um resíduo eletronegativo. Em certas outras modalidades, um resíduo tendo um grupo lateral eletronegativo é substituído por um resíduo eletropositivo. Em certas modalidades, um resíduo tendo um grupo lateral volumoso é substituído por um resíduo não tendo um grupo lateral. Em certas outras modalidades, um resíduo não tendo um grupo lateral é substituído por um resíduo tendo um grupo lateral volumoso.

1.1.4.3. Modificação Química da Variante da Hélice 3 de ApoC-II [00228] Em certas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II compreende pelo menos uma modificação química. Em algumas modalidades, a modificação química aumenta a afinidade da variante da hélice 3 para ligação às lipoproteínas. Em algumas modalidades, a modificação química aumenta a capacidade da variante da hélice 3 para ativar lipólise pela LPL.

[00229] Em algumas modalidades, a modificação química é no terminal N da variante da hélice 3 de apoC-II. Em algumas modalidades, a modificação química é no terminal C da variante da hélice 3 de apoC-II. Em várias modalidades, a extremidade amino do terminal N e/ou a extremidade carboxila do terminal C podem ser modificadas pela conjugação com vários grupos funcionais. A neutralização da carga terminal de imitações sintéticas de peptídeo de apolipoproteínas foi mostrada aumentar a sua afinidade lipídica (Yancey et al., Biochem. 34: 7955-7965, 1995; Venkatachalapathi et al., Protein: Structure, Function and Genetics 15: 349-359, 1993). Por exemplo, acetilação da extremidade de terminal amino de peptídeos anfipáticos aumenta a afinidade lipídica do peptídeo (Mishra et al., J. Biol. Chem. 269: 7185-7191, 1994). Outras modificações possíveis de extremidade são descritas, por exemplo, em Brouillette et al., Biochem. Biophys. Acta 1256: 103-129, 1995; Mishra et al., J. Biol. Chem. 269: 7185-7191, 1994; e Mishra et al., J. Biol. Chem. 270: 1602-1611, 1995.

[00230] Em algumas modalidades, a modificação química está em um grupo lateral de aminoácidos da variante da hélice 3 de apoC-II. Modificações

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63/95 em grupos laterais de aminoácidos incluem, sem limitação, acilação de grupos ε-amino da lisina, N-alquilação da arginina, histidina ou lisina, alquilação de grupos de ácido glutâmico ou aspártico carboxílico, formação de lactama por intermédio da ciclização de grupos ε-amino da lisina com grupos carboxila do grupo lateral de ácido glutâmico ou aspártico, “grampeamento” de hidrocarboneto (por exemplo, para estabilizar conformações de hélice alfa), e desamidação de glutamina ou asparagina. Em algumas modalidades, a variante da hélice 3 de apoC-II é modificada pela substituição de um ou mais grupos laterais com outros grupos laterais tais como alquila, alquila inferior, alquila cíclica de 4, 5, 6 a 7 membros, amida, amida alquila inferior, amida di(alquila inferior), alcóxi inferior, hidróxi, carbóxi e os derivados de éster inferiores dos mesmos, e com heterocíclicos de 4, 5, 6 a 7 membros. Por exemplo, análogos de prolina podem ser fabricados em que o tamanho do anel do resíduo de prolina é mudado de um anel de 5 membros para um anel de 4, 6 ou 7 membros. Os grupos cíclicos podem ser saturados ou insaturados, e se insaturados, podem ser aromáticos ou não aromáticos. Os grupos heterocíclicos podem conter um ou mais heteroátomos de nitrogênio, oxigênio e/ou enxofre. Os exemplos de tais grupos incluem grupos furazanila, furila, imidazolidinila, imidazolila, imidazolinila, isotiazolila, isoxazolila, morfolinila (por exemplo, morfolino), oxazolila, piperazinila (por exemplo, 1piperazinila), piperidila (por exemplo, 1-piperidila, piperidino), piranila, pirazinila, pirazolidinila, pirazolinila, pirazolila, piridazinila, piridila, pirimidinila, pirrolidinila (por exemplo, 1-pirrolidinila), pirrolinila, pirrolila, tiadiazolila, tiazolila, tienila, tiomorfolinila (por exemplo, tiomorfolino), e triazolila. Estes grupos heterocíclicos podem ser substituídos ou não substituídos. Onde um grupo é substituído, o substituinte pode ser alquila, alcóxi, halógeno, oxigênio ou fenila substituído ou não substituído. Peptídeos, assim como análogos e miméticos de peptídeo, também podem ser covalentemente ligados a um ou mais de uma variedade de polímeros não

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64/95 proteináceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol ou polioxialquenos, como descrito nas Pat. U.S. Nos. 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192, e 4.179.337.

[00231] Em certas modalidades, a modificação química é modificação não covalente. Em certas outras modalidades, a modificação química é ligação covalente. Em várias modalidades, a modificação química pode ser fosforilação, glicosilação ou lipidação.

[00232] Em algumas modalidades, a modificação química é uma ligação covalente de um ácido graxo. Em certas modalidades, o ácido graxo é saturado. Em certas outras modalidades, o ácido graxo é insaturado.

[00233] Em várias modalidades, o ácido graxo compreende 2 a 30 carbonos, tais como 4 a 26 carbonos, 6 a 24 carbonos, 10 a 20 carbonos, 12 a 18 carbonos, e 14 a 16 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 6 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 7 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 8 carbonos. Em algumas modalidades, o ácido graxo compreende 9 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 10 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 11 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 12 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 13 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 14 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 15 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 16 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 17 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 18 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 19 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 20 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 21 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 22 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 23 carbonos. Em certas modalidades, o ácido graxo compreende 24 carbonos.

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65/95 [00234] Em algumas modalidades, o ácido graxo insaturado tem 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ligações duplas. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido araquidônico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido linoléico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido oléico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido palmitoléico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido linolênico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido eicosapentaenóico. Em certas modalidades, o ácido graxo insaturado é ácido docosahexaenóico.

[00235] Em modalidades específicas, o ácido graxo é ácido palmítico. Em modalidades específicas, o ácido graxo é ácido esteárico.

[00236] Em certas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado compreende um ácido esteárico covalentemente ligado ao aminoácido de terminal N. Em algumas destas modalidades, o aminoácido de terminal N é alanina.

[00237] Em certas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado compreende um ácido esteárico covalentemente ligado ao grupo lateral do resíduo de lisina. Em modalidades específicas, quando o peptídeo mimético de apoC-II isolado compreende uma lisina na posição 60, o ácido esteárico é covalentemente ligado ao resíduo de lisina. Em modalidades específicas, quando o peptídeo mimético de apoC-II isolado compreende uma lisina na posição 76, o ácido esteárico é covalentemente ligado ao resíduo de lisina.

1.1.5. Preparação de Peptídeo Mimético de ApoC-II [00238] Também são aqui divulgados métodos para produzir o peptídeo mimético de apoC-II isolado.

1.1.5.1. Síntese Recombinante [00239] Em certas modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado é produzido de maneira recombinante, por exemplo usando sistemas de expressão bacteriana, de levedura ou eucariótica.

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66/95 [00240] Para a produção recombinante, uma sequência de polinucleotídeo codificando o peptídeo de domínio único ou múltiplo é inserido em um veículo de expressão apropriado, que é, um vetor que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência codificadora inserida ou no caso de um vetor de RNA viral, os elementos necessários para a replicação e tradução. O veículo de expressão é depois transfectado em uma célula alvo adequada que expressará o peptídeo de domínio único ou múltiplo. Dependendo do sistema de expressão usado, o peptídeo expresso é depois isolado pelos procedimentos bem estabelecidos na técnica. Os métodos para a produção de proteína e peptídeo recombinantes são bem conhecidos na técnica.

[00241] Para aumentar a eficiência de produção, o polinucleotídeo pode ser planejado para codificar unidades múltiplas do peptídeo de domínio único ou múltiplo separadas pelos sítios de clivagem enzimática. O polipeptídeo resultante pode ser clivado (por exemplo, pelo tratamento com a enzima apropriada) de modo a recuperar as unidades de peptídeo. Isto pode aumentar o rendimento de peptídeos dirigidos por um único promotor. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo policistrônico pode ser planejado de modo que um único mRNA seja transcrito que codifique peptídeos múltiplos, cada região codificadora operativamente ligada a uma sequência de controle de tradução independente de capuz, por exemplo, um sítio interno de entrada ribossômica (IRES). Quando usado em sistemas de expressão viral apropriados, a tradução de cada peptídeo codificado pelo mRNA é direcionada intemamente no transcrito, por exemplo, pelo IRES. Assim, a construção policistrônica direciona a transcrição de um mRNA policistrônico único, grande que, por sua vez, direciona a tradução de peptídeos múltiplos, individuais. Este método elimina a produção e processamento enzimático de polipeptídeos e pode significantemente aumentar o rendimento de peptídeo dirigido por um único promotor.

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67/95 [00242] Uma variedade de sistemas vetoriais de expressão em hospedeiro pode ser utilizada para expressar os peptídeos aqui descritos. Estes incluem, mas não são limitados a, micro-organismos tais como bactérias transformadas com vetores de expressão de DNA bacteriófago ou DNA plasmídico recombinantes contendo uma sequência codificadora apropriada; levedura ou fungos filamentosos transformados com vetores de expressão de levedura ou fungos recombinantes contendo uma sequência codificadora apropriada; sistemas de célula de inseto infectados com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, baculovírus) contendo uma sequência codificadora apropriada; sistemas de célula vegetal infectados com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus mosaico da couve-flor (CaMV) ou vírus mosaico do tabaco (TMV)) ou transformados com vetores de expressão plasmídicos recombinantes (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo uma sequência codificadora apropriada; ou sistemas de célula animal.

[00243] Os elementos de expressão dos sistemas de expressão variam na sua concentração e especificidades. Dependendo do sistema de hospedeiro/vetor utilizado, qualquer um de vários elementos de transcrição e tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e indutíveis, pode ser usado no vetor de expressão. Por exemplo, quando da clonagem em sistemas bacterianos, promotores indutíveis tais como pL de bacteriófago λ, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido de ptrp-lac) e os semelhantes podem ser usados. Quando da clonagem em sistemas de célula de inseto, promotores tais como o promotor poliédrico de baculovírus pode ser usado. Quando da clonagem em sistemas de célula vegetal, promotores derivados do genoma de células vegetais (por exemplo, promotores de choque térmico, o promotor para a subunidade pequena de RUBISCO, o promotor para a proteína de ligação de clorofila a/b) ou de vírus vegetais (por exemplo, o promotor de RNA 35S de CaMV, o promotor da proteína de revestimento de TMV) podem ser usados.

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Quando da clonagem em sistemas de célula de mamífero, promotores derivados do genoma de células de mamífero (por exemplo, promotor da metalotioneína) ou de vírus de mamífero (por exemplo, o promotor tardio de adenovirus, o promotor de 7,5 K do vírus da vaccinia) podem ser usados.

1.1.5.2. Síntese Química [00244] Em certas outras modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado é produzido pela síntese química. Em algumas modalidades, o peptídeo é produzido usando técnicas de síntese de peptídeo de fase líquida. Em algumas outras modalidades, o peptídeo é produzido usando técnicas de síntese de peptídeo de fase sólida.

[00245] Os peptídeos tendo a configuração D ou L podem ser sintetizados pelos procedimentos de fase sólida automatizados bem conhecidos na técnica. As sínteses adequadas podem ser realizadas utilizandose procedimentos “Boc” ou “Fmoc”. As técnicas e procedimentos para a síntese de fase sólida são bem conhecidos na técnica. Os peptídeos de domínio único ou múltiplo também podem ser preparados por meio da condensação de segmentos, como descrito, por exemplo, em Liu et al., Tetrahedron Lett. 37: 933-936, 1996; Baca et al., J. Am. Chem. Soe, 717: 1881 a 1887, 1995; Tam et al., Int. J. Peptide Protein Res. 45: 209-216, 1995; Schnolzer e Kent, Science 256: 221-225, 1992; Liu e Tam, J. Am. Chem. Soc. 116: 4149-4153, 1994; Liu e Tam, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6584-6588, 1994; e Yamashiro e Li, Int. J. Peptide Protein Res, 31: 322-334, 1988). Este é particularmente o caso com peptídeos contendo glicina. Outros métodos úteis para sintetizar os peptídeos de domínio único e múltiplo da divulgação estão descritos em Nakagawa et al., J. Am. Chem. Soc. 107: 7087-7092, 1985. [00246] As técnicas exemplares adicionais conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica da síntese de peptídeo e análogo de peptídeo são divulgadas por Bodanszky, M. e Bodanszky, A., The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York, 1994; e por Jones, J., Amino Acid and

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Peptide Synthesis, 2a ecL, Oxford University Press, 2002. As referências de Bodanszky e Jones detalham os parâmetros e técnicas para ativar e encaixar aminoácidos e derivados de aminoácido. Além disso, as referências divulgam como selecionar, usar e remover vários grupos funcionais e de proteção úteis. [00247] Os peptídeos tendo a configuração D ou L também podem ser adquiridos de fornecedores comerciais de peptídeos sintéticos, tais fornecedores incluem, por exemplo, Advanced ChemTech (Louisville, KY), Applied Biosystems (Foster City, CA), Bachem (Torrance, CA), Anaspec (San Jose, CA), e Cell Essentials (Boston, MA).

1.1.6. Purificação de Peptídeo mimético de apoC-II [00248] Os peptídeos ou análogos de peptídeo da divulgação podem ser purificados por muitas técnicas bem conhecidas na técnica, tais como cromatografia de fase reversa, cromatografia líquida de alto desempenho, cromatografia de troca iônica, cromatografia de deleção de tamanho, cromatografia de afinidade, eletroforese em gel, e os semelhantes. As condições reais usadas para purificar um peptídeo de domínio único ou múltiplo ou análogo de peptídeo particulares dependerão, em parte, da estratégia de síntese e de fatores tais como carga líquida, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e os semelhantes, e estarão evidentes para aqueles de habilidade comum na técnica.

[00249] Em várias modalidades, o peptídeo mimético de apoC-II isolado compreende ainda uma etiqueta de purificação. Em algumas modalidades, a etiqueta de purificação é uma etiqueta de poli-histidina, uma etiqueta myc ou uma etiqueta HA.

1.2. Composição Farmacêutica [00250] Também são aqui providas composições farmacêuticas compreendendo um ou mais peptídeos miméticos apoC-II isolados aqui descritos e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00251] Qualquer carreador que possa suprir um peptídeo ativo (por

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70/95 exemplo, sem destruir ou danificar o peptídeo dentro do carreador) é um carreador adequado, e tais carreadores são bem conhecidos na técnica. O peptídeo mimético de apoC-II pode ser formulado, por exemplo, usando qualquer formulação correntemente usada para formular outros peptídeos terapêuticos, tais como insulinas, agonistas de GLP-1, e todos os peptídeos aprovados divulgados na base de dados THPdb dos peptídeos e proteínas terapêuticos aprovados pelo FDA (crdd.osdd.net/raghava/thpdb/).

[00252] A composição farmacêutica com base no peptídeo mimético de apoC-II pode estar na forma de uma forma de dosagem sólida, semissólida ou líquida: tal como pó, solução, elixir, xarope, suspensão, cremem, gotas, pasta e pulverização. Como aqueles versados na técnica podem reconhecer, dependendo da via escolhida de administração a forma da composição é determinada.

[00253] Em algumas modalidades, as composições são formuladas para a administração por qualquer via adequada, incluindo mas não limitada a, oralmente (por exemplo, tal como na forma de tabletes, cápsulas, grânulos ou pós), sublingualmente, bucalmente, parenteralmente (tal como pela injeção ou infusão subcutâneas, intravenosas, intramusculares, intradérmicas ou intraestemais (por exemplo, como soluções ou suspensões estéreis injetáveis aquosas ou não aquosas, etc.)), nasalmente (incluindo administração às membranas nasais, tal como pela pulverização de inalação), topicamente (tal como na forma de um creme ou unguento), transdérmica (tal como pelo emplastro transdérmico), retalmente (tal como na forma de supositórios) ou pela implantação cirúrgica em um sítio particular, etc.

[00254] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas são formuladas para serem adequadas para injeção subcutânea.

1.3. Métodos de Tratamento [00255] Também são aqui providos métodos para tratar distúrbios dislipidêmicos e vasculares, incluindo, mas não limitados à hiperlipidemia,

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71/95 hiperlipoproteinemia, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, deficiência de HDL, doença da artéria coronária, aterosclerose, acidente vascular cerebral trombótico, doença vascular periférica, restenose, síndrome coronária aguda, e lesão miocárdica de reperfusão.

[00256] Em algumas modalidades, os métodos compreendem administrar o peptídeo ou a composição farmacêutica como aqui descrita a um paciente com hipertrigliceridemia.

[00257] Em algumas modalidades, o paciente está em risco de desenvolver hipertrigliceridemia.

[00258] Em várias modalidades, o paciente tem hipertrigliceridemia, com base na concentração plasmática ou TG sérico no jejum acima de um certo nível. Em algumas modalidades, o paciente tem hipertrigliceridemia branda, definida como concentração de triglicerídeo (TG) sérico prétratamento entre 150 mg/dL e 199 mg/dL. Em algumas modalidades, o paciente tem hipertrigliceridemia moderada, definida como concentração de triglicerídeo (TG) sérico no pré-tratamento entre 200 mg/dL e 999 mg/dL, tal como entre 200 mg/dL a 499 mg/dL e entre 500 mg/dL a 999 mg/dL. Em algumas modalidades, o paciente tem hipertrigliceridemia severa, definida como concentração de triglicerídeo (TG) sérico no pré-tratamento entre 1000 mg/dL e 1999 mg/dL. Em algumas modalidades, o paciente tem hipertrigliceridemia muito severa, definida como concentração de triglicerídeo (TG) sérico no pré-tratamento igual a ou mais alta do que 2000 mg/dL.

[00259] Em algumas modalidades, o paciente tem níveis de LDL-c acima do normal. Em algumas outras modalidades, o paciente tem níveis abaixo do normal de HDL-c.

[00260] Em certas modalidades, a hipertrigliceridemia é causada pela deficiência de LPL. Em algumas destas modalidades, a hipertrigliceridemia do paciente é a deficiência familiar da lipoproteína lipase.

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72/95 [00261] Em algumas modalidades, a deficiência de LPL é causada por uma mutação genética. Em algumas destas modalidades, a mutação genética é detectada pela análise de sequência de DNA. Em várias modalidades, a deficiência de LPL é causada por uma mutação nos genes LPL, APOC2, APOA5, GPIHBP1 ou LMF1.

[00262] Em certas modalidades, a deficiência de LPL é causada por uma mutação é o gene LPL. Em algumas destas modalidades, a mutação leva à atividade reduzida da enzima de LPL. Em algumas destas modalidades, a mutação leva à atividade ausente da enzima de LPL.

[00263] Em certas modalidades, a hipertrigliceridemia do paciente é monogênica. Em certas outras modalidades, a hipertrigliceridemia do paciente é poligênica. Em certas modalidades, as mutações estão presentes no estado homozigótico. Em certas modalidades, as mutações estão presentes no estado heterozigótico.

[00264] Em algumas modalidades, a deficiência de LPL é diagnosticada pela ausência de atividade de LPL no soro do paciente.

[00265] Em certas modalidades, a hipertrigliceridemia é causada pela deficiência de apoC-II. Em certas modalidades, a hipertrigliceridemia é causada pela apoC-III elevada.

[00266] Em algumas modalidades, o paciente tem diabete. Em algumas modalidades, o paciente tem síndrome metabólica. Em algumas destas modalidades, a síndrome metabólica é obesidade. Em algumas modalidades, o paciente tem pancreatite. Em algumas destas modalidades, o paciente tem pancreatite aguda. Em algumas modalidades, o paciente tem esteatose ou esteatohepatite. Em algumas destas modalidades, a esteatose ou esteatohepatite está relacionada com o álcool. Em algumas destas modalidades, a esteatose ou esteatohepatite é não alcoólica. Em algumas modalidades, o paciente tem doença cardiovascular. Em algumas destas modalidades, o paciente tem doença cardiovascular aguda. Em algumas

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73/95 modalidades, o paciente tem artrosclerose. Em algumas modalidades, o paciente tem tomado medicação que pode levar à hipertrigliceridemia.

[00267] Em certas modalidades, o paciente é um adulto. Em certas outras modalidades, o paciente é uma criança.

[00268] Em várias modalidades, o peptídeo ou a composição farmacêutica são administrados em uma quantidade, em um programa, e por uma duração suficiente para reduzir o nível sanguíneo de triglicerídeo do paciente. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é administrado em uma quantidade, em um programa, e por uma duração suficiente para diminuir os níveis de triglicerídeo em pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25% ou mais quando comparado com os níveis exatamente antes do início do tratamento. Em certas modalidades, o polipeptídeo é administrado em uma quantidade, em um programa de dosagem, e por uma duração suficiente para diminuir os níveis de em pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50% ou mais. Em modalidades particulares, o polipeptídeo é administrado em uma quantidade, em um programa, e por um tempo suficiente para reduzir os níveis de triglicerídeo em pelo menos 55%, 60%, 65%, 70% ou mais.

[00269] O tratamento pode consistir de uma dose única ou uma pluralidade de doses em um período de tempo.

EXEMPLOS [00270] Abaixo estão exemplos de modalidades específicas para realizar a presente invenção. Os exemplos são oferecidos apenas para propósitos ilustrativos, e não são intencionados a limitar o escopo da presente invenção de nenhum modo. Esforços foram feitos para garantir exatidão com respeito aos números usados (por exemplo, quantidades, temperaturas, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais, naturalmente, devem ser levados em consideração.

[00271] A prática da presente invenção utilizará, a menos que de outro modo indicado, métodos convencionais da química, bioquímica de proteína,

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74/95 técnicas de DNA recombinante e farmacologia, dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são explicadas na íntegra na literatura.

Métodos

Ensaio de LPL [00272] Preparação of LPL: estoque congelado de 10 μΕ de LPL bovino a 0,5 mg/mL foi usado e diluído 1:100 (10 pL + 990 pL de PBS).

[00273] Preparação de Intralipid a 20%: 2000 mg/dL de TG Intralipid foram usados para preparar 3 mg/dL de TG Intralipid diluindo-se 1,5 pL do estoque com 998,5 pL de PBS ou diluindo-se o estoque 1:10 primeiro e depois misturando-se 15 pL do estoque diluído com 985 pL de PBS. Quando soro humano deficiente em apoC-II foi usado como um substrato, uma alíquota congelada de 10 pL de (TG) a 1711 mg/dL foi diluída adicionandose 990 pL de PBS (diluição 1:100).

[00274] Preparação do ensaio de ácido graxo livre (NEFA): Os reagentes de NEFA foram adquiridos da Wako Diagnostics, Wako Life Sciences, Inc. O Reagente A foi preparado misturando-se o Reagente de Cor A com o Solvente A (225 pL por poço). O Reagente B foi preparado misturando-se o Reagente de Cor B com o Solvente B (75 pL por poço). 5 nmoL de padrão do ácido oléico foram preparados diluindo-se 20 pL de estoque a 1 rnM de ácido oléico (solução padrão NEFA da WAKO) com 180 pL de BSA a 0,2%.

[00275] Ensaio de atividade de LPL: 10 pL de Intralipid, amostra de plasma humano ou amostra de plasma de camundongo foram adicionados em cada poço usando pipeta de repetição. 10 pL (ou 15 pL nos poços de controle sem nenhum LPL) de PBS e 10 pL de BSA a 1% foram adicionados em cada poço usando pipeta de repetição. 10 pL de peptídeos foram adicionados aos poços correspondentes em triplicatas verticais (a concentração mais baixa está na esquerda, a mais alta está à direita). A placa foi girada a 1000 RPM durante 10 segundos para misturar e remover as soluções da parede de cada

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75/95 poço. A placa foi colocada em gelo e 5 pL de LPL foram adicionados usando pipeta de repetição. A placa foi girada mais uma vez a 1000 RPM durante 10 segundos. A placa foi coberta e colocada de volta em gelo para uma incubação de 30 min. A placa foi depois movida para 37°C e incubada durante

I hora.

[00276] Ensaio de ácidos graxos livres (NEFA): 45 pL de padrão a 5 nmoL e controle a 0 nmoL (0,2% de BSA) foram adicionados aos poços correspondentes. 225 pL de reagente A foram adicionados em cada poço usando a bandeja de reagente e pipeta de 12 canais. A placa foi incubada durante 10 min antes que 75 pL de reagente B fossem adicionados a cada poço usando a bandeja de reagente e pipeta de 12 canais. A placa não foi coberta devido ao alto volume. A absorbância a 550 nm e 660 nm foi medida. Estudo de deslocamento de ApoC-III [00277] VLDL ou quilomicrons isolados de plasma humano foram incubados com um peptídeo mimético de apoC-II durante 1 hora a 37°C e lavado 3 vezes com PBS usando filtro giratório com membrana de corte de 100 kDa. Os sobrenadantes foram levados ao volume original com PBS e carregado a gel de Bis-TRIS SDS PAGE de 4 a 12%. As faixas de ApoC-I, apoC-II, apoC-III, e apoE foram identificadas pelo seu tamanho correspondente.

[00278] Estudo de Inibição de ApoC-III [00279] O ensaio de LPL foi realizado usando Intralipid, plasma humano com alto TG (diluição 1:50) ou plasma de camundongo transgênico apoC-III (diluição 1:50). Quando Intralipid foi usado como um substrato, 25 ou 50 pM de ApoC-III recombinante foram adicionados como um inibidor. Quando o plasma humano com TG alto foi usado como um substrato, 25 ou 50 pM de ApoC-III recombinante foram adicionados como um inibidor com ou sem pré-incubação a 37°C durante 1 hora. Um peptídeo mimético de apoC-

II foi adicionado em várias concentrações.

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Estudo in vivo [00280] Camundongos C57B1/6 (tipo selvagem), camundongos nocaute em apoC-II (KO em apoC-II), e camundongos transgênicos em apoCIII foram usados para estudo in vivo. Os camundongos C57B1/6 (tipo selvagem) foram adquiridos da Taconic Biosciences Inc. Os camundongos KO em apoC-II foram criados como descrito em Sakurai et al., J Pharmacol Exp Ther 356: 341-353, 2016. Os camundongos transgênicos em apoC-III foram gerados pela expressão excessiva de apoC-III humana em camundongos C57B1/6. Ver Qu et al., J. Lipid. Res. 48: 1476-1487, 2007.

[00281] Os camundongos foram jejuados durante a noite (aproximadamente 12 horas) antes do estudo e 6 horas durante o estudo, no dia seguinte. Os peptídeos miméticos de apoC-II foram sinteticamente produzidos e livres de contaminação biológicas (não disponíveis como compostos/tratamento aprovados pelo FDA). Os peptídeos foram produzidos e usados em condições estéreis e filtrados em filtro de 0,2 nm antes das injeções em uma dose única de 1 a 10 pmol/kg de peso corporal (B. W.) administrada pela injeção subcutânea (S.Q. ou S.C.), injeção intraperitoneal (I.P.) ou injeção intravenosa (I.V.) (em uma solução de PBS grau farmacêutico, estéril em um volume < 200 pL) como descrito em Sakurai et al., J Pharmacol Exp Ther 356: 341-353, 2016.

Estudo com Intralipid In Vivo [00282] Em alguns experimentos, cada animal recebeu 20% de Intralipid (aprovado pelo FDA, Fresenius Kabi, Uppsala, Suécia) em uma dose única pela gavagem oral (usando agulhas de alimentação animal especiais estéreis de uso único não tóxicas) em uma dose de 10 a 20 pL/grama de peso corporal (B.W.) (Tuzcu et al. Drug Chem Toxicol 37: 261267, 2014; Kusminski et al. Nature Medicine 18: 1539-1549, 2012) ou pela injeção intraperitoneal em um único bolo de 0,1 a 1,0 mL (Mahadero et al. American J Surgery 164: 45-50, 1992) ou pela administração intragástrica de

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77/95 um óleo líquido dietético comercialmente disponível (vegetal grau alimentício, óleo de milho, soja ou oliva) em uma dose única de 10 a 20 pL/grama de peso corporal. Estes óleos foram uma fonte de TG - quando absorvido TG tende a ser decomposto dentro de 3 h (pico em 30 min) (Kritchevsky Nutritional Biochemistry 6: 172-178, 1995). Amostras de sangue (20 a 30 pL) foram obtidas do plexo retro-orbital nos pontos de tempo: -1 h, 0 h, 1 h, 3 h, 6 h e 24 h para a medição de lipídeos. Os camundongos foram retomados para as gaiolas metabólicas depois do ponto de tempo de 6 h onde o alimento foi colocado de volta. Uma vez que o estudo foi completado (depois de 24 horas da administração de gordura), os camundongos foram eutanizados e os órgãos coletados.

[00283] Em alguns casos, os camundongos foram retornados para gaiolas regulares e alojados durante mais 2 a 3 semanas para uma recuperação completa, antes de serem estudados em um outro experimento. Houve 1 grupo de controle que recebeu uma solução salina estéril grau farmacêutico no lugar do peptídeo.

[00284] O planejamento do estudo está apresentado na FIG. 55.

Estudo Triton WR1339 In Vivo [00285] A capacidade dos peptídeos miméticos de apolipoproteína para normalizar a hipertrigliceridemia em camundongos tratados com um inibidor de LPL, Tiloxapol, na presença de TG alto provido pelos 20% de Intralipid, foi avaliada.

[00286] Os camundongos foram jejuados durante a noite (aproximadamente 12 horas) antes do estudo e 6 horas durante o estudo, no dia seguinte. Os peptídeos miméticos de apo foram sinteticamente produzidos e livres de contaminação biológica (não disponível como compostos/tratamento aprovados pelo FDA). Os peptídeos foram produzidos e usados em condições estéreis e filtrados pelo filtro de 0,2 nm antes das injeções em uma dose única de 1 a 5 pmol/kg de B.W. S.C. ou I.P. ou I.V.

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78/95 (em uma solução estéril, grau farmacêutico de PBS em um volume < 200 pL). Em seguida, 10% de Tiloxapol (Triton WR-1339, T-0307, Sigma-Aldrich) foram injetados I.V. em uma dose única de 5 pL/grama de B.W., como descrito mais no princípio (Zhang Y.L. et al., J Biol Chem. 279: 1936219374, 2004; Abe C. et al., J. Nutr. 137: 345-350, 2007). Tiloxapol é um detergente não iônico que inibe LPL e consequentemente a depuração de triglicerídeos do soro (Rasouli M. et al., J Clin. Diagn. Research. 10: BF01BF05, 2016). Finalmente, cada animal recebeu 20% de Intralipid (aprovado pelo FDA, Fresenius Kabi, Uppsala, Suécia) em uma dose única pela gavagem oral (usando agulhas de alimentação animal especiais estéreis de uso único não tóxicas) — em uma dose de 10 a 20 pL/grama de B.W. (Tuzcu K. et al., Drug Chem Toxicol., 37: 261-267, 2014, Kusminski C. et al., Nature Medicine. 18: 1539-1549, 2012) ou pela injeção intraperitoneal — em um único bolo de 0,1 a 1,0 mL (Mahadero G. et al., American J Surgery. 164: 4550, 1992). As amostras de sangue (20 a 30 pL) foram obtidas do plexo retroorbital nos pontos de tempo: -1 h, 0 h, 1 h, 3 h, 6 h e 24 h para as medições de lipídeos. Os camundongos foram retomados para as gaiolas metabólicas depois do ponto de tempo de 6 h onde o alimento foi colocado de volta. Uma vez que o estudo foi completado (depois de 24 horas da administração de Intralipid), os camundongos foram eutanizados e os órgãos coletados.

[00287] Em alguns casos, os camundongos foram retornados para as gaiolas regulares e alojados por mais 2 a 3 semanas para uma recuperação completa, antes de serem estudados em um outro experimento. Houve 2 grupos de controle, ambos recebendo uma solução salina estéril grau farmacêutico no lugar do peptídeo ou Triton WR1339).

[00288] O planejamento do estudo está apresentado na FIG. 56.

Estudos In vivo no modelo de macacos obesos [00289] Macacos com um nível de TG maior do que 2 mmol/L foram selecionados, treinados e designados em 3 grupos (controle, 1 mg/kg de

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DeltaóPV, e 5 mg/kg de DeltaóPV). A dose desejada foi injetada intravenosamente nos animais no ponto de tempo 0 h. Os macacos foram monitorados durante o curso de 72 horas e as amostras de sangue em pontos de tempo diferentes foram coletadas para análise de biomarcador.

Exemplo 1: Planejamento de Peptídeo [00290] A apolipoproteína C-II (apoC-II) é um ativador fisiológico da lipoproteína lipase (LPL) e pode promover a hidrólise de triglicerídeo em lipoproteínas. Uma falta de apoC-II funcional leva à hipertrigliceridemia severa, similar ao que é observado para uma deficiência genética de LPL (Breckenridge et al.,NEngl J Med. 298: 1265-1273, 1978).

[00291] A forma madura de apoC-II humana consiste em 79 resíduos de aminoácido. A estrutura secundária de apoC-II foi determinada por várias medidas, com resíduos 17 a 38 designados como hélice 1, resíduos 45 a 57 designados como hélice 2, e resíduos 65 a 74/75 designados como hélice 3 (Zdunek et al., Biochemistry 42: 1872-1889, 2003). O um terço do terminal C de apoC-II, que é necessário para a ativação de LPL, é mais conservado entre espécies diferentes do que os dois terços do terminal N de apoC-II, que é necessário para a ligação de lipídeo (Shen et al., Gene 254: 189-198, 2000). A homologia dos resíduos de aminoácido 40 a 58 da proteína de apoC-II humana madura através de várias espécies é mostrada na FIG. 1.

[00292] De modo a fabricar um peptídeo que ativa LPL clinicamente útil, nós planejamos peptídeos miméticos de apoC-II de hélice única e bihelicoidal. Nós introduzimos várias modificações, tais como alongamentos, truncagens, mutações, e modificações químicas para as hélices de proteína de apoC-II nativa humana.

[00293] Algumas modificações, tais como as substituições de aminoácido, aumentaram o momento hidrofóbico da sequência de aminoácido nativa de apoC-II. Por exemplo, como mostrado na FIG. 2A e FIG. 2B, a substituição de T para D na posição 40, a substituição de P para K na posição

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43, a substituição de D para F na posição 46, e a substituição de S para F na posição 56 aumentaram o momento hidrofóbico dos resíduos de aminoácido 40 a 57 de 6,04 para 9,62. Como mostrado na FIG. 3A e FIG. 3B, a substituição de T para D na posição 40, a substituição de P para K na posição 43, a substituição de A para E na posição 44, a substituição de D para F na posição 46, e a substituição de S para F na posição 56 aumentaram o momento hidrofóbico dos resíduos de aminoácido 40 a 57 de 6,04 a 11,08. A FIG. 4A e FIG. 4B mostram que uma substituição de T para D na posição 40, a substituição de P para K na posição 43, a substituição de A para E na posição 44, a substituição de D para F na posição 46, a substituição de S para E na posição 54, e a substituição de S para F na posição 56 aumentaram o momento hidrofóbico dos resíduos de aminoácido 40 a 57 de 6,04 para 12,48.

[00294] As modificações químicas também foram introduzidas para aumentar a associação dos peptídeos miméticos de apoC-II para partículas lipídicas e para realçar outras características terapêuticas dos peptídeos miméticos de apoC-II, tais como permeabilidade celular aumentada e/ou meia-vida biológica prolongada. A FIG. 5 mostra os exemplos de peptídeos miméticos de apoC-II modificados pelo ácido esteárico.

[00295] Uma lista de peptídeos miméticos de apoC-II e as suas sequências é mostrada na Tabela 2 abaixo, onde “nL” indica norleucina e “Aib” indica ácido aminoisobutírico.

Tabela 2
Nome	Sequência	SEQ ID NO
Deltaó	DILKEVFEKLRDLYEKFTAAnLSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 6
DeltaóV	DILKEVFEKLRDLYEKFTAAVSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 7
DeltaóL	DILKEVFEKLRDLYEKFTAALSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 8
DeltaóPV	DILKEVFEKLRDLYEKFTPAVSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 9
DeltaóPL	DILKEVFEKLRDLYEKFTPALSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 10
DeltaóMP	DILKEVFEKLRDLYEKFTPAMSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 11
Delta6MPK-4R	DILREVFERLRDLYERKTPAMSTYTGIFTDQVLSVLRGEE	SEQ ID NO: 12
Deltaó-NH	DILKEVFEKLRDLYEKFTAAnLSTYTGIFTDQVLSVLKGEE_N H2	SEQ ID NO: 13
Deltaób-P	DILKEVFEKLRDLYEKKcisTPAnLSTYTGIFTDQVLSVLKGE E	SEQ ID NO: 14
Deltaób-A	DILKEVFEKLRDLYEKKcisTAAnLSTYTGIFTDQVLSVLKGE E	SEQ ID NO: 15
Delta4	DILKAVFEKLRDLYSKFTAAnLSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 16
Delta4 S15E	DILKAVFEKLRDLYEKFTAAnLSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 17

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Tabela 2
Nome	Sequência	SEQ ID NO
Delta4 T18F	DILKAVFEKLRDLYSKFFAAnLSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 18
Delta4 Y24S	DILKAVFEKLRDLYSKFTAAnLSTSTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 19
Delta4Q31R	DILKAVFEKLRDLYSKFTAAnLSTYTGIFTDRVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 20
Delta4Q31K	DILKAVFEKLRDLYSKFTAAnLSTYTGIFTDKVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 21
Delta4 Truncado	KRDLYEKKFAAnLSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 22
mono-acil-Delta4	cisDILKAVFEKLRDLYSKFTAAnLSTYTGIFTDQVLSVLKGE E	SEQ ID NO: 23
bi-acil-Delta4	cisDILKAVFEKKcisRDLYSKFTAAnLSTYTGIFTDQVLSVLK GEE	SEQ ID NO: 24
Delta4b	DILKAVFEKLRDLYSKFTPAMSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 25
Delta4b S15E	DILKAVFEKLRDLYEKFTPAMSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 26
Delta4b S15K	DILKAVFEKLRDLYKKFTPAMSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 27
Delta4b R11K	DILKAVFEKLKDLYSKFTPAMSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 28
Delta4b Y2W	DWEKAVFEKERDEYSKFTPAMSTYTGIFTDQVESVEKGEE	SEQ ID NO: 29
Delta4b T18F	DILKAVFEKLRDLYSKFFPAMSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 30
Delta4b V6F/F7Y/Y14L/F 17A/T18F	DILKAFYEKLRDLLSKAFPAMSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 31
Delta4b-1	DIEKAVKcisEKERDEYSKFTPAMSTYTGIFTDQVESVEKGE E	SEQ ID NO: 32
Delta4b-2	DIEKAVFEKKcisRDEYSKFTPAMSTYTGIFTDQVESVEKGE E	SEQ ID NO: 33
Delta4b-3	DILKAVFEKLRDLYSKKcisTPAMSTYTGIFTDQVLSVLKGE E	SEQ ID NO: 34
Delta4c	DILKAVFEKLRDLYSKFTAAKcieSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 35
Delta4c trunc3	KAVFEKLRDLYSKFTAAKcieSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 36
Delta4c trunc4	DVFEKLRDLYSKFTAAKcieSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 37
Delta4c trunc7	EKLRDLYSKFTAAKcieSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 38
Delta4c trunclO	RDLYSKFTAAKcieSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 39
Delta4c truncl 1	DLYSKFTAAKcieSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 40
Delta4c truncl4	DKFTAAKcieSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 41
Delta5	DILKEVFEKLRDLYSKFTAAnLSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 42
Delta5b Y2W	DWLKAVFEKLRDLYEKFTPAMSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 43
Delta5b T18F	DILKAVFEKLRDLYEKFFPAMSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 44
Delta5b Y2W/T18F	DWLKAVFEKLRDLYEKFFPAMSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 45
Delta5b Y2W M2 INF	DWLKAVFEKLRDLYEKFTPAnLSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 46
Delta5b T18F M2 INF	DILKAVFEKLRDLYEKFFPAnLSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 47
Delta5b Y2W/T18F M2 INF	DWLKAVFEKLRDLYEKFFPAnLSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 48
C2thirdhelix	AMSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 49
C2thirdhelixStear ilposl	cisAMSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 50
C2thirdhelix Stearilpos2	AKcisSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 51
C2thridhélice Stearilposl7	AMSTYTGIFTDQVLSVLKcisGEE	SEQ ID NO: 52
Delta6T18F-PV	DILKEVFEKLRDLYEKFFPAVSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 53
Delta6T18F-PV- AIB7,17	DILKEVAibEKLRDLYEKAibFPAVSTYTGIFTDQVLSVLKGE E	SEQ ID NO: 54
Deltal3-31-PV	DKVKEFLSEYWEKAKEFAPAVSTYTGIFTDQVLSVLKGEE	SEQ ID NO: 55

Exemplo 2: Peptídeos miméticos de ApoC-II exemplares com substituições de aminoácido promovem a hidrólise de TG in vitro

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82/95 [00296] Para determinar o possível impacto de peptídeos miméticos de apoCII sobree a hidrólise de TG, nós avaliamos o efeito dos peptídeos usando um ensaio de lipólise in vitro.

[00297] O ensaio de LPL com soros de paciente deficiente em apoC-II mostrou que os peptídeos miméticos de apoC-II exemplares Delta4, Delta5, e Delta6, assim como variantes Delta4 de mono-acil-Delta4 e bi-acil-Delta4, foram capazes de promover a hidrólise de TG na presença de LPL. Em concentrações mais baixas, a maior parte dos peptídeos miméticos testados, tais como Delta4, Delta5, e Delta6, funcionaram mais eficientemente do que a proteína de apoC-II nativa (FIG. 6).

[00298] O ensaio de LPL usando Intralipid como substrato confirmou que todos os peptídeos miméticos de apoC-II testados foram capazes de promover a hidrólise de TG na presença de LPL. Os peptídeos miméticos de apoC-II Delta4 e Delta5 funcionaram mais eficientemente do que a proteína de apoC-II nativa nas concentrações dentre cerca de 1 nM a cerca de 10 μΜ (FIG. 7).

[00299] Estes resultados mostram que os peptídeos miméticos de apoC-II exemplares Delta4, Delta5, e Delta6 são capazes de promover a hidrólise de TG in vitro.

Exemplo 3: Variantes de Delta4 e terceira hélice de apoC-II promovem a hidrólise de TG in vitro [00300] A região de dobradiça entre a hélice 2 e hélice 3 da proteína apoC-II permite que as duas hélices retenham uma conformação relativamente reta. A hélice 3 inclina para fora da hélice 2 uniformemente em direções diferentes em um ângulo de não mais do que cerca de 20°. Acreditase que esta conformação ajude a hélice 3, que contém o domínio de ativação de LPL, a ligar-se à superfície da micela de lipoproteína. A incorporação de uma prolina na posição 58 do domínio de dobradiça preserva e acentua a conformação. As variantes de Delta4, tais como Delta4b, Delta4b-1, e

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Delta4b S54E, compreendem uma prolina na posição 58.

[00301] O peptídeo mimético de apoC-II C2thirdhelix compreende os resíduos de aminoácido 59 a 79 da proteína apoC-II. C2thirdhelixStearilposl, C2thirdhelixStearilpos2, e C2thirdhelixStearilposl7 compreendem uma modificação no ácido esteárico de C2thirdhelix em diferentes resíduos de aminoácido.

[00302] Como mostrado na FIG. 8, a maior parte dos peptídeos miméticos de apoC-II mencionados acima exibiram a capacidade para promover a hidrólise de TG na presença de LPL quando soros de paciente deficiente em apoC-II foram usados como substrato. Uma olhada mais de perto nos resultados de C2thirdhelix, C2thirdhelixStearilposl, C2thirdhelixStearilpos2, e C2thirdhelixStearilposl7 revelou que a lipidação realçou a capacidade de C2thirdhelix para promover a hidrólise de TG (FIG.

9). Uma comparação dos peptídeos miméticos de apoC-II Delta4, Delta4b, e Delta4b-3 revelou que a incorporação de prolina na posição 58 e a modificação do ácido esteárico no resíduo de lisina na posição 56 realçaram a capacidade de depuração de TG do peptídeo mimético de apoC-II exemplar Delta4 (FIG. 10). A FIG. 11 confirmou que a lipidação de peptídeo mimético de apoC-II Delta4b realçou a sua capacidade para realçar a lipólise, especialmente em concentrações mais baixas.

[00303] Nós testamos ainda os peptídeos miméticos de apoC-II em uma ampla faixa de concentrações de 100 pM a 10 μΜ. Os peptídeos miméticos de apoC-II, Delta4b-1, Delta4b-2, Delta4b-3, Delta4b, Delta4b T57F, e Delta4, promoveram a hidrólise de TG em uma maneira dependente da dose. Todos os peptídeos miméticos de apoC-II testados neste experimento funcionaram mais eficientemente do que a proteína apoC-II de tamanho natural (FIG. 12).

[00304] O peptídeo Delta4c compreendeu uma lisina modificada no ácido palmítico (K) na posição 60, e seus derivados incluíram truncagens no

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84/95 terminal C em 3, 4, 7, 10, 11 on 14 aminoácidos. Em um ensaio de LPL com soros de paciente deficiente em apoC-II como substrato e em uma faixa de concentrações de peptídeo de 10 pM a 100 μΜ, Delta4c e as suas variantes de truncamento promoveram a hidrólise de TG (FIG. 13).

[00305] Juntos, estes resultados mostram que as variantes de peptídeo mimético de apoC-II Delta4 exemplares e variantes da terceira hélice de apoC-II podem promover a hidrólise de TG in vitro.

Exemplo 4: Variantes de Delta5 promovem a hidrólise de TG in vitro [00306] Substituições de aminoácido adicionais foram feitas ao peptídeo mimético de apoC-II Delta5b, que compreende uma prolina na posição 58 e uma metionina na posição 60.

[00307] O ensaio de LPL foi realizado usando soros de paciente deficiente em apoC-II como substrato. Os peptídeos foram testados em uma faixa de concentrações de 100 pM a 10 nM. Como mostrado na FIG. 14, todas as variantes de Delta5 e Deltaó com as substituições de aminoácido indicadas exibiram a capacidade para promover a hidrólise de TG em uma maneira dependente da dose.

[00308] Estes resultados mostram que as variantes do peptídeo mimético de apoC-II Delta5 exemplar são capazes de promover a hidrólise de TG in vitro.

Exemplo 5: Variantes de Deltaó promovem a hidrólise de TG in vitro [00309] O peptídeo mimético de apoC-II Deltaó exemplar foi modificado ainda para ser mais adequado para a expressão recombinante. DeltaóL compreende um resíduo de leucina (L) na posição 60. DeltaóPV compreende uma prolina (P) na posição 58 e uma valina (V) na posição 60. DeltaóPV compreende uma prolina (P) na posição 58 e uma leucina (V) na posição 60. Delta6T18F-PV compreende ainda uma fenilalanina (F) na posição 57 comparada com DeltaóPV. Delta6T18F-PV-AIB7.17 compreende ainda um ácido aminoisobutírico (Aib) nas posições 46 e 56 e uma

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85/95 fenilalanina (F) na posição 57 comparada com DeltaóPV.

[00310] Como mostrado nas FIGs. 15A-D, o peptídeo Deltaó e suas variantes DeltaóL, DeltaóPV, e DeltaóPL ativaram LPL in vitro quando soros de paciente com hipertrigliceridemia foram usados como substrato. As concentrações de triglicerídeo dos soros de paciente variaram de cerca de 1000 mg/dL a cerca de 1700 mg/dL.

[00311] Nós testamos ainda a atividade do peptídeo Deltaó e sua variante DeltaóPV em uma ampla faixa de concentrações de 10 pM a 10 μΜ. Soros de paciente deficiente em apoC-II foram usados como substrato. Como mostrado na FIG. 51, Deltaó e DeltaóPV ativaram LPL in vitro mais eficientemente do que a proteína apoC-II de tamanho natural.

[00312] Adicionalmente, as variantes de Delta 6 DeltaóPV, Delta6T18F-PV, e Delta6T18F-PV-AIB7,17 ativaram LPL in vitro com amostras de soro de pacientes deficientes em apoC-II (FIG. 52).

[00313] Nós geramos um peptídeo mimético de apoC-II, Deltal3-31PV, que compreende uma variante da hélice 1 de apoC-II. Deitai 3-31-PV tem a sequência de DKVKEFLSEYWEKAKEFAPAVSTYTGIFTDOVLSV LKGEE (SEQ ID NO: 55), com as substituições de aminoácido na hélice 1 de apoC-II sublinhadas. O peptídeo Deitai3-31-PV promoveu a hidrólise de TG in vitro em uma maneira dependente da dose (FIG. 52).

[00314] Estes resultados mostram que as variantes de peptídeo mimético de apoC-II Deltaó exemplar e o peptídeo mimético de apoC-II compreendendo a variante da hélice 1 de apoC-II são capazes de promover a hidrólise de TG in vitro.

Exemplo 6: Delta4 e as suas variantes realçaram a lipólise in vivo [00315] ApoC-II é um cofator para lipoproteína lipase, uma enzima que hidrolisa triglicerídeos. A deficiência de ApoC-II resulta na hipertrigliceridemia em indivíduos humanos. Como descrito em Sakurai et al., J Pharmacol Exp Ther 356: 341-353, 2016, nós criamos camundongos

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86/95 nocautes em apoC-II que tiveram TG plasmático alto.

[00316] Peptídeo mimético de apoC-II Delta4 foi injetado subcutaneamente em camundongos nocautes em apoC-II e os lipídeos plasmáticos foram monitorados com o tempo (FIG. 16). A injeção de Delta4 resultou em uma redução rápida e acentuada de TG plasmático. A injeção subcutânea de Delta4 também levou a uma diminuição no nível de colesterol total (FIG. 17).

[00317] Os camundongos nocaute em apoC-II também foram injetadas com peptídeo Delta4 intraperitonealmente (FIGs 18 e 19). Similarmente, a injeção de Delta4 levou a uma redução acentuada de TG plasmático com uma diminuição máxima depois de cerca de 3 horas. A injeção intraperitoneal também levou a uma diminuição no nível de colesterol total.

[00318] Os derivados de Delta4 Delta4b e Delta4b-3 também foram testados quanto à sua capacidade para promover a hidrólise de TG in vivo (FIG. 20). Depois de uma gavagem oral com óleo vegetal, o TG sérico aumentou em camundongos C57BL/6 em cerca de 4,5 vezes em 3 h. Quando os camundongos foram intraperitonealmente injetados 30 min antes da gavagem com um peptídeo mimético de apoC-II Delta4, Delta4b ou Delta4b-3, o TG aumentado foi significantemente reduzido.

[00319] Estes resultados mostram que o peptídeo mimético de apoC-II Delta4 e suas variantes tiveram a capacidade para realçar a lipólise in vivo.

Exemplo 7: Lipólise de Delta6 e suas variantes realçadas in vivo [00320] Peptídeo mimético de apoC-II Delta6 foi injetado intraperitonealmente em camundongos nocautes em apoC-II e os lipídeos plasmáticos foram monitorados com o tempo (FIG. 21). A injeção de Delta6 resultou em uma redução rápida e acentuada de TG plasmático. A injeção intraperitoneal de Delta6 também levou a uma diminuição no nível de colesterol total (FIG. 22).

[00321] Como mostrado na FIG. 23, três doses diferentes de peptídeo

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Deltaó (0,25, 0,5, e 1 pmol/kg de peso corporal) foram injetadas intraperitonealmente em camundongos nocautes em apoC-II e o TG plasmático foi monitorado com o tempo. Todas as doses de Deltaó levaram a uma redução rápida e acentuada de TG plasmático.

[00322] Variantes de Deltaó, Deltaób-A, Deltaób-P, e Deltaó-NH também foram testadas quanto à sua capacidade para realçar a lipólise in vivo na concentração de 0,25 pmol/kg de peso corporal. Todas as variantes Deltaó resultaram em uma redução significante de TG plasmático a seguir da sua injeção intraperitoneal em camundongos nocautes em apoC-II (FIG. 24).

[00323] Como mostrado na FIG. 53, variantes Deltaó DeltaóPV e Deltaó-T18F-PV foram injetados intraperitonealmente em camundongos nocautes em apoC-II a 0,1 pmol/kg de peso corporal e o TG plasmático foi monitorado com o tempo. Tanto DeltaóPV quanto Deltaó-T18F-PV levaram a uma redução rápida de TG plasmático nos camundongos nocautes em apoC-II com uma redução máxima em cerca de 6 horas depois da injeção de peptídeo.

[00324] Estes resultados mostram que o peptídeo mimético de apoC-II Deltaó e suas variantes tiveram a capacidade para realçar a lipólise in vivo.

Exemplo 8: Deslocamento de ApoC-III pelos Peptídeos Miméticos de ApoC-II [00325] ApoC-III é comumente associada com as lipoproteínas ricas em triglicerídeo e foi identificada como um modulador potente dos níveis plasmáticos de TG. A ApoC-III regula os níveis de plasmático TG através de uma variedade de mecanismos, incluindo a supressão da atividade de lipoproteína lipase (LPL) e efeitos independentes de LPL na depuração de TG. Nós investigamos o efeito de peptídeos miméticos de apoC-II no deslocamento de apoC-III.

[00326] A incubação de VLDL e quilomicrons isolados do plasma humano com diferentes concentrações de peptídeo mimético de apoC-II Deltaó mostraram que o Deltaó teve uma afinidade maior para o VLDL e

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88/95 quilomicrons do que as apolipoproteinas (FIG. 25). Similarmente, a incubação de VLDL isolado do plasma humano com Deltaó e seus derivados, Delta6-A, Delat6-P, e Delta6-NH, mostraram que o Deltaó e seus derivados foram capazes de deslocar a apoC-III (FIG. 26).

[00327] Como mostrado na FIG. 27, o ensaio de LPL in vitro foi realizado com o soro do paciente com hipertrigliceridemia. Os peptídeos miméticos de apoC-II Delta4 e Deltaó aumentaram a atividade de LPL em pacientes com altos níveis de proteína apoC-III.

[00328] Estes resultados mostram que os peptídeos miméticos de apoC-II Delta4, Delató e suas variantes são capazes de deslocar apoC-III e aumentar a lipólise in vitro no soro de um paciente com alto teor de proteína apoC-III.

Exemplo 9: Deslocamento de ApoC-III pelo peptídeo de ApoC-II-a [00329] Nós investigamos o efeito do peptídeo apoC-II-a no deslocamento de apoC-III.

[00330] A incubação de VLDL isolado do plasma humano com um peptídeo apoC-II-a exógeno mostrou que a apoC-II-a tem uma afinidade maior para o VLDL do que as apolipoproteinas (FIG. 28). A análise de espectrometria de massa MALDI-TOF mostrou que um peptídeo apoC-II-a substituiu seletivamente apoC-III e apoC-I, mas não apoC-II (FIG. 29A), de modo interessante, a ligação do peptídeo de apoC-II-a a VLDL é quase proporcional à sua concentração (FIG. 29B).

[00331] A incubação de quilomicrons isolados do plasma humano com um peptídeo de apoC-II-a exógeno mostrou que a apoC-II-a tem uma afinidade maior para quilomicrons do que as apolipoproteinas (FIG. 30).

[00332] O ensaio de LPL foi realizado usando Intralipid como um substrato. Como mostrado na FIG. 31, o apoC-III inibiu a produção do ácido graxo livre (NEFA). A adição do peptídeo de apoC-II-a supera o efeito inibidor de apoC-III e facilitou a lipólise em uma maneira dependente da

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89/95 dose.

[00333] O ensaio de LPL também foi realizado usando plasma humano alto em high TG como um substrato em uma diluição de 1:50 diluição. Os resultados são mostrados na FIG. 32. Quando 50 μΜ da proteína de apoC-III recombinante foram adicionados, a produção de ácido graxo livre (NEFA) caiu de cerca de 3,2 μΜ a cerca de 1,7 μΜ. O peptídeo ApoC-II-a foi adicionado em várias concentrações. Em uma concentração de 0,01 μΜ, de início para afetar a lipólise. Em uma concentração de cerca de 0,2 μΜ, esta superou o efeito inibidor de apoC-III. Concentrações mais altas de apoC-II-a também facilitaram a lipólise. A pré-incubação de apoC-III com plasma humano não mudou o efeito do peptídeo de apoC-II-a.

[00334] Nós também testamos o plasma de camundongos transgênicos expressando excessivamente a apoC-III humana. A apoC-III no plasma inibiu a lipólise, consistente com a capacidade conhecida das altas concentrações de apoC-III causarem a hipertrigliceridemia. No ensaio de LPL usando o plasma de camundongos transgênicos apoC-III, um peptídeo de apoC-II-a superou o efeito inibidor da expressão elevada de apoC-III em todos as amostras plasmáticas dos três camundongos transgênicos (FIG. 33).

Exemplo 10: ApoC-II-a enfraquece a hipertrigliceridemia pós-prandial em camundongos através de mecanismos adicionais à ativação da lipoproteína lipase.

[00335] A hipertrigliceridemia pós-prandial é um fator de risco importante para doença cardiovascular (CVD). Recentemente, descrevemos um peptídeo mimético de apoC-II (apoC-II-um) que ativa a LPL e diminui a TG no soro em camundongos apoC-II-KO. Para investigar a apoC-II-a como uma terapia para a hipertrigliceridemia pós-prandial, nós investigamos seu efeito em vários modelos de camundongo depois de um teste de inoculação de gordura.

[00336] Depois de uma gavagem oral com óleo vegetal (10 pL/grama),

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90/95 a TG no soro aumentou em 3 h em camundongos C57BL/6 em pelo menos 5vezes mas quando os camundongos foram injetados 30 min antes da gavagem com apoC-II-a (1 pmoL/kg; IP ou SQ), a elevação da TG pósprandial foi quase completamente enfraquecida. O nível de TG pós-prandial no soro de camundongos é mostrado nas FIGs. 34A e 34B. Resultados similares foram verificados em camundongos apoE-KO, indicando que o efeito de apoC-II-a é independente de apoE (não mostrado). A ApoC-II-a não pareceu funcionar no nível de absorção de TG, por que a mesma também acelerou rapidamente a depuração no soro de TG depois da injeção IP de 20 % de Intralipid. A adição de LPL exógeno às amostras de soro coletadas depois da injeção IP com Intralipid revelou que as partículas de lipoproteína dos camundongos tratados com apoC-II-a foram os melhores substratos para LPL.

[00337] A elevação do TG no soro depois da injeção IP de Intralipid foi apenas parcialmente bloqueada em cerca de 50 % quando os camundongos foram coinjetados com o inibidor de LPL Triton WR1339, indicando que a apoC-II-a funciona adicionalmente para um mecanismo independente de LPL. As FIGs. 34A e 34B mostram a comparação da TG pós-prandial no soro de camundongos com ou sem a coinjeção de Triton. A incubação de soro humano com apoC-II-a exógeno em doses comparáveis àquelas obtidas in vivo em camundongos mostrou que a apoC-II-a liga à todas lipoproteínas, incluindo HDL e causa o deslocamento de apoC-I e apoC-III. Além disso, a inibição in vitro de LPL da adição de apoC-III exógeno pode ser superada adicionando-se apoC-II-a em uma razão molar de pelo menos 1:10 de comparado com a apoC-III.

[00338] Em resumo, o peptídeo de apoC-II-a mimético em doses relativamente baixas pode acelerar a depuração do TG pós-prandial depois de uma carga de gordura. Este faz isso, em parte para ativar a LPL, como esperado. Inesperadamente, entretanto, verificamos que a apoC-II-a também

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91/95 reduz os níveis de triglicerídeo aliviando-se a inibição de LPL por apoC-III, e também possivelmente bloqueando-se os outros efeitos independentes de LPL conhecidos de apoC-III, e possivelmente apoC-I, atrasando a depuração pósprandial do TG.

Exemplo 11: DeltaóPV aumentou a lipólise in vivo em modelos de camundongo (estudos de dose única) [00339] O efeito do peptídeo DeltaóPV na lipólise in vivo foi investigado em camundongos do tipo selvagem, nocaute em apoC-II, e apoCIII transgênicos com estudos de dose única.

[00340] Depois de uma injeção intraperitoneal de Intralipid, o TG no soro aumentou significantemente nos camundongos tipo selvagem. A coinjeção do inibidor de LPL Triton também aumentou o nível de TG no soro em mais do que 1000 vezes no ponto de tempo de 6 h. Quando os camundongos foram intraperitonealmente injetados com o peptídeo mimético de apoC-II DeltaóPV, o aumento de TG foi significantemente reduzido (FIG. 35B). O peptídeo DeltaóPV reverteu a inibição de LPL por Triton.

[00341] O peptídeo mimético de apoC-II DeltaóPV foi injetado intraperitonealmente (FIG. 36B) ou subcutaneamente (FIG. 36C) em camundongos nocautes em apoC-II e o nível de TG plasmático foi monitorado com o tempo. A injeção de DeltaóPV resultou em uma redução rápida e acentuada do TG plasmático.

[00342] Depois de uma injeção intraperitoneal com Intralipid, o TG no soro aumentou em camundongos nocautes em apoC-II em cerca de 7 vezes 6 horas depois da injeção. Quando os camundongos foram intraperitonealmente injetados com o peptídeo DeltaóPV 1 hora depois da injeção de Intralipid, o aumento de TG foi significantemente reduzido (FIG. 37B).

[00343] O peptídeo DeltaóPV foi injetado intraperitonealmente em camundongos transgênicos apoC-III e o nível de TG plasmático foi monitorado com o tempo. A injeção de DeltaóPV resultou em uma redução

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92/95 rápida e acentuada do TG plasmático com uma diminuição máxima depois de cerca de 6 horas depois da injeção (FIG. 38B).

[00344] Depois de uma injeção intraperitoneal com Intralipid, o TG no soro aumentou em camundongos apoC-III transgênicos em cerca de 4 vezes 6 horas depois da injeção. Quando os camundongos foram intraperitonealmente injetados com o peptídeo DeltaóPV 1 hora depois da injeção de Intralipid, o aumento na TG foi significantemente reduzido (FIG. 39).

[00345] Os estudos de dose única mostram que o peptídeo mimético de apoC-II DeltaóPV tem a capacidade para aumentar a lipólise in vivo em modelos de camundongo.

Exemplo 12: DeltaóPV aumentou a lipólise in vivo em modelos de camundongo (estudos de dose repetida) [00346] Os camundongos do tipo selvagem, camundongos nocautes em apoC-II, e camundongos transgênicos apoC-III foram injetados com o peptídeo mimético de apoC-II DeltaóPV múltiplas vezes através da injeção intraperitoneal.

[00347] O DeltaóPV peptídeo foi injetado intraperitonealmente em camundongos nocautes em apoC-II em intervalos de 24 h durante 6 dias e o nível de TG plasmático foi medido em 0 h, 3 h e 6 h no Dia leOh, 3h, eóh no Dia 6. A injeção repetida de DeltaóPV resultou em uma redução notável e duradoura do TG plasmático (FIG. 40). SEC-FPLC (cromatografia por exclusão de tamanho - cromatografia líquida de proteína rápida) foi operada nas amostras de plasma reunidas de 0 h e 6 h no Dia leOheóhno Dia 6 dos camundongos tratados com o peptídeo DeltaóPV a 1 pmole/kg (B. W.). Como mostrado na FIG. 41, o nível de VLDL diminuiu 6 horas depois da injeção do DeltaóPV peptídeo, enquanto o nível de HDL aumentou, como medido pelo nível de fosfolipídeo. O nível de TG também diminuiu no VLDL pool (FIG. 42).

[00348] O peptídeo DeltaóPV foi injetado intraperitonealmente em

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93/95 camundongos transgênicos apoC-III em intervalos de 24 h durante 5 dias e os lipídeos plasmáticos foram monitorados no Dia 1 e Dia 5 como indicado na FIG. 43A. A injeção repetida de DeltaóPV resultou em um TG plasmático inferior 1 h, 3 h, e 6 h depois da injeção de peptídeo no Dia 1 e Dia 5 se comparado com as condições de controle (FIG. 43 B e FIG. 44). As amostras de plasma de 0 h e 3 h no Dia 1 e Dia 5 dos camundongos tratados com 5 pmole/kg de (B. W.) DeltaóPV peptídeo foram aplicadas a SEC-FPLC para separar as populações de VLDL e HDL. Os níveis de apoC-III em VLDL e HDL foram medidos por ELISA. A apoC-III diminuiu tanto em VLDL e HDL nos camundongos tratados com DeltaóPV (FIG. 45A e FIG. 45B). Este resultado indica que a DeltaóPV reduziu o nível de apoC-III em VLDL e HDL pelo deslocamento.

[00349] Depois de uma injeção intraperitoneal com Intralipid, o TG no soro aumentou nos camundongos do tipo selvagem em mais do que 40 vezes por 3 hours depois da injeção. Quando os camundongos foram intraperitonealmente injetada com o peptídeo DeltaóPV 1 hora depois da injeção de Intralipid, o aumento de TG foi significantemente reduzido (FIG. 46B).

[00350] Os estudos de dose repetida mostram que o peptídeo mimético de apoC-II DeltaóPV tem a capacidade para aumentar a lipólise in vivo nos modelos de camundongo.

Exemplo 13: DeltaóPV aumentou a lipólise in vivo em modelo de macaco obeso [00351] O peptídeo mimético de apoC-II DeltaóPV foi injetado intravenosamente em macacos obesos com um nível plasmático de TG de mais do que 2 mmol/L e os lipídeos plasmáticos foram monitorados com o tempo. Uma injeção única de peptídeo DeltaóPV leva a uma redução significante do nível de TG plasmático medido a 24 h, 48 h, e 72 h depois da injeção (FIG. 47). O efeito do peptídeo DeltaóPV no modelo de macaco obeso

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94/95 é dependente da dose.

[00352] A injeção do peptídeo DeltaóPV também levou a uma redução notável do nível de VLDL (FIG. 48A), embora os níveis de LDL e HDL não mudaram significantemente (FIG. 48B e FIG. 48C).

[00353] Em resumo, o peptídeo mimético de apoC-II DeltaóPV tem a capacidade de aumentar a lipólise in vivo e reduzir o nível de VLDL no modelo de macaco obeso.

Exemplo 14: Deslocamento de ApoC-III pelo peptídeo DeltaóPV [00354] Nós investigamos o efeito de peptídeo DeltaóPV no deslocamento de apoC-III.

[00355] A incubação de VLDL isolado do plasma humano com peptídeo DeltaóPV mostrou que o peptídeo DeltaóPV tem uma afinidade maior para o VLDL do que as apolipoproteínas. Como mostrado na FIG. 49, o deslocamento de peptídeo DeltaóPV deslocou a apoC-III em uma maneira dependente da dose. A apoC-II em VLDL também foi deslocada no peptídeo DeltaóPV.

[00356] O ensaio de LPL também foi realizado usando plasma deficiente em apoC-II humano como um substrato. Os resultados são mostrados na FIG. 50. Quando 25 μΜ da proteína apoC-III recombinante foram adicionados, a produção de ácido graxo livre (NEFA) caiu de cerca de 1,5 μΜ para cerca de 0,8 μΜ. Os peptídeos Deltaó e DeltaóPV foram adicionados em várias concentrações. A adição de peptídeos Deltaó e DeltaóPV superou o efeito inibidor de apoC-III e facilitou a lipólise.

[00357] Estes resultados mostram que o peptídeo DeltaóPV é capaz de deslocar a apoC-III e aumentar a lipólise in vitro.

[00358] Enquanto a invenção foi particularmente mostrada e descrita com referência a uma modalidade preferida e várias modalidades alternadas, será entendido por aqueles versados na técnica relevante que várias mudanças na forma e detalhes podem ser aqui realizadas sem romper com o espírito e

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95/95 escopo da invenção.

[00359] Todas as referências, parentes publicadas e pedidos de patente citados dentro do corpo do presente relatório descritivo são aqui incorporados por referência na sua totalidade, para todos os propósitos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Peptídeo mimético apoC-II isolado de não mais do que 50 aminoácidos, caracterizado pelo fato de que compreende do terminal N para o terminal C um primeiro domínio helicoidal, uma região de dobradiça e um segundo domínio helicoidal, em que o primeiro domínio helicoidal é anfipático, e em que o peptídeo mimético apoC-II não é um peptídeo da SEQ ID NO: 56.
2. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio é a hélice nativa 1 de apoC-II.
3. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio é uma variante da hélice 1 de apoC-II.
4. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio é a hélice nativa 2 de apoC-II.
5. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio é uma variante da hélice 2 de apoC-II.
6. Peptídeo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a variante da hélice 2 de apoC-II compreende o alongamento da hélice 2 de apoC-II.
7. Peptídeo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a hélice 2 de apoC-II é alongada em 1 a 10 aminoácidos no terminal N.
8. Peptídeo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a hélice 2 de apoC-II é alongada em 1 aminoácido no terminal N.
9. Peptídeo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o aminoácido é ácido aspártico.
10. Peptídeo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a hélice 2 de apoC-II é alongada em 2 aminoácidos no terminal N.

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2/20
11. Peptídeo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que os aminoácidos são lisina e alanina do terminal N para o terminal C.
12. Peptídeo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a hélice 2 de apoC-II é alongada em 5 aminoácidos no terminal N.
13. Peptídeo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a hélice 2 de apoC-II é alongada na sequência de aminoácidos nativa a montante de apoC-II humana ou um mutante da sequência de aminoácidos nativa a montante de apoC-II humana.
14. Peptídeo de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a variante da hélice 2 de apoC-II compreende um ácido aspártico na posição 40.
15. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que a variante da hélice 2 de apoC-II compreende uma tirosina ou um triptofano na posição 41.
16. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que a variante da hélice 2 de apoC-II compreende uma leucina na posição 42.
17. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, caracterizado pelo fato de que a variante da hélice 2 de apoC-II compreende uma lisina ou uma arginina na posição 43.
18. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 17, caracterizado pelo fato de que a variante da hélice 2 de apoC-II compreende uma alanina ou um ácido glutâmico na posição 44.
19. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18, caracterizado pelo fato de que a variante da hélice 2 de apoC-II compreende um ácido aspártico na posição 40, uma tirosina na posição 41, uma leucina na posição 42, uma lisina na posição 43 e um ácido glutâmico na

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3/20 posição 44.
20. Peptídeo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a variante da hélice 2 de apoC-II compreende truncamento da hélice 2 de apoC-II.
21. Peptídeo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que os resíduos de aminoácido 45-46 da hélice nativa 2 de apoCII são deletados.
22. Peptídeo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que os resíduos de aminoácido 45-48 da hélice nativa 2 de apoCII são deletados.
23. Peptídeo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que os resíduos de aminoácido 45-49 da hélice nativa 2 de apoCII são deletados.
24. Peptídeo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que os resíduos de aminoácido 45-50 da hélice nativa 2 de apoCII são deletados.
25. Peptídeo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que os resíduos de aminoácido 45-53 da hélice nativa 2 de apoCII são deletados.
26. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 25, caracterizado pelo fato de que a variante da hélice 2 de apoC-II compreende pelo menos uma mutação da hélice 2 de apoC-II.
27. Peptídeo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a mutação é uma substituição de aminoácido.
28. Peptídeo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que um aminoácido original da hélice 2 de apoC-II é substituído por um natural aminoácido.
29. Peptídeo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que um aminoácido original da hélice 2 de apoC-II é substituído

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4/20 por um aminoácido não natural.
30. Peptídeo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que um aminoácido original da hélice 2 de apoC-II é substituído por um análogo de aminoácido.
31. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizado pelo fato de que a substituição de aminoácido está na posição 45.
32. Peptídeo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a valina na posição 45 é substituída pela fenilalanina.
33. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizado pelo fato de que a substituição de aminoácido está na posição 46.
34. Peptídeo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o ácido aspártico na posição 46 é substituído por uma fenilalanina.
35. Peptídeo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o ácido aspártico na posição 46 é substituído por uma lisina.
36. Peptídeo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o ácido aspártico na posição 46 é substituído por um ácido aminoisobutírico.
37. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizado pelo fato de que a substituição de aminoácido está na posição 48.
38. Peptídeo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a lisina na posição 48 é substituída por uma arginina.
39. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizado pelo fato de que a substituição de aminoácido está na posição 49.
40. Peptídeo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado

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5/20 pelo fato de que a leucina na posição 49 é substituída por uma lisina.
41. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizado pelo fato de que a substituição de aminoácido está na posição 50.
42. Peptídeo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a arginina na posição 50 é substituída por uma lisina.
43. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizado pelo fato de que a substituição de aminoácido está na posição 53.
44. Peptídeo de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a tirosina na posição 53 é substituída por uma leucina.
45. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizado pelo fato de que a substituição de aminoácido está na posição 54.
46. Peptídeo de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a serina na posição 54 é substituída por um ácido glutâmico.
47. Peptídeo de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a serina na posição 54 é substituída por uma lisina.
48. Peptídeo de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a serina na posição 54 é substituída por um ácido aspártico.
49. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizado pelo fato de que a substituição de aminoácido está na posição 55.
50. Peptídeo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a lisina na posição 55 é substituída por uma arginina.
51. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizado pelo fato de que a substituição de aminoácido está na posição 56.
52. Peptídeo de acordo com a reivindicação 51, caracterizado

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6/20 pelo fato de que a serina na posição 56 é substituída por uma fenilalanina.
53. Peptídeo de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a serina na posição 56 é substituída por uma lisina.
54. Peptídeo de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a serina na posição 56 é substituída por uma alanina.
55. Peptídeo de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a serina na posição 56 é substituída por um ácido aminoisobutírico.
56. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizado pelo fato de que a substituição de aminoácido está na posição 57.
57. Peptídeo de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que a treonina na posição 57 é substituída por uma fenilalanina.
58. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizado pelo fato de que a variante da hélice 2 de apoC-II compreende três substituições de aminoácido, em que as substituições de aminoácido estão na posição 46, posição 54 e posição 56.
59. Peptídeo de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o ácido aspártico na posição 46 é substituído por uma fenilalanina, a serina na posição 54 é substituída por um ácido glutâmico, e a serina na posição 56 é substituída por uma fenilalanina.
60. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 59, caracterizado pelo fato de que a variante da hélice 2 de apoC-II compreende pelo menos uma modificação química.
61. Peptídeo de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a modificação química é uma ligação covalente de um ácido graxo.
62. Peptídeo de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 4 a 26 carbonos.

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7/20
63. Peptídeo de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 10 carbonos.
64. Peptídeo de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 12 carbonos.
65. Peptídeo de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 14 carbonos.
66. Peptídeo de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 16 carbonos.
67. Peptídeo de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 18 carbonos.
68. Peptídeo de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 20 carbonos.
69. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 68, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é saturado.
70. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 68, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é insaturado.
71. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 70, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é ligado ao aminoácido de terminal N.
72. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 71, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é ligado a um grupo lateral de aminoácido.
73. Peptídeo de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é ligado à ε-amina de um resíduo de lisina.
74. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça compreende 5 a 10 aminoácidos.
75. Peptídeo de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça compreende 7 aminoácidos.

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8/20
76. Peptídeo de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça compreende uma prolina.
77. Peptídeo de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça compreende uma prolina na posição 58.
78. Peptídeo de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça compreende uma alanina.
79. Peptídeo de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça compreende uma alanina na posição 58.
80. Peptídeo de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça compreende uma norleucina.
81. Peptídeo de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça compreende uma norleucina na posição 60.
82. Peptídeo de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça compreende uma lisina.
83. Peptídeo de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça compreende uma lisina na posição 60.
84. Peptídeo de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça compreende uma valina.
85. Peptídeo de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça compreende uma valina na posição 60.
86. Peptídeo de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça compreende uma leucina.
87. Peptídeo de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça compreende uma leucina na posição 60.
88. Peptídeo de acordo com a reivindicação 74, caracterizado

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9/20 pelo fato de que a região de dobradiça compreende uma metionina.
89. Peptídeo de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça compreende uma metionina na posição 60.
90. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 89, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça compreende pelo menos uma modificação química.
91. Peptídeo de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que a modificação química é uma ligação covalente de um ácido graxo.
92. Peptídeo de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 4 a 26 carbonos.
93. Peptídeo de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 10 carbonos.
94. Peptídeo de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 12 carbonos.
95. Peptídeo de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 14 carbonos.
96. Peptídeo de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 16 carbonos.
97. Peptídeo de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 18 carbonos.
98. Peptídeo de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 20 carbonos.
99. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 98, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é saturado.
100. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 98, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é insaturado.
101. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações

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10/20

91 a 100, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é ligado a um grupo lateral de aminoácido.
102. Peptídeo de acordo com a reivindicação 101, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é ligado à ε-amina de um resíduo de lisina.
103. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a região de dobradiça permite que o primeiro domínio helicoidal e o segundo domínio helicoidal retenham uma conformação quase reta, em que o segundo domínio se afasta do primeiro domínio em um ângulo de não mais do que cerca de 20°.
104. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio é a hélice nativa 3 de apoC-II.
105. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 103, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio é uma variante da hélice 3 de apoC-II.
106. Peptídeo de acordo com a reivindicação105, caracterizado pelo fato de que a variante da hélice 3 de apoC-II compreende alongamento da hélice 3 de apoC-II.
107. Peptídeo de acordo com a reivindicação106, caracterizado pelo fato de que a hélice 3 de apoC-II é alongada em 1a 10 aminoácidos no terminal C.
108. Peptídeo de acordo com a reivindicação107, caracterizado pelo fato de que a hélice 3 de apoC-II é alongada em 4 aminoácidos no terminal C.
109. Peptídeo de acordo com a reivindicação 108, caracterizado pelo fato de que a hélice 3 de apoC-II é alongada nos aminoácidos lisina, glicina, ácido glutâmico e ácido glutâmico do terminal N para o terminal C.

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11/20
110. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 105 a 109, caracterizado pelo fato de que a variante da hélice 3 de apoC-II compreende pelo menos uma mutação da hélice 3 de apoC-II.
111. Peptídeo de acordo com a reivindicação 110, caracterizado pelo fato de que a mutação é uma substituição de aminoácido.
112. Peptídeo de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pelo fato de que um aminoácido original da hélice 3 de apoC-II é substituído por um aminoácido natural.
113. Peptídeo de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pelo fato de que um aminoácido original da hélice 3 de apoC-II é substituído por um aminoácido não natural.
114. Peptídeo de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pelo fato de que um aminoácido original da hélice 3 de apoC-II é substituído por um análogo de aminoácido.
115. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 114, caracterizado pelo fato de que a substituição de aminoácido está na posição 70.
116. Peptídeo de acordo com a reivindicação 115, caracterizado pelo fato de que a glutamina na posição 70 é substituída por uma arginina.
117. Peptídeo de acordo com a reivindicação 115, caracterizado pelo fato de que a glutamina na posição 70 é substituída por uma lisina.
118. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 105 a 117, caracterizado pelo fato de que a variante da hélice 3 de apoC-II compreende pelo menos uma modificação química.
119. Peptídeo de acordo com a reivindicação 118, caracterizado pelo fato de que a modificação química é uma ligação covalente de um ácido graxo.

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12/20
120. Peptídeo de acordo com a reivindicação 119, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 4 a 26 carbonos.
121. Peptídeo de acordo com a reivindicação120, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 10 carbonos.
122. Peptídeo de acordo com a reivindicação120, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 12 carbonos.
123. Peptídeo de acordo com a reivindicação120, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 14 carbonos.
124. Peptídeo de acordo com a reivindicação120, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 16 carbonos.
125. Peptídeo de acordo com a reivindicação120, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 18 carbonos.
126. Peptídeo de acordo com a reivindicação120, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 20 carbonos.
127. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 119 a 126, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é saturado.
128. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 119 a 126, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é insaturado.
129. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 119 a 128, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é ligado ao aminoácido de terminal C.
130. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 119 a 129, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é ligado a um grupo lateral de aminoácido.
131. Peptídeo de acordo com a reivindicação 130, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é ligado à ε-amina de um resíduo de lisina.
132. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 119 a 131, caracterizado pelo fato de que o aminoácido de terminal C é

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13/20 modificado por uma amida de terminal C.
133. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o peptídeo mimético apoC-II isolado compreende adicionalmente uma etiqueta de purificação.
134. Peptídeo de acordo com a reivindicação 133, caracterizado pelo fato de que a etiqueta de purificação é uma etiqueta de poli-histidina, uma etiqueta myc ou uma etiqueta HA.
135. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio tem uma afinidade para a ligação às lipoproteínas.
136. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio é capaz de ativar a lipoproteína lipase (LPL).
137. Peptídeo de acordo com a reivindicação 135 ou 136, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é capaz de ativar lipólise pela LPL.
138. Peptídeo de acordo com a reivindicação 135 ou 136, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é capaz de deslocar apoC-III nas lipoproteínas.
139. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é capaz de reduzir o nível de triglicerídeo (TG) in vivo.
140. Peptídeo de acordo com a reivindicação 139, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é capaz de reduzir o nível de TG elevado causado pela deficiência de LPL.
141. Peptídeo de acordo com a reivindicação 139, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é capaz de reduzir o nível de TG elevado causado pela apoC-III elevada.
142. Peptídeo de acordo com a reivindicação 139, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é capaz de reduzir o nível de TG

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14/20 elevado causado pela deficiência de apoC-II.
143. Peptídeo de acordo com a reivindicação 139, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é capaz de reduzir nível pósprandial de TG elevado.
144. Peptídeo mimético apoC-II isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6.
145. Peptídeo mimético apoC-II isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9.
146. Peptídeo mimético apoC-II isolado de não mais do que 30 aminoácidos, caracterizado pelo fato de que consiste em uma variante da hélice 3 de apoC-II.
147. Peptídeo de acordo com a reivindicação146, caracterizado pelo fato de que a variante da hélice 3 de apoC-II compreende alongamento da hélice 3 de apoC-II.
148. Peptídeo de acordo com a reivindicação147, caracterizado pelo fato de que a hélice 3 de apoC-II é alongada em 1a 10 aminoácidos no terminal N.
149. Peptídeo de acordo com a reivindicação148, caracterizado pelo fato de que a hélice 3 de apoC-II é alongada em 6 aminoácidos no terminal N.
150. Peptídeo de acordo com a reivindicação 149, caracterizado pelo fato de que a variante da hélice 3 de apoC-II compreende uma lisina ou metionina na posição 60.
151. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 147 a 150, caracterizado pelo fato de que a hélice 3 de apoC-II é alongada em 1 a 10 aminoácidos no terminal C.
152. Peptídeo de acordo com a reivindicação 151,

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15/20 caracterizado pelo fato de que a hélice 3 de apoC-II é alongada em 4 aminoácidos no terminal C.
153. Peptídeo de acordo com a reivindicação 152, caracterizado pelo fato de que a hélice 3 de apoC-II é alongada em aminoácidos lisina, glicina, ácido glutâmico e ácido glutâmico do terminal N para o terminal C.
154. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 153, caracterizado pelo fato de que a variante da hélice 3 de apoC-II compreende pelo menos uma mutação da hélice 3 de apoC-II.
155. Peptídeo de acordo com a reivindicação 154, caracterizado pelo fato de que a mutação é uma substituição de aminoácido.
156. Peptídeo de acordo com a reivindicação 155, caracterizado pelo fato de que um aminoácido original da hélice 3 de apoC-II é substituído por um aminoácido natural.
157. Peptídeo de acordo com a reivindicação 155, caracterizado pelo fato de que um aminoácido original da hélice 3 de apoC-II é substituído por um aminoácido não natural.
158. Peptídeo de acordo com a reivindicação 155, caracterizado pelo fato de que um aminoácido original da hélice 3 de apoC-II é substituído por um análogo de aminoácido.
159. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 158, caracterizado pelo fato de que a variante da hélice 3 de apoC-II compreende pelo menos uma modificação química.
160. Peptídeo de acordo com a reivindicação 159, caracterizado pelo fato de que a modificação química é uma ligação covalente de um ácido graxo.
161. Peptídeo de acordo com a reivindicação 160, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 4 a 26 carbonos.
162. Peptídeo de acordo com a reivindicação 161,

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16/20 caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 10 carbonos.
163. Peptídeo de acordo com a reivindicação 161, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 12 carbonos.
164. Peptídeo de acordo com a reivindicação161, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 14 carbonos.
165. Peptídeo de acordo com a reivindicação161, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 16 carbonos.
166. Peptídeo de acordo com a reivindicação161, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 18 carbonos.
167. Peptídeo de acordo com a reivindicação161, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo compreende 20 carbonos.
168. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 160 a 167, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é saturado.
169. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 160 a 167, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é insaturado.
170. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 160 a 169, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é ligado ao aminoácido de terminal N.
171. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 160 a 169, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é ligado ao aminoácido de terminal C.
172. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 160 a 171, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é ligado a um grupo lateral de aminoácido.
173. Peptídeo de acordo com a reivindicação 172, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é ligado à ε-amina de um resíduo de lisina.
174. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 173, caracterizado pelo fato de que o peptídeo mimético apoC-II

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17/20 isolado compreende adicionalmente uma etiqueta de purificação.
175. Peptídeo de acordo com a reivindicação 174, caracterizado pelo fato de que a etiqueta de purificação é uma etiqueta de poli-histidina, uma etiqueta myc ou um etiqueta HA.
176. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 175, caracterizado pelo fato de que a variante da hélice 3 de apoC-II tem uma afinidade para a ligação às lipoproteínas.
177. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 176, caracterizado pelo fato de que a variante da hélice 3 de apoC-II é capaz de ativar lipoproteína lipase (LPL).
178. Peptídeo de acordo com a reivindicação 176 ou 177, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é capaz de ativar lipólise pela LPL.
179. Peptídeo de acordo com a reivindicação 176 ou 177, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é capaz de deslocar apoC-III em lipoproteínas.
180. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 179, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é capaz de reduzir o nível de triglicerídeo (TG) in vivo.
181. Peptídeo de acordo com a reivindicação 180, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é capaz de reduzir o nível de TG elevado causado pela deficiência de LPL.
182. Peptídeo de acordo com a reivindicação 180, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é capaz de reduzir o nível de TG elevado causado pela apoC-III elevada.
183. Peptídeo de acordo com a reivindicação 180, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é capaz de reduzir o nível de TG elevado causado pela deficiência de apoC-II.
184. Peptídeo de acordo com a reivindicação 180, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é capaz de reduzir nível pós

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18/20 prandial de TG elevado.
185. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores e um carreador farmaceuticamente aceitável.
186. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 185, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é adequada para injeção subcutânea.
187. Método para tratar hipertrigliceridemia em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz do peptídeo ou da composição farmacêutica como definida qualquer uma das reivindicações anteriores.
188. Método de acordo com a reivindicação 187, caracterizado pelo fato de que a hipertrigliceridemia está associada com a obesidade.
189. Método de acordo com a reivindicação 187, caracterizado pelo fato de que a hipertrigliceridemia está associada com diabete melito.
190. Método de acordo com a reivindicação 187, caracterizado pelo fato de que a hipertrigliceridemia está associada com consumo de álcool.
191. Método de acordo com a reivindicação 187, caracterizado pelo fato de que a hipertrigliceridemia está associada com medicação.
192. Método de acordo com a reivindicação 187, caracterizado pelo fato de que a hipertrigliceridemia é causado pela deficiência de LPL.
193. Método de acordo com a reivindicação 192, caracterizado pelo fato de que a hipertrigliceridemia é deficiência familiar da lipoproteína lipase.
194. Método de acordo com a reivindicação 192 ou 193, caracterizado pelo fato de que a deficiência de LPL é causada por uma mutação no gene da LPL.
195. Método de acordo com a reivindicação 194, caracterizado pelo fato de que a mutação leva à atividade enzimática da LPL reduzida

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196. Método de acordo com a reivindicação 194, caracterizado pelo fato de que a mutação leva à atividade enzimática da LPL ausente.
197. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 192 a 196, caracterizado pelo fato de que a deficiência de LPL é diagnosticada pela ausência da atividade de LPL no soro do paciente.
198. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 194 a 196, caracterizado pelo fato de que a mutação é detectada pela análise de sequência de DNA.
199. Método de acordo com a reivindicação 187, caracterizado pelo fato de que a hipertrigliceridemia é causada pela deficiência de apoC-II.
200. Método de acordo com a reivindicação 187, caracterizado pelo fato de que a hipertrigliceridemia é causada pela apoC-III elevada.
201. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 187 a 200, caracterizado pelo fato de que a concentração sérica de triglicerídeo (TG) do paciente no pré-tratamento está entre 150 mg/dL e 199 mg/dL.
202. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 187 a 200, caracterizado pelo fato de que a concentração sérica de triglicerídeo (TG) do paciente no pré-tratamento está entre 200 mg/dL a 499 mg/dL.
203. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 187 a 200, caracterizado pelo fato de que a concentração sérica de triglicerídeo (TG) do paciente no pré-tratamento está entre 500 mg/dL a 999 mg/dL.
204. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 187 a 200, caracterizado pelo fato de que a concentração sérica de triglicerídeo (TG) do paciente no pré-tratamento está entre 1000 mg/dL e 1999 mg/dL.
205. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

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187 a 200, caracterizado pelo fato de que a concentração sérica de triglicerídeo (TG) do paciente no pré-tratamento é igual a ou mais alta do que 2000 mg/dL.
206. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 187 a 205, caracterizado pelo fato de que o paciente desenvolveu ou está em risco para pancreatite aguda.
207. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 187 a 206, caracterizado pelo fato de que o paciente desenvolveu ou está em risco para doença cardiovascular aguda.
208. Método para fabricar o peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 184, caracterizado pelo fato de que compreende produzir o peptídeo de maneira recombinante.
209. Método para fabricar o peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 184, caracterizado pelo fato de que compreende produzir o peptídeo pela síntese química.