BR112019011627A2 - oxabiciclo-heptanos para modulação da resposta imunológica - Google Patents
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Abstract
a presente invenção refere-se a um método para tratar um indivíduo que sofre de câncer compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um inibidor de pp2a.
Description
OXABICICLO-HEPTANOS PARA MODULAÇÃO DA RESPOSTA
HMUNOLÓGUCA.
Referência Remissiva a Pedidos Relacionados [001 ] Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente US provisória série número 62/497,949, depositado em 8 de dezembro de
2016, do pedido de patente US provisória série número 62/465,001, depositado em 28 de fevereiro de 2017, e do pedido de patente US provisória série número 62/545,373, depositado em 14 de agosto de
2017, cuja íntegra está aqui incorporada a título de referência. Antecedentes da Invenção [002] A proteína fosfatase 2A (PP2A) é uma serina/treonina fosfatase ubíqua que desfosforila numerosas proteínas tanto das vias de resposta ATM/ATR-dependentes quanto -independentes (Mumby, M. 2007). Já foi anteriormente mostrado que a inibição farmacológica de PP2A sensibiliza as células cancerosas a danos em DNA mediados por radiação via a fosforilação constitutiva de várias proteínas sinalizadoras, tais como p53, yH2AX, PLK1 e Akt, resultando na desregulação do ciclo celular, inibição de reparo de DNA, e apoptose (Wei, D. et al. 2013).
[003] Já foi mostrado que a cantaridina, o principal princípio ativo do extrato de besouro de bolha (Mylabrís), é um composto derivado da medicina chinesa tradicional, que é um potente inibidor de PP2A (Efferth, T. et al. 2005). Embora a cantaridina tenha sido previamente usada no tratamento de hepatomas e tenha apresentado eficácia contra linhagens celulares de leucemia resistentes a múltiplas fármacos (Efferth, T. et al. 2002), sua severa toxicidade limita sua utilidade clínica. LB-100 é um derivado de moléculas pequenas da cantaridina com significativamente menos toxicidade. Estudos pré-clínicos anteriores já mostraram que o LB-100 pode melhorar os efeitos citotóxicos de
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2/104 temozolomida, doxorubicina, e radioterapia contra glioblastoma (GBM), feocromocitoma metastático, e câncer de pâncreas (Wei, D. eta!. 2013; Lu, J. eta/. 2009; Zhang, C. eta/. 2010; Martiniova, L. eta/. 2011). LB100 também está passando por um estudo fase 1 em combinação com docetaxel para o tratamento de tumores sólidos (Chung, V. 2013). Sumário da Invenção [004] A presente invenção apresenta um método para tratar um indivíduo que sofre de câncer compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um inibidor de PP2A em combinação com uma quantidade eficaz de um inibidor de ponto de verificação, onde as quantidades quando tomadas juntas são eficazes para tratar o indivíduo. [005] A presente invenção também apresenta um método para tratar um indivíduo que sofre de câncer e receber um inibidor de ponto de verificação compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade de inibidor de PP2A eficaz para melhorar o tratamento em relação ao inibidor de ponto de verificação isoladamente.
[006] A presente invenção também apresenta um método para tratar um tumor ou câncer em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um inibidor de PP2A em combinação com uma quantidade eficaz de um inibidor de ponto de verificação, onde as quantidades quando tomadas juntas são eficazes para tratar o tumor ou câncer.
[007] A presente invenção também apresenta um método para aumentar a resposta de células T a células cancerosas em um indivíduo que sofre de câncer compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade de um inibidor de PP2A em combinação com uma quantidade eficaz de um inibidor de ponto de verificação eficaz para aumentar a resposta de células T a células cancerosas.
[008] A presente invenção também apresenta um método para aumentar a ativação de células T em um indivíduo que sofre de câncer
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3/104 compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um inibidor de PP2A em combinação com uma quantidade eficaz de um inibidor de ponto de verificação para assim aumentar a ativação de células T.
[009] A presente invenção também apresenta um método para inibir a função de CTLA-4 em células T compreendendo administrar às células T um inibidor de PP2A para assim inibir a função de CTLA-4.
[0010] A presente invenção também apresenta um método para inibir a interação de PD-1:PD-L1 em células T compreendendo administrar às células T um inibidor de PP2A para assim inibir a interação de PD-1 :PD~L1.
Breve Descrição dos Desenhos [0011] Figura 1. Maior alteração no tamanho da lesão indicadora nos pacientes com doença mensurável no momento do ingresso.
[0012] Figura 2. Duração da estabilidade ou resposta parcial (círculo vermelho) da doença (número de ciclos) para cada paciente em ordem crescente de ingresso no estudo.
[0013] Fig. 3A. A inibição de PP2A aumenta significativamente a produção de IFN-γ em células T CD4. Produção de IFN gama a partir de células T CD4 ativadas com contas CD3/CD28 por 5 dias na presença ou ausência de LB-100 a 40nM. LB-100 foi adicionado ou substituído no 3°dia.
[0014] Fig. 3B. A inibição de PP2A aumenta significativamente a produção de IFN~y em células T CD4. Produção de IFN gama a partir de células T CD4 ativadas com contas CD3/CD28 por 5 dias na presença ou ausência de LB-100 em diferentes concentrações. LB-100 foi adicionado ou substituído no 3°dia.
[0015] Fig. 4A. A inibição de PP2A aumenta significativamente a produção de proliferação de células T CD4. Percentagem de células T CD4 proliferadas com contas CD3/CD28 por 5 dias na presença ou
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4/104 ausência de LB-100 a 1000πΜ. LB-100 foi adicionado ou adicionado ou substituído no 3°dia.
[0016] Fig. 4B. A inibição de PP2A aumenta significativamente a produção de proliferação de células T CD4. Percentagem de células T CD4 proliferadas com contas CD3/CD28 por 5 dias na presença ou ausência de LB-100 em diferentes concentrações. LB-100 foi adicionado ou substituído no 3°dia.
[0017] Fig. 5A. A inibição de PP2A aumenta significativamente a produção de proliferação de células T CD4. Diagrama de fluxo representativo de células T CD4 proliferadas com contas CD3/CD28 por 5 dias na ausência de LB-100. LB-100 foi adicionado ou substituído no 3°dia.
[0018] Fig. 5B. A inibição de PP2A aumenta significativamente a produção de proliferação de células T CD4. Diagrama de fluxo representativo de células T CD4 proliferadas com contas CD3/CD28 por 5 dias na presença de LB-100 a 1000nM. LB-100 foi adicionado ou substituído no 3°dia.
[0019] Fig. 6A. A inibição de PP2A aumenta significativamente a produção de expressão de 0X40 da molécula coestimuladora em células T. Percentagem de 0X40 expressando células T CD4 com contas CD3/CD28 por 5 dias na presença ou ausência de LB-100 a 1000nM. LB-100 foi adicionado ou substituído no 3o dia.
[0020] Fig. 6B. A inibição de PP2A aumenta significativamente a produção de expressão de 0X40 da molécula coestimuladora em células T. Percentagem de 0X40 expressando células T CD4 com contas CD3/CD28 por 5 dias na presença ou ausência de LB-100 em diferentes concentrações. LB-100 foi adicionado ou substituído no 3o dia.
[0021] Fig. 7A. Inibição de PP2A melhora Tbet, um fator de trancrição para induzir a produção de IFNy em células T CD4.
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Percentagem de Tbet expressando células T CD4 com contas
CD3/CD28 por 5 dias na presença ou ausência de LB-100 a 1000nM.
LB-100 foi adicionado ou substituído no 3cdia.
[0022] Fig. 7B. Inibição de PP2A melhora Tbet, um fator de trancrição para induzir a produção de IFNy em células T CD4. Percentagem de células dendríticas derivadas de monócitos em cocultura com células T CD4 por 5 dias na presença ou ausência de LB100 em diferentes concentrações com ou sem anticorpo anti-PD1. LB100 foi adicionado ou substituído no 3°dia.
[0023] Fig. 8A. Proliferação aumentada de células T CD4 com tratamento combinado. Percentagem de células dendríticas derivadas de monócitos em cocultura com células T CD4 proliferadas por 5 dias na presença ou ausência de LB-100 a 8nM com ou sem anticorpo antiPD1. LB-100 foi adicionado ou substituído no 3°dia .
[0024] Fig. 8B. Proliferação aumentada de células T CD4 com tratamento combinado. Percentagem de células dendríticas derivadas de monócitos em cocultura com células T CD4 proliferadas por 5 dias na presença ou ausência de LB-100 em diferentes concentrações com ou sem anticorpo anti~PD1. LB-100 foi adicionado ou substituído no 3o dia.
[0025] Fig. 9A. Gráfico de citometria proliferação de células T CD4 em controle.
[0026] Fig. 9B. Gráfico de citometria proliferação de células T CD4 em LB-100.
[0027] Fig. 9C. Gráfico de citometria proliferação de células T GD4 em anti-PD-1 [0028] Fig. 9D. Gráfico de citometria proliferação de células T CD4 em LB-100 + anti-PD-1.
[0029] Fig. 10A. Expressão aumentada de 0X40 em células T CD4 com tratamento combinado. Percentagem de 0X40 expressando de de de de fluxo fluxo fluxo fluxo representativo representativo representativo representativo da da da da
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6/104 células dendríticas derivadas de monócitos cocultivadas com células T
CD4 proliferadas por 5 dias na presença ou ausência de LB-100 a 8nM com ou sem anticorpo anti~PD1 at 0,05nM. LB-100 foi adicionado ou substituído no 3°dia.
[0030] Fig. 10B. Expressão aumentada de 0X40 em células T CD4 com tratamento combinado. Percentagem de 0X40 expressando células dendríticas derivadas de monócitos cocultivadas com células T CD4 proliferadas por 5 dias na presença ou ausência de LB-100 em diferentes concentrações com ou sem anticorpo anti~PD1. LB-100 foi adicionado ou substituído no 3°dia.
[0031] Fig. 11 A. Expressão aumentada de Tbet em células T CD4 com tratamento combinado. Percentagem de Tbet expressando células T CD4 cocultivadas com células dendríticas derivadas de monócitos por 5 dias na presença ou ausência de LB-100 a 200nM com ou sem anticorpo anti-PD1. LB-100 foi adicionado ou substituído no 3°dia.
[0032] Fig. 11B. Expressão aumentada de Tbet em células T CD4 com tratamento combinado. Percentagem de expressão de Tbet em células T CD4 cocultivadas com células dendríticas derivadas de monócitos por 5 dias na presença ou ausência de LB-100 em diferentes concentrações com ou sem anticorpo anti-PD1. LB-100 foi adicionado ou substituído no 3°dia.
[0033] Figure 12. O inibidor de PP2A reduziu significativamente o crescimento tumoral de melanoma B16 de camundongo em camundongos tratados a cada dois dias por 8 doses. O tratamento teve início no mesmo dia do implante do tumor. Controle - PBS, dose baixa -0,16 mg/kg, dose média - 0,32 mg/kg.
[0034] Fig. 13A. O inibidor de PP2A aumentou as células efetoras CD4/8 em camundongos naíves. Dose baixa de tratamento com LB in vivo induzir mais células T efetoras CD8 (à esquerda) e CD4 (à direita) nos nódulos linfáticos. 5 camundongos por grupo. Controle - PBS, Dose
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7/104 baixa-0,16 mg/kg, Dose média - 0,32 mg/kg.
[0035] Fig. 13B. O inibidor de PP2A aumentou as células efetoras CD4/8 em camundongos naíves. Gráfico de citometria de fluxo representativo de CD44+CD62L- CD8 (à esquerda) e CD4 (à direita) na Fig. 13A. Controle - PBS, Dose baixa -0,16 mg/kg, Dose média - 0,32 mg/kg.
[0036] Fig. 14A. O inibidor de PP2A reduziu a expressão de PD-1 em células T CD8 no sangue e no baço. Dose baixa de tratamento com LB in vivo reduziu as células T CD8+ expressando PD-1 no sangue.
[0037] Fig. 14B. O inibidor de PP2A reduziu a expressão de PD-1 em células T CD8 no sangue e no baço. Dose média de tratamento com LB in vivo as células T CD8+ expressando PD-1 no baço.
[0038] Figure 15. O inibidor de PP2A aumentou a produção de IFNya partir de células T humanas. Produção de IFNy no sobrenadante de células T CD4 cocultivadas com DCs derivadas de monócitos na presença de LB-100, ou anti-PD-1 ou combinação (LB-100 e anti-PD1)· [0039] Fig. 16A. O inibidor de PP2A reduziu a expressão de PD-1 em células T CD4 humanas. Percentagem de células T CD4 expressando PD-1 que foram cocultivadas com DCs derivadas de monócitos na presença de controle de isótipo.
[0040] Fig. 16B. O inibidor de PP2A reduziu a expressão de PD-1 em células T CD4 humanas. Percentagem de células T CD4 expressando PD-1 que foram cocultivadas com DCs derivadas de monócitos na presença de LB-100.
[0041] Fig. 16C. O inibidor de PP2A reduziu a expressão de PD-1 em células T CD4 humanas. Percentagem de células T CD4 expressando PD-1 que foram cocultivadas com DCs derivadas de monócitos na presença de anti-PD-1.
[0042] Fig. 16D. O inibidor de PP2A reduziu a expressão de PD-1
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8/104 em células T CD4 humanas. Percentagem de células T CD4 expressando PD-1 que foram cocultivadas com DCs derivadas de monócitos na presença de combinação (LB-100 e anti-PD-1).
[0043] Fig. 17A. As células T efetoras CD8+CD44+ são aumentadas com tratamento com o inibidor de PP2A LB-100. Percentagem da população de células T efetoras CD8+CD44+ em nódulo linfático de drenagem de tumor de camundongos portadores do tumor B16 tratados com LB-100 ou PBS. 5 camundongos por grupo.
[0044] Fig. 17B. As células T efetoras CD8+CD44+ são aumentadas com tratamento com o inibidor de PP2A LB-100. Gráfico de citometria de fluxo representativo dos dados mostrados na Fig. 17A. [0045] Fig. 18A. Células T efetoras CD4 CD44+CD62Laumentadas nos nódulos linfáticos de camundongos portadores do tumor B16. Percentagem da população de células T efetoras CD4 CD44+CD62L- nos nódulos linfáticos de camundongos portadores do tumor B16 tratados com LB-100 ou PBS. 5 camundongos por grupo.
[0046] Fig. 18B. Células T efetoras CD4 CD44+CD62Laumentadas nos nódulos linfáticos de camundongos portadores do tumor B16. Gráfico de citometria de fluxo representativo dos dados mostrados na Fig. 18A.
[0047] Fig. 19A. Células T efetoras CD8 CD44+CD62Laumentadas nos nódulos linfáticos de camundongos portadores do tumor B16. Percentagem da população de células T efetoras CD8 CD44+CD62L- nos nódulos linfáticos de camundongos portadores do tumor B16 tratados com LB-100 ou PBS. 5 camundongos por grupo.
[0048] Fig. 19B. Células T efetoras CD8 CD44+CD62Laumentadas nos nódulos linfáticos de camundongos portadores do tumor B16. Gráfico de citometria de fluxo representativo dos dados mostrados na Fig. 19A.
[0049] Fig. 20A. Camundongos BALB/c foram implantados
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9/104 subcutaneamente com células CT26 em seus flancos torácicos direitos.
Depois de 13 dias, os camundongos com tumores atingindo 30-100 mm3 de tamanho foram randomizados e tratados com PBS de controle, anti-PD-L1, LB-100, ou combinação (LB-100 e anti-PD-1) por 28 dias.
Volume tumoral individual ao longo do tempo.
[0050] Fig. 20B. Camundongos BALB/c foram implantados subcutaneamente com células CT26 em seus flancos torácicos direitos. Depois de 13 dias, os camundongos com tumores atingindo 30-100 mm3 de tamanho foram randomizados e tratados com PBS de controle, anti-PD-L1, LB-100, ou combinação (LB-100 e anti-PD-1) por 28 dias. Volume tumoral médio ao longo do tempo.
[0051] Fig. 20C. Camundongos BALB/c foram implantados subcutaneamente com células CT26 em seus flancos torácicos direitos. Depois de 13 dias, os camundongos com tumores atingindo 30-100 mm3 de tamanho foram randomizados e tratados com PBS de controle, anti-PD-L1, LB-100, ou combinação (LB-100 e anti-PD-1) por 28 dias. Sobrevida dos camundongos ao longo do tempo.
[0052] Fig. 21A. Cerca de 60 dias depois da inoculação inicial, os camundongos curados e os camundongos de controle naíves para CT26, foram (re)inoculados com células CT26 em seus flancos esquerdos. Volumes tumorais individuais ao longo do tempo.
[0053] Fig. 21B. Cerca de 60 dias depois da inoculação inicial, os camundongos curados e os camundongos de controle naíves para CT26, foram (re)inoculados com células CT26 em seus flancos esquerdos. Volumes tumorais médios ao longo do tempo.
[0054] Fig. 22A. Camundongos BALB/c foram implantados subcutaneamente com células CT26 em seus flancos torácicos direitos. Depois de 11 dias, os camundongos com tumores atingindo 30-100 mm3 de tamanho foram randomizados em quatro grupos: Controle, depleção de CD8, depleção de CD8 + Combinação (LB-100 e anti-PD
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1), ou apenas combinação (LB-100 e anti-PD-1). Os camundongos no grupo de depleção receberam então anticorpos depletores de CD8. Dois dias mais tarde os camundongos foram então iniciados no respectivo tratamento. Volume tumoral individual ao longo do tempo.
[0055] Fig. 22B. Camundongos BALB/c foram implantados subcutaneamente com células CT26 em seus flancos torácicos direitos. Depois de 11 dias, os camundongos com tumores atingindo 30-100 mm3 de tamanho foram randomizados em quatro grupos: Controle, depleção de CD8, depleção de CD8 + Combinação (LB-100 e anti-PD1), ou apenas combinação (LB-100 e anti-PD-1). Os camundongos no grupo de depleção receberam então anticorpos depletores de CD8. Dois dias mais tarde os camundongos foram então iniciados no respectivo tratamento. Volume tumoral médio ao longo do tempo.
[0056] Fig. 22C. Camundongos BALB/c foram implantados subcutaneamente com células CT26 em seus flancos torácicos direitos. Depois de 11 dias, os camundongos com tumores atingindo 30-100 mm3 de tamanho foram randomizados em quatro grupos: Controle, depleção de CD8, depleção de CD8 + Combinação (LB-100 e anti-PD1), ou apenas combinação (LB-100 e anti-PD-1). Os camundongos no grupo de depleção receberam então anticorpos depletores de CD8. Dois dias mais tarde os camundongos foram então iniciados no respectivo tratamento. Sobrevida dos camundongos ao longo do tempo.
[0057] Fig. 23A. Camundongos BALB/c foram inoculados subcutaneamente com células tumorosas CT26 nos flancos toráticos direitos e tratados com controle (PBS), LB-100, anti-PD-1, ou combinação (LB-100 e anti-PD-1), da maneira descrita nas Figs. 22AC. As células T infiltrantes de tumor foram analisadas por citometria de fluxo 12 dias depois do início do tratamento. A percentagem de células T CD8+ infiltrantes de tumor produzindo IFNyg+ depois de 4 horas de estimulação com PMA foi aumentada no grupo tratado com a
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11/104 combinação (*p = 0,05).
[0058] Fig. 23B. Camundongos BALB/c foram inoculados subcutaneamente com células tumorosas CT26 nos flancos toráticos direitos e tratados com controle (PBS), LB-100, anti-PD-1, ou combinação (LB-100 e anti-PD-1), da maneira descrita nas Figs. 22AC. As células T infiltrantes de tumor foram analisadas por citometria de fluxo 12 dias depois do início do tratamento. A percentagem de células T reguladoras CD4+FoxP3 + no tumor foi diminuída no grupo de tratamento com LB-100 (** p<0,01).
[0059] Fig. 24A. Camundongos BALB/c foram inoculados subcutaneamente com 0,5 x 106 células CT26 no flanco torácico direito. Quando os tumores atingiram entre 50-100 mm3 os camundongos foram randomizados em quatro grupos de tratamento e tratados a cada 2 dias por 4 semanas.
[0060] Fig. 24B. À esquerda, curvas de crescimento tumoral individual: controle, LB-100, a-PD-1, e combinação. No centro, tamanho tumoral médio ao longo do tempo. À direita, sobrevida cumulativa ao longo do tempo.
[0061] Fig. 24C. A eficácia da inibição de PP2A com bloqueio de PD-1 é dependente das células T CD8+. Camundongos BALB/c foram inoculados em 24A. Quando os tumores atingiram 30-100 mm3, os camundongos foram temporariamente depletados de células T CD8+ e tratados com combinação.
[0062] Fig. 24D. À esquerda, curvas de crescimento tumoral individual: controle, combinação, apenas depleção de CD-8, e combinação com depleção de CD8. No centro, tamanho tumoral médio ao longo do tempo. À direita, sobrevida cumulativa ao longo do tempo. Os dados são representativos de 2 experimentos independentes. *P < 0,05, **P < 0,01 e ****P < 0,0001 (teste log-rank de Mantel-Cox).
[0063] Fig. 25A. Camundongos BALB/c foram inoculados
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12/104 subcutaneamente com 0,5x106 células CT26 e tratados. Os camundongos CR ou naíves foram novamente desafiados cerca de 60 dias depois do implante inicial com 0,5 x 106 células CT26 no flanco torácico esquerdo ou em combinação com 1,25 x105 células 4T1 de carcinoma de mama no coxim adiposo do mamilo. Os camundongos novamente desafiados apenas com CT26 não apresentaram crescimento de tumores CT 26.
[0064] Fig. 25B. À esquerda, curvas de crescimento tumoral individual: naive, CR. À direita, tamanho tumoral médio ao longo do tempo.
[0065] Fig. 25C. Quantificação do volume do tumor CT26 18 dias depois da inoculação. (P<0,001, teste t de student de duas caudas).
[0066] Fig. 25D. Camundongos CR e naíves foram novamente desafiados com células do tumor CT26 e 4T1: naive - CT26, CR CT26, naive - 4T1, CR - 4T1. À esquerda, curvas de crescimento tumoral individual. À direita, tamanho tumoral médio ao longo do tempo. [0067] Fig. 25E. Quantificação do volume do tumor CT26 e do tumor 4T1 18 dias depois da inoculação. (P<0,0001, ANOVA unilateral com teste de comparações múltiplas de Tukey).
[0068] Fig. 25F. Imagem de camundongo naive e CR representativo subsequente à inoculação dos tumores CT26 e 4T1.
[0069] Fig. 26A. Gráficos representativos de FACS de CD44 e CD62L em células T CD8+ no baço.
[0070] Fig. 26B. Quantificação de CD62-CD44+ (de células T CD8+) no baço (n=4-5).
[0071] Fig. 26C. Quantificação de CD62-CD44+ (de células T CD8+) nos nódulos linfáticos drenantes de tumor (n=4-5).
[0072] Fig. 26D. Gráficos representativos de FACS de células T CD8+ CD3+ T como percentagem de células CD45+.
[0073] Fig. 26E. Análise do infiltrado imune de CD3+ expressa como
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13/104 percentagem de células CD45+ (n=5). As barras de erro retratam o
DPM. Os dados representam um de dois experimentos com cinco camundongos/grupo analisados independentemente.
[0074] Fig. 26F. Análise do infiltrado imune de CD8+ expressa como percentagem de células CD45+ (n=5). As barras de erro retratam o DPM. Os dados representam um de dois experimentos com cinco camundongos/grupo analisados independentemente.
[0075] Fig. 26G. Análise do infiltrado imune de CD4+ expressa como percentagem de células CD45+ (n=5). As barras de erro retratam o DPM. Os dados representam um de dois experimentos com cinco camundongos/grupo analisados independentemente.
[0076] Fig. 26H. Razão de células CD8+ para células CD4+ no tumor. As barras de erro retratam o DPM. Os dados representam um de dois experimentos com cinco camundongos/grupo analisados independentemente.
[0077] Fig. 26I. CD8+ e CD44+ expressas como percentagem de células CD45+ no tumor. As barras de erro retratam o DPM. Os dados representam um de dois experimentos com cinco camundongos/grupo analisados independentemente.
[0078] Fig. 26J. CD8+ e KÍ67+ expressas como percentagem de células CD45+ no tumor. As barras de erro retratam o DPM. Os dados representam um de dois experimentos com cinco camundongos/grupo analisados independentemente.
[0079] Fig. 26K. Expressão de PD1+ em células CD8+ no tumor. *P < 0,05, (ANOVA unilateral com teste de comparações múltiplas de Tukey).
[0080] Fig. 26L. Expressão de células CD4+ no tumor. *P < 0,05, (ANOVA unilateral com teste de comparações múltiplas de Tukey).
[0081] Fig. 27A. Gráficos representativos de FACS de células FoxP3+ e 4+ T nos tumores. Fig. 27B. Percentagem de células T
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CD4+FoxP3+ T das células CD3+ totais.
[0082] Fig. 27C. Razão de células Treg CD8+ para células Treg
CD4+FoxP3+ no tumor (n=5).
[0083] Fig. 27D Gráficos representativos de FACS de células T
CD8+IFNy+ T de células CD45+.
[0084] Fig. 27E. Percentagem de células T CD8+IFNy+ de células CD45+.
[0085] Fig. 27F. Percentagem de células T CD8+ TNFa+ de células CD45+.
[0086] Fig. 27G. Percentagem of CD8+ double positive IFNy+TNFa+ T cells de células CD45+.
[0087] Fig. 27H. Percentagem de células T CD8+GranzymeB+ de células CD45+.
[0088] Fig. 27I. Percentagem de células T CD4+IFNy+ de células T CD4+.
[0089] Fig. 27J. Resumo de subgrupos de células imunes CD45+ e células CD45- segundo determinado por FACS. Os subgrupos estão representados como percentagem de todos os eventos vivos adquiridos (à direita) e células CD3+ (à esquerda); Diagrama à direita: leucócitos Não CD45-, CD3+, Não CD3+ CD45; Diagrama à esquerda: CD8, CD4Treg, CD4-conv. *P < 0,05, (ANOVA unilateral com teste de comparações múltiplas de Tukey). As barras de erro retratam o DPM. Os dados representam um de dois experimentos com cinco camundongos/grupo analisados independentemente.
[0090] Fig. 28A. Análise por citometria de fluxo da ativação e de marcadores de pontos de verificação imunológicos de (A) CD4+ no baço de camundongos que receberam tratamento com LB-100 e/ou com aPD-1. Nas células T CD4+, ao contrário das células T CD8+, não houve alteração na expressão de CD62L-CD44+. Também não houve alteração na expressão dos marcadores de pontos de verificação
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15/104 imunológicos: PD1, CTLA4, ΊΠΜ3 e 0x40.
[0091] Fig. 28B. Análise por citometria de fluxo da ativação e de marcadores de pontos de verificação imunológicos de linfócitos CD8+ no baço de camundongos que receberam tratamento com LB-100 e/ou com aPD-1. Nas células T CD8+, não houve alteração na expressão dos marcadores de pontos de verificação imunológicos: PD1, CTLA4, TIM3 e 0x40.
[0092] Fig. 29A. Análise por citometria de fluxo da ativação e de marcadores de pontos de verificação imunológicos de CD4+ nos nódulos linfáticos drenantes de tumor (dLN) de camundongos que receberam tratamento com LB-100 e/ou com aPD-1. Nas células T CD4+, ao contrário das células T CD8+, não houve alteração na expressão de CD62L-CD44+. Houve um aumento pequeno, porém significativo, na expressão de PD-1 nos grupos tratados com aPD-1, mas o LB-100 isolado ou em combinação não alterou adicionalmente a expressão PD-1. Não houve alteração na expressão de outros marcadores de pontos de verificação imunológicos: CTLA4, TIM3 e 0x40. *P < 0,05, **<P<0,01 (ANOVA unilateral com teste de comparações múltiplas de Tukey). As barras de erro retratam o DPM.
[0093] Fig. 29B. Análise por citometria de fluxo da ativação e de marcadores de pontos de verificação imunológicos de linfócitos CD8+ nos nódulos linfáticos drenantes de tumor (dLN) de camundongos que receberam tratamento com LB-100 e/ou com aPD-1. Nas células T CD8+, não houve alteração na expressão de marcadores de pontos de verificação imunológicos: PD1, CTLA4, TIM3 e 0x40. *P < 0,05, **<P<0,01 (ANOVA unilateral com teste de comparações múltiplas de Tukey). As barras de erro retratam o DPM.
[0094] Fig. 30. Estratégia de retenção (gating) para análise por citometria de fluxo de linfócitos infiltrantes no tumor. O portão SSC~ FSC” foi usado para excluir detritos não celulares, seguida por exclusão
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16/104 de dupleto de FSC-H-FSA-A. Coloração para vivo/morto (L/D) fixável foi usada para excluir as células mortas. As células vivas foram então retidas (gated) com base na expressão do marcador de leucócitos CD45+. As células CD45- foram consideradas como células tumorosas. As células CD45+ foram então fenotipadas com base na expressão de CD3, CD8, CD4. As células CD45+CD3+CD8+ foram retidas como linfócitos CD8+, ao passo que as células CD45+CD3+CD4+ foram retidas como linfócitos CD4+. Além disso, coloração dos subgrupos de CD4+ e de CD8+ foi então realizada como indicada no texto.
[0095] Fig. 31A. As razões de células CD3+, CD8+, e CD4+ para células CD45 residentes no tumor foram mostradas para cada grupo de tratamento. Houve um aumento nas razões de CD3/tumor e CD8/tumor no grupo tratado com a combinação em comparação com o controle, ao passo que não houve alteração na razão de CD4/tumor.
[0096] Fig. 31B. O número de células CD3+, CD8+ e CD4+ por grama de peso tumoral foi mostrado para cada grupo de tratamento. Foi observada uma tendência similar àquela vista na Fig. 31A, mas houveram diferenças significativas em CD3+ e CD8+ por grama de tumor no grupo tratado com aPD-1 isolado em comparação com o controle. Houve uma tendência de um aumento adicional em CD3+ e CD8+/tumor para o tratamento com combinação, mas não houve qualquer significância estatística. *P < 0,05, ***<P<0,001 (ANOVA unilateral com teste de comparações múltiplas de Tukey). As barras de erro retratam o DPM.
[0097] Fig. 32A. Análise por citometria de fluxo e marcadores de pontos de verificação imunológicos de linfócitos CD4+ nos tumores de camundongos que receberam tratamento com LB-100 e/ou com aPD-1. Nas células T CD4+, não houve alteração na expressão de marcadores de pontos de verificação imunológicos: TIM3, 0x40, CTLA4 e LAG3.
[0098] Fig. 32B. Análise por citometria de fluxo e marcadores de
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17/104 pontos de verificação imunológicos de linfócitos CD8+ nos tumores de camundongos que receberam tratamento com LB-100 e/ou com aPD-1.
Nas células T CD8+, não houve alteração na expressão de marcadores de pontos de verificação imunológicos: TIM3, 0x40, CTLA4 e LAG3.
[0099] Fig. 33A. Gráfico de citometria de fluxo representativo mostrando TNF-a+ aumentado. As percentagens apresentadas são de CD3+ total.
[00100] Fig. 33B. Gráfico de citometria de fluxo representativo mostrado TNF-a+ IFN-y+ duplo positivo aumentado. As percentagens apresentadas são de CD8+ total.
[00101] Fig. 33C. Gráfico de citometria de fluxo representativo mostrando células T infiltrantes de GranzymeB + CD8 aumentadas. As percentagens apresentadas são de células CD3+ totais.
[00102] Fig. 34A. Camundongos C57BL/6 foram randomizados em quatro grupos de tratamento. 2,5 x 105 células B16F10 foram inoculadas 2 dias depois do início do tratamento por via subcutânea no flanco torácico direito. Os camundongos foram tratados a cada dois dias até o término da sobrevida.
[00103] Fig. 34B. À esquerda, curvas de crescimento tumoral individual: controle, LB-100, a-PD-1, e combinação. À direita, tamanho tumoral médio ao longo do tempo.
[00104] Fig. 34C. Quantificação do volume do tumor B16 15 dias depois da inoculação. (P<0,0001, ANOVA unilateral com teste de comparações múltiplas de Tukey) [00105] Fig. 34D. Sobrevida cumulativa ao longo do tempo. *P < 0,05, (teste log-rank de Mantel-Cox). Estão agrupados dados de 2 experimentos independentes.
[00106] Fig. 34E. Imagens representativas de coloração da pele e da glândula salivar com hematoxina-e-eosina de cada grupo de tratamento (n = 2-3 por grupo). Barras de escala, 100pm.
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18/104 [00107] Fig. 35. Imagens representativas de coloração do pâncreas, do pulmão e do estômago com hematoxina-e-eosina de cada grupo de tratamento (n = 2-3 por grupo). Barras de escala, 100 pm.
[00108] Fig. 36A. Células T CD3 foram isoladas a partir de esplenócitos de camundongo e cultivadas com ou sem estimulação usando antiCD3 imobilizado (10.ig/ml) e antiCD28 solúvel (2.ig/ml). A atividade enzimática de PP2A foi medida depois de 3 horas de ativação. A atividade de ΡΡ2Α foi medida em relação ao controle ativado na presença de titulação da dose de LB-100.
[00109] Fig. 36B. Citometria de fluxo analisando AKT fosforilado em Thr308 (p-AKT(T308)) ou Ser473 (p-AKT(S473)) depois de 3 horas de estimulação na presença de titulação da dose de LB-100.
[00110] Fig. 36C. Citometria de fluxo analisando S6 fosforilado (pS6) na presença de titulação da dose de LB-100. *P < 0,05, ***P < 0,001, (ANOVA unilateral com teste de comparações múltiplas de Tukey). Os dados são de um experimento representativo de dois experimentos independentes com resultados similares. As barras de erro retratam o DPM.
[00111] Fig. 37. Sinalização de AKT e mTORC depois de 30 minutos de estimulação. Citometria de fluxo analisando AKT fosforilado em Thr308 (p-AKT(T308)), Ser473 (p-AKT(S473)) ou S6 fosforilado (p-S6) depois de 30 minutos de estimulação na presença de titulação da dose de LB-100. (ANOVA unilateral com teste de comparações múltiplas de Tukey). Os dados são de um experimento representativo de dois experimentos independentes com resultados similares. As barras de erro retratam o DPM.
[00112] Fig. 38A. À esquerda, a % de células CD4 positivas para Foxp3. À direita, dados representativos de citometria de fluxo demonstrando redução na % de células Foxp3 com LB-100. As células ficaram retidas em células CD4+.
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19/104 [00113] Fig. 38B. Os níveis intracelulares de GAT A3 foram medidos com citometria de fluxo. À esquerda, a % de células CD4 positivas para
GATA3. À direita, dados representativos de citometria de fluxo demonstrando redução na % de células GATA3 com LB-100.
[00114] Fig. 38C. Razão de células GATA3+ Th2 para células Tbet+ Th1 CD4.
[00115] Fig. 38D. A produção intracelular de IFN-γ foi medida por citometria de fluxo. À esquerda, a % de células CD4 positivas para IFNy em condições de TH1 e TH2. À direita, dados representativos de citometria de fluxo demonstrando aumentado na % de células IFN-γ com LB-100 tanto na condição de TH1 como na condição de TH2.
[00116] Fig. 38E. Produção de TNF, IL2 e IFN-γ no sobrenadante de células T CD4+ naíves ativadas em condições de desvio de TH1 por 3 dias.
[00117] Fig. 38F. Produção de TNF, IL2, IFN-γ e IL4 no sobrenadante de células T CD4+ naíves ativadas em condições de desvio de TH2 por 3 dias. Os níveis de citocina foram ajustados para o número absoluto de células. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, (ANOVA unilateral com teste de comparações múltiplas de Tukey). Os dados são de um experimento representativo de dois experimentos independentes com resultados similares. As barras de erro retratam o DPM.
[00118] Fig. 39A. DCs foram induzidas a partir de monócitos purificados por cultivo em IL4 e GM-CSF por 7 dias. 105 células T CD4+ marcadas com CFSE e purificadas foram então cocultivadas com 104 DCs alogênicas na presença de uma titulação de LB-100 em duplicata ou triplicata por 5 dias. LB-100 foi reabastecido no 3o dia. Os sobrenadantes foram recolhidos no 5°dia e medidos quanto à produção de IFN-γ. Análise por FACS foi feitas nas células cultivadas.
[00119] Fig. 39B. Proliferação in vitro de células T CD4+ na presença de titulação da dose de LB-100, medida por diluição do CFSE
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20/104 citosóloico. À esquerda, a % de células divididas foi plotada contra a concentração de LB-100. À direita, dados representativos de citometria de fluxo demonstrando o aumento na % de células divididas a 1 uM de
LB-100.
[00120] Fig. 39C. A produção de IFN-α foi medida no 5o dia, demonstrando um aumento dependente da dose na secreção de IFN-a com LB-100.
[00121] Fig. 39D. A coloração intracelular de T-bet foi feita nas células T CD4+ depois de 5 dias de cocultura. Percentagem de CD4+Tbet+ (de células CD4+) contra concentração de LB-100.
[00122] Fig. 39E. (E) Produção de IFN-γ nas células tratadas com controle de isótipo, LB-100 e/ou Nivolumab, demonstrando uma resposta sinergística ao tratamento com combinação. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 (ANOVA unilateral com teste de comparações múltiplas de Tukey). Os dados são de um experimento representativo de dois experimentos independentes com resultados similares. As barras de erro retratam o DPM.
Descrição Detalhada da Invenção [00123] A presente invenção apresenta um método para tratar um indivíduo que sofre de câncer compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um inibidor de PP2A em combinação com uma quantidade eficaz de um inibidor de ponto de verificação, onde as quantidades quando tomadas juntas são eficazes para tratar o indivíduo. [00124] A presente invenção também apresenta um método para tratar um indivíduo que sofre de câncer e receber um inibidor de ponto de verificação compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade de inibidor de PP2A eficaz para melhorar o tratamento em relação ao inibidor de ponto de verificação isoladamente.
[00125] A presente invenção também apresenta um método para tratar um tumor ou câncer em um indivíduo compreendendo administrar
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21/104 ao indivíduo uma quantidade eficaz de um inibidor de PP2A em combinação com uma quantidade eficaz de um inibidor de ponto de verificação, onde as quantidades quando tomadas juntas são eficazes para tratar o tumor ou câncer.
[00126] A presente invenção também apresenta um método para aumentar a resposta de células T a células cancerosas em um indivíduo que sofre de câncer compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade de um inibidor de PP2A em combinação com uma quantidade eficaz de um inibidor de ponto de verificação eficaz para aumentar a resposta de células T a células cancerosas.
[00127] A presente invenção também apresenta um método para aumentar a ativação de células T em um indivíduo que sofre de câncer compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um inibidor de PP2A em combinação com uma quantidade eficaz de um inibidor de ponto de verificação para assim aumentar a ativação de células T.
[00128] Em algumas modalidades, a quantidade do composto e a quantidade do inibidor de ponto de verificação são, cada uma delas, administradas periodicamente ao indivíduo.
[00129] Em algumas modalidades, a quantidade do composto e a quantidade do inibidor de ponto de verificação são administradas simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[00130] Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação é administrado concomitantemente, antes, ou depois do inibidor de PP2A.
[00131] Em algumas modalidades, a quantidade de inibidor de ponto de verificação e a quantidade de composto quando administradas juntas são mais eficazes para tratar o indivíduo do que quando cada agente na mesma quantidade é administrado isoladamente.
[00132] Em algumas modalidades, a quantidade do composto e a
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22/104 quantidade do inibidor de ponto de verificação quando tomadas juntas são eficazes para reduzir um sintoma clínico do câncer no indivíduo.
[00133] Em algumas modalidades, o composto intensifica o efeito imunoterapêutico do inibidor de ponto de verificação.
[00134] Em algumas modalidades, o câncer é suscetível a tratamento por uma resposta imunológica.
[00135] Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é um agente para CTLA-4.
[00136] Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de verificação de CTLA-4 is ipilimumab ou tremelimumab.
[00137] Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação imunológico é um agente anti-PD-1 ou anti-PD~L1.
[00138] Em algumas modalidades, o inibidor de ponto de verificação PD-1 e/ou PD-L1 é atezolizumab, nivolumab ou pembrolizumab.
[00139] Em algumas modalidades, o câncer é melanoma, carcinoma de células renais, câncer de próstata, carcinoma urotelial ou câncer de ovário.
[00140] Em algumas modalidades, o câncer é melanoma.
[00141] Em algumas modalidades, o inibidor de PP2A é administrado a uma dose de 0,25 mg/m2, 0,5 mg/m2, 0,83 mg/m2, 1,25 mg/m2, 1,75 mg/m2, 2,33 mg/m2, de 3,1 mg/m2.
[00142] Em algumas modalidades, o inibidor de PP2A é administrado a uma dose de 2,33 mg/m2.
[00143] Em algumas modalidades, o inibidor de PP2A é administrado por 3 dias a cada 3 semanas.
[00144] Em algumas modalidades, o ipilimumab é administrado por via intravenosa a uma dose de 0,5 mg/kg - 10 mg/kg ou menos.
[00145] Em algumas modalidades, o ipilimumab é administrado por via intravenosa durante 90 minutos a cada 3 semanas ou menos.
[00146] Em algumas modalidades, o atezolizumab é administrado
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23/104 por via intravenosa a uma dose de 0,1 mg/kg - 20 mg/kg ou menos. [00147] Em algumas modalidades, o atezolizumab é administrado por via intravenosa durante 60 minutos a cada 3 semanas ou menos. [00148] Em algumas modalidades, o nivolumab é administrado por via intravenosa a uma dose de 0,1 mg/kg - 10 mg/kg ou menos. [00149] Em algumas modalidades, o nivolumab é administrado por via intravenosa durante 60 minutos a cada 2 semanas ou menos.
[00150] Em algumas modalidades, o pembrolizumab é administrado por via intravenosa a uma dose de 1 mg/kg - 10 mg/kg ou menos.
[00151] Em algumas modalidades, o pembrolizumab é administrado por via intravenosa durante 30 minutos a cada 3 semanas ou menos. [00152] A presente invenção também apresenta um método para inibir a função de um CTLA-4 em células T compreendendo administrar às células T um inibidor de PP2A para assim inibir a função do CTLA-4. [00153] A presente invenção também apresenta um método para inibir a interação de PD-1:PD-L1 em células T compreendendo administrar às células T um inibidor de PP2A para assim inibir a interação de PD-1 :PD-L1.
[00154] Em algumas modalidades, o método onde o inibidor de PP2A tem a estrutura:
onde a ligação α está presente ou ausente;
R1 e R2 juntos são ~O;
R3 é OH, O-, OR9, O(CH2)1-6R9, SH, S-, ou SR9,
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24/104 onde R9 é H, alquila, alquenila, alquinila ou arila;
onde X é O, S, NR10, N+HR10 ou N+R10R10, onde cada R10 é independentemente H, alquila, alquenila, alquinila, arila,
, -CH2CN, -CH2CO2R11, ou
CH2COR11, onde cada R11 é independentemente H, alquila, alquenila ou alquinila;
R5 e R6 juntos são ~O;
R7 e R8 são, cada um, H, ou um sal, zwiteríon, ou éster do mesmo.
[00155] Em algumas modalidades, o composto tem a estrutura:
[00156] Em algumas modalidades, a ligação o no composto está presente.
[00157] Em algumas modalidades, a ligação α no composto está ausente.
[00158] Em algumas modalidades, R3 é OH, O-, ou OR9, onde R9 é alquila, alquenila, alquinila ou arila;
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25/104
onde X é O, S, NR10, N+HR10 ou N+R10R10, onde cada R10 é independentemente H, alquila, alquenila, alquinila,
[00159] Em algumas modalidades, R3 é OH, O- ou OR9, onde R9 é
H, metila, etila ou fenila.
[00160] Em algumas modalidades, R3 é OH, O- ou OR9, onde R9 é metila.
[00161]
Em algumas modalidades, R4 é
onde R10 é H, alquila, alquenila, alquinila, arila, ou
[00163]
Em algumas modalidades, R4 é
onde
R10 é -H, -CH3, -CH2CH3, ou
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[00165]
Em algumas modalidades, R4 é
[00166]
Em algumas modalidades,
[00167]
Em algumas modalidades, R4 é
[00168] Em algumas modalidades, o composto tem a estrutura
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27/104
onde a ligação α está presente ou ausente;
R9 está presente ou ausente e quando presente é H, alquila, alquenila, alquinila ou fenila; e
X é O, NR10, NH+R10 ou N+R10R10, onde cada R10 é independentemente H, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila,
-CH2CN, -CH2CO2R12,or
CH2COR12, onde R12 é H ou alquila, ou um sal, zwiteríon, ou éster do mesmo.
[00169] Em algumas modalidades, o composto tem a estrutura
onde a ligação o está presente ou ausente;
Xé O ou NR10, onde cada R10 é independentemente H, alquila, alquil substituído, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila,
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28/104
, -CH2CN, -CH2CO2R12, ou CH2COR12, onde R12 é H ou alquHa, ou um sal, zwiteríon, ou éster do mesmo.
[00170] Em algumas modalidades, o composto tem a estrutura
onde a ligação α está presente ou ausente;
Xé O ou NH+R10, onde R10 é H, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila
substituída, alquinila, alquinila substituída, arila,
CH2CN, -CH2CO2R12, ou -CH2COR12, onde R12 é H ou alquila, ou um sal, zwiteríon, ou éster do mesmo.
[00171] Em algumas modalidades, o composto tem a estrutura
ou um sal ou éster do mesmo.
[00172] A presente invenção apresenta um método para inibir a
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29/104 função de CTLA-4 em células T compreendendo administrar às células
T um inibidor de PP2A para assim inibir a função de CTLA-4.
[00173] A presente invenção também apresenta um método para inibir a função de CTLA-4 em um indivíduo que sofre de câncer compreendendo administrar ao indivíduo um inibidor de PP2A para assim inibir a função de CTLA-4 no indivíduo.
[00174] A presente invenção apresenta ainda um método para aumentar a ativação de células T em um indivíduo que sofre de câncer compreendendo administrar ao indivíduo um inibidor de PP2A para assim aumentar a ativação de células T.
[00175] A presente invenção apresenta ainda um método para aumentar a resposta de células T a células cancerosas em um indivíduo que sofre de câncer compreendendo administrar ao indivíduo um inibidor de PP2A para assim aumentar a resposta de células T a células cancerosas.
[00176] A presente invenção também apresenta um método para tratar um indivíduo que sofre de câncer compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um inibidor do ponto de verificação de CTLA-4 e uma quantidade eficaz de um inibidor de PP2A, onde as quantidades quando tomadas juntas são eficazes para tratar o indivíduo. [00177] Em algumas modalidades, o inibidor de PP2A altera interação de PP2A com CTLA-4.
[00178] Em algumas modalidades, o inibidor de PP2A diminui a ligação de PP2A ao CTLA-4.
[00179] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, o câncer é suscetível a imunoterapia anticTLA-4.
[00180] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, o indivíduo tem a ativação de células T reduzida mediada por CTLA-4.
[00181] A presente invenção também apresenta um método para
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30/104 tratar um indivíduo que sofre de câncer compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um inibidor de PP2A para assim tratar o câncer, onde o câncer é suscetível à imunoterapia com anticTLA~4.
[00182] A presente invenção também apresenta um método para tratar um indivíduo que sofre de câncer compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um inibidor de PP2A para assim tratar o câncer, onde o câncer é suscetível à imunoterapia.
[00183] A presente invenção também apresenta um método para tratar um indivíduo que sofre de câncer compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um inibidor de PP2A para assim tratar o câncer, onde o indivíduo tem ativação de células T reduzida mediada por CTLA-4.
[00184] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, o câncer é suscetível à imunoterapia com anticTLA~4.
[00185] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, o indivíduo tem ativação de células T reduzida mediada por CTLA-4.
[00186] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, o câncer é melanoma, carcinoma de células renais, câncer de próstata, carcinoma urotelial ou câncer de ovário.
[00187] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, o câncer é melanoma.
[00188] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, o câncer suscetível à imunoterapia com anticTLA-4 é melanoma. [00189] Em algumas modalidades, o câncer é câncer de pâncreas.
[00190] Em algumas modalidades, o câncer é câncer de pâncreas, e as células cancerosas do câncer de pâncreas superexpressam Mad2.
[00191] Em algumas modalidades, o câncer tem anormalidades na função de PP2A e/ou na via de reparo de danos ao DNA. Em algumas
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31/104 modalidades, o indivíduo é que sofre de fibrossarcoma, condrossarcoma, timoma, carcinoide atípico de pulmão, ou câncer de ovário, de testículo, de mama, ou de próstata.
[00192] Em algumas modalidades do método acima, o inibidor de
PP2A é eficaz para tratar um indivíduo que sofre de um câncer.
[00193] Em algumas modalidades, o método acima compreende ainda administrar uma terapia anticâncer concomitantemente, antes, ou depois do inibidor de PP2A.
[00194] Em algumas modalidades, a terapia anticâncer compreende administrar um inibidor de ponto de verificação, por exemplo, um inibidor de ponto de verificação de CTLA-4. Em algumas modalidades do método acima, o inibidor de PP2A melhora o efeito quimioterapêutico do inibidor de ponto de verificação de CTLA-4.
[00195] Em algumas modalidades do método acima, o inibidor de ponto de verificação de CTLA-4 é um anticorpo.
[00196] Em algumas modalidades do método acima, o inibidor de PP2A altera a interação de PP2A com CTLA-4.
[00197] Em algumas modalidades do método acima, o inibidor de PP2A aumenta a ligação de PP2A ao CTLA-4.
[00198] Cânceres suscetíveis à imunoterapia anticTLA-4 incluem, porém sem limitação, cânceres que se mostraram sensíveis à imunoterapia com anticTLA-4 em ensaios pré-clínicos ou clínicos.
[00199] Cânceres suscetíveis à imunoterapia anti-PD-1 ou anti-PDL1 incluem, porém sem limitação, cânceres que se mostraram sensíveis à imunoterapia com anti-PD-1 ou com anti-PD-L1 em ensaios préclínicos ou clínicos.
[00200] Em algumas modalidades, a quantidade do composto é eficaz para reduzir um sintoma clínico do câncer no indivíduo.
[00201] Em algumas modalidades, o tratamento compreende aumentar a quantidade de células T citotóxicas no indivíduo.
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32/104 [00202] Em algumas modalidades, o tratamento compreende aumentar a quantidade de células T citotóxicas que interagem com células cancerosas no indivíduo.
[00203] Em algumas modalidades, o tratamento compreende aumentar a quantidade de células cancerosas eliminadas por células T citotóxicas no indivíduo.
[00204] Tipos de células T incluem células T CD8+ citotóxicas exterminadoras e células T CD4+ auxiliares. Estas últimas abrangem subtipos envolvidos na regulação de respostas imunológicas, tais como células Treg”, e outras que estimulam o sistema imunológico adquirido, incluindo reconhecimento de proteínas não próprias que estimulam as células T exterminadoras ou as células B produtoras de anticorpos. Clones de células T específicos, alguns deles sendo mantidos depois de exposição a antígenos em níveis baixos como células T de memória, são ativados por combinações de MHC/epítopo particulares, levando à liberação de citocinas, expansão clonal, e respostas imunológicas adquiridas.
[00205] Em algumas modalidades, as células T são células T CD4+, células T CD8+, e/ou células T CD4+CD8+.
[00206] Em algumas modalidades, o câncer é carcinoma hepatocelular, osteossarcoma humano, câncer de fígado primário, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer endometrial, câncer colorretal, câncer de pulmão não-pequenas células, sarcoma de tecido mole, seminoma, câncer de mama, linfoma, fibrossarcoma, neuroblastoma, câncer mucinoso de ovário, câncer epitelial de bexiga, carcinoma de células escamosas do cérvix uterino, linfoma de células B grandes e difusas, adenoma de pulmão, hepatoma, câncer de intestino, fibrossarcoma, osteossarcoma, câncer de próstata, angiomiolipoma, adenocarcinoma mamário, leucemia mieloide aguda, leucemia Hnfocítica crônica, e mieloma múltiplo e outros neoplasmas de células
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33/104 plasmáticas.
[00207] Em algumas modalidades, o câncer é adenoma de pulmão, hepatoma, carcinoma hepatocelular, câncer de intestino, linfoma, fibrossarcoma, osteossarcoma, câncer de próstata, angiomiolipoma, ou adenocarcinoma mamário.
[00208] Em algumas modalidades, o câncer é leucemia mieloide aguda.
[00209] Em algumas modalidades, o câncer é câncer de mama, câncer de cólon, câncer de pulmão de células grandes, adenocarcinoma de pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de estômago, câncer de fígado, adenocarcinoma de ovário, carcinoma de pâncreas, carcinoma de próstata, leucemia promilocítica, leucemia mielogenosa crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, mieloma múltiplo e neoplasmas de células plasmáticas, câncer colorretal, câncer de ovário, linfoma, linfoma não-Hodgkin, linfoma de Hodgkin, neuroblastoma, meduloblastoma, glioblastoma, cordoma, meningioma (não maligno e maligno), glioma pontino intrínseco difuso, ou tumor teratoide/rabdoide atípico.
[00210] Em algumas modalidades do método acima, o câncer é um câncer de mama, câncer de cólon, câncer de pulmão de células grandes, adenocarcinoma do pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de estômago, câncer de fígado, adenocarcinoma de ovário, carcinoma de pâncreas, carcinoma de próstata, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielogenosa crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, mieloma múltiplo e neoplasma de células plasmáticas, câncer colorretal, câncer de ovário, linfoma, linfoma não-Hodgkin ou linfoma de Hodgkin.
[00211] Em algumas modalidades do método acima, o câncer é um câncer de cérebro.
[00212] Em algumas modalidades do método acima, o câncer de
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34/104 cérebro é um glioma, astrocitoma pilocítico, astrocitoma difuso de baixo grau, astrocitoma anaplásico, glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, ependimoma, meningioma, tumor da glândula pituitária, linfoma primário do sistema nervoso central, meduloblastoma, craniofaringioma, ou glioma pontino intrínseco difuso.
[00213] Em algumas modalidades do método acima, compreende ainda administrar ao indivíduo um agente anticâncer.
[00214] Em algumas modalidades do método acima, o agente anticâncer é selecionado dentre radiação x ou radiação ionizante.
[00215] Em algumas modalidades do método acima, a célula alvo é uma célula cancerosa.
[00216] Em algumas modalidades do método acima, a célula cancerosa é um câncer de mama, câncer de cólon, câncer de pulmão de células grandes, adenocarcinoma do pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de estômago, câncer de fígado, adenocarcinoma de ovário, carcinoma de pâncreas, carcinoma de próstata, leucemia promilocítica, leucemia mielogenosa crônica, leucemia linfoblástica aguda, câncer colorretal, câncer de ovário, linfoma, linfoma não-Hodgkin ou linfoma de Hodgkin.
[00217] Análogos de LB-100 têm atividade análoga ao LB-100 e apresentam similares nos métodos descritos neste pedido. Tais análogos incluem os compostos descritos na Publicação do Pedido Internacional PCT N°WO 2008/097561, publicada em 1 4 de agosto de 2008; Publicação do Pedido Internacional PCT N°WO 2010/014254, publicada em 4 de fevereiro de 2010; Publicação do Pedido Internacional PCT N°WO 2015/073802, publicada em 2 1 de maio de 2015; e Publicação do Pedido Internacional PCT N°W O 2016/186963, publicada em 24 de novembro de 2016, a íntegra de cada um deles estando aqui incorporada a título de referência.
[00218] Compostos que agem como pró-fármacos para a distribuição
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35/104 in vivo de LB-100 e/ou endothall têm atividade análoga ao LB-100 e apresentam similares nos métodos descritos neste pedido. Mais especificamente, a administração do pró-fármaco proporciona um efeito similar à administração de LB-100. Pró-fármacos de LB-100 e/ou endothall incluem compostos descritos na Publicação do Pedido Internacional PCT N°W0 2015/073802 publicada em 21 de maio de 2015; e Publicação do Pedido Internacional PCT N°W O 2016/186963, publicada em 24 de novembro de 2016, a íntegra de cada um deles estando aqui incorporada a título de referência.
[00219] Exceto onde especificado em contrário, quando a estrutura de um composto usado no método desta invenção incluir um átomo de carbono assimétrico, fica entendido que o composto ocorre como um racemato, uma mistura racêmica, e um enantiômero um único isolado. Todas estas formas isoméricas desses compostos estão expressamente incluídas nesta invenção. Exceto onde especificado em contrário, cada carbono estereogênico pode ter a configuração R ou S. Fica, por conseguinte, entendido que os isômeros decorrentes de tal assimetria (por exemplo, todos os enantiômeros e diastereômeros) estão incluídos no escopo desta invenção, a menos que indicado em contrário. Tais isômeros podem ser obtidos na forma substancialmente pura por técnicas de separação clássicas e por síntese controlada estereoquimicamente, tais como aquelas descritas em Enantiomers, Racemates and Resolutions de J. Jacques, A. Collet and S. Wilen, Pub. John Wiley & Sons, NY, 1981. Por exemplo, a resolução pode ser realizada por cromatografia preparatória em uma coluna quiral.
[00220] A presente invenção também se destina a incluir todos os isótopos dos átomos que ocorrem nos compostos no método divulgado neste pedido. Isótopos incluem aqueles átomos que têm o mesmo número atômico, mas números de massa diferentes. A título de exemplo geral e sem limitação, isótopos de hidrogênio incluem trítio e deutério.
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Isótopos de carbono incluem C-13 e C-14.
[00221] Será observado que toda notação de um carbono nas estruturas em todo este pedido, quando usada sem notação adicional, destinam-se a representar todos os isótopos de carbono, tais como 12C, 13C, ou 14C. Além disso, quaisquer compostos contendo 13C ou 14C podem ter especificamente a estrutura de qualquer um dos compostos divulgados neste pedido. Também será observado que toda notação de um hidrogênio nas estruturas em todo este pedido, quando usada sem notação adicional, destinam-se a representar todos os isótopos de hidrogênio, tais como 1H, 2H, ou 3H. Além disso, quaisquer compostos contendo 2H ou 3H podem ter especificamente a estrutura de qualquer um dos compostos divulgados neste pedido. Compostos marcados isotopicamente geralmente podem ser preparados por técnicas convencionais conhecidos pelos especialistas na técnica usando reagentes marcados isotopicamente apropriados no lugar dos reagentes não marcados empregados.
[00222] Em algumas modalidades, o método onde o indivíduo recebe uma composição farmacêutica compreendendo um composto da presente invenção e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável para tratar o câncer no indivíduo.
[00223] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica onde o veículo farmaceuticamente aceitável compreende um lipossoma.
[00224] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica onde o composto está contido em um lipossoma ou em uma microesfera.
[00225] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende o inibidor de PP2A e o inibidor de pontos de verificação de CTLA-4.
[00226] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou usos acima, o indivíduo é um ser humano.
[00227] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou
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37/104 usos acima, o composto e/ou o inibidor de pontos de verificação de
CTLA-4 é administrado por via oral ao indivíduo.
[00228] A presente invenção apresenta um inibidor de PP2A para uso na inibição da função de CTLA-4 em células T.
[00229] A presente invenção apresenta um inibidor de PP2A para uso na inibição da função de CTLA-4 em um indivíduo que sofre de câncer.
[00230] A presente invenção apresenta um inibidor de PP2A para uso no aumento da ativação de células T em um indivíduo que sofre de câncer.
[00231] A presente invenção apresenta um inibidor de PP2A para uso no aumento da resposta de células T a células cancerosas em um indivíduo que sofre de câncer.
[00232] A presente invenção apresenta um inibidor de PP2A para uso no tratamento de um indivíduo que sofre de câncer, onde o câncer é suscetível à imunoterapia anticTLA-4.
[00233] A presente invenção apresenta um inibidor de PP2A para uso no tratamento de um indivíduo que sofre de câncer, onde o indivíduo tem ativação de células T reduzida mediada por CTLA-4.
[00234] A presente invenção apresenta um inibidor de PP2A em combinação com um inibidor de pontos de verificação de CTLA-4 para uso no tratamento de um indivíduo que sofre de câncer.
[00235] Uso de um inibidor de PP2A para inibir a função de CTLA-4 em células T.
[00236] Uso de um inibidor de PP2A para inibir a função de CTLA-4 em um indivíduo que sofre de câncer.
[00237] Uso de um inibidor de PP2A para aumentar a ativação de células T em um indivíduo que sofre de câncer.
[00238] Uso de um inibidor de PP2A para aumentar a resposta de células T a células cancerosas em um indivíduo que sofre de câncer.
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38/104 [00239] Uso de um inibidor de PP2A para tratar um indivíduo que sofre de câncer, onde o câncer é suscetível à imunoterapia anticTLA-4.
[00240] Uso de um inibidor de PP2A para tratar um indivíduo que sofre de câncer, onde o indivíduo tem reduzida a ativação de células T mediada por CTLA-4.
[00241] Uso de um inibidor de PP2A em combinação com um inibidor de pontos de verificação de CTLA-4 para tratar um indivíduo que sofre de câncer.
[00242] A presente invenção também apresenta um método para otimizar a concentração de LB-100 na corrente sanguínea de um indivíduo que recebera uma dosagem de LB1-00 compreendendo:
(a) medir a concentração plasmática de LB-100 no indivíduo;
(b) determinar se é necessária a administração de mais uma dose de LB-100 ao indivíduo com base na medição obtida em (a); e (c) administrar mais uma dosagem ou dosagens do LB-100 conforme necessário com base na determinação obtida em (b).
[00243] Em algumas modalidades, a etapa (b) acima compreende determinar se é necessária a administração de mais uma dose de LB100 ao indivíduo com base no fato de a medição obtida em (a) estar acima, abaixo, ou ser igual à Concentração Eficaz Mínima (MEC) de LB100.
[00244] Em algumas modalidades, a dose inicial de LB-100 administrada ao indivíduo é uma quantidade de 0,1 mg/m2 a 5 mg/m2.
[00245] Em algumas modalidades, a dose adicional de LB-100 administrada ao indivíduo é uma quantidade de 0,1 mg/m2 a 5 mg/m2.
[00246] Em algumas modalidades, o composto é administrado a uma dose de 0,25 mg/m2, 0,5 mg/m2, 0,83 mg/m2,1,25 mg/m2,1,75 mg/m2, 2,33 mg/m2, ou 3,1 mg/m2.
[00247] Em algumas modalidades, o composto é administrado a uma dose de 2,33 mg/m2.
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39/104 [00248] Em algumas modalidades, o composto é administrado por 3 dias a cada 3 semanas.
[00249] Em algumas modalidades, a dose adicional de LB-100 administrada ao indivíduo é uma quantidade 25% menor que a dose inicial.
[00250] Em algumas modalidades, a dose adicional de LB-100 administrada ao indivíduo é uma quantidade 50% menor que a dose inicial.
[00251] Em algumas modalidades, a dose adicional de LB-100 administrada ao indivíduo é uma quantidade 75% menor que a dose inicial.
[00252] Em algumas modalidades, a dose adicional de LB-100 administrada ao indivíduo é uma quantidade 25% maior que a dose inicial.
[00253] Em algumas modalidades, a dose adicional de LB-100 administrada ao indivíduo é uma quantidade 50% maior que a dose inicial.
[00254] Em algumas modalidades, a dose adicional de LB-100 administrada ao indivíduo é uma quantidade 75% maior que a dose inicial.
[00255] Em algumas modalidades, o indivíduo é ainda tratado com uma terapia anticâncer concomitantemente, antes, ou depois da administração.
[00256] Exemplos de terapia anticâncer incluem radioterapia ou quimioterapia, terapia vetorizada para promover a liberação de antígenos, vacinação para promover a apresentação de antígenos, agonista para moléculas coestimuladoras ou bloqueio de moléculas coinibitórias para amplificar a ativação de células T, inibição de trânsito de células T reguladoras ou células supressoras derivadas de mieloides, fator de crescimento endotelial antivascular para estimular a infiltração
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40/104 de células T intratumorais, transferência de células adotivas para aumentar o reconhecimento de câncer por infiltração de células T, ou estimular a eliminação do tumor. Exemplos adicionais podem ser encontrados em Swart et ai. 2016; Topalian et a!. 2015; e Tsiatas et ai.
2016.
[00257] Em algumas modalidades, a terapia anticâncer compreende imunoterapia. O termo imunoterapia refere-se ao tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença por um método que compreende induzir, melhorar, suprimir ou de alguma forma modificar uma resposta imunológica. Agentes de imunoterapia podem incluir agentes do tipo anticorpo que visam um ou mais de CTLA-4, PD-1, PD-L1, GITR, OC40, LAG-3, KIR, TIM-3, B7-H3, B7-H4, CD28, CD40, e CD137.
[00258] Em algumas modalidades, a terapia anticâncer compreende administrar um agente anticâncer.
[00259] Em algumas modalidades, o agente anticâncer é um modulador de pontos de verificação imunológicos. O termo modulador de pontos de verificação imunológicos refere-se a um agente que interage direta ou indiretamente com um ponto de verificação imunológico. Moduladores de pontos de verificação imunológicos podem ser administrados para vencer sinais inibitórios e permitir e/ou aumentar um ataque imune (immune attach) contra células cancerosas. Em algumas modalidades, um modulador de pontos de verificação imunológicos aumenta uma resposta efetora imune (por exemplo, resposta de células T citotóxicas). Em algumas modalidades, um modulador de pontos de verificação imunológicos reduz, remove, ou previne a tolerânica imune a um ou mais antígenos. Por exemplo, moduladores de pontos de verificação imunológicos podem facilitar as respostas de células imunes aumentando, inibindo, ou anulando a sinalização por reguladores negativos de respostas imunológicas (por exemplo, CTLA4), estimulando ou aumentando a sinalização de
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41/104 reguladores de respostas imunológicas (por exemplo, CD28), ou prevenindo respostas imunológicas e limitando danos teciduais mediados por células imunes.
[00260] Em algumas modalidades, o agente anticâncer compreende um anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo.
[00261] Em algumas modalidades, o agente anticâncer compreende um inibidor do aLigante 1 de Morte Programada (PD-L1). Em algumas modalidades, o inibidor de PD-L1 é atezolizumab.
[00262] Atezolizumab, o princípio ativo de Tecentriq™, é um anticorpo bloqueador do ligante-1 de morte programada humano (PD~ L1). O Atezolizumab é identificado por anticorpos específicos (Tecentriq, Food and Drug Administration Approved Labeling (Reference ID:4000525) [online], Genentech Inc., 2016 [encontrado em 24 de fevereiro de 2017], encontrado na Internet: <URL: www.accessdata.fda.gov/drugsatfda__docs/label/2016/761041lbl.pdf >).
[00263] A dose e o programa recomendados para o atezolizumab é de 1200 mg administrados por via intravenosa durante 60 minutos a cada 3 semanas até a evolução da doença ou toxicidade inaceitável. Infusões subsequentes podem ser distribuídas durante 30 minutos se a primeira infusão for tolerada.
[00264] Em algumas modalidades, a administração de atezolizumab compreende 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg ou menos de atezolizumab.
[00265] Em algumas modalidades, a administração periódica de atezolizumab compreende 1, 2, 3, 4 ou menos administrações de atezolizumab.
[00266] Em algumas modalidades, a administração de nivolumab é a cada 2 ou 3 semanas ou menos.
[00267] Em algumas modalidades, o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo liga-se especificamente a um receptor de Morte
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Programada-1 (PD-1) e inibe a atividade de PD-1 (anticorpo anti-PD~
1). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é nivolumab ou pembrolizumab.
[00268] Nivolumab, o princípio ativo de Opdivo™, é um anticorpo bloqueador do receptor de Morte Programada-1 (PD-1). O Nivolumab é identificado por anticorpos específicos (Opdivo™, Food and Drug Administration Approved Labeling (Reference ID:3677021) [online], Bristol-Myers Squibb, 2014 [encontrado em 27 de fevereiro de 2017], Encontrado na Internet: <URL:
www.accessdata.fda.gov/drugsatfda__docs/label/2014/125554lbl.pdf>).
[00269] A dose e o programa recomendados para o nivolumab é de 3 mg/kg administrados por via intravenosa durante 60 minutos a cada 2 semanas por 4 doses até a evolução da doença ou toxicidade inaceitável.
[00270] Em algumas modalidades, a administração de nivolumab compreende 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg ou menos de nivolumab.
[00271] Em algumas modalidades, a administração periódica de nivolumab compreende 1, 2, 3, 4 ou menos administrações de nivolumab.
[00272] Em algumas modalidades, a administração de nivolumab é a cada 2 ou 3 semanas ou menos.
[00273] Pembrolizumab, o princípio ativo de Keytruda™, é um anticorpo bloqueador do receptor de morte programada-1 humana (PD1). O Pembrolizumab é identificado por anticorpos específicos (Keytruda, Food and Drug Administration Approved Labeling (Reference ID:3621876) [online], Merck & Co., 2014 [encontrado em 27 de fevereiro de 2017], Encontrado na Internet: <URL:
www.accessdata.fda.gov/drugsatfda__docs/label/2014/125514lbl.pdf>).
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43/104 [00274] A dose e o programa recomendados para o pembrolizumab é de 2 mg/kg administrados por via intravenosa durante 30 minutos a cada 3 semanas até a evolução da doença ou toxicidade inaceitável. [00275] Em algumas modalidades, a administração de pembrolizumab compreende 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg ou menos de pembrolizumab.
[00276] Em algumas modalidades, a administração periódica de pembrolizumab compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou menos administrações de pembrolizumab.
[00277] Em algumas modalidades, a administração de pembrolizumab é a cada 2 ou 3 semanas ou menos.
[00278] Em algumas modalidades o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo liga-se especificamente ao antígeno-4 de linfócitos T citotóxicos (CTLA-4) e inibe a atividade de CTLA-4) (anticorpo anticTLA~4). Em uma outra modalidade. Em algumas modalidades, o anticorpo anticTLA-4 é ipilimumab ou tremelimumab.
[00279] Ipilimumab, o princípio ativo de Yervoy™, é um anticorpo bloqueador do antígeno 4 de linfócitos T citotóxicos humano (CTLA-4). O Ipilimumab é identificado por anticorpos específicos (Yervoy, Food and Drug Administration Approved Labeling (Reference ID: 3839653) [online], Bristol-Myers Squibb, 2015 [encontrado em 27 de fevereiro de 2017], Encontrado na Internet: <URL:
www.accessdata.fda.gov/drugsatfda__docs/label/2015/125377s073lbLp df>).
[00280] A dose e o programa recomendados para o ipilimumab para melanoma não ressectável ou metastático é de 3 mg/kg administrados por via intravenosa durante 90 minutos a cada 3 semanas por 4 doses. A dose e o programa recomendados para o ipilimumab para tratamento adjuvante de melanoma é de 10 mg/kg administrados por via
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44/104 intravenosa durante 90 minutos a cada 3 semanas por 4 doses seguida por 10 mg/kg a cada 12 semanas por até 3 anos.
[00281] Em algumas modalidades, a administração de ipilimumab compreende 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg ou menos de ipilimumab.
[00282] Em algumas modalidades, a administração periódica de ipilimumab compreende 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou menos administrações de ipilimumab.
[00283] A presente invenção também apresenta um método para tratar um tumor ou câncer em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um inibidor de PP2A, onde o tumor ou o câncer é suscetível a tratamento por uma resposta imunológica.
[00284] A presente invenção também apresenta um método para aumentar a resposta de células T a células cancerosas em um indivíduo que sofre de câncer compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade de um inibidor de PP2A eficaz para aumentar a resposta de células T.
[00285] Em algumas modalidades, o inibidor de PP2A tem a estrutura:
[00286] Em algumas modalidades, o método compreende ainda administrar um ou mais agentes anticâncer adicionais.
[00287] A presente invenção também apresenta um método para tratar um indivíduo que sofre de câncer compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um inibidor de PP2A em combinação com uma quantidade eficaz de uma terapia anticâncer,
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45/104 onde as quantidades quando tomadas juntas são eficazes para tratar o indivíduo.
[00288] A presente invenção também apresenta um método para tratar um indivíduo que sofre de câncer e receber terapia anticâncer compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de inibidor de PP2A eficaz para melhorar o tratamento em relação à terapia anticâncer isoladamente.
[00289] Em algumas modalidades, o câncer é suscetível a tratamento com imunoterapia por uma resposta imunológica.
[00290] Os compostos usados no método da presente invenção são inibidores da proteína fosfatase 2A (PP2A). Métodos de preparação podem ser encontrados em Lu et al., 2009; US 7,998,957 B2; e US 8,426,444 B2. O composto LB-100 é um inibidor de PP2A in vitro em células cancerosas humanas e em xenoenxertos de células tumorais humanas em camundongos quando administrado por via parenteral em camundongos. O LB-100 inibe o crescimento de células cancerosas em sistemas de modelos de camundongos.
[00291] Conforme usado neste relatório, um sintoma associado à lesão de reperfusão inclui qualquer manifestação clínica ou laboratorial associada à lesão de reperfusão e não se limita àquilo que o indivíduo possa sentir ou observar.
[00292] Conforme usado neste relatório, tratamento das doenças ou tratar, por exemplo, de lesão de reperfusão, abrange induzir prevenção, inibição, regressão, ou estase da doença ou de um sintoma ou condição associada à doença.
[00293] Conforme usado neste relatório, inibição da evolução ou doença ou de complicação da doença em um indivíduo significa prevenir ou reduzir a evolução da doença e/ou a complicação da doença no indivíduo.
[00294] Conforme usado neste relatório, alquila destina-se a incluir
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46/104 grupos hidrocarboneto alifático saturado de cadeia ramificada e de cadeia reta tendo o número especificado de átomos de carbono. Assim sendo, C1-Cn como em Cl-Cn alquil é definido como incluindo grupos com 1, 2......, n~1 ou n carbonos em um arranjo linear ou ramificado, e inclui especificamente metila, etila, propila, butila, pentila, hexila, heptila, isopropila, isobutila, sec-butila entre outros. Uma modalidade pode ser C1-C20 alquila, C2-C20 alquila, C3-C20 alquila, C4-C20 alquila entre outros. Uma modalidade pode ser C1-C30 alquila, C2-C30 alquila, C3C30 alquila, C4-C30 alquila entre outros. Alcóxi representa um grupo alquila como descrito acima preso através de uma ponte de oxigênio.
[00295] O termo alquenila refere-se a um radical hidrocarboneto não aromático, de cadeia reta ou ramificada, contendo pelo menos 1 ligação dupla carbono a carbono, e até o número máximo possível de ligações duplas carbono-carbono não aromáticas podem estar presentes. Assim sendo, C2-Cn alquenila é definido como incluindo grupos com 1, 2...., n~1 ou n carbonos. Por exemplo, C2-C6 alquenila significa um radical alquenila com 2, 3, 4, 5, ou 6 átomos de carbono, e pelo menos 1 ligação dupla carbono-carbono, e até, por exemplo, 3 ligações duplas carbono-carbono no caso de um C6 alquenila, respectivamente. Grupos alquenila incluem etenila, propenila, butenila e ciclo-hexenila. Como descrito acima para alquila, the straight, a porção ramificada ou cíclica do grupo alquenila pode conter ligações duplas e pode ser substituída se um grupo alquenila substituída estiver indicado. Uma modalidade pode ser C2-C12 alquenila, C3-C12 alquenila, C2-C20 alquenila, C3-C20 alquenila, C2-C30 alquenila, ou C3-C30 alquenila.
[00296] O termo alquinila refere-se a um radical hidrocarboneto de cadeia reta ou ramificada, contendo pelo menos 1 ligação tripla carbono a carbono, e até o número máximo possível de ligações trilas carbonocarbono não aromáticas podem estar presentes. Assim sendo, C2-Cn alquinila é definido como incluindo grupos com 1, 2...., n-1 ou n
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47/104 carbonos. Por exemplo, C2-C6 alquinila significa um radical alquinila com 2 ou 3 átomos de carbono, e 1 ligação tripla carbono-carbono, ou com 4 ou 5 átomos de carbono, e até 2 ligações triplas carbonocarbono, ou com 6 átomos de carbono, e até 3 ligações triplas carbonocarbono. Grupos alquinila incluem etinila, propinila, e butinila. Como descrito acima para alquila, a porção reta ou ramificada do grupo alquinila pode conter ligações triplas e pode ser substituído se um grupo alquinila substituída estiver indicado. Uma modalidade pode ser um C2Cn alquinila. Uma modalidade pode ser C2-C12 alquinila ou C3-C12 alquinila, C2-C20 alquinila, C3-C20 alquinila, C2-C30 alquinila, ou C3C30 alquinila.
[00297] Conforme usado neste relatório, arila destina-se a indicar qualquer anel de carbono moncílico ou bicíclico de até 10 átomos em cada anel, onde pelo menos um anel é aromático. Exemplos de tais elementos arila incluem fenila, naftila, tetra-hidro-naftila, indanila, bifenila, fenantrila, antrila ou acenaftila. Nos casos em que o substituinte arila é bicíclico e onde um anel é não aromático, entende-se que a ligação ocorre via o anel aromático. As arilas substituídas incluídas nesta invenção incluem substituição em qualquer posição adequada com aminas, aminas substituídas, alquilaminas, hidróxis e alquilhidróxis, onde a porção alquila das alquilaminas e alquil-hidróxis é um C2-Cn alquila já definido acima. As aminas substituídas podem ser substituídas com grupos alquila, alquenila, alquinila, ou arila como definidos acima.
[00298] Cada ocorrência de alquila, alquenila, ou alquinila é ramificada ou não ramificada, não-substituída ou substituída.
[00299] Os substituintes alquila, alquenila, alquinila, e arila podem ser substituídos ou não substituídos, a menos que especificamente indicado em contrário. Por exemplo, um (C1-C6) alquila pode ser substituído com um ou mais substituintes selecionados dentre OH, oxo,
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48/104 halogênio, alcóxi, dialquil-amino, ou heterociclila, tal como morfolinila, piperidinila, entre outros.
[00300] Nos compostos da presente invenção, os grupos alquila, alquenila, e alquinila podem ser ainda substituídos por substituição de um ou mais átomos de hidrogênio por grupos diferentes de hidrogênio descritos neste pedido na medida do possível. Estes incluem, porém sem limitação, halo, hidróxi, mercapto, amino, carbóxi, ciano e carbamoila.
[00301] O termo substituído conforme usado neste relatório significa que uma dada estrutura tem um substituinte que pode ser um grupo alquila, alquenila, ou arila definido acima. O termo deve ser considerado como incluindo múltiplos graus de substituição por um substituinte especificado. Onde estão divulgadas ou reivindicadas múltiplas porções substituintes, o composto substituído pode ser independentemente substituído com uma ou mais das porções substituintes divulgadas ou reivindicadas, individualmente ou coletivamente. Por independentemente substituído entende-se que os (dois ou mais) substituintes podem ser os mesmos ou diferentes.
[00302] Fica entendido que os substituintes e os padrões de substituição nos compostos da presente invenção podem ser selecionados pelo especialista na técnica de forma a fornecer compostos que sejam quimicamente estáveis e que podem ser facilmente sintetizados por técnicas conhecidas no estado da técnica, assim pelos métodos apresentados acima, a partir de materiais de partida facilmente disponíveis. Se um substituinte for ele mesmo substituído com mais de um grupo, fica entendido que esses múltiplos grupos podem ser estar no mesmo carbono ou em carbonos diferentes, contanto que resulte em uma estrutura estável.
[00303] Conforme usado neste relatório, a administração de um agente pode ser feita por meio de qualquer um de vários métodos ou
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49/104 sistemas de distribuição bastante conhecidos pelos especialistas na técnica. A administração pode ser feita, por exemplo, por via oral, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intra-arterial, transdérmica, sublingual, intramuscular, retal, transbucal, intranasal, lipossômica, via inalação, vaginal, intraocular, via distribuição local, subcutânea, intraadiposa, intra-articular, intratecal, em um ventrículo cerebral, intraventicular, intratumoral, no parânquima cerebral ou intraparenquimatosa.
[00304] Os sistemas de distribuição a seguir, que empregam inúmeros veículos farmacêuticos rotineiramente usados, podem ser usados, mas são apenas representativos dos muitos sistemas possíveis previstos para administração das composições de acordo com a invenção.
[00305] Sistemas de distribuição de fármacos injetáveis incluem soluções, suspensões, géis, microesferas e injetáveis poliméricos, e podem compreender excipientes tais como agentes que alteram a solubilidade (por exemplo, etanol, propileno glicol e sacarose) e polímeros (por exemplo, policaprilactonas e PLGAs).
[00306] Outros sistemas de distribuição de fármacos injetáveis incluem soluções, suspensões, géis. Sistemas de distribuição oral incluem comprimidos e cápsulas. Estes podem conter excipientes tais como aglutinantes (por exemplo, hidroxipropilmetilcelulose, polivinil pirrolidona, outros materiais celulósicos e amido), diluentes (por exemplo, lactose e outros açúcares, amido, fosfato dicálcico e materiais celulósicos), agentes desintegrantes (por exemplo, polímeros de amido e materiais celulósicos) e agentes lubrificantes (por exemplo, estearatos e talco).
[00307] Sistemas implantáveis incluem bastões e discos, e podem conter excipientes tais como PLGA e policaprilactona.
[00308] Sistemas de distribuição oral incluem comprimidos e
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50/104 cápsulas. Estes podem conter excipientes tais como aglutinantes (por exemplo, hidroxipropilmetilcelulose, polivinil pirrolldona, outros materiais celulósicos e amido), diluentes (por exemplo, lactose e outros açúcares, amido, fosfato dicálclco e materiais celulósicos), agentes desintegrantes (por exemplo, polímeros de amido e materiais celulósicos) e agentes lubrificantes (por exemplo, estearatos e talco).
[00309] Sistemas de distribuição transmucosa incluem compressas, comprimidos, supositórios, pessários, géis e cremes, e podem conter excipientes tais como solubilizantes e melhoradores (por exemplo, propileno glicol, sais biliares e aminoácidos), e outros veículos (por exemplo, polietileno glicol, ésteres de ácidos graxos e derivados, e polímeros hidrofílicos tais como hidroxipropilmetilcelulose e ácido hialurônico).
[00310] Sistemas de distribuição dérmica incluem, por exemplo, géis aquosos e não aquosos, cremes, emulsões múltiplas, microemulsões, lipossomas, pomadas, soluções aquosas e não aquosas, loções, aerossóis, bases e pós de hidrocarboneto, e podem conter excipientes tais como solubilizantes, melhoradores de permeação (por exemplo, ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos, álcoois graxos e aminoácidos), e polímeros hidrofílicos (por exemplo, policarbophil e polivinilpirrolidona). Em uma modalidade, o veículo farmaceuticamente aceitável é um lipossoma ou um melhorador transdérmico.
[00311] Soluções, suspensões e pós para sistemas de distribuição reconstituíveis incluem veículos tais como agentes de suspensão (por exemplo, gomas, zantanas, celulósicos e açúcares), umectantes (por exemplo, sorbitol), solubilizantes (por exemplo, etanol, água, PEG e propileno glicol), tensoativos (por exemplo, lauril sulfato de sódio, Spans, Tweens, e cetil piridina), preservativos e antioxidantes (por exemplo, parabenos, vitaminas E e C, e ácido ascórbico), agentes antiaglomerantes, agentes de revestimento, e agentes quelantes (por
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51/104 exemplo, EDTA).
[00312] Conforme usado neste relatório, veículo farmaceuticamente aceitável refere-se a um veículo ou excipiente que é adequado para uso com seres humanos e/ou animais sem efeitos colaterais adversos indevidos (tais como toxicidade, irritação, e resposta alérgica) condizente com uma relação risco/benefício razoável. Este pode ser um solvente, agente de suspensão ou veículo farmaceuticamente aceitável, para distribuição dos presentes compostos ao indivíduo.
[00313] Os compostos usados no método da presente invenção podem estar na forma de um sal. Conforme usado neste relatório, um sal é um sal dos presentes compostos que fora modificado fazendose sais de ácido ou de base dos compostos. No caso de compostos usados para tratar uma infecção ou doença, o sal é farmaceuticamente aceitável. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém sem limitação, sais de ácidos minerais ou orgânicos de resíduos básicos tais como aminas; sais alcalinos ou orgânicos de resíduos ácidos tais como fenóis. Os sais podem ser feitos usando-se um ácido orgânico ou inorgânico. Tais sais de ácido são cloretos, brometos, sulfatos, nitratos, fosfatos, sulfonatos, formiatos, tartaratos, maleatos, malatos, citratos, benzoatos, salicilatos, ascorbatos, entre outros. Sais de fenolato são os sais de metais alcalino-terrosos, sódio, potássio ou lítio. O termo sal farmaceuticamente aceitável neste contexto referese aos sais de adição de ácido ou de base inorgânica ou orgânica relativamente atóxicos dos compostos da presente invenção. Estes sais podem ser preparados in situ durante o isolamento e a purificação finais dos compostos da invenção, por reação separada de um composto da invenção purificado em sua forma de base livre ou de ácido livre com um ácido ou base orgânica ou inorgânica adequada, e isolamento do sal assim formado. Sais representativos incluem os sais de bromidrato cloridrato, sulfato, bissulfato, fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato,
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52/104 palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maieato, fumarato, succinato, tartarato, naftiiato, mesilato, glucoheptonate, lactobionato, e laurilsulfonato, entre outros (Vide, por exemplo, Berge et al. (1977) Pharmaceutical Salts, J. Pharm. Sci.
66:1-19).
[00314] A presente invenção inclui ésteres ou ésteres farmaceuticamente aceitáveis dos compostos do presente método. O termo éster inclui, porém sem limitação, um composto contendo o grupo R-CO-OR’. A porção R-CO-O pode ser derivada do composto parental da presente invenção. A porção R”' inclui, porém sem limitação, grupos alquila, alquenila, alquinila, heteroalquila, arila, e carbóxi alquila.
[00315] A presente invenção inclui ésteres de pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis dos compostos do presente método. Ésteres de pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da presente invenção são derivados do tipo éster que são conversíveis por solvólise ou em condições fisiológicas nos ácidos carboxílicos livres do composto parental. Um exemplo de um pró-fármaco é um alquil éster que é clivado in vivo para dar o composto de interesse.
[00316] O composto, ou sal, zwiteríon, ou éster do mesmo, é opcionalmente apresentado em uma composição farmaceuticamente aceitável incluindo os veículos farmaceuticamente aceitáveis apropriados.
[00317] Conforme usado neste relatório, uma quantidade ou dose de um agente medida em miligramas refere-se aos miligramas de agente presentes em um produto medicamentoso, independente da forma do produto medicamentoso.
[00318] O National Institutes of Health (NIH) apresenta uma tabela de Fatores de Conversão de Equivalência de Dosagem para Área Superficial abaixo (Tabela A) que apresenta fatores de conversão que
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53/104 levam em conta as razões de área superficial para peso entre as espécies.
Tabela A: Fatores de Conversão de Equivalência de Dosagem para
Área Superficial
Para | ||||||
CD Q | Camundongo 20 g | Rato 150 g | Macaco 3 kg | Cachorro 8 kg | Homem 60 kg | |
Camundongo | 1 | 1/2 | 1/4 | 1/6 | 1/12 | |
Rato | 2 | 1 | 1/2 | 1/4 | 1/7 | |
Macaco | 4 | 2 | 1 | 3/5 | 1/3 | |
Cachorro | 6 | 4 | 1 2/3 | 1 | 1/2 | |
Homem | 12 | 7 | 3 | 2 | 1 |
[00319] Conforme usado neste relatório, o termo quantidade terapeuticamente eficaz ou quantidade eficaz refere-se à quantidade de um componente que é suficiente para produzir uma resposta terapêutica desejada sem efeitos colaterais adversos indevidos (tais como toxicidade, irritação, ou resposta alérgica) condizente com uma relação risco/benefício razoável quando usada da maneira desta invenção. A quantidade eficaz específica vai variar com fatores tais como a condição particular sendo tratada, a condição física do paciente, o tipo de mamífero sendo tratado, a duração do tratamento, a natureza da terapia concomitante (se houver), e as formulações específicas empregadas e a estrutura dos compostos ou seus derivados.
[00320] Onde dado um intervalo no relatório descritivo, fica entendido que os intervalos inclui todos os números inteiros e 0,1 unidade dentro daquele intervalo, e qualquer subintervalo do mesmo. Por exemplo, um intervalo de 77 a 90% é uma exposição de 77, 78, 79, 80, e 81% etc.
[00321] Conforme usado neste relatório, cerca de em relação a um número dado abrange um intervalo de +um por cento a -um por cento do valor dado. A título de exemplo, cerca de 100 mg/kg inclui, portanto,
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99, 99,1,99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9, 100, 100,1, 100,2,
100,3, 100,4, 100,5, 100,6, 100,7, 100,8, 100,9 e 101 mg/kg. Assim sendo, cerca de 100 mg/kg inclui, em uma modalidade, 100 mg/kg.
[00322] Fica entendido que onde apresentado um intervalo de algum parâmetro, todos os números inteiros dentro daquele intervalo, e seus decimais, também são apresentados pela invenção. Por exemplo, 0,25 mg/kg/dia é uma divulgação de 0,2 mg/kg/dia, 0,3 mg/kg/dia, 0,4 mg/kg/dia, 0,5 mg/kg/dia, 0,6 mg/kg/dia etc. até 5,0 mg/kg/dia.
[00323] Para as modalidades precedentes, contempla-se que cada modalidade divulgada neste pedido é aplicável a cada uma das outras modalidades divulgadas. Assim, todas as combinações dos vários elementos descritos neste pedido estão dentro do escopo da invenção. [00324] Esta invenção será melhor compreendida com referência aos Detalhes Experimentais a seguir, mas os especialistas na técnica facilmente perceberão que os experimentos específicos detalhados são apenas ilustrativos da invenção descrita de forma mais completa nas reivindicações mais adiante.
TERAPIA COMBINADA [00325] A administração de dois fármacos para tratar uma dada condição, tal como melanoma, cria inúmeros problemas potenciais. As interações in vivo entre dois fármacos são complexas. Os efeitos de qualquer fármaco único estão relacionados com sua absorção, distribuição, e eliminação. Quando dois fármacos são introduzidos no corpo, cada fármaco pode afetar a absorção, a eliminação, e a eliminação da outra e, portanto, alterar os efeitos da outra. Por exemplo, um fármaco pode inibir, ativar ou induzir a produção de enzimas envolvidas em uma via metabólica de eliminação do outro fármaco. (Guidance for Industry, 1999). Assim sendo, quando são administrados dois fármacos para tratar a mesma condição, é imprevisível se cada uma delas vai complementar a outra, não ter qualquer efeito na outra,
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55/104 ou interferir na atividade terapêutica da outra em um indivíduo humano. [00326] Não só a interação entre dois fármacos pode afetar a atividade terapêutica pretendida de cada fármaco, como a interação pode aumentar os níveis de metabólitos tóxicos (Guidance for Industry, 1999). A interação também pode aumentar ou diminuir os efeitos colaterais de cada fármaco. Portanto, com a administração de dois fármacos para tratar uma doença, é imprevisível qual alteração ocorrerá no perfil de efeitos colaterais negativos de cada fármaco.
[00327] Adicionalmente, é difícil prever com exatidão quando os efeitos da interação entre os dois fármacos vão se manifestar. Por exemplo, as interações metabólicas entre fármacos podem ficar aparentes quando da administração inicial do segundo fármaco, depois de os dois atingirem uma concentração estacionária ou depois da descontinuação de um dos fármacos. (Guidance for Industry, 1999) DETALHES EXPERIMENTAIS
Exemplo 1. Inibição de PP2A e atividade de CTLA-4 [00328] O composto LB-100 e outros homólogos de LB-100 divulgados neste pedido inibem a função de CTLA-4 em células T alterando a interação de CTLA-4 e PP2A, dessa forma bloqueando a inibição mediada por CTLA-4 de ativação de células T. Tal interação resulta em ativação aumentada de células T.
Exemplo 2. Estudos in vitro: PP2A e CTLA4 [00329] Células T humanas primárias e células T de Jurkat são tratadas com LB-100 e os níveis de ativação das células T são medidos. LB-100 aumenta a ativação das células T.
[00330] Células T humanas primárias e células T de Jurkat são tratadas com LB-100 e a interação de PP2A:CTLA~4 é avaliada. LB-100 diminui a interação de PP2A e CTLA-4.
[00331] Células T humanas primárias e células T de Jurkat são tratadas com LB-100 e os níveis de fosforilação de PP2A são medidos.
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LB-100 aumenta a fosforilação nas células T.
Exemplo 3. Administração de LB-100 e análogos [00332] Uma quantidade do composto LB-100 é administrada a um indivíduo que sofre de câncer. A quantidade do composto é eficaz para tratar o câncer aumentando o número de células T citotóxicas no indivíduo.
[00333] Um análogo do composto LB-100 divulgado neste pedido é administrado a um indivíduo que sofre de câncer. A quantidade do composto é eficaz para tratar o câncer aumentando o número de células T citotóxicas no indivíduo.
[00334] Uma quantidade do composto LB-100 é administrada a um indivíduo que sofre de melanoma. A quantidade do composto é eficaz para tratar o câncer aumentando o número de células T citotóxicas no indivíduo.
[00335] Um análogo do composto LB-100 divulgado neste pedido é administrado a um indivíduo que sofre de melanoma. A quantidade do composto é eficaz para tratar o câncer aumentando o número de células T citotóxicas no indivíduo.
Exemplo 4. Administração de LB-100 em combinação com um inibidor do ponto de verificação de CTLA-4 [00336] Uma quantidade do composto LB-100 em combinação com um inibidor do ponto de verificação de CTLA-4 é administrada a um indivíduo que sofre de câncer. A quantidade do composto e do inibidor é eficaz para tratar o indivíduo.
[00337] Uma quantidade do composto LB-100 em combinação com um inibidor do ponto de verificação de CTLA-4 é administrada a um indivíduo que sofre de câncer. A quantidade do composto é eficaz para aumentar a atividade anticâncer do inibidor do ponto de verificação de CTLA-4.
[00338] Uma quantidade do composto LB-100 em combinação com
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57/104 um inibidor do ponto de verificação de CTLA-4 é administrada a um indivíduo que sofre de melanoma. A quantidade do composto e do inibidor é eficaz para tratar o indivíduo.
[00339] Uma quantidade do composto LB-100 em combinação com um inibidor do ponto de verificação de CTLA-4 é administrada a um indivíduo que sofre de melanoma. A quantidade do composto é eficaz para aumentar a atividade anticâncer do inibidor do ponto de verificação de CTLA-4.
Exemplo 5: Avaliação da eficácia de LB-100 como terapia complementar ao Ipilimumab ou ao Tremelimumab [00340] A terapia complementar proporciona um efeito sinergístico, e permite doses mais baixas com efeitos colaterais reduzidos.
[00341] A administração periódica de LB-100 como uma terapia complementar a um paciente humano que sofre de melanoma que já está recebendo Ipilimumab ou Tremelimumab oferece uma vantagem clinicamente significativa e é mais eficaz (proporciona pelo menos um efeito aditivo ou mais de um efeito aditivo) no tratamento do paciente do que quando ipilimumab ou tremelimumab é administrado isoladamente (na mesma dose).
[00342] A administração periódica de Ipilimumab ou Tremelimumab como uma terapia complementar a um paciente humano que sofre de melanoma que já está recebendo LB-100 oferece uma vantagem clinicamente significativa e é mais eficaz (proporciona pelo menos um efeito aditivo ou mais de um efeito aditivo) no tratamento do paciente do que quando LB-100 é administrado isoladamente (na mesma dose).
[00343] As terapias complementares também apresentam eficácia (proporcionam pelo menos um efeito aditivo ou mais de um efeito aditivo) no tratamento do paciente sem efeitos colaterais adversos indevidos ou sem afetar a segurança do paciente. Comparado com quando cada agente é administrado isoladamente:
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1. A terapia complementar é mais eficaz (proporciona um efeito aditivo ou mais de um efeito aditivo) em aumentar a quantidade de células T citotóxicas em pacientes com melanoma;
2. A terapia complementar é mais eficaz (proporciona um efeito aditivo ou mais de um efeito aditivo) em reduzir a evolução de melanoma em pacientes com melanoma; e/ou
3. A terapia complementar é mais eficaz (proporciona um efeito aditivo ou mais de um efeito aditivo) em reduzir a função de CTLA-4 em pacientes com melanoma.
DISCUSSÃO (Exemplas 1-5) [00344] A importância do sistema imunológico no contexto de câncer tem sido cada vez reconhecida com o desenvolvimento de imunoterapia para câncer. O mecanismo de controle natural do sistema imunológico para prevenir a autoimunidade frequentemente é co-optado por tumores para escapar da imunovigilância. Moléculas de ponto de verificação, tais como morte programada-1 (PD-1) e proteína associada a linfócitos T citotóxicos 4 (CTLA-4), são reguladores negativos no sistema imunológico que são constitutivamente ativados por tumores para suprimir a atividade das células T citotóxicas que reconhecem neoantígenos de tumores (Topalian et aL 2015). As células T reguladoras imunossupressoras também são recrutadas pelo microambiente do tumor (TME) para reduzir a eficiência das células T CD8. Anticorpos monoclonais que bloqueiam a sinalização de PD-1 ou CTLA-4 conseguiram induzir respostas de longo prazo duradouras em alguns pacientes com melanoma metastático. Isto levou à aprovação do Ipilimumab (anticTLA-4) em 2011 e do nivolumab (anti-PD-1) em 2014 pelo U.S. Food and Drug Administration para tratamento de melanoma avançado. Os ensaios clínicos atuais estão em vias de expandir o uso de inibidores de pontos de verificação para vários outros tipos de câncer, abrindo uma mudança de paradigma na abordagem de
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59/104 terapias contra câncer. No entanto, somente um subgrupo de pacientes responde efetivamente à inibição de pontos de verificação como único agente, ressaltando o fato de que múltiplos mecanismos redundantes estão envolvidos na criação de um TME imunossupressor. Por conseguinte, uma área de pesquisa ativa é identificar estratégias combinadas que poderíam aumentar o efeito da inibição de pontos de verificação.
[00345] O antígeno associado a linfócitos T citotóxicos 4 (CTLA-4) é uma glicoproteína induzida por ativação da superfamília de imunoglobulinas, cuja função principal é infra-regular as respostas de células T (Brunet, J.F. et al. 1987). O CTLA-4 é expresso na superfície das células T, onde ele suprime primariamente seus estágios iniciais de ativação induzindo a sinalização de receptores de células T (TCR) a jusante inibitórios e neutralizando a atividade do receptor de células T coestimulador, CD28, inibindo assim a ativação de células T e aumentando a tolerância imunológica a certas doenças, por exemplo, câncer. Diversos mecanismos, incluindo antagonismo da coestimulação CD28~dependente e sinalização negativa direta já foram documentados para explicar a capacidade inibitória do CTLA-4 (Carreno, B.M. et al. 2000). Como a cauda citoplasmática do CTLA-4 não possui atividade enzimática intrínseca, a distribuição de tal sinal negativo provavelmente é fornecida através da associação de CTLA-4 com moléculas sinalizadoras essenciais (Teft, W.A. Et al. 2006).
[00346] A inibição de CTLA-4 tem sido visada para o tratamento de cânceres por meio de um bloqueio de pontos de verificação imunológicos. Modelos celulares e murinos de malignidade demonstram que o bloqueio do antígeno de linfócitos T citotóxicos 4 (CTLA-4), um regulador negativo de respostas de células T, aumenta as respostas endógenas a células tumorais, levando assim à morte das células tumorais quando usado isoladamente ou com outras intervenções
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60/104 terapêuticas (Grosso, J.F. et al. 2013). As descobertas pré-clínicas já levaram ao desenvolvimento clínico de um anticorpo monoclonal (mAb) de lgG1 totalmente humano, ipilimumab e um mAb de lgG2 totalmente humano, tremelimumab, sendo que cada um deles liga o CTLA-4. [00347] A fosforilação de proteínas por quinases e sua desfosforilação por fosfatases são componentes críticos das vias de sinalização celular que regulam a multiplicidade de processos que incluem proliferação celular e morte celular (Shi et al. 2009). Embora as fosfatases há muito sejam consideradas potencialmente importantes para o tratamento de câncer, poucos esforços são feitos no sentido de desenvolver inibidores de fosfatase por causa da preocupação com a toxicidade (Janssens et al. 2012).
[00348] A proteína fosfatase 2A (PP2A) é uma serina/treonina fosfatase ubíqua que desfosforila numerosas proteínas tanto das vias de resposta ATM/ATR-dependentes quanto -independentes (Mumby, M. 2007). PP2A está envolvida em um conjunto variado de processos celulares. No sistema imunológico, já foi mostrado que a PP2A se associa ao CTLA-4 e medeia a desfosforilação de Akt levando à inibição das células T ativadas (Parry et al. 2005). Já foi anteriormente mostrado que a inibição farmacológica de PP2A sensibiliza as células cancerosas a danos em DNA mediados por radiação via a fosforilação constitutiva de várias proteínas sinalizadoras, tais como p53, γΗ2ΑΧ, PLK1 e Akt, resultando na desregulação do ciclo celular, inibição de reparo de DNA, e apoptose (Wei, D. et al. 2013).
[00349] Já foi mostrado que a cantaridina, o principal princípio ativo do extrato de besouro de bolha (Mylabris), é um composto derivado da medicina chinesa tradicional, que é um potente inibidor de PP2A (Efferth, T. et al. 2005). Embora a cantaridina tenha sido previamente usada no tratamento de hepatomas e tenha apresentado eficácia contra linhagens celulares de leucemia resistentes a múltiplos fármacos
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61/104 (Efferth, T. etal. 2002), sua severa toxicidade limita sua utilidade clínica. Foi relatado que a cantaridina, uma toxina de ocorrência natural, e seu análogo desmetilado, norcantaridina, ambos potentes inibidores de PP2A (Bertini et al. 2009) possuem atividade anticâncer em pacientes na China com câncer gastrointestinal (Wang et al. 1989) embora poucos detalhes clínicos se encontrem disponíveis.
[00350] Fostriecina, um outro inibidor seletivo de PP2A foi avaliada em diversos ensaios fase 1 patrocinados pelo US NCI há mais de vinte anos. No maior ensaio, a fostriecina foi associada à estabilidade da doença em 16 (34,8%) de 46 pacientes com tumor sólido sem toxicidade limitante da dose (DLT) (Lê et al. 2004). Nenhum ensaio foi concluído devido ao suprimento insuficiente do fármaco.
[00351 ] LB-100 é um derivado de moléculas pequenas de cantaridina com significativamente menos toxicidade. O LB-100 e seu homólogo solúvel em lipídio, LB-102, inibem a proliferação de linhagens celulares de uma variedade de tumores sólidos humanos. Ambos os compostos potentcializam a atividade sem aumentar significativamente a toxicidade da cisplatina, doxorubicina, e temozolomida contra xenoenxertos de carcinoma pancreático e hepatocelular; fibrossarcoma; feocromocitoma; neuroblastoma; e glioblastoma e de raios X focal contra xenoenxertos pancreáticos, nasofaríngeos e de glioblastoma (Bai etal., 2014a; Bai et al., 2014b; Zhang etal., 2010; Matiniova etal., 2011; Lu etal., 2009; Wei et al., 2013; Lv et al., 2014; Gordon et al., 2015). Além disso, LB-100 reverteu a resistência à cisplatina em xenoenxertos de carcinoma de ovário e meduloblastoma (Chang et al., 2015; Ho et al., 2016). Estudos pré-clínicos anteriores mostraram que o LB-100 pode melhorar os efeitos citotóxicos da temozolomida, doxorubicina, e radioterapia contra glioblastoma (GBM), feocromocitoma metastático, e câncer de pâncreas (Wei, D. etal. 2013; Lu, J. etal. 2009; Zhang, C. etal. 2010; Martiniova, L. etal. 2011).
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62/104 [00352] LB-100 também está passando por um estudo Fase 1 em combinação com docetaxel para o tratamento de tumores sólidos (Chung, V. 2013). LB-100 é um novo inibidor de moléculas pequenas de primeira linha da proteína fosfatase 2A (PP2A) que mostrou, em um ensaio de Fase 1, ser bem tolerado em doses associadas à estabilização de tumores sólidos progressivos (Chung et al. 2017). A PP2A foi implicada na mediação da sinalização de Akt a jusante de CTLA-4 (Parry et a!. 2005). Em uma triagem in vivo de RNA tipo grampo de cabelo curto agrupado, foi constatado que Ppp2r2d, uma subunidade reguladora de PP2A, quando nocauteada, aumentava ao máximo a proliferação de linfócitos infiltrantes de tumor entre todos os genes na biblioteca de RNA e PP2A foi identificado como um regulador chave na supressão da proliferação de células T no microambiente tumoral (Zhou et at. 2014). Além disso, foi constatado que ο PP2A era essencial para a função das células T reguladoras (Treg) (Apostolidis et al. 2014).
[00353] Embora múltiplos estudos pré-clínicos tenham mostrado que o LB-100 é um quimio- ou radio-sensibilizador eficaz em vários modelos de tumor (Hone et al. 2015), nenhum deles estudou seu efeito no sistema imunológico.
[00354] O enfraquecimento da função do CTLA-4 permite que pacientes com câncer instalem um ataque mais eficaz de células T citotóxicas em seus cânceres. Ao contrário do modulador de CTLA-4 clinicamente usado, o anticorpo ipilimumab (Yervoy), que está associado à toxicidade em doses terapeuticamente eficazes, o composto LB-100 está associado à estabilidade de diversos tipos diferentes de câncer na ausência de qualquer toxicidade ou efeitos colaterais significativos.
[00355] Existem inúmeros relatos de atividade clínica inibindo CTLA4 com ipilimumab, particularmente em pacientes com melanoma avançado. Estes estudos mostram que o agente ipilimumab
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63/104 isoladamente e em combinação com um fármaco citotóxico tal como dacarbazina ou com um outro inibidor de pontos de verificação imunológicos, nivolumab, provocam a regressão de cânceres. Isoladamente ou em combinação com outros agentes, o ipilimumab está associado à toxicidade significativa tal como no estudo de Hodi et al. (2010) no qual até 15% dos pacientes tinham eventos adversos grau 3 ou 4 incluindo uma incidência de 2,1% de falecimento. Wolchok et al. (2013) estudaram ipilimumab mais nivolumab em pacientes com advanced melanoma, mas eventos adversos grau 3 ou 4 ocorreram em 53% dos pacientes. Por conseguinte, a disponibilidade de uma molécula tal como LB-100 que não tem toxicidade limitante em doses associadas à estabilização de câncer progressivo e tem atividade anticTLA-4 é um candidato clínico atraente para o tratamento de cânceres humanos. Atualmente não existem determinantes moleculares de resposta clínica à modulação de CTLA-4. Snyder et al. (2014) apresentaram uma base genética para o potencial benefício resultante do tratamento de melanoma com CTLA-4, proporcionando um base em potencial para a caracterização de neoantígenos tumorais candidatos para cada paciente.
[00356] Sem desejarmos nos ater à teoria, acredita-se que o CTLA4 interage com a PP2A nas células T humanas e tal interação é essencial para a função apropriada do CTLA-4. Quando funcionando corretamente, o CTLA-4 inibe a ativação de células T, reduzindo assim a imunorresposta a células cancerosas. A administração de um inibidor de PP2A a um indivíduo com câncer altera a interação de PP2A com CTLA-4, perturbando assim a função normal do CTLA-4. A redução ou eliminação da função do CTLA-4 em células T leva à ativação aumentada de células T. A ativação aumentada de células T resulta em um aumento de células T citotóxicas no indivíduo que visam e destroem as células cancerosas. Como com os inibidores de pontos de verificação
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64/104 imunológicos existentes, o LB-100 é eficaz isoladamente e/ou em combinação com outros inibidores de pontos de verificação.
Exemplo 6. Avaliação do LB-100 em pacientes adultos com tumores sólidos progressivos [00357] PP2A há muito foi reconhecido como um alvo potencialmente importante para terapia contra câncer por conta seu papel regulador na divisão celular, resposta a danos no DNA, reparo de recombinação homóloga, e saída mitótica, mas a inibição dessa enzima foi considerada propensa a ser tóxica demais para uso clínico. Este estudo mostra a segurança, a tolerabilidade, e a potencial atividade anticâncer de um inibidor de PP2A, LB-100, em pacientes com tumores sólidos refratários. A atividade da PP2A é alterada por mutação direta ou indireta em muitos tipos de câncer. A disponibilidade de um inibidor de PP2A clinicamente seguro abre uma nova e promissora seara para terapia contra câncer, a saber, a inibição farmacológica de PP2A em cânceres com anormalidades mutacionalmente adquiridas na função de PP2A e/ou na via de reparo de danos no DNA. Os resultados desse estudo dão ainda suporte ao desenvolvimento de LB-100 isoladamente e em combinação com outros agentes para o tratamento de cânceres.
[00358] Objetivo: Avaliar a segurança, a tolerabilidade, e a potencial atividade de LB-100, um inibidor de moléculas pequenas de primeira linha da proteína fosfatase 2A (PP2A), em pacientes adultos com tumores sólidos progressivos.
[00359] Desenho Experimental: LB-100 foi administrado por via intravenosa diariamente por 3 dias em ciclos de 21 dias em um desenho de escalonamento da dose 3+3. O principal objetivo era determinar a dose máxima tolerada e a dose recomendada na fase 2 (ClinicalTrials.gov: NCT01837667).
Materiais e Métodos [00360] Pacientes elegíveis tinham a idade de 18 anos ou mais com
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65/104 tumores sólidos progressivos comprovados que não obtiveram sucesso com os tratamentos tradicionais. Os pacientes precisavam ter uma expectativa de vida de pelo menos 12 semanas, um status de desempenho ECOG de 0 ou 1, e estarem aptos a dar consentimento informado. Antes da participação, os pacientes deviam ter a toxicidade de tratamentos anteriores recuperada para a linha basal ou menor que grau 1, ter medula óssea adequada (uma contagem absoluta de neutrófilos >1,5 x 109/L e contagem de plaquetas > 100 x 109/L); rim (creatinina sérica <1,2 mg/dL e se >1,2 mg/dL, depuração de creatinina [método de Cockcroft-Gault] >60mL/min/1,73 m2); e função hepática (bilirubina total plasmática <1,5mg/dL, alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST) <2,5x limite superior do normal). Eles não deviam ter qualquer outra doença sistêmica não controlada. Mulheres com potencial de engravidar precisavam ter um resultado negativo do teste de gravidez pelo sangue ou pela urina.
Desenha do estudo e tratamento [00361] Um estudo fase I de escalonamento da dose de rótulo aberto foi realizado para avaliar a segurança, a tolerabilidade, e a atividade do LB-100 administrado por 3 dias consecutivos a cada 3 semanas. Os estudos farmacocinéticos foram planejados na dose máxima tolerável (MTD). A dose inicial, 0,25mg/m2, 1/15° da mais alta dose não severamente tóxica em cachorros, e o plano de escalonamento da dose foram especificados pelo FDA. O estudo foi aprovado pela comissão de pesquisas em seres humanos em cada centro de estudo e foi registrado em clinicaltrials.gov: NCT01837667.
[00362] LB-100 foi apresentado como uma solução de uso único.
Inicialmente, o LB-100 foi administrado em 50 mL de solução salina durante 15 minutos. Devido a um aumento reversível não limitante na creatinina sérica no nível de 2,33 mg/m2, LB-100 foi subsequentemente administrado em 500 mL de solução salina normal durante 2 horas. O
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66/104 escalonamento da dose foi proibido em qualquer coorte. Os pacientes eram elegíveis para receber até 6 ciclos da terapia de estudo, a menos que toxicidade inaceitável, evolução da doença, ou enferm idade intercorrente exigisse a descontinuação. Mais de 6 ciclos eram permitidos na falta de evolução e toxicidade. Devido à toxicidade cardíaca e renal a doses altas nos estudos toxicológicos em animais, os pacientes contaram com extenso monitoramento incluindo ECG, MUGA ou ecocardiograma, troponinas cardíacas, e BNP antes de cada ciclo. A química sanguínea, a urinálise, o perfil hematológico e os sinais vitais eram monitorados antes e nos dias 1, 3, 8, 15, e 22 de cada ciclo. Os parâmetros laboratorias foram classificados pelo grau de severidade máximo NCI-CTCAE (Versão 4.0). Uma comissão de revisão da segurança avaliava todos os dados clínicos a cada 2 semanas e aprovava o escalonamento da dose entre as coortes.
Avaliação da toxicidade e da atividade clínica [00363] Doses de LB-100 foram escalonadas em grupos de três pacientes. O primeiro paciente usando um novo nível de dose era observado por três semanas antes de tratar os outros dois com aquela dose. Quando ocorria uma DLT potencial, três novos pacientes eram introduzidos naquela dose. Caso ocorresse uma outra DLT, três pacientes adicionais eram tratados com a dose não DLT anterior para determinar a segurança daquele nível para ensaios fase 2.
[00364] A resposta ao tratamento foi avaliada com a ajuda do RECIST versão 1.1. Todos os pacientes com doença mensurável, que completaram 2 ciclos de LB-100 e tiveram pelo menos 1 avaliação tumoral pós-linha basal, eram avaliáveis quanto à eficácia. Os pacientes que receberam qualquer LB-100 eram avaliáveis quanto à segurança. A severidade dos eventos adversos e das anormalidades laboratoriais está apresentada de acordo com o NCI-CTCAE versão 4.0 e codificada segundo o Medical Dictionary for Regulatory Activities.
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Desfechos [00365] O principal objetivo era determinar a segurança, a tolerabilidade, e a dose máxima tolerada de LB-100 dado por via intravenosa diariamente por três dias consecutivos a cada 3 semanas. Os objetivos secundários eram documentar qualquer evidência de atividade antitumoral em potencial e obter dados farmacocinéticos para o LB-100 e um metabolite, endothall, em pacientes recebendo LB-100 na MTD (Quang et al., 2016).
Resultados:
[00366] Ocorreram 29 admissões de pacientes durante 7 escalonamentos da dose. Um paciente interrompeu o tratamento depois de uma dose por causa de uma infecção aguda e foi readmitido depois de recuperado. As duas admissões foram analisadas como admissão de pacientes diferentes. Dois pacientes apresentam toxicidade limitante da dose (aumentos reversíveis na creatinina sérica ou depuração de creatinina sérica calculada) no nível de 3,1mg/m2. Eventos adversos Grau 3 relacionados com a provável ou possível fármaco de estudo ocorreram em 6 (20,7%) pacientes [anemia (n=2), depuração de creatinina reduzida, dispnéia, hiponatremia, linfopenia]. Dez (50%) dos 20 pacientes com resposta avaliável ficaram com a doença estável por 4 ou mais ciclos. Um paciente com carcinoma de pâncreas apresentou uma resposta parcial observada depois de 10 ciclos e que foi mantida por mais 5 ciclos. Os outros pacientes que atingiram uma doença estável tinham um dos seguintes tumores: fibrossarcoma, condrossarcoma, timoma, carcinoide atípico de pulmão, ou câncer de ovário, de testículo, de mama (n=2), e de próstata. A dose de LB-100 recomendada na fase 2 é de 2,33mg/m2 ao dia por 3 dias a cada 3 semanas.
Características dos pacientes [00367] Vinte e oito pacientes com tumores sólidos avançados foram
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68/104 admitidos em quatro locais clínicos. Suas características demográficas estão listadas na Tabela 1. Quatro pacientes não eram avaliáveis quanto à toxicidade. Três desses pacientes apresentavam complicações associadas à doença antes do término do ciclo 1. Um quarto paciente com carcinoide atípico do pulmão foi retirado do estudo depois de uma dose de LB-100 por causa de uma infecção aguda; ele foi readmitido no estudo 7 semanas mais tarde e ficou com a doença estável por 5 ciclos. As duas admissões foram incluídas nas análises. Nenhum desses eventos adversos foi considerado relacionado com a administração do fármaco.
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Tabefe 1: Caracísmta® étnicas basfes e demográfeas dss ^ciemas
Escalonamento da dose e toxicidade [00368] Vinte e quatro pacientes completaram pelo menos um ciclo de 3 dias LB-100. Os níveis de dose testados foram de 0,25, 0,50, 0,83, 1,25, 1,75, 2,33, e 3,1mg/m2. Não houve DLT durante os 6 primeiros níveis da dose. No nível de dose de 3,1 mg/m2, um paciente com câncer de próstata e um com condrossarcoma não tiveram DLT durante 4 e 9 ciclos de tratamento, respectivamente. Um terceiro paciente com câncer
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70/104 de ovário apresentou um aumento grau 3 na depuração de creatinina calculada depois do ciclo 1 com volta ao normal no dia 8 e recebeu mais 3 ciclos em uma dose reduzida de 2,33 mg/m2 antes da evolução do tumor. Um quarto paciente com fibrossarcoma apresentou um aumento grau 3 na depuração de creatinina calculada depois do primeiro ciclo. A creatinina voltou para o valor de antes do tratamento no dia 21 e um segundo ciclo a 2,33 mg/m2 resultou em um aumento grau 2 na depuração de creatinina sem outra toxicidade. A dose foi diminuída para 1,75 mg/m2 e foram administrados mais dez ciclos sem toxicidade até a evolução depois de 36 semanas. Como 2/4 pacientes a 3,1mg/m2 apresentaram aumentos grau 3 na depuração de creatinina durante o ciclo um, mais três pacientes foram avaliados no nível de dose precedente de 2,33 mg/m2. Eles não apresentaram toxicidade limitante estabelecendo assim a MTD naquele nível. Não houve toxicidade sintomática além de fadiga leve a moderada reversível. Os eventos adversos possivelmente relacionados com a administração do fármaco estão listados na Tabela 2.
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Termo preferido pefo í&edDRA [1J i2j | Í|Graiít-21 | Grau 3 | Gray: 4 | 4;4 Grau S |
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distensão abdcmisai | 5555555545OOO4555 | ri | 444^44444444; | 4444^444444 |
Mpertehslo aceleraste | '''''''''''''''lO^W''''''''' | eee^-eeeeeeeeeeeeeee. | •eeee^-eeeeeeeeeeee | eeeeeeeeeeeeeeeee. |
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fosfatese alcalina sanguínea aumentada | 2222í^A^22z | ;4;;^44444444;4;4 | 444^44444444: | 555555^;55555555; |
uréia s angoinea. aumentada | 3 £3--.454^ | ri | eeeeeeeeeeeeeeeeeee. | ri |
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Tabeía 2. Eventos adversos na popataçâo de segurança
Farmacocmética [00369] As concentrações plasmáticas de LB-100 e endothall foram medidas (Quang etaL, 2016) antes e durante 4 horas depois do término
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72/104 da infusão de 2 horas na MTD de 2,33 mg/m2 de LB-100 no dia 1 em um paciente e nos dias 1 e 3 em dois pacientes. As farmacocinéticas do LB-100 foram similares nos dias 1 e 3 e foram caracterizadas por uma baixa depuração, baixo volume de distribuição, e meia-vida curta. As concentrações plasmáticas de endothall foram baixas durante toda a infusão, ficando abaixo do limite inferior de detecção (5 ng/mL) em um paciente. Nos outros dois pacientes, a concentração máxima de endothall (34,7 ng/mL) foi observada no último instante de amostragem (4 h), o que impediu a determinação de sua meia-vida de eliminação (Tabela 3).
LB-Ιβδ
3R:pc· de | tlia nominaí | Ífiílívidíios | sexo | Dwe (mg-rlE} | CL3 aparente (agsh fal,) | V»* aparente (agsh/mL) | Tra (h) |
1 | 1 | 901-0930 | iT.asCTiifio | 2.33 | 0.52 | 1.10 | |
1 | 3 | 902-0928 | femsnfcs | 2.33 2.33 | 5_7 | 13 0 0.65 | 0.95 135 |
3 | 2.33 | 2.3 | 0.4-7 | 1.56 | |||
1 | 1 | 903-0029 | f&SátHtW | 2.33 | 4.7 | 1.06 | 1.5 S |
3 valer is Separação e4 c vcíoms ds áisfriótsção no es&So Estadanáris representa uma aproximação estreitei porçue a petfii Se· csncsritraçâü pfesmàSca-teíYs&o fai csrad.erizado par4 fiaras Sepsis So término ca íníusão.
Endothal:
çkis» cie | Sia | itieáídLícs | Dose | Cmax | Trnax | AUC | ||
ímMduos | tí3mÍB3Í | (sg.-’ml} | Ά | (ug^h/mL ) NDC | ||||
1 | 1 | 001-9030 | mascaSnc | 2.33 | nds | ND! | ND* | |
3 | x. Jb | NDS | NDS | NDS | ND£ | |||
3 | 1 | <302-0028 | 2.33 | 115 | 4 | ND* | ||
3 | 34.3 | 4 | 143 | |||||
1 | 1 | 003-0020 | íerrâranc | 2.33 | 14.8 | 4 | ND* | 28 |
3 as concentrações plasmáticas Se eriSoteâ «caiam aáatm do IMI» interior d» çMaoSficaçâs (5 agánl) 4 me: asc'iSa Se s iiawaçãs te-ratífiai e c os vaiaras de AUC nãe puderam ser CeSniSos.
Tabela 3. Parâmetros farmacocinéticos para LB-100 e endoítaü
Avaliação da atividade clínica [00370] Dos 20 pacientes com doença mensurável, um paciente com câncer de pâncreas apresentou uma resposta parcial, observada depois de 10 ciclos e que durou por mais 5 ciclos, e 16 pacientes não apresentaram evolução de suas lesões indicadoras. Eles foram retirados do estudo seja devido ao aparecimento de uma nova lesão ou
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73/104 sintomas que se acreditava representarem evolução clínica. Somente 3 pacientes, um com adenocarcinoma de duodeno e dois com adenocarcinomas de cólon, apresentaram aumentos significativos no tamanho de suas lesões indicadoras pelos critérios RESIST (Figura 1). [00371] A obtenção de resposta parcial ou estabilidade da doença não foi nitidamente dose-dependente, ocorrendo a 0,83 mg/m2 em câncer de pâncreas (15 ciclos) e carcinoida atípico do pulmão (5 ciclos); a 1,25 mg/m2 em câncer de mama (4 ciclos) e câncer de testículo (5 ciclos); e a 1,75 mg/m2 em timoma maligno (8 ciclos) e câncer de ovário (6 ciclos). A 3,1 mg/m2, um paciente com condrossarcoma ficou estável por 8 ciclos de LB-100 sem qualquer alteração na função renal normal enquanto que um paciente com fibrossarcoma que começou a 3,1 mg/m2 ficou estável por 12 ciclos depois de duas reduções da dose (Figura 2).
[00372] Conclusões: A segurança, a tolerabilidade, e as evidências preliminares de atividade antitumoral, e o novo mecanismo de ação do LB-100, suportam seu desenvolvimento continuado isoladamente e em combinação com outras terapias.
DISCUSSÃO (Exemplo 6) [00373] A MTD de LB-100, um potente inibidor de PP2A, foi determinada em pacientes com tumores sólidos. A dose inicial recomendada na fase 2 é de 2,33 mg/m2 ao dia por 3 dias a cada 3 semanas com escalonamento para 3,1 mg/m2 na ausência de toxicidade renal e descalonamento para 1,75 mg/m2 ou menos com a pre3sença de toxicidade renal no caso de doença estável ou em regressão. Como os pacientes apresentaram estabilidade da doença e um paciente com regressão objetiva de câncer de pâncreas em doses tão baixas quanto 0,83 mg/m2 ao dia por 3 dias a cada 3 semanas, é possível que a atividade anticâncer ótima em seres humanos possa ser considerada menor que a MTD.
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74/104 [00374] Dez (50%) dos 20 pacientes que receberam pelo menos 2 ciclos de LB-100 ficaram com a doença estável por até 15 ciclos de terapia sem toxicidade limitante ou cumulativa. O mecanismo subjacente a este fenômina não está claro. A atividade de PP2A é prejudicada ou melhorada em muitos tipos de câncer por mutação ou por expressão aumentada de um ou mais de vários inibidores de PP2A endógeno (Chang etal., 2015; Perotti etal., 2013; Seshacharyulu etal·, 2013; Sangodkar et al·, 2016). Visto que o único paciente com câncer de pâncreas no presente estudo apresentou uma resposta objetiva e sob outros aspectos uma doença estável por mais de 11 meses, é especificamente interessante o fato de que superexpressão acentuada de uma subunidade reguladora de PP2A associada à hiperatividade do PP2A na maioria dos cânceres de pâncreas humanos tenha sido reportada recentemente (Hein et al·, 2016). Nocaute desta subunidade, PR55a, em uma linhagem celular pancreática humana implatada ortotopicamente em camundongos nus, reduziu significativamente sua tumorigenicidade e potência metastática (Hein et al·, 2016).
[00375] Por outro lado, sem desejarmos nos ater a uma teoria específica, as deficiências adquiridas a atividade do PP2A podem deixar os tumores seletivamente vulneráveis a uma inibição farmacológica adicionalo do PP2A. Por exemplo, na síndrome mielodisplásica (MDS) del(5q), um alelo para a subunidade catalítica do PP2A é deletado (Sallman et al., 2014). Foi reportado que a Lenalidomida, o agente tradicional para o tratamento de MDS, era seletivamente citotóxica para essas células de del(5q)MDS haplo-insuficientes em PP2A em função de sua moderada atividade inibitória de PP2A (Sallman et al., 2014). A inibição de PP2A também resulta em letalidade sintética das células cancerosas que superexpressam Mad2 (proteína de deficiência de paralisação mitótica 2) que ocorrem em sintonia com mutações nas vias de Rb e/ou p53 (Bian etal., 2014; Schvartman etal., 2011). No presente
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75/104 estudo, o câncer de pâncreas do paciente com uma resposta parcial superexpressou acentuamente Mad2.
[00376] Um outro mecanismo potencial pelo qual o agente único LB100 pode inibir a evolução do câncer é melhorando a função das células T. Sem desejarmos nos ater a uma teoria específica, a atividade fosfatase de PP2A é importante para a ativação de células T mediada por CTLA-4 (Teft et aí, 2009) e essencial para a função das células T reguladoras (Apostolidis et aí, 2016). Além disso, a inibição de Ppp2r2d, uma subunidade reguladora de PP2A, aumenta a proliferação de células Tea produção de citocinas por um mecanismo diferente daqueles dos reguladores negativos conhecidos da função de células T (Zhou et aí, 2014). No presente estudo, no entanto, nenhum paciente experimentou toxicidades sugestivas de atividade autoimune que ocorre com os compostos atualmente aprovados que induzem o bloqueio de pontos de verificação imunológicos.
[00377] A disponibilidade de um inibidor clinicamente seguro de PP2A oferece uma oportunidade de explorar um alvo terapêutico há muito apreciado, porém negligenciado, para terapia contra câncer. O ensaio atual sugere que LB-100 isoladamente tem atividade anticâncer. É provável, no entanto, que a inibição farmacológica do PP2A seja mais eficaz para terapia contra câncer quando combinada com fármacos citotóxicos, particularmente para tumores com anormalidades adquiridas na função de PP2A e/ou na via de reparo de danos no DNA (Zhuang et aí, 2009; Hong et aí, 2015) e/ou com outros tipos de inibidores de pontos de verificação imunológicos.
Exemplo 7. Administração de LB-100 em uma combinação [00378] Uma quantidade do composto LB-100 em combinação com uma terapia anticâncer é administrada a um indivíduo que sofre de câncer. A quantidade do composto e terapia anticâncer é eficaz para tratar o indivíduo.
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76/104 [00379] Uma quantidade do composto LB-100 em combinação com uma terapia anticâncer é administrada a um indivíduo que sofre de câncer. A quantidade do composto é eficaz para aumentar a atividade anticâncer em relação à terapia anticâncer isoladamente.
Exemplo 8. PP2A e PD-1 [00380] A inibição farmacológica de PP2A podería melhorar a ativação imunológica e a imunoterapia contra câncer. A inibição de PP2A deve melhorar a imunoterapia contra câncer aumentando diretamente a proliferação de células T CD4 e CD8 convencionais através do enfraquecimento da função imunossupressora das Tregs. Foi levantada a hipótese de que o LB-100 podería aumentar o efeito do bloqueio de pontos de verificação imunológicos. Este é o primeiro estudo que demonstra, em um modelo pré-clínico, que a inibição farmacológica do PP2A poderia sinergizar com imunoterapia.
[00381] O efeito do LB-100 em células T foi avaliado em reações de linfócitos mistos alogênicos humanos, nas quais células T CD8+ ou CD4+ T foram cocultivadas com células dendríticas derivadas de monócitos autólogos. Foi observado um aumento dependente da dose na proliferação de células T em células CD8+ e CD4+ (Figs. 4A-B e 5AB) e um aumento na secreção de IFNy nas células T CD4+ (Figs. 3AB). Foi observado que um aumento dependente da dose melhora a expressão de 0X40 da molécula coestimuladora em células T (Figs. 6AB) e que o fator de transcrição Tbet induz a produção de IFNy nas células T CD4+ (Figs 7A~B). O efeito de LB-100 mais o anticorpo antiPD-1 foi investigado em células T CD4+ no mesmo ensaio. A combinação melhorou a proliferação (Figs. 8A-B, 9A-D), a expressão de 0X40 (Figs. 10A-B), a expressão de Tbet (Figs. 11A-B), e a produção de IFNy em comparação com o anti-PD-1 isoladamente (Figura 15).
Exemplo 9. Inibição de LB-100 e bloqueios de PD-1 provocam a rejeição duradoura de tumores mediadas por células T CD8*
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77/104 [00382] Para testar a hipótese de que a inibição de PP2A com LB100 podería melhorar as respostas antitumorais imunomediadas, camundongos receberam um implante de células tumorais CT26. CT26 é um adenocarcinoma de cólon murino expressando um baixo nível de PD-L1 e é resistente à terapia anti-PD1. Depois de cerca de 13 dias, os camundongos com tamanho tumoral entre 30-100 mm3 foram randomizados em quatro grupos de tratamento (controle com PBS, LB100 isoladamente - 0,16 mg/kg, anti-PD-1 isoladamente -10 mg/kg, ou uma combinação de ambos). O tratamento foi dado a cada 2 dias por um total de 28 dias. O tamanho tumoral foi avaliado a cada dois dias (Figs. 20A-C). O tratamento com único agente com anti-PD1 foi ineficaz em reduzir a carga tumoral ou aumentar a sobrevida. LB-100 isoladamente foi capaz de aumentar a sobrevida média de 21 para 33 dias (p=0,02). O tratamento combinado diminuiu significativamente o volume tumoral médio em 70% em comparação com o controle (p<0,01) no dia 14 depois do tratamento. A sobrevida média também aumentou de 21 para 72 dias (p<0,01). Mais surpreendemente, 50% dos camundongos atingiram a regressão completa (CR) dos tumores sem evidências da doença. Esta resposta foi duradoura depois do término do tratamento.
[00383] Em seguida foi examinado se os camundongos que atingiram CR pela terapia combinada desenvolveram memória imunológica de longo prazo. Cerca de 60 dias depois da inoculação inicial, os camundongos curados foram reinoculados com as mesmas células CT26 (Figs. 21A-B). Nenhum dos camundongos (n=8) desenvolveu tumor com o novo desafio. Camundongos naíves para CT26 foram inoculados ao mesmo tempo para servir de controle. Este resultado indica que os camundongos curados pela terapia combinada conseguiram estabelecer memória de longo prazo para o antígeno específico para tumor.
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78/104 [00384] Foi então explorado se o efeito sinergístico de LB-100 com anti-PD-1 que resultou na regressão do tumor é mediado por células T CD8. Camundongos portadores de tumores CT26 foram submetidos à ablação de CD8 usando anticorpos de depleção antes do início do tratamento. A ablação de células T CD8+ foi confirmada por FACS de esplenócitos 3 dias depois do tratamento. Com o CD8 depletado, a terapia combinada fracassou em produzir resposta antitumoral. 0% dos camundongos com CD8+ depletado recebendo a combinação atingiram a CR comparados aos 72% no grupo sem depleção de CD8+ (Figs. 22AC). Juntos, estes resultados demonstraram que o efeito do LB-100 é mediado pelo sistema imunológico e não é um efeito citotóxico direto no tumor.
Métodos [00385] Reagentes - LB-100 foi fornecido pela Lixte Biotechnology. O anticorpo anti-PD-1 de camundongo, Clone RMP1-14, foi adquirido na BioXcell. Os anticorpos monoclonais (mAbs) a seguir foram usados para citometria de fluxo: CD4-BV421 anticamundongo de rato, CD3-PE anticamundongo de rato, CD8a-Alexa 647 anticamundongo de rato, CD45-BV785 anticamundongo de rato, IFNg-FITC anticamundongo de rato, FOXP3-Alexa 647 anticamundongo de rato. Estes anticorpos foram adquiridos na Biolegend.
[00386] Linhagens celulares e camundongos - A linhagem de3 carcinoma de cólon CT26.CL25 foi obtida no ATCC. Células tumorais foram cultivadas em meio completo (RPM11640; Cellgro) contendo 10% (vol/vol) de FBS (Thermofisher), 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina (Gibco). Camundongos BALB/c fêmeas de seis a 8 semanas de idade foram adquiridos no Charles River. Os camundongos foram alojados nas Instalações para Animais de Laboratório do National Institutes of Health (Bethesda, MD). Todos os experimentos foram aprovados pelo National Institutes of Health Office of Animal Care and
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Use e conhduzidos de acordo com as diretrizes do National Institutes of
Health.
[00387] Inoculação de tumor e estudos com animais - Células tumorais CT26 (0,5 * 106) foram injetadas por via subcutânea no lado direito do abdome. LB-100 e anti-PD-1 foram injetados por via i.p. a uma dose de 0,16 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente, começando no dia 11 depois do implante do tumor e continuando a cada 2 dias por 28 dias. O tamanho tumoral foi monitorado com um paquímetro digital a cada 23 dias e expresso como volume (comprimento * Iargura2 x 0,5). Os animais cujos tumores ficaram ulcerados/necróticos ou com uma carga tumoral superior a 2.000 mm3 ou com o maior diâmetro superior a 2 cm foram eutanaziados.
[00388] Depleção de células T CD8. mAbs anticD8 (clone 53.6.7) (BioXcell) foram injetados 2 dias e 1 dia antes da terapia, no dia da terapia e 5 e 8 dias depois do início da terapia. A dose foi de 0,1 mg por injeção.
[00389] Estudos de novo desafio com tumor. Camundongos BALB/c naives e camundongos previamente curados com tratamento combinado como descrito acima foram inoculados com células CT26 no flanco torácico esquerdo (não previamente inoculado). Os tumores foram medidos duas vezes por semana como descrito acima. Os animais cujos tumores ficaram ulcerados/necróticos ou com uma carga tumoral superior a 2.000 mm3 ou com o maior diâmetro superior a 2 cm foram eutanaziados.
Exemplo 10. Bloqueios de LB-100 e de PD-1 regulam os Imfócítos infiltrantes de tumor (TIL) [00390] O efeito do tratamento foi avaliado em linfócitos infiltrantes de tumor (Figs. 23A-B). Camundongos portadores do tumor CT26 foram tratados com LB-100 e/ou com anticorpos anti-PD~1 como descrito acima. Depois de 12 dias de tratamento, os tumores foram analisados
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80/104 por FACS. As células T CD8+ infiltrantes de tumor provenientes dos camundongos tratados com a combinação LB-100 e anticorpo anti-PD1 apresentaram um aumento significativo em células T IFNg+CD8+ em comparação com as células provenientes dos animais de controle e dos animais tratados com anti-PD-1 isoladamente (25,3% comparados a 11,0% e 10,5% respectivamente, p=0,05). Como o IFNy é a citocina mais crítica que medeia a resposta antitumoral, este resultado é uma confirmação funcional de que os camundongos tratados com a combinação têm imunidade melhorada contra os tumores implantados. Além disso, dada a conhecida importância de PP2A em Treg, foi examinado o efeito do tratamento com LB-100 e/ou anti-PD-1 na quantidade de Tregs presentes no tumor. LB-100 isoladamente depletou significativamente as Tregs no ambiente tumoral (2,1% comparados a 14,7% no controle). Este efeito é semelhante em grau ao efeito na depleção de Tregs pelo anti-PD-1 ou pela combinação. O fato de que o LB-100 isoladamente pode depletar Tregs sugere um possível mecanismo explicando o pequeno, porém significativo, benefício de sobrevida no grupo tratado com LB-100 isoladamente.
[00391] Além disso, os camundongos que atingiram a CR foram resistentes ao crescimento tumoral quando reinoculados com células CT26. Os camundongos submetidos à ablação de células T CD8+ usando anticorpos de depleção foram incapazes de rejeitar tumores CT26 - 0/8 (0%) apesar do tratamento com a terapia combinada, indicando que o efeito antitumoral do LB-100 com tratamento anti-PD-1 é mediado por células T CD8+. Concluindo, em um modelo animal singênico, o inibidor de PP2A, LB-100, tem potencial sinergístico em conjunto com o bloqueio de pontos de verificação suportando a investigação de sua capacidade de melhorar a imunoterapia na clínica. [00392] Em suma, foi demonstrado neste modelo pré-clínico que o LB-100 quando combinado com anti-PD-1 tem um efeito robusto e
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81/104 sinergístico que resulta na regressão completa de uma porção significativa dos camundongos tratados. Este efeito é mediado pela imunidade adaptativa através de células T CD8+. Ocorre também o estabelecimento de memória imunológica associada à regressão do tumor. Este é o primeiro relato de uso da inibição farmacológica de PP2A como um alvo para melhorar a imunoterapia.
[00393] Os tumores frequentemente desenvolvem múltiplos mecanismos para escapar do sistema imunológico, um deles sendo a expressão de PD-1 de células T, que efetivamente inibe as células T de atacarem o tumor. O anti-PD-1 anula este sinal inibitório, permitindo assim que as células T reconheçam e erradiquem o tumor. Foi constatado que LB-100, um inibidor da proteína fosfatase 2A (PP2A), tem um efeito antitumoral drástico em um modelo pré-clínico de câncer de cólon. Foi constatado que este efeito é mediado pelo melhoramento do sistema imunológico.
Exemplo 11. Administração de LB-100 em combinação com um inibidor de pontos de verificação de PD-1 e/ou PD-L1 [00394] Uma quantidade do composto LB-100 em combinação com um inibidor de pontos de verificação de PD-1 e/ou PD-L1 é administrada a um indivíduo que sofre de câncer. A quantidade do composto e inibidor é eficaz para tratar o indivíduo.
[00395] Uma quantidade do composto LB-100 em combinação com um inibidor de pontos de verificação de PD-1 e/ou PD-L1 é administrada a um indivíduo que sofre de câncer. A quantidade do composto é eficaz para aumentar a atividade anticâncer do inibidor de pontos de verificação de PD-1 e/ou PD-L1.
[00396] Uma quantidade do composto LB-100 em combinação com um inibidor de pontos de verificação de PD-1 e/ou PD-L1 é administrado a um indivíduo que sofre de melanoma. A quantidade do composto e inibidor é eficaz para tratar o indivíduo.
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82/104 [00397] Uma quantidade do composto LB-100 em combinação com um inibidor de pontos de verificação de PD-1 e/ou PD-L1 é administrado a um indivíduo que sofre de melanoma. A quantidade do composto é eficaz para aumentar a atividade anticâncer do inibidor de pontos de verificação de PD-1 e/ou PD-L1.
Exemplo 12: Avaliação da eficácia de LB-100 como terapia complementar ao Atezolizumab, Nivolumab ou Pembrolizumab.
[00398] A terapia complementar proporciona um efeito sinergístico, e possibilita o uso de doses mais baixas com efeitos colaterais reduzidos. [00399] A administração periódica de LB-100 como uma terapia complementar para um paciente humano que sofre de melanoma e que já está recebendo Atezolizumab, Nivolumab ou Pembrolizumab oferece uma vantagem clinicamente significativa e é mais eficaz (proporciona pelo menos um efeito aditivo ou mais de um efeito aditivo) no tratamento do paciente do que quando Atezolizumab, Nivolumab ou Pembrolizumab é administrado isoladamente (na mesma dose).
[00400] A administração periódica de Atezolizumab, Nivolumab ou Pembrolizumab como uma terapia complementar para um paciente humano que sofre de melanoma e que já está recebendo LB-100 oferece uma vantagem clinicamente significativa e é mais eficaz (proporciona pelo menos um efeito aditivo ou mais de um efeito aditivo) no tratamento do paciente do que quando LB-100 é administrado isoladamente (na mesma dose).
[00401] As terapias complementares também proporcionam eficácia (proporciona pelo menos um efeito aditivo ou mais de um efeito aditivo) no tratamento do paciente sem efeitos colaterais adversos indevidos ou sem afetar a segurança do paciente. Comparada a quando cada agente é administrado isoladamente:
1. A terapia complementar é mais eficaz (proporciona um efeito aditivo ou mais de um efeito aditivo) em aumentar a quantidade de
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83/104 células T citotóxicas em pacientes com melanoma;
2. A terapia complementar é mais eficaz (proporciona um efeito aditivo ou mais de um efeito aditivo) em retardar a evolução de melanoma em pacientes com melanoma; e/ou
3. A terapia complementar é mais eficaz (proporciona um efeito aditivo ou mais de um efeito aditivo) em reduzir a função de PD-1 e/ou PD-L1 nos pacientes com melanoma.
Exemplo 13: Inibição farmacológica da proteína fosfatase-2A com LB-100 atinge atividade antitumoral imunomediada duradoura quando combinada com bloqueio de PD-1 [00402] O presente exemplo demonstra, inter alia, que um inibidor de PP2A de moléculas pequenas, LB-100, quando combinado com bloqueio de anti-PD1 (aPD-1) provoca sinergisticamente uma resposta antitumoral imunomediada duraroura no modelo de câncer de cólon CT26. Este efeito foi dependente das células T, levando a uma regressão surpreendente de uma proporção significa de tumores. Análise dos linfócitos tumorais demonstrou infiltração melhorada das células T efetoras e depleção de células T reguladoras supressoras resultando em um aumento acentuado nas razões de células T efetoras para células T reguladoras. A depuração do tumor estabeleceu imunidade protetora secundária antígeno-específica. Um efeito sinergístico de LB-100 e bloqueio de aPD-1 também foi observado no modelo de melanoma B16. Além disso, descrita neste pedido está a descoberta de que o LB-100 ativou especificamente a via de sinalização de mTORCI resultando na diferenciação reduzido de células CD4 naíves nas células T reguladoras. Também foi encontrada uma expressão aumentada de citocinas Th1 e uma expressão reduzida de citocinas Th2. Estes dados destacam o potencial translacional da inibição de PP2A em combinação com a inibição de pontos de verificação.
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84/104 [00403] Tratamento combinado com LB-100 e aPD-1 provoca sinergisticamente a rejeição de tumores CT26: Para testar a hipótese de que a inibição de PP2A sinergiza com a terapia com aPD-1 in vivo em tumores refratários ao aPD-1, foi usado um tumor CT26, que é um carcinoma colorretal murino com alta expressão de PD-L1, mas com resposta limitada à terapia com aPD-1. Os camundongos foram inoculados com células tumorais CT26 (0,25 x 106). Depois de 10-13 dias, os camundongos com tumores atingindo 50-100 mm3 de tamanho foram randomizados em quatro grupos de tratamento: controle (PBS), aPD-1, LB-100 e a combinação de aPD-1 e LB-100. Os tratamentos foram administrados a cada 2 dias por 30 dias. O crescimento tumoral foi avaliado a cada 2 dias (Fig. 24A). Neste modelo, LB-100 isoladamente não reduziu significativamente o crescimento tumoral, mas estendeu a sobrevida média (33 vs 21 dias, p - 0,02). Adicionalmente, aPD1 isoladamente não teve qualquer efeito no crescimento tumoral ou na sobrevida. A combinação de LB-100 e aPD1, no entanto, resultou na surpreende regressão de uma porção significativa de tumores, com 50% atingindo a regressão completa (CR) durante todo o período do estudo. Houve uma diferença significativa no tamanho tumoral no dia 8 após o tratamento (p<0,05) e um aumento significativo na sobrevida (p<0,005) entre os braços de tratamento com a combinação e o controle (Fig. 24B).
[00404] O efeito da combinação de LBWOe aPD-1 é dependente das células T CD8: Em seguida foi examinado se o efeito sinergístico da combinação de LB-100 e aPD-1 resultando na regressão duradoura do tumor era um processo imunomediado. Camundongos portadores de tumor CT26 foram submetidos à ablação de células T CD8+ usando anticorpos de depleção antes e durante o tratamento com LB-100 e aPD-1 (Fig. 24C). A depleção de CD8+ periféricas foi confirmada por FACS 5 dias depois do tratamento (dados não mostrados). Quando
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85/104 depletados de células T CD8+, a combinação de LB-100 e aPD-1 não provocou rejeição do tumor (0 vs 72%, p-0,0015) (Fig. 24D). O volume tumoral médio foi aumentado 13 vezes 10 dias depois do tratamento no grupo tratado com a combinação com depleção de CD8 comparado ao volume tumoral no grupo sem depleção (612 vs 46 mm3, p < 0,001). A sobrevida também foi significativamente reduzida com a depleção de CD8 (p<0,0001). A depleção de células T CD8 isoladamente teve um pequeno efeito nocivo comparado ao controle tanto no crescimento tumoral quanto na sobrevida, sugerindo que um nível basal de imunidade mediada por células T CD8+ serviu para limitar o crescimento de CT26 em condições basais. Estes dados indicam que o LB-100 com sinergia de aPD-1 é dependente da imunidade adaptativa mediada por células T CD8+ e não um efeito direto da inibição de PP2A do crescimento tumoral.
[00405] Camundongos curados pela terapia combinada desenvolvem memória antigeno-específica de longo prazo: O marco de uma resposta imunológica adaptativa bem-sucedida é o estabelecimento de memória imunológica. O experimento a seguir testou camundongos que experimentaram uma resposta completa (CR) para sua resposta antitumoral protetora secundária. Os camundongos foram novamente desafiados com células CT26 cerca de 60 dias depois do implante do tumor inicial (Fig. 25A). Estes camundongos foram totalmente resistentes ao novo desafio com células CT26 (Fig. 25B). O tamanho tumoral médio no dia 18 após o (re)implante foi era de 480 mm3 nos camundongos naive comparados com 0 mm3 nos camundongos CR (p<0,0001) (Fig. 25C).
[00406] Em seguida, foi testado se a resposta imunológica secundária protetora era específica para tumores CT26. Depois de cerca de 60 dias a contar do implante inicial, os camundongos CR foram novamente desafiados tanto com células CT26 no flanco quanto com
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86/104 células 4T1, uma linhagem celular câncer de mama murino não relacionada, no coxim adiposo do mamilo (Fig. 25D). Os camundongos com CR foram resistentes às células CT26, mas não às células 4T1. Dezoito dias depois da inoculação, não havia diferença no volume do tumor 4T1 entre os camundongos naive e CR, ao passo que CT26 não conseguir crescer nos camundongos CR (Fig. 25E-F). Este resultado indica que a resposta de memória secundária é específica para antígenos expressos em CT26.
[00407] Ativação melhorada de linfócitos com tratamento combinado: Para abordar o mecanismo celular que medeia a rejeição do tumor pela combinação LB-100/aPD-1, foi examinada a situação do sistema imunológico nos órgãos linfoides secundários e no tumor. Os camundongos foram implantados com tumores CT26 e tratados com LB-100 e/ou aPD-1 como descrito acima. No dia 3, depois de dois tratamentos, os baços, os nódulos linfáticos drenantes de tumor (dLN) e os tumores foram recolhidos e analisados por citometria de fluxo (Fig. 26-27). No tecido linfoide secundário, foi observada uma ativação maior de células T CD8+ nos camundongos tratados com o regime de combinação em relação aos controles, segundo indicado pela frequência maior de células T CD44+CD62L-CD8+ (Fig. 26A-C). No baço, o tratamento com LB-100 isoladamente resultou em um pequeno aumento nas células T CD44+CD62L-CD8+ (de 13,0 para 16,6%, p<0,05), mas o tratamento combinado resultado em um aumento maior do que o LB-100 ou aPD1 isoladamente (20,8 comparados com 16,6 e 15,5% respectivamente, p<0,05 e p<0,005) (Fig. 26B). Similarmente, as células T CD44+CD62L-CD8+ foram aumentadas no dLN de camundongos tratados com a combinação em comparação com o controle (de 7,4 para 17,9%, p<0,05) (Fig. 26C). Não houve diferença na frequência do subgrupo CD44+CD62L- nas células T CD4+ tanto no baço quanto no dLN (Fig. 28A e 29A). Marcadores de pontos de
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87/104 verificação imunológicos, incluindo a expressão de PD-1, CTLA4, TIM3 e 0x40 em células T CD8+ e CD4+ foram examinados nos nódulos linfáticos drenantes de tumor e no baço (Fig. 28 e 29). Não houve diferença na expressão desses marcadores exceto por um pequeno, porém significativo, aumento na expressão de PD-1 nas células T CD4+ tratadas com aPD~1 no dLN; no entanto, LB-100 isoladamente ou em combinação não alterou mais a expressão de PD-1 (Fig. 29A).
[00408] Em seguida foi feita uma análise abrangente dos linfócitos infiltrantes de tumor (Fig. 26-27, 30). Primeiro, foi examinada a percentagem absoluta de células CD45+. Não houve diferença significativa entre os grupos de tratamento. No entanto, na população de CD45+, houve um aumento significativo nas células T CD3+ no tratamento combinado em comparação com o controle (de 33,3 para 49,9%, p<0,05) (Fig. 26E). O que é mais importante, este aumento na população de células T CD3+ foi atribuído a um aumento significativo das células T CD8+ (Fig. 26D), seja normalizado para as células CD45+ (de 25,9 para 45,3%, p < 0,01) (Fig. 26F) ou para o número de células residentes do tumor (de 8 para 19%, p<0,05) (Fig. 31 A). Uma tendência similar foi observada nas células T CD8+ normalizadas para o peso do tumor (Fig. 31B). Ao contrário, a população de células T CD4+ permaneceu inalterada (Fig. 26G, 31), resultando em um aumento acentuado na relação CD8/CD4 (de 3,6 para 9,0, p<0,001) (Fig. 27H). Isto indicou que a combinação LB-100/aPD-1 resultou em trânsito aumentado das células T CD8+ para o tumor, que foi consistentemente mostrado ser o mais importante preditor da resposta à imunoterapia. Foi ainda examinada a subpopulação de TILs CD8+ através da marcação do marcador de fenótipo efetor CD44+. Houve um aumento significativo nas células T CD8+CD44+ nos camundongos tratados com a combinação em relação ao controle (de 9,8 para 17,1%, p < 0,01) (Fig. 26I). Também foi observada uma proliferação aumentada de TILs
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CD8+, segundo medida pela expressão da proteína associada ao ciclo celular Ki67 (de 12,3 para 22,5%, p<0,05) (Fig. 26J). Em seguida, foi examinada a expressão de um arranjo de marcadores de pontos de verificação imunológicos nos TILs, incluindo PD-1, TIM3, 0x40, CTLA4, e LAG3. O tratamento com aPD-1 resultou em uma esperada redução na expressão de PD-1, mas o LB-100 isoladamente ou adicionalmente ao aPD-1 não alterou mais a expressão de PD-1 tanto nos TILsS CD4+ como nos TILsS CD8+ (Fig. 26K-L). A expressão de TIM3, 0x40, CTLA4 e LAG3 não foi significativamente alterada nos TILs CD4+ ou CD8+ com tratamento isolado ou combinado (Fig. 32), sugerindo que existe potencial na combinação de LB-100 com terápicos vetorizados contra esses marcadores de pontos de verificação.
[00409] Visto que o estudo anterior demonstrando que ο PP2A desempenha um papel essencial na Treg supressora, foi então examinado se a adição de LB-100 podería resultar na depleção de Treg, similar à terapia anticTLA4. Sabe-se que aPD-1 age no nível do tumor e com capacidade limitada para depletar as Tregs. Entretanto, com a adição de LB-100, o tratamento combinado aumentou significativamente a percentagem de células Treg CD4+FoxP3+ entre os TILs (de 10,3 para 4,9% de células T CD3+, p<0,05) (Fig. 27A-B). A concomitante redução em Treg e aumento nas células T CD8+ resultou em um drástico aumento na razão de CD8+ para Treg em 3,5 vezes entre os TILs (de 7,5 para 26,4, p<0,05) (Fig. 27C). Subsequentemente, foi avaliada a consequência funcional da combinação LB-100/aPD-1 nos TILs. A expressão intracelular de IFN-yem resposta à estimulação in vitro com PMA/ionomicina foi analisada. O tratamento combinado aumentou significativamente a produção de IFN-γ pelos TILs CD8+ em relação ao controle (de 16,6 para 31,5% de CD45+, p<0,05) (Fig. 27DE). Além disso, a frequência de TILs CD8+ produtores de fator alfa de necrose tumoral (TNF-α) (Fig. 27F, 33A) e produtores duals de IFN
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89/104 γ/TNF-a (Fig. 27G, 33B) foi significativamente aumentada com o tratamento combinado. A capacidade citolítica dos TILs CD8+ também foi determinada pela expressão de Granzima B (GzmB), que também foi significativamente aumentada com o tratamento com LB-100/a-PD1 (Fig. 27H, 33C). Nas células T CD4+ foi observado um aumento pequeno, porém estatisticamente significativo na produção de IFN-y(de 6,1 para 10,8% de células CD4+, p<0,05) (Fig. 27I). Isto sugere que embora não haja um aumento global na infiltração de CD4+ com a combinação LB-100/a-PDI, as células T CD4+ efetoras presentes no tumor eram, contudo, mais ativas funcionalmente com a produção aumentada de IFN-γ.
[00410] Juntos, a combinação de LB-100 com bloqueio de aPD-1 resultou em uma alteração significativa na composição dos TILs (Fig. 27J). Embora a população geral de CD45+ permanecesse relativamente estável, houve um aumento acentuado na infiltração de células T CD3+, induzido por uma preponderância de células T CD8+. Ao mesmo tempo, a população de Treg foi concomitantemente depletada resultando em um drástico aumento na razão de CD8/Treg. Além disso, as células T CD8+ foram mais proliferativas e funcionalmente ativas conforme indicado pelas expressões de citocinas. Estas descobertas são consistentes com a observação de que a combinação LB-100/a-PD1 poderia provocar uma rejeição duradoura ao tumor em CT26 de forma imunodependente.
[00411] LB-100 e aPD-1 aumentam a atividade antitu moral em melanoma B16 sem evidência histológica de autoimunidade: Em seguida foi determinado se a combinação LB-100/aPD-1 era eficaz contra outro tumor resistente ao aPD-1. Em um modelo de prevenção de tumor, camundongos C57BL/6 de 6-8 semanas de idade foram randomizados em quatro grupos de tratamento: PBS, LB-100, aPD-1 e combinação. Células B16F10 (2,5x105) foram inoculadas 2 dias depois
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90/104 do início do tratamento por via subcutânea no flanco torácico direito. Os tratamentos foram administrados a cada dois dias subsequente à sobrevida (Fig. 34A). No dia 15 depois do implante do tumor, não havia diferença entre o controle e os braços de agente único. No entanto, o tamanho tumoral foi significativamente menor no grupo tratado com a combinação em relação ao controle (de 305,9 para 109,0 mm3, p<0,05) (Fig. 34B-C) e a sobrevida foi prolongada pelo tratamento com a combinação (p<0,05) (Fig. 34D).
[00412] É importante notar que nenhum dos camundongos no grupo tratado com a combinação apresentou sinais clínicos de eventos inflamatórios autoimunes. No entanto, uma vez que a combinação LB~ 100/aPD~1 resultou em função efetora aumentada e depleção de Treg, a autoimunidade constitui uma preocupação. Por conseguinte, examinamos a histologia de múltiplos órgãos dos camundongos tratados em busca de sinais de inflamação. Os camundongos C57BL/6 que chegaram ao limite da sobrevida foram sacrificados e a histologia da pele, da glândula salivar, do pâncreas, do pulmão e do estômago foi examinada (Fig. 34E, 35). Não houve evidências em qualquer dos grupos de tratamento que sugerissem infiltração aumentada de linfócitos ou sinais de autoimunidade.
[00413] LB-100 inibe a atividade de PP2A e aumenta a ativação de mTORCI: A atividade enzimática de PP2A de células CD4 e CD8 isoladas provenientes de esplenócitos de camundongos foi medida 3 horas depois da estimulação in vitro com CD3 plaqueada e CD28 solúvel. Houve uma redução dependente da dose na atividade enzimática de PP2A tanto nas células CD4 quanto nas células CD8, com um efeito maior nas células CD8 do que nas células CD4 (Fig. 36A). [00414] Depois de 3 horas de ativação in vitro das células CD3 isoladas, a atividade das vias de mTORCI, de mTORC2 e de PI(3)K~ AKT foi avaliada verificando-se a fosforilação da proteína S6 (S6)
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91/104 ribossômica, AKT em Thr473 e AKT em Thr308, respectivamente. Foi constatado que embora o LB-100 tenha efeito mínimo nas vias de mTORC2 e de PI(3)K-AKT (Fig. 36B), houve um aumento dependente da dose na atividade de mTORCI conforme medido pela fosforilação de S6 (Fig. 36c). Esta diferença não foi observada em qualquer das 3 vias em um instante precoce de 30 minutos depois da ativação (Fig. 37). [00415] LB-100 inibe o desenvolvimento de células CD4 naíves em células CD4 reguladoras ou células CD4Th2: Células CD4 naíves foram isoladas a partir de esplenócitos de camundongo e ativadas in vitro com antiCD3 e CD28 na presença de TGF-β ou IL4 para induzir o desenvolvimento de células CD4+ Treg ou Th2, respectivamente. Depois de 72 horas, as expressões intranucleares de Foxp3 ou GATA3 foram quantificadas por citometria de fluxo para determinar a percentagem de células Treg ou Th2, respectivamente. O tratamento com LB-100 prejudicou significativamente a indução de Foxp3 por TGFβ (Fig. 38A) ou GATA3 (Fig. 38B) por IL-4 de uma forma dependente da dose. Além disso, a proporção relativa de células CD4+ Th2 e Th1 foi quantificada por meio de3 marcação para T-bet. A frequência de células expressando GATA3 em relação às células expressando Tbet diminuiu significativamente com o tratamento com LB-100 (Fig. 38C). Em seguida, foi explorada a consequência funcional de células CD4+ Th1 com tratamento com LB-100. Em condições de desvio de Th1 e de Th2, houve um aumento dependente da dose na expressão de IFN-γ com inibição de PP2A. Este foi demonstrado tanto por coloração intracelular (Fig. 38D) como por medição da secreção de citocinas (Fig. 38E-F). Outras cicotinas relacionadas com Th1, incluindo TNF-α e IL2, também foram aumentadas nas condições de Th1 e de Th2. A secreção de IL4, como esperado, foi reduzida (Fig. 38F). Estes dados sugerem que a inibição de PP2A diminuiu a formação de Treg e desviou a diferenciação de células CD4 para a linhagem Th1 resultando em um aumento global
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92/104 na secreção de citocinas Th1. Estes experimentos in vitro são consistentes com as descobertas de TILS in vivo e sugerem potencialmente que a inibição de PP2A aumentou a imunidade para câncer via hiperativação de mTORCI.
[00416] Atividade in vitro de LB-100 em reações de linfócitos mistos humanos: Para confirmar ainda que o efeito imunomodulador do LB-100 tem utilidade clínica, reações de linfócitos mistos (MLRs) foram realizadas usando PBMC de doadores humanos saudáveis. Células dendríticas derivadas de monócitos foram cocultivadas com células T CD4+ alogênicas marcadas com o corante citosólico CFSE. LB-100 foi dado no dia da cocultura (Dia 0) e novamente no Dia 3. a proliferação e a secreção de IFN-γ pelas células T CD4 foram avaliadas no Dia 5 (Fig. 39A). Houve um aumento significativo na proliferação de células T CD4, segundo medida pela percentagem de células divisoras, com tratamento com LB-100 a 1 μΜ (31% comparados com 20% nos controles) (Fig. 39B). Também houve uma tendência à proliferação aumentada a concentrações mais baixas de LB100 (na faixa submicromolar). Na dose alta de 5 μΜ, a proliferação ficou prejudicada, sugerindo que existe uma janela ideal de exposição ao LB-100 que aumenta a imunidade. Um padrão similar foi observado com a secreção de IFN-y (Fig. 39C). A 0,2 e 1 μΜ de LB-100, a liberação de IFN-γ foi significativamente aumentada 3,5 e 4 vezes, respectivamente. Também foi examinado o efeito da diferenciação de linhagens em células T CD4 por meio de marcação para T-bet. LB-100 a 1 μΜ diminuiu significativamente a expressão de T-bet e (Fig. 8D)., confirmando nosso achado anterior de que parece que o LB-100 desvia a linhagem CD4 para diferenciação de Th1. Em seguida testamos se o LB-100 podería aumentar a secreção de IFN-y in vitro em combinação com o bloqueio de PD1 usando Nivolumab. Um ensaio de MLR similar foi realizado com LB-100. Foi constatado que o LB-100 sinergizava com o bloqueio anti
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PD1 (aPD-1) e aumentava a secreção de IFN-γ em comparação com os agentes individuais (Fig. 39E).
Materiais e Métodos [00417] Fármacos - Nivolumab foi adquirido na Bristol-Myers Squibb e LB-100 foi adquirido na Lixte Biotechnology Holdings, Inc.
[00418] Linhagens celulares - as linhagens celulares de carcinoma de cólon CT26.CL25, melanoma B16 F10 e carcinoma de mama 4T1 foram adquiridas no ATCC. As células tumorais foram cultivadas em meio completo (RPMI 1640, Gibco) contendo 10% (vol/vol) de FBS (Gibco), 100 U/ml de penicilina, 100 ug/ml de estreptomicina (Gibco).
[00419] Modelos de tumor singênico - Os camundongos foram mantidos e os experimentos foram conduzidos com a aprovação das Comissões de Ética no uso de Animais NINDS. Para tumores CT26: BALB/c (6-8 semanas de idade) foram adquiridos no Charles River Laboratory. Células CT26 (0,5 x 106) foram injetadas subcutaneamente no flanco direito. Depois que os tumores atingiram um volume de 30100 mm3 (dia 0), os camundongos foram randomizados e tratados com PBS, LB-100 (0,156 mg/kg) e/ou PD-1 anticamundongo (10 mg/kg) (RMP1-14; lgG2b de rato; Bio X Cell). Os tratamentos foram dados a cada 2 dias por 30 dias. Os volumes tumores foram medidos a cada 2 dias com a ajuda de um paquímetro e o volume tumoral foi calculado de acordo com a fórmula: Volume (mm3) - L x W2 /2, onde Léo comprimento e W é a largura do tumor (em milímetros. Para tumores B16: C57BL/6 (6-8 semanas de idade) foram adquiridos no Charles River Laboratory. Os camundongos foram randomizados nos respectivos grupos de tratamento e 2 dias depois do tratamento inicial células B16F10 (0,5x106) foram injetadas subcutaneamente no flanco direito. O tratamento e as medições foram feitos a cada 2 dias. O limite de sobrevida foi definido como quando qualquer um dos seguintes critérios fosse atingido: 1) volume tumoral superior a 2000 mm3, 2)
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94/104 diâmetro tumoral superior a 2 cm, 3) necrose de pele não cicatrizante severa. Quando indicado, alguns camundongos foram depletados para células T CD8+ por injeção de 250 ocg de anticorpos depletores de CD8 (clone 53,6,7; BioXcell). As injeções foram dadas 2 dias e 1 dia antes da terapia, no dia do início da terapia, e 5 dias e 8 dias depois do início da terapia, e diariamente depois disso.
[00420] Estudos de novo desafio com tumor - Camundongos BALB/c naíves previamente curados (CR) de tumores CT26 com terapia combinada foram inoculados com 0,5 x106 células CT26 no flanco torácico esquerdo (CR) e no flanco torácico direito (naive). Onde indicado, alguns camundongos também foram inoculados com 1,25 x 105 células de carcinoma de mamilo 4T1 no coxim adiposo mamário. Os volumes tumorais foram então monitorados de maneira semelhante à descrita acima.
[00421] Isolamento de TILs - Os camundongos receberam uma injeção de 0,5 x 106 células CT26 no flanco torácico direito e foram tratados da maneira acima depois que os tumores atingiram entre 50~ 100 mm3. Depois de 2 tratamentos, os camundongos foram sacrificados e os tumores, excisados. Os tumores foram submetidos à ruptura mecânica usando-se um dissociador GentleMACS (Miltenyi Biotec) na presença de digestão enzimática usando-se o Kit de Dissociação de Tumor (Miltenyi Biotec). A estratégia de retenção usada para análise dos TILs está mostrada na Fig. S3. Coloração de citocinas intracelulares, citometria de fosfoluxo e de fluxo - Suspensões contendo células T foram coloridas com uma coloração para vivo/morto fixável (Invitrogen) em PBS seguida por coloração com anticorpo de superfície em tampão de FACS (PBS com 0,5% de BSAe 0,1% de azida de sódio). Para coloração intracelular, as células foram coloridas com moléculas de superfície seguidas de fixação e permeabilização (eBioscience). Para coloração de citocinas, as células foram primeiro estimuladas com
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95/104 um coquetel de estimulação de células (eBioscience) contendo PMA/lonomcina e um inibidor do transporte de proteínas antes de serem coloridas. Para fosfocoloração, formaldeído a 4% foi usado para fixação e metanol a 100% foi usado para os protocolos de permeabilização. As células foram analisadas por citometria de fluxo (LSRII; BD Bioscience). A análise dos dados foi efetuada com a ajuda do software FlowJo (TreeStar).
[00422] Ensaio da fosfatase PP2A - Células T CD4+ e CD8+ de camundongos foram isoladas com o kit de isolamento de CD4 e de CD8 (StemCell), respectivamente. As células foram ativadas usando-se antiCD3 imobilizado (10 ug/ml) e antiCD28 solúvel (2 ug/ml) por três horas. A atividade de PP2A foi então avaliada depois de imunoprecipitação com a ajuda de um kit de ensaio de fosfatase com verde malaquita de acordo com as instruções do fabricante (EMD Millipore).
[00423] Estimulação e desvio de células T - Células CD4 naíves foram isoladas a partir de esplenócitos de camundongo (StemCell). As células foram ativadas por 3 dias usando-se antiCD3 imobilizado (10 ug/ml) e antiCD28 solúvel (2 ug/ml). As condições de desvio foram as seguintes: TH1, 1 .ig/mL anti-IL.4, 5 ng/mL IL2, e 10 ng/mL IL12; TH2, 1 Jg/mL anti-IFN-y, 5 ng/mL IL2, e 10 ng/mL IL4 ; Treg, 1 Jg/ mL anti-IFNy, e 1 ig/mL anti-IL4, e 2 ng/ mL TGFpl. Imunoensaios de fluxo de múltiplos analitos à base de contas (BD Bioscience) foram usados para medir a produção de citocinas no sobrenadante de acordo com as instruções do fabricante. Os números de células absolutos foram quantificados por citometria de fluxo usando contagem das contas (Biolegend).
[00424] Anticorpos para citometria de fluxo Anticamundongo: aCD45 (30-F11, BD), a~CD3 (145-2C11, Biolegend), a-CD4 (GK1.5, Biolegend), a-CD8 (53-6,7, BD), a-PD-1 (J43, ThermoFisher), O-CTLA4
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96/104 (1B8, abeam), α-ΤΙΜ-3 (B8.2C12, Biolegend), α-ΟΧ-40 (OX-86, Biolegend), O-CD62L (MEL-14, BD), O-CD44 (IM7, Biolegend), a-LAG-3 (C9B7W, Biolegend), a-IFN-γ (XMG1,2, Biolegend), a-TNF-a (MP6XT22, Biolegend), a-Granzima B (NGZB, ThermoFisher), a-FOXP3 (MF-14, Biolegend), O-KI67 (SolA15, ThermoFisher). Anti-humano: oCD4 (A161A1, Biolegend), α-Τ-bet (4B10, Biolegend), a-Fosfo-Akt (Ser473) (D9E, Cell Signaling), a-Fosfo-Akt (Thr308) (D25E6, Cell Signaling), Proteína Ribossômica o-Fosfo-S6 (Ser235/236) (D57.2.2E, Cell Signaling).
[00425] Histologia - Tecidos fixados em formalina foram processados, coloridos com hematoxilina e eosina e foram avaliados às cegas por um patologista certificado.
[00426] Reação de linfócitos mistos humanos - como descrito anteriormente em 39. Células dendríticas (DCs) foram geradas por meio de cultura de monócitos isolados de PBMC usando-se um kit de isolamento de monócitos (StemCell) in vitro por 7 dias com 500LJ/ml de interleucina-4 (IL-4) e 250 U/ml de GM-CSF (R&D Systems). Células T CD4+ (1x 105) isoladas com o kit de isolamento de CD4 (StemCell) e marcadas com CFSE (ThermoFisher) foram cocultivadas com DCs alogênicas (1x 104). No início do ensaio, foi adicionada uma titulação de LB-100 e/ou de Nivolumab. Depois de 3 dias, LB-100 foi reabastecido até a concentração final indicada. Depois de 5 dias, os sobrenadantes da cultura foram analisados por ELISA (eBioscience) e as células foram analisadas por citometria de fluxo. Foram obtidos pelo menos 3 doadores separados e os resultados de um doador representativo foram reportados.
[00427] Estatística - Se não indicado em contrário na legenda da figura, as amostras foram analisadas com o software GraphPad Prism usando o teste de múltiplas comparações de Tukey. Os gráficos de dispersão estão representados como a média com DPM.
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Claims (49)
- REIVINDICAÇÕES1. Método para tratar um indivíduo que sofre de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um inibidor de PP2A em combinação com uma quantidade eficaz de um inibidor de ponto de verificação, onde as quantidades quando tomadas juntas são eficazes para tratar o indivíduo.
- 2. Método para tratar um indivíduo que sofre de câncer e receber um inibidor de ponto de verificação, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade de inibidor de PP2A eficaz para melhorar o tratamento em relação ao inibidor de ponto de verificação isoladamente.
- 3. Método para tratar um tumor ou câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um inibidor de PP2A em combinação com uma quantidade eficaz de um inibidor de ponto de verificação, onde as quantidades quando tomadas juntas são eficazes para tratar o tumor ou câncer.
- 4. Método para aumentar a resposta de células T a células cancerosas em um indivíduo que sofre de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade de um inibidor de PP2A em combinação com uma quantidade eficaz de um inibidor de ponto de verificação eficaz para aumentar a resposta de células T a células cancerosas.
- 5. Método para aumentar a ativação de células T em um indivíduo que sofre de câncer, caracterizado pelo fato de compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um inibidor de PP2A em combinação com uma quantidade eficaz de um inibidor de ponto de verificação para assim aumentar a ativação de células T.
- 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a quantidade do composto e aPetição 870190052756, de 04/06/2019, pág. 148/1982/10 quantidade do inibidor de ponto de verificação são, cada uma delas, administradas periodicamente ao indivíduo.
- 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a quantidade do composto e a quantidade do inibidor de ponto de verificação são administradas simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
- 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ponto de verificação é administrado concomitantemente, antes, ou depois do inibidor de PP2A.
- 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a quantidade de inibidor de ponto de verificação e a quantidade de composto quando administradas juntas são mais eficazes para tratar o indivíduo do que quando cada agente na mesma quantidade é administrado isoladamente.
- 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a quantidade do composto e a quantidade do inibidor de ponto de verificação quando tomadas juntas são eficazes para reduzir um sintoma clínico do câncer no indivíduo.
- 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o composto melhora o efeito imunoterapêutico do inibidor de ponto de verificação.
- 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado peto fato de que o câncer é suscetível a tratamento por uma resposta imunológica.
- 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ponto de verificação imunológico é um agente para CTLA-4.
- 14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ponto de verificação imunológico éPetição 870190052756, de 04/06/2019, pág. 149/1983/10 ipilimumab ou tremelimumab.
- 15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ponto de verificação imunológico é um agente anti-PD-1 ou anti-PD-L.1.
- 16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ponto de verificação PD-1 e/ou PD-L1 é atezolizumab, nivolumab ou pembrolizumab.
- 17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado peto fato de que o câncer é melanoma, carcinoma de células renais, câncer de próstata, carcinoma urotelial ou câncer de ovário.
- 18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o câncer é melanoma.
- 19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado peto fato de que o composto é administrado a uma dose de 0,25 mg/m2, 0,5 mg/m2, 0,83 mg/m2,1,25 mg/m2,1,75 mg/m2, 2,33 mg/m2, de 3,1 mg/m2.
- 20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o composto é administrado a uma dose de 2,33 mg/m2.
- 21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado peto fato de que o composto é administrado por 3 dias a cada 3 semanas.
- 22. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado peto fato de que o ipilimumab é administrado por via intravenosa a uma dose de 0,5 mg/kg - 10 mg/kg ou menos.
- 23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o ipilimumab é administrado por via intravenosa durante 90 minutos a cada 3 semanas ou menos.
- 24. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o atezolizumab é administrado por via intravenosa aPetição 870190052756, de 04/06/2019, pág. 150/1984/10 uma dose de 0,1 mg/kg - 20 mg/kg ou menos.
- 25. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o atezolizumab é administrado por via intravenosa durante 60 minutos a cada 3 semanas ou menos.
- 26. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o nivolumab é administrado por via intravenosa a uma dose de 0,1 mg/kg - 10 mg/kg ou menos.
- 27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado peto fato de que o nivolumab é administrado por via intravenosa durante 60 minutos a cada 2 semanas ou menos.
- 28. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado peto fato de que o pembrolizumab é administrado por via intravenosa a uma dose de 1 mg/kg - 10 mg/kg ou menos.
- 29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado peto fato de que o pembrolizumab é administrado por via intravenosa durante 30 minutos a cada 3 semanas ou menos.
- 30. Método para inibir a função de um CTLA-4 em células T caracterizado pelo fato de que compreende administrar às células T um inibidor de PP2A para assim inibir a função do CTLA-4.
- 31. Método para inibir a interação de PD-1 :PD-L1 em células T,caracterizado peto fato de que compreende administrar às células T um inibidor de PP2A para assim inibir a interação de PD-1 :PD-L1.
- 32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o inibidor de PP2A tem a estrutura:Petição 870190052756, de 04/06/2019, pág. 151/1985/10 onde a ligação α está presente ou ausente;R1 e R2 juntos são =0;R3 é OH, O-, OR9, O(CH2)1-6R9, SH, S-, ou SR9, onde R9 é H, alquila, alquenila, alquinila ou arila;onde X é O, S, NR10, N+HR10 ou N+R10R10, onde cada R10 é independentemente H, alquila, alquenila, alquinila, arila,, -CH2CN, -CH2CO2R11, ou-CH2COR11, onde cada R11 é independentemente H, alquila, alquenila ou alquinila;R5 e R6 juntos são -O;R7 e R8 são cada um H, ou um sal, zwiteríon, ou éster do mesmo.
- 34. Método de acordo com a reivindicação 32 ou 33,Petição 870190052756, de 04/06/2019, pág. 152/1986/10 caracterizado pelo fato de que a ligação o no composto está presente.
- 35. Método de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracterizado pelo fato de que a ligação α no composto está ausente.
- 37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que R3 é OH, O- ou OR9, onde R9 é H, metila, etila ou fenila.
- 38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que R3 é OH, O- ou OR9, onde R9 é metila.
- 46. Método de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que o composto tem a estruturaonde:a ligação α está presente ou ausente;R9 está presente ou ausente e quando presente é H, alquila, alquenila, alquinila ou fenila; eX é O, NR10, NH+R10 ou N+R10R10, onde cada R10 é independentemente H, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila,CH2CO2R12, ou -CH2COR12, onde R12 é H ou alquila, ou um sal, zwiteríon, ou éster do mesmo.Petição 870190052756, de 04/06/2019, pág. 155/1989/10
- 47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o composto tem a estruturaonde:a ligação α está presente ou ausente; XéOouNRW, onde cada R10 é independentemente H, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila,-CH2CN, CH2CO2R12, ou -CH2COR12, onde R12 é H ou alquila, ou um sal, zwiteríon, ou éster do mesmo.
- 48. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o composto tem a estruturaonde:a ligação α está presente ou ausente;Xé O ou NH+R10, onde R10 é H, alquila, alquila substituída, alquenila,Petição 870190052756, de 04/06/2019, pág. 156/19810/10 alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, arila,, -CH2CN, -CH2CO2R12, ou -CH2COR12, onde R12 é H ou alquila, ou um sal, zwiteríon, ou éster do mesmo.
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