BR112019011545B1 - Composição, uso de uma composição, métodos para suprimir uma doença causada por um fungo patogênico de plantas, para preparar a composição e para detectar a presença de uma cepa de methylobacterium, e, material de propagação de planta - Google Patents

Composição, uso de uma composição, métodos para suprimir uma doença causada por um fungo patogênico de plantas, para preparar a composição e para detectar a presença de uma cepa de methylobacterium, e, material de propagação de planta Download PDF

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Abstract

São providas composições compreendendo Methylobacterium com atividade antifúngica, métodos para controlar fungos patogênicos de plantas, e métodos para preparar as composições.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido de patente reivindica o benefício do U.S. 62/431927, depositado em 9 de dezembro de 2016, incorporado aqui por referência na sua totalidade.
DECLARAÇÃO SOBRE A LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[002] Uma listagem de sequências contendo o arquivo chamado “53907-171478_ST25.txt”, que tem 32768 bytes (medido no MS-Windows®) e criado em 1° de dezembro de 2017, contém 60 sequências de nucleotídeos, é provida aqui através do sistema EFS do USPTO e é incorporada aqui por referência na sua totalidade.
FUNDAMENTOS
[003] Compostos orgânicos de um carbono, como metano e metanol, são encontrados extensivamente na natureza, e são utilizados como fontes de carbono por bactérias classificadas como metanotróficas e metilotróficas. As bactérias metanotróficas incluem espécies nos gêneros Methylobacter, Methylomonas, Methylomicrobium, Methylococcus, Methylosinus, Methylocystis, Methylosphaera, Methylocaldum e Methylocella (Lidstrom, 2006). As metanotróficas possuem a enzima metano mono-oxigenase que incorpora um átomo de oxigênio do O2 no metano, formando o metanol. Todas as metanotróficas são utilizadores obrigatórios de um carbono que são incapazes de usar compostos contendo ligações carbono-carbono. As metilotróficas, por outro lado, também podem utilizar compostos orgânicos mais complexos, tais como ácidos orgânicos, álcoois superiores, açúcares e semelhantes. Assim, as bactérias metilotróficas são metilotróficas facultativas. As bactérias metilotróficas incluem espécies no gênero Methylobacterium, Hyphomicrobium, Methylophilus, Methylobacillus, Methylophaga, Aminobacter, Methylorhabdus, Methylopila, Methylosulfonomonas, Marinosulfonomonas, Paracoccus, Xanthobacter, Ancylobacter (também conhecido como Microcyclus), Thiobacillus, Rhodopseudomonas, Rhodobacter, Acetobacter, Bacillus, Mycobacterium, Arthobacter e Nocardia (Lidstrom, 2006).
[004] A maioria das bactérias metilotróficas do gênero Methylobacterium é pigmentada de rosa. Elas são convencionalmente referidas como bactérias PPFM, sendo metilotróficas facultativas pigmentadas de rosa. Green (2005, 2006) identificou doze espécies validadas no gênero Methylobacterium, specifically M. aminovorans, M. chloromethanicum, M. dichloromethanicum, M. extorquens, M. fujisawaense, M. mesophilicum, M. organophilum, M. radiotolerans, M. rhodesianum, M. rhodinum, M. thiocyanatum, e M. zatmanii. No entanto, M. nidulans é um Methylobacterium fixador de nitrogênio que não é uma PPFM (Sy et al., 2001). Methylobacterium são onipresentes na natureza, sendo encontrados no solo, poeira, água doce, sedimentos e superfícies foliares, bem como em ambientes industriais e clínicos (Green, 2006).
[005] Pressões bióticas - os efeitos combinados de patógenos, animais, insetos e ervas daninhas - resultam em uma perda anual de 20-40% da produtividade da cultura agrícola. Custos adicionais de controle de pragas, redução da qualidade da cultura agrícola e fundos para pesquisa para combater essas pressões, entre outros fatores, dificultam a quantificação precisa das perdas causadas por pragas e doenças das culturas agrícolas (Savary et al. 2012, Food Sec. DOI: 10.1007/s12571-012-0200-5). Os compostos biológicos agrícolas apresentam uma nova, excitante e crescente opção para combater as pragas e doenças das culturas agrícolas, de uma maneira que complementa e preserva os atuais traços de resistência dos germoplasma das culturas agrícolas, as opções de controle químico e as práticas culturais. (Schlaeppi e Bulgarelli 2015, MPMI 28(3): 212-217. DOI: 10.1094/MPMI-10-14-0334-FI).
[006] As doenças fúngicas são uma das principais causas de perda de rendimento e qualidade para culturas agrícolas em linha agronomicamente importantes, incluindo milho, soja, trigo, algodão e canola. Entre essas doenças, as espécies de fungos ascomicetos nos gêneros Cercospora, Colletotrichum, Fusarium, e Septoria são particularmente difundidas e contribuem para perdas significativas de culturas agrícolas. A espécie Fusarium sozinha causou uma perda estimada de 36,2 milhões de bushels/ano em soja dos anos 1994-2010 (Wrather et al. 2010). Essas espécies causam uma variedade de males foliares, de mudas e de caules, e, ao contrário das ferrugens ou outras doenças causadas por patógenos biotróficos obrigatórios, não há resistência genética completa a essas doenças. Além disso, os controles químicos geralmente devem ser aplicados em momentos muito precisos para impedir o progresso da doença, maximizando os lucros e protegendo a saúde das plantas. Os limites estritos e as janelas de controle podem resultar em falha da proteção de cultura agrícola ou proteção de cultura agrícola incompleta. Os inoculantes microbianos, que podem colonizar a partir da semente e continuar nas plantas e no solo durante toda a duração da estação de crescimento, oferecem amplas janelas de proteção, podem compensar as insuficiências do controle químico e estender os benefícios do fungicida através da gestão da resistência.
SUMÁRIO
[007] São aqui providas composições compreendendo Methylobacterium que inibem o crescimento de um fungo patogênico de plantas, métodos de utilização das composições para controlar infecções fúngicas de plantas, partes de plantas, e plantas derivadas das mesmas, e métodos para preparar as composições. Tais Methylobacterium que inibem o crescimento de um fungo patogênico de plantas são, em certos casos, aqui referidos como “Methylobacterium que inibe os fungos patogênicos de plantas” ou, em certos contextos, simplesmente como “Methylobacterium”. Em certas modalidades, o Methylobacterium que inibe o crescimento de um fungo patogênico de plantas pode ser distinguido de outro Methylobacterium que não inibe os fungos patogênicos de plantas, testando a capacidade do Methylobacterium de inibir a doença fúngica em uma planta ou em uma parte de planta isolada.
[008] São aqui providas composições compreendendo uma mono ou cocultura de Methylobacterium que inibe o crescimento de um fungo patogênico de plantas e um excipiente agriculturalmente aceitável e/ou um adjuvante agriculturalmente aceitável. Em certas modalidades, o Methylobacterium tem pelo menos um gene que codifica um 16S RNA tendo pelo menos 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 8; ou o Methylobacterium é NLS0109 ou um derivado do mesmo. Em certas modalidades, o Methylobacterium tem no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores de polinucleotídeos de pelo menos 50, 60, 100, 120, 180, 200, 240 ou 300 nucleotídeos da SEQ ID NOS: 9-11. Em certas modalidades, o Methylobacterium tem no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores compreendendo uma sequência tendo pelo menos 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência ao longo de todo o comprimento da SEQ ID NOS: 9-11. Em certas modalidades, o Methylobacterium não é M. radiotolerans ou M. oryzae. Em certas modalidades, o fungo patogênico de plantas é selecionado a partir do grupo que consiste em um Blumeria sp., um Cercospora sp., um Cochliobolus sp., um Colletotrichum sp., um Diplodia sp., um Exserohilum sp., um Fusarium sp., Gaeumanomyces sp., Macrophomina sp., um Magnaporthe sp., um Microdochium sp., um Peronospora sp., um Phakopsora sp., um Phialophora sp., um Phoma sp., um Phymatotrichum sp., um Phytophthora sp., um Pyrenophora sp., um Pyricularia sp, um Pythium sp., um Rhizoctonia sp., um Sclerophthora, um Sclerospora sp., um Sclerotium sp., um Sclerotinia sp., um Septoria sp., um Stagonospora sp., um Stenocarpella sp. e um Verticillium sp. Em certas modalidades, o Fusarium sp. é selecionado a partir do grupo que cosiste em Fusarium graminearum, Fusarium verticillioides, Fusarium oxysporum, Fusarium virguliforme, e Fusarium solani. Em certas modalidades de qualquer das composições acima mencionadas, a composição compreende uma substância sólida em que uma monocultura ou cocultura de Methylobacterium é aderida à mesma. Em certas modalidades, o fungo patogênico de plantas é um Rhizoctonia sp. ou um Sclerotinia sp. Em certas modalidades, o Rhizoctonia sp. é Rhizoctonia solani ou Rhizoctonia cerealis. Em certas modalidades, o Sclerotinia sp. é Sclerotinia sclerotiorum ou Sclerotinia homoeocarpa. Em certas modalidades, a composição compreende um coloide formado pela substância sólida em que uma monocultura ou cocultura de Methylobacterium é aderida à mesma e um líquido. Em certas modalidades, o coloide é um gel. Em certas modalidades de qualquer uma das composições acima mencionadas, a composição é uma emulsão. Em certas modalidades de qualquer uma das composições acima mencionadas, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109. Em certas modalidades de qualquer uma das composições acima mencionadas, a composição compreende adicionalmente uma segunda cepa de Methylobacterium selecionada a partir de NLS0017, NLS0020, NLS0021, NLS0042, NLS0064, NLS0066, NLS0089, um derivado dos mesmos, ou um Methylobacterium sp. relacionado com os mesmos. Em certas modalidades, os derivados de cepas de Methylobacterium NLS0017, NLS0020, NLS0089 e NL0109 ou um Methylobacterium sp. relacionado com os mesmos podem ser identificados pela presença de um ou mais fragmentos marcadores selecionados a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 9-11, 21-24, 37-39, ou 49-51, e podem ser distinguidos do outro Methylobacterium relacionado por análise de PCR, utilizando ensaios de detecção de DNA específico que incluem, mas não estão limitados a, combinações de sondas e iniciadores de DNA aqui providos. Uso de qualquer uma das composições acima referidas para o revestimento ou o revestimento parcial de uma parte de planta (por exemplo, uma semente) para inibir o crescimento de qualquer dos fungos patogênicos de plantas acima mencionados também é aqui provido.
[009] Em certas modalidades de qualquer uma das composições acima mencionadas, o Methylobacterium é NLS0109 ou um derivado do mesmo. Em certas modalidades, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109 e o fungo patogênico de plantas é um Rhizoctonia sp. ou um Sclerotinia sp. Em certas modalidades, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109 e o fungo patogênico de plantas é Fusarium graminearum, Cercospora zeae-maydis ou Colletotrichum graminicola. Em certas modalidades, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109 e o fungo patogênico de plantas é Septoria tritici, Stagonospora nodorum, Pythium spp., Rhizoctonia solani, a Fusarium spp., Magnaportha grisea, Pyrenophora tritici-repentis, Microdochium nivale, Sclerotinia sclerotiorum, Cercospora sojina, Cercospora kikuchii, Fusarium spp., Rhizoctonia solani, Fusarium virguliforme, Pythium spp., Rhizoctonia solani, Gibberella zeae, ou um Pythium spp. Em qualquer uma das modalidades acima mencionadas, o fungo patogênico de plantas que é inibido pode estar na sua forma anamórfica, na sua forma teleomórfica, ou na sua forma anamórfica e nas suas formas teleomórficas. Em qualquer das modalidades acima mencionadas, a composição pode compreender uma concentração inibidora de fungos da mono ou cocultura de Methylobacterium. Uso de qualquer uma das composições acima referidas para o revestimento ou o revestimento parcial de uma parte de planta (por exemplo, uma semente) para inibir o crescimento de qualquer dos fungos patogênicos de plantas acima mencionados também é aqui provido.
[0010] Em certas modalidades, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109 e o fungo patogênico de plantas é um Rhizoctonia sp. ou um Fusarium sp. e a planta é milho ou soja. Em certas modalidades dos metódos, o Fusarium sp. é uma ou mais espécies selecionadas dentre Fusarium graminearum, Fusarium verticillioides, Fusarium oxysporum, Fusarium virguliforme, e Fusarium solani, e o Rhizoctonia is Rhizoctonia solani. Em algumas modalidades, Methylobacterium sp. o controle de infecções fúngicas por Fusarium e Rhizoctonia é evidenciado por germinação melhorada e emergência de sementes após aplicação do Methylobacterium. Em certas modalidades, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109 e o fungo patogênico de plantas é um Pythium sp. e a planta é milho ou soja. Em certas modalidades dos métodos, o Pythium sp. é uma ou mais espécies selecionadas dentre Pythium torulosum, Pythium oopapillum, Pythium sylvaticum e Pythium lutarium.
[0011] Em qualquer das modalidades acima mencionadas, a composição pode compreender adicionalmente um composto antifúngico. Em certas modalidades, o composto antifúngico pode ser um azol, um ditiocarbamato, uma estrobilurina, uma fenilamida, uma tiazol-carboxamida, uma piperidinil-tiazol-isoxazolina ou um benzimidazol. Em certas modalidades, o azol é ipconazol, tebuconazol, triticonazol, metconazol, protioconazol, triadimenfona, propiconazol e imazalil. Em certas modalidades, a composição compreende adicionalmente um fungicida de estrobilurina. Em certas modalidades, o fungicida estrobilurina é selecionado a partir do grupo que consiste em azoxistrobina, piraclostrobina, fluoxastrobina e trifloxistrobina. Em certas modalidades, o fungicida estrobilurina é piraclostrobina. O uso de qualquer uma das composições acima referidas para o revestimento ou o revestimento parcial de uma parte de planta (por exemplo, uma semente) para inibir o crescimento de qualquer dos fungos patogênicos de plantas acima mencionados também é aqui provido. Em certas modalidades de qualquer das composições ou usos acima mencionados, a combinação de Methylobacterium, cultura agrícola, patógeno, doença e/ou compostos antifúngicos é como apresentado na Tabela 4.
[0012] Também são providas plantas ou partes de plantas que são pelo menos parcialmente revestidas com qualquer uma das composições acima mencionadas compreendendo uma mono ou cocultura de Methylobacterium. Em certas modalidades, o Methylobacterium tem pelo menos um gene que codifica um 16S RNA tendo pelo menos 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 8; ou o Methylobacterium é NLS0109 ou um derivado do mesmo. Em certas modalidades, o Methylobacterium tem no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores de polinucleotídeos de pelo menos 50, 60, 100, 120, 180, 200, 240 ou 300 nucleotídeos da SEQ ID NOS: 9-11. Em certas modalidades, o Methylobacterium tem no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores compreendendo uma sequência tendo pelo menos 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência ao longo de todo o comprimento da SEQ ID NOS: 911. Em certas modalidades, a planta revestida pelo menos parcialmente ou parte de planta é uma planta de cereal ou parte de planta de cereal. Em certas modalidades, a planta revestida pelo menos parcialmente é selecionada a partir do grupo que consiste em uma planta de arroz, trigo, milho, cevada, painço, sorgo, aveia e centeio. Em certas modalidades, a parte de planta de cereal revestida pelo menos parcialmente é selecionada a partir do grupo que consiste em uma parte de planta de arroz, trigo, milho, cevada, painço, sorgo, aveia e centeio. Em certas modalidades, a planta revestida pelo menos parcialmente ou parte de planta é uma parte de planta de dicotiledônea. Em certas modalidades, a planta de dicotiledônea ou parte de planta é uma parte de planta de soja, amendoim ou tomate. Em certas modalidades de qualquer uma das plantas ou partes de plantas acima mencionadas, o Methylobacterium na composição foi obtido a partir de um gênero de planta, espécie de planta, subespécie de planta ou cultivar de planta que é distinto do gênero, espécie, subespécie, ou cultivar da planta ou parte de planta que é revestida com a composição. Também são providos produtos vegetais processados que compreendem uma quantidade detectável de qualquer um dos Methylobacterium de qualquer das composições acima mencionadas.
[0013] São providos aqui também métodos de identificação de composições, incluindo, mas não limitados a, amostras de solo, partes de plantas, incluindo sementes de plantas, ou produtos vegetais transformados, compreendendo ou revestidos com NLS0109, NL0020, NLS0017 ou NLS0089 de Methylobacterium sp. pela análise da presença de fragmentos de ácido nucleico compreendendo pelo menos 40, 50, 60, 100, 120, 180, 200, 240 ou 300 nucleotídeos de SEQ ID NO: 9-11, 21-24, 37-39, ou 49-51 nas composições. Em certas modalidades, tais métodos podem compreender submeter uma amostra suspeita de conter NLS0109, NL0020, NLS0017 ou NLS0089 de Methylobacterium sp. a uma técnica de análise de ácido nucleico e determinar que a amostra contém um ou mais ácidos nucleicos contendo uma sequência de pelo menos cerca de 50, 100, 200 ou 300 nucleotídeos que é idêntica a uma sequência contígua na SEQ ID NO 9-11, 21-24, 37-39, ou 49-51, em que a presença de uma sequência que é idêntica a uma sequência contígua na SEQ ID NO: 9-11, 21-24, 37-39, ou 49-51 é indicativo da presença de NLS0109 (SEQ ID NO: 9-11), NL0020 (SEQ ID NO: 21-24) NLS0017 (SEQ ID NO: 37-39) ou NLS0089 (SEQ ID NO: 49-51) na amostra. Tais análises de ácido nucleico incluem, mas não se limitam a, técnicas com base na hibridação de ácido nucleico, reações em cadeia da polimerase, espectroscopia de massa, detecção baseada em nanoporos, análises de DNA ramificado, combinações dos mesmos e semelhantes. Um exemplo de tal análise de ácido nucleico é um ensaio baseado em ácido nucleico bloqueado (LNA) de qPCR aqui descrito. Tal análise pode ser usada para detectar cepas de Methylobacterium presentes a uma concentração (UFC/gm de amostra) de 103, 104, 105, 106 ou mais.
[0014] Também são aqui providos métodos de identificação e/ou isolamento de Methylobacterium sp. que pode inibir o crescimento de um fungo patogênico de plantas pela análise da presença de sequências de ácido nucleico contidas na SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9-11, 21-24, 37-39 ou 49-51 no Methylobacterium sp. Em certas modalidades, tais métodos podem compreender submeter um Methylobacterium sp. candidato a uma técnica de análise de ácido nucleico e determinar que a amostra contém um ou mais ácidos nucleicos contendo uma sequência de pelo menos cerca de 50, 100, 200 ou 300 nucleotídeos que é idêntica a uma sequência contígua na SEQ ID NO 9-11, 21-24, 37-39, ou 49-51, em que a presença de uma sequência que é idêntica a uma sequência contígua na SEQ ID NO: 9-11, 21-24, 37-39 ou 4951 indica que o Methylobacterium sp. candidato que pode inibir o crescimento de um fungo patogênico de plantas. Tais análises de ácido nucleico incluem, mas não se limitam a, técnicas com base na hibridação de ácido nucleico, reações em cadeia da polimerase, espectroscopia de massa, detecção baseada em nanoporos, análises de DNA ramificado, combinações dos mesmos e semelhantes.
[0015] Em certas modalidades, um Methylobacterium que é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109, é utilizado em qualquer das composições acima mencionadas, usos dos mesmos, ou métodos para inibir o crescimento de um fungo patogênico de plantas, onde o uso e/ou método compreende o controle de qualquer um dos patógenos ou doenças, em qualquer das culturas agrícolas, através de qualquer um dos modos de aplicação apresentados na Tabela 3. Em certas modalidades de qualquer uma das composições acima mencionadas, usos das mesmas, ou métodos, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109, o fungo patogênico de plantas que é inibido é Fusarium graminearum, Septoria tritici, Stagonospora nodorum, Rhizoctonia solani, um Fusarium spp., Magnaportha grisea, Pyrenophora tritici-repentis, Microdochium nivale, Blumeria graminis f. sp. tritici, ou um Pythium sp., e a planta ou parte de planta é uma planta de trigo ou parte de planta. Em certas modalidades de qualquer uma das composições acima mencionadas, usos das mesmas, ou métodos, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109, o fungo patogênico de plantas que é inibido é Cercospora zeae-maydis, Colletotrichum graminicola, Fusarium graminearum, Fusarium verticillioides, Gibberella zeae, Rhizoctonia solani, Stenocarpella maydis, um Pythium sp., Sclerospora graminicola ou Sclerophthora macrospora, e a planta ou parte de planta é uma planta de milho ou parte de planta. Em certas modalidades de qualquer uma das composições acima mencionadas, usos das mesmas, ou métodos, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109, o fungo patogênico de plantas que é inibido é Sclerotinia sclerotiorum, Cercospora sojina, Cercospora kikuchii, Fusarium spp., Rhizoctonia solani, Septoria glycines, Fusarium virguliforme, Pythium spp., Peronospora manshurica, ou Phytophthora sojae, e a planta ou parte de planta é uma planta de soja ou parte de planta de soja.
[0016] Em certas modalidades de qualquer uma das composições acima mencionadas, usos das mesmas, ou métodos, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com o mesmo e um segundo Methylobacterium selecionado dentre NLS0020, NLS0017, NLS0089, um derivado dos mesmos, ou um Methylobacterium relacionado com os mesmos, está incluído na composição. Em certas modalidades, a combinação de NLS0109 com um segundo Methylobacterium selecionado dentre NLS0020, NLS0017, NLS0089, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com o mesmo, que é utilizado em qualquer das composições acima mencionadas, usos das mesmas, ou métodos compreende qualquer uma das combinações de Methylobacterium, culturas agrícolas, patógenos, doenças e/ou modos de aplicação estabelecidos na Tabela 3. Por exemplo, em certas modalidades apresentadas na Tabela 3, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacteriumrelacionado com o mesmo e um segundo Methylobacterium é NLS0020, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com o mesmo, a cultura agrícola é trigo, o patógeno é Fusarium graminearum, Septoria tritici; Stagonospora nodorum, um Pythium spp., Rhizoctonia solani, a Fusarium spp., Blumeria graminis f. sp. tritici, Magnaporthe grisea, Pyrenophora tritici-repentis, ou Microdochium nival, e a aplicação é em uma semente no sulco; foliar; ou qualquer combinação dos mesmos, quando os isolados são utilizados isoladamente ou em combinação para qualquer tratamento, incluindo NLS0020 aplicado nos sulco e NLS0109 aplicado nas folhas (foliar). Em certas modalidades, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com o mesmo e um segundo Methylobacterium selecionado dentre NLS0020, NLS0017, NLS0089, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com o mesmo, o fungo patogênico de plantas que é inibido é Fusarium graminearum, Septoria tritici, Stagonospora nodorum, Rhizoctonia solani, um Fusarium spp., Magnaportha grisea, Pyrenophora tritici-repentis, Microdochium nivale, Blumeria graminis f. sp. tritici, ou um Pythium sp., e a planta ou parte de planta é uma planta de trigo ou parte de planta. Em certas modalidades, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com o mesmo e um segundo Methylobacterium selecionado dentre NLS0020, NLS0021, NLS0017, NLS0089, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com o mesmo, o fungo patogênico de plantas que é inibido é Cercospora zeae- maydis, Colletotrichum graminicola, Fusarium graminearum, Fusarium verticillioides, Gibberella zeae, Rhizoctonia solani, Stenocarpella maydis, um Pythium sp., Sclerospora graminicola ou Sclerophthora macrospora, e a planta ou parte de planta é uma planta de milho ou parte de planta de milho. Em certas modalidades, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com o mesmo e um segundo Methylobacterium selecionado dentre NLS0020, NLS0064, NLS0017, NLS0089, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com o mesmo, o fungo patogênico de plantas que é inibido é Sclerotinia sclerotiorum, Cercospora sojina, Cercospora kikuchii, Fusarium spp., Rhizoctonia solani, Septoria glycines, Fusarium virguliforme, Pythium spp., Peronospora manshurica, ou Phytophthora sojae, e a planta ou parte de planta é uma planta de soja ou parte de planta de soja
[0017] Em certas modalidades de qualquer das composições acima mencionadas, usos das mesmas, ou métodos, a planta ou parte de planta compreende uma quantidade inibidora de fungos do Methylobacterium. Em certas modalidades, uma quantidade inibidora de fungos do Methylobacterium aplicado em uma parte de planta (por exemplo, uma semente) é de cerca de 1,0x103, 1,0x104 ou 1,0x105 a cerca de 1,0x107 ou 1,0x108 UFCs de bactérias PPFM/parte de planta (por exemplo, uma semente). Em certas modalidades, o Methylobacterium é heterólogo à planta ou parte de planta. Em certas modalidades de qualquer uma das partes de planta acima mencionadas, a parte de planta é uma folha, um tronco, uma flor, uma raiz, um tubérculo ou uma semente.
[0018] São também providos métodos para preparar qualquer das composições acima mencionadas contendo o Methylobacterium que inibe o crescimento de um fungo patogênico de plantas que compreende combinar um Methylobacterium que inibe o crescimento de um fungo patogênico de plantas com um excipiente agriculturalmente aceitável e/ou com um adjuvante agriculturalmente aceitável. Em certas modalidades, o Methylobacterium tem: (i) pelo menos um gene que codifica um 16S RNA tendo pelo menos 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 8; (ii) tem no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores de polinucleotídeos de pelo menos 50, 60, 100, 120, 180, 200, 240 ou 300 nucleotídeos da SEQ ID NOS: 9-11; ou (iii) tem no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores compreendendo uma sequência tendo pelo menos 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência ao longo de todo o comprimento da SEQ ID NOS: 9-11; ou o Methylobacterium é NLS0109 ou um derivado do mesmo. Em certas modalidades dos métodos, o Methylobacterium sp. é selecionado a partir do grupo que consiste em M. aminovorans, M. extorquens, M. fujisawaense, M. mesophilicum, M. radiotolerans, M. rhodesianum, M. nodulans, M. phyllosphaerae, M thiocyanatum, e M. oryzae. Em certas modalidades dos métodos, o Methylobacterium não é M. radiotolerans ou M. oryzae. Em certas modalidades dos métodos, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos acima mencionados, a composição compreende adicionalmente a cepa de Methylobacterium NLS0017, NLS0020, NLS0021, NLS0042, NLS0064, NLS0066, NLS0089, um derivado dos mesmos, ou um Methylobacterium sp. relacionado com os mesmos. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos acima mencionados, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109. Em certas modalidades, a planta ou parte de planta é uma planta de soja ou parte de planta de soja. Em certas modalidades, a planta ou parte de planta é selecionada a partir do grupo que consiste em uma planta de arroz, trigo, milho, cevada, painço, sorgo, aveia e centeio ou parte de planta. Em certas modalidades dos métodos, o fungo patogênico de plantas é selecionado a partir do grupo que consiste em um Blumeria sp., um Cercospora sp., um Cochliobolus sp., um Colletotrichum sp., um Diplodia sp., um Exserohilum sp., um Fusarium sp., Gaeumanomyces sp., Macrophomina sp., um Magnaporthe sp., um Microdochium sp., um Peronospora sp., um Phakopsora sp., um Phialophora sp., um Phoma sp., um Phymatotrichum sp., um Phytophthora sp., um Pyrenophora sp., um Pyricularia sp, um Pythium sp., um Rhizoctonia sp., um Sclerophthora, um Sclerospora sp., um Sclerotium sp., um Sclerotinia sp., um Septoria sp., um Stagonospora sp., um Stenocarpella sp. e um Verticillium sp.
[0019] Em certas modalidades de qualquer das composições acima mencionadas, usos das mesmas, ou métodos, a mono ou cocultura de Methylobacterium é aderida a uma substância sólida. Em certas modalidades dos métodos, o Methylobacterium que é aderido à substância sólida é combinado com um líquido para formar uma composição que é um coloide. Em certas modalidades dos métodos, o coloide é um gel. Em certas modalidades dos métodos, a mono ou cocultura de Methylobacterium aderida à substância sólida é provida por cultura do Methylobacterium na presença da substância sólida. Em certas modalidades dos métodos, a composição compreende uma emulsão. Em certas modalidades dos métodos, o Methylobacterium é provido por cultura do Methylobacterium em uma emulsão. Em qualquer das modalidades acima mencionadas, o fungo patogênico de plantas que é inibido pode estar na sua forma anamórfica, na sua forma teleomórfica, ou nas suas formas anamórficas e teleomórficas. Em qualquer das modalidades acima mencionadas, a composição pode compreender adicionalmente um composto antifúngico selecionado a partir do grupo que consiste em um azol, ditiocarbamato, estrobilurina e benzimidazol. Em certas modalidades, o azol é ipconazol.
[0020] São também providos métodos para controlar um fungo patogênico de plantas que compreendem a aplicação de qualquer das composições acima mencionadas como uma primeira composição que contém uma ou mais Methylobacterium que inibem o crescimento de um fungo patogênico de plantas em uma planta ou em uma parte de planta, no solo em que uma planta é cultivada, no solo onde uma parte de planta como uma semente é depositada, ou qualquer combinação dos mesmos, em uma quantidade que provê a inibição da infecção pelo fungo patogênico de plantas na planta, parte de planta, ou uma planta obtida a partir da mesma em relação à infecção de uma planta de controle, parte de planta, ou planta obtida a partir da mesma que não tinha recebido uma aplicação da composição ou foi cultivada em solo tratado com a composição. Em certas modalidades, o Methylobacterium: (i) tem pelo menos um gene que codifica um 16S RNA tendo pelo menos 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 8; ; (ii) tem no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores de polinucleotídeos de pelo menos 50, 60, 100, 120, 180, 200, 240 ou 300 nucleotídeos da SEQ ID NOS: 9-11; ou (iii) tem no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores compreendendo uma sequência tendo pelo menos 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência ao longo de todo o comprimento da SEQ ID NOS: 9-11; ou o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou é um Methylobacterium relacionado com NLS0109. Em certas modalidades, o Methylobacterium contém no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores tendo uma sequência de SEQ ID NOS: 9-11.
[0021] Em certas modalidades de qualquer dos métodos ou usos acima mencionados, a aplicação da composição provê pelo menos uma inibição de 40%, 50%, 75%, pelo menos 85%, ou pelo menos 95% de uma infecção por fungo patogênico de plantas na dita planta, parte de planta, ou uma planta derivada da mesma em relação à infecção da planta de controle, parte de planta, ou planta obtida da mesma. Em certas modalidades dos métodos, a parte de planta é selecionada a partir do grupo que consiste em uma folha, um tronco, uma flor, uma raiz, um tubérculo e uma semente. Em certas modalidades dos métodos, o método compreende adicionalmente a etapa de colher pelo menos uma parte de planta selecionada a partir do grupo que consiste em uma folha, um tronco, uma flor, uma raiz, um tubérculo ou uma semente a partir da planta ou parte de planta. Em certas modalidades dos métodos, os níveis de micotoxinas na parte de planta são reduzidos em pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, ou pelo menos 95% em relação a uma parte de planta obtida da planta de controle, parte de planta ou planta obtida a partir da mesma. Em certas modalidades dos métodos acima mencionados, o método compreende adicionalmente a obtenção de uma composição alimentar ou alimento processado a partir da planta ou parte de planta. Em certas modalidades dos métodos acima mencionados, os níveis de micotoxinas na composição alimentar ou alimento processado são reduzidos em pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, ou pelo menos 95% em relação a uma composição alimentar ou alimento processado obtido da planta de controle, parte de planta ou planta obtida a partir da mesma. Em certas modalidades, uma quantidade inibidora de fungos do Methylobacterium é aplicada na parte de planta. Em certas modalidades, a quantidade inibidora de fungos do Methylobacterium aplicado em uma parte de planta (por exemplo, uma semente) é de cerca de 1,0x103, 1,0x104 ou 1,0x105 a cerca de 1,0x107 ou 1,0x108 , 1,0x109, ou 1,0x1010 UFCs de Methylobacterium/parte de planta (por exemplo, uma semente). Em certas modalidades, o Methylobacterium é heterólogo à planta ou parte de planta. Em certas modalidades de qualquer dos métodos acima mencionados, a parte de planta é uma folha, um tronco, uma flor, uma raiz, um tubérculo ou uma semente. Em certas modalidades dos métodos, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos acima mencionados, a composição compreende adicionalmente a cepa de Methylobacterium NLS0017, NLS0020, NLS0021, NLS0042, NLS0064, NLS0066, NLS0089, um derivado dos mesmos, ou um Methylobacterium sp. relacionado com os mesmos. Em certas modalidades, um derivado de NLS0020, NLS0017 ou NLS0089 ou um Methylobacterium sp. relacionado com NLS0020, NLS0017 ou NLS0089, pode ser identificado pela presença de um ou mais fragmentos marcadores tendo uma sequência de SEQ ID NO: 21-24, 37-39 ou 49-51. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos acima mencionados, o Methylobacterium é NLS0109 ou um derivado do mesmo. Em certas modalidades, a planta ou parte de planta é uma planta de soja ou parte de planta de soja, ou uma planta de amendoim ou parte de planta de amendoim. Em certas modalidades, a planta ou parte de planta é selecionada a partir do grupo que consiste em uma planta de arroz, trigo, milho, cevada, painço, sorgo, aveia e centeio ou parte de planta.
[0022] Em certas modalidades, os métodos podem adicionalmente compreender a aplicação de uma segunda composição no solo onde a planta é cultivada, em que a segunda composição compreende a cepa de Methylobacterium NLS0017, NLS0020, NLS0021, NLS0042, NLS0064, NLS0066, NLS0089, um derivado dos mesmos ou um Methylobacterium sp. relacionado com os mesmos. Em certas modalidades, a segunda composição é aplicada no solo no sulco com a parte de planta ou com uma semente a partir da qual a planta é cultivada. Em certas modalidades, a primeira composição é aplicada na folhagem da planta após a aplicação da segunda composição no solo. Em certas modalidades, a primeira composição compreende NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium sp. relacionado com o mesmo; e a segunda composição compreende a cepa de Methylobacterium NLS0020, NLS0021, NLS0017, um derivado dos mesmos, ou um Methylobacterium sp. relacionado com os mesmos. Em certas modalidades, a primeira composição compreende NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium sp. relacionado com o mesmo e um fungicida estrobilurina; e a segunda composição compreende a cepa de Methylobacterium NLS0020, NLS0021, NLS0017, um derivado dos mesmos, ou um Methylobacterium sp. relacionado com os mesmos.
[0023] Em certas modalidades, os métodos podem compreender adicionalmente a aplicação de um fungicida em uma planta, parte de planta ou solo. Em tais modalidades, o fungicida pode ser aplicado simultaneamente com um ou mais do Methylobacterium sp. ou pode ser aplicado como uma composição separada em uma planta ou parte de planta. Em certas modalidades, o fungicida é um fungicida de estrobilurina, uma fenilamida, uma tiazol-carboxamida, ou uma piperidinil-tiazol-isoxazolina. Em certas modalidades, o fungicida estrobilurina é selecionado a partir do grupo que consiste em azoxistrobina, piraclostrobina, fluoxistrobina e trifloxistrobina. Em certas modalidades, o fungicida estrobilurina é piraclostrobina. Em certas modalidades, o fungicida é metalaxil, mefenoxam, etaboxam ou oxatiapiprolina. Em certas modalidades de qualquer dos métodos acima mencionados, a combinação de Methylobacterium, cultura agrícola, patógeno, doença e/ou compostos antifúngicos é como apresentado na Tabela 4. Em certas modalidades, as composições aqui providas ou as plantas ou partes de plantas tratadas com as composições podem compreender adicionalmente um ou mais dos fungicidas acima mencionados.
[0024] Em certas modalidade, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109 e o fungo patogênico de plantas é um Fusarium sp., um Rhizoctonia sp., um Colletotrichum sp., um Cercospora sp., um Septoria sp., um Pythium sp., um Puccinia sp. ou um Sclerotinia sp. Em certas modalidades, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109, o fungo patogênico de plantas que é inibido é Fusarium graminearum, Septoria tritici, Stagonospora nodorum, Rhizoctonia solani, a Fusarium spp., Magnaportha grisea, Pyrenophora tritici-repentis, Microdochium nivale, Blumeria graminis f. sp. tritici, ou um Pythium sp., e a planta ou parte de planta é uma planta de trigo ou parte de planta. Em certas modalidades, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109, o fungo patogênico de plantas que é inibido é Cercospora zeae-maydis, Colletotrichum graminicola, Fusarium graminearum, Fusarium verticillioides, Gibberella zeae, Rhizoctonia solani, Stenocarpella maydis, um Pythium sp., Sclerospora graminicola ou Sclerophthora macrospora, e a planta ou parte de planta é uma planta de milho ou parte de planta de milho. Em certas modalidades, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109, o fungo patogênico de plantas que é inibido é Sclerotinia sclerotiorum, Cercospora sojina, Cercospora kikuchii, Fusarium spp., Rhizoctonia solani, Septoria glycines, Fusarium virguliforme, Pythium spp., Peronospora manshurica, ou Phytophthora sojae, e a planta ou parte de planta é uma planta de soja ou parte de planta de soja.
[0025] Também são providos Methylobacterium isolados que inibem o crescimento de um fungo patogênico de plantas. Em certas modalidades, o Methylobacterium sp. que inibe o crescimento de um fungo patogênico de plantas tem uma sequência de ácido nucleico 16S tendo pelo menos 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 8; ou o Methylobacterium é NLS0109 ou um derivado do mesmo. Em certas modalidades, o Methylobacterium isolado tem no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores de polinucleotídeos de pelo menos 50, 60, 100, 120, 180, 200, 240 ou 300 nucleotídeos da SEQ ID NOS: 9-11. Em certas modalidades, o Methylobacterium isolado tem no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores compreendendo uma sequência tendo pelo menos 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência ao longo de todo o comprimento da SEQ ID NOS: 9-11. Em certas modalidades dos métodos, o fungo patogênico de plantas é selecionado a partir do grupo que consiste em um Blumeria sp., um Cercospora sp., um Cochliobolus sp., um Colletotrichum sp., um Diplodia sp., um Exserohilum sp., um Fusarium sp., Gaeumanomyces sp., Macrophomina sp., um Magnaporthe sp., um Microdochium sp., um Peronospora sp., um Phakopsora sp., um Phialophora sp., um Phoma sp., um Phymatotrichum sp., um Phytophthora sp., um Pyrenophora sp., um Pyricularia sp, um Pythium sp., um Rhizoctonia sp., um Sclerophthora, a Sclerospora sp., um Sclerotium sp., um Sclerotinia sp., um Septoria sp., um Stagonospora sp., um Stenocarpella sp. e um Verticillium sp.
[0026] Em qualquer das modalidades acima mencionadas, o fungo patogênico de plantas que é inibido pode estar na sua forma anamórfica, na sua forma teleomórfica, ou nas suas formas anamórficas e teleomórficas. O uso de qualquer um dos Methylobacterium isolados acima mencionados para inibir o crescimento de qualquer um dos fungos patogênicos de plantas acima mencionados é também aqui provido.
Breve descrição dos desenhos
[0027] Os desenhos anexos, que são incorporados e fazem parte do relatório descritivo, ilustram certas modalidades da presente descrição. Nos desenhos:
[0028] A Figura 1 é um gráfico de barras que mostra a supressão da gravidade dos sintomas da murcha de mofo branco na soja por NLS0109. As barras brancas representam a média para controles falso-inoculados (ou inoculados de forma simulada); as barras cinzas representam a média para todas as plantas inoculadas dentro de cada grupo de tratamento. As médias são calculadas a partir de três experimentos independentes com oito vasos replicados por experimento (n = 24). Barras de erros representam ± um SEM. A gravidade foi classificada em uma escala de 0 a 5, com 0 = sem desenvolvimento de sintomas e 5 = planta morta.
[0029] A Figura 2 é um gráfico de barras que mostra a supressão do desenvolvimento da extensão da lesão de mofo branco na soja por NLS0109. As barras brancas representam a média para controles falso-inoculados (ou inoculados de forma simulada); as barras cinzas representam a média para todas as plantas inoculadas dentro de cada grupo de tratamento. As médias são calculadas a partir de três experimentos independentes com oito vasos replicados por experimento (n = 24). Barras de erros representam ± um SEM. A extensão da lesão foi medida até o milímetro mais próximo usando uma régua mantida contra a planta infectada.
[0030] A Figura 3 é um gráfico de barras que mostra o efeito aditivo na redução da gravidade da doença cercosporiose tardia no milho da aplicação no sulco de NLS0020 seguida por aplicação foliar de NL0109. As aplicações foram feitas durante a temporada de campo de 2015 em um local de ensaios em Bethel, MO. O NLS0020 foi aplicado no sulco a uma taxa de 1.250 mL/A e o NLS0109 foi aplicado a uma taxa foliar de 5.000 mL/A.
[0031] A Figura 4 é um gráfico de linhas que mostra o progresso da gravidade da doença cercosporiose ao longo do tempo em plantas de milho tratadas com cepas de PPFM, vários fungicidas comerciais e suas combinações. Grupos de dez plantas foram tratados com vários tratamentos com PPFM e fungicidas representando práticas padrão de gestão de doenças ou regimes alternativos de tratamento com PPFM isolados ou em combinação com produtos químicos convencionais. Os dados de incidência e gravidade da doença foram coletados aos 14, 21 e 28 dias após a inoculação e usados para calcular os valores do índice de doença [(incidência * gravidade)/100].
DESCRIÇÃO Definições
[0032] Como aqui utilizado, as frases “aderida à mesma” e “aderente” referem-se aos Methylobacterium que estão associados a uma substância sólida por cultivo, ou tendo sido cultivadas, em uma substância sólida.
[0033] Tal como aqui utilizada, a frase “adjuvante agriculturalmente aceitável” refere-se a uma substância que melhora o desempenho de um agente ativo em uma composição que compreende uma monocultura ou cocultura de Methylobacterium para o tratamento de plantas e/ou partes de plantas.
[0034] Como aqui utilizado, a frase “excipiente agriculturalmente aceitável” refere-se a uma substância essencialmente inerte que pode ser utilizada como um diluente e/ou veículo para um agente ativo em uma composição para o tratamento de plantas e/ou partes de plantas. Em certas composições, um agente ativo pode compreender uma monocultura ou cocultura de Methylobacterium.
[0035] Como aqui utilizado, a frase “derivados dos mesmos”, quando usado no contexto de uma cepa de Methylobacterium, ou isolado refere-se a qualquer cepa ou isolado que é obtido a partir de uma dada cepa de Methylobacterium. Os derivados de uma cepa de Methylobacterium incluem, mas não se limitam a, variantes da cepa obtida por seleção, variantes da cepa selecionadas por mutagênese e seleção, variantes das cepas resultantes de mutações não selecionadas resultantes do cultivo em cultura durante uma ou mais gerações, e cepas geneticamente transformadas obtidas de uma cepa de Methylobacterium.
[0036] Como aqui utilizado, o termo “Methylobacterium” refere-se a bactérias que são metilotróficas facultativas do gênero Methylobacterium. O termo Methylobacterium, como usado aqui, não inclui espécies nos gêneros Methylobacter, Methylomonas, Methylomicrobium, Methylococcus, Methylosinus, Methylocystis, Methylosphaera, Methylocaldum, e Methylocella, que são metanotróficas obrigatórias.
[0037] Como aqui utilizado, a frase “cocultura de Methylobacterium” refere-se a uma cultura de Methylobacterium compreendendo pelo menos duas cepas de Methylobacterium ou pelo menos duas espécies de Methylobacterium.
[0038] Como aqui utilizado, o termo “cultivar” refere-se a qualquer planta conhecida apenas no cultivo e inclui plantas propagadas assexuadamente, plantas propagadas sexuadamente, linhas puras e híbridos.
[0039] Como aqui utilizado, a frase “microrganismo contaminante” refere-se a microrganismos em uma cultura, caldo de fermentação, produto de caldo de fermentação ou composição que não foram identificados antes da introdução na cultura, caldo de fermentação, produto de caldo de fermentação ou composição.
[0040] Como aqui utilizado, o termo “emulsão” refere-se a uma mistura coloidal de dois líquidos imiscíveis em que um líquido é a fase contínua e o outro líquido é a fase dispersa. Em certas modalidades, a fase contínua é um líquido aquoso e a fase dispersa é líquido que não é miscível, ou parcialmente miscível, no líquido aquoso.
[0041] Como aqui utilizado, a frase “essencialmente isento de microrganismos contaminantes” refere-se a uma cultura, caldo de fermentação, produto de fermentação ou composição em que pelo menos cerca de 95% dos microrganismos presentes pela quantidade ou tipo na cultura, caldo de fermentação, produto de fermentação, ou composição são os Methylobacterium desejados ou outros microrganismos desejados de identidade pré-determinada.
[0042] Como usado aqui, a frase “uma concentração inibidora de fungos da mono ou cocultura de Methylobacterium” é uma concentração que provê pelo menos 40%, 50%, 75%, pelo menos 85%, ou pelo menos 95% de inibição de uma infecção por fungo patogênico de plantas em uma planta, parte de planta, ou uma planta derivada da mesma em relação à infecção da planta de controle ou parte de planta.
[0043] Como usado aqui, o termo “heterólogo”, quando usado no contexto de Methylobacterium que reveste pelo menos parcialmente uma planta ou parte de planta, refere-se a um Methylobacterium que não está naturalmente associado a uma planta ou parte de planta da mesma espécie que a planta ou parte de planta que é revestida pelo menos parcialmente com o Methylobacterium. Em certas modalidades, o Methylobacterium heterólogo que é utilizado para revestir pelo menos parcialmente uma planta ou parte de planta de uma primeira espécie de planta é um Methylobacterium que foi isolado, ou pode ser isolado, a partir de uma segunda espécie de planta distinta.
[0044] Como aqui utilizado, a frase “substância sólida inanimada” refere-se a uma substância que é insolúvel ou parcialmente solúvel em água ou soluções aquosas e que é não viva ou que não faz parte de um organismo ainda vivo do qual foi derivada.
[0045] Como usado aqui, a frase “um Methylobacterium relacionado com NLS0109” pode referir-se a um Methylobacterium que: (i) tem pelo menos um gene que codifica um 16S RNA tendo pelo menos 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 8; ; (ii) tem no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores de polinucleotídeos de pelo menos 50, 60, 100, 120, 180, 200, 240 ou 300 nucleotídeos da SEQ ID NOS: 9-11; ou (iii) tem no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores compreendendo uma sequência tendo pelo menos 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência ao longo de todo o comprimento das SEQ ID NOS: 9-11.
[0046] Como aqui utilizado, a frase “monocultura de Methylobacterium” refere-se a uma cultura de Methylobacterium consistindo em uma única cepa de Methylobacterium.
[0047] Como aqui utilizado, um “pesticida” refere-se a um agente que é inseticida, fungicida, nematocida, bactericida ou qualquer combinação dos mesmos.
[0048] Como usado aqui, a frase “agente bacteriostático” refere-se a agentes que inibem o crescimento de bactérias mas não matam as bactérias.
[0049] Como aqui utilizado, a frase “pesticida não inibe substancialmente o crescimento do Methylobacterium” refere-se a qualquer pesticida que quando provido em uma composição compreendendo um produto de fermentação compreendendo uma substância sólida em que uma monocultura ou cocultura de Methylobacterium é aderida à mesma, resulta em não mais do que uma inibição de 50% do crescimento de Methylobacterium quando a composição é aplicada em uma planta ou parte de planta em comparação com uma composição sem o pesticida. Em certas modalidades, o pesticida resulta em não mais do que 40%, 20%, 10%, 5% ou 1% de inibição do crescimento de Methylobacterium quando a composição é aplicada em uma planta ou parte de planta em comparação com uma composição sem o pesticida.
[0050] Como aqui utilizado, o termo “bactérias PPFM” refere-se sem limitação a espécies bacterianas no gênero Methylobacterium diferentes de M. nodulans.
[0051] Como aqui utilizado, a frase “substância sólida” refere-se a uma substância que é insolúvel ou parcialmente solúvel em água ou soluções aquosas.
[0052] Como usado aqui, a frase “fase sólida que pode ser suspensa no mesmo” refere-se a uma substância sólida que pode ser distribuída por todo um líquido por agitação.
[0053] Como usado aqui, o termo “não regenerável” refere-se a uma parte de planta ou produto vegetal processado que não pode ser regenerado em uma planta inteira.
[0054] Como aqui utilizado, a frase “substancialmente toda a fase sólida é suspensa na fase líquida” refere-se a meios em que pelo menos 95%, 98% ou 99% da(s) substância(s) sólida(s) compreendendo a fase sólida são distribuídas por todo o líquido por agitação.
[0055] Como usado aqui, a frase “substancialmente toda a fase sólida não é suspensa na fase líquida” refere-se a meios onde menos de 5%, 2% ou 1% do sólido está em uma forma particulada que é distribuída por todo o meio por agitação.
[0056] Como qualquer uma das definições anteriores é inconsistente com as definições providas em qualquer patente ou referência não patentária aqui incorporada por referência, qualquer patente ou referência não patentária aqui citada, ou em qualquer patente ou referência não patentária encontrada em outro lugar, entende-se que a definição precedente será usada aqui.
Methylobacterium que inibe fungos patogênicos de plantas, composições compreendendo Methylobacterium que inibe fungos patogênicos de plantas, métodos de seu uso e métodos de preparação
[0057] Vários Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas, composições que compreendem estes Methylobacterium, métodos de uso das composições para inibir os fungos patogênicos de plantas e métodos de preparação das composições são aqui providos. Tal como aqui utilizado, a inibição do crescimento de um fungo patogênico de plantas inclui qualquer diminuição mensurável no crescimento dos fungos, em que o crescimento fúngico inclui, mas não está limitado a qualquer diminuição mensurável nos números e/ou extensão das células fúngicas, esporos, conídios ou micélios. Como aqui utilizado, a inibição de infecção por um fungo patogênico de plantas e/ou a inibição do crescimento de um fungo patogênico de plantas são também entendidas como incluindo qualquer diminuição mensurável nos efeitos adversos causados pelo crescimento fúngico em uma planta. Os efeitos adversos do crescimento fúngico em uma planta incluem, mas não estão limitados a, qualquer tipo de dano tecidual ou necrose da planta, qualquer tipo de redução de rendimento da planta, qualquer redução no valor do produto vegetal da cultura agrícola e/ou produção de metabólitos de fungos indesejáveis ou subprodutos do crescimento fúngico incluindo, mas não se limitando a, micotoxinas. Os fungos patogênicos de plantas que são inibidos pelas composições e Methylobacterium aqui providos podem estar na sua forma anamórfica, na sua forma teleomórfica, ou nas suas formas anamórficas e teleomórficas.
[0058] Methylobacterium e composições compreendendo os mesmos que inibem o crescimento de um fungo patogênico de plantas são aqui providos. Em certas modalidades, o Methylobacterium ou composição provê pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 75% de inibição do crescimento de fungos patogênicos de plantas em comparação com um tratamento de controle após exposição a um fungo patogênico de plantas. Em certas modalidades, o fungo patogênico de plantas que é inibido é selecionado a partir do grupo que consiste em um Blumeria sp., um Cercospora sp., um Cochliobolus sp., um Colletotrichum sp., um Diplodia sp., um Exserohilum sp., um Fusarium sp., Gaeumanomyces sp., Macrophomina sp., um Magnaporthe sp., um Microdochium sp., um Peronospora sp., um Phakopsora sp., um Phialophora sp., um Phoma sp., um Phymatotrichum sp., um Phytophthora sp., um Pyrenophora sp., um Pyricularia sp, um Pythium sp., um Rhizoctonia sp., um Sclerophthora sp., um Sclerospora sp., um Sclerotium sp., um Sclerotinia sp., um Septoria sp., um Stagonospora sp., um Stenocarpella sp. e um Verticillium sp.
[0059] Em certas modalidades, o fungo patogênico de plantas que é inibido é um Fusarium sp. Em certas modalidades, o Fusarium sp. que é inibido é selecionado a partir do grupo que consiste em Fusarium graminearum, Fusarium verticillioides, Fusarium oxysporum, Fusarium virguliforme, e Fusarium solani. Em certas modalidades, o Methylobacterium isolado é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109. Em certas modalidades, o Methylobacterium relacionado com NLS0109 inclui, mas não está limitado a, (i) Methylobacterium sp. que inibe o crescimento de um fungo patogênico de plantas e que tem um gene que codifica uma sequência de RNA 16S que tem, pelo menos, 97%, 98%, 99%, 99,5%, ou 100% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 8; (ii) um Methylobacterium tem no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores de polinucleotídeos de, pelo menos, 50, 60, 100, 120, 180, 200, 240, ou 300 nucleotídeos de SEQ ID NOS: 9-11; ou (iii) é um Methylobacterium que tem no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores compreendendo uma sequência tendo pelo menos 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência ao longo de todo o comprimento da SEQ ID NOS: 9-11. Em certas modalidades, a composição compreende adicionalmente a cepa de Methylobacterium NLS0017, NLS0020, NLS0021, NLS0042, NLS0064, NLS0066, NLS0089, um derivado dos mesmos, ou um Methylobacterium sp. relacionado com os mesmos. Os fungos patogênicos de plantas que são inibidos pelas composições e Methylobacterium aqui providos podem estar na sua forma anamórfica, na sua forma teleomórfica, ou nas suas formas anamórficas e teleomórficas.
[0060] Também são providas composições que compreendem Methylobacterium que inibem o crescimento de um fungo patogênico de plantas. Em certas modalidades, as composições compreendem adicionalmente um excipiente agriculturalmente aceitável e/ou um adjuvante agriculturalmente aceitável. Em certas modalidades, a composição provê pelo menos cerca de 25%, cerca de 50%, ou cerca de 75% de inibição do crescimento de fungos patogênicos de plantas em comparação com um tratamento de controle após exposição a um fungo patogênico de plantas. Em certas modalidades, o fungo patogênico de plantas que é inibido é selecionado a partir do grupo que consiste em um Blumeria sp., um Cercospora sp., um Cochliobolus sp., um Colletotrichum sp., um Diplodia sp., um Exserohilum sp., um Fusarium sp., Gaeumanomyces sp., Macrophomina sp., um Magnaporthe sp., um Microdochium sp., um Peronospora sp., um Phakopsora sp., um Phialophora sp., um Phoma sp., um Phymatotrichum sp., um Phytophthora sp., um Pyrenophora sp., um Pyricularia sp, um Pythium sp., um Rhizoctonia sp., um Sclerophthora, um Sclerospora sp., um Sclerotium sp., um Sclerotinia sp., um Septoria sp., um Stagonospora sp., um Stenocarpella sp. e um Verticillium sp.
[0061] Em certas modalidades, o fungo patogênico de plantas que é inibido é um Fusarium sp. Em certas modalidades, o Fusarium sp. que é inibido é selecionado a partir do grupo que consiste em Fusarium graminearum, Fusarium verticillioides, Fusarium oxysporum, Fusarium virguliforme, e Fusarium solani. Em certas modalidades de qualquer das composições acima mencionadas, a composição compreende uma substância sólida em que uma monocultura ou cocultura de Methylobacterium é aderida à mesma. Em certas modalidades onde o Methylobacterium é aderido a uma substância sólida, a composição compreende um coloide formado pela substância sólida em que uma monocultura ou cocultura de Methylobacterium é aderida à mesma e um líquido. Em certas modalidades, o coloide é um gel. Em certas modalidades de certas composições acima mencionadas, a composição é uma emulsão que não contém uma substância sólida. Em certas modalidades de qualquer uma das composições acima mencionadas, o Methylobacterium sp. que inibe o crescimento de um fungo patogênico de plantas tem um gene que codifica uma sequência de RNA 16S que tem pelo menos 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 8. Em certas modalidades de qualquer uma das composições acima mencionadas, o Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109. Em certas modalidades de qualquer uma das composições acima mencionadas, a composição compreende adicionalmente a cepa de Methylobacterium NLS0017, NLS0020, NLS0021, NLS0042, NLS0064, NLS0066, NLS0089, um derivado dos mesmos, ou um Methylobacterium sp. relacionado com os mesmos. Em qualquer das modalidades acima mencionadas, os fungos patogênicos de plantas que são inibidos podem estar na sua forma anamórfica, na sua forma teleomórfica, ou nas suas formas anamórficas e teleomórficas.
[0062] Em certas modalidades, o Methylobacterium sp. que inibe os fungos patogênicos de plantas pode ser identificado testando o Methylobacterium sp. candidato recém-isolado quanto à presença de ácido nucleico polimórfico, gene ortólogo ou sequências de genes que estão presentes em Methylobacterium sp. providos aqui que inibem certos fungos patogênicos de plantas.
[0063] Vários isolados de Methylobacterium sp. aqui providos são descritos na Tabela 1. Tabela 1. Isolados de Methylobacterium sp.
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[0064] 1Número de depósito para cepa depositada na AGRICULTURAL RESEARCH SERVICE CULTURE COLLECTION (NRRL) do National Center for Agricultural Utilization Research, Agricultural Research Service, Departamento de Agricultura dos EUA, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 EUA sob os termos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para Fins do Procedimento de Patentes (International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure). Sujeitas ao 37 CFR §1.808 (b), todas as restrições impostas pelo depositante sobre a disponibilidade ao público do material depositado serão irrevogavelmente removidas mediante a concessão de qualquer patente a partir deste pedido de patente.
[0065] Além disso são providos aqui métodos para controlar um fungo patogênico de plantas que compreendem a aplicação de qualquer uma das composições acima mencionadas compreendendo o Methylobacterium que são aqui providas em uma planta ou uma parte de planta em uma quantidade que provê inibição da infecção pelo fungo patogênico de plantas na planta, parte de planta, ou uma planta obtida a partir da mesma em relação à infecção de uma planta de controle, parte de planta, ou planta obtida a partir da mesma que não tenha recebido uma aplicação da composição. Em certas modalidades, a aplicação da composição provê pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 95% de inibição de uma infecção por fungo patogênico de plantas na dita planta, parte de planta, ou uma planta derivada da mesma em relação à infecção da planta de controle, parte de planta, ou planta obtida da mesma. Em certas modalidades, a parte de planta é selecionada a partir do grupo que consiste em uma folha, um tronco, uma flor, uma raiz, um tubérculo e uma semente. Em certas modalidades, o método compreende adicionalmente a etapa de colher pelo menos uma parte de planta selecionada a partir do grupo que consiste em uma folha, um tronco, uma flor, uma raiz, um tubérculo ou uma semente a partir da planta ou parte de planta. Em certas modalidades de qualquer dos métodos acima mencionados, os níveis de micotoxinas na parte de planta são reduzidos em pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, ou pelo menos 95% em relação a uma parte de planta obtida da planta de controle, parte de planta ou planta obtida a partir da mesma. Em certas modalidades de qualquer dos métodos acima mencionados, os métodos compreendem adicionalmente a obtenção de uma composição alimentar ou alimento processado a partir da planta ou parte de planta. Em certas modalidades dos métodos acima mencionados, os níveis de micotoxinas na composição alimentar ou alimento processado são reduzidos em pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, ou pelo menos 95% em relação a uma composição alimentar ou alimento processado obtido da planta de controle, parte de planta ou planta obtida a partir da mesma. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos acima mencionados, a composição compreende o isolado de Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos acima mencionados, a composição compreende adicionalmente a cepa de Methylobacterium NLS0017, NLS0020, NLS0021, NLS0042, NLS0064, NLS0066, NLS0089, um derivado dos mesmos, ou um Methylobacterium sp. relacionado com os mesmos. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos acima mencionados, a composição compreende um Methylobacterium sp. relacionado com NLS0109 que: (i) tem pelo menos um gene que codifica um 16S RNA que tem pelo menos 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 8; (ii) tem no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores de polinucleotídeos de pelo menos 50, 60, 100, 120, 180, 200, 240 ou 300 nucleotídeos da SEQ ID NOS: 9-11; ou (iii) tem no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores compreendendo uma sequência tendo pelo menos 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência ao longo de todo o comprimento da SEQ ID NOS: 9-11. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos acima mencionados, a composição compreende um Methylobacterium sp. relacionado com NLS0017, NLS0020, NLS0021, NLS0042, NLS0064, NLS0066 ou NLS0089 que tem pelo menos um gene que codifica um 16S RNA que tem pelo menos 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de seqüência à SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, respectivamente. Tabela 2. Sequências de RNA 16S de cepas de Methylobacterium
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[0066] São também providos métodos de tornar as composições úteis para controlar fungos patogênicos de plantas que compreendem a combinação de um Methylobacterium que inibe o crescimento de um fungo patogênico de plantas com um excipiente agriculturamente aceitável e/ou com um adjuvante agriculturamente aceitável. Em certas modalidades dos métodos, o Methylobacterium não é M. radiotolerans ou M. oryzae. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos acima mencionados, a composição compreende um Methylobacterium sp. relacionado com NLS0109 que tem; (i) pelo menos um gene que codifica um 16S RNA que tem pelo menos 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de seqüência à SEQ ID NO: 8; (ii) no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores de polinucleotídeos de pelo menos 50, 60, 100, 120, 180, 200, 240 ou 300 nucleotídeos da SEQ ID NOS: 9-11; ou (iii) no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores compreendendo uma sequência tendo pelo menos 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência ao longo de todo o comprimento da SEQ ID NOS: 911. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos acima mencionados, a composição compreende o isolado de Methylobacterium é NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium relacionado com NLS0109. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos acima mencionados, a composição compreende adicionalmente a cepa de Methylobacterium NLS0017, NLS0020, NLS0021, NLS0042, NLS0064, NLS0066, NLS0089, um derivado dos mesmos, ou um Methylobacterium sp. relacionado com os mesmos. Em certas modalidades dos métodos, as composições proveem pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 75% de inibição do crescimento de fungos patogênicos de plantas em comparação com uma composição de controle que não possui Methylobacterium que inibe um fungo patogênico de plantas após a exposição ao fungo patogênico de plantas. Em certas modalidades dos métodos, o fungo patogênico de plantas é selecionado a partir do grupo que consiste em um Blumeria sp., um Cercospora sp., um Cochliobolus sp., um Colletotrichum sp., um Diplodia sp., um Exserohilum sp., um Fusarium sp., Gaeumanomyces sp., Macrophomina sp., um Magnaporthe sp., um Microdochium sp., um Peronospora sp., um Phakopsora sp., um Phialophora sp., um Phoma sp., um Phymatotrichum sp., um Phytophthora sp., um Pyrenophora sp., um Pyricularia sp, um Pythium sp., um Rhizoctonia sp., um Sclerophthora, a Sclerospora sp., um Sclerotium sp., um Sclerotinia sp., um Septoria sp., um Stagonospora sp., um Stenocarpella sp. e um Verticillium sp.
[0067] Em certas modalidades dos métodos, o Fusarium sp. é selecionado a partir do grupo que consiste em Fusarium graminearum, Fusarium verticillioides, Fusarium oxysporum, e Fusarium solani. Em certas modalidades dos métodos, o Methylobacterium é aderido a uma substância sólida. Em certas modalidades dos métodos, o Methylobacterium aderido à substância sólida é combinado com um líquido para formar uma composição que é um coloide. Em certas modalidades dos métodos, o coloide é um gel. Em certas modalidades dos métodos, o Methylobacterium aderido à substância sólida é provido por cultura do Methylobacterium na presença da substância sólida. Em certas modalidades dos métodos, a composição compreende uma emulsão. Em certas modalidades dos métodos, o Methylobacterium é provido por cultura do Methylobacterium em uma emulsão. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos acima mencionados, o fungo patogênico de plantas é um Fusarium sp. e/ou a planta é uma planta de cereal. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos acima mencionados, o fungo patogênico de plantas é um Fusarium sp. e a planta é uma planta de cereal selecionada a partir do grupo que consiste em uma planta de arroz, trigo, milho, cevada, painço, sorgo, aveia e centeio. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos acima mencionados, o fungo patogênico de plantas é Fusarium graminearum e a planta é uma planta de cereal selecionada a partir do grupo que consiste em uma planta de arroz, trigo, milho, cevada, painço, sorgo, aveia e centeio. Em qualquer das modalidades acima mencionadas, o fungo patogênico de plantas que é inibido pode estar na sua forma anamórfica, na sua forma teleomórfica, ou nas suas formas anamórficas e teleomórficas.
[0068] Verificou-se que os métodos em que o Methylobacterium é cultivado em meios bifásicos compreendendo uma fase líquida e uma substância sólida aumentam significativamente o rendimento resultante de Methylobacterium em relação aos métodos onde o Methylobacterium é cultivado isoladamente em meio líquido. Em certas modalidades, os métodos podem compreender o cultivo do Methylobacterium em meio líquido com uma substância sólida particulada que pode ser suspensa no líquido por agitação sob condições que proveem o crescimento de Methylobacterium. Em certas modalidades em que as substâncias sólidas particuladas são utilizadas, pelo menos substancialmente toda a fase sólida pode, portanto, ser suspensa na fase líquida após agitação. Tais substâncias sólidas particuladas podem compreender materiais que têm cerca de 1 milímetro ou menos de comprimento ou diâmetro. Em certas modalidades, o grau de agitação é suficiente para prover uma distribuição uniforme da substância sólida particulada na fase líquida e/ou níveis ótimos de aeração da cultura. No entanto, em outras modalidades aqui providas, pelo menos substancialmente toda a fase sólida não é suspensa na fase líquida, ou porções da fase sólida são suspensas na fase líquida e porções da fase sólida não são suspensas na fase líquida. Substâncias sólidas não particuladas podem ser usadas em certos meios bifásicos onde a fase sólida não é suspensa na fase líquida. Tais substâncias sólidas não particuladas incluem, mas não estão limitadas a, materiais que são maiores do que cerca de 1 milímetro de comprimento ou diâmetro. Tais substâncias sólidas particuladas e não particuladas também incluem, mas não estão limitadas a, materiais que são porosos, fibrosos, ou de outro modo configurados para prover áreas de superfície aumentadas para o crescimento aderente do Methylobacterium. Meios bifásicos em que porções da fase sólida são suspensas na fase líquida e porções da fase sólida não são suspensas na fase líquida podem compreender uma mistura de substâncias sólidas particuladas e não particuladas. Tais substâncias sólidas particuladas e não particuladas usadas em qualquer um dos meios bifásicos acima mencionados também incluem, mas não estão limitadas a, materiais que são porosos, fibrosos, ou de outro modo configurados para prover áreas de superfície aumentadas para o crescimento aderente do Methylobacterium. Em certas modalidades, o meio compreende um coloide formado por uma fase sólida e uma líquida. Um coloide compreendendo um sólido e um líquido pode ser pré-formado e adicionado a meios líquidos ou pode ser formado em meios contendo um sólido e um líquido. Os coloides compreendendo um sólido e um líquido podem ser formados submetendo certas substâncias sólidas a uma alteração química e/ou térmica. Em certas modalidades, o coloide é um gel. Em certas modalidades, a fase líquida do meio é uma emulsão. Em certas modalidades, a emulsão compreende um líquido aquoso e um líquido que não é miscível, ou apenas parcialmente miscível, no líquido aquoso. Líquidos que não são miscíveis, ou apenas parcialmente miscíveis, na água incluem, mas não estão limitados a, qualquer um dos seguintes: (1) líquidos com uma miscibilidade em água igual ou inferior à do pentanol, hexanol ou heptanol a 25 graus C; (2) líquidos compreendendo um álcool, um aldeído, uma cetona, um ácido graxo, um fosfolipídio ou qualquer combinação dos mesmos; (3) álcoois seleccionados a partir do grupo que consiste em álcoois alifáticos contendo pelo menos 5 carbonos e esteróis; (4) um óleo animal, óleo microbiano, óleo sintético, o óleo vegetal, ou uma combinação destes; e/ou (5) um óleo vegetal selecionado a partir do grupo que consiste em milho, soja, algodão, amendoim, girassol, azeite, linho, coco, palma, colza, semente de sésamo, cártamo e combinações dos mesmos. Em certas modalidades, o líquido imiscível ou parcialmente imiscível pode compreender pelo menos cerca de 0,02% a cerca de 20% da fase líquida em massa. Em certas modalidades, os métodos podem compreender a obtenção de um meio de cultura bifásico compreendendo o líquido, o sólido e o Methylobacterium e a incubação da cultura sob condições que proveem o crescimento do Methylobacterium. Os meios de cultura bifásicos compreendendo o líquido, o sólido e o Methylobacterium podem ser obtidos por uma variedade de métodos que incluem, mas não estão limitados a, qualquer um dos seguintes: (a) inocular um meio bifásico compreendendo o líquido e a substância sólida com Methylobacterium; (b) inocular a substância sólida com Methylobacterium e, em seguida, introduzir a substância sólida que compreende o Methylobacterium no meio líquido; (c) inocular a substância sólida com Methylobacterium, incubar o Methylobacterium na substância sólida, e depois introduzir a substância sólida compreendendo o Methylobacterium no meio líquido; ou (d) qualquer combinação de (a), (b) ou (c). Os métodos e composições para o crescimento do Methylobacterium em meios bifásicos compreendendo um líquido e um sólido são descritos na Publicação do Pedido de Patente dos EUA N° 20130324407 cedida ao mesmo cessionário, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
[0069] Verificou-se também que os métodos em que os Methylobacterium são cultivados em meios compreendendo uma emulsão aumentam significativamente o rendimento resultante de Methylobacterium em relação aos métodos onde o Methylobacterium é cultivado isoladamente em meio líquido. Em certas modalidades, os métodos para preparar as composições aqui providas podem compreender o crescimento do Methylobacterium em uma emulsão sob condições que proveem o crescimento de Methylobacterium. Os meios compreendendo a emulsão e o Methylobacterium podem ser obtidos por uma variedade de métodos que incluem, mas não estão limitados a, qualquer um dos seguintes: (a) inocular um meio compreendendo a emulsão com Methylobacterium; (b) inocular o líquido aquoso com o Methylobacterium, introduzir o líquido não aquoso, e misturar para formar uma emulsão; (C) inocular o líquido aquoso com o Methylobacterium, introduzir o líquido não aquoso, e misturar para formar uma emulsão; ou (d) qualquer combinação de (a), (b) ou (c). Em certas modalidades, a emulsão compreende um líquido aquoso e um líquido que não é miscível, ou apenas parcialmente miscível, no líquido aquoso. Líquidos não aquosos que não são miscíveis, ou apenas parcialmente miscíveis, na água incluem, mas não estão limitados a, qualquer um dos seguintes: (1) líquidos com uma miscibilidade em água igual ou inferior à do n-pentanol, n-hexanol ou n-heptanol a 25 graus C; (2) líquidos compreendendo um álcool, um aldeído, uma cetona, um ácido graxo, um fosfolipídio ou qualquer combinação dos mesmos; (3) álcoois selecionados a partir do grupo que consiste em álcoois alifáticos contendo pelo menos 5, 6 ou 7 carbonos e esteróis; (4) um óleo animal, óleo microbiano, óleo sintético, o óleo vegetal, ou uma combinação destes; e/ou (5) um óleo vegetal selecionado a partir do grupo que consiste em milho, soja, algodão, amendoim, girassol, azeite, linho, coco, palma, colza, semente de sésamo, cártamo e combinações dos mesmos. Em certas modalidades, o líquido não aquoso imiscível ou parcialmente imiscível pode compreender pelo menos cerca de 0,02% a cerca de 20% da emulsão em massa. Em certas modalidades, o líquido não aquoso imiscível ou parcialmente imiscível pode compreender pelo menos cerca de qualquer de cerca de 0,05%, 0,1%, 0,5% ou 1% a cerca de 3%, 5%, 10% ou 20% da emulsão em massa. Os métodos e composições para o cultivo de Methylobacterium em meios compreendendo uma emulsão são descritos no Pedido de Patente dos EUA No 14/894.568 cedido ao mesmo cessionário, depositado em 30 de maio de 2014, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0070] Em certas modalidades, o caldo de fermentação, o produto de caldo de fermentação, ou composições que compreendem Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas podem compreender adicionalmente um ou mais microrganismos introduzidos de identidade pré- determinada diferente de Methylobacterium. Outros microrganismos que podem ser adicionados incluem, mas não estão limitados a, microrganismos que são biopesticidas ou proveem algum outro benefício quando aplicados em uma planta ou parte de planta. Microrganismos biopesticidas ou de outra forma benéficos incluem assim, mas não estão limitados a, vários Bacillus sp., Pseudomonas sp., Coniothyrium sp., Pantoea sp., Streptomyces sp., e Trichoderma sp, bem como bioinoculantes para melhor fixação de nitrogênio, incluindo espécies de rizóbios tais como de Rhizobium ou Bradyrhizobium, biopesticidas microbianos podem ser uma bactéria, fungo, vírus ou protozoários. Microrganismos biopesticidas particularmente úteis incluem várias cepas de Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus pumilis, Pseudomonas syringae, Trichoderma harzianum, Trichoderma virens, e Streptomyces lydicus. Outros microrganismos que são adicionados podem ser geneticamente modificados ou isolados que estão disponíveis como culturas puras. Em certas modalidades, é antecipado que o microrganismo bacteriano ou fúngico pode ser provido no caldo de fermentação, no produto do caldo de fermentação ou na composição na forma de um esporo.
[0071] Em certas modalidade, o meio de cultura líquido é preparado a partir de componentes de baixo custo e facilmente disponíveis, incluindo, mas não limitados a, sais inorgânicos tais como fosfato de potássio, sulfato de magnésio e semelhantes, fontes de carbono, tais como glicerol, metanol, ácido glutâmico, ácido aspártico, ácido succínico e semelhantes, e misturas de aminoácidos, tais como peptona, triptona, e semelhantes. Exemplos de meios líquidos que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, meio de sais minerais de amônio (AMS) (Whittenbury et al., 1970), meio de cultura mínimo de Vogel-Bonner (VB) (Vogel e Bonner, 1956), e Caldo LB (“Caldo Luria - Brett”).
[0072] São aqui providos produtos e composições de fermentação com mono ou cocultura de Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas a um título maior do que cerca de 5 x 107 unidades formadoras de colônias por mililitro, a um título maior do que cerca de 1 x 108 unidades formadoras de colônias por mililitro, a um título maior do que cerca de 5 x 108 unidades formadoras de colônias por mililitro, a um título maior do que cerca de 1 x 109 unidades formadoras de colônias por mililitro, a um título maior do que cerca de 1 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro, a um título de pelo menos cerca de 3 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro. Em certas modalidades, os produtos e composições de fermentação aqui providos podem compreender Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas a um título de pelo menos cerca de 5 x 107, 1 x 108 , ou 5 x 108 unidades formadoras de colônias por mililitro a pelo menos cerca de 3 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro, pelo menos cerca de 5 x 108 unidades formadoras de colônias por mililitro a pelo menos cerca de 4 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro, ou pelo menos cerca de 5 x 108 unidades formadoras de colônias por mililitro a pelo menos 6 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro. Em certas modalidades, os produtos e composições de fermentação aqui providos podem compreender Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas a um título de pelo menos cerca de 1 x 109 unidades formadoras de colônias por mililitro a pelo menos cerca de 3 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro, pelo menos cerca de 1 x 109 unidades formadoras de colônias por mililitro a pelo menos cerca de 4 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro, ou pelo menos cerca de 1 x 109 unidades formadoras de colônias por mililitro a pelo menos 6 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro. Em certas modalidades, os produtos da fermentação e composições aqui providos podem compreender Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas a um título de pelo menos cerca de 1 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro a pelo menos cerca de 3 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro, pelo menos cerca de 1 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro a pelo menos cerca de 4 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro, ou pelo menos cerca de 1 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro a pelo menos 6 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro. Em certas modalidades, os produtos e composições de fermentação aqui providos irão compreender Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas a um título de, pelo menos cerca de 3 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro a pelo menos cerca de 4 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro, ou pelo menos cerca de 3 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro a pelo menos cerca de 6 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro. Em qualquer dos produtos ou composições de fermentação acima mencionados, as concentrações indicadas podem ser concentrações inibidoras de fungos. Em qualquer um dos produtos ou composições de fermentação acima mencionados, os produtos ou composições de fermentação podem ser essencialmente isentos de microrganismos contaminantes, podem compreender Methylobacterium que são aderidos ao e/ou associados com materiais aos quais Methylobacterium não estão aderidos e/ou associadas na sua forma natural, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0073] São aqui providos produtos e composições de fermentação com Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas a um título maior do que cerca de 5 x 107, 1 x 108, ou 5 x 108 unidades formadoras de colônias por grama, a um título maior do que cerca de 1 x 109 unidades formadoras de colônias por grama, a um título maior do que cerca de 1 x 1010 unidades formadoras de colônias por grama, a um título de pelo menos cerca de 3 x 1010 unidades formadoras de colônias por grama. Em certas modalidades, os produtos e composições de fermentação aqui providos podem compreender Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas a um título de pelo menos cerca de 5 x 107, 1 x 108 , ou 5 x 108 unidades formadoras de colônias por grama a pelo menos cerca de 3 x 1010 unidades formadoras de colônias por grama, pelo menos cerca de 5 x 107 , 1 x 108 , ou 5 x 108 unidades formadoras de colônias por grama a pelo menos cerca de 4 x 1010 unidades formadoras de colônias por grama, ou pelo menos cerca de 5 x 107, 1 x 108 , ou 5 x 108 unidades formadoras de colônias por grama a pelo menos 6 x 1010 unidades formadoras de colônias por grama. Em certas modalidades, os produtos e composições de fermentação aqui providos podem compreender Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas a um título de pelo menos cerca de 1 x 109 unidades formadoras de colônias por grama a pelo menos cerca de 3 x 1010 unidades formadoras de colônias por grama, pelo menos cerca de 1 x 109 unidades formadoras de colônias por grama a pelo menos cerca de 4 x 1010 unidades formadoras de colônias por grama, ou pelo menos cerca de 1 x 109 unidades formadoras de colônias por grama a pelo menos 6 x 1010 unidades formadoras de colônias por grama. Em certas modalidades, os produtos da fermentação e composições aqui providos podem compreender Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas a um título de pelo menos cerca de 1 x 1010 unidades formadoras de colônias por grama a pelo menos cerca de 3 x 1010 unidades formadoras de colônias por grama, pelo menos cerca de 1 x 1010 unidades formadoras de colônias por grama a pelo menos cerca de 4 x 1010 unidades formadoras de colônias por grama, ou pelo menos cerca de 1 x 1010 unidades formadoras de colônias por grama a pelo menos 6 x 1010 unidades formadoras de colônias por grama. Em certas modalidades, os produtos e composições de fermentação aqui providos irão compreender Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas a um título de, pelo menos cerca de 3 x 1010 unidades formadoras de colônias por grama a pelo menos cerca de 4 x 1010 unidades formadoras de colônias por grama, ou pelo menos cerca de 3 x 1010 unidades formadoras de colônias por grama a pelo menos cerca de 6 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012, 1x1013, ou 5x1013 unidades formadoras de colônias por grama. Em qualquer dos produtos ou composições de fermentação acima mencionados, a fermentação ou composição pode compreender uma mono ou cocultura de Methylobacterium que é aderida a uma substância sólida. Em qualquer dos produtos ou composições de fermentação acima mencionados, as concentrações indicadas podem ser concentrações inibidoras de fungos. Em qualquer dos produtos ou composições de fermentação acima mencionados, as concentrações indicadas podem ser concentrações inibidoras de fungos. Em qualquer um dos produtos ou composições de fermentação acima mencionados, os produtos ou composições de fermentação podem ser essencialmente isentos de microrganismos contaminantes, podem compreender Methylobacterium que são aderidos e/ou associados com materiais aos quais Methylobacterium não estão aderidos e/ou associadas na sua forma natural, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0074] Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas podem ser obtidos assim como produtos de fermentação podem ser usados para preparar várias composições úteis para o tratamento de plantas ou partes de plantas para inibir a infecção por fungos patogênicos de plantas. Alternativamente, as composições aqui providas compreendendo substâncias sólidas com Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas ou Methylobacterium aderente que inibem fungos patogênicos de plantas podem ser usadas para tratar plantas ou partes de plantas. Plantas, partes de plantas, e, em particular, sementes de plantas que foram pelo menos parcialmente revestidas com os produtos de caldo de fermentação ou composições compreendendo Methylobacterium que inibem os fungos patogênicos de plantas são assim providas. Também são providos produtos vegetais processados que contêm os produtos de caldo de fermentação ou composições com Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas ou Methylobacterium aderente que inibem fungos patogênicos de plantas. Methylobacterium que inibem os fungos patogênicos de plantas podem ser utilizados para preparar várias composições que são particularmente úteis para o tratamento de sementes de plantas. As sementes que foram pelo menos parcialmente revestidas com os produtos ou composições de caldo de fermentação são assim providas. Também são providos produtos de sementes processados, incluindo, mas não se limitando a, farinha de grãos mais grossos (meal), farinha de grãos mais finos (flour), rações e flocos que contêm os produtos ou composições de caldo de fermentação aqui providos. Em certas modalidades, o produto vegetal processado será não regenerável (isto é, será incapaz de se transformar em uma planta). Em certas modalidades, o produto ou composição de fermentação que reveste, pelo menos parcialmente, a planta, parte de planta ou semente de planta ou que está contido na planta processada, parte de planta ou produto de semente compreende um Methylobacterium que inibe fungos patogênicos de plantas que pode ser prontamente identificado pela comparação de uma planta tratada ou não tratada, parte de planta, semente de planta ou produto processado da mesma. Em certas modalidades, a identificação é realizada determinando se o produto ou composição de fermentação que reveste, pelo menos parcialmente, a planta, parte de planta ou semente de planta ou que está contido na planta processada, parte de planta ou produto de semente compreende um Methylobacterium sp. relacionado com NLS0109 que: (i) tem pelo menos um gene que codifica um 16S RNA que tem pelo menos 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 8; (ii) tem no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores de polinucleotídeos de pelo menos 50, 60, 100, 120, 180, 200, 240 ou 300 nucleotídeos da SEQ ID NOS: 9-11; ou (iii) tem no seu genoma um ou mais fragmentos marcadores compreendendo uma sequência tendo pelo menos 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência ao longo de todo o comprimento da SEQ ID NOS: 9-11. Análises da sequência de RNA 16S similares podem ser realizadas para determinar se o produto ou composição de fermentação que reveste, pelo menos parcialmente, a planta, parte de planta, ou semente da planta ou que está contido na planta processada, parte de planta, ou produto de semente compreende adicionalmente NLS0017, NLS0020, NLS0021, NLS0042, NLS0064, NLS0066, NLS0089, um derivado dos mesmos, ou um Methylobacterium sp. relacionados aos mesmos.
[0075] As composições úteis para o tratamento de plantas ou partes de plantas que compreendem Methylobacteriumque inibem fungos patogênicos de plantas ou uma substância sólida com Methylobacterium aderente que inibe fungos patogênicos de plantas, emulsões contendo o Methylobacterium que inibem planta patogênica de fungos ou combinações dos mesmos também podem compreender um adjuvante agriculturalmente aceitável ou um excipiente agriculturalmente aceitável. Um adjuvante agriculturalmente aceitável ou um excipiente agriculturalmente aceitável é tipicamente um ingrediente que não causa fitotoxicidade indevida ou outros efeitos adversos quando exposto a uma planta ou parte de planta. Em certas modalidades, a substância sólida pode ela própria ser um adjuvante agriculturalmente aceitável ou um excipiente agriculturalmente aceitável desde que não seja bactericida ou bacteriostática para o Methylobacterium. Em outras modalidades, a composição compreende adicionalmente pelo menos um de um adjuvante agriculturalmente aceitável ou um excipiente agriculturalmente aceitável. Qualquer uma das composições acima mencionadas pode também compreender adicionalmente um pesticida. Os pesticidas utilizados na composição incluem, mas não se limitam a, um inseticida, um fungicida, um nematocida e um bactericida. Em certas modalidades, o pesticida utilizado na composição é um pesticida que não inibe substancialmente o crescimento do Methylobacterium. Como os Methylobacterium são bactérias gram-negativas, os bactericidas adequados utilizados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a, bactericidas que exibem atividade contra bactérias gram- positivas mas não bactérias gram-negativas. As composições aqui providas podem também compreender um agente bacteriostático que não inibe substancialmente o crescimento do Methylobacterium. Os agentes bacteriostáticos adequados para utilização nas composições aqui providas incluem, mas não se limitam a, aqueles que exibem atividade contra bactérias gram-positivas, mas não bactérias gram-negativas. Qualquer uma das composições acima mencionadas pode também ser um produto essencialmente seco (isto é, tendo cerca de 5% ou menos de teor de água), uma mistura da composição com uma emulsão ou uma suspensão.
[0076] Os adjuvantes agriculturalmente aceitáveis utilizados nas composições que compreendem Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas, emulsões contendo o Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas, ou combinações dos mesmos incluem, mas não estão limitados a, componentes que aumentam a eficácia do produto e/ou produtos que aumentam a facilidade de aplicação do produto. Os adjuvantes que aumentam a eficácia do produto podem incluir vários agentes umidificantes/espalhantes que promovem a adesão e o espalhamento da composição nas partes de planta, adesivos que promovem a adesão na parte de planta, penetrantes, extensores e umectantes que aumentam a densidade ou o tempo de secagem das composições pulverizadas. Agentes umidificantes/espalhantes utilizados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a, tensoativos não iônicos, tensoativos aniônicos, tensoativos catiônicos, tensoativos anfotéricos, tensoativos organossilicatos e/ou tensoativos acidificados. Os adesivos utilizados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a, substâncias à base de látex, substâncias à base de terpeno/pinoleno e pirrolidona. Os penetrantes podem incluir óleo mineral, óleo vegetal, óleo vegetal esterificado, tensoativos organossilicatos e tensoativos acidificados. Os extensores utilizados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a, sulfato de amônio ou substâncias à base de menteno. Os umectantes utilizados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a, glicerol, propilenoglicol e dietilglicol. Os adjuvantes que melhoram a facilidade de aplicação do produto incluem, mas não se limitam a, agentes acidificantes/tamponantes, agentes antiformação de espuma/desespumantes, agentes de compatibilidade, agentes redutores de deriva, corantes e condicionadores de água. Os agentes antiformação de espuma/desespumantes utilizados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a, dimetopolissiloxano. Os agentes de compatibilidade utilizados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a, sulfato de amônio. Os agentes redutores de deriva utilizados nas composições podem incluir, mas não se limitam a, poliacrilamidas e polissacarídeos. Os condicionadores de água utilizados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a, sulfato de amônio.
[0077] Os métodos de tratamento de plantas e/ou partes de plantas com os caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, e as composições que compreendendo Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas, ou combinações dos mesmos são também aqui providos. As plantas tratadas e partes de plantas tratadas obtidas a partir das mesmas incluem, mas não estão limitadas a, milho, Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), alfafa, arroz, centeio, sorgo, painço (por exemplo, mexoeira (Pennisetum glaucum)), Panicum miliaceum, milho painço (Setaria italica), capim-pé-de-galinha-gigante (Eleusine coracana), girassol, cártamo, soja, tabaco, batata, amendoim, algodão, batata-doce (Ipomoea batatus), mandioca, café, coco, abacaxi, citrinos, cacau, chá, banana, abacate, figo, goiaba, manga, oliva, mamão, caju, macadâmia, amêndoa, beterraba sacarina, cana de açúcar, aveia, cevada, tomates, alface, feijão verde, feijões-de-lima, ervilhas, cucurbitáceas como pepino, melão Cantaloupe e melão, plantas ornamentais e coníferas. As partes de planta que são tratadas incluem, mas não estão limitadas a folhas, caules, flores, raízes, sementes, frutos, tubérculos, coleópteros e semelhantes. As plantas ornamentais e partes de plantas que podem ser tratadas incluem, mas não estão limitadas a, azaleia, hortênsia, hibisco, rosas, tulipas, narcisos, petúnias, craveiro, poinsétia e crisântemo. As plantas coníferas e partes de plantas que podem ser tratadas incluem, mas não estão limitadas a, pinheiros tais como Pinus taeda, pinheiro-americano, Pinus ponderosa, Pinus contorta e Pinus radiata; Abeto-de-Douglas; Cicuta ocidental; Pícea de Sitka; sequóia; abetos verdadeiros como abeto de prata e abeto balsâmico; e cedros como o cedro vermelho ocidental e o cedro amarelo do Alasca. As plantas de relva e partes de plantas que podem ser tratadas incluem, mas não estão limitadas a, Poa annua, azevém anual, Poa compressa, festuca, agróstis, capim-trigo, erva-de- febra, Dactylis glomerata, azevém, capim-rosado, grama-bermuda, grama Sto. Agostinho, e grama zoysia. Em certas modalidades, a planta tratada ou parte de planta é uma planta de cereal ou parte de planta selecionada a partir do grupo que consiste em uma planta de arroz, trigo, milho, cevada, painço, sorgo, aveia e centeio ou parte de planta. As sementes ou outros propágulos de qualquer uma das plantas acima mencionados podem ser tratados com os caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, produtos de fermentação, e/ou composições aqui providas.
[0078] Em certas modalidades, as plantas e/ou partes de plantas são tratadas aplicando os caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, produtos de fermentação e composições que compreendem Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas, ou combinações dos mesmos como uma pulverização. Tais aplicações de pulverização incluem, mas não estão limitadas a, tratamentos de uma única parte de planta ou qualquer combinação de partes de planta. A pulverização pode ser obtida com qualquer dispositivo que irá distribuir os caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, produtos de fermentação, e as composições na planta e/ou parte(s) de planta. Os dispositivos de pulverização úteis incluem um pulverizador de barra, um pulverizador de mão ou de mochila, pulverizadores aéreos (crop duster) (isto é, pulverização aérea) e semelhantes. Os dispositivos de pulverização ou métodos que proveem a aplicação dos caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, produtos de fermentação, e composições em um ou ambos da superfície adaxial e/ou da superfície abaxial também podem ser utilizados. São também providas aqui plantas e/ou partes de plantas que são pelo menos parcialmente revestidas com qualquer um de caldo de fermentação bifásico, produto de caldo de fermentação, produto de fermentação, ou composições que compreendem uma substância sólida com Methylobacterium que inibe fungos patogênicos de plantas aderidos nas mesmas. São também providos produtos vegetais processados que compreendem uma substância sólida com Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas aderidos nas mesmas.
[0079] Em certas modalidades, as sementes são tratadas por exposição das sementes aos caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, produtos de fermentação e composições que compreendem Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas, ou combinações dos mesmos. As sementes podem ser tratadas com os caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação e composições aqui providos por métodos incluindo, mas não limitados a, embebição, revestimento, pulverização e semelhantes. Os tratamentos de sementes podem ser efetuados com tratadores de sementes contínuos e/ou descontínuos. Em certas modalidades, as sementes revestidas podem ser preparadas por preparo de uma suspensão das sementes com uma composição de revestimento contendo um caldo de fermentação, produto de caldo de fermentação, ou composições que compreendem a substância sólida com Methylobacterium que inibe fungos patogênicos de plantas e secagem ao ar do produto resultante. A secagem ao ar pode ser realizada a qualquer temperatura que não seja nociva à semente ou ao Methylobacterium, mas normalmente não será superior a 30 graus centígrados. A proporção de revestimento que compreende uma substância sólida e Methylobacterium que inibe fungos patogênicos de plantas inclui, mas não está limitado a, uma faixa de 0,1 a 25% em peso da semente, de 0,5 a 5% em peso da semente, e 0,5 a 2,5% em peso de semente. Em certas modalidades, uma substância sólida usada no revestimento ou no tratamento das sementes terão Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas aderidos na mesma. Em certas modalidades, uma substância sólida utilizada no revestimento ou tratamento de sementes estará associada ao Methylobacterium que inibe os fungos patogênicos de plantas e será um caldo de fermentação, produto de caldo de fermentação ou composição obtida pelos métodos aqui providos. Várias composições de tratamento de sementes e métodos para tratamento de sementes descritos nas Patentes dos EUA Nos 5.106.648; 5.512.069; e 8.181.388 são aqui incorporadas por referência na sua totalidade e podem ser adaptados para utilização com produtos de fermentação ou composições aqui providos. Em certas modalidades, a composição utilizada para tratar a semente pode conter excipientes agriculturalmente aceitáveis que incluem, mas não estão limitados a, farinha de madeira, argilas, carvão ativado, terra diatomácea, sólidos inorgânicos de grão fino, carbonato de cálcio e semelhantes. As argilas e sólidos inorgânicos que podem ser usados com os caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, ou composições aqui providos incluem, mas não estão limitados a, bentonita de cálcio, caulino, caulinita (china clay), talco, perlita, mica, vermiculita, sílicas, pó de quartzo, montmorilonita e misturas dos mesmos. Adjuvantes agriculturalmente aceitáveis que promovem a fixação na semente que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, acetatos de polivinil, copolímeros de acetato de polivinil, acetatos de polivinil hidrolisados, copolímero de polivinilpirrolidona-acetato de vinil, álcoois polivinílicos, copolímeros de poli (álcool vinílico), éter metílico de polivinil, copolímero de éter metílico de polivinil-anidrido maleico, ceras, polímeros de látex, celuloses incluindo etilceluloses e metilceluloses, hidroximetilceluloses, hidroxipropilcelulose, hidroximetilpropilceluloses, polivinilpirrolidonas, alginatos, dextrinas, maltodextrinas, polissacarídeos, gorduras, óleos, proteínas, goma karaya, goma jaguar, goma tragacanta, gomas polissacarídicas, mucilagem, gomas árabicas, goma-laca, polímeros e copolímeros de cloreto de vinilideno, polímeros e copolímeros de proteína à base de soja, lignossulfonatos, copolímeros acrílicos, amidos, polivinilacrilatos, zeínas, gelatina, carboximetilcelulose, quitosano, óxido de polietileno, polímeros e copolímeros de acrilamida, acrilato de polihidroxietil, monômeros de metilacrilamida, alginato, etilcelulose, policloropreno e xaropes ou misturas dos mesmos. Outros adjuvantes agriculturalmente aceitáveis úteis que podem promover revestimento incluem, mas não estão limitados a, polímeros e copolímeros de acetato de vinil, copolímero de acetato de vinil-polivinilpirrolidona e ceras solúveis em água. Vários tensoativos, dispersantes, agentes antiaglomerantes, agentes de controle de espuma, e corantes aqui descritos e na Patente dos EUA No 8.181.388 podem ser adaptados para utilização com produtos de fermentação ou composições aqui providos.
[0080] São aqui providas composições que compreendem Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas e que proveem o controle de infecções por fungos patogênicas de plantas, partes de plantas e plantas obtidas a partir das mesmas em relação a plantas não tratadas, partes de planta e plantas obtidas a partir das mesmas que não tenham sido expostas às composições. Em certas modalidades, as partes de planta, incluindo, mas não limitadas a, uma semente, uma folha, um fruto, um tronco, uma raiz, um tubérculo ou um coleóptilo podem ser tratadas com as composições aqui providas para controlar a doença fúngica. Os tratamentos ou aplicações podem incluir, mas não estão limitados a, pulverização, revestimento, revestimento parcial, imersão, e/ou embebição das plantas ou partes de plantas com as composições aqui providas. Em certas modalidades, uma semente, uma folha, um fruto, um tronco, uma raiz, um tubérculo ou um coleóptilo podem ser imersos e/ou embebidos com um líquido, semi-líquido, emulsão ou pasta de uma composição aqui provida. Tal imersão ou embebição da semente pode ser suficiente para prover a inibição da doença fúngica em uma planta ou parte de planta, em comparação com uma planta ou parte de planta não tratada. Tal inibição de doença fúngica inclui, mas não está limitada a, reduções no crescimento de fungos e/ou os efeitos adversos do crescimento de fungos em relação a plantas não tratadas. Em certas modalidades, as sementes de plantas podem ser imersas e/ou embebidas durante pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 horas. Tal imersão e/ou embebição pode, em certas modalidades, ser realizada a temperaturas que não sejam prejudiciais à semente da planta ou ao Methylobacterium. Em certas modalidades, as sementes podem ser tratadas a cerca de 15 a cerca de 30 graus centígrados ou a cerca de 20 a cerca de 25 graus centígrados. Em certas modalidades, a embebição e/ou a imersão das sementes podem ser realizadas com agitação suave.
[0081] As quantidades das composições que compreendem Methylobacterium que inibe fungos patogênicos de plantas que são suficientes para prover uma inibição de infecção fúngica de uma planta ou parte de planta pode, assim, ser determinada medindo todo ou qualquer crescimento fúngico e/ou os efeitos adversos de crescimento fúngico em plantas ou partes de planta tratadas em relação a plantas ou partes de plantas não tratadas. Os efeitos adversos do crescimento fúngico em uma planta que podem ser medidos incluem qualquer tipo de dano tecidual ou necrose da planta, qualquer tipo de redução de rendimento da planta, qualquer redução no valor do produto vegetal da cultura agrícola e/ou produção de metabólitos de fungos indesejáveis ou subprodutos do crescimento fúngico incluindo, mas não se limitando a, micotoxinas. As micotoxinas compreendem um número de moléculas tóxicas produzidas por espécies de fungos, incluindo, mas não limitado a, policetídeos (incluindo aflatoxinas, demetilesterigmatocistina, O- metilesterigmatocistina etc.), fumonisinas, alperisinas (por exemplo, A1, A2, B1, B2), esfingofunginas (A, B, C e D), tricotecenos, fumifunginas e semelhantes. Os métodos de quantificação dos níveis de micotoxina são amplamente documentados. Além disso, também estão disponíveis kits comerciais para medição de micotoxinas, como aflatoxina, fumonisina, desoxinivalenol e zearalenona (VICAM, Watertown, MA, EUA).
[0082] Espera-se que as composições aqui providas compreendendo Methylobacterium que inibem fungos patogênicos de plantas sejam úteis na inibição do crescimento e/ou infecção fúngica em uma ampla variedade de fungos patogênicos de plantas, incluindo, mas não limitado aos, estágios anamórfico e/ou teleomórfico daqueles fungos fitopatogênicos nos seguintes gêneros e espécies: Blumeria (Blumeria graminis f. sp. tritici), Cercospora (Cercospora kikuchii; Cercospora sojina; Cercospora zeae-maydis); Cochliobolus (Colchliobolus maydis; Cochliobolus heterostrophus; Cochliobolus carbonum); Colletotrichum (Colletotrichum lindemuthianum; Colletotrichum graminicola; Colletotrichum cereale); Diplodia (Diplodia maydis); Exserohilum (Exserohilum turcicum); Fusarium (Fusarium nivale; Fusarium oxysporum; Fusarium graminearum; Fusarium culmorum; Fusarium solani; Fusarium moniliforme; Fusarium virguliforme); Macrophomina (Macrophomina phaseolina); Magnaporthe (Magnaporthe oryzae; Magnaporthe grisea); Phakopsora (Phakopsora pachyrhizi); Phialopora (Phialophora gregata); Phymatotrichum (Phymatotrichum omnivorum); Phytophthora (Phytophthora cinnamomi; Phytophthora cactorum; Phytophthora phaseoli; Phytophthora parasitica; Phytophthora citrophthora; Phytophthora megasperma f.sp. sojae; Phytophthora infestans); Puccinia (Puccinia sorghi; Puccinia striiformis; Puccinia graminis f.sp. tritici; Puccinia asparagi; Puccinia recondita; Puccinia arachidis; Puccinia coronata); Pythium (Pythium aphanidermatum; Pythium ultimum; Pythium sylvaticum; Pythium torulosum; Pythium lutarium; Pythium oopapillum); Pyrenophora (Pyrenophora tritici-repentis); Rhizoctonia (Rhizoctonia solani; Rhizoctonia cerealis); Sclerotium (Sclerotium rolfsii); Sclerotinia (Sclerotinia sclerotiorum; Sclerotinia homoeocarpa); Septoria (Septoria lycopersici; Septoria glycines; Septoria nodorum; Septoria tritici); Setosphaeria (Setosphaeria turcica); Stagonospora (Stagonospora nodorum); Verticillium (Verticillium dahliae; Verticillium albo-atrum). Espera-se que as composições aqui providas, compreendendo Methylobacterium que inibem fungos patogênicas de plantas sejam úteis na inibição de crescimento e/ou infecção fúngica por Fusarium graminearum, Fusarium verticillioides, Fusarium virguliforme, e/ou Fusarium proliferatum. As composições aqui providas compreendendo Methylobacterium que inibem o crescimento e/ou infecção fúngica por Fusarium graminearum, Fusarium verticillioides, Fusarium virguliforme, e/ou Fusarium proliferatum podem ser usadas para controlar infecções de plantas de cereal infectadas por estes fungos. As infecções de plantas de cereal selecionadas a partir do grupo que consiste em plantas de arroz, trigo, milho, cevada, painço, sorgo, aveia e centeio por Fusarium sp podem ser controladas pelas composições aqui providas. Em qualquer das modalidades acima mencionadas, o fungo patogênico de plantas que é inibido pode estar na sua forma anamórfica, na sua forma teleomórfica, ou nas suas formas anamórficas e teleomórficas. Certos isolados de Methylobacterium ou combinações de isolados também podem ser usados para inibir certos fungos patogênicos de plantas em certas culturas, como descrito na Tabela 3. Em certas modalidades em que uma combinação de isolados são utilizados (por exemplo, NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium sp. relacionado com o mesmo e, pelo menos, uma cepa de Methylobacterium adicional selecionado a partir do grupo que consiste em NLS0017, NLS0020, NLS0021, NLS0042, NLS0064, NLS0066 , NLS0089, um derivado dos mesmos e um Methylobacterium sp. relacionado com os mesmos), os isolados podem ser aplicados simultaneamente ou sequencialmente. Em certas modalidades em que uma combinação de isolados são utilizados (por exemplo, ou NLS0109, um derivado do mesmo, ou um Methylobacterium sp. relacionado com o mesmo e, pelo menos, uma cepa de Methylobacterium adicional selecionado a partir do grupo que consiste em NLS0017, NLS0020, NLS0021, NLS0042, NLS0064, NLS0066, NLS0089, um derivado dos mesmos e um Methylobacterium sp. relacionado com os mesmos), os isolados podem ser aplicados no(s) mesmo(s) modo(s) (por exemplo, através de um tratamento de sementes, uma aplicação nas folhas ou em sulco) ou por modos distintos.
[0083] Tabela 3. Isolados de Methylobacterium e combinações de isolados para uso em composições e métodos para controlar certos fungos patogênicos de plantas em certas culturas agrícolas (incluindo derivados dos isolados de Methylobacterium ou Methylobacterium spp. relacionados com os mesmos)
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[0084] Em certas modalidades, uma quantidade de uma composição aqui provida que é suficiente para prover a inibição da infecção fúngica em uma planta ou parte de planta pode ser uma composição com Methylobacterium que inibe fungos patogênicos de plantas a um título de pelo menos cerca de 5 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro, pelo menos cerca de 1 x 109 unidades formadoras de colônias por mililitro, pelo menos cerca de 1 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro ou pelo menos cerca de 3 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro. Em certas modalidades, uma quantidade de uma composição aqui provida que é suficiente para prover a inibição da doença fúngica em uma planta ou parte de planta pode ser uma composição com Methylobacterium que inibe fungos patogênicos de plantas a um título de cerca de 5 x 108 unidades formadoras de colônias por mililitro a pelo menos cerca de 6 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro. Em certas modalidades, uma quantidade de uma composição aqui provida que é suficiente para prover inibição da doença fúngica em uma planta ou parte de planta pode ser um produto de caldo de fermentação com um Methylobacterium que inibe o título de fungos patogênicos de plantas de uma fase sólida desse produto é pelo menos cerca de 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, ou 5 x 108 unidades formadoras de colônias por grama a pelo menos cerca de 6 x 1010, 1x1013, ou 5x1013 unidades formadoras de colônias de Methylobacterium por grama da fase sólida em que uma monocultura ou cocultura de Methylobacterium que inibe os fungos patogênicos de plantas é aderida às mesmas. Em certas modalidades, uma quantidade de uma composição aqui provida que é suficiente para prover inibição da doença fúngica em uma planta ou parte de planta pode ser uma composição com um título de Methylobacterium de pelo menos cerca de 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, ou 5 x 108 unidades formadoras de colônias por grama a pelo menos cerca de 6 x 1010, 1x1013, ou 5x1013 unidades formadoras de colônias de Methylobacterium por grama de partículas na composição contendo as partículas que compreendem uma substância sólida em que uma monocultura ou cocultura de Methylobacterium que inibe os fungos patogênicos de plantas é aderida às mesmas. Em qualquer das composições acima mencionadas, as concentrações indicadas podem ser concentrações inibidoras de fungos.
[0085] Em certas modalidades, as composições, plantas e partes de plantas tratadas com as composições e métodos aqui providos podem compreender fungicidas além das cepas de Methylobacterium para um controle melhorado da doença. Em certas modalidades, os fungicidas são providos em composições compreendendo o Methylobacterium, por exemplo, como tratamentos de sementes, como pastas para tratamento em sulco ou em pulverizações foliares. Em certas modalidades, os fungicidas são providos como composições separadas para uso nos métodos aqui providos. Exemplos de fungicidas que podem ser utilizados nas composições e métodos aqui providos para um controle melhorado de fungos patogênicos de plantas são providos na Tabela 4. Tabela 4
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[0086] Quando os produtos químicos são usados em combinação com Methylobacterium, as taxas de aplicação dos produtos químicos podem ser reduzidas em comparação com as taxas de aplicação comercial padrão para uma determinada espécie de planta, provendo o mesmo nível ou maior proteção à planta de patógenos fúngicos fitopatogênicos. Em certas modalidades, as cepas de Methylobacteriumprovidas aqui proveem atividade aumentada em combinação com fungicidas como resultado da atividade contra cepas específicas de fungos para as quais os fungicidas químicos proveem nenhum controle ou controle incompleto. Em certas modalidades, o Methylobacterium é NLS0109 ou NL0089, o fungo é Cercospora, a cultura agrícola é milho, a doença é cercosporiose, e a substância química é uma estrobilurina, tal como piraclostrobina, ou um azol, como o tebuconazol. Em certas modalidades, a taxa de aplicação de fungicida ou o número de aplicações do fungicida pode ser reduzido como resultado da atividade antifúngica do Methylobacterium aplicado. Em certas modalidades, o Methylobacterium é NLS0109, o fungo é Pythium, a cultura agrícola é soja ou milho, a doença é podridão da raiz de Pythium e a substância química é metalaxil, mefenoxam, oxatiapiprolina ou etaboxam. Em certas modalidades, a taxa de aplicação de fungicida ou o número de aplicações do fungicida pode ser reduzido como resultado da atividade antifúngica do Methylobacterium aplicado.
EXEMPLOS
[0087] Os exemplos seguintes são incluídos para demonstrar várias modalidades. Será apreciado pelos peritos na técnica que as técnicas descritas nos exemplos seguintes representam técnicas descobertas pelos Requerentes que funcionam bem. No entanto, os peritos na técnica devem, à luz da presente descrição, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são descritas, enquanto ainda obtêm resultados iguais ou semelhantes, sem se afastarem do escopo da descrição.
Exemplo 1. Ensaios de Campo de Milho e Soja Verão de 2015
[0088] No verão de 2015, ensaios de campo para avaliar a supressão de doenças em milho e soja por PPFMs foram realizados em dois locais independentes: Bethel, Missouri e Troy, Ohio. Ambos os locais de ensaio foram gerenciados por organizações de pesquisa contratadas. O pessoal da NewLeaf Symbiotics visitou cada localidade pelo menos duas vezes para garantir a implementação correta do ensaio. As mesmas cepas e taxas de aplicação foram testadas em ambos os locais. Os ensaios foram organizados como parcelas subdivididas (split-plot) dentro de um RCBD (delineamento em bloco completamente aleatorizado) com seis repetições na localidade de Bethel e quatro repetições na localidade de Troy. Os tratamentos para o milho estão descritos na Tabela 5 e os tratamentos para a soja estão descritos na Tabela 6. Os tratamentos em sulco foram aplicados a uma taxa de 1.250 mL de concentrado de PPFM 10X por acre e tratamentos foliares foram aplicados a uma taxa de 5.000 mL de concentrado PPFM 10X por acre. O delineamento em parcelas subdivididas permitiu a avaliação do tratamento no sulco, tratamento foliar, resposta a tratamentos de PPFM sequenciais e interações entre diferentes PPFMs. Os dados do estudo de soja de Troy, Ohio, não foram analisados. Tabela 5. Tratamentos de Ensaio de Campo de Milho Contra Patologia 2015
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Tabela 6. Trainmen i tos de Ensaio de Campo de Soja Contra Patologia 2015
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[0089] Em cada local, foi utilizado espaçamento entre linhas convencional e práticas agronômicas padrão foram seguidas. Híbridos de milho e soja com genética semelhante, mas adequados para os locais específicos do ensaio, foram fornecidos para cada localidade. Os tamanhos das subparcelas não foram inferiores a quatro linhas de 6,096 m (20 pés). Uma borda de 1,524 m (5 pés) foi deixada entre a subparcela para mitigar os efeitos da vizinhança. Além disso, as observações foram coletadas a partir apenas do centro de duas linhas de cada parcela. As parcelas inteiras consistiam nas quatro subparcelas mais bordas de 1,524 m (5 pés) entre as parcelas. Os locais dos ensaios foram selecionados em áreas com pressão natural da doença e não foram realizadas inoculações artificiais. Como resultado, as mesmas doenças não foram avaliadas em cada local. As doenças classificadas em milho foram antracnose (Colletotrichum graminicola), cercosporiose (Cercospora zeae-maydis) e ferrugem comum (Puccinia sorghi). As doenças classificadas em soja foram a mancha marrom (Septoria glycines) e várias doenças foliares, particularmente a mancha olho-de-rã (Cercospora sojina). Para cada doença presente, as taxas de incidência e/ou gravidade foram coletadas e analisadas para determinar os efeitos do tratamento.
[0090] As classificações de doenças e os resultados da análise estatística são apresentados nas Tabelas 7-9. Devido às diferentes classificações de doenças e ao número de replicação em cada localidade, os dados dos dois locais de ensaio foram analisados separadamente. As análises de dados foram realizadas usando o software SAS JMP v11.2 (SAS Institute, Cary, NC). Os dados foram analisados de acordo com as diretrizes do JMP para análise de parcelas subdivididas dentro da função 'Fit Model’ (Ajustar Modelo), que usa a técnica REML para modelos mistos. Testes post hoc de t de Student e de Tukey HSD foram aplicados para determinar as diferenças entre os grupos de tratamento (α= 0,05). Os contrastes foram usados para fazer comparações entre grupos de interesse específicos. Tabela 7. Doença Foliar da Soja—Bethel, Missouri
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T Tratamento significativamente diferente do controle (Simulado, Simulado) pelo teste t de Student (α = 0,05) H Tratamento significativamente diferente do controle (Simulado, Simulado) pelo Tukey HSD (α = 0,05) Tabela 8. Doença Foliar do Milho—Bethel, Missouri
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Tabela 9. Doença Foliar do Milho—Troy, Ohio
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I A média em todos os tratamentos no sulco simulados foi significativamente diferente da média em todos os tratamentos de NLS0020 no sulco por contraste (α= 0,05) * Tratamento significativamente diferente do controle (Simulado, Simulado) por contraste (α = 0,10)
[0091] Todos os tratamentos aplicados à soja demonstraram supressão da doença contra a mancha marrom (Septoria glycines) e outras doenças de manchas foliares. A aplicação foliar de NLS0020 sem tratamento no sulco resultou na menor classificação para todas as doenças e foi o tratamento mais eficaz para a supressão da doença em relação ao controle. A aplicação foliar de NLS0020 após o tratamento com NLS0089 no sulco também demonstrou supressão da doença em todos os tratamentos. O tratamento foliar de NLS0109 reduziu significativamente todas as doenças e proveu uma maior supressão quando aplicado após o tratamento no sulco com NLS0089 para todas as aplicações, exceto a classificação de mancha marrom precoce. O tratamento no sulco com o NLS0089 sozinho reduziu significativamente todas as doenças e teve um efeito particularmente forte contra as doenças de manchas foliares.
[0092] No milho na localidade em Bethel, Missouri, as aplicações foliares de NLS0066 e NLS0109 suprimiram significativamente todas as doenças, com exceção do NLS0066 contra a ferrugem comum. A aplicação do NLS0020 no sulco melhorou a supressão de doenças provida pelas aplicações foliares de NLS0066 e NLS0109 em todos os exemplos. Isso demonstra eficácia melhorada por meio de várias aplicações dessas cepas de PPFM específicas. A aplicação do NLS0020 sozinha, incluindo foliar, no sulco e no sulco seguido de foliar, resultou na redução da gravidade da cercosporiose precoce, mas não teve impacto significativo sobre as outras doenças testadas.
[0093] No local de Troy, Ohio, as aplicações foliares de NLS0066 e NLS0109 proveram as menores classificações de gravidade da cercosporiose. Isso estava de acordo com os efeitos do tratamento observados no Missouri. A aplicação de NLS0020 sozinho no sulco suprimiu tanto a gravidade quanto a incidência de secamento de ponteiras, o que pode ser indicativo de um efeito na doença e estressores abióticos. Além disso, todas as aplicações de NLS0020 combinado no sulco suprimiu métricas de secamento de ponteiras em relação a todos os tratamentos combinados simulados no sulco, indicando um efeito positivo geral do tratamento com NLS0020 no sulco.
Exemplo 2. Supressão do mofo branco por Methylobacterium
[0094] Sclerotinia sclerotiorum é um fungo ascomiceto polífago, com uma gama de hospedeiros que abrange milhares de plantas dicotiledôneas. O mofo branco na soja e outras culturas leguminosas é de particular importância agronômica. Sob condições ambientais frescas e úmidas, o mofo branco causa senescência prematura e reduz drasticamente os rendimentos. Não há resistência genética completa disponível ao mofo branco e a resistência parcial é apenas marginalmente eficaz. Além disso, as aplicações de fungicidas especificamente para o mofo branco são aplicadas apenas em anos quando a doença é altamente provável e deve ser aplicada dentro de uma janela estreita, a fim de fornecer proteção eficaz. A aplicação de bactérias benéficas que colonizam a planta e proveem maior resistência a doenças poderia mitigar os efeitos do mofo branco e aumentar a eficácia das táticas de gestão de doenças genéticas e químicas.
[0095] Soluções estoque de PPFM congeladas a uma concentração 10X de aproximadamente 1x108 UFC/mL foram descongeladas à temperatura ambiente diretamente antes do tratamento foliar. As células de PPFM foram lavadas centrifugando para sedimentar as células, retirando o sobrenadante resultante, ressuspendendo as células em um mL de água destilada estéril, centrifugando e retirando o sobrenadante uma segunda vez, em seguida, ressuspendendo uma segunda vez em 1 mL de água destilada estéril. As células lavadas e ressuspensas, foram então diluídas para uma concentração de 1X. Duas horas após a preparação de PPFM, um aerógrafo calibrado para 20 psi foi usado para aplicar uniformemente 10mL de solução 1X de PPFM em cada plano de plantas de tratamento. As PPFM foram aplicadas em plantas com três semanas de idade e as inoculações foram realizadas na semana seguinte quando as plantas tinham aproximadamente um mês de idade.
[0096] As sementes foram plantadas em meios em vasos, solo de campo ou uma mistura 50/50 de meios em vasos e solo de campo, dependendo do experimento específico. Em todas os experimentos, planos contendo 18 vasos cada foram utilizados e os vasos contendo tratamentos individuais foram organizados em blocos completamente aleatorizados, quer no plantio ou imediatamente antes da inoculação. Imediatamente após o plantio, os vasos foram transferidos para uma estufa (23,89 - 26,67°C (75-80 °F); UR 40-90%; 16 horas de duração) e cresceram lá por um mês. As plantas foram regadas com água diariamente e receberam fertilizante suplementar duas vezes por semana.
[0097] Plantas de um mês de idade foram inoculadas com culturas de 5-7 dias de idade de Sclerotinia sclerotiorum cultivadas em PDA no escuro. Uma versão modificada da técnica de inoculação do pecíolo cortado foi utilizada (Hoffman et al. 2002. Plant Dis. 86:971-980). Resumidamente, o pecíolo do terceiro trifólio foi cortado com tesouras a aproximadamente 2,54 cm (1 polegada) a partir do caule. A extremidade larga de uma ponta de pipeta de 1000uL foi usada para excisar um disco de ágar da borda externa de uma cultura de S. sclerotiorum. A ponta foi então colocada sobre o pecíolo cortado de tal modo que a extremidade larga da ponta da pipeta estava em contato com a base do tronco e do pecíolo e a extremidade cortada do pecíolo estava em contato com o lado do micélio do tampão de ágar. Um pequeno pedaço de parafilme foi enrolado em torno da ponta e do tronco para evitar que a ponta caísse. As plantas inoculadas foram incubadas na estufa durante 7-10 dias para permitir o desenvolvimento da doença antes da classificação.
[0098] A extensão da lesão e a gravidade da murcha foram coletados como métricas da doença. A extensão das lesões marrons ou branqueadas foi medida usando uma régua. A gravidade da murcha foi classificada em uma escala de 0 a 5, com 0 indicando uma planta completamente saudável e 5 indicando uma planta morta.
[0099] Um total de 12 cepas de PPFM diferentes em cinco experimentos individuais, cada uma delas repetida três vezes, foram testadas quanto à supressão do mofo branco após aplicação foliar de PPFM (Tabela 10). Destas cepas, apenas NLS0020 e NLS0109, cujas ambas nos dois primeiro experimentos, tiveram um efeito significativo na extensão da lesão ou na gravidade da murcha causada pela infecção pelo patógeno (Tabela 11). No primeiro experimento, que teve um tamanho de amostra menor, nenhum efeito significativo foi detectado, mas tanto o NLS0020 quanto o NLS0109 diminuíram a extensão da lesão do mofo branco e a gravidade da murcha em pelo menos 20% em relação ao controle falso-tratado (simulação). No segundo experimento, o NLS0020 diminuiu a extensão da lesão em aproximadamente 30% (P = 0,04), mas não teve um efeito significativo na gravidade da murcha (redução de 10%; P = 0,76). O NLS0109 diminuiu a extensão da lesão em aproximadamente 40% (P <0,01) e murcha em aproximadamente 40% (P = 0,06). Para análise, um teste de Dunnett foi realizada na função “Fit Y by X” (Ajustar Y por X) do software de análise estatística SAS JMP v12.0. O grupo de aplicação do tratamento foliar simulado, que recebeu um meio de crescimento bacteriano apenas de aplicação foliar, foi designado como o grupo de controle. Tabela 10. Extensão da lesão (LL) e a gravidade da murcha do mofo branco após aplicação foliar de cepas de PPFM
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Tabela 11. Aná ise do Controle do Mofo Branco por Cepas de PPFM
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[00100] As aplicações foliares da cepa de PPFM NLS0109 reduziram os sintomas da extensão da lesão e da murcha da soja causada pelo patógeno do mofo branco Sclerotinia sclerotiorum. As aplicações desta cepa podem ser usadas como um tratamento independente para a supressão do mofo branco. Além disso, o NLS0109 pode ser misturado com ferramentas de gestão de doenças químicas ou biológicas como parte de uma abordagem integrada de gestão de doenças. Tais combinações poderiam ser aproveitadas para aumentar e/ou prolongar a eficácia do produto e como parte de um programa de gestão de resistência.
Exemplo 3. Supressão da cercosporiose por Methylobacterium spp. em combinação e comparação com Fungicidas Convencionais
[00101] A cercosporiose, causada pelo patógeno fúngico ascomiceto Cercospora zeae-maydis, é uma doença grave do milho de campo. Embora níveis variáveis de resistência a esta doença estejam presentes no germoplasma comercial, não há resistência completa disponível. A cercosporiose é um problema perene e é particularmente grave durante os verões com alta umidade relativa. O verão de 2016 foi favorável para a cercosporiose, com a pressão da doença começando em junho e persistindo durante a estação de crescimento.
[00102] Neste ensaio, um estudo em estufa foi realizado para determinar a eficácia de cepas de PPFM quando aplicadas sozinhas, em combinação uma com a outra, ou em combinação com baixas taxas baseadas no rótulo do fungicida foliar Headline™ (ingrediente ativo - piraclostrobina; BASF Corporation, Research Triangle, NC, EUA). Estes tratamentos foram comparados contra a aplicação de Headline apenas, bem como com outro tratamento fungicida agriculturalmente fungicida e combinações de tratamento contendo piraclostrobina como ingrediente ativo (Tabela 12). Tabela 12. Tratamentos de Ensaio em Estufa Padrão da Indústria/PPFM
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1 Fortix™ (Arysta Life Sciences, Cary, North Carolina, USA) 2-Xanthion™ (BASF Corporation, Research Triangle, NC, USA)
[00103] O ensaio foi realizado na primavera-verão de 2016 com milho plantado no início de abril e inoculado duas semanas antes da antese. O inóculo foi aplicado colocando fragmentos de milho infectados com patógenos ao redor da base de cada planta e então aumentando a umidade relativa dentro da estufa para 60-90% durante o dia e mais de 90% durante a noite, com a temperatura variando de 21,11-27,78°C (70-82°F). Para promover a infecção, um híbrido de milho suscetível à cercosporiose (Sun Prairie 617RR) foi usado para o ensaio. A classificação da doença foi feita aos 14, 21 e 28 dias pós-inoculação e um peso final da espiga foi coletado para cada planta.
[00104] O ensaio foi organizado como um RCBD com 10 repetições. Os tratamentos no sulco foram aplicados no plantio usando um pulverizador portátil e os volumes de aplicação foram reduzidos para a área do vaso total. Os fungicidas foram misturados e aplicados de acordo com as instruções do rótulo. As PPFMs foram fornecidas como concentrado congelado que foi descongelado imediatamente antes da aplicação. Sementes extras foram plantadas e tratadas para cada grupo de tratamento para assegurar que um total de dez repetições estivesse disponível para inoculação. Duas semanas após a germinação, as mudas de milho foram transferidas das bandejas de mudas para vasos de 9,46 L (2,5 galões), nos quais elas cresceram durante o restante do experimento. Aplicações foliares foram realizadas no estágio de crescimento VT usando um pulverizador de mochila. Para evitar a deriva dentro da estufa, as plantas em cada grupo de tratamento foram trazidas para fora e o tratamento foi aplicado em todo o grupo. As plantas foram então devolvidas à estufa e distribuídas aleatoriamente nas dez replicações experimentais.
[00105] Os dados da doença foram analisados em JMP versão 12.0 (SAS Institute, Cary, NC). Os valores de incidência e gravidade da doença coletados em cada dado de amostragem foram usados para calcular o índice de doença [(incidência * gravidade)/100] e uma área cumulativa abaixo da curva de progresso da doença (AUDPC) foi calculada para os três valores do índice de doença para cada tratamento. Os dados foram analisados usando a função “Fit Model” (Ajustar Modelo) no JMP com ‘Rep’ como um efeito aleatório e ‘Treatment’ (Tratamento) como um efeito fixo. Um teste post-hoc de Tukey a um nível alfa de 0,05 foi aplicado para realizar a separação das médias entre os tratamentos (Tabela 13).
[00106] Os tratamentos com PPFM isoladamente não tiveram um desempenho diferente do UTC ou do tratamento no sulco com Xanthion™. Xanthion™ é um produto de combinação de piraclostrobina e a cepa inoculante microbiana de Bacillus subtilis MBI600; assim, as cepas de PPFM sozinhas tiveram desempenho semelhante ao produto comercial atualmente disponível que combina um fungicida químico com um agente microbiano. A combinação de NL0020-SE/NL0109-F reduziu a doença em relação ao UTC e os níveis de doença sob este tratamento não foram significativamente diferentes dos de qualquer fungicida à base de piraclostrobina de aplicação foliar (Headline™ e Fortix™). NL0020-IF / Headline-F™ suprimiu a doença aos níveis semelhantes aos de Xanthion-IF™/Headline-F™, Headline-F™, e Fortix-F™. Como a combinação Xanthion™ / Headline™ requer duas aplicações de piraclostrobina, o desempenho similar do NLS0020/Headline indica que uma aplicação desse ingrediente ativo poderia ser descartada em favor de uma aplicação de PPFM sem quaisquer efeitos adversos na gravidade da doença.
[00107] De todos os tratamentos, NLS0109-F / Headline-F™ e NLS0020-IF / NLS0109-F + Headline-F™ apresentaram os maiores efeitos sobre a supressão de doenças em relação ao UTC. Em particular, esses tratamentos reduziram numericamente a doença a níveis maiores que o Headline™ sozinho nos intervalos de classificação de 21 e 14 dias (Figura 4). Isto indica o potencial para aplicações de PPFM, particularmente aplicações foliares de NLS0109 feitas em combinação com Headline™ para estender a janela de proteção provida por fungicidas convencionais usados para mitigação de cercosporiose.
[00108] Além da supressão da doença, a aplicação de PPFM apresentou um forte efeito positivo no peso da espiga (Tabela 12). O peso médio para todos os tratamentos com PPFMs foi de 132,67 gramas/espiga, o que é quase dez gramas maior do que a média de 123,00 gramas/espiga do controle não tratado e tratamentos somente com fungicida. Fortix™ O Fortix ™ sozinho foi o único tratamento com fungicida que teve um desempenho similar aos tratamentos com PPFM e a aplicação no sulco de NLS0020 foi particularmente favorável ao aumento do peso de rendimento, obtendo três dos quatro maiores pesos obtidos.
[00109] Este experimento demonstra o potencial para o uso de PPFMs em combinação com fungicidas convencionais. As PPFMs podem ser usadas para aumentar a eficácia do produto prolongando a janela de proteção eficaz oferecida pelas químicas atualmente disponíveis e oferecendo um produto alternativo para uso na gestão de resistência. Adicionalmente, as PPFMs tiveram um efeito positivo no peso da espiga, indicando um potencial para aumentar as produtividades quando usadas sozinhas ou em combinação com fungicidas convencionais. Tabela 13. Resultados da Avaliação em Estufa da Cercosporiose
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Exemplo 4. Ensaios de campo de cercosporiose verão 2016
[00110] Um segundo ano de ensaios de campo de patologia do milho foi realizado em 2016. Ensaios foram colocados em localidades com níveis naturalmente elevados de inóculo de cercosporiose e um híbrido de milho suscetível (Sun Prairie 617RR) foi usado para facilitar a infecção por cercosporiose. Dois locais de ensaio foram incluídos: Dana, Iowa e Bethel, Missouri. Em cada localidade, o ensaio foi realizado como um bloco completamente aleatorizado com seis repetições. Foram utilizadas práticas agronômicas locais padrão para aplicação de fertilizantes, lavoura, espaçamento entre linhas, população e gestão de pragas. As práticas padrão de gestão de ervas e de insetos foram empregadas e as sementes foram fornecidas aos co-operadores pré-tratados com um pacote padrão de tratamento de sementes com fungicida/inseticida (Acceleron™ 2016 Corn, Monsanto, St. Louis, MO, USA). As aplicações foliares de fungicida foram feitas somente se especificado no protocolo do ensaio. Dezesseis tratamentos foram incluídos nos ensaios, incluindo PPFMs aplicadas isoladamente, PPFMs aplicadas em combinação, PPFMs aplicadas junto com fungicidas químicos e padrões de fungicida isolados (Tabela 14). As composições de PPFM foram diluídas para uma concentração de aproximadamente 109 UFC/ml e aplicadas nas taxas mostradas na Tabela 14. As avaliações coletadas incluíram estande e vigor no início da estação, incidência e gravidade da cercosporiose no meio da estação, época de floração, diâmetro do caule, alojamento, estande final na colheita, rendimento e teor de umidade. Os dados de incidência e gravidade de cada data de classificação foram combinados para prover um valor de índice de doença [(incidência * gravidade) / 100]. Os dados de cada localidade foram analisados separadamente usando JMP v12.0 (SAS Institute, Cary, NC). Os efeitos do tratamento nas variáveis de resposta de interesse foram determinados usando a função “Fit Model” com “Treatmento” especificado como um efeito fixo e “Rep” como um efeito aleatório. A separação de médias post-hoc foi realizada usando a opção “LSMeans Differences Student's” dentro de “Fit Model” e as médias são reportadas como LSMeans do modelo correspondente. Na localidade de Bethel, Missouri, a testemunha sem tratamento foi o tratamento de menor rendimento e manteve os níveis mais altos de incidência e severidade da doença cercosporiose durante a estação de crescimento (Tabela 15). Os tratamentos com NLS0109 proveram um aumento de rendimento superior a 10 bu/A em relação à testemunha sem tratamento. Os valores do índice de doença para ambos os tratamentos com NLS0109 foram significativamente menores (P <0,05) do que a testemunha sem tratamento nas duas primeiras datas de avaliação (12 de agosto e 21 de agosto), mas na data de classificação final (28 de agosto) apenas a combinação de tratamento de NLS0020 no sulco seguido por um tratamento foliar de NLS0109 suprimiu a doença em relação à testemunha não tratada (Tabela 15). Tabela 14. Tratamentos de Ensaios de Campo de Cercosporiose 2016
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1 estágio de desenvolvimento VT: último ramo do pendão completamente visível, mas estilo-estigmas não visíveis. Tabela 15. Resultados do Ensaio de Campo de Cercosporiose Verão 2016—Bethel, Missouri
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1Valores reportados são médias de seis parcelas repetidas por tratamento 2Médias seguidas da mesma letra maiúscula não são significativamente diferentes uma da outra pelo teste de comparação de médias post-hoc de T de Student LSMeans Differences (alfa = 0,05)
Exemplo 5 Detecção de isolados de Methylobacterium em culturas agrícolas alvo
[00111] Os ensaios são descritos para a detecção de cepas de Methylobacterium específicas e derivados estreitamente relacionados em culturas agrícolas alvo.
[00112] Um ensaio baseado em ácido nucleico bloqueado (LNA) de qPCR é desenvolvido como se segue. A sequência de DNA genômico de NLS109 é comparada por análise BLAST de aproximadamente 300 pb fragmentos utilizando uma janela deslizante de de 1-25 nucleotídeos a sequências do genoma completo de mais de 1000 isolados de Methylobacterium públicos e privados. Foram identificados os fragmentos de DNA genômico que tinham alinhamentos BLAST fracos, indicativos de aproximadamente 60-95% de identidade ao longo de todo o fragmento, a fragmentos correspondentes de NLS0109. Os fragmentos alvo do genoma de NLS0109 correspondentes às regiões de alinhamentos fracas identificadas que foram selecionados para o desenvolvimento do ensaio são providos como SEQ ID NOS: 9-11 Tabela 16. Sequências de Fragmentos Alvo de NLS0109
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[00113] As regiões na SEQ ID NOS: 9-11 onde as regiões correspondentes em outras cepas de Methylobacterium foram identificadas como tendo um ou mais mal pareamentos de nucleotídeos da seqüência NLS109 foram selecionadas, e iniciadores de qPCR projetados usando o software Primer3 (Untergasser et al., 2012, Koressaar et al., 2007) para flanquear as regiões de mal pareamento, ter uma temperatura de fusão (Tm) na faixa de 53-58 graus e gerar um fragmento de DNA de PCR de aproximadamente 100 pb. A sequência da sonda foi projetada com um corante repórter 5’ FAM, um supressor 3’ Iowa Black FQ e contém de uma a seis bases de LNA (Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa). Pelo menos 1 das bases de LNA está na posição de um mal pareamento, enquanto as outras bases de LNA são usadas para elevar a Tm. A Tm da sequência da sonda é direcionada para estar 10 graus acima da Tm dos iniciadores.
[00114] As sequências de iniciadores e sonda para detecção da detecção específica de NLS0109 são providas como SEQ ID NOS: 12-20 na Tabela 17. Cada uma das sondas contém um corante repórter 5’ FAM e um supressor 3' Iowa Black FQ. Tabela 17 Sequências de Iniciador e Sonda para Detecção Específica de NLS0109
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*Letras em negrito e sublinhadas representam a posição de uma base de LNA
Uso de conjuntos de iniciador/sonda em DNA isolado para detectar NLS0109 e distinguir de isolados de Methylobacterium relacionados
[00115] Uma reação de qPCR é realizada em 20 ul e contém 10 ul de 2x KiCqStartTM Probe qPCR ReadyMixTM, Low ROXTM da Sigma (no de cat KCQS05-1250RXN), 1 ul de mistura 20x iniciador-sonda (concentração final de iniciadores é 0,5 uM cada e concentração final da sonda é 0,25 uM) e 9 ul de molde de DNA/água. Aproximadamente 30-40 ng de molde de DNA é usado por reação. A reação é realizada em uma máquina Stratagene Mx3005P qPCR com o seguinte programa: 95oC por 3 min, em seguida 40 ciclos de 95oC por 15 seg e 60oC por 1 min. O software MxPro na máquina calcula um valor limite e Ct para cada amostra. Cada amostra foi executada em triplicata na mesma placa de qPCR. Um resultado positivo é indicado onde o delta Ct entre controles positivos e negativos é de pelo menos 5.
[00116] O uso dos três conjuntos iniciador/sonda para distinguir NLS0109 a partir de isolados estreitamente relacionadas por análise de DNA isolado está apresentado na Tabela 18 abaixo. A pontuação de similaridade mostrada para os isolados relacionados leva em conta tanto a identidade média de nucleotídeos quanto a fração de alinhamento entre os isolados e NLS0109. Uma das cepas testadas, NLS0730, foi usada como um controle positivo adicional. Foi isolado a partir de uma cultura de NLS0109, foi confirmada por sequenciamento do genoma completo como idêntico ao NLS0109, e marcou pontuações positivas em todas as três reações. A pontuação de similaridade maior que 1.000 para esta cepa é provavelmente o resultado de uma montagem ligeiramente diferente do genoma para este isolado em comparação com o NLS0109. O delta Ct de aproximadamente 15 ou mais entre os isolados de NLS0109 e NLS0730 e o controle apenas com água é consistente com a confirmação da sequência da identidade destes isolados. A análise de outros isolados menos estreitamento relacionados com o NLS0109 resulta em valores de delta Ct semelhantes aos do controle somente com água. Tabela 18
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Uso de iniciador/sondas para detecção de NLS109 em materiais de plantas tratadas. Detecção de NLS0109 em lavagens de sementes de sementes de soja tratadas.
[00117] O NLS0109 pode ser detectado e distinguido de outros isolados de Methylobacterium em sementes de soja tratadas como se segue. As sementes de soja foram tratadas com isolados de Methylobacterium de solução estoque de glicerol congelada 10x para obter uma concentração final de 106 UFC/semente. O polímero Becker Underwood Flo Rite 1706 é utilizado para melhorar a aderência. Um controle não inoculado contendo polímero e água é usado. O DNA é isolado das sementes como segue. Aproximadamente 25 ml de sementes tratadas são submersas durante 5 minutos em 20 ml de solução salina estéril a 0,9%. Os tubos são centrifugados durante 15 minutos, depois a lavagem de sementes é removida para um novo tubo. Um adicional de 10 ml de solução salina estéril a 0,9% é adicionado às mesmas sementes, centrifugado brevemente e combinado com a lavagem prévia da semente. O líquido de lavagem de sementes é centrifugado. O pellet solto é salvo e transferido para tubos menores, enquanto o sobrenadante é descartado. A amostra é centrifugada novamente, e a amostra final é obtida como um pellet solto de aproximadamente 100 ul. O pellet de 100 ul é utilizado como entrada para extração de DNA usando o Kit de Extração de DNA Microbiano MOBio UltraClean no de Cat 12224-250. Como mostrado na Tabela 19, NLS0109 e NLS0730 são detectados em lavagens de sementes a partir de sementes de soja tratadas utilizando todos os 3 conjuntos de sonda- iniciador, como demonstrado por delta Ct superior a 10 em comparação com valores de Ct de controles negativos. Tabela 19
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Detecção de NLS0109 em folhas de plantas cultivadas de sementes de soja tratadas.
[00118] As sementes de soja foram tratadas com isolados de Methylobacterium NLS0109, NS0730, e NLS0731 a partir da solução estoque de glicerol congelada 10x para obter uma concentração final de 106 UFC/semente. O polímero Becker Underwood Flo Rite 1706 é utilizado para melhorar a aderência. Um controle não inoculado continha polímero e água. As sementes foram plantadas em mistura de solo de campo, colocadas em uma câmara de crescimento por aproximadamente duas semanas e regadas com água de RO (osmose reversa) não fertilizada a cada 1-2 dias para manter o solo úmido. Após 2 semanas de crescimento, folhas verdadeiras a partir de cerca de 9 plantas foram colhidas em tubos estéreis. Cada tratamento teve pelo menos 2 repetições em cada experimento e cada experimento foi cultivado pelo menos 3 vezes.
[00119] O DNA das bactérias nas folhas colhidas é isolado da seguinte forma. As folhas são submersas durante 5 minutos em tampão contendo Tris 20 mM, EDTA 10 mM e Triton X-100 a 0,024%. Os tubos são centrifugados durante 10 minutos e depois sonicados em dois tratamentos de 5 minutos (10 minutos no total). O tecido da folha é removido e o líquido restante é centrifugado. O pellet solto é salvo e transferido para tubos menores, enquanto o sobrenadante é descartado. A amostra é centrifugada novamente, e a amostra final é obtida como um pellet solto de aproximadamente 100 ul. O pellet de 100 ul é utilizado como entrada para extração de DNA usando o Kit de Extração de DNA Microbiano MOBio UltraClean no de Cat 12224250. O rendimento médio de DNA é 50-60 ng/ul em 30ul. Como mostrado na Tabela 20, NLS0109 e NLS0730, são detectados em folhas colhidas a partir de plantas cultivadas de sementes de soja tratadas com as cepas de Methylobacterium usando todos os 3 conjuntos de iniciador-sonda, como demonstrado pelos valores delta Ct de cerca de 5.
Tabela 20
[00120] Média de 3 experimentos, cada um com 3 repetições biológicas
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[00121] Para detecção do tratamento com pulverização foliar de NLS0109 em milho: Sementes de milho não tratadas foram plantadas em solo de campo na câmara de crescimento, e regadas com água RO não fertilizada. Depois que as plantas germinaram e cresceram por aproximadamente 3 semanas, elas foram transferidas para a estufa. No estágio V5, as plantas foram divididas em 3 grupos para tratamento: pulverização foliar de NLS0109, pulverização foliar simulada e não tratada. As plantas que receberam a pulverização foliar de NLS0109 foram tratadas com solução estoque de glicerol 10x a uma taxa de 71,4 ul por planta utilizando pulverizadores Solo. Isso se converte na taxa de 10 L/acre no campo. As plantas tratadas de modo simulado foram pulverizadas com 71,4 ul de água/planta. Plantas não tratadas não receberam tratamento de pulverização foliar. As folhas foram colhidas duas semanas após o tratamento com pulverização foliar em tubos estéreis e o DNA de bactérias nas folhas colhidas é isolado como descrito acima. Cada experimento foi cultivado pelo menos 2 vezes. Como mostrado na Tabela 21, NLS0109 é detectada em folhas colhidas a partir de plantas de milho tratadas por uma aplicação por pulverização foliar das cepas de Methylobacterium, utilizando todos os três conjuntos de iniciador-sonda, como demonstrado por valores de Ct delta de cerca de 10 entre a amostra e os controles negativos. Tabela 21
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[00122] Os resultados acima demonstram o uso de iniciadores e sondas específicos do genoma para detectar a cepa de Methylobacterium NLS0109 em vários tecidos vegetais após o tratamento com as cepas, e proveem métodos para distinguir NLS0109 de isolados estreitamente relacionados. Métodos semelhantes são desenvolvidos para cepas adicionais de Methylobacterium, NLS0020, NLS0017 e NLS0089 usando fragmentos da sequência alvo e os pares iniciador/sonda, como mostrado nas Tabelas 22 - 27 abaixo. Tabela 22 Sequências de Fragmentos Alvo de NLS0020
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Tabela 23 Sequências de Iniciador e Sonda para Detecção Específica de NLS0020
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*Letras em negrito e sublinhadas representam a posição de uma base de LNA Tabela 24 Sequências de Fragmentos Alvo de NLS0017
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Tabela 25 Sequências de Iniciador e Sonda para Detecção Específica de NLS0017
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*Letras em negrito e sublinhadas representam a posição de uma base de LNA Tabela 26 Sequências de Fragmentos Alvo de NLS0089
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Tabela 27 Sequências de Iniciador e Sonda para Detecção Específica de NLS0089
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*Letras em negrito e sublinhadas representam a posição de uma base de LNA
[00123] Exemplo 6 Ensaios de campo de cercosporiose verão 2017
[00124] O efeito do tratamento com Methylobacterium na doença de cercosporiose foi avaliado em experimentos de campo de milho. Os ensaios foram realizados como um bloco completamente aleatorizado com seis repetições. Foram utilizadas práticas agronômicas locais padrão para aplicação de fertilizantes, lavoura, espaçamento entre linhas, população e gestão de pragas. As práticas padrão de gestão de ervas e de insetos foram empregadas e as sementes foram fornecidas aos co-operadores pré-tratados com um pacote padrão de tratamento de sementes com fungicida/inseticida (Acceleron™ 2016 Corn, Monsanto, St. Louis, MO, USA). As aplicações foliares de fungicida foram feitas somente se especificado no protocolo do ensaio e mostradas nas tabelas abaixo. Quando a semente foi pré-tratada com Methylobacterium, ela foi provida a partir de uma composição compreendendo de 109-1010 UFC/ml para prover aproximadamente 106 UFC/semente. Para aplicações em sulco ou foliar, as composições de PPFM foram diluídas para uma concentração de aproximadamente 109 UFC/ml e aplicadas nas taxas mostradas nas tabelas abaixo.
[00125] Em um ensaio, os tratamentos com NLS0109 em combinação com NLS0017 ou NLS0020 foram avaliados. As cepas de Methylobacterium foram aplicadas como tratamento de sementes ou em aplicações em sulco. A gravidade da doença e os resultados de rendimento são providos na Tabela 28 abaixo. O tratamento com NLS0109/NLS0017 no sulco proveu um aumento de rendimento de 15 bu/acre em relação à testemunha sem tratamento. O tratamento com NLS0109/ NLS0109 como um tratamento de semente proveu um aumento de rendimento superior a 10 bu/acre em relação à testemunha sem tratamento. Cada um destes tratamentos resultou em um rendimento que foi aproximadamente o mesmo (ou ligeiramente aumentado) em relação ao milho tratado com Fortix (estrobilurina mais triazol). Tabela 28 Redução da Doença de Cercosporiose com Combinações de Cepas de PPFM
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[00126] Em um segundo ensaio, o NLS0089 e o NLS0109 foram aplicados em diferentes taxas de aplicação, isoladamente ou em combinação com fungicidas comerciais, também aplicados em várias taxas. Todas as aplicações foram por pulverização foliar no estágio de desenvolvimento VT. A gravidade da doença e os resultados de rendimento são providos nas Tabelas 29 e 30 abaixo. Tabela 29 NLS 89 e 109 aplicados em combinação com Headline (piraclostrobina)
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Tabela 30 NLS 89 e 109 aplicados em combinação com Monsoon (Tebuconazol)
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Exemplo 7 Ensaio em estufa para determinar a atividade de cepas de Methylobacterium contra espécies de Pythium
[00127] Um experimento em estufa foi realizado para avaliar a capacidade de cepas de Methylobacterium suprimirem a doença de Pythium em soja. Os tratamentos com Methylobacterium foram comparados com tratamentos com metalaxil em várias taxas para determinar se as cepas de Methylobacterium podem prover proteção além do nível de proteção provido pelos tratamentos de sementes agronômicas comumente usados. O experimento foi projetado para permitir o crescimento de plantas na presença de níveis moderados de Pythium. spp. para determinar os impactos na emergência, % de sementes mortas e incidência e gravidade de podridão da raiz.
[00128] Os inoculantes de Pythium foram preparados misturando 453 g de arroz parboilizado e 323 mL de água destilada, colocando o arroz em um saco plástico autoclavável ventilado e autoclavando 2 x 40 minutos com cada ciclo separado por 24 horas. O arroz foi inoculado com culturas de Pythium com 3-4 dias de idade e incubado durante 7-10 dias a 230C no escuro. O inóculo foi então seco durante 2 dias.
[00129] Uma camada de 20 ml de inóculo de arroz é colocada no solo em xícaras e um solo adicional é colocado em camadas sobre o inóculo para posicionar o inóculo aproximadamente 2-3 cm abaixo das sementes a serem plantadas. A água é adicionada ao solo e 10 sementes são plantadas em cada xícara. As coberturas em forma de abóbadas são colocadas sobre as xícaras e as xícaras são colocadas em câmaras de crescimento com temperatura regulada a 230°C e em um ciclo diurno de 16 horas de luz e 8 horas de escuridão. As sementes são incubadas por 14 dias a 230C. Para experimentos para avaliar a atividade de cepas de Methylobacterium contra um consórcio de 4 espécies de Pythium, as sementes são incubadas por 14 dias a 130°C e por mais 7 dias a 230°C.
[00130] As plantas são avaliadas quando o primeiro trifólio aflorou completamente e é aberto para determinar o peso total da planta, o número de mudas e o número de sementes mortas. A incidência da doença é avaliada como porcentagem de plantas com raízes podres e gravidade de doença como porcentagem de tecido da raiz podre para cada muda. Os resultados das análises são providos nas Tabelas 31-36 abaixo.
[00131] Os resultados da inoculação com Pythium sylvaticum a 230°C são apresentados nas Tabelas 31-32 abaixo. Tabela 31
Figure img0048
[00132] NLS0109 e NLS0089 melhoraram emergência e reduziram a % de sementes mortas melhor que 7gm/100 kg de ingrediente ativo metalaxil Tabela 32
Figure img0049
[00133] NLS0109 melhorou a emergência e reduziu a gravidade da podridão da raiz melhor do que 7, 15 ou 25 g/100 kg de ingrediente ativo metalaxil
[00134] Os resultados da inoculação com Pythium lutarium a 230°C são apresentados nas Tabelas 33-34 abaixo. Tabela 33
Figure img0050
[00135] O NLS0109 melhorou a emergência e reduziu a porcentagem de sementes mortas melhor do que 25 g/100 kg de ingrediente ativo metalaxil e realizou assim como 15 g/100 kg de ingrediente ativo metalaxil Tabela 34
Figure img0051
[00136] NLS0109 melhorou a emergência e reduziu a gravidade da podridão da raiz melhor do que 7, 15 ou 25 g/100 kg de ingrediente ativo metalaxil
[00137] Os resultados da inoculação com um consórcio de 4 espécies de Pythium em temperatura alternada de 130C e 230C são mostrados nas Tabelas 35-36 abaixo. As quatro espécies, que são todos importantes patógenos de milho e soja, são P. torulosum, P. oopapillum, P. sylvaticum e P. desempium. Tabela 35
Figure img0052
[00138] NLS0109 e NLS0089 melhoraram emergência e NLS0089 reduziu a % de sementes mortas melhor que 7gm/100 kg de ingrediente ativo metalaxil. Tabela 36
Figure img0053
[00139] NLS0109 e NLS0089 reduziram a incidência e a gravidade da podridão da raiz quando aplicados na semente não tratada melhor que 7, 15 ou 25 g/100 kg de ingrediente ativo metalaxil
Exemplo 8 Análise do Efeito de cepas de Methylobacterium em doenças do solo de Rhizoctonia e Fusarium
[00140] O efeito do tratamento com Methylobacterium na emergência foi avaliado em ensaios de campo de soja e milho. A emergência melhorada é evidência de atividade do tratamento com Methylobacterium contra patógenos comuns de solo de Fusarium e Rhizoctonia. Os ensaios foram realizados como um bloco completamente aleatorizado com quatro repetições. Foram utilizadas práticas agronômicas locais padrão para aplicação de fertilizantes, lavoura, espaçamento entre linhas, população e gestão de pragas. As práticas padrão de gestão de ervas e de insetos foram empregadas e as sementes foram fornecidas aos co-operadores pré-tratados com um tratamento padrão de sementes com fungicida/inseticida. As composições de tratamento de sementes para soja continham ipconazol, metalaxil, imidacloprida e um revestimento de sementes, além das cepas de Methylobacterium. As composições de tratamento de sementes para milho continham ipconazol, metalaxil, trifloxistrobina e clotianidina. As contagens dos estandes foram feitas aos 21 dias após a primeira emergência ou cerca de 27 dias após o plantio. O efeito do tratamento com Methylobacterium na emergência em milho foi avaliado com Methylobacterium provido como tratamento de sementes ou por aplicação em sulco. Os resultados são apresentados nas Tabelas 37-39 abaixo. Tabela 37 Emergência de Soja
Figure img0054
[00141] O tratamento de sementes com NLS0109 melhorou a contagem de sementes de soja em comparação com o tratamento com Integral™ (B. subtilis, BASF), PPST 2030 (Pioneer Premium Seed Treatment) e controle não tratado. Tabela 38 Emergência de Milho após tratamento de sementes com Methylobacterium
Figure img0055
Tabela 39 Emergência de Milho após aplicação em sulco de Methylobacterium
Figure img0056
[00142] O tratamento de sementes com NLS0109 em combinação com NLS0017 melhorou a emergência de milho em comparação com o controle não tratado.
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[00170] A inclusão de várias referências aqui não deve ser interpretada como qualquer admissão pelo Requerente de que as referências constituem técnica anterior. Os requerentes reservam expressamente o seu direito de contestar quaisquer alegações de não patenteabilidade de invenções aqui descritas sobre as referências aqui incluídas.
[00171] Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente descrição, deve ser evidente para as pessoas peritas na técnica que a descrição pode ser modificada em arranjo e detalhes sem se afastar de tais princípios.
[00172] Embora os materiais e métodos desta descrição tenham sido descritos em termos de várias modalidades e exemplos ilustrativos, será evidente para os especialistas na técnica que as variações podem ser aplicadas aos materiais e métodos aqui descritos sem se afastar do conceito, espírito e escopo da descrição. Todos esses substitutos e modificações semelhantes, aparentes para os peritos na técnica, são considerados como estando dentro do espírito, escopo e conceito da descrição, como definido pelas reivindicações anexas ou de outro modo aqui descritas.

Claims (15)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que a composição compreende (i) Methylobacterium NLS0109 (NRRL B-67340) ou uma cepa de Methylobacterium relacionada a NLS0109 que tem em seu genoma um ou mais fragmentos de marcadores polinucleotídicos de SEQ ID NOS: 9-11; e (ii) um excipiente agriculturalmente aceitável selecionado do grupo consistindo em farinha de madeira, argilas, carvão ativado, terra diatomácea, sólidos inorgânicos e carbonato de cálcio; ou um adjuvante agriculturalmente aceitável selecionado do grupo consistindo em umidificante, um espalhante, um adesivo, um penetrante, um extensor e um umectante, que aumentam a eficácia do produto ou que aumentam a facilidade de aplicação do produto; ou uma combinação dos mesmos.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito Methylobacterium suprime uma doença causada por um fungo patogênico de plantas que é um Blumeria sp., um Cercospora sp., um Cochliobolus sp., um Colletotrichum sp., um Diplodia sp., um Exserohilum sp., um Fusarium sp., Gaeumanomyces sp., Macrophomina sp., um Magnaporthe sp., um Microdochium sp., um Peronospora sp., um Phakopsora sp., um Phialophora sp., um Phoma sp., um Phymatotrichum sp., um Phytophthora sp., um Pyrenophora sp., um Pyricularia sp, um Pythium sp., um Rhizoctonia sp., um Sclerophthora, um Sclerospora sp., um Sclerotium sp., um Sclerotinia sp., um Septoria sp., um Stagonospora sp., um Stenocarpella sp. ou um Verticillium sp.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende adicionalmente a cepa de Methylobacterium NLS0017 (NRRL B-50931), NLS0020 (NRRL B-50930), NLS0089 (NRRL B-50933), ou uma cepa de Methylobacterium relacionada com as mesmas compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 37-39, 21-24 ou 49-51, respectivamente.
4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a composição compreende adicionalmente um fungicida.
5. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o dito fungicida é um fungicida de estrobilurina, um triazol, um fenilamida, tiazol-carboxamida, ou piperidinil-tiazol-isoxazolina.
6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os referidos argila ou sólido inorgânico são selecionados do grupo que consiste em bentonita de cálcio, caulino, caulinita (china clay), talco, perlita, mica, vermiculita, sílicas, pó de quartzo, montmorilonita e misturas dos mesmos.
7. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido adjuvante agriculturalmente aceitável é selecionado do grupo consistindo em acetatos de polivinil, copolímeros de acetato de polivinil, acetatos de polivinil hidrolisados, copolímero de polivinilpirrolidona-acetato de vinil, álcoois polivinílicos, copolímeros de poli (álcool vinílico), éter metílico de polivinil, copolímero de éter metílico de polivinil-anidrido maleico, ceras, polímeros de látex, celuloses incluindo etilceluloses e metilceluloses, hidroximetilceluloses, hidroxipropilcelulose, hidroximetilpropilceluloses, polivinilpirrolidonas, alginatos, dextrinas, maltodextrinas, polissacarídeos, gorduras, óleos, proteínas, goma karaya, goma jaguar, goma tragacanta, gomas polissacarídicas, mucilagem, gomas árabicas, goma-laca, polímeros e copolímeros de cloreto de vinilideno, polímeros e copolímeros de proteína à base de soja, lignossulfonatos, copolímeros acrílicos, amidos, polivinilacrilatos, zeínas, gelatina, carboximetilcelulose, quitosano, óxido de polietileno, polímeros e copolímeros de acrilamida, acrilato de polihidroxietil, monômeros de metilacrilamida, alginato, etilcelulose, policloropreno e xaropes ou misturas dos mesmos.
8. Uso de uma composição como a definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a composição reduz a incidência e/ou severidade de uma doença causada por um fungo patogênico de plantas na planta.
9. Método para suprimir uma doença causada por um fungo patogênico de plantas, caracterizado pelo fato de que compreende a aplicação da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 em uma planta, uma parte de planta, no solo em que uma planta cresce, ou qualquer combinação dos mesmos em uma quantidade que provê a redução da incidência e/ou severidade de uma doença causada pelo referido fungo patogênico de plantas na referida planta, parte da planta ou uma planta obtida a partir da mesma em relação a uma planta controle, parte da planta ou planta que não tinha recebido uma aplicação da referida composição ou foi cultivada em solo tratado com a composição.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a planta ou parte de planta é selecionada a partir do grupo que consiste em uma planta de arroz, trigo, milho, cevada, painço, sorgo, aveia, centeio, Brassica, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, batata, amendoim, algodão, batata-doce, mandioca, café, coco, abacaxi, citrinos, cacau, chá, banana, abacate, figo, goiaba, manga, oliva, mamão, caju, macadâmia, amêndoa, beterraba sacarina, cana de açúcar, tomate, alface, feijão verde, feijões-de-lima, ervilhas, cucurbitáceas, plantas ornamentais, coníferas e plantas de relva ou parte de planta.
11. Método para preparar a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende combinar a Methylobacterium que suprime uma doença causada por um fungo patogênico de planta com o excipiente agriculturamente aceitável e/ou com o adjuvante agriculturamente aceitável.
12. Uso de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1-7 para melhorar a germinação e/ou emergência de sementes na presença de um fungo patogênico de plantas, caracterizado pelo fato de que uma composição como a definida em qualquer uma das reivindicações 1-7 é aplicada a uma semente de planta em uma quantidade que proporciona germinação e/ou emergência melhoradas na presença de um fungo patogênico de plantas em relação à germinação e/ou emergência de uma semente controle que não recebeu uma aplicação da referida composição.
13. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o dito fungo patogênico de planta é um Fusarium, Rhizoctonia or Pythium sp.
14. Método para detectar a presença de uma cepa de Methylobacterium NL0109, NLS0020, NLS0017 ou NLS0089 em uma amostra, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende detectar a presença, na amostra, de um ácido nucleico compreendendo ou localizado na SEQ ID NO: 9-11, 21-24, 37, 38 ou 49-51.
15. Material de propagação de planta, caracterizado pelo fato de que é uma parte de planta revestida com a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a parte de planta é uma semente ou outro propágulo de planta.
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