BR112019011015A2 - uso de uma composição, formulação e seu uso, lubrificante vaginal prebiótico e uso de uma cápsula vaginal simbiótica - Google Patents

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Abstract

a invenção refere-se a composições para administração vaginal ou, alternativamente, oral, e ao uso de tais composições para estabilizar a acidez vaginal, ou, alternativamente, a acidez intestinal e estabelecer condições favoráveis para a inibição de patógenos e para o crescimento de lactobacilos no trato urogenital, ou, alternativamente, gastrointestinal.

Description

USO DE UMA COMPOSIÇÃO, FORMULAÇÃO E SEU USO, LUBRIFICANTE VAGINAL PREBIÓTICO E USO DE UMA CÁPSULA VAGINAL SIMBIÓTICA
CAMPO DA INVENÇÃO [0001] A invenção refere-se a uma composição bioquímica de formulações urogenitais que estabilizam a acidez na vagina e estabelecem condições adequadas para a inibição de patógenos urogenitais e o crescimento de lactobacilos. A invenção proporciona composições para administração vaginal ou, alternativamente, oral, e à utilização de tais composições para estabilizar a acidez vaginal ou, alternativamente, a acidez intestinal e estabelecer condições favoráveis para a inibição de patógenos e o crescimento de lactobacilos no trato urogenital, ou alternativamente, gastrointestinal. Estas composições baseiam-se em ingredientes quimicamente definidos, evitando componentes nutricionais naturais ou mal definidos comumente utilizados e as composições podem estar associadas a estirpes vaginais humanas com propriedades antimicrobianas e/ou anti-inflamatórias especificas. Além disso, deve-se prestar atenção ao valor apropriado do potencial redox seguinte à administração vaginal de tal formulação, em particular com respeito à inibição de patógenos associados à vaginose bacteriana (BV) do tipo G. vaginalis.
[0002] Finalmente, as formulações também são apresentadas contendo um agente para adicionalmente inibir o crescimento de leveduras oportunistas, como Candida albicans, sem comprometer o crescimento de lactobacilos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
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2/67 [0003] É bem conhecido que as bactérias não patogênicas, úteis e bem toleradas, a chamada microbiota natural humana, predominam no intestino, na vagina e na uretra/bexiga no estado saudável, enquanto que o crescimento excessivo de microrganismos patogênicos e oportunistas, tais como bactérias, leveduras, vírus e protozoários, muitas vezes leva a infecções por disbiose nesses órgãos.
[0004] Os termos bactérias aeróbicas e bactérias anaeróbicas são comumente usados para descrever, respectivamente, os microrganismos que necessitam de ar e aqueles incapazes de crescer na presença de ar.
[0005] Notavelmente, algumas das bactérias não patogênicas e patogênicas, que podem ser encontradas na vagina, podem ser definidas como anaeróbias não facultativas, isto é, elas podem crescer tanto na presença como na ausência de ar e basicamente não são afetadas por condições oxidativas no meio de crescimento. Exemplos não limitativos de tais bactérias anaeróbicas não facultativas são E. coli e Staphylococcus aureus, que são conhecidas por causar uma condição vaginal geralmente indicada como vaginite aeróbica.
[0006] Outros microrganismos que podem ser encontrados na vagina são anaeróbios obrigatórios, isto é, não crescem na presença de oxigênio livre e podem, na verdade, ser mortos na presença de oxigênio ou de condições oxidativas.
[0007] Organismos anaeróbicos como Gardnerella vaginalis, um anaerobic obrigatório, migrando do períneo para a vagina, ou adquiridos através de relações sexuais, podem causar disbiose com poucos sintomas, seguidos por uma vaginose bacteriana completa (BV) , que é a infecção vaginal mais comum. A BV
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3/67 constitui um sério risco ao trabalho de parto prematuro em mulheres grávidas e aumenta o risco de infecções sexualmente transmissíveis (Ref. 1) . Em tais casos de disbiose vaginal ou infecções vaginais causadas por anaeróbios, o pH do meio vaginal aumenta dos valores fisiológicos de 3,5-4,5 para valores que atingem 5-6 ou até mais. Este aumento do pH é um parâmetro clínico crítico utilizado no diagnóstico da BV e uma das principais causas dos riscos associados à BV. A ação fermentativa da microbiota de lactobacilos de Doderlein sobre os metabolites do glicogênio e outros carboidratos presentes na vagina e produzindo principalmente ácido láctico, bem como outros ácidos orgânicos em menor grau, e resulta no baixo valor de pH dos fluidos vaginais. Além disso, certas estirpes de E.coli Gram-negativas, originadas do intestino e migrando primeiro para a vagina e, posteriormente, para a uretra/bexiga são a causa mais comum de uretrite/cistite em mulheres sexualmente ativas. Esta mesma E.coli também pode causar disbiose na vagina, uma condição chamada vaginite aeróbica, que também é acompanhada por uma perturbação da microbiota vaginal, uma diminuição na acidez vaginal e um aumento do valor de pH correspondente (Ref. 2).
[0008] Outro patógeno causador de infecções vaginais, em particular durante a gravidez, é a levedura Candida que se comporta de maneira oportunista e frequentemente coexiste com os lactobacilos.
[0009] Candida é o único organismo de levedura que se comporta como um anaerobic facultativo, isto é, basicamente não é afetado pela presença ou ausência de ar e de condições oxidativas.
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4/67 [0010] Estas infecções são normalmente curadas por tratamento anti-infecioso dirigido contra os patógenos que se pretende erradicar com sucesso no decurso de tal terapia, pelo menos em um certo grau. No entanto, em cerca de 70% dos casos, o paciente apresenta uma recaida ou uma reinfecção em até 3 meses após o tratamento primário (Ref. 3), porque os patógenos não foram adequadamente mortos ou devido à falta de proteção através da microbiota vaginal nativa restaurada. Esta microbiota é, na verdade, frequentemente danificada como consequência da terapia anti-infecciosa. A microbiota vaginal nativa, historicamente referida como microbiota de Doderlein, é sensível a muitos agentes anti-infecciosos e em particular antibióticos. Frequentemente é perturbada ou até mesmo erradicada pela terapia anti-infecciosa e, portanto, é incapaz de inibir a proliferação de organismos oportunistas, frequentemente patogênicos, sempre presentes. Como consequência, uma vaginose bacteriana tratada por um antibiótico especifico de espectro estreito contra anaeróbios como a clindamicina podería levar a uma infecção por fungos, já que a microbiota vaginal depletada por Lactobacillus não pode mais inibir as leveduras oportunistas.
[0011] A possibilidade de aplicar Lactobacillus exógeno diretamente à vagina para tratar a disbiose ou a infecção da vagina já havia sido sugerida pelo médico que o descobriu, o próprio Albert Doderlein, em seu livro pioneiro em 1892 (Ref. 4). Desde então, esse conceito foi amplamente desenvolvido na literatura cientifica e de patentes e recentemente revisado de forma abrangente (Ref. 5).
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5/67 [0012] WO 2009/123982 A2 refere-se a métodos e composições para terapia de substituição de Lactobacillus, isto é, colonizar a mucosa vaginal com uma espécie microbiana desejada, ao contatar uma parede vaginal com uma formulação seca de células microbianas vivas.
[0013] WO 2016/020861 Al refere-se a composições de filme ou esponja e a um método para a prevenção e tratamento de infeções vaginais, em que o referido filme ou esponja compreende pelo menos um polímero mucoadesivo, pelo menos um probiótico e/ou prebiótico e pelo menos um composto ativo tal como um agente antifúngico ou antibiótico em quantidades farmacologicamente eficazes.
[0014] Nos últimos anos, os inventores levaram investigações completas sobre as propriedades de estirpes de Lactobacillus de origem vaginal humana, anteriormente desconhecidas, relevantes para a competição com os patógenos urogenitais mais comuns. Em particular, os inventores investigaram mecanismos envolvendo a interação de ácido láctico, peróxido de hidrogênio e outros agentes, os quais foram descobertos para explicar a atividade antibiótica excepcionalmente forte e especifica de, por exemplo, Lactobacillus gasseri contra Gardnerella vaginalis patogênica e Prevotella bivia (Ref. 6) e a atividade de L jensenii e L crispatus contra E. coli uropatogênica (Ref. 7) . A abordagem descrita nos documentos e patentes mencionados (Ref. 8) tem ainda a vantagem de usar estirpes isoladas do mesmo trato de mulheres perfeitamente saudáveis para uma aplicação terapêutica direcionada ao trato urogenital. Deste modo, possíveis problemas com a tolerabilidade de estirpes de Lactobacillus administradas
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6/67 exogenamente podem ser em grande medida reduzidos em comparação com a utilização de tais estirpes que não são de origem humana e não do trato urogenital de mulheres jovens saudáveis. Para estirpes de origem não humana, a questão da segurança e tolerabilidade em terapêuticos, por exemplo, aplicações urogenitais, não é clara a priori e deve, portanto, ser avaliada a posteriori.
[0015] Para proporcionar composições adequadas para um transportador farmaceuticamente aceitável, os inventores estudaram as diferentes formulações utilizadas em produtos probióticos e/ou descritas na literatura. Em uma abordagem publicada (Ref. 9) os inventores afirmam que o uso de leite desnatado resp. e preparações de leite desnatado e derivados chamados LGF (fator de crescimento de Lactobacillus) ou NGF (fator de crescimento natural) favorecem o crescimento dos Lactobacillus desejados, ao mesmo tempo que inibem o crescimento dos uropatógenos indesejados. Tais fatores de crescimento dedicados a serem usados para aplicações vaginais também foram encontrados em meios de crescimento microbiológico, de acordo com os mesmos inventores. O meio de crescimento mais utilizado para as estirpes de Lactobacillus é, na verdade, o meio MRS (DeMan-Rogosa-Sharp) (Ref. 10) . Além de minerais e vitaminas, este caldo também contém peptonas, fontes de carbono e especialmente nitrogênio de composição quimicamente mal definida. Outros inventores também recomendam o uso de substâncias proteináceas complexas como leite desnatado e albumina na matriz de preservação de um medicamento vaginal contendo estirpes de Lactobacillus (Ref. 11) .
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7/67 [0016] Em nossa opinião, enquanto formulações contendo nutrientes naturais, como leite desnatado ou peptonas, podem ser úteis para aplicações especiais, elas não são adequadas como ingredientes em formulações farmacêuticas contendo Lactobacillus para aplicações vaginais. Isso porque, primeiro, elas são de origem biológica (especialmente animal) e, segundo, esses ingredientes naturais têm frequentemente uma composição quimicamente mal definida e, portanto, carregam um risco aumentado de causar efeitos adversos nos pacientes, como explicado mais adiante. Além disso, do ponto de vista de uma eficácia seletiva, estes NGF podem não alcançar o efeito desejado para inibir o crescimento de uropatógenos. Não só as estirpes de lactobacilos, mas também numerosos agentes patogênicos podem crescer em um ingrediente tão rico (com proteínas, carboidratos, vitaminas, minerais e semelhantes)
como leite desnatado depois de ter estado em contato e
misturado com o fluido vaginal Patógenos como a E.coli
crescem às vezes mais nutrientes . rápido no leite do que em um caldo de
[0017] Tomando 2 patógenos comumente encontrados na
microbiota urogenital, S. aureus e E. coli, ambos os quais
também crescem vários logs em cerca de 20 horas quando
inoculados em um meio especifico para Lactobacillus como MRS
(Tabela 1), resultados semelhantes sendo obtidos também com
leite desnatado (não mostrado a seguir).
Tabela 1: Desempenho de crescimento dos 2 patógenos no caldo
MRS .
Patógeno Tempo (h) ODsoOnm pH Ufc/ml
E. Coli CCOS 492 0 0,05 6, 5 Approx. 108
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8/67
20 3, 05 5, 1 2,3xl010
S. aureus CCOS 461 0 0,05 6, 5 Approx. 108
20 3, 1 5,2 1, 8xl010
[0018] Mesmo começando com uma concentração relativamente alta de 108 cfu/ml, esses patógenos podem crescer ainda mais em MRS por vários logs, apenas para serem interrompidos após cerca de 20 horas no final pelo baixo pH que eles geraram. Ou seja, um chamado meio de crescimento altamente específico para Lactobacillus também pode promover o crescimento de patógenos perigosos. Para inibir o crescimento de tais patógenos, um inibidor efetivo e seletivo deve ser adicionado à formulação.
[0019] Portanto, se um indivíduo abriga principalmente estirpes de Lactobacillus saudáveis presentes em quantidades suficientes na vagina, pode ser apropriado administrar LGFs, uma vez que essas bactérias nativas de Lactobacillus podem metabolizá-los. No entanto, não será apropriado administrar a uma vagina dibiótica, já infectada, ou em déficit de Lactobacillus benéfico, LGF de qualquer tipo ou fatores de crescimento inespecíficos, pois estes podem estimular o crescimento dos patógenos presentes em vez das raras estirpes de Lactobacillus. Uma disbiose ou uma infecção pode até piorar com esse tratamento com LGF, cujo risco deve ser evitado.
[0020] Em conclusão: preparações de leite desnatado ou componentes de meios de crescimento de Lactobacillus como MRS podem, em algumas circunstâncias, sustentar o crescimento de Lactobacillus vaginal nativo eubiótico. No entanto, em geral, eles não são adequados como ingredientes terapêuticos de formulações farmacêuticas para serem aplicados em uma vagina
Petição 870190050285, de 29/05/2019, pág. 50/135
9/67 disbiótica, pois têm baixa seletividade para Lactobacillus e não são bem definidos quimicamente. A presente invenção destina-se a superar estas desvantagens.
[0021] Devido à produção de ácido láctico e de diferentes ácidos alifáticos pela microbiota fisiológica de Doderlein (isto é, vaginal), os fluidos vaginais exibem um pH ácido entre 3,5 e 4,5 em média, o que parece ser ótimo para a homeostase vaginal, já que Lactobacillus spp. pode ainda crescer a este pH pelo qual a maioria dos patógenos e micróbios oportunistas são inibidos. Acima de pH 4,5, os patógenos podem facilmente crescer, porém abaixo de pH 3,5, o crescimento dos próprios Lactobacillus de Doderlein torna-se cada vez mais inibido. Este fluido vaginal ácido, produzido pela fermentação da microbiota de Doderlein de carboidratos endógenos como os metabolites do glicogênio, é a base muito bioquímica do mecanismo de defesa da vagina contra infecções e de importância primordial para a saúde reprodutiva das mulheres (Ref. 12).
[0022] Considerando esses fatores, não é surpreendente que na literatura, sejam encontradas referências (por exemplo, Ref. 13) sobre a inclusão de um agente tamponante de pH não especificado na composição vaginal. Em outra aplicação (Ref. 14) recomenda-se uma composição que contém um agente tamponante (quimicamente não definido na referência mencionada) para estabilizar o grau ácido da vagina na faixa de pH 3,5 - 5,0.
[0023] Contudo, os presentes inventores descobriram gue o somente o pH ácido não é suficiente para impedir o crescimento dos patógenos em todos os casos. Experimentos conduzidos nos
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10/67 laboratórios dos inventores (mostrados abaixo) indicam que mesmo abaixo do pH 5, patógenos relevantes como S. aureus e E. coli podem crescer rapidamente. O meio utilizado continha lactose como fonte de carbono e MRS a 15% como promotor do início do crescimento.
[0024] Em conclusão: a importância do pH vaginal ácido é incontestável na comunidade científica e vários autores reconheceram a utilidade de adicionar um agente tamponante a uma formulação farmacêutica concebida para aplicação vaginal. A faixa de pH deve, portanto, ser claramente definida de acordo com a fisiologia na faixa entre 3,5 e 4,5. O valor de pH 4,5 no limite superior da faixa fisiológica é deliberadamente escolhido, pois é bem tolerado pelos pacientes. Valores mais ácidos, pH em torno de 4 ou menos, podem causar desconforto, como prurido e ardor, uma vez que o epitélio vaginal é mais sensível em casos de disbiose e infecções.
[0025] Além disso, a composição química do agente tampão e as doses devem ser indicadas na receita farmacêutica para, por exemplo, uma cápsula. Finalmente, o tampão deve ser capaz de exercer sua ação logo após a administração intravaginal e durar, pelo menos, até a próxima administração, ou seja, entre 12 e 24 horas.
[0026] Além do tampão ácido e dos fatores de nutrientes expostos na seção anterior, há também outros fatores que desempenham um papel no projeto de uma formulação pré- ou pró ou simbiótica eficaz para a aplicação vaginal. Um desses fatores é o potencial redox do fluido vaginal após a aplicação do dispositivo.
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11/67 [0027] Como mostraremos, isso é de relevância, especialmente no caso da vaginose bacteriana (BV) , onde os patógenos são anaeróbios obrigatórios (Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia, Atopobium vaginae, ...) . O potencial redox pode, de fato, influenciar o crescimento desses últimos patógenos mencionados.
[0028] O efeito do potencial redox no crescimento e sobrevivência de microrganismos na flora vaginal é mostrado na Figura 3 (de acordo com a Ref. 22, Eschenbach et al 1985).
[0029] Finalmente, outro micróbio potencialmente perigoso é o fungo Candida albicans, que muitas vezes está presente como um oportunista na flora vaginal. Os autores apresentarão um método para controlar o crescimento do fungo sem inibir o dos lactobacilos vaginais.
[0030] A presente invenção visa fornecer uma solução que atenda a esses objetivos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0031] Numa concretização, a presente invenção refere-se a uma composição para utilização no tratamento ou prevenção de infecções urogenitais causadas por microrganismos patogênicos em um indivíduo do sexo feminino, em que a composição compreende uma quantidade eficaz de cada:
a) um agente tampão,
b) um agente de preservação totalmente compatível com a microbiota vaginal,
c) uma fonte de nitrogênio bioquímica molecular pura ou iônica explorável pela microbiota vaginal,
d) polissacarideo prebiótico fermentável pela microbiota vaginal,
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12/67 em que o tratamento ou prevenção compreende administrar a composição intravaginalmente ao individuo, para estabilizar a acidez do fluido vaginal de um individuo com o valor fisiológico em torno de pH 4,5 ou inferior.
[0032] Numa concretização, a presente invenção proporciona um método para o tratamento ou prevenção de infecções urogenitais causadas por microrganismos patogênicos em um individuo feminino, que compreende a administração intravaginal ao individuo, opcionalmente após o tratamento anti-infeccioso de uma infecção urogenital, de uma formulação com uma quantidade efetiva de cada:
a) um agente tampão,
b) um agente de preservação totalmente compatível com a microbiota vaginal,
c) uma fonte de nitrogênio bioquímico molecular puro ou iônico explorável pela microbiota vaginal,
d) polissacarideo prebiótico fermentável pela microbiota vaginal, em que o tratamento ou prevenção compreende administrar a composição intravaginalmente ao individuo.
[0033] Em outra concretização, a presente invenção proporciona um método para estabilizar a acidez do fluido vaginal de um individuo com um valor fisiológico em torno de pH 4,5 ou inferior, o qual compreende administrar intravaginalmente ao individuo uma formulação com uma quantidade eficaz de cada:
a) um agente tampão,
b) um agente de preservação totalmente compatível com a microbiota vaginal,
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13/67
c) uma fonte de nitrogênio bioquímico molecular puro ou iônico explorada pela microbiota vaginal,
d) polissacarídeo prebiótico fermentável pela microbiota vaginal, em que o tratamento ou prevenção compreende administrar a composição intravaginalmente ao indivíduo. [0034] Em outra concretização, a presente invenção refere-se a uma formulação adequada para administração oral com um pH variando de 4 a 5, em que a composição compreende uma quantidade eficaz de cada:
a) um agente tampão,
b) um agente de preservação totalmente compatível com a microbiota vaginal,
c) uma fonte de nitrogênio bioquímico molecular puro ou iônico explorada pela microbiota vaginal,
d) polissacarídeo prebiótico fermentável pela microbiota vaginal.
FIGURAS [0035] Figura 1: Representação gráfica dos dados obtidos em experimentos de crescimento com Lactobacillus gasseri KS 120.1
CNCM 1-3218.
[0036]
Figura 2: Representação gráfica dos dados obtidos em experimentos de crescimento com S. aureus CCOS 461 muitirresistente.
[0037]
Figura 3: Representação esquemática bidimensional do potencial redox Eh e pH da acidez na vagina em função da composição da microbiota vaginal (flora) (de acordo com Ref. Eschenbach et ai. 1985)
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14/67 [0038] A presente invenção proporciona uma composição para utilização para estabilizar o pH do fluido vaginal ao valor fisiológico em torno de 4,5 e, opcionalmente, o potencial redox do fluido vaginal acima de 150 mV durante uma duração suficiente e para favorecer seletivamente o crescimento de Lactobacillus spp. contra o crescimento de agentes patológicos, em particular anaeróbios, como um método para prevenir, mitigar ou tratar infecções vaginais e urogenitais, tais como BV, causadas por microrganismos patogênicos, de acordo com as reivindicações anexas.
[0039] A composição de acordo com a presente invenção pode opcionalmente incluir uma substância natural, quimicamente definida, numa concentração que inibe Candida, mas não as bactérias Lactobacillus.
ACIDEZ E NUTRIENTES: FORMULAÇÕES CONTRA PATÓGENOS ANAERÓBIOS FACULTATIVOS [0040] Este método utiliza composições especificas, bioquimicamente bem definidas, de formulações farmacêuticas a serem aplicadas vaginalmente.
[0041] A composição no contexto da presente invenção contém os seguintes componentes bioquímicos:
- um agente de tamponamento bioquímico para manter o pH da composição (in vitro e in vivo) na faixa desejada de 4,0 a 5,0, preferivelmente 4,5, após a aplicação e durante até a 1224 h depois disso;
um agente de preservação anti-patogênico de natureza bioquímica de outro modo totalmente compatível com os componentes bacterianos da microbiota de Doderlein (vaginal) ;
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15/67 uma fonte biológica, quimicamente definida de carbono, escolhida para aumentar seletivamente o crescimento de Lactobacillus spp.;
uma fonte biologicamente explorável, de outra forma quimicamente pura, de nitrogênio que suporta um crescimento adequado e proliferação de Lactobacillus spp. (já presente ou administrado); e opcionalmente uma fonte de enxofre adequada, quimicamente definida, assimilável pelos lactobacilos;
moduladores redox (oxidantes em combinação com antioxidantes numa razão adequada);
- compostos químicos (orgânicos e/ou inorgânicos) escolhidos por sua atividade anti-infecciosa específica e direcionada contra patógenos de diferentes tipos, como parasitas e/ou protozoários e/ou bactérias e/ou fungos e/ou vírus e minerais selecionados, vitaminas e outros componentes opcionais, que podem ser relevantes para o crescimento de Lactobacillus spp. ou a inibição de patógenos indesejáveis. Um exemplo não limitativo de agente antifúngico, particularmente contra Candida, é o sorbato.
[0042] Os referidos ingredientes podem estar sozinhos na composição da presente invenção, ou em combinação com: estirpes de Lactobacillus probióticas, como células vivas ou os seus liofilizados, os seus sobrenadantes de cultura isenta de células ou os seus tindalizados, selecionados pelas suas propriedades específicas incluindo, mas não limitados a atividade semelhante a antibiótica contra patógenos urogenitais, adesão a células epiteliais vaginais/uretrais,
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16/67 produção de H2O2, ácido láctico, bem como de bacteriocinas e enzimas relevantes.
[0043] A formulação em si é uma forma galênica apropriada em um transportador ou sistema de entrega farmaceuticamente aceitável. A composição real pode ser instilada na forma de uma preparação liofilizada, creme, pasta, gel liquido ou de um supositório, cápsula ou comprimido/estilete para aplicação intestinal, uretral ou vaginal. Alternativamente, a preparação pode ser uma cápsula ou comprimido ou supositório, um creme ou gel (lubrificante) para o parto vaginal.
[0044] As espécies de Lactobacillus probióticas citadas acima devem estar na prática do método administrado como células inteiras viáveis, tipicamente em uma quantidade entre 105 e 1010 cfu ou como sobrenadante livre de células das culturas correspondentes em forma liquida, semi-sólida ou liofilizada. As espécies de Lactobacillus são preferencialmente selecionadas a partir do grupo consistindo em L. crispatus, L. jensenii, L. gasseri, L. acidophilus, L. iners, L. plantarum, L. fermentum, L. lactis e L. johnsonii.
[0045] Pelo contrário, o método de acordo com a presente invenção não compreende a utilização de meios como nutrientes lácteos naturais ou componentes de origem animal como sugerido anteriormente em outro local. Além do fato de que a eficácia dos referidos fatores de crescimento precisa ser ainda confirmada em estudos clínicos, tais nutrientes e componentes não são adequados para uma aplicação farmacêutica intravaginal ou intra-uretral pelas seguintes razões médicas. Eles podem conter substâncias conhecidas e desconhecidas de natureza proteica com potencial alergênico ou irritativo para
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17/67 os epitélios sensíveis da vagina e da uretra e/ou esporos bacterianos, virus, prions ou componentes/metabblitos dos mesmos que possam ter sobrevivido à esterilização e tornar-se uma ameaça potencial para a saúde do paciente.
[0046] As mesmas considerações detalhadas acima para a composição ótima de uma formulação probiótica aplicam-se analogamente ao ambiente gastrointestinal (GI). Embora o trato GI seja, em comparação com o trato urogenital, mais rico em nutrientes para a microbiota residente, bem como para os patógenos que residem no local, o conceito de que a formulação probiótica deve ajudar a manter a acidez ótima e o estado redox no trato GI e, ao mesmo tempo, a promoção do crescimento de bactérias probióticas saudáveis enquanto inibe o crescimento de patógenos e espécies oportunistas, permanece válida.
[0047] Há, no entanto, duas diferenças principais a serem consideradas quando se muda o foco do trato urogenital para o GI como um ecossistema.
[0048] Em primeiro lugar, a acidez no trato GI, devido à natureza e duração do mesmo, é variável (Ref. 17) . Os seguintes valores de pH são tipicamente medidos em humanos normais:
a. Estômago: 1,0 a 2,5
b. Intestino delgado proximal: 6,6
c. íleo terminal: 7,5
d. Ceco: 6,4
e. Reto: 7,0 [0049] O pH nos intestinos varia entre 6 e 7, em comparação com valores que variam de 3,5 a 5 na vagina saudável.
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18/67 [0050] Outra diferença é que o principal produto de fermentação ácida da microbiota GI não será predominantemente ácido láctico, mas toda uma gama de ácidos graxos de cadeia curta (SCFA), incluindo acetato ou butirato, que constituem o principal fluxo de carbono da dieta através da microbiota GI ao hospedeiro e uma importante contribuição para o metabolismo do hospedeiro (Ref. 18).
[0051] Como consequência, as fibras prebióticas compreendidas na composição de acordo com a invenção para melhorar o metabolismo das estirpes da microbiota de Doderlein, quando aplicadas no intestino, irão beneficiar não só os Lactobacillus spp., mas também, por exemplo, as bifidobactérias e outras espécies residentes. Vantajosamente, a composição de acordo com a invenção compreende pelo menos duas fibras diferentes que atuam a diferentes niveis do intestino, como a microbiota GI no intestino superior e no delgado, respectivamente, de algum modo diferente.
[0052] O método de acordo com a invenção para a aplicação urogenital pode ser traduzido sem grandes alterações na aplicação oral. De fato, o pH ótimo de uma preparação oral contendo probióticos é o do iogurte ou do leite coalhado, que está na região em torno de 4,5 (Ref. 19), o mesmo pH encontrado na vagina saudável.
[0053] Por esta razão, as considerações desenvolvidas acima, e os experimentos realizados em conformidade, mantêm sua validade quando se considera uma formulação oral adequada contendo probióticos. Como salientado acima, a principal diferença consiste na escolha das fibras prebióticas, tal como para o intestino é preferível incluir pelo menos duas fibras.
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19/67 [0054] Como utilizado daqui em diante, o termo composição refere-se à composição para administração intravaginal bem como à formulação para uso oral, como definido nas reivindicações anexas.
[0055] A composição de acordo com a presente invenção pode conter os seguintes componentes bioquímicos:
a. Um agente tampão bioquímico para manter o pH da composição (in vitro e logo dissolvido in vivo) na gama desejada de 4 a 5, preferivelmente 4,5;
b. um agente de preservação anti-patogênico de natureza bioquímica de outra forma totalmente compatível com os componentes bacterianos da microbiota intestinal de ácido láctico;
c. uma fonte biologicamente explorável, de outra forma quimicamente pura, de nitrogênio que suporta um crescimento adequado e proliferação de Lactobacillus spp. (já presente ou administrado);
d. fontes de carbono biológicas e quimicamente definidas escolhidas para aumentar seletivamente o crescimento de Lactobacillus spp. e ser fermentadas em ácido láctico, bem como SCFA; preferivelmente em combinação com
e. uma fonte de enxofre biologicamente explorável, de outra forma quimicamente pura, suportando um crescimento adequado e proliferação de Lactobacillus spp. (já presente ou administrado);
f. um componente que modula o potencial redox no fluido vaginal, que pode ser compreendido na composição na presença ou na ausência da fonte de enxofre,
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g. minerais selecionados, e/ou vitaminas, oxidantes/antioxidantes e outros componentes que podem ser relevantes para o crescimento de Lactobacillus spp. e a inibição dos patógenos, e
h. Lactobacillus probióticos como células vivas (ou seus liofilizados, seus sobrenadantes de cultura isenta de células ou seus tindalizados) selecionados por suas propriedades específicas, incluindo, mas não se limitando a, atividade antibiótica contra patógenos urogenitais e/ou intestinais, adesão ao intestino, bem como células epiteliais vaginais/uretrais, produção de H2O2, ácido láctico, bem como de bacteriocinas e enzimas relevantes.
[0056] No contexto da presente invenção, os termos quimicamente puro e quimicamente definido indicam um meio ou substância sintética, em que a composição química exata é conhecida (ref. Livro Texto Microbiologia Básica 8a Edição, W. A: Volk, J. C, Brown, 1997, páginas 39-40).
[0057] Um meio complexo (indefinido) é aquele em que a constituição química exata do meio não é conhecida. Os meios definidos são geralmente compostos de bioquímicos puros da prateleira; meios complexos geralmente contêm materiais complexos de origem biológica, como sangue ou leite ou extrato de levedura ou extrato de carne, cuja composição química exata é obviamente indeterminada. Um meio definido é um meio mínimo. A formulação em si pode ser uma formulação galênica apropriada em um transportador ou sistema de entrega farmaceuticamente aceitável. A composição real em líquido (bebidas iogurte), semi-sólido (iogurte, queijo) ou forma sólida, este último incluindo comprimidos, cápsulas, sachês e palitos também.
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21/67 [0058] A seguir estão concretizações preferidas da invenção.
a. Agente Tampão [0059] O objetivo de tal ingrediente é ajudar a manter o valor de pH do liquido vaginal após aplicação na gama fisiológica de pH 4 a 5. Os ácidos e os seus sais que têm em solução tais propriedades desejadas são, por exemplo, ácidos orgânicos como ácidos alifáticos: acético, propiônico, ácido asbártico butírico, ácidos dicarboxilicos como oxálico, malônico, succinico, hidroxi-ácidos como ácido lático, ácido citrico, ácidos dicarboxilicos como ácido málico. Também outros ácidos que são encontrados no organismo humano podem ser considerados para este uso, como ácido fosfórico.
b. agente de preservação antipatogênico compatível com a microbiota de Doderlein [0060] A especificidade do metabolismo das bactérias do ácido láctico é, como o próprio nome indica, a produção de ácido láctico. Esta é a principal razão para o uso, na preparação de alimentos tradicionais e industriais, da fermentação do ácido lático para matar potenciais patógenos presentes nos nutrientes brutos e preservá-los no final do processo de fermentação através de uma quantidade efetiva de ácido lático (por exemplo, chucrute) . Como os Lactobacillus spp., em particular os vaginais, toleram bem um meio ácido contendo ácido láctico, este último composto é de fato um conservante compatível com Doderlein. Sais selecionados respectivamente de ácido láctico (cálcio, magnésio, potássio, sódio, amônio) são incluídos nas composições para alcançar este efeito.
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c. fonte bioquimicamente explorável de nitrogênio para apoiar o crescimento de Lactobacillus spp.
[0061] Muita atenção é atualmente devotada às propriedades e usos dos chamados prebióticos, os polissacarideos sendo metabolizados especificamente por probióticos como lactobacilos e bifidobactérias (ver próximo ponto). Os prebióticos são amplamente utilizados em combinação com bactérias probióticas para produzir os chamados simbióticos, que, quando ingeridos por via oral, garantem uma melhor multiplicação das bactérias probióticas no trato GI. No entanto, num ambiente vaginal, a disponibilidade de nutrientes adequados às bactérias probióticas já existentes ou administradas exogenamente é mais limitada, em particular no que diz respeito às fontes de nitrogênio necessárias (fontes de N) . A adição de uma fonte de N adequada, orgânica e/ou inorgânica, definida quimicamente e pura em um transportador farmaceuticamente adequado aparece como um fator essencial permitindo um crescimento e proliferação de Lactobacillus spp. na vagina. [0062] Tais fontes N quimicamente definidas são, por exemplo, sais de amônio (por exemplo, cloreto de amônio, Ref. 15) , ureia, aminoácidos como o ácido glutâmico e similares (arginina), capazes de estimular o crescimento de lactobacilos e bifidobactérias.
d. fonte biológica e quimicamente definida de carbono para apoiar o crescimento de lactobacilos [0063] Obviamente, também é necessária uma fonte de carbono (fonte de C) para o crescimento dos lactobacilos vaginais. Preferencialmente, uma dessas fontes é um nutriente específico
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23/67 para Lactobacillus spp. ao invés de bactérias oportunistas ou patogênicas. Exemplos destes são os carboidratos não digeríveis como: fruto-oligossacarideos, galactooligossacarideos, glico-oligossacarideos e também outros. A presença destes chamados prebióticos confere, na vagina e no intestino, uma vantagem competitiva diferencial adicional para o crescimento de Lactobacillus spp. em relação ao dos patógenos atuais ou oportunistas.
[0064] Opcionalmente, outros componentes estão presentes na composição de acordo com a invenção, tal como uma fonte de enxofre, minerais, moduladores de redução de oxidação (redox) e vitaminas.
[0065] De um modo preferido, a composição de acordo com a presente invenção compreende uma fonte de enxofre biologicamente utilizável, de outra forma quimicamente pura,
que suporta um crescimento e proliferação adequados de
Lactobacillus spp. (já presente ou administrado) , que pode
ser, sem limitação , um composto orgânico/inorgânico tal como
um sulfato, um sulfito, um sulfureto, tiossulfato, um
aminoácido contendo enxofre como cisteina e metionina, cisteina (o dimero oxidado de cisteina).
[0066] Meios quimicamente definidos, minimos, para o crescimento de diferentes Lactobacillus spp. foram encontrados e publicados (Ref. 18a) . Além dos componentes listados acima, pode ser que, sob circunstâncias de uma disponibilidade muito pobre de nutrientes na vagina, seja útil considerar também a adição dos seguintes componentes às formulações preferidas: ions metálicos: por exemplo, Mg2+ e Mn2+, antioxidantes: por exemplo, vitamina C, N-acetilcisteina, tiossulfato, vitaminas:
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24/67 por exemplo, riboflavina e ácido nicotinico; sozinho ou em combinação um com o outro.
[0067] Ingredientes preferidos são também probióticos como células vivas, liofilizados, tindalizados, sobrenadantes secos ou líquidos, de espécies e estirpes com atividade comprovada contra condições infecciosas ou inflamatórias da vagina e, de preferência, de origem urogenital humana. Essas espécies podem ser encontradas e isoladas da microbiota de Doderlein de mulheres jovens saudáveis e são representadas mundialmente por L. gasseri, L. jensenii, L. crispatus, L. acidophilus, L. fermentum, L. plantarum e L. iners.
[0068] Ingredientes preferidos também são compostos com atividade contra agentes patogênicos (bactérias, virus, fungos e semelhantes) , os quais, na intenção e compreensão desta invenção, são aqueles que são tipicamente capazes de inibir o crescimento de patógenos sem perturbar o metabolismo e crescimento de patógenos das bactérias probióticas. Exemplos de tais compostos antifúngicos adequados de origem orgânica ou inorgânica são cisteina, sorbato ou tiossulfato, respectivamente.
[0069] De preferência, a composição de acordo com a presente invenção compreende um modulador redox biologicamente explorável, isto é, um componente que modula o potencial redox em um fluido biológico. No contexto da presente invenção, o termo modulador redox indica uma substância, ou pelo menos um par de substâncias, capazes de reduzir ou aumentar o potencial redox de um determinado meio biológico. Um método para determinação do potencial redox vaginal na vaginose bacteriana está indicado em Ref. 22.
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25/67 [0070] O referido modulador redox pode estar compreendido na composição da presença da invenção na presença ou na ausência da fonte de enxofre como definida acima.
[0071] Quando o modulador redox está presente, a composição de acordo com a presente invenção é particularmente adequada para tratar ou prevenir infecções devidas a anaeróbios obrigatórios, por exemplo, vaginose bacteriana (BV).
[0072] De preferência, o modulador redox é escolhido entre: sistemas redox contendo enxofre, como o tiossulfato/bissulfito de sódio e a glutationa no estado reduzido (GSH) e no estado oxidado (GSSG), sistemas redox baseados em oxigênio, como a quinona/hidroquinona, sistemas redox baseados em nitrogênio, tais como sais de nitrito/nitrato, sistemas redox baseados em selênio (selenito/selenato e selenieto). Por exemplo, o potencial redox pode ser melhorado de modo a tornar-se definitivamente positivo (> 150 mV, preferivelmente 200-300 mV) e a inibir anaeróbios como Gardnerella. [0073] De preferência, no contexto da presente invenção, pelo menos uma estirpe de lactobacilos é adicionada à composição da invenção, a referida estirpe sendo selecionada a partir do grupo consistindo em L. gasseri, L. jensenii, L. crispatus, L. acidophilus, L. helveticus. L. plantarum, L. fermentum e L. johnsonii, mais preferencialmente a referida estirpe sendo selecionada a partir do grupo que consiste em L. gasseri KS 114.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de Julho
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26/67 de 2005 com número de acesso CNCM 1-3482, L. crispatus 116.1 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3483, L. jensenii KS 119.1 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 13217, L crispatus 119.4 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3484, L. gasseri 120.1 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3218, L. jensenii KS 121.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de Junho de 2004 com o número de acesso CNCM I3219, L gasseri 123.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3485, L. gasseri 126.2, L crispatus 127.1 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3486, e L. acidophilus KS 400, mais preferencialmente, a referida estirpe de Lactobacillus é selecionada a partir do grupo que consiste em L. jensenii KS 119.1 CNCM 1-3217, L. crispatus 119.4 CNCM I3484, L. gasseri 120.1 CNCM 1-3218 e L. gasseri 124.3 CNCM I3220 .
[0074] As estirpes de bactérias acima indicadas foram depositadas sob as condições do Tratado de Budapeste e são disponibilizadas ao público.
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27/67 [0075] De preferência, no contexto da presente invenção, ο agente tamponante a) é um ácido, ou um sal seu, selecionado a partir dos grupos que compreendem, ou, alternativamente, consistindo em ácidos orgânicos tais como ácidos alifáticos, incluindo ácido acético, propiônico, butírico, ácidos dicarboxíicos incluindo ácidos oxálico, malônico, succínico, hidroxiácidos como o ácido láctico, ácido cítrico, ácidos dicarboxílicos como ácido málico.
[0076] De preferência, no contexto da presente invenção, o agente de conservação b) é ácido láctico, ou um derivado seu e/ou sal.
[0077] De um modo preferido, no contexto da presente invenção, a fonte de nitrogênio c) é um sal de amônio, ureia, um aminoácido de ocorrência natural ou sintético, tal como ácido glutâmico, e suas misturas.
[0078] De um modo preferido, no contexto da presente invenção, a fonte de carbono d) é um carboidrato não digerível, tal como: fruto-oligossacarídeos, galacto oligossacarídeos, glico-oligossacarídeos e suas misturas. De preferência, a composição de acordo com a presente invenção compreende, por exemplo, os seguintes ingredientes baseados em ml de solução/suspensão dos ingredientes. A de, por exemplo, um comprimido ou cápsula composição real é obtida pela multiplicação da quantidade de ingredientes por
3:
pH
Final aprox. 4,5 da solução/supensão:
Agente de preservação compatível com Lactobacillus Pentahidrato lactato de Ca 10-30, preferencialmente 20 mg/ml
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28/67
Sistema Tampão
Fonte de Carbono
Fonte de nitrogênio
Fonte de Enxofre
Citrato de magnésio dibásico 5-15, preferencialmente 10 mg/ml
a-Glico- oligossacarídeo 15-30, preferencialmente 20 mg/ml
Ácido Glutâmico 10-30 mg
Cistina 10-30 mg
Excipientes q. s . 150-250 mg
[0079] A invenção compreende as seguintes concretizações (E) .
[0080] El. Uma composição para utilização no tratamento ou prevenção de infecções urogenitais causadas por microrganismos patogênicos em um indivíduo feminino, em que a composição compreende uma quantidade eficaz de cada:
a) um agente tampão,
b) um agente de preservação totalmente compatível com a microbiota vaginal,
c) uma fonte de nitrogênio bioquímico molecular puro ou iônico explorável pela microbiota vaginal,
d) polissacarídeo prebiótico fermentável pela microbiota vaginal e, opcionalmente,
e) um componente antioxidante, em que o tratamento ou prevenção compreende administrar a composição intravaginalmente ao indivíduo, para estabilizar a
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29/67 acidez do fluido vaginal de um indivíduo com o valor fisiológico em torno de pH 4,5 ou inferior.
[0081] E2. A composição para utilização de acordo com El, em que a formulação vaginal é um gel lubrificante para uso pessoal.
[0082] E3. A composição para utilização de acordo com El ou E2, em que o antioxidante é escolhido entre compostos contendo enxofre como N-acetilcisteína, cisterna, metionina, tiossulfato de sódio.
[0083] E4. A composição para utilização de acordo com qualquer uma de E1-E3, em que uma ou mais estirpes de lactobacilos são adicionadas à formulação do grupo consistindo
em L. gasseri, L. jensenii, L. crispatus, L. acidophilus, L.
helveticus, L plantarum, L. fermentum, L. lactis, L.
johnsonii e L. acidophilus KS 400.
[0084] E5. A composição para utilização de acordo com
qualquer uma de E1-E4, em que uma ou mais estirpes de
lactobacilos são adicionadas à formulação do grupo consistindo
em L. gasseri, L. jensenii, L. crispatus, L. acidophilus, L.
helveticus, L. plantarum, L. fermentum, L. lactis e L.
johnsonii.
[0085] E6. A composição para utilização de acordo com
qualquer uma de E1-E5, na referida estirpe Lactobacillus,
selecionada do grupo que consiste em L. jensenii KS 109, L gasseri KS 114.1 depositada por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos em 22 de Julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3482, L. crispatus 116.1 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de julho de 2005 com o número de
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30/67 acesso CNCM 1-3483, L. jensenii KS 119.1 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM I3217, L crispatus 119.4 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3484, L. gasseri 120.1 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de Junho de 2004 com número de acesso CNCM 1-3218, L. jensenii KS 121.1 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de Junho de 2004 com número de acesso CNCM 1-3219, L. jensenii KS 122.1, L. gasseri 121.1 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de Julho de 2005 com número de acesso CNCM I3485, L. gasseri 124.3 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de Junho de 2004 com número de acesso CNCM 1-3220, L. gasseri 126.2, L. crispatus 127.1 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de Julho de 2005 com número de acesso CNCM 1-3486, L. jensenii KS 130.1, L. helveticus KS 300 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 10 de fevereiro de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3360 e L acidophilus KS 400.
[0086] E7. A composição para utilização de acordo com qualquer uma de E1-E6, em que a referida estirpe Lactobacillus é selecionada a partir do grupo consistindo em L. jensenii KS 119.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de Junho de 2004 com o
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31/67 número de acesso CNCM 1-3217, L. crispatus 119.4 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3484, L. gasseri 120.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3218, L gasseri 124.3 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3220.
[0087] E8. A composição para utilização de acordo com qualquer uma de E1-E7, em que a formulação compreende ainda uma quantidade eficaz de um agente antimicrobiano terapeuticamente eficaz capaz de inibir ou erradicar os patógenos urogenitais.
[0088] E9. Método para o tratamento ou prevenção de infecções urogenitais causadas por microrganismos patogênicos em um indivíduo feminino, que compreende a administração intravaginal ao indivíduo, opcionalmente após o tratamento anti-infeccioso de uma infecção urogenital, de uma formulação com uma quantidade eficaz de cada:
a) um agente tampão,
b) um agente de preservação totalmente compatível com a microbiota vaginal,
c) uma fonte de nitrogênio bioquímico molecular puro ou iônico explorável pela microbiota vaginal,
d) polissacarideo prebiótico fermentado pela microbiota vaginal e, opcionalmente,
e) um componente antioxidante.
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32/67 [0089] E10. Método para estabilizar a acidez do fluido vaginal de um indivíduo com urn valor fisiológico em torno de pH 4,5 ou inferior, o qual compreende administrar intravaginalmente ao indivíduo uma formulação com uma quantidade eficaz de cada:
a) um agente tampão,
b) um agente de preservação totalmente compatível com a microbiota vaginal,
c) uma fonte de nitrogênio bioquímico molecular puro ou iônico explorável pela microbiota vaginal,
d) polissacarídeo prebiótico fermentado pela microbiota vaginal e, opcionalmente,
e) um componente antioxidante.
[0090] Eli. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, em que o agente tampão a) é um ácido, ou um sal seu, selecionado a partir dos grupos compreendendo, ou, alternativamente, consistindo em ácidos orgânicos tais como ácidos alifáticos, incluindo ácido acético, propiônico, butírico, ácidos dicarboxílicos incluindo ácido oxálico, malônico, succínico, hidroxiácidos tais como o ácido lático, ácido cítrico, ácidos dicarboxílicos como o ácido málico.
[0091] E12. O método de acordo com qualquer uma de E9-E11, em que o agente de conservação b) é ácido láctico, ou um derivado e/ou sal seu.
[0092] E13. O método de acordo com E9-E12, em que a fonte de nitrogênio c) é um sal de amônio, ureia, um aminoácido de ocorrência natural ou sintético, tal como ácido glutâmico, e suas misturas.
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33/67 [0093] E14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações E9-E13, em que a fonte de carbono d) é um carboidrato não digerível, tal como: fruto-oligossacarídeos, galacto-oligossacarideos, glico-oligossacarideos e suas misturas.
[0094] E15. Uma formulação adequada para administração oral com um pH variando de 4 a 5, em que a composição compreende uma quantidade eficaz de cada:
a) um agente tampão,
b) um agente de conservação totalmente compatível com a microbiota gastrointestinal,
c) uma fonte de nitrogênio bioquímico molecular puro ou iônico,
d) polissacarídeo prebiótico fermentável pela microbiota gastrintestinal e, opcionalmente,
e) um componente antioxidante.
[0095] E16. Formulação da reivindicação E15, em que o antioxidante e) é selecionado dentre compostos contendo enxofre como N-acetilcisteína, cisterna, metionina, tiossulfato de sódio.
[0096] E17. A Formulação da reivindicação E15 ou E16, em que pelo menos uma estirpe de lactobacilos é adicionada à formulação, a referida estirpe sendo selecionada a partir do grupo consistindo em L gasseri, L. jensenii, L. crispatus, L. acidophilus, L. helveticus, L. plantarum, L. fermentum e L. johnsonii.
[0097] E18. A formulação de qualquer uma de E15 a E17, em que pelo menos uma estirpe de lactobacilos é adicionada à formulação, a referida estirpe sendo selecionada a partir do
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34/67 grupo que consiste em L jensenii KS 109, L gasseri KS 114.1 depositada por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3482, L crispatus 116.1 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3483, L. jensenii KS 119.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3217, L. crispatus 119.4 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3484, L. gasseri 120.1 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3218, L. jensenii KS 121.1 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3219, L. jensenii KS 122.1, L. gasseri 123.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3485, L gasseri 124.3 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3220, L. gasseri 126.2, L. crispatus 127.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3486, L. jensenii KS 130.1, L. helveticus KS 300 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 10 de fevereiro de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3360 e L acidophilus KS 400.
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35/67 [0098] E19. A formulação de qualquer uma de E15 a E18 em que a referida estirpe de Lactobacillus é selecionada a partir do grupo consistindo em L. jensenii KS 119.1 depositada por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de Junho de 2004 com o número de acesso CNCM 13217, L crispatus 119.4 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3484, L gasseri 120.1 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3218, L. gasseri 124.3 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3220 e L. acidophilus KS 400.
[0099] E20. A composição para utilização de acordo com qualquer uma de E1-E8, ou formulação de acordo com qualquer uma de E15-E19, em que o agente tampão a) é um ácido, ou um sal seu, selecionado a partir dos grupos compreendendo ou, alternativamente, consistindo em ácidos orgânicos como ácidos alifáticos, incluindo ácido acético, ácido propiônico, ácido butirico, ácidos dicarboxilicos incluindo ácido oxálico, málico, succinico, hidroxiácidos como ácido lático, ácido citrico, ácidos dicarboxilicos como ácido málico.
[0100] E21. A composição para uso de acordo com qualquer uma de E1-E8 ou E20, ou formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 15-20, em que o agente de conservação b) é ácido láctico, ou um derivado e/ou sal seu.
[0101] E22. A composição para utilização de acordo com qualquer uma de E1-E8 ou E20-E21, ou formulação de acordo com
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36/67 qualquer uma das reivindicações 15-21, em que a fonte de nitrogênio c) é um sal de amônio, ureia, um aminoácido de ocorrência natural ou sintético tal como ácido glutâmico e suas misturas.
[0102] E23. A composição para utilização de acordo com qualquer uma de E1-E8 ou E20-E22, ou formulação de acordo com qualquer uma de E15-E22, em que a fonte de carbono d) é um carboidrato não digerível tal como: fruto-oligossacarideos, galacto-oligossacarideos, glico-oligossacarideos e suas misturas.
[0103] E24. Composição para utilização de acordo com qualquer uma de E1-E8 ou E20-E23, ou formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 15-23, com pH de 4,3 a 4,6, se sólido após dissolução/suspensão até um volume de 3 ml, e que compreende os seguintes ingredientes por dose única:
Penta-hidrato de lactato de Ca: 30-90, preferencialmente 60 mg
Citrato de magnésio dibásico: 15-45, preferencialmente 3 0mg Fibra pré-biótica: 50-150, preferencialmente 100 mg Ácido glutâmico: 20-60, preferencialmente 40 mg Cisteina/Tiossulfato: 10-50, preferencialmente 30 mg Excipientes ad 400-1100 mg: q.s.
[0104] E25. A composição para utilização ou formulação de acordo com E24, compreendendo ainda:
Liofilizados de L. gasseri 120.1 depositados por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3218 e/ou
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L. gasseri 124.3 e/ou L. crispatus 119.4 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3484 e/ou L. jensenii KS 119.1 depositado pela Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de Junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3217 para urn total de 2 a 10 bilhões de UFC, somando 50 a 200 mg.
Exemplos :
Exemplo 1
Composição de diferentes meios de crescimento e condições de crescimento [0105] Assumindo uma completa dissolução no meio vaginal (volume: 2-5 ml), várias composições são apresentadas para permitir um crescimento comparativo de Lactobacillus spp. e patógenos sob condições de teste: Controle de crescimento (positivo) para lactobacilos: MRS [0106] O meio MRS convencional (Biolife) sem ajuste de pH permite um crescimento ótimo de Lactobacillus spp. e é escolhido para este propósito.
[0107] Controle de crescimento (positivo) para patógenos: TS [0108] O caldo de Soja Tríptica (TS) convencional (BD, 211825) sem ajuste de pH foi escolhido.
[0109] Controle de linha de base (negativo).
[0110] Uma solução diluída da referida MRS (15% em volume), tamponada ou não tamponada, é escolhida para assegurar uma sobrevivência dos lactobacilos e patógenos testados a um baixo nível de crescimento ou inibição, respectivamente.
[0111] Meio 17 (de acordo com a invenção):
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38/67 uma composição de teste otimizada de acordo com a tabela a seguir e destinada a estabilizar o pH, bem como permitir o crescimento de Lactobacillus spp. e, ao mesmo tempo, a inibição de patógenos.
Meio 17 Função Substância Origem Concentração
preservante Pentahidrato de lactato de Ca Applichem, A3670 20 mg/ml
tampão Citrato de amônio dibásico Sigma 09833 10 mg/ml
Fonte de N (amônio, contido no tampão)
pH final da solução: 4,56 Fonte de Carbono a-Glico- oligossacarideo Bio- Ecolians, Grupo UCIB Solabia, AB020 20 mg/ml
Contém compostos sulfurados Caldo de MRS Biolife 4017292 15% vol
Condições de crescimento e procedimento de contagem [0112] Todas as culturas foram cultivadas a 37° C sob condições anaeróbicas sem agitação.
[0113] Uma primeira cultura foi preparada a partir de material conservado a -80° C por meio de estrias em placas de ágar. Após incubação por não mais de 24 horas, uma única colônia da placa foi usada para inocular 5 ml de cultura
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39/67 liquida e incubada por até 18 horas e depois usada para inocular 25 ml de cada um dos diferentes meios para os experimentos de crescimento. A densidade celular inicial foi ajustada para corresponder a uma densidade óptica (600 nm) de 0,05.
[0114] Todos os experimentos foram realizados em duplicata.
[0115] O crescimento das culturas foi monitorizado medindo a densidade óptica a 600 nm, o pH, por plaqueamento de diluições em série em placas de ágar (ufc/mL) e por contagem do número total de células utilizando um hemato-citômetro (Neubauer melhorado).
[0116] Estirpes testadas: Lactobacillus spp. e patógenos urogenitais [0117] As estirpes vaginais testadas compreendem todas as espécies relevantes de Lactobacillus da microbiota vaginal fisiológica, ou seja, L gasseri, L. crispatus e L. jensenii e, em particular, L. gasseri 120.1 CNCM 1-3218, L. gasseri 124.3 CNCM 1-3220, L crispatus 119.4 CNCM 1-3484 e L. jensenii 119.1 CNCM 1-3217.
[0118] Como patógenos representativos nesses experimentos foram selecionados:
a) Gram-negativo: isolado clinico humano multirresistente de E.coli 492 CCOS uropatogênico, do Hospital Universitário de Zurique, isolado em 1976.
b) Gram-positivo: isolado clinico humano multirresistente de S. aureus CCOS 461, MRSA, Hospital em Oxford, Reino Unido, isolado em 1960.
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40/67 [0119] A E. coli uropatogênica é a estirpe mais comum que causa cistite. 0 S. aureus está associado a infecções vaginais do tipo chamado vaginite aeróbica (AV). Comentário [0120] Como mencionado no titulo desta seção, fatores acidificantes, preservantes e nutrientes foram escolhidos para serem usados contra patógenos anaeróbios facultativos. Estes podem produzir energia com oxigênio, como aeróbios, ou também anaerobicamente (fermentando açúcares a ácido lático) . E. coli e S. aureus são representantes dessa classe de bactérias. Composições comparativas [0121] A seguir são apresentados exemplos de composições que, apesar de terem uma composição semelhante ao Meio 17, não inibem igualmente o crescimento dos patógenos acima mencionados.
Exemplo 2a: efeito de um ligeiro aumento do pH [0122] Como primeiro exemplo comparativo, o seguinte Meio 11 é fornecido:
Meio 11 Substância Origem Concentração
Pentahidrato de lactato de Ca Applichem, A3670 20 mg/ml
Citrato de amônio dibásico Sigma 09833 10 mg/ml
Citrato de amônio tribásico Sigma 10 mg/ml
pH final da solução: 5, 00 a-Glico-oligossacarideo Bio- Ecolians, Grupo UCIB Solabia, AB020 20 mg/ml
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41/67
Caldo de MRS Biolife 4017292 15% vol
[0123] Neste meio, a evolução da contagem dos patógenos mencionados acima sob condições experimentais similares foi estudada.
E.coli CCOS 492
Meio 11 100%MRS
Tempo (h.min) pH Contagem (uf c) pH Contagem (uf c)
00.00 5, 00 1*10Λ5 6, 35 1*10Λ5
06.10 4, 98 8*10Λ5 5,53 5*10Λ7
20.20 4, 98 4*10Λ6 5, 01 >1*10Λ9
S. aureus CCOS 461
Meio 11 100%MRS
Tempo (h.min) pH Contagem (uf c) pH Contagem (uf c)
00.00 5, 00 1*10Λ5 6, 35 1*10Λ5
06.10 4, 99 1*10Λ6 5, 69 6*10Λ7
20.20 4, 98 4*10Λ6 5, 05 >1*10Λ9
[0124] Assim, um aumento do pH de 4,5 por meia unidade para um valor final de 5,0 é suficiente para permitir o crescimento de patógenos por mais de um log, patógenos que são inibidos em pH 4,5.
Exemplo 2b: efeito de uma redução da concentração de lactato em 50%.
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42/67 [0125] Como uma concretização, o seguinte Meio 12 foi preparado e a evolução da contagem de E. coli no mesmo meio foi observada.
Meio 12 Substância Origem Concentração
Pentahidrato de lactato de Ca Applichem, A3670 20 mg/ml
Citrato de amônio dibásico Sigma 09833 10 mg/ml
Citrato de amônio tribásico Sigma 10 mg/ml
pH final da solução: 5, 18 a-Glico-oligossacarideo Bio- Ecolians, Grupo UCIB Solabia, AB020 20 mg/ml
Caldo de MRS Biolife 4017292 15% vol
[0126] Neste meio, bem como em TSA como um meio de controle positivo, a evolução da contagem de E. coli CCOS 492 patogênica mencionada acima foi estudada em condições experimentais semelhantes como no Exemplo 2a.
E.coli CCOS 492
Meio 12 TSA
Tempo (h.min) pH Contagem (uf c) pH Contagem (uf c)
00.00 5, 18 1*10Λ5 6, 7 1*10Λ5
06.10 5,21 4*10Λ6 6, 1 5*10Λ7
20.20 5,23 8*10Λ6 5,5 >1*10Λ9
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43/67 [0127] Parece que a redução na concentração de lactato como no Meio 12 para a metade do valor do Meio 17 vem junto com uma redução significativa do poder inibitório em relação ao último, levando a um aumento da contagem de patógenos de quase 2 logs.
[0128] Em resumo, parece que as concentrações precisas dos princípios ativos (citrato, lactato) como exemplificado para o Meio 17 são preferíveis para assegurar uma ação de inibição elevada de patógenos dos mesmos. Exemplo 2: discussão detalhada dos resultados para L gasseri 120.1 CNCM 1-3218 [0129] O modelo in vitro para testar o efeito da aplicação de uma formulação farmacêutica na vagina utilizada neste pedido é o de um meio liquido contendo os ingredientes da formulação aproximadamente à mesma concentração que terá após a dissolução na vagina. O objetivo dos experimentos in vitro a serem descritos a seguir foi, portanto, encontrar uma formulação de meio de crescimento que permita instalar e manter por uma duração de um dia um pH fisiológico de 4,0 4,5. Além disso, o referido meio deve permitir que os lactobacilos se estabeleçam rapidamente e cresçam, enquanto que ao mesmo tempo os agentes patogênicos urogenitais devem ser inibidos.
[0130] A contagem de células de L. gasseri KS 120.1 CNCM I3218 cultivadas durante 19,4 horas em meio MRS atingiu IxlO8 ufc/ml, o valor mais elevado em todos os 3 meios testados. Como esperado, uma clara queda de pH de 6,4 para 4,0 foi observada. Este experimento de controle indica a boa adequação
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44/67 do inóculo utilizado e que as curvas de crescimento observadas nos outros meios estão corretas.
[0131] Comparando o crescimento obtido no Meio 17 com o controle MRS, observou-se um crescimento ligeiramente reduzido (0,4 unidades log). Como o Meio 17, com sua composição relativamente simples, contém apenas uma quantidade reduzida de elementos em traços, esse efeito era esperado.
[0132] Comparando o crescimento no Meio 17 com o do meio MRS a 15%, foi observada uma redução de nivel de 4,9 log na contagem final de células entre estes meios. Isso mostra claramente que os nutrientes e componentes adicionais presentes no Meio 17 realmente promovem o crescimento da estirpe de Lactobacillus testada.
[0133] Acidez: os valores de pH permanecem notavelmente estáveis em torno de 4,5 a partir do inicio dos experimentos e até 20 horas depois (variando de 4,58 a 4,41), confirmando assim a força adequada do sistema tampão.
[0134] Conclusão: Meio 17 formulado de acordo com a descrição da presente invenção induz um crescimento significativo do Lactobacillus gasseri inoculado, ligeiramente menos do que para a MRS puro, mas definitivamente mais forte do que o MRS diluido (15%). O pH do sistema permanece constante no valor alvo ideal de aproximadamente 4,5.
Exemplo 3: discussão detalhada dos resultados para S. aureus
CCOS 461
[0135] A hipótese a ser testada neste caso é que o Meio 17
escolhido é capaz de inibir o crescimento do patógeno
multirresistente selecionado.
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45/67 [0136] As contagens de células de S. aureus 461 CCOS cultivadas para 21,1 horas em meio TS alcançaram com 2x 108 ufc/mL o valor mais elevado ao longo de todos os 3 meios testados começando com urn valor de 9 x 10Λ6 em t = Oh. Também neste caso, uma queda clara de pH de 7,0 para 4,8 foi observada. Este experimento de controle indica uma boa adequação do inóculo usado e que as curvas de crescimento observadas nos outros meios estão corretas.
[0137] Comparando a evolução da contagem de células obtida no Meio 17 com o controle positivo de TS, foi observada uma forte inibição de S. aureus CCOS 461 de -5,2 unidades logaritmicas. Com relação ao MRS diluido, a inibição também foi alta, totalizando -4,4 logs.
[0138] Acidez: mesmo na presença do patógeno vivo, os valores de pH permanecem novamente notavelmente estáveis em torno de 4,5 a partir do inicio dos experimentos e até 20 horas depois, com apenas um ligeiro decréscimo (variando de 4,59 inicialmente a 4,40 finalmente).
[0139] Conclusão: o Meio 17, formulado de acordo com a descrição da presente invenção, induz uma diminuição significativa das contagens do patógeno inoculado S. aureus CCOS 461: em relação ao meio de controle positivo TS, mas mesmo em relação ao MRS diluido. O Meio 17 mostra por si só uma ação antimicrobiana contra este patógeno.
Exemplo 4: resumo da série experimental [0140] Os resultados das estirpes restantes mencionadas acima no Exemplo 2 serão apresentados em forma de tabela juntamente com os dois últimos exemplos e comentados.
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46/67 [0141] Observações preliminares: Todos os 4 lactobacilos testados apresentaram a mesma tendência: bom crescimento no Meio 17, crescimento reduzido em caldo de MRS a 15% e excelente crescimento no meio de controle do caldo de MRS. Uma queda no pH no meio não tamponade (MRS a 15% e MRS puro) também foi observada.
[0142] Para todas as 4 estirpes de Lactobacillus e os 2 patógenos, os valores de pH, projetados para serem tamponados a um valor de 4,5, as medições confirmam a excelente estabilidade da acidez do meio por até 20 horas ou mais de tempo de reação.
[0143] Os patógenos S. aureus e E.coli também claramente não
foram capazes de crescer no Meio 17. As concentrações de
células correspondentes neste meio diminuíram drasticamente no
tempo.
Tabela Ex. 4: valores de pH em Meio 17 e log (redução ou
aumento) do número de células dos organismos testados cultivados no Meio 17 (de acordo com a invenção) em relação ao meio de referência
Mudança no Meio em log de cfu/mL .7 versus valor de pH no Meio 17
Linhagem Tempo MRS a 15% MRS TSB inicial final
KS 119,4 CNCM I- 3484 2 8,6h 0,57 -0,49 4,57 4,33
KS 119,1 CNCM I- 3217 18, 6h 1, 12 -2,15 4,59 4,37
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KS 120,1 19, 4h 4, 94 -0,40 4,58 4,44
CNCM 3218 I-
KS 124,3 2 8,6h 0,44 -0, 90 4,57 4,33
CNCM I-
3220
CCOS 461 21, Ih -4,44 -5,19 4,59 4,40
CCOS 492 22, Ih -5,70 -8,13 4,49 4,42
[0144] Na Tabela Ex. 4, as diferenças nos números de log no final dos respectivos experimentos de crescimento são resumidas. O efeito promotor de crescimento mais forte foi observado em Lactobacillus gasseri KS 120,1 CNCM 1-3218 com aumento de guase 5 níveis de log comparado a MRS a 15%, enquanto o efeito mais fraco foi encontrado em Lactobacillus gasseri KS 124,3 CNCM 1-3220, com um aumento em nivel de log de apenas 0,44.
[0145] Conclusão geral: Durante o processo de fermentação, o Meio 17 estabilizou o pH a um valor entre 4,5 e 4,3 para todas as estirpes testadas. Quanto às estirpes de Lactobacillus: elas cresceram melhor no Meio 17 do que no Meio de MRS a 15%. Nesse meio em particular, a adição de citrato de amônio como fonte adicional de nitrogênio e de lactato de cálcio como substância tampão, bem como o uso de uma fonte seletiva de carbono (neste caso, glico-oligossacarideo) para os probióticos mostrou ser suficiente para estimular diferencialmente o crescimento dos lactobacilos testados. Por outro lado, os 2 patógenos testados (E. coli e S. aureus) não cresceram no Meio 17, mas foram inibidos pelo mesmo.
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Exemplo 5 [0146] Fora dos experimentos sistemáticos conduzindo aos meios adequados, como o Meio 17 descrito acima, pode ser calculada a composição quantitativa de uma unidade de dosagem farmacêutica (cápsula, comprimido...) a ser aplicada intravaginalmente. Como mencionado acima, isso requer que se leve em conta quantitativamente o volume do fluido vaginal, uma quantidade que obviamente varia de acordo com a idade e condições de saúde da mulher. A pesquisa encontrou que o volume de tal liquido é em média de 3 ml (Ref. 16).
Tabela Ex. 5.1: composição quantitativa de uma cápsula vaginal prebiótica de acordo com a invenção
Cápsula #6 Substância Quantidade
Pentahidrato de lactato de Ca 60 mg
Citrato de amônio dibásico 10 0 mg
a-Glico- oligossacarideo 10 0 mg
pH alvo na vagina: 4,5 Ácido Glutâmico 4 0 mg
Cisteina ou Cistina 2 0 mg
Excipientes conforme necessários 2 0 0 mg
Peso total 450 mg
Tabela Ex. 5.2: composição quantitativa da cápsula vaginal de acordo com a invenção
Comprimido #8 Substância Quantidade
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Liofilizados de estirpes vaginais de L. gasseri 120,1 e 124,3 a concentrações de 1011 cfu/g 10 0 mg
Pentahidrato de lactato de Ca 60 mg
Citrato de amônio dibásico 3 0 mg
Arabinogalactano 10 0 mg
pH alvo na vagina: 4,5 Tiossulfato 3 0 mg
Excipientes conforme necessários 27 0 mg
Peso total 60 0 mg
Tabela 5.3: composição quantitativa da cápsula vaginal de acordo com a invenção
Comprimido #9 Substância Quantidade
Pentahidrato de lactato de Ca 60 mg
Citrato de magnésio dibásico 3 0 mg
Arabinogalactano 10 0 mg
pH alvo na vagina: aproximadamente 4,5 Tiossulfato 3 0 mg
Ácido Aspártico 60 mg
Excipientes conforme necessários 27 0 mg
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Peso total de exciplentes/aditivos 55 0 mg
Liofilizados de L. gasseri 120,1 CNCM 1-3218 5 0 mg
Liofilizados de L. jensenii 119,1 CNCM 1-3484 5 0 mg
Liofilizados de L. crispatus KS 119,4 CNCM 1-3217 5 0 mg
Peso total incluindo liofilizados 7 0 0 mg
Tabela Ex. 5.4: composição quantitativa de uma preparação simbiótica oral (sachês) de acordo com a invenção
Sachê #9 Substância Quantidade
Pentahidrato de lactato de Ca 10 0 mg
Citrato de magnésio dibásico 5 0 mg
Alfa-Glico- Oligossacarideo 1000 mg
pH alvo na preparação oral quando dissolvido em 150 ml de água: 4,5 Arabinogalactano 1000 mg
Tiossulfato 3 0 mg
Ácido Aspártico Alanina 60 mg 60 mg
Excipientes conforme necessários 35 0 mg
Peso total de 2650 mg
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excipientes/aditivos
Liofilizados de L. gasseri 120,1 CNCM 1-3218 5 0 mg
Liofilizados de L. jensenii 119,1 CNCM 1-3217 5 0 mg
Liofilizados de L. crispatus KS 119,4 CNCM 1-3484 5 0 mg
Peso total incluindo liofilizados 2850 mg
Tabela Ex. 5.5: composição quantitativa de um lubrificante vaginal prebiótico de acordo com a invenção
Gel lubrificante #9 Substância Quantidade
Ácido lático 5 0 mg
pH alvo do gel finalizado =4,5 Ácido cítrico 3 0 mg
Glicerol 8 0 mg
Carbômero 5 mg
Fruto- oligossacarídeo de cadeia curta 5 0 mg
Tiossulfato 10 mg
Ácido Glutâmico 10 mg
NaOH 0,1 mol ou HC1 0,1 mol para pH=4,5 q. s .
Água deionizada ad 1000 mg
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OTIMIZANDO O POTENCIAL REDOX DO FLUIDO VAGINAL [0147] No Exemplo 5.1 acima, a fonte de enxofre adicionada ao M17 é cisteina ou cistina, no Exemplo 5.2 é tiossulfato de sódio. Todas as 3 formulações acima identificadas levam, por exemplo, a um valor de pH da solução correspondente em 2-5 ml de cerca de 4,5. Do ponto de vista da acidez, nutrientes, e conservantes, elas parecem muito semelhantes.
[0148] A questão que levantamos agora é se elas são equivalentes à tarefa que lhes é atribuída, isto é, promover o crescimento de lactobacilos na vagina e inibir o dos patógenos. Para especificar essa questão, temos que nos concentrar em patógenos específicos; vamos escolher a infecção vaginal mais frequente como mencionada acima, a chamada vaginose bacteriana ou BV associada a patógenos como Gardnerella vaginalis ou Prevotella bivia. Em 1985, David Eschenbach e colaboradores publicaram um artigo de pesquisa (Ref. 22) no qual investigaram a correlação entre vaginose bacteriana e o potencial redox vaginal, respectivamente, o pH.
[0149] Por um lado, confirmaram, como esperado, que nos 15 pacientes, um pH na faixa de 4,0 a 4,5 está associado principalmente a uma microbiota vaginal saudável, enquanto que na faixa de 4,5 a 5,5 os pacientes exibem uma forte presença de anaeróbios com poucos lactobacilos e os sintomas da BV. A novidade foi que eles também podem mostrar que também o potencial redox Eh na vagina é in vivo fortemente dependente do estado da microbiota: enquanto os valores de Eh nos pacientes com BV variam entre +50 e -250 mV, os valores Eh das vaginas saudáveis variam entre 100 e 300 mV. Eles também descobriram que isso não é uma característica de mulheres
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53/67 individuais, mas dependia apenas do estado da microbiota. Após uma cura com sucesso com metronidazol, todas as mulheres com um potencial redox negativo retornaram a um positivo (e também o pH retornou a ser mais ácido).
[0150] Curiosamente, não houve tentativas de terapeuticamente usar este fato para produzir produtos farmacêuticos vaginais para o tratamento da BV, o que justifica um maior potencial redox.
[0151] Nós investigamos essa oportunidade através do seguinte procedimento experimental: Resumo do procedimento de teste [0152] Preparou-se uma formulação de meio consistindo em 20 mg/mL de Lactato de Ca, 10 mg/mL de citrato de amônio dibásico, 20 mg/mL de Ecolians e caldo de MRS a 15% (correspondendo ao M17 descrito acima). Após a medição do potencial redox e do pH, vários compostos (fontes de nitrogênio e enxofre) foram adicionados a este meio e seu efeito no pH e potencial redox foi determinado.
Breve descrição dos experimentos [0153] Utilizou-se um eletrodo redox (Mettler Toledo LE 501 ORP, ligado a um medidor de pH MP230, Mettler Toledo) para medir o potencial redox da formulação do meio antes e depois da adição dos compostos de teste. Os valores redox foram lidos após o sinal ficar estável por pelo menos 30 segundos. Além disso, o pH foi medido usando um eletrodo de pH padrão conectado a um medidor de pH MP225 (Mettler Toledo).
[0154] Antes de cada série de medições, o eletrodo redox foi calibrado usando uma solução de referência (Mettler Toledo, no 51350060, 220 mV, pH 7 (UH = 427 mV)).
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Resultados de análise
Configu- ração Konz . Subst. pH Redox Referen.
1 20 mg/mL Lactato de Ca 4, 67 235,0 mV 236,2 mV
10 mg/mL Amoniocitrato, dibásico
15% Caldo de MRS
20 mg/mL Ecolians
10 mg/mL Ácido L- glutâmico 4,48 310,8 mV
2 20 mg/mL Lactato de Ca 4, 67 235,0 mV 236,2 mV
10 mg/mL Amoniocitrato, dibásico
15% Caldo de MRS
20 mg/mL Ecolians
10 mg/mL Ácido L- glutâmico 4,41 265,2 mV
lOmg/mL Cistina
3 20 mg/mL Lactato de Ca 4, 67 235,0 mV 236,2 mV
10 mg/mL Amoniocitrato, dibásico
15% Caldo de MRS
20 mg/mL Ecolians
10 mg/mL Ácido L- glutâmico 4,30 -103,0 mV
lOmg/mL Cisteina
4 20 mg/mL Lactato de Ca 4, 67 235,0 mV 233,0 mV
10 mg/mL Amoniocitrato, dibásico
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0% Caldo de MRS
20 mg/mL Ecolians
10 mg/mL Ácido L- glutâmico 4,26 284,2 mV
20 mg/mL Tiossulfato de Na 4,21 -36,5 mV
5 20 mg/mL Lactato de Ca 4,48 237,8 mV 234,9 mV
15 mg/mL Amoniocitrato, dibásico
0% Caldo de MRS
20 mg/mL Ecolians
10 mg/mL Ácido L- glutâmico 4,27 301,3 mV
20 mg/mL Dimetilsulfona 4,26 273,3 mV
Comentários [0155] A adição ou não de MRS a 15% à solução praticamente não tem efeito sobre o pH ou Eh.
[0156] A adição da fonte de nitrogênio ácido glutâmico torna o meio ligeiramente mais ácido e mais eletropositivo/oxidativo, atingindo 300 mV.
[0157] Os compostos de enxofre têm, nesta série experimental em particular, o efeito mais marcante do potencial redox e um efeito menor na acidez: compare, por exemplo, a configuração 2 e a configuração 3, em que a cisteina e a cistina são trocadas. Com a cisteina, o Eh diminui para -103,0 mV, enquanto que com a mesma quantidade de cisteina, ele aumenta para 265,2 mV. O pH no seu lado varia apenas minimamente, de 4,30 a 4,41.
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56/67 [0158] A cistina (a forma dimérica oxidada da cisterna) e a MSM (dimetilsulfona) mantêm um elevado potencial redox positivo, enquanto que a cisterna e o tiossulfato fazem com que a solução se torne redutora em vez de oxidante, alcançando valores negativos de -103 e - 36 mV.
[0159] A conclusão é que adicionando, por exemplo, cisterna ou tiossulfato, um ambiente favorável à proliferação de anaeróbios é obtido, enquanto que a adição de cistina ou dimetilsulfona ajuda a criar um ambiente favorável ao desenvolvimento de lactobacilos. Isto é de interesse terapêutico, pois podemos escolher, por tais meios, não apenas qual pH, mas também qual potencial redox é mais adequado para combater localmente um patógeno definido. Utilizando um modulador redox adequado, a eficácia da formulação anti-BV de acordo com a invenção pode assim ser aumentada.
[0160] As considerações acima se aplicam contra os patógenos da BV (Gardnerella, Prevotella, Atopobium, que são por natureza anaeróbios obrigatórios, ou seja, micróbios que não podem se defender contra os oxidantes como, por exemplo, peróxido de hidrogênio ou outros agentes oxidantes. Contra esses patógenos, o potencial redox é uma arma terapêutica adicional. Ele funciona sem danificar ou inibir os lactobacilos vaginais: a razão pela qual os lactobacilos, embora sejam eles próprios anaeróbios, são os chamados aero tolerantes. Isto é, o oxigênio e mais geralmente um ambiente com alto potencial redox (Eh) não os impedem de crescer. Escolhendo um modulador redox [0161] De preferência, no contexto da presente invenção, o termo modulador redox indica uma substância, ou pelo menos
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57/67 um par de substâncias, capaz de reduzir ou aumentar o potencial redox de um determinado meio biológico. Preferencialmente, o modulador redox e) é escolhido entre os compostos contendo enxofre, o par cisteína/cistina, como Nacetilcisteína, cisterna, metionina, quinona/hidroquinona, sistemas redox baseados em selênio (selenito/selenato, por exemplo na forma de sal de sódio), tiossulfato/bissulfito de sódio, glutationa no estado reduzido (GSH) e no estado oxidado (GSSG). Por exemplo, se o potencial redox precisa ser aumentado para se tornar definitivamente positivo (> 150 mV) e inibir anaeróbios como Gardnerella, a cistina (a forma oxidada) será escolhida para essa finalidade em vez de cisteina.
Exemplos concretos de formulações anti-BV com potencial de oxidação aprimorado
Exemplo 6.1: formulação pré-biótica
Tabela Ex. 6.1: composição quantitativa de uma cápsula vaginal pré-biótica contra BV de acordo com a invenção
Cápsula #10 Substância Quantidade
Eh alvo no fluido vaginal: >200 mV Pentahidrato de lactato de Ca 60 mg
Citrato de magnésio dibásico 3 0 mg
a-Glico- oligossacarideo 10 0 mg
pH alvo na vagina: 4,5 Ácido Glutâmico 4 0 mg
Modulador redox e fonte de S Cistina 2 0 mg
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Excipientes conforme necessários 2 0 0 mg
Peso total 450 mg
Exemplo 6.2: formulação simbiótica contra infecção vaginal anaeróbica de acordo com a invenção.
Tabela Ex. 6.2: composição quantitativa de uma cápsula vaginal simbiótica contra BV
Cápsula #11 Substância Quantidade
Linhagens com atividade pronunciada e provada contra Gardnerella Liofilizados das linhagens vaginais L. gasseri 120,1 e 124,3 a concentrações de 1011 uf c/g 100 mg cada
Potencial de oxidação alvo na vagina: >200 mV Pentahidrato de lactato de Ca 60 mg
Citrato de magnésio dibásico 3 0 mg
Alanina 4 0 mg
Arabinogalactano 10 0 mg
pH alvo na vagina: aprox. 4,5 Dimetilsulfona (MSM) 3 0 mg
Excipientes conforme necessários 14 0 mg
Peso total 60 0 mg
ERRADICANDO CANDIDA ALBICANS [0162] Como mencionado acima, Candida é um micróbio frequentemente observado na vagina, seja como um agente oportunista ou como patógeno, por exemplo, após um tratamento
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59/67 anti-infeccioso de infecções vaginais, como a vaginose bacteriana. A peculiaridade da Candida é que, ao contrário dos patógenos anaeróbios envolvidos na BV, eles podem coexistir com Lactobacilli, exercendo assim apenas um efeito sobre a composição da microbiota vaginal. A composição da flora Doderlein sob estes 3 estados diferentes (sem infecção, BV ou Candidiase) foi investigada recentemente em detalhes e publicada por G. Donders e colaboradores (Ref. 23).
[0163] Pelas razões acima mencionadas, os autores pensaram que seria útil, se viável, moldar a composição destinada a promover lactobacilos, mas ao mesmo tempo inibir patógenos, tais como ter um efeito inibitório também sobre leveduras em geral e Candida albicans em particular.
[0164] Seria tentador usar para este fim uma droga antifúngica clássica e segura como o Clotrimazol, esta molécula tem também, no entanto, uma atividade bactericida contra bactérias Gram-positivas, como Lactobacilli (Ref. 24). Na busca de uma molécula adequada para o nossa finalidade desejada, encontramos um ácido orgânico de ocorrência natural (ácido sórbico) que é amplamente utilizado como agente preservativo seguro contra a degradação de fungos e leveduras na indústria farmacêutica e de alimentos. A questão era, então, testar se o ácido sórbico (geralmente disponível como sorbato de sódio ou potássio) era capaz de inibir Candida em concentrações que não fossem inibidoras para os lactobacilos vaginais. O ótimo reportado para a atividade de sorbato é em torno de pH 4,5, que se encaixa perfeitamente na nossa faixa escolhida. A concentração praticamente utilizada para conservação contra leveduras e bolores é de 0,1% (Ref. 25).
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60/67 [0165] Para este fim, os seguintes experimentos foram realizados.
Resumo do procedimento de teste [0166] Utilizou-se uma cultura fresca durante a noite das estirpes de teste para inocular o meio de teste suplementado com diferentes concentrações de sorbato de potássio. O crescimento foi determinado pela medição da densidade óptica e do pH no inicio, após 6 horas e após 24 horas.
Condições de crescimento:
Meio para cultura durante a noite Caldo MRS com Tween
Meio de teste: Caldo MRS com Tween, diluido a 30%, pH ajustado para 4,5 com ácido lático
Volume de teste 5 ml
Incubação: 37°C, anaerobic, com agitação (120 rpm)
Densidade celular para inoculação: Aprox. 107 ufc/ml
Concentrações de sorbato de potássio 0,00%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1,0%, 1,5% (peso/volume)
Parâmetros de medição: pH, OD a 590 nm
Medições em: t=0h, 6h e 24h
Culturas bacterianas testadas
Lactobacillus gasseri CCOS 960, Lactobacillus gasseri KS
121,1, Lactobacillus crispatus KS 116,1
Preparação de culturas
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61/67 [0167] Todas as culturas foram reativadas a partir de estoques de trabalho criopreservados (-80° C) por cultivo em ágar de MRS por 1 a 3 dias. Uma única colônia destas placas foi usada para inocular 5 mL de caldo de MRS. Após incubação durante a noite, foram utilizados 107 ufc/ml para realizar os experimentos. Resultados de análise
Linhagem Concentr ação de Sorbato de Potássio OD pH Interpre tação
Oh 6h 24h Oh 6h 24h
Lactobacillus gasseri KS 120,1 0,00% 0,51 0,84 1,26 4,71 4,57 4,27 0
1,00% 0,54 0,78 0, 97 5,16 5 5, 07 1
1,50% 0,53 0,73 0,72 5,31 5,26 5,26 1
Lactobacillus jensenii KS 119, 1 0,00% 0, 12 0,54 0, 68 4,51 4,49 4,41 0
0,10% 0,08 0,23 0,44 4,5 4,5 4,5 0
0,50% 0,07 0, 11 0, 12 4 4,5 4,5 4,85 1
1,00% 0,18 0,26 0,16 5, 03 5, 01 5,09 2
1,50% 0, 17 0,24 0,13 5,32 5, 18 5,25 2
Lactobacillus crispatus KS 119, 4 0,00% 0,72 1,36 1,36 4,73 4,5 4,37 0
0,01% 0,7 1,36 1,47 4,71 4,42 4,35 0
0,05% 0, 6 1,16 1,24 4, 69 4,43 4,32 0
0,10% 0, 68 1,34 1,24 4,7 4,48 4,44 0
0,50% 0, 67 1,24 1, 15 4, 97 4,73 4,77 0
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1, 00% 0, 65 1, 13 0, 96 5, 8 5, 01 5, 08 1
1, 50% 0, 64 0, 99 0,76 5,32 5,2 5,26 1
Interpretação: 0: sem inibição, 1: inibição leve, 2: inibição forte
Conclusões [0168] Para um forte efeito inibitório no crescimento dos lactobacilos testados, foi necessária uma concentração minima de sorbato de potássio de 1% (ou 10 mg/ml) , para uma inibição ligeira, 0,5% ou superior foi necessário.
[0169] De acordo com Kramer e Assadian (Ref. 25) a
concentração microbiostática para a inibição do crescimento de
bactérias e fungos patogênicos é muito menor (S. aureus, E.
coll, K. pneumoniae: 50-100 pg/ml, Penicillium notatum, Aspergillus niger 200-500 pg/ml, Saccharomyces cerevisiae: 50100 pg/ml).
[0170] Os lactobacilos testados (gasseri, crispatus e j ensenii) que representam a flora padrão de Doderlein devem, por conseguinte, ser capazes de sustentar o seu crescimento na presença de concentrações até 0,1 - 0,2% (1,5 a 3 mg/ml) de sorbato de potássio.
[0171] Transformada numa fórmula de uma cápsula que será dissolvida em aproximadamente 3 ml de fluido vaginal, isto corresponde à adição de 3 a 6 mg de sorbato de potássio à composição (ver abaixo).
Exemplo 7.1: Formulação contra agentes patogênicos anaeróbicos obrigatórios com atividade anti-Candida
Tabela Ex. 7.1: composição quantitativa da cápsula vaginal pré-biótica de acordo com a invenção sem liofilizados e contendo também sorbato como ingrediente antifúngico
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Cápsula #12 Substância Quantidade
Pentahidrato de lactato de Ca 60 mg
Citrato de magnésio dibásico 3 0 mg
a-Glico- oligossacarideo 10 0 mg
pH alvo na vagina: 4,5 Ácido Glutâmico 4 0 mg
Cistina 3 0 mg
Sorbato de K 5 mg
Excipientes conforme necessários 185 mg
Peso total 450 mg
Tabela Ex. 7.2: composição quantitativa da cápsula vaginal de acordo com a invenção contendo liofilizados e também sorbato de potássio como agente antifúngico
Comprimido #11 Substância Quantidade
Liofilizados das linhagens vaginais L. gasseri 120,1 e 124,3 a concentrações de 1011 uf c/g 100 mg cada
Pentahidrato de lactato de Ca 60 mg
Citrato de amônio dibásico 3 0 mg
Sorbato de K 5 mg
Arginina 2 0 mg
Petição 870190050285, de 29/05/2019, pág. 105/135
64/67
Arabinogalactano 10 0 mg
pH alvo na vagina: Cistina 3 0 mg
4,5 Excipientes conforme necessários 155 mg
Peso total 60 0 mg
Exemplo 7.3: Formulação prebiótica lubrificante com atividade contra BV e Candida
Tabela Ex. 7.3: composição quantitativa de um lubrificante vaginal pré-biótico de acordo com a invenção
Gel lubrificante #3 Substância Quantidade
Ácido lático (D- ou racêmico) 5 0 mg
pH alvo do gel finalizado =4,5 Ácido cítrico 3 0 mg
Glicerol 8 0 mg
Carbômero 5 mg
Fruto- oligossacarídeo de cadeia curta 5 0 mg
MSM 2 0 mg
Ácido Glutâmico 2 0 mg
Potencial de oxidação alvo: >150 mV NaOH 0,1 mol ou HC1 0,1 mol para pH=4,5 q. s .
Água deionizada ad 1000 mg
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Claims (14)

1. Uso de uma composição caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de infecções urogenitais causadas por microrganismos patogênicos em um indivíduo feminino, em que a composição tem um pH de 4,3 a 4,6, se sólida, após dissolução/suspensão a um volume de 3 ml, e em que a composição compreende os seguintes ingredientes por dosagem única:
i) Penta-hidrato de lactato de Ca: 30-90, preferencialmente 60 mg, ii) Citrato de magnésio dibásico: 15-45, preferencialmente 3 0 mg, iii) Fibra pré-biótica: 15-150, preferencialmente 100 mg, iv) Ácido glutâmico: 20-60, preferencialmente 40 mg,
v) Cistina ou Tiossulfato: 10-50, preferencialmente 30 mg, e vi) Excipientes ad 400-1100 mg: q.s.
em que o tratamento ou prevenção compreende administrar a composição intravaginalmente ao indivíduo, para estabilizar a acidez do fluido vaginal do indivíduo ao valor fisiológico em torno de pH 4,5 ou inferior.
2. Formulação adequada para administração oral com um pH variando de 4,3 a 4,6, se sólida, após dissolução/suspensão a um volume de 3 ml, caracterizada pelo fato de que a composição compreende os seguintes ingredientes por dosagem única:
i) Penta-hidrato de lactato de Ca: 30-90, preferencialmente 60 mg,
Petição 870190050285, de 29/05/2019, pág. 111/135
2/7 ii) Citrato de magnésio dibásico: 15-45, preferencialmente 3 0 mg, iii) Fibra pré-biótica: 15-150, preferencialmente 100 mg, iv) Ácido glutâmico: 20-60, preferencialmente 40 mg,
v) Cistina ou Tiossulfato: 10-50, preferencialmente 30 mg, e vi) Excipientes ad 400-1100 mg: q.s.
3. Uso da composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição é um gel lubrificante para uso pessoal ou uma cápsula, comprimido, supositório, creme ou gel.
4. Formulação de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a formulação está na forma de uma preparação liofilizada, creme, pasta, liquido de gel, supositório, cápsula ou comprimido/haste adequado para aplicação intestinal, uretral ou vaginal.
5. Uso da composição de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda uma ou mais estirpes de lactobacilos selecionadas a partir do grupo que consiste em L. gasseri, L. j ensenii, L. crispatus, L. acidophilus, L. helveticus, L. plantarum, L. fermentum, L. lactis, L. johnsonii e L. acidophilus KS 400;
ou a formulação de acordo com a reivindicação 2, compreendendo ainda pelo menos uma estirpe de lactobacilos selecionada a partir do grupo que consiste em L. gasseri, L. jensenii, L. crispatus, L. acidophilus, L. helveticus, L. plantarum, L. fermentum e L. johnsonii.
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3/7
6. Uso da composição ou da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a referida estirpe de Lactobacillus é selecionada a partir do grupo que consiste em L. jensenii KS 109, L. gasseri KS 114.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3482, L. crispatus 116.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3483, L. jensenii KS 119.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3217, L. crispatus 119.4 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3484, L. gasseri 120.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3218, L. jensenii KS 121.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3219, L. jensenii KS 122.1, L. gasseri 123.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3485, L. gasseri 124.3 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3220, L. gasseri 126.2, L crispatus 127.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3486, L. jensenii KS 130.1, L. helveticus KS 300
Petição 870190050285, de 29/05/2019, pág. 113/135
4/7 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 10 de fevereiro de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3360 e L. acidophilus KS 400.
7. Uso da composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida estirpe de Lactobacillus é selecionada a partir do grupo consistindo em L. jensenii KS 119.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3217, L. crispatus 119.4 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3484, L. gasseri 120.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3218 e L. gasseri 124.3 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3220.
8. Formulação de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a referida estirpe de Lactobacillus é selecionada a partir do grupo consistindo em L. jensenii KS 119.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3217, L. crispatus 119.4 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3484, L. gasseri 120.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 04 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3218 e L. gasseri 124.3 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional
Petição 870190050285, de 29/05/2019, pág. 114/135
5/7 de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3220 e L. acidophilus KS 400.
9. Uso da composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 5, 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda uma quantidade eficaz de um agente anti-infeccioso terapeuticamente eficaz, capaz de inibir ou erradicar os agentes patogênicos urogenitais incluindo parasitas, protozoários, bactérias, virus e/ou fungos, preferencialmente, um agente antifúngico capaz de inibir ou erradicar fungos na área urogenital, mais preferencialmente, ácido sórbico ou seus sais.
10. Uso da composição ou da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a fibra pré-biótica é um carboidrato não digerível tal como: fruto-oligossacarideos, galacto-oligossacarideos, glicololigossacarideos e suas misturas.
11. Uso da composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 5, 6, 7, 9 ou 10 ou formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 4, 6, 8 ou 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda liofilizados de:
i) L. gasseri 120.1 depositado por Medinova AG na Coleção
Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3218 e/ou
ii) L. gasseri 124.3 e/ou L. crispatus 119.4 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 22 de julho de 2005 com o número de acesso CNCM 1-3484 e/ou
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6/Ί iii) L. jensenii KS 119.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3217 para urn total de 2 a 10 bilhões de u.f.c., somando 50 a 200 mg.
12. Uso da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 4, 6, 8, 10 ou 11 caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de infecções urogenitais causadas por microrganismos patogênicos em um indivíduo do sexo feminino.
13. Lubrificante vaginal prebiótico caracterizado pelo fato de que compreende:
1) ácido láctico: 50 mg, ii) ácido cítrico: 30 mg, iii) glicerol: 80 mg, iv) carbômero: 5 mg,
v) fruto-oligossacarídeos de cadeia curta: 50 mg, vi) tiossulfato: 10 mg, vii) ácido glutâmico: 10 mg, viii) NaOH 0,1 M ou HC1 0,1 M a pH 4,5 do lubrificante.
14. Uso de uma cápsula vaginal simbiótica para a fabricação de um medicamento para o tratamento de vaginose bacteriana, caracterizado pelo fato de que compreende:
1) Liofilizados das estirpes vaginais L. gasseri 120.1 depositado por Medinova AG na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) no dia 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3218 e L. gasseri 124.3 depositado
Petição 870190050285, de 29/05/2019, pág. 116/135
7/7 por Medinova AG em Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em 4 de junho de 2004 com o número de acesso CNCM 1-3220 em concentrações de 1011 u.f.c./g: 100 mg cada, ii) Penta-hidrato de lactato de Ca: 60 mg, iii) Citrato de magnésio dibásico: 30 mg,
Iv) Alanina: 40 mg,
v) Arabinogalactana: 100 mg, vi) Dimetil sulfona (MSM): 30 mg, vii) Excipientes: 140 mg.
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