BR112019009430A2 - geração de oócitos humanos - Google Patents
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Abstract
a presente invenção refere-se a métodos de geração de oócitos humanos funcionais após transferência nuclear de genomas do primeiro corpo polar (pb1) de oócitos em metáfase ii (mii) para o citoplasma de mii doador enucleado (pbnt) e usando técnicas de substituição mitocondrial para contornar a transmissão da doença de mtdna de mãe para filho.
Description
“GERAÇÃO DE OÓCITOS HUMANOS”
CAMPO DA TÉCNICA [001]Geralmente, o campo envolve a geração de oócitos humanos in vitro através da transferência de material nuclear. Mais especificamente, o campo envolve a geração de oócitos humanos através de transferência nuclear de corpos polares para oócitos de doador enucleados e/ou a transferência de material nuclear de um oócito contendo mutações de DNA mitocondrial para um oócito sem essas mutações.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002]A infertilidade atribuída a fatores masculinos e femininos afeta milhões de famílias em todo o mundo e enquanto as tecnologias de reprodução assistida (ARTs) podem contornar muitos casos (Huang JY e Rosenwaks Z, Meth Mol Biol 1154, 171 a 231 (2014); incorporado por referência aqui; Leridon H, Human Reproduction 19, 1548 a 1553 (2004); Trounson A e Mohr L, Nature 305, 707 a 709 (1983); todos os quais são aqui incorporados por referência), a sua eficácia é particularmente limitada pelo número e a qualidade dos oócitos que diminuem com a idade materna avançada (Leridon 2004 acima). Portanto, o desenvolvimento de fontes adicionais de oócitos competentes, geneticamente relacionados aos pacientes, é desejável.
[003]Talvez a abordagem final envolva a diferenciação de células-tronco pluripotentes em células germinativas primordiais (PGCs) e, finalmente, em oócitos maduros (Daley GQ e outros, Science 316, 409 a 410 (2007); Handel MA e outros, Cell 157, 1257 a 1261 (2014), Hayashi Y e outros, Fértil Steril 97, 1250 a 1259 (2012), Matthews TJ e outros, NCHS Data Brief 1-8 (2009), todos os quais são aqui incorporados por referência). No entanto, a complexidade de estabelecer um sistema in vitro para produzir oócitos humanos haploides funcionais atualmente limita esta aplicação (Irie N e outros, Cell 160, 253 a 268 (2015) e Sasaki K e outros, Cell Stem Cell 17, 178 a 194 (2015), ambos os quais são aqui incorporados por referência).
[004]Mutações de mtDNA maternalmente herdadas podem causar doenças
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2/55 debilitantes fatais ou graves em crianças (Archer SL, Engl J Med 369, 2236 a 2251 (2013); Koopman WJ e outros, N Engl J Med 366, 1132 a 1141 (2012); e Schon E e outros, Nat Rev Genet 13, 878 a 890 (2012), todos os quais são aqui incorporados por referência). A gravidade da doença depende da mutação genética específica e da relação de mtDNA patogênico para ocorrência natural (nível de heteroplasmia) em cada célula e tecido (Wallace DC & Chalkia D, Cold Spr Harb Perspect Biol 5, a021220 (2013); incorporado aqui como referência). Mutações patogênicas de mtDNA são relativamente comuns com um número estimado de 778 crianças afetadas nascidas a cada ano nos Estados Unidos (Gorman GS e outros, N Engl J Med 372, 885 a 887 (2015); incorporado aqui por referência). Atualmente, não há cura efetiva para pacientes com mutações do mtDNA. Portanto, técnicas de substituição mitocondrial (MRTs) foram desenvolvidas para prevenir a transmissão de mtDNA mutante de mães para seus filhos (Wolf DP e outros, Tendências Mol Med 21,68 a 76 (2015); Wang T e outros, Cell 157, 1591 a 1604 (2014), Tachibana M e outros, Nature 493, 627 a 631 (2013), Craven L e outros, Nature 465, 82 a 85 (2010) e Tachibana M e outros, Nature 461,367 a 372 (2009) todos os quais são aqui incorporados por referência). Agências reguladoras nos EUA e Reino Unido estão atualmente avaliando aplicações clínicas de MRT projetadas para avaliar a eficácia e a segurança. Até o momento, os aspectos clínicos de MRT não foram estudados, incluindo questões de elegibilidade do paciente, desenvolvimento do embrião e manutenção do mtDNA do doador pós-MRT.
[005]Permanece a necessidade de métodos melhorados de assistência com fertilização, implantação e gravidez bem-sucedida em pacientes com oócitos em declínio ou de outro modo incompetentes.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [006]São aqui fornecidos métodos para a preparação de oócitos para fertilização e implantação uterina.
[007]É aqui descrita a reconstrução de novo de oócitos humanos haploides
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3/55 através da reciclagem de genomas PB1 através de transferência nuclear em citoplasma doador (Gurdon JB, Rambam Maimonides Med J 6 (2015), aqui incorporado por referência).
[008]Os defeitos dos oócitos estão no coração de algumas formas de infertilidade, e poderíam potencialmente ser tratados terapeuticamente por rotas alternativas para a formação de oócitos. É aqui descrita a geração de oócitos humanos funcionais após transferência nuclear de genomas do primeiro corpo polar (PB1) a partir de oócitos da metáfase II (Mil) para o citoplasma Mil do doador enucleado (transferência nuclear de corpo polar, PBNT). Os oócitos reconstruídos suportaram a formação de fusos meióticos de novo e, após a fertilização com espermatozóides, a finalização da meiose e a formação de zigotos diploides normais. Enquanto os zigotos PBNT evoluíram para blastocistos com menor frequência (42%) que controles (75%), análises genéticas, epigenéticas e transcricionais de PBNT e células-tronco embrionárias de controle (ESCs) indicaram números comparáveis de variações estruturais e perfis de transcriptoma e metilação de DNA similares. O material genético PB1 através da introdução no citoplasma do doador pode fornecer oócitos para tratamento de infertilidade ou terapia de reposição mitocondrial para doença de mtDNA.
[009]Este método permite gerar oócitos adicionais que correspondem ao paciente para o tratamento de infertilidade. Utilizando cada oócito Mil do paciente e seu PB1 (mais citoplasma do doador), os oócitos / embriões relacionados ao paciente podem ser teoricamente duplicados. Realisticamente, o desenvolvimento de embriões PBNT para blastocistos é menor. Assim, pode-se estimar que o número de embriões viáveis para transferência e, portanto, taxas de gravidez pode aumentar em 40%.
[010]É aqui descrito um método para gerar um oócito humano viável. O método envolve enuclear um primeiro oócito no estágio Mil, criando assim um citoplasto, isolando um corpo polar de um segundo oócito por aspiração, e colocando
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4/55 o corpo polar no espaço perivitelino do citoplasto. O método também pode envolver fertilizar o oócito humano viável, criando assim um embrião. O método pode ainda compreender implantar o embrião em um revestimento uterino receptivo (endometrial). A enucleação do primeiro oócito pode ser realizada em um meio compreendendo ao menos 10% de fluido tubário humano, um tampão, e citocalasina B utilizando um Sistema de Imagiologia de Microscópio de Polarização. O isolamento do corpo polar pode ser realizado em um meio compreendendo ao menos 10% de fluido tubário humano, tampão, citocalasina B, e a fusão com o citoplasto de doador pode ser induzida com o extrato de HVJ-E (vírus hemaglutinante do envelope de vírus do Japão / Sendai).
[011]É fornecido um método para preparar um oócito para fertilização, o método compreendendo as etapas de:
a) isolar um primeiro oócito contendo um corpo polar;
b) ganhar acesso através da zona pelúcida do primeiro oócito;
c) remover o corpo polar do primeiro oócito;
d) remover o fuso nuclear de um segundo oócito para criar um citoplasto enucleado;
e) colocar o corpo polar removido do primeiro oócito no espaço perivitelino do citoplasto enucleado.
[012]É também fornecido um método para produzir um oócito humano in vitro, o método compreendendo:
a) determinar uma sequência de DNA mitocondrial da caixa II de sequência conservada de um oócito do doador;
b) enuclear o oócito do doador enquanto o oócito do doador está preso na metáfase II, isolando assim o material genético nuclear do doador;
c) introduzir o material genético nuclear do doador em um oócito do receptor enucleado, desde que o DNA mitocondrial do oócito do doador tenha o mesmo
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5/55 genótipo da caixa II de sequência conservada que o oócito do receptor.
[013]Modalidades adicionais de ambos os métodos acima envolvem uma etapa adicional de fertilizar o oócito recém-criado através de fertilização in vitro. Em modalidades adicionais, o oócito / embrião fertilizado é cultivado no estágio de blastocisto antes da implantação em um receptivo revestimento uterino / endometrial.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [014]Figuras coloridas foram enviadas como parte da descrição original e referências a cores nas figuras são fornecidas nesta descrição. Os requerentes se reservam o direito de apresentar versões em cores das figuras descritas neste documento em procedimentos posteriores.
[015]A Figura 1A mostra a geração de oócitos humanos haploides por PBNT. Ο PB1 de um oócito do doador é recuperado e introduzido em um citoplasto Mil do receptor. Após a fertilização, os zigotos do PBNT são cultivados no estágio de blastocisto antes de serem transferidos para um paciente. Alternativamente, eles podem ser usados para derivar células-tronco embrionárias para posterior análise.
[016]A Figura 1B mostra microscopia confocal detectando estruturas cromossômicas do fuso meiótico em PB1 (primeiro painel da esquerda), oócitos Mil intactos (segundo painel) e oócitos PBNT (terceiro painel) marcados com DAPI (azul) para DNA e a- e β-tubulinas (verde) para microtúbulos. Observa-se a ausência de fuso meiótico em PB1 (primeiro painel) e fusos anormais em prófase (terceiro painel) ou anáfase (último painel) em alguns oócitos PBNT. Barras de escala de 5 pm.
[017]A Figura 1C mostra que a maioria dos PB1s em oócitos Mil humanos recentemente recuperados estavam intactos com morfologia circular (painel esquerdo). Outros oócitos Mil continham PB1 fragmentados ou desintegrados, inadequados para o PBNT (painéis do meio e direito). Barra de escala, 100 pm.
[018]A Figura 1D mostra a formação do fuso (seta), detectada usando o sistema de imagem OosightTM, 60 min após ο PB1 ter sido introduzido em um
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6/55 citoplasto Mil enucleado. Barra de escala, 100 pm.
[019]A Figura 1E mostra a conclusão da meiose e formação de pronúcleos em oócitos PBNT humanos após a fertilização. Observa-se o zigoto normal com 2 pronúcleos (2PN) e um segundo corpo polar (PB2) no painel esquerdo e 1PN, 3PN ou 2PN anormais sem extrusão de PB2 em outras imagens. Barras de escala, 100 pm.
[020]A Figura 1F mostra um blastocisto de eclosão a partir de um zigoto PBNT, com ICM proeminente indicado por asterisco. Barra de escala, 100 pm.
[021 ]A Figura 1G mostra um resumo da fertilização e desenvolvimento in vitro de blastocistos de oócitos PBNT. Barras de erro são média ± SEM. Significância estabelecida com o teste t de Student. Controle = oócitos Mil intactos.
[022]A Figura 2A mostra uma análise de bandas G citogenética das linhagens PBNT 1, PBNT2, e hESO-14, hESO-15, hESO-16 e hESO-17 de controle. Nota-se que os cariótipos femininos normais em PBNT1 e hESO-14 de controle e cariótipos masculinos normais em hESO-16 de controle e hESO-17. PBNT2 exibiu um cariótipo triploide anormal enquanto hESO-15 de controle teve um cariótipo anormal com a monossomia do cromossomo 21.
[023]A Figura 2B mostra um diagrama de Venn exibindo os resultados da análise de variação estrutural em PBNT 1, hESO-14 em comparação com o doador de óvulos. PBNT1 (azul) e hESO-14 (vermelho) apresentaram números similares de SVs quando comparados com o doador de óvulos.
[024]A Figura 2C mostra um diagrama de Venn exibindo os resultados da análise de variação estrutural em PBNT 1, hESO-14 em comparação com o doador de esperma. PBNT1 (azul) e hESO-14 (vermelho) apresentaram números similares de SVs quando comparados com o doador de esperma.
[025]A Figura 2D mostra um resumo de SVs em PBNT1 e hESO-14.
[026]A Figura 3A mostra a porcentagem de CGs metilados em PBNT1 e hESO-14 do total de sítios CG.
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7/55 [027]A Figura 3B mostra taxas de metilação não CG em PBNT1 e hESO-14 entre todos os sítios não-CG.
[028]A Figura 3C mostra que um total de 116 CG DMRs foi identificado entre PBNT1 e hESO-14. Características genômicas de DMRs (sobreposição de ao menos 1 pb) - CGI, ilhas CG; DHS, sítios de hipersensibilidade à DNase I, TSS, sítios de início da transcrição; TES, sítios de fim de transcrição.
[029]A Figura 3D mostra uma captura de tela representativa mostrando uma CG DMR hipometilada em PBNT1 em comparação com hESO-14.
[030]A Figura 3E é um conjunto de capturas de tela mostrando quatro DMRs não-CG identificados em PBNT1 em comparação com hESO-14.
[031 ]A Figura 4A é um gráfico de manchas que resume a análise de expressão diferencial (DE). A variação log-fold de cada um dos 14877 genes usados na análise é representada contra a abundância média (log de contagens por milhão) de cada gene. Os pontos vermelhos representam os genes com expressão significativamente diferente (FDR < 0,05). As linhas azuis indicam aumentos de 2 vezes.
[032]A Figura 4B é um mapa de calor que mostra o perfil de expressão dos genes 186 DE. Dois grupos distintos foram aparentes com genes expressos altamente em células PBNT1 em comparação com células hESO-14 e vice-versa (n = 6).
[033]A Figura 5A mostra análises histológicas de tumores de teratoma produzidos após injeções de PBNT1 em camundongos SCID. Barras de escala, 100 pm. As setas indicam tecidos similares à crista neural (ectoderma), tecidos similares à cartilagem (mesoderma) e epitélio da mucosa de tecidos similares a intestino (endoderme).
[034]A Figura 5B mostra análises histológicas de tumores de teratoma produzidos após injeções de hESO-14 em camundongos SCID. Barras de escala, 100 pm. As setas indicam tecidos similares à crista neural (ectoderma), tecidos similares à cartilagem (mesoderma) e epitélio da mucosa de tecidos similares a intestino
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8/55 (endoderme).
[035]A Figura 6A é uma genealogia das famílias 1 e 2 da Síndrome de Leigh.
[036]A Figura 6B é uma genealogia da família 3 G13513A da Síndrome de Leigh.
[037]A Figura 6C é uma genealogia da família 5 A3243G da síndrome MELAS de genealogia grande (ver também a Figura 10B).
[038]Para todas as Figuras 6A, 6B e 6C, os níveis de heteroplasma sublinhados foram obtidos a partir de relatórios anteriores. Em todas as famílias, os níveis de heteroplasmia para as mutações de mtDNA foram diversos entre tecidos e indivíduos, e associados à doença clínica. Preto preenchido, diagnosticado como uma doença mitocondrial. LS = síndrome de Leigh, y = anos de idade, quadrado = macho; círculo = fêmea, B = sangue; SF = fibroblastos da pele; U = urina.
[039]A Figura 7A é um conjunto de gráficos que mostram oócitos individuais que abrigam diferentes níveis de heteroplasmia. cED = doador de oócito portador.
[040]A Figura 7B é um conjunto de dois gráficos que mostram que o nível médio de heteroplasmia em oócitos está correlacionado com níveis em crianças existentes, em vez daqueles em doadores de oócitos portadores. Os níveis de heteroplasmia de portadores e crianças foram medidos no sangue. R = valores r de Pearson.
[041 ]A Figura 7C é um gráfico que mostra variantes de mtDNA comparáveis entre oócitos com mtDNA saudável e aqueles carregando mutações de mtDNA (p > 0,05).
[042]A Figura 7D é um gráfico que mostra que o número total de cópias de mtDNA era comparável em oócitos com mtDNA saudável e aqueles carregando mtDNA patogênico (p > 0,05). Os carioplastos foram isolados de oócitos portadores para ST, exceto os oócitos de cED2, que exibiram luteinização prematura. Os oócitos de doadores de óvulos saudáveis eram Mil maduros, n = o número de oócitos. LS:
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9/55 síndrome de Leigh; MELAS: encefalomiopatia mitocondrial com acidose lática e episódios tipo acidente vascular cerebral, teste t, ns = não significativo (p > 0,05).
[043]A Figura 8A é um conjunto de gráficos que mostram o desenvolvimento do embrião ST após várias manipulações experimentais. Resultados de desenvolvimento similares foram observados entre os grupos, exceto a taxa de fertilização normal, que foi significativamente menor nos grupos ST congelados (p < 0,05). Combinações = mistura de diferentes haplótipos de mtDNA entre o carioplasto e o citoplasto; Controle intacto = não manipulado, somente ICSI.
[044]A Figura 8B é um conjunto de gráficos que mostra que os embriões ST portadores de diferentes tipos de mutação apresentaram um padrão de desenvolvimento similar.
[045]A Figura 8C é um conjunto de gráficos que mostra o desenvolvimento do embrião ST como uma função das distâncias de correspondência do mtDNA do doador. Os números no topo das barras são porcentagem (%) do desenvolvimento embrionário. N = o número de embriões, ns = não significativo (p > 0,05).
[046]A Figura 8D é um conjunto de gráficos de NPCs derivados de ST ESCs com diferenças de 6 e 49 SNP em taxas de consumo de oxigênio (OCR) exibidas de mtDNA do doador similares aos controles não manipulados. No entanto, NPCs com 33 SN Ps mostraram OCR significativa reduzida em comparação a controles ou com mtDNA de doador ou materno (p < 0,05). O ensaio de cavalos-marinhos foi repetido 3 vezes diferentes com 6 a 18 repetições de cada vez. Ver também a Figura 13A. NPCs = células progenitoras neurais. SNPs = polimorfismos de nucleotídeo único, teste t ou ANOVA Unidirecional.
[047]A Figura 9A é uma imagem de um gel mostrando polimorfismo na região CSBII do mtDNA do doador que resulta em uma eficiência reduzida de geração de iniciadores de replicação por RNA-polimerase mitocondrial. O polimorfismo 311315CCCCC é um encurtamento do primeiro alongamento G na região G-quadruplex
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10/55 do mtDNA (alongamento G5 vs. G6), responsável pela terminação da transcrição e geração de iniciador de replicação em mitocôndrias humanas.
[048]A Figura 9B é um gráfico mostrando taxas de heteroplasmia para o mtDNA materno (haplótipo H49) aumentadas gradualmente durante a cultura estendida in vitro de 3243ST-ES1 e atingiu homoplasmia.
[049]A Figura 9C é um gráfico que mostra que os níveis de heteroplasmia também aumentaram durante a subcultura de colônia ESC única.
[050]A Figura 9D é um gráfico que mostra a manutenção da heteroplasmia estável na progênie de células cultivadas individualmente.
[051 ]A Figura 9E é um gráfico que mostra taxas mais rápidas de crescimento e proliferação celular em clones contendo maior heteroplasmia de mtDNA materno.
[052]A Figura 9F é um conjunto de três gráficos que mostram alterações da heteroplasmia do mtDNA materno em linhagens celulares 3243ST-ES1, ST-ES7 e NTES8 reversas durante a diferenciação in vitro e in vivo. ANOVA Unidirecional. Média ±SD.
[053]A Figura 10A é uma tabela que mostra famílias com doença mitocondrial e mulheres em idade reprodutiva recrutadas para MRT. Todas as famílias LS tinham uma criança gravemente afetada. F, família; não-sin, não sinônimo; n/a, não aplicável.
[054]A Figura 10B mostra que a Família 5 foi selecionada a partir de uma genealogia de síndrome MELAS extensiva. Os fenótipos clínicos da síndrome MELAS A3243G variaram mesmo com níveis similares de heteroplasmia. Quadrados, machos vs. Círculos, fêmeas; B = sangue e U = urina, n/t, não testado. *, o primeiro paciente MELAS diagnosticado clinicamente. Heteroplasmia no sangue (superior) e na urina (inferior).
[055]A Figura 11A é um gráfico que mostra que a idade dos doadores de oócitos foi similar entre os grupos de portadores e saudáveis.
[056]A Figura 11B é um gráfico que mostra que a reserva ovariana foi
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11/55 significativamente inferior nos doadores portadores em relação aos doadores de oócitos saudáveis.
[057]A Figura 11C é um gráfico que mostra que a contagem de folículos antrais (AFC) foi significativamente menor nos doadores portadores em relação aos doadores de oócitos saudáveis.
[058]A Figura 11D é um gráfico que mostra que a duração de COS foi maior nos portadores.
[059]A Figura 11E é um gráfico que mostra que o pico de estradiol (E2) no dia de hCG tendeu a reduzir nos portadores.
[060]A Figura 11F é um gráfico que mostra que o rendimento total de oócitos foi significativamente menor em portadores do que os doadores de oócitos saudáveis.
[061 ]A Figura 11G é um gráfico que mostra que o número de oócitos maduros foi significativamente menor nos doadores portadores do que nos doadores de oócitos saudáveis.
[062]A Figura 11H é uma tabela de características basais e resultados de ciclo. Portadores tiveram maior IMC e menores níveis de AMH. Os menores níveis de pico de estradiol foram medidos em cED1 e cED2. Método de controle de natalidade: contraceptive oral combinado. Medroxiprogesterona.
[063]A Figura 111 é um conjunto de dois gráficos de pizza mostrando a análise de variantes de mtDNA heteroplásmicas detectadas em oócitos Mil. De novo indica mutações únicas encontradas em oócitos individuais; hereditária significa mutações compartilhadas com outros oócitos, irmãos ou doadores de óvulos, n = número de mutações em oócitos individuais.
[064]A Figura 11J é um conjunto de dois gráficos que mostram que os níveis de AMH, uma medida da reserva ovariana, não estavam correlacionados com o número de cópias do mtDNA. n = o número de oócitos. ns = não significativo.
[065]A Figura 12A é uma tabela que mostra os resultados do sequenciamento
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12/55 de mtDNA integral realizado para identificar haplótipos de todos os doadores de óvulos e ST foi realizado para combinar vários haplótipos. Cyto, citoplasto; Karyo, carioplasto.
[066]A Figura 12B é um conjunto de imagens que mostram a fertilização normal (2PN, esquerda) e fertilização anormal (1 ou 3 PN). Ver as setas.
[067]A Figura 12C é uma tabela que mostra que o portador ST apresentou maior fertilização anormal que os controles. Um zigoto de 3 PN do grupo controle ST evoluiu para um blastocisto e exibiu um cariótipo 69, XXY. * p < 0,05.
[068]A Figura 12D é uma tabela que mostra que a taxa de blastulação era similar entre citoplasma vitrificado com fusos frescos e fusos vitrificados com citoplasma fresco (p > 0,05).
[069]A Figura 12E é um conjunto de gráficos que mostram o desenvolvimento do embrião com DNA mitocondrial de diferentes doadores.
[070]A Figura 13A é um conjunto de 15 gráficos que mostram os resultados em que o metabolismo energético (OCR / ECAR) foi medido e comparado entre células progenitoras neurais (NPCs) derivadas de MRT e embriões de controle portadores ou de mtDNA de doador ou de mtDNA materno. OCR = taxa de consumo de oxigênio (representando OXPHOS), ECAR = taxa de acidificação extracelular (representando a glicólise). NPCs de MRT ESCs com 6 e 49 diferenças de SNP apresentaram OCR comparável para NPCs portadores de mtDNA materno ou de mtDNA de doador, exceto a respiração máxima em grupo de 49 SNP. OCR foi reduzido em NPCs com 33 SNPs. Os dados de OCR foram normalizados pelo teor de DNA de células vivas. * vs. mtDNA de hospedeiro, ** vs. mtDNA de doador, *** vs. ST (p < 0,05, teste t ou ANOVA Unidirecional, n = 16-18 réplicas técnicas). Média ± SEM.
[071 ]A Figura 13B é um conjunto de gráficos que mostram a atividade enzimática da cadeia respiratória mitocondrial em células diferenciadas de ST-ESCs. Atividades do complexo mitocondrial I e IV em células diferenciadas de ST-ESCs
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13/55 portadoras de mtDNA do doador com 49 diferenças de SNP foram comparáveis aos controles ou com mtDNA de doador ou mtDNA materno.
[072]A Figura 14A é uma tabela que mostra um resumo da diferenciação in vitro e in vivo de ESCs derivados de embriões ST ou SCNT portadores de mtDNA de doador. De forma similar ao controle de IVF-ESCs, todos os MRT ESCs testados produziram tumores de teratoma in vivo e formaram células progenitoras neurais (NPCs) e cardiomiócitos in vitro.
[073]A Figura 14B é uma análise histológica de tecidos diferenciados a partir de MRT-ESCs. Os tecidos representativos foram coletados e utilizados para análise de transporte de mtDNA e medições da função mitocondrial.
[074]A Figura 15A é um gráfico e uma tabela que mostram que a taxa de aneuploidia em blastocistos, determinada por arranjo CGH, não foi significativamente diferente nos grupos ST em comparação com o controle.
[075]A Figura 15B é um gráfico e uma tabela que mostram que uma taxa de anormalidade de Cariótipo em ESCs determinada por análise de bandas G também foi comparável entre os grupos ST. Barras = média ± s.d. Número dentro das barras = o número de blastocistos ou linhas ESC. Testes simples de χ2.
[076]A Figura 16A é um conjunto de dois gráficos que mostram que a heteroplasmia do mtDNA materno (haplótipo X2c) aumentou durante o cultivo in vitro prolongado e atingiu a homoplasmia em culturas agrupadas ou em subculturas de colônias individuais.
[077]A Figura 16B é um conjunto de dois gráficos que mostram que as atividades enzimáticas do complexo da cadeia respiratória 1 (COM I) e do complexo 4 (COM IV) foram medidas em fibroblastos que transportam vários haplótipos de mtDNA humano utilizados neste estudo. Não foram observadas diferenças significativas.
[078]A Figura 17 é uma tabela que resume o arranjo CGH em blastocistos
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14/55 intactos e ST.
[079]A Figura 18 é uma tabela que resume as bandas G de linhas ESC derivadas de blastocistos de controle e ST.
DESCRIÇÃO DETALHADA [080]É aqui fornecido um método para gerar um oócito humano viável, o método compreendendo as etapas de:
a) enuclear um primeiro oócito no estágio Mil, criando assim um citoplasto;
b) isolar um corpo polar a partir de um segundo oócito por aspiração; e
c) colocar o corpo polar no espaço perivitelino, fundindo assim o corpo polar com o citoplasto e gerando o oócito humano viável.
[081 ]Em outras modalidades, os métodos aqui incluídos envolvendo transplante de corpo polar compreendem ainda uma etapa de fertilizar o oócito humano viável via fertilização in vitro, criando assim um embrião. Em outras modalidades, o método compreende ainda implantar o embrião em um revestimento uterino endometrial receptivo.
[082]Em outras modalidades dos métodos, a enucleação do primeiro oócito é realizada em um meio compreendendo ao menos 10% de fluido tubário humano, tampão HEPES e citocalasina B. Em outras modalidades, a etapa de enucleação é completada utilizando um Sistema de Imagiologia de Microscópio de Polarização.
[083]Ainda em outras modalidades, a etapa do método de isolar o corpo polar é realizada em um meio compreendendo ao menos 10% de fluido tubário humano, tampão HEPES, citocalasina B e fusão com citoplasto de doador induzido com extrato de HVJ-E.
[084]Em outras modalidades, a zona pelúcida é aberta por meio de métodos selecionados a partir de corte de zona, perfuração a laser (tal como com um laser de nitrogênio compacto) e perfuração ácida (como com meio ácido de Tyrode).
[085]É também fornecido um método para produzir um oócito humano in vitro,
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15/55 compreendendo:
a) determinar uma sequência de DNA mitocondrial da caixa de sequência II conservada de um oócito do doador;
b) enuclear o oócito do doador enquanto o oócito do doador está preso na metáfase II, isolando assim o material genético nuclear do doador;
c) introduzir o material genético nuclear do doador em um oócito do receptor enucleado, desde que o DNA mitocondrial do oócito do doador tenha o mesmo genótipo da caixa de sequência II conservada que o oócito do receptor.
[086]Em algumas modalidades, o método imediatamente acima é realizado quando o oócito do doador e o oócito do receptor têm ambos o genótipo G5A8 ou ambos têm o genótipo G6A8. Ainda em outras modalidades do método, o DNA mitocondrial do oócito do doador compreende uma mutação que resulta em uma doença mitocondrial, incluindo mas não limitada à Síndrome de Leigh ou MELAS.
[087]Também é fornecido um método de produzir um oócito humano in vitro, o oócito humano produzido compreendendo DNA mitocondrial materno mínimo e o método compreendendo as etapas de:
a) determinar a sequência da região não codificante principal do DNA mitocondrial de um oócito do doador, em que a sequência principal da região não codificante inclui uma região de D-loop;
b) enuclear o oócito do doador enquanto o oócito do doador está preso na metáfase II, isolando assim o material genético nuclear do doador; e
c) introduzir o material genético nuclear do doador em um oócito do receptor, desde que o DNA mitocondrial do oócito do doador tenha a mesma sequência da região não codificante principal do oócito do receptor.
[088]Em modalidades adicionais do método imediatamente acima, o oócito do doador e o oócito do receptor têm ambos o haplótipo de mtDNA H56, H1b, U5a, F1a, X2c, D4a, H49 ou B2k. Em outras modalidades, o DNA mitocondrial a partir do oócito
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16/55 do doador compreende uma mutação que resulta em uma doença mitocondrial, tal como Síndrome de Leigh ou MELAS.
[089]Outras doenças mitocondriais para as quais a utilização dos presentes métodos pode ser considerada incluem, mas não estão limitadas à possível ocorrência de miopatia mitocondrial; diabetes mellitus e surdez; poliodistrofia infantil progressiva (doença de Alpers); neuropatia óptica hereditária de Leber; Síndrome de Barth / Cardiomiopatia Letal Infantil (LIC); neuropatia, ataxia, retinite pigmentosa, e ptose (NARP); encefalopatia gastrointestinal mioneurogênica (MNGIE); deficiência de carnitina-acil-carnitina; deficiência de carnitina; síndromes de deficiência de creatina; deficiência de co-enzima Q10; deficiência do complexo I; deficiência do complexo II; deficiência do complexo III; deficiência de complexo IV / deficiência de COX; deficiência do complexo V; epilepsia mioclônica com fibras vermelhas irregulares (MERRF); miopatia mitocondrial, encefalomiopatia, acidose lática, sintomas similares a AVC (MELAS); depleção de mtDNA; Síndrome de Oftalmoplegia Externa Progressiva Crônica (CPEO); deficiência de CPT I; deficiência de CPT II; Síndrome de Kearns-Sayre (KSS); acidose lática; LBSL-Leucodistrofia; deficiência de Acil-CoA Desidrogenase de Cadeia Longa (LCAD); LCHAD; Doença de Luft; Deficiência múltipla de Acil-CoA Desidrogenase; Deficiência de Acil-CoA Desidrogenase de Cadeia Curta; Deficiência de Acil-CoA Desidrogenase de Cadeia Média; Deficiência de Acil-CoA Desidrogenase de Cadeia Muito Longa; Encefalomiopatia Mitocondrial Acidose Lática e Episódios tipo Acidente Vascular Cerebral (MELAS); Síndrome de Ataxia Recessiva Mitocondrial; Citapatia Mitocondrial; Depleção de DNA mitocondrial; encefalopatia mitocondrial; Transtorno e Encefalopatia Mioneurogastrointestinal; Síndrome de Pearson; deficiência de Piruvato Carboxilase; deficiência de piruvato desidrogenase; e Mutações de POLG2.
Definições [090]0 termo “corpo polar” refere-se a células haploides, significativamente
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17/55 menores que um oócito que é formado em conjunto com um oócito durante a oogênese. Em particular, os corpos polares incluem a metade do conjunto cromossômico diploide não incluído no oócito após a divisão meiótica. Os corpos polares compreendem polinucleotídeos (por exemplo, DNA) que codificam a informação sobre o indivíduo. O material genético nuclear inclui, mas não está limitado a cromossomos e cromatina. O termo inclui material genético nuclear produzido por divisão celular meiótica, tal como a divisão ou uma célula diploide, a um oócito haploide. Assim, uma célula inclui material genético nuclear derivado de um corpo polar de doador se o corpo polar tiver sido transferido para um citoplasto enucleado via transferência nuclear de célula somática.
[091 ]O termo “oócito” refere-se a um gameta feminino ou célula germinativa envolvida na reprodução, também chamada de óvulo. Um oócito maduro é uma célula haploide com um único conjunto de cromossomos maternos (23, X em um primata humano) e é interrompido na metáfase II. Um oócito “híbrido” tem o citoplasma de um primeiro oócito de primata (denominado “receptor”), mas não tem o material genético nuclear do receptor; ele tem o material genético nuclear de outro oócito ou de um corpo polar e é denominado oócito do “doador”.
[092]Meiose é um processo de divisão redutora no qual o número de cromossomos por célula é reduzido pela metade. Nos animais, a meiose sempre resulta na formação de gametas. Durante a meiose, o genoma de uma célula germinativa diploide, que é composta de longos segmentos de DNA empacotados em cromossomos, sofre replicação de DNA seguida de dois ciclos de divisão, resultando em quatro células haploides. Cada uma dessas células contém um conjunto completo de cromossomos, ou metade do conteúdo genético da célula original. A meiose I separa cromossomos homólogos, produzindo duas células haploides (23 cromossomos, N em humanos), então a meiose I é chamada de uma divisão redutora. Uma célula humana diploide regular contém 46 cromossomos e é considerada 2N
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18/55 porque contém 23 pares de cromossomos homólogos. No entanto, após a meiose I, embora a célula contenha 46 cromossomos, ela é considerada apenas N, porque mais tarde, na anáfase I, as cromátides irmãs permanecerão juntas enquanto o fuso puxa o par em direção ao polo da nova célula. Na meiose II, ocorre uma divisão equacionai similar à mitose, por meio da qual as cromátides irmãs são finalmente separadas, criando um total de 4 células haploides (23 cromossomos, N) por célula-filha a partir da primeira divisão.
[093]Um “fuso meiótico” é uma estrutura que separa os cromossomos em células filhas durante a divisão celular meiótica. Ele faz parte do citoesqueleto em células eucarióticas. O aparelho de fuso inclui os microtúbulos do fuso, proteínas associadas, e quaisquer centrossomas ou asters presentes nos polos do fuso. O aparelho do fuso tem uma forma vagamente elipsoide e afunila nas extremidades, mas se espalha no meio. Na porção média ampla, conhecida como fuso-mediano, os microtúbulos antiparalelos são agrupados por cinesinas. Nas extremidades pontiagudas, conhecidas como polos fusiformes, os microtúbulos são nucleados pelos centrossomas na maioria das células animais.
[094]O termo “DNA mitocondrial” ou “mtDNA” refere-se ao DNA da mitocôndria, uma estrutura situada no citoplasma da célula e não no núcleo (onde todos os outros cromossomos estão localizados). In vivo, todo o mtDNA é herdado da mãe. Existem 2 a 10 cópias do genoma do mtDNA em cada mitocôndria. O DNA mitocondrial é uma molécula circular de fita dupla. Ele é muito pequeno em relação aos cromossomos do núcleo e inclui apenas um número limitado de genes, como aqueles que codificam várias subunidades do complexo mitocondrial da cadeia respiratória e os genes de alguns RNAs ribossômicos e RNAs de transferência. Uma célula inclui o mtDNA derivado da mitocôndria baseada na replicação citoplasmicamente continuada, que no caso da transferência do corpo polar é baseada no citoplasto do receptor.
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19/55 [095]O termo “metilação do DNA” refere-se à adição pós-sintética de grupos metila a sítios específicos em moléculas de DNA; a reação é catalisada por enzimas chamadas DNA metiltransferases que são específicas para nucleotídeos e posição de metilação. Em eucariotas, a metilação está envolvida na expressão gênica, e desempenha um papel em uma variedade de mecanismos epigenéticos, incluindo o desenvolvimento, a inativação do cromossomo X, a impressão genômica, a mutabilidade do DNA, e o crescimento celular descontrolado no câncer.
[096]O termo “inativação do cromossomo X” refere-se à inativação de um de cada par de cromossomos X para formar o corpo de Barr em células somáticas de mamíferos fêmeas. Assim, os tecidos cujo zigoto original continha genes heterozigóticos que transportam X deveríam ter células individuais expressando um ou outro, mas não ambos, dos produtos gênicos codificados por X. Acredita-se que a inativação ocorra no início do desenvolvimento e leve ao mosaicismo de expressão desses genes no corpo.
[097]A frase “compensação de dosagem” refere-se a um mecanismo que detecta a dosagem de genes e regula a expressão consequentemente. Em mamíferos, há expressão monoalélica de genes ligados ao X que diferem em dose entre fêmeas (XX) e machos (XY). “XIST” refere-se a um gene que codifica um RNA não codificante grande que demonstrou ser necessário para o silenciamento do cromossomo X regulado pelo desenvolvimento em fêmeas. O XIST RNA tem aproximadamente 18 kb e não é traduzido, ele é spliced, e poliadenilado. Ele também é organizado em blocos de sequência repetitiva. In vivo, o XIST RNA revela-se associado de forma estável com o cromossomo X silenciado. A expressão do XIST RNA é sempre limitada por cis, e está associada ao cromossomo X silenciado nas fêmeas.
[098]O termo “quantidade eficaz” ou “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se à quantidade de agente ou célula que é suficiente para prevenir, tratar,
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20/55 reduzir e/ou melhorar os sintomas e/ou causas subjacentes de qualquer distúrbio ou doença, ou a quantidade de um agente suficiente para produzir um efeito desejado em uma célula. Em uma modalidade, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” é uma quantidade de uma célula ou um agente suficiente para reduzir ou eliminar um sintoma de uma doença. Em outra modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade suficiente para superar a própria doença.
[099]Como aqui utilizado, o termo “embrião” refere-se geralmente a uma massa celular obtida por uma ou mais divisões de um zigoto ou um oócito ativado com um núcleo artificialmente reprogramado. Uma “mórula” é o embrião pré-implantação 3-4 dias após a fertilização, quando é uma massa sólida, geralmente composta de 1232 células (blastômeros). Um “blastocisto” refere-se a um embrião pré-implantação em mamíferos placentários (aproximadamente 3 dias após a fertilização no camundongo, aproximadamente 5 dias após a fertilização em humanos) de aproximadamente 30-150 células. O estágio de blastocisto segue o estágio de mórula, e pode ser distinguido por sua morfologia única. O blastocisto é geralmente uma esfera formada por uma camada de células (o trofectoderma), uma cavidade cheia de fluido (o blastocelo ou cavidade de blastocisto), e um aglomerado de células no interior (o ICM).
[0100]“Transferência nuclear” refere-se à inserção de um núcleo do corpo polar de doador em uma célula hospedeira do receptor enucleada.
[0101 ]A menos que seja explicado de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que o comumente entendido por um versado na técnica ao qual esta descrição pertence. Os termos singulares “um”, “uma” e “o”, ‘a” incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra “ou” deve incluir “e”, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Entende-se ainda que todos os tamanhos de base ou tamanhos de aminoácidos, e todos os pesos moleculares ou valores de massa
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21/55 molecular, dados para ácidos nucleicos ou polipeptídeos são aproximados, e são fornecidos para descrição. As quantidades que são “aproximadamente” um determinado intervalo ou valor numérico incluem o intervalo ou valor numérico exato. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou teste desta descrição, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. O termo “compreende” significa “inclui”. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência em sua totalidade. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo explicações de termos, controlará. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não são destinados a ser limitantes.
[0102]O desenvolvimento de oócitos haploides normais e competentes depende de duas divisões consecutivas de células meióticas na ausência de uma fase S de replicação de DNA intermediária (Petronczki e outros, 2003). Em mamíferos, as células germinativas primordiais formam oócitos primários que sofrem recombinação cromossômica durante o desenvolvimento fetal e então param na prófase da meiose I. A meiose é retomada, por sua vez, em oócitos primários selecionados após a puberdade, durante ciclos menstruais periódicos, levando à conclusão da primeira divisão meiótica, abstração de PB1 e formação de um oócito secundário que fica preso novamente na metáfase da meiose II. Mil recomeça após a ovulação, durante a fertilização, resultando na segregação do segundo corpo polar (PB2) e na formação de um genoma de oócito haploide (Clift D e Schuh M, Mol Cell Biol 14, 549 a 562 (2013); incorporado aqui por referência). As contribuições de DNA haploide do esperma e óvulo se misturam durante a preparação para a primeira divisão mitótica e conclusão da fertilização.
[0103]Núcleos interfásicos de fibroblastos da pele transplantados em oócitos Mil humanos enucleados (citoplastos) sofrem remodelação rápida e reprogramação do ciclo celular resultando na formação de fusos presos a Mil tipo oócito (Ma H e
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22/55 outros, Nature 511, 177 a 183 (2014); Tachibana M e outros, Cell 153, 1228 a 1238 (2013), os quais são aqui incorporados por referência). A atividade meiótica residual em citoplastos capazes de formar fusos Mil de novo é crucial para a reprogramação e subsequente desenvolvimento embrionário após transferência nuclear de células somáticas (SCNT). Como o principal objetivo do SCNT humano é produzir ESCs autólogos, os oócitos SCNT presos em Mil não são fertilizados com esperma, mas ativados artificialmente para sair da prisão meiótica, enquanto a segregação dos cromossomos durante a segunda divisão meiótica é suprimida para preservar o genoma da célula somática diploide. O potencial de reprogramação do citoplasma do oócito meiótico, como demonstrado por SCNT, sugeriu a possibilidade de produzir oócitos haploides com genomas de doadores no contexto de um tratamento para infertilidade. Estudos anteriores em camundongos demonstraram que ambos os genomas PB1 e PB2 podem ser reconstituídos por transferência para Mil compatível ou citoplasma zigótico e contribuem para o desenvolvimento de descendentes viáveis (Wakayama T e outros., J Reprod Fértil 110, 263 a 266 (1997); Wakayama T e Yanagimachi R, Biol of Reproduction 59, 100 a 104 (1998); incorporados aqui como referência). No entanto, estes estudos em murinos não foram traduzidos para outras espécies, incluindo primatas e humanos. É aqui descrita a geração de oócitos humanos haploides após a transferência de genomas PB1 para oócitos Mil enucleados e a indução de meiose II de novo após fertilização com esperma (Figura 1 A). O desenvolvimento pré-implantação de oócitos PBNT para blastocistos e ESCs também foi estudado e suas propriedades genéticas e epigenéticas determinadas.
[0104]Estudos anteriores com camundongos demonstraram que ambos os genomas do corpo polar mantêm o potencial de participar no desenvolvimento normal ou formar ESCs se reintroduzidos no correspondente oócito ou citoplasma zigótico (Wakayama S e outros, Stem Cells 25, 986 a 993 (2007) e Wang T e outros, Cell 157, 1591 a 1604 (2014), ambos aqui incorporados por referência). É aqui descrita a
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23/55 tradução destas descobertas em camundongos e a demonstração de que o PBNT pode resgatar o material genético de genomas de PB1 humanos descartados pelo desenvolvimento. A atividade meiótica residual em oócitos Mil enucleados é suficiente para induzir a formação de fusos similares a Mil funcionais de novo que resultam em oócito haploide após a fertilização. Usando imagens de birrefringência não invasivas, verificou-se que a maioria dos oócitos PBNT (67%) formou fusos visíveis dentro de 60 min de fusão. No entanto, uma análise mais detalhada da morfologia do fuso em oócitos revelou que alguns fusos meióticos estavam em prófase ou anáfase, sugerindo conteúdo nuclear comprometido em PB1. Além disso, aproximadamente metade dos zigotos PBNT normalmente fertilizados param antes de atingir o estágio de blastocisto, sugerindo que os esforços para otimizar os protocolos no momento da coleta de oócitos para isolar PBs viáveis são apropriados.
[0105]A aneuploidia em embriões IVF é relativamente comum (Alfarawati S e outros, Fértil Steril 95, 520 a 524 (2011) e Angell RR e outros, Nature 303, 336 a 338 (1983); aqui incorporados por referência) e, como mostrado aqui, também ocorre em blastocistos PBNT. As taxas de aneuploidia em embriões humanos aumentam com a idade materna como um resultado de erros de meiose I ou II (Hassold T e Hunt P, Nat Rev Genet 2, 280 a 291 (2001); Nagaoka SI e outros, Nat Rev Genet 13, 493 a 504). (2012), Petronczki M e outros, Cell 112, 423 a 440 (2003), incorporados aqui por referência). Além disso, podem ocorrer erros mitóticos durante as divisões pósclivagem zigótica, produzindo blastômeros em mosaico contendo múltiplos cariótipos distintos dentro de um embrião pré-implantação (McCoy RC e outros., PLoS Genetics 11, e1005601 (2015); incorporado por referência aqui). Embora seja improvável que o PBNT corrija erros de meiose I, o citoplasma funcional de doadores jovens pode reduzir a incidência de aneuploidia resultante de meiose II ou erros mitóticos. As taxas de aneuploidia em blastocistos PBNT fertilizados normalmente no presente estudo foram similares aos controles baseados em análises de STR e Arranjo-CGH. É
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24/55 provável que outras otimizações dos protocolos PBNT reduzam as taxas de aneuploidia. No entanto, a implementação da triagem genética pré-implantação (PGS) é crucial antes das aplicações clínicas dos oócitos PBNT.
[0106]Devido à tendência atual de atraso na procriação no mundo ocidental, a infertilidade relacionada à idade com concomitantes decréscimos na reserva ovariana é comum (Bellieni CV, World J Clin Pediatr 1, 34 a 36 (2012); aqui incorporada por referência). É aqui descrito que a geração de oócitos adicionais resgatando PB1 aumentaria o rendimento de blastocistos relacionados ao paciente disponíveis para transferência a partir de um único ciclo de estimulação. Isto implica que a utilização de PBNT pode melhorar significativamente os resultados de ART e as taxas de gravidez, particularmente para as mulheres de idade avançada com diminuição da reserva ovariana. No entanto, esta terapia é baseada na disponibilidade de PB1 do paciente e, portanto, não é aplicável para mulheres que não podem produzir oócitos maduros (Bilgin EM e Kovanci E, Curr Opin Obst Gynecol 27, 167 a 174 (2015); Grynberg M e outros, Fértil Steril 105, 13 a 19 (2016), ambos aqui incorporados por referência). Além disso, a tecnologia PBNT será limitada a países, tais como os Estados Unidos, onde os programas de fertilização in vitro podem coordenar os ciclos de doação de oócitos com a compensação dos doadores. A biópsia do corpo polar é uma técnica estabelecida em IVF e sua remoção de oócitos do paciente não afeta a fertilização e o desenvolvimento subsequente do embrião (Cimadomo D e outros., Biomed Res Int 2016, 7193075 (2016). Uma vez que PBNT conta com oócitos de doadores, essa estratégia permite a complementação de genomas PB de mulheres mais velhas com citoplasto de doadores jovens.
[0107]O uso expandido de PBNT, além da transferência do fuso (ST), podería fornecer uma técnica adicional para apoiar a terapia de reposição mitocondrial (MRT); uma abordagem promissora para evitar a transmissão materna de doença baseada em mtDNA (Tachibana M e outros, Nature 493, 627 a 631 (2013) e Tachibana M e
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25/55 outros, Nature 461,367 a 372 (2009); ambos são aqui incorporados por referência). Em camundongos, foi demonstrado que um transporte mínimo de mtDNA pode ser conseguido em descendentes gerados por transferência de corpo polar (Wang T e outros, Cell 157, 1591 a 1604 (2014) e Yamada M e outros, Cell Stem Cell 18, 749 a 754 (2016), ambos aqui incorporados por referência). São aqui descritos dados que sugerem que, em conjunto com ST, o PBNT podería aumentar potencialmente o número de oócitos MRT reconstruídos para famílias com defeitos baseados em mtDNA. Similar a outras tecnologias MRT, o PBNT terá que atender às exigências de segurança e eficácia das agências reguladoras antes da aprovação de aplicações clínicas de rotina (Wolf DP e outros, Trends Mol Med 21,68 a 76 (2015); incorporado por referência aqui). Além disso, o PBNT fornece uma ferramenta para estudar mecanismos básicos da biologia do desenvolvimento relacionados à meiose feminina e expande a compreensão da estabilidade genética em oócitos.
EXEMPLOS [0108] Os exemplos a seguir são apenas para ilustração. Face a esta descrição, os versados na técnica reconhecerão que as variações destes exemplos e outros exemplos da invenção descrita são possíveis sem experimentação desnecessária.
[0109]Exemplo 1 - Formação de novo de Fusos Mil a partir dos Genomas de PB1 [0110]Foi determinado primeiro se a atividade meiótica residual em oócitos Mil humanos enucleados é suficiente para induzir a formação de fusos similares a Mil morfologicamente normais a partir do genoma de PB1, carregando um complemento genético de cromossomos Mil (Hou Y e outros, Cell 155, 1492 a 1506 (2013), incorporado aqui por referência). Para este fim, oócitos frescos Mil doados por e recuperados a partir de 11 voluntários saudáveis (25 a 31 anos) foram utilizados após protocolos de estimulação ovariana controlada (COS) e aspirações foliculares
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26/55 transvaginais.
[0111 ]Utilizando imunoquimica com anticorpos contra a e β tubulinas e 4’,6diamidino-2-fenilindol (DAPI) para coloração de DNA, foi determinado que PB1s intactos em oócitos Mil humanos maduros não contêm fusos metafásicos detectáveis, possivelmente devido a um declínio rápido nos fatores meióticos após a abstrição (Figura 1B). Os oócitos PBNT reconstruídos foram produzidos por fusão de PB1 intacto redondo com citoplastos Mil (Figuras 1A e 1C). A imagiologia não invasiva indicou que a maioria dos oócitos PBNT (67%) formou fusos visíveis dentro de 60 minutos de fusão (Figura 1 D). A marcação com anticorpos para α e β tubulinas e DAPI demonstrou que todos os oócitos PBNT (n = 5) continham complexos fusocromossômicos. No entanto, apenas 2 oócitos experimentais formaram fusos metafásicos similares aos oócitos Mil intactos. Os fusos PBNT restantes estavam na prófase (n = 2) ou na anáfase (n = 1) (Figura 1B) provavelmente refletindo o conteúdo nuclear comprometido.
[0112]Exemplo 2 - Retomada e conclusão da meiose II em oócitos PBNT após fertilização com esperma [0113]Quando a funcionalidade dos fusos meióticos em oócitos PBNT reconstruídos foi examinada após a fertilização, por injeção de esperma intracitoplasmática (ICSI), a conclusão da meiose II foi evidenciada pela abstrição de PB2 e formação de pronúcleos. A maioria dos oócitos PBNT sobreviveu à ICSI (97%; 31/32) e formou pronúcleos visíveis (81%; 25/31) em taxas similares aos controles intactos não manipulados (Tabela 1). A maioria dos zigotos PBNT fertilizados (76%; 19/25) continha 2 pronúcleos (PN) e um segundo corpo polar (PB2) indicativo de conclusão normal da meiose II (Figura 1E). Os zigotos restantes continham números irregulares de pronúcleos (1 ou 3) ou não conseguiram extrudar PB2 (Figura 1E; Tabela 1). Estes resultados foram ligeiramente inferiores aos do controle (Tabela 1) indicativos de que a maioria dos oócitos PBNT formou fusos funcionais capazes de
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27/55 recapitular a meiose II após a fertilização.
Tabela 1
| Conclusão da Meiose II em Oócitos PBNT e oócitos Mil de controle intactos após a fertilização | |||||||
| Grupo | No. de oócitos | Sobrevida após ICSI (%) | Taxa de fertilização | Conclusão da meiose II normal | Conclusão da meiose II anormal | ||
| 3 PN (%) | 1 PN (%) | 2 PN/OPB (%) | |||||
| PBNT | 32 | 31 /32 (97 ± 1) | 25/31 (81 ±8) | 19/25 (76 ± 10) | 2 / 25 (8 ± 10) | 2 / 25 (8 ±5) | 2 / 25 (8 ± 7) |
| Controle | 21 | 20/21 (95 ±6) | 17/20 (85 ±8) | 16/17(94± 4) | 0/17(0) | 1 / 17 (6 ±4) | 0/17 (0) |
[0114]Exemplo 3 - Desenvolvimento pré-implantação e ploidiade blastocistos
PBNT [0115]Para examinar a competência do desenvolvimento, os zigotos PBNT normalmente fertilizados e controles foram cultivados até o estágio de blastocisto. Similar aos controles, 95% (18 / 19) dos zigotos PBNT clivaram, 74% (14 / 19) alcançaram d8 células e 68% (13/19) formaram embriões em estágio de morula compactos (Tabela 2). No grupo de controle, 75% (12/16) dos zigotos atingiram blastocistos, enquanto apenas 42% (8 /19) dos zigotos PBNT o fizeram (teste t de Student, p < 0,05, Figura 1F, 1G e Tabela 2). Como a aneuploidia embrionária resultante de anormalidades cromossômicas numéricas levando à falha na implantação ou perda espontânea da gestação é comum, independente da morfologia do blastocisto, blastocistos PBNT (n = 2) e de controle (n = 3) foram submetidos à análise de repetições curtas em tandem (STR). O exame dos marcadores microssatélites mapeados para 22 lóci autossômicos humanos e um locus ligado ao cromossomo X revelou que dois blastocistos PBNT amostrados continham cromossomos diploides normais que contribuíam tanto a partir do oócito quanto do esperma. Esses resultados minimizaram a possibilidade de erros na segregação cromossômica meiótica do oócito. Três blastocistos PBNT adicionais foram submetidos à biópsia de trofectoderma e realizaram a análise de hibridização genômica comparativa de arranjo (Arranjo-CGH) e determinaram que dois eram normais, mas um blastocisto era aneuploide (perda de 17). Este resultado foi
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28/55 comparável aos controles com um blastocisto aneuploide de três testados (perda de
21).
Tabela 2
| Desenvolvimento pré-implantação de zigotos PBNT e de controle | |||||
| Grupo | No. de oócitos com conclusão de meiose II normal | 2 células (%) | 8 células (%) | Mórula compacta (%) | Blastocisto (%) |
| PBNT | 19 | 18/19 (95 ± 2) | 14/19 (74 ± 17) | 13/19(68± 18) | 8/19 (42 ± 9)a |
| Controle | 16 | 16/16(100) | 15/16(96± 4) | 14/16 (88 ± 5) | 12/16(75± 10)b |
a’b Diferentes sobrescritos dentro de uma coluna indicam diferenças significativas (P <0,05).
[0116]Exemplo 4 - Integridade genética em ESCs derivados de embriões PBNT [0117]Em um esforço para definir melhor a potencial utilidade clínica de oócitos PBNT haploides reconstruídos, uma linhagem ESC foi derivada de cinco blastocistos PBNT. A linhagem foi designada PBNT1 (Figura 1F). Outras quatro linhagens ESC foram desenvolvidas a partir de nove blastocistos de controle. Isso incluiu o hESO-14, que era um irmão geneticamente relacionado de PBNT 1, derivado dos mesmos doadores de óvulos e esperma. A menor eficiência de derivação ESC (20%, 1/5) dos embriões PBNT em comparação com os controles (44%, 4/9) pode indicar má qualidade dos blastocistos PBNT, mas o número total foi baixo para conclusões definitivas. Uma linhagem ESC (PBNT2) foi derivada de dois blastocistos desenvolvidos a partir de zigotos PBNT anormais (3PN). A banda G citogenética revelou que ο PBNT1 e três dos quatro ESCs de controle exibiam cariótipos diploides normais, sem evidência de anormalidades cromossômicas numéricas ou estruturais detectáveis (Figura 2A). O hESO-15 de controle restante era aneuploide com a monossomia do cromossomo 21 (Figura 2A). Além disso, a análise STR de PBNT1 e hESO-14 confirmou sua relação normal de ploidia e irmãos (Tabela 3). Como
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29/55 esperado, ο PBNT2 exibiu um cariótipo triploide 66-69, XXX (Figura 2A). A impressão digital do DNA por STR corroborou a presença de três alelos para os cromossomos 2, 6, 13, 18 e 22 e quatro alelos no cromossomo 12 nesta linhagem celular (Tabela 3). Com base na análise de herança alélica, o cariótipo triploide foi causado por falha na conclusão da meiose II com retenção de material genético de PB2. Isto foi consistente com a observação de 3 pronúcleos e falha em segregar um segundo corpo polar após a fertilização nestes zigotos. Além disso, o esperma também contribuiu com um segundo alelo para a tetraploidia de cromossomo 12. Tanto a linhagem PBNT1 quanto a linhagem hESO-14 de controle mantiveram a morfologia de ESC típica e formaram tumores de teratoma contendo células e tecidos de todas as três camadas germinativas (Figuras 5A e 6B).
Tabela 3 [0118]Análise Paternidade de PBNT1, PBNT2 e hESO-14 determinado por Ensaio de Repetições Curtas em Tandem (STR)
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30/55
| Loci STH, | ÍW1 | hgS044 | Doador 1 de oócitos | Doador 4 de esperma | Doador 2 de oócitos | Doador 2 de esperma | |
| Ssx | f | F | :F | 84 | 9 | F | 65 |
| XX | XX | XX | X¥ | XXX | XX | X¥ | |
| 362/Ϊ76 | 152/174 | 182/Ϊ® | iw.m | iWi® | 352/112 | ||
| G2S1.33? | ww | 259/317 | 2«/«? | »!« | 23%m/3as | 233/203 | 3ÜS/3ÓS |
| 52/163 | 392/2« | 2W369 | 192/192 | iWm | 146/369 | ||
| 113523.55 | W3® | MíS§ | Wit» | iwm | WWÍ | 2W3CS3 | 2S6/ãS« |
| MSttá | 323/161 | 333/3« | Í21/1&1 | 123/223 | liWs | 3.23/323 | |
| EXS14S7 | 123/123 | 3:83/165 | 161/123 | 185/3« | 113/223 | 3.23/123 | 11W3 |
| WW | 227/2« | «7/1« | W/2S1 | 323/335 | Í27/Í3.S/2S7 | 232/333 | 232/2 Si |
| Ml» | 172/112 | WW | IW/WÂ ? 3 | lSS/172 | 3S4/322 | ||
| 013S2002 | 254/2 94 | 254/2« | 2W254 | 2W26Í | 3W3S4 | 234/234 | |
| BIIS92S | »&88 | 392/3« | W&88 | 39//299 | 262/36S | 395/383 | 2S3/2S2 |
| BS2S3M | 3S4/2-SS | 204/286 | 27S/2-SS | W2/S | 273/212/374 | 230/2/2 | 3W214 |
| 1/32S6.X | 3W366 | 248/26S | 248/264 | 253/2SS | 256/304 | ||
| Wl« | 186/1« | W2« | 1WWW | W206 | 366/152 | ||
| :4//543 | 133714s | :44/541 | 137/143 | 145/145 | 135/W | ||
| O1751380 | 201/265 | 285/165 | W-/M1 | 26S/2S9 | 332/2» | 257/265 | |
| EWS37 | 204/2« | 209/2« | tmsw | 3.2S/2&S | 2W2« | ||
| WS72 | 361/365 | WS8? | 363/3» | 38S/362 | 361/395 | WS» | 301./38S |
| D22S665 | Ml® | w» | 164/169 | 1W1W1« | Wm | iwm | |
| 03025/16 | >73/232 | 373/133 | 232/2« | 276 | 1W1« | Ww | 162' |
| MKY122 | 1W1CS | W2« | 184/186 | 194/193 | iWi» | 1«/132 | 3.06/163 |
Somente amostras masculinas mostram uma marca de DXS2506 no cromossomo
X.
[0119]Para avaliar se o PBNT introduziu alterações subcromossômicas indetectáveis por bandas G, mapas físicos genômicos de alta resolução ao longo do genoma das linhagens PBNT1 e hESO-14, bem como o DNA de doador de óvulo e de doador de esperma foram gerados. A plataforma BioNano Genomics Irys (Mak AC
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31/55 e outros, Cell Stem Cell 5, 11 a 14 (2016); aqui incorporada por referência) permite a detecção de variações estruturais (SVs) incluindo inserções, deleções e inversões em resolução de 1 kb. Quando comparado ao genoma de doador de óvulo, 372 SVs foram identificados em PBNT1 e 380 SVs em hESO-14, dos quais 157 foram compartilhados entre estas linhagens de células irmãs (Figura 2B). Em comparação com o genoma do doador de esperma, 268 SVs foram detectados em PBNT1 e 265 SVs em hESO14 com 124 SVs comuns (Figura 2C). Além disso, números comparáveis de SVs únicos foram identificados em PBNT1 (281) e hESO-14 (297) (Figura 2D). Nenhum gene foi encontrado dentro ou perto de SVs que foram diferencialmente expressos entre PBNT1 e hESO-14.
[0120]Exemplo 5 - Assinaturas epigenéticas e transcricionais de PBNT ESCs [0121 ]A metilação do DNA envolvendo a transferência covalente de um grupo metila para o quinto átomo de carbono do anel citosina um importante mecanismo epigenético que define a identidade celular (Smith ZD e Meissner A, Nat Rev Genet 14, 204 a 220 (2013); incorporado aqui por referência. Este processo sofre mudanças dinâmicas durante e após a fertilização, refletindo a reprogramação do desenvolvimento (Canovas S e Ross PJ, Theriogenology 86, 69 a 79 (2016); incorporado aqui como referência). Além disso, o estabelecimento de ESCs estáveis está associado a grandes mudanças nos perfis de metilação, conforme o genoma se reconfigura para o estado pluripotente (Lister R e outros, Nature 462, 315 a 322 (2009); Lister R e outros, Nature 471, 68 a 73 (2011), ambos aqui incorporados por referência). Para avaliar a normalidade destas alterações, foram realizadas análises de metilação de DNA ao longo do genoma das linhagens de células PBNT1 e hESO14 utilizando MethylC-seq de resolução base de alta cobertura (Lister 2009 acima). Ambas as linhagens apresentaram níveis similares de metilação CG, uma diferença de apenas 0,7% entre PBNT1 (86,1%) e hESO-14 (85,4%) e metilação não-CG, uma diferença de apenas 0,4% entre PBNT1 (1,3%) e hESO-14 (0,9%) (Figura 3A e 3B).
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Comparações entre pares dessas duas amostras identificaram apenas 116 regiões diferencialmente metiladas CG (DMRs) e 4 mega DMRs não-CG abrangendo aproximadamente 500kb (He Y e Ecker JR, Ann Rev Genom Hum Genet 16, 55 a 77 (2015); incorporado por referência aqui) (Figura 3C; Tabela S5, FDR < 0,01). A inspeção visual implicou a conformação dessas DMRs (Figura 3D e 3E), mas não houve enriquecimento em termos de ontologia genética (GO), características genéticas (Figura 3C) ou correlação com o perfil transcricional. Estes resultados sugerem que o perfil global de metilação do PBNT1 experimental foi muito similar ao hESO-14 de controle.
[0122]Finalmente, os padrões globais de expressão gênica foram examinados nas linhagens PBNT1 e hESO-14. Sequenciamento profundo (50M leituras) por RNAseq foi realizado em triplicados para cada uma das duas linhagens. A análise da expressão diferencial foi realizada usando o pacote edgeR (Robinson MD e Smyth GK, Biostatistics 9, 321 a 332 (2008); incorporado aqui por referência) e mostrou que apenas 1,25% dos genes examinados (186 de 14.876) foram expressos diferencialmente entre PBNT1 e hESO-14 (Figuras 4A e 4B, FDR < 0,05). Usando a análise de Ontologia Genética (GO), vários termos GO foram alocados. No entanto, não foram identificadas categorias funcionais estatisticamente enriquecidas para os genes diferencialmente expressos. Estes dados indicaram que os padrões globais de expressão gênica de células PBNT1 se assemelham aos das células hESO-14 de controle.
[0123]Assim, dentro dos limites dessas análises, o genoma de PB1 interage com o citoplasma dos oócitos estabelecendo características epigenéticas e transcriptomais que emulam o estado pluripotente.
[0124]Exemplo 6 - Doação de Gametas [0125] Doadores de oócitos de 25 a 31 anos de idade foram recrutados através da OHSU Women’s Health Research Unit. Dois doadores saudáveis de esperma
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33/55 também foram recrutados. Os participantes elegíveis participaram de uma sessão de informações descrevendo as metas do estudo e os procedimentos relacionados. Consentimento informado por escrito foi obtido a partir de todos os doadores de gametas afirmando que os oócitos serão fertilizados para criar embriões para fins de pesquisa e não serão usados para fins reprodutivos, mas serão estudados in vitro, incluindo a geração de células-tronco embrionárias.
[0126]Exemplo 7 - Métodos [0127]Para produzir citoplasto Mil de receptor, os oócitos foram colocados em uma gotícula de manipulação de 50 μΙ de fluido tubário humano com meio HEPES a 10% contendo 5 pg / ml de citocalasina B (HTF com HEPES 10% CB) em um prato de fundo de vidro. A gotícula foi coberta com óleo de cultura de tecidos e os oócitos foram mantidos a 37° C durante 10 min antes da enucleação. O prato foi montado no estágio de um microscópio invertido (Olympus 1X71) equipado com um aquecedor de estágio (http://www.tokaihit.com), micromanipuladores Narishige, Oosight Imaging System (http://wwwcri-inc.com), e objetiva a laser (http://www.hamiltonthome.com) (sítios da rede e conteúdo incorporados aqui por referência). Um oócito foi posicionado usando uma pipeta de retenção de modo que o fuso estivesse situado em uma posição de aproximadamente 2 a 4 horas. A zona pelúcida próxima ao fuso foi perfurada a laser e, em seguida, uma pipeta de enucleação foi introduzida através da fenda. O fuso foi extraído por aspiração para a pipeta com uma quantidade mínima de citoplasma e membrana plasmática circundante e descartado.
[0128]Para o isolamento do corpo polar, um oócito foi posicionado com o primeiro corpo polar (PB1) às 2 horas, e a zona pelúcida foi perfurada antes de uma pipeta de transferência ser introduzida e ο PB1 aspirado. Ο PB1 foi então transferido brevemente para uma gota contendo extrato de HVJ-E (Ishihara Sangyo Kaisha) diluído 1:3 com HTF com HEPES 10% CB, transferido e enxaguado em HTF com HEPES 10% CB, e colocado no espaço perivitelino do citoplasto do receptor. Os pares
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34/55 foram lavados em HTF com HEPES a 10%, transferidos para meio Global 10%, e incubados a 37° C em CO2 a 6% durante 60 minutos para permitir a fusão. A fusão foi confirmada 30 a 60 min após a transferência nuclear e os oócitos PBNT foram fertilizados após uma cultura adicional de 50 min usando injeção intracitoplasmática de esperma (ICSI) usando esperma fresco de doador. Os oócitos fertilizados foram então cultivados em meio Global 10% 37° C em 6% de CO2, 5% de O2 e 89% de N2. A fertilização foi determinada 16 horas após ICSI, observando-se a formação de pronúcleos e a extrusão do corpo polar. Oócitos Mil intactos não manipulados serviram como controles que foram fertilizados e cultivados de forma similar ao grupo PBNT.
[0129]Os seguintes exemplos também ajudam a demonstrar exemplos dentro do presente escopo em relação aos oócitos preparados para superar problemas com a pobre genômica mitocondrial.
[0130]Exemplo 8 - Critérios de Inclusão e Exclusão [0131]Uma vez que a doença mitocondrial pode ser atribuída a mutações do genoma no mtDNA e/ou DNA nuclear (Wallace DC, J Clin Invest 123, 1405 a 1412 (2013); incorporado como referência), um desafio clínico importante é confirmar mutações patogênicas de mtDNA em famílias elegíveis para MRT. Cinco famílias quatro com diagnóstico de síndrome de Leigh (LS) e uma com MELAS - foram recrutadas e testes genéticos realizados para confirmar mutações de mtDNA herdadas da mãe. O DNA foi coletado a partir do sangue, fibroblastos da pele (SF) e/ou urina de crianças e mães, e 0 sequenciamento completo do mtDNA foi realizado. A primeira família LS teve uma criança afetada de 2 anos de idade com uma substituição T8993G homoplásmica tanto no sangue quanto em amostras SF enquanto sua mãe de 22 anos teve a mesma mutação com 70% de heteroplasmia no sangue e 100% em SF (Figura 6A , esquerda).
[0132]Na segunda família LS relacionada, uma criança afetada de 2,5 anos portava a mesma mutação T8993G em 95% heteroplasmática no sangue e 100% em
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SF enquanto em um segundo irmão assintomático de 1 ano de idade, a carga de mutação era de 50% no sangue e 62% em SF. Sua mãe de 23 anos, que era a irmã mais velha do indivíduo da primeira família, carregava essa mutação em 13% no sangue e 16% em SF (Figura 6A, direita).
[0133]Na terceira família LS, o menino afetado de 12 anos sofreu uma substituição G13513A em 56%, 86% e 97% de heteroplasmia no sangue, SF e urina, respectivamente. Seu irmão de 19 anos, assintomático, apresentava a mesma mutação nos níveis de heteroplasma de 10%, 14% e 23% no sangue, SF e urina, respectivamente. Sua mãe de 36 anos de idade também abrigava a mutação nos níveis de 3%, 98% e 39% no sangue, SF e urina, respectivamente (Figura 6B).
[0134]Uma quarta família também apresentou uma criança de 1 ano de idade com diagnóstico de LS. No entanto, a triagem genética não revelou quaisquer mutações patogênicas do mtDNA na criança ou na mãe.
[0135]A quinta família provém de um grande linhagem de MELAS bem estudada carregando uma mutação patogênica A3243G (Figura 10B) (McClelland K, 2014, https://scholarworks.csustan.edu/bitstream/handle/011235813/793/McClellandK.sum mer2014%20.pdf?Sequence=1; sítio da rede acessado pela última vez em 28 de novembro de 2016 e incorporado por referência neste documento). A mãe de 32 anos carregou a mutação em 14%, 47% e 35% no sangue, SF e urina, respectivamente. Todos os seus 3 filhos herdaram essa mutação (Figura 6C).
[0136]Esses resultados indicaram que mutações patogênicas de mtDNA transmitidas pela mãe foram implicadas em quatro das cinco famílias estudadas. O fenótipo de LS clínico na quarta família não foi associado a nenhuma mutação patogênica do mtDNA e, portanto, foi excluído de análises posteriores. Isso destaca a importância do teste genético para doenças de mtDNA herdadas pela mãe antes de MRT. Além disso, uma vez que os níveis de heteroplasmia podem variar entre os
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36/55 diferentes tecidos, é crucial amostrar e testar o sangue, a pele e a urina, tanto em mães quanto em crianças (Monnot S e outros., Hum Mutat 32, 116-125, 2011); incorporado aqui por referência).
[0137]Doadores de oócitos voluntários saudáveis foram também triados e foi confirmado que não possuíam quaisquer mutações patogênicas de mtDNA herdadas. As suas sequências de mtDNA e o correspondente haplótipo foram subsequentemente utilizados para combinações de MRT correspondentes.
[0138]Exemplo 9 - COS (estimulação ovariana controlada), recuperação de oócitos e mutações em oócitos [0139]Mulheres com doença de mtDNA exibem taxas de nascidos vivos comparáveis à população geral, portanto, aceita-se que elas tenham fertilidade normal. No entanto, a resposta ovariana à estimulação de gonadotrofinas e à recuperação de oócitos em mulheres portadoras de mutações patogênicas de mtDNA (portadores) foi avaliada.
[0140]A idade foi similar entre portadores e doadores saudáveis. Os níveis de AMH, uma medida da reserva ovariana, foram mais baixos nos portadores do que nos doadores saudáveis (1,1 vs. 4,8 ng / ml). A contagem de folículos antrais (AFC) também foi menor nos portadores em comparação com os doadores saudáveis (10,3 vs. 22,3). Além disso, a duração da COS foi de aproximadamente um dia a mais nos portadores e o nível de pico de estradiol no sangue (E2) antes da administração de hCG também foi menor. Finalmente, o número total e o número de oócitos Mil maduros recuperados também foram significativamente menores nos portadores (5,8 vs. 16,6 e 3,8 vs. 13,2, respectivamente) (Figuras 11 A, 11B, 11C, 11 D, 11E, 11F e 11G). Nota-se que um portador (cED2) exibiu luteinização prematura, evidenciada pelo aumento dos níveis de progesterona antes do surto de LH (Figura 11H). Portanto, as análises de mutação foram realizadas apenas em oócitos atrésicos recuperados.
[0141 ]Embora os números na coorte tenham sido baixos (Smeets HJ e outros,
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Ann NY Acad Sci 1350, 29 a 36 (2015); aqui incorporado por referência), os resultados sugerem que a mutação do mtDNA podería levar à redução da resposta ovariana. A idade avançada e o IMC mais elevado nos portadores também poderíam ter afetado o resultado (Kelsey TW e outros, PLoS One 6, e22024 (2011) e Kelsey TW e outros, Mol Hum Reprod 18, 79 a 87 (2012); ambos são aqui incorporados por referência). Outro potencial fator contribuinte é a contracepção hormonal a longo prazo em que essas mulheres estavam antes da estimulação ovariana.
[0142]Mutações de MtDNA foram então identificadas em oócitos individuais dos portadores. Após a remoção do fuso Mil (genoma nuclear), os citoplastos (mtDNA) foram utilizados para o sequenciamento. No primeiro portador, dois oócitos recuperados continham a mutação T8993G nos níveis de 86% e 96%. No segundo portador irmão, os níveis de heteroplasmia em 5 oócitos atrésicos variaram de 72% a 100%. Em 4 oócitos do terceiro portador de LS, os níveis de mutação G13513A em 3 óvulos foram muito baixos (0,6 a 3%), enquanto no quarto foi de 40%. Finalmente, em nove oócitos do portador A3243G de MELAS, a mutação não foi detectada em um óvulo, enquanto o restante continha 9 a 52% (Figura 7A). Na busca de um método para prever os níveis de mutação de oócitos, os níveis médios de heteroplasmia no sangue de crianças irmãs altamente foram correlacionados com os níveis de oócitos (Brown DT e outros, Am J Hum Genet 68, 533 a 536 (2001); incorporado aqui por referência) (R2 = 0,52 vs. 0,85, Figura 7B).
[0143]Em seguida, sequências de mtDNA integrais foram analisadas em oócitos portadores em um esforço para rastrear mutações secundárias de mtDNA. Comparações foram feitas com oócitos de doadores saudáveis. Os oócitos de portadores continham variantes heteroplásmicas secundárias do mtDNA, no entanto, o número médio por oócito não foi significativamente diferente dos controles saudáveis (2,2 vs. 1,3; p > 0,05) (Figura 7C). Algumas destas variantes estavam presentes em vários oócitos do mesmo portador e também foram encontradas no
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38/55 sangue, pele ou em crianças irmãs sugerindo mutações na linhagem germinativa recorrentes. No entanto, essas variantes foram mutações D-loop não codificantes. Outras foram encontradas apenas em um oócito dentro do grupo indicativo de mutações de novo (45%). A maioria (83%) dessas variantes secundárias eram mutações heteroplásmicas de baixo nível (< 15%) (Figura 111). O número de cópias de MtDNA por oócito foi usado como uma medida indireta da qualidade do oócito (Monot S e outros, Hum Mol Genet 22, 1867 a 1872 (2013) e Fragouli E e outros, PLoS Genet 11, e1005241 (2015); incorporados aqui por referência). Não foram observadas diferenças significativas entre oócitos saudáveis e portadores (média de 348.954 vs. 283.605, respectivamente) (Figura 7D). Um número baixo de cópias de mtDNA pode desempenhar um papel na redução da reserva ovariana (Boucret e outros, Hum Reprod 30, 1653 a 1664 (2015); aqui incorporada por referência), mas nenhuma correlação entre o número de cópias de oócitos e os níveis de AMH foi observada aqui (Figura 11J).
[0144]Em conclusão, os oócitos de portadores foram de qualidade normal e os níveis de mutações no sangue de crianças irmãs parecem ser de valor preditivo para a mutação em coortes de oócitos.
[0145]Exemplo 10 - Transferência de fuso (ST) em oócitos de portadores de mutação de mtDNA [0146]Fusos meióticos (carioplastos; com mtDNA materno de transporte) recuperados a partir de oócitos de portador de Mil (n = 13) foram transferidos para oócitos de doadores enucleados (citoplastos; mtDNA do doador) (Figura 8A) enquanto controles envolveram ST entre oócitos saudáveis (n = 36) com haplótipos de mtDNA pré-selecionados (Figura 12A). Todos os carioplastos e citoplastos sobreviveram às micromanipulações e fusão, com exceção de um no grupo controle. Oócitos ST, juntamente com controles intactos (não manipulados), foram então fertilizados por injeção intracitoplasmática de esperma (ICSI) e cultivados em blastocistos. Altas taxas
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39/55 de fertilização, comparáveis aos controles intactos, foram observadas em ambos os grupos ST (Figura 8A e Figuras 12B e 12C). O desenvolvimento subsequente de zigotos ST portadores diploides para o estágio de blastocisto foi de 75%, similar aos controles. Um padrão similar de desenvolvimento foi observado entre portadores de ST com diferentes tipos de mutação (8993ST, 13513ST e 3243ST) (Figura 8B).
[0147]Para abordar a assincronia de COS, idealmente, tanto os doadores portadores quanto os doadores saudáveis seriam submetidos a recuperações no mesmo dia com o ponto final de um número similar de oócitos maduros para ST. Uma abordagem alternativa para alcançar esses objetivos envolve congelamento, armazenamento e descongelamento de oócitos. ST entre oócitos frescos e vitrificados (ST congelado) foi conduzido. A taxa de fertilização geral usando oócitos vitrificados foi comparável à ST fresca, enquanto a formação de zigotos diploides normais foi menor (Figura 8A). Não foram observadas diferenças na fertilização entre a vitrificação do carioplasto e do citoplasto (Figura 12D).
[0148]Uma vez que o risco de falhas de comunicação entre genomas nucleares e mitocondriais levou a preocupações quanto à potencial disfunção metabólica secundária (Woodson JD & Chory J, Nat Rev Genet 9, 383 a 395 (2008); aqui incorporado por referência), o desenvolvimento do embrião ST foi analisado como uma função da distância da sequência do mtDNA do doador. Os oócitos e embriões ST foram agrupados com base no número de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) entre o mtDNA original (materno) e o mtDNA do doador de oócitos, variando do próximo (6 SNPs) ao meio (33 SNPs) e ao distante (57 SNPs) (Figura 12A). As taxas de fertilização e blastulação foram similares entre os três grupos ST, sugerindo que o desenvolvimento embrionário não é comprometido (Figura 8C). Linhagens ESC foram estabelecidas a partir de blastocistos ST e diferenciadas em cardiomiócitos de células progenitoras neurais (NPCs) e teratomas. Foram observadas eficiências de diferenciação comparáveis entre a atividade enzimática da
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40/55 cadeia respiratória mitocondrial (RC) e as taxas de consumo de oxigênio (OCR) entre os derivados ESC contendo 6 ou 49 diferenças de SNP (Figuras 8D, 13A, 13B, 16A e 16B). Curiosamente, as células diferenciadas de uma linhagem ST-ESC com 33 diferenças de SNP mostraram níveis de OCR significativamente reduzidos, aludindo possível incompatibilidade nuclear a mitocondrial.
[0149]Em resumo, o MRT em oócitos portadores por ST resultou em alta fertilização e desenvolvimento de blastocistos similar aos controles. Além disso, o desenvolvimento embrionário, a derivação e a diferenciação de ESC não foram afetados pelo background genético do mtDNA do doador. No entanto, é possível que determinado mtDNA de doador possa não funcionar adequadamente, um processo que foi independente das diferenças totais de SNP.
[0150]Exemplo 11 - Anormalidades do Genoma Nuclear [0151]Como os embriões ST podem estar em risco de anormalidades cromossômicas ou subcromossômicas, os blastocistos expandidos derivados de embriões ST e de controle foram biopsiados e examinados por arranjo CGH (hibridização comparativa do genoma). Uma taxa de aneuploidia ligeiramente maior foi observada em ambos os grupos ST em relação aos controles intactos, mas a diferença não foi significativa. Isso pode estar relacionado à maior idade materna no grupo de portadores (Figuras 14A e 17). Em seguida, foi realizada análise cariotípica de bandas G em ST e ESCs de controle. Cariótipos anormais foram observados em todos os grupos, mas não foram encontradas diferenças significativas. Bandas G também detectaram casos de mosaicismo cromossômico e poliploidia (Figuras 14B e 18). Assim, para detectar anormalidades cromossômicas, o diagnóstico genético préimplantação pode ser realizado antes da transferência de embrião MRT.
[0152]Variações no número de cópias (CNVs) foram examinadas em linhagens de células ST-ES selecionadas para explorar possíveis anormalidades subcromossômicas (deleção ou duplicação) (Lupski JR, Trends Genet 14, 417 a 422
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41/55 (1998) e Sharp AJ e outros, Nat Genet 38, 1038 a 1042 (2006), ambos aqui incorporados por referência). CNVs de novo foram detectadas em ambos os controles, ST e intactos, mas foram consideradas de significado clínico incerto (Kearny HM e outros, Genet Med 13, 680 a 685 (2011); aqui incorporado por referência).
[0153]Em resumo, um total de 6 blastocistos ST foi produzido a partir de 4 ciclos de estimulação ovariana em portadores (Tabela 4). Um blastocisto foi aneuploide e quatro foram elegíveis para transferência com base em avaliações de qualidade morfológica. Esses resultados foram comparáveis aos controles.
[0154]Tabela 4. Resultados de MRT para famílias com mutações patogênicas de mtDNA
| Família 1 | Família 2 | Família 3 | Família 4 | Família 5 | |||||
| Doença mitocondrial | LS | LS | LS | LS | MELAS | ||||
| Mutação patogênica de mtDNA | T8993G | T8993G | G13513A | Não | A3243G | ||||
| Idade do portador (anos) | 22 | 23 | 36 | 28 | 32 | ||||
| COS | Sim | Sim | Sim | Excluído | Sim | ||||
| No. de oócitos recuperados | 3 | 5 | 4 | n/a | 11 | ||||
| No. de oócitos ST | 2 | Cancelado | 4 | n/a | 7 | ||||
| Blastocistos ST | 0 | n/a | 2 | n/a | 4 | ||||
| Grau em D6 | n/a | n/a | 5AA | 5BB | n/a | 5AA | 5AA | 5BB | 5CC |
| Aneuploidia | n/a | n/a | Sim: +9 | n/t | n/a | n/t | Não | Não | Não |
| Sexo | n/a | n/a | M | n/a | n/a | n/a | M | F | F |
| Transporte de mtDNA | n/a | n/a | < 1% | n/a | n/a | n/a | < 1% | < 1% | 1%* |
Seis embriões ST derivados de oócitos carregando mutações patogênicas de mtDNA alcançaram o estágio de blastocisto. Ao menos 2 blastocistos foram elegíveis para transferência. *, mtDNA em ESCs a partir desse blastocisto reverteu para haplótipo de mtDNA materno, mas era de ocorrência natural (não carregava mutação A3243G). n/a, não aplicável; n/t, não testado.
[0155]Exemplo 12 - Manutenção do mtDNA do doador em embriões ST e
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42/55 linhagens ESC [0156]A eficácia e a segurança de MRT dependem não somente do grau de mtDNA materno inicialmente cotransferido com o carioplasto, mas também de sua subsequente persistência e possível amplificação em embriões. Estudos recentes observaram que, devido à deriva genética, alguns MRT ESCs restauraram o mtDNA materno (Yamada M e outros, Cell Stem Cell 18, 749 a 754 (2016) e Hyslop LA e outros, Nature 534, 383 a 386 (2016); que são aqui incorporados por referência). Claramente, uma pequena quantidade de transporte de mtDNA materno é comum durante ST resultando em baixa heteroplasmia em embriões humanos e em descendentes de primatas não humanos (tipicamente abaixo de 2%) (Pauli D e outros, Nature 493, 632 a 637 (2013); incorporado aqui por referência). Aqui, todos os zigotos ST examinados e embriões clivantes (n = 22) continham > 99% do mtDNA do doador (Tabela 5) e resultados similares foram observados em 13 das 15 linhagens de células ES (87%) estabelecidas a partir de blastocistos ST controlados, independentemente do haplótipo do mtDNA do doador. No entanto, 2 linhagens ESC de embriões ST irmãos (ST-ES7 e ST-ES8), geradas pela combinação de U5a materno e mtDNA H1 b de doador (33 SNPs), apresentaram níveis elevados de mtDNA materno (81 % e 94%) (Tabela 5). A passagem prolongada resultou em uma perda completa do mtDNA do doador e retornou ao haplótipo do mtDNA materno original (100%). Curiosamente, duas outras linhagens de ESC geneticamente relacionadas (ST-ES5 e ST-ES6) derivadas da combinação recíproca de H1 b materno e U5a de doador mostraram alta manutenção do mtDNA do doador (> 99%). Outra linhagem ESC gerada a partir de U5a materno e mtDNA V3 de doador (ST-ES9; 33 SNPs) também carregou predominantemente mtDNA do doador.
[0157]Tabela 5. mtDNA do doador em embriões MRT humanos préimplantação e linhagens ESC
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Diferenças de SNPs
Tratamento
Linhagens
Estágio do emhriãsj
Embriões · çxrvv· pré^mplaataçâo : ΧΧν&Λί
Haptôtip-o Hajstétípo matem© do doador
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[0158]Dentre as três linhagens ST-ESC portadoras, 3243ST-ES1 também continha um nível significativo de mtDNA materno (20%) (Tabela 5). No entanto, este haplótipo H49 materno não incluiu a mutação A3243G. Os níveis de mtDNA materno nesta linhagem celular aumentaram gradualmente durante a cultura estendida para
90% na passagem 8 e para homoplasmia na p.10 (Figura 9A). Notavelmente, outra linhagem ESC de irmão (3243ST-ES2) gerada pela mesma combinação de mtDNA materno e de doador não mostrou nenhum aumento no mtDNA materno,
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44/55 presumivelmente devido a efeitos estocásticos ou de gargalo (Tabela 5).
[0159]O estudo foi ampliado para incluir oito linhagens ESC derivadas por SCNT (NT-ESCs) que também carregam mtDNA de oócito de doador (Tabela 5) (Tachibana M e outros, Cell 153, 1228 a 1238 (2013); Ma H e outros, Nature 524, 234 a 238 (2015), e Kang E e outros, Cell Stem Cell 18, 625ã 636 (2016); aqui incorporados por referência). A dinâmica da heteroplasmia de mtDNA foi analisada durante a passagem estendida e identificou que o NT-ES8 apresentou um aumento gradual do mtDNA materno (somático) de 19% em p. 2 para 100% em p.10 (Tabela 5, Figura 15A). Nota-se que esta linhagem NT-ESC foi gerada por combinação de haplótipos de mtDNA materno X2c e de doador D4a (39 SNPs).
[0160]Em conclusão, o ST permite a substituição eficiente do mtDNA do oócito com o mtDNA transportado muito baixo nos embriões resultantes pré-implantação. A maioria dos ESCs derivados dos blastocistos ST manteve predominantemente o mtDNA do doador. No entanto, algumas linhagens ESC apresentaram perda gradual mtDNA do doador e reversão para o mtDNA materno, exigindo mais pesquisas para compreender melhor os mecanismos subjacentes.
[0161 ]Exemplo 13 - Mecanismos moleculares e celulares que contribuem para a manutenção do mtDNA do doador [0162]Com base na observação de que combinações de haplótipos específicos levaram à reversão para o mtDNA materno, assumiu-se que isso podería ser devido à replicação preferencial de haplótipos específicos de mtDNA ou que certos mtDNAs dotavam células com vantagens de crescimento (Burgstaller JP e outros, Mol Hum Reprod 21, 11 a 22 (2015) e Agaronyan K e outros, Science 347, 548 a 551 (2015), ambos aqui incorporados por referência).
[0163]A região D-loop altamente polimórfica do mtDNA, denominada caixa de sequência II conservada (CSBII) foi focada em primeiro lugar. Foi anteriormente demonstrado que um polimorfismo raro na CSBII, ou seja, G5AG7, afeta a eficiência
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45/55 da terminação da transcrição mitocondrial e da geração de iniciadores de replicação. Quando o mtDNA do doador e o mtDNA materno foram comparados em urn total de 26 linhagens ESC com 18 diferentes combinações de haplótipos, observou-se que dois irmãos “reversos” ST-ES7 e ST-ES8 carregavam mtDNA do doador com um polimorfismo G5AG8 enquanto o mtDNA materno era G6AG8. Utilizando ensaios de transcrição in vitro, determinou-se se a síntese do iniciador de replicação pela RNA polimerase mitocondrial foi afetada no mtDNA do doador. Verificou-se que a deleção de um único resíduo de guanosina (G5AG8 vs. G6AG8) no mtDNA do doador resulta em uma redução de 4 vezes da síntese do iniciador de replicação (Figura 9a). Portanto, certos haplótipos de mtDNA variando na sequência de CSBII fornecem uma síntese mais eficiente do iniciador de replicação e, subsequentemente, podem alcançar uma vantagem replicativa. Sem estar limitado pela teoria, esse mecanismo podería explicar o fenômeno da replicação preferencial do mtDNA materno em algumas das linhagens ESC. A análise de sequências não encontrou diferenças de CSBII SNP nos restantes dois 3243ST-ES1 e NT-ES8 revertidos. Foram observados vários outros polimorfismos de D-loop, incluindo a região do núcleo TAS, que também está implicada na regulação da replicação de mtDNA (Jemt E e outros, Nucl Acids Res 43, 9262 a 9275 (2015); aqui incorporado por referência). Embora o mecanismo exato pelo qual esses polimorfismos afetam a replicação permaneça obscuro, podese especular que, similar às regiões CSBII eTAS, algumas variantes de D-loop podem resultar em viés de replicação de um haplótipo particular de mtDNA.
[0164]Também foi considerado se os mecanismos independentes de replicação adicionais afetam a reversão para o mtDNA materno e examinado o aumento do mtDNA materno em 3243ST-ES1 e NT-ES8 revertidos em culturas integrais ou clones de células individuais. Os níveis iniciais de mtDNA materno aumentaram com a passagem em culturas integrais (Figuras 9B, 9C e 15A). No entanto, quando as ESCs foram desassociadas em células individuais e clones
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46/55 isolados de células individuais cultivadas, os níveis iniciais de mtDNA materno variaram em diferentes clones, mas a heteroplasmia no se alterou com a cultura estendida (Figura 9D). Diferenças significativas na proliferação celular e nas taxas de crescimento entre os diferentes clones foram observadas. Os clones com maiores níveis de mtDNA materno exibiram taxas de crescimento significativamente mais rápidas do que os clones com menor heteroplasmia de mtDNA materno (Figura 9E). Estes resultados sugerem que certos haplótipos de mtDNA conferem às ESCs crescimento mais rápido e vantagens proliferativas. Assim, em culturas mistas consistindo de células com variada heteroplasmia, uma subpopulação de células com maior mtDNA materno pode supercrescer células com mtDNA do doador.
[0165]As atividades enzimáticas do complexo I e do complexo IV da cadeia respiratória mitocondrial foram medidas em células carregando vários haplótipos de mtDNA, mas não foram encontradas diferenças significativas. Isto sugere que a reversão para o mtDNA materno é independente da atividade mitocondrial (Figura 15B).
[0166]Em seguida, foi examinado se a reversão é específica para ESCs não diferenciadas ou podería ocorrer durante a diferenciação. Diversas ESCs revertidas e não revertidas foram diferenciadas in vitro em NPCs e cardiomiócitos, e em teratomas in vivo. Os níveis de mtDNA materno foram medidos antes e depois da diferenciação (Figuras 16A, 16B). Os níveis de mtDNA materno em 3243ST-ES1 revertido reduziram-se a níveis indetectáveis em alguns tecidos, mas foram levemente elevados em outros tipos de células em comparação com os 4% iniciais em ESCs não diferenciados (Figura 9F). O mtDNA materno era indetectável durante a diferenciação in vivo e in vitro da linhagem de células irmãs não revertidas 3243ST-ES2. Em contraste, os níveis de mtDNA materno aumentaram em todos os tecidos diferenciados testados em ST-ES7 e NT-ES8 revertidos (Figura 9F). Estes resultados demonstram que o fenômeno de reversão do mtDNA não é exclusivo das ESCs e
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47/55 ocorre durante a diferenciação, aumentando a possibilidade de que o retorno para o mtDNA mutante possa ocorrer em algumas crianças MRT.
[0167]Exemplo 14 - Conclusões [0168]A praticabilidade e os resultados clínicos após MRT em oócitos portadores de mutações patogênicas de mtDNA foram investigados 8, 10. Como mutações nos genes nucleares ou mtDNA podem causar síndromes mitocondriais similares, é fundamental realizar testes genéticos para confirmar a elegibilidade de mulheres com mutações patogênicas no DNA para MRT.
[0169]Uma faixa de heteroplasmia para o mtDNA mutante foi observada entre os diferentes tecidos testados em mulheres portadoras e seus filhos. Como esperado, mutações patogênicas de mtDNA foram detectadas em oócitos de todos os portadores.
[0170]O transporte do mtDNA materno, embora detectável, foi inferior a 1% em embriões ST pré-implantação. No entanto, a reversão para o original mtDNA materno foi observada em algumas MRT ESCs (15%, 4 / 26) durante a sua cultura estendida ou diferenciação. O mtDNA materno em macacos ST estava em níveis baixos esperados e não aumentou com a idade em adultos. No entanto, um aumento moderado no mtDNA materno (16%) foi observado em oócitos selecionados a partir de fêmeas ST (Lee HS e outros, Cell Rep 1,506 a 515 (2012); incorporado aqui por referência). Isso implica que, apesar da substituição eficiente do mtDNA mutante em oócitos, algumas crianças MRT ainda podem desenvolver altas cargas de mutação e doença mitocondrial.
[0171]Dentre os fatores que podem contribuir para a reversão do mtDNA, parece que esse fenômeno foi independente dos métodos MRT (ST, PNT ou SCNT), presença de mutações patogênicas de mtDNA e a distância genética medida em SNPs totais entre mtDNA de doador e mtDNA materno. No entanto, algumas combinações de haplótipos específicos produziram aumento preferencial do mtDNA
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48/55 materno e perda gradual do mtDNA do doador. Um dos possíveis mecanismos responsáveis pela reversão observada podería ser a síntese de iniciadores de replicação mais eficiente e, assim, inclinar-se para a amplificação preferencial de haplótipos de mtDNA com polimorfismos específicos da sequência de CSBII. A seleção de mtDNA de doador compatível contendo CSBII ou outras sequências de Dloop similares ao mtDNA materno resolvería este problema. Embora o número de combinações testadas no estudo descrito seja pequeno, a possível ordem de vantagem de replicação nos haplótipos de mtDNA pode ser H56 > H1b, U5a > H1b> F1a, U5a > X2c > D4a e H49 > B2k. No entanto, a amplificação estocástica ou de gargalo do mtDNA durante o desenvolvimento embrionário precoce também pode coexistir.
[0172]As mitocôndrias não apenas geram energia, mas também regulam a proliferação celular e a apoptose (Chan DC e outros, Cell 125, 1241 a 1252 (2006); aqui incorporadas por referência). Descreve-se aqui que os haplótipos de mtDNA podem afetar o crescimento e a proliferação celular, fornecendo assim vantagem seletiva para as células com mtDNA materno. Futuras aplicações de MRT exigirão estudos adicionais avaliando haplótipos de mtDNA de doadores compatíveis para evitar disfunção de OXPHOS, diferençaas na replicação de mtDNA, crescimento celular e recuperação de mtDNA mutante (Koehler CM e outros., Genetics 129, 247 a 255 (1991); incorporado aqui por referência).
[0173]Exemplo 15 - Sequenciamento de mtDNA [0174]As mutações específicas de mtDNA e haplótipos gerais foram determinadas em oócitos, sangue, fibroblastos da pele (SF) e/ou urina por sequenciamento completo de mtDNA utilizando MiSeq ou sistema de mutação refratário de amplificação - reação em cadeia da polimerase quantitativa (ARMSqPCR).
[0175]Exemplo 16 - Estimulação Ovariana Controlada (COS)
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49/55 [0176]A triagem basal foi realizada incluindo um histórico médico e exame físico, avaliação do índice de massa corporal (IMC), nível de hormônio antimulleriano (AMH) e contagem de folículos antrais (AFC). Os indivíduos foram submetidos à estimulação ovariana e à recuperação de oócitos, empregando protocolos e procedimentos padrão de IVF.
[0177]Exemplo 17 - Transferência de Fuso (ST) [0178]O ST foi realizado da seguinte forma: os fusos metafásicos meióticos II (Mil) foram visualizados sob microscopia polarizada e isolados com citoplasma mínimo (carioplasto, mtDNA hospedeiro). O carioplasto foi então colocado no espaço perivitelino de um oócito enucleado (citoplasto, mtDNA do doador) e fundido usando HVJ-E (vírus hemaglutinante do Japão envelopado).
[0179]Exemplo 18 - Vitrificação de Oócitos [0180]A vitrificação dos oócitos foi realizada como anteriormente descrito utilizando kits de vitrificação e descongelamento de oócitos humanos comercialmente disponíveis(kit de Vitrificação e kit de aquecimento Vit., Life Global).
[0181]Exemplo 19 - Derivação de Células ES e Cultura [0182]Os blastocistos ST foram libertos de sua zona pelúcida e plaqueados em camadas alimentadoras mEF em placas de cultura de 4 poços por 5 a 7 dias a 37° C, 3% CO2, 5% O2 e 92% N2 em meio (DMEM / F12 com 10 % De FBS, 10% de KSR, aminoácidos não essenciais a 0,1 mM, l-glutamina a 1 mM, β-mercaptoetanol a 0,1 mM, 5 ng / ml de fator de crescimento de fibroblastos básico, inibidor de ROCK a 10μΜ). Os excrescimentos de blastocisto anexados foram manualmente cortados em pequenos pedaços, re-plaqueados em placas novas e mantidos em meio DMEM nocaute (Invitrogen) suplementado com 20% de KSR, aminoácidos não essenciais a 0,1 mM, l-glutamina a 1 mM, β- mercaptoetanol a 0,1 mM, penicilina - estreptomicina e 4 ng / ml de bFGF para posterior propagação e análise. Todas as linhas celulares foram negativas para contaminação por micoplasma.
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50/55 [0183]Exemplo 20 - Ensaios de transcrição de mtDNA [0184]Os ensaios antiterminação de transcrição in vitro foram realizados utilizando modelos amplificados por PCR contendo a região 202-481 de mtDNA de doador (H1b) ou hospedeiro (U5a). Os produtos das reações de transcrição foram resolvidos por PAGE a 20% contendo 6 M de ureia e visualizado por PhosphoImager (GE Health).
[0185]Exemplo 21 - Ensaios de Crescimento e Proliferação Celular [0186]As ESCs foram adaptadas para crescer sob condições isentas de alimentação na matriz de Matrigel em meio mTeSRTMI (tecnologias STEMCELL) (Wu J e outros, Nature 521,316 a 321 (2015); aqui incorporado por referência). As células foram dissociadas com Accutase (Life Technologies) durante 2 min e aproximadamente 105 células foram semeadas em cada placa de 60 mm. As células foram colhidas periodicamente e contadas utilizando o Contador Automático de Células Condensadas (Invitrogen).
[0187]Exemplo 22 - Diferenciação e Cultura de Células Progenitoras Neurais (NPC) [0188]Um protocolo publicado anteriormente com pequenas modificações foi usado para a diferenciação de NPC. Resumidamente, as ESCs foram mantidas em MEFs em meio CDF12 antes da diferenciação de NPC. O meio CDF12 continha DMEM / F12 (Life Technology), 20% de substituição de soro nocaute (Life Technologies), 2 mM de Glutamax (Life Technologies), 0,1 mM de NEAA (Life Technology), 0,1 mM de β-mercaptoetanol (Life Technologies) e 4 ng / ml de FGF2 (Peprotech). As ESCs foram desagregadas com Colagenase IV (Life Technologies) e permitidas crescer até aproximadamente 40% de confluência. Para iniciar a indução neural, as células foram lavadas duas vezes com DPBS 1x sem cálcio e magnésio (Corning Cellgro) e mudadas para Meio de Indução Neural 1 (NIM-1: 50% DMEM Avançado / F12 (Invitrogen), 50% Neurobasal (Invitrogen), 1x B27 (Invitrogen), 1x N2
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51/55 (Invitrogen), 2mM de GlutaMAX e 10 ng / ml de hLIF (Peprotech), 4uM de CHIR99021 (Selleckchem), 3 uM de SB431542 (Selleckchem), 2 uM de Dorsomorfina (Sigma) e 0,1 uM de Composto E (SEM Chemicals Inc.). Após 2 dias de cultura no meio NIM-1, as células foram mudadas para o Meio de Indução Neural 2 (NIM-2: 50% de DMEM Avançado / F12, 50% de Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 2mM de GlutaMAX e 10 ng / ml de hLIF, 4 uM de CHIR99021,3 uM de SB431542 e 0,1 uM de Composto E.) As células foram ainda cultivadas em NIM-2 durante 5 dias com mudança de meio diariamente. No timo dia no meio NIM-2, as células foram tratadas de um dia para o outro com 10 uM de Y27632 (Selleckchem) e 20 a 30 colônias em forma de “domo” foram colhidas manualmente e digeridas com Accumax (Innovative Cell Technologies) durante 10 minutos a 37° C. As células de tratamento Accumax foram suavemente desagregadas em células individuais e plaqueadas novamente em placas de 6 poços revestidas com Matrigel a uma densidade de aproximadamente 3,5 x 104 por cm2 em Meio de Manutenção de Células Progenitoras Neurais (NPMM: 50% DMEM Avançado / F12, 50% Neurobasal, 1x B27, 1x N2, 2 mM de GlutaMAX, 10ng / ml de hLIF, 3 mM de CHIR99021 e 2 mM de SB431542) suplementado com 10 uM de Y27632. As NPCs foram mantidas em placas revestidas com Matrigel em NPMM. As NPCs foram passadas quando atingiram aproximadamente 70% a 80% de confluência usando Accumax e replaqueadas a uma densidade de 3 x 104 por cm2 com mudança diária média. Para as 6 passagens iniciais, as NPCs foram pré-tratadas com Y27632 a 10 μΜ durante a noite antes e durante a divisão celular. O estudo foi randomizado e os investigadores foram cegos para alocações de tratamento em laboratórios de colaboradores.
[0189]Exemplo 23 - Diferenciação de Cardiomiócitos [0190]A diferenciação de cardiomiócitos foi realizada com base em um protocolo GiWi (inibidor de GSK3 e inibidor de Wnt) descrito anteriormente (Lian X e outros, Nat Protoc 7, 1235 a 1246 (2012); aqui incorporado por referência).
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Resumidamente, as ESCs foram cultivadas em placas revestidas com Matrigel em meio mTeSRI a 80-90% de confluência antes da passagem com Accutase e então novamente semeadas em 0,5-1,5 milhões de células por poço em placas de 12 poços em 1 ml de mTeSRI mais 10 μΜ de Y27632. No dia 5, as células foram incubadas com 6 a 12 μΜ de CHIR99021 (Selleckchem) durante 16-24 h e depois substituídas por 2 ml de RPMI / B27 (insulina) e cultivadas durante dois dias. No dia 8, um meio combinado de 2 ml foi preparado misturando 1 ml de meio coletado a partir da placa de 12 poços e 1 ml de meio RPMI / B27 (-insulina) fresco. As células foram então substituídas por 2 ml de meio combinado com 5 μΜ de IWP2 (Tocris) e cultivadas por 48 h. No dia 10, 2 ml de RPMI / B27 (insulina) fresco foram adicionados a cada poço da placa de 12 poços. A partir do dia 12, o meio foi trocado a cada três dias por 2 ml / poço de RMPI / B27 (+ insulina). Os cardiomiócitos contraídos foram observados já no dia 17 a partir da passagem inicial de ESCs. Tipos celulares diferenciados foram identificados por imunocitoquímica como descrito anteriormente.
[0191]Exemplo 24 - Ensaio de Teratoma [0192]ESCs foram injetadas na região femoral de camundongos machos SCID com 6 semanas de idade (Charles River). Os camundongos com tumores foram eutanasiados e os teratomas foram isolados, seccionados e caracterizados histologicamente quanto à presença de tecidos representativos como descrito anteriormente.
[0193]Exemplo 25 - Avaliação da Função Mitocondrial [0194]As atividades enzimáticas da cadeia respiratória mitocondrial (complexos I e IV) foram medidas por espectrofotometria, como descrito, por exemplo, por Spinazzi M e outros, Nat Protoc 7, 1235 a 1246 (2012); incorporado aqui por referência. Resumidamente, as mitocôndrias intactas foram isoladas de fibroblastos e tratadas com e sem 3 mM de rotenona a um comprimento de onda de 340 nm durante 5 min. Diferenças de absorbância por minuto foram obtidas, e a especificidade da
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53/55 atividade COMI foi estimada pela porcentagem de inibição da rotenona. Para o consumo de oxigênio das células vivas, um analisador de fluxo extracelular XF96 (Seahorse Biosciences) foi usado para medir as taxas de consumo de oxigênio (OCR) e taxas de acidificação extracelular (ECAR), conforme descrito anteriormente. Resumidamente, as células progenitoras neurais (NPCs) foram semeadas a uma densidade de 30.000 células por poço de uma microplaca de cultura de células XF96 e incubadas durante 24 h para permitir que as células se ligassem. Antes do ensaio, as NPCs foram equilibradas durante 1 h em meio de ensaio XF não tamponado suplementado com glucose a 25 mM, piruvato de sódio a 1 mM, glutamax a 2 mM, 1x aminoácidos não essenciais e 1% (em volume) de FBS em uma incubadora não-C02. Injeções sequenciais de composto de oligomicina (0,5 μΙ / ml), carbonil cianeto 4(trifluorometoxi) fenilidrazona (FCCP, 1 μΜ) e rotenona (0,5 μΜ) / antimicina A (1 μΜ) foram utilizados para medir os parâmetros chave da respiração mitocondrial. índices de função mitocondrial foram calculados como taxa respiratória basal (OCR basal OCR de rotenona / antimicina A), dependente de ATP (taxa respiratória basal - OCAR oligomicina), taxa respiratória máxima (FCCP OCR - OCR rotenona / antimicina A) e reserva oxidativa (máxima taxa de respiração - taxa de respiração basal). Cada valor representado foi a média de um mínimo de 4 poços replicados, e foi normalizado para o número total de células plaqueadas. Os resultados foram apresentados como média ± SEM. ANOVA unidirecional foi usado para três comparações entre grupos e o teste t de Student foi usado para comparações entre pares. Um valor P menor que 0,05 foi considerado significativo. O estudo foi randomizado, e os investigadores foram cegos para alocação de amostras entre diferentes grupos.
[0195]Exemplo 26 - Sequenciamento de mtDNA por MiSeq [0196]O DNA foi extraído de fibroblastos da pele, sangue integral, urina, ESCs e tecidos de teratoma usando o kit de extração de DNA Centra (Qiagen), e de oócitos usando o kit de extração de DNA Pico Pure (Life Technologies). O mtDNA foi
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54/55 amplificado por uma única reação de PCR. A amplificação de mtDNA de oócitos individuais foi realizada utilizando 2 conjuntos de iniciadores: 7272F 5GGCTCATTCATTTCTCTAACAG-3, 15712R 5-TTGGCTTAGTGGGCGAAATA-3 e 15635F 5-TCCATCCTCATCCTAGCAAT-3, 7401R 5GGGGGCATCCATATAGTCAC-3 e o sequenciamento mitocondrial realizado.
[0197]Exemplo 27 - Detecção de variantes de mtDNA por sequenciamento de Sanger [0198]As variantes de mtDNA presentes em mais de 10% de heteroplasmia foram corroboradas independentemente pelo sequenciamento de Sanger. Regiões de mtDNA contendo mutações da linhagem germinativa ou SNPs foram amplificadas por PCR com conjuntos de iniciadores previamente descritos usando o kit de alta fidelidade PCR Platinum SuperMix (Life Technologies). Os produtos de PCR foram purificados, sequenciados e analisados por Sequencher v. 5.0 (GeneCodes).
[0199]Exemplo 28 - Medição de ARMS-qPCR e Número de Cópias [0200]0 ensaio de PCR quantitativo do sistema de mutação refratário de amplificação (ARMs-qPCR) foi realizado para verificar a heteroplasmia em mt8993T> G, mt13513G>A e mt3243A>G e para medir o transporte em embriões ST de controle e células ES em 7843A>G, 16519T>C e 16278T>C8. A medição do número de cópias de mtDNA foi realizada.
[0201]Exemplo 29 - Análises Genéticas e Citogenéticas [0202]A cariotipagem por banda G foi realizada em 20 células metafásicas de cada linhagem celular humana. Arranjo CGH foi realizado por IVI Gen. As CNVs foram identificadas por genotipagem de SNP como previamente descrito por MaH e outros, Nature 511, 177 a 183 (2014) aqui incorporado por referência e analisado por um laboratório de diagnóstico genético clínico.
[0203]Exemplo 30 - Análise Estatística [0204]0s resultados são apresentados como médias ± SD, ou SEM. p < 0,05
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55/55 foi considerado significativo. Os dados foram analisados pelo teste não paramétrico de Pearson para correlação, teste t de grupo independente ou teste do qui-quadrado para comparação pareada e ANOVA com análise de Bonferroni para múltiplas comparações (IBM SPSS).
Claims (17)
1. Método para preparar um oócito humano viável para fertilização, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de:
a) isolar um primeiro oócito contendo um corpo polar;
b) ganhar acesso através da zona pelúcida do primeiro oócito;
c) remover o corpo polar do primeiro oócito;
d) remover o fuso nuclear de um segundo oócito para criar um citoplasto enucleado;
e) colocar o corpo polar removido do primeiro oócito no espaço perivitelino do citoplasto enucleado.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que compreende fertilizar o oócito humano viável através de fertilização in vitro, criando assim um embrião.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que compreende implantar o embrião em um útero receptivo.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a enucleação do primeiro oócito é realizada em um meio compreendendo ao menos 10% de fluido tubário humano, tampão HEPES, e citocalasina B utilizando um Sistema de Imagiologia de Microscópio de Polarização.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o isolamento do corpo polar é realizado em um meio compreendendo ao menos 10% de fluido tubário humano, tampão HEPES, citocalasina B, e fusão com citoplasto doador induzido com extrato de HVJ-E.
6. Método para produzir um oócito humano in vitro, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
a) determinar uma sequência de DNA mitocondrial da caixa de sequência II
Petição 870190043447, de 08/05/2019, pág. 7/25
2/3 conservada de um oócito do doador;
b) enuclear o oócito do doador enquanto o oócito do doador está preso na metáfase II, isolando assim o material genético nuclear do doador;
c) introduzir o material genético nuclear do doador em um oócito do receptor enucleado, desde que o DNA mitocondrial do oócito do doador tenha o mesmo genótipo da caixa II de sequência conservada que o oócito do receptor.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que compreende fertilizar o oócito humano viável através de fertilização in vitro, criando assim um embrião.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que compreende implantar o embrião em um útero receptivo.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6, 7 ou 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a enucleação do oócito do doador é realizada em um meio compreendendo ao menos 10% de fluido tubário humano, tampão HEPES, e citocalasina B utilizando um Sistema de Imagiologia de Microscópio de Polarização.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3, 7 e 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o embrião é cultivado no estágio de blastocisto antes da implantação em um útero receptivo.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6, 7, 8, 9 ou 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o oócito do doador e o oócito do receptor têm ambos o genótipo G5A8 ou têm ambos o genótipo G6A8.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6, 7, 8, 9 ou 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o DNA mitocondrial do oócito do doador compreende uma mutação que resulta em uma doença mitocondrial.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença mitocondrial é selecionada a partir da Síndrome de Leigh,
Petição 870190043447, de 08/05/2019, pág. 8/25
3/3 encefalomiopatia Mitocondrial, Acidose Lática ou Episódios tipo Acidente Vascular Cerebral.
14. Método de produzir um oócito humano in vitro, o oócito humano produzido compreendendo DNA mitocondrial materno mínimo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
determinar a sequência da região não codificante principal do DNA mitocondrial de um oócito do doador, em que a sequência da região não codificante principal inclui uma região de alça D;
enuclear o oócito do doador enquanto o oócito do doador está preso na metáfase II, isolando assim o material genético nuclear do doador;
Introduzir o material genético nuclear do doador em um oócito do receptor enucleado, desde que o DNA mitocondrial do oócito do doador tenha a mesma sequência de região não codificante principal do oócito do receptor.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o oócito do doador e o oócito do receptor têm ambos o haplótipo de mtDNA H56, H1b, U5a, F1a, X2c, D4a, H49 ou B2k.
16. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o DNA mitocondrial do oócito do doador compreende uma mutação que resulta em uma doença mitocondrial.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença mitocondrial é síndrome de Leigh, encefalomiopatia mitocondrial, acidose lática, ou episódios tipo acidente vascular cerebral.
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