BR112019009430A2 - generation of human oocytes - Google Patents
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Abstract
a presente invenção refere-se a métodos de geração de oócitos humanos funcionais após transferência nuclear de genomas do primeiro corpo polar (pb1) de oócitos em metáfase ii (mii) para o citoplasma de mii doador enucleado (pbnt) e usando técnicas de substituição mitocondrial para contornar a transmissão da doença de mtdna de mãe para filho.The present invention relates to methods of generating functional human oocytes after nuclear transfer of first polar body (pb1) genomes from metaphase II (mii) oocytes to enucleated donor mii cytoplasm (pbnt) and using mitochondrial replacement techniques to circumvent the transmission of mtdna disease from mother to child.
Description
“GERAÇÃO DE OÓCITOS HUMANOS”"GENERATION OF HUMAN OOCYTES"
CAMPO DA TÉCNICA [001]Geralmente, o campo envolve a geração de oócitos humanos in vitro através da transferência de material nuclear. Mais especificamente, o campo envolve a geração de oócitos humanos através de transferência nuclear de corpos polares para oócitos de doador enucleados e/ou a transferência de material nuclear de um oócito contendo mutações de DNA mitocondrial para um oócito sem essas mutações.TECHNICAL FIELD [001] Generally, the field involves the generation of human oocytes in vitro through the transfer of nuclear material. More specifically, the field involves the generation of human oocytes through nuclear transfer of polar bodies to enucleated donor oocytes and / or the transfer of nuclear material from an oocyte containing mitochondrial DNA mutations to an oocyte without these mutations.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002]A infertilidade atribuída a fatores masculinos e femininos afeta milhões de famílias em todo o mundo e enquanto as tecnologias de reprodução assistida (ARTs) podem contornar muitos casos (Huang JY e Rosenwaks Z, Meth Mol Biol 1154, 171 a 231 (2014); incorporado por referência aqui; Leridon H, Human Reproduction 19, 1548 a 1553 (2004); Trounson A e Mohr L, Nature 305, 707 a 709 (1983); todos os quais são aqui incorporados por referência), a sua eficácia é particularmente limitada pelo número e a qualidade dos oócitos que diminuem com a idade materna avançada (Leridon 2004 acima). Portanto, o desenvolvimento de fontes adicionais de oócitos competentes, geneticamente relacionados aos pacientes, é desejável.BACKGROUND OF THE INVENTION [002] Infertility attributed to male and female factors affects millions of families worldwide and while assisted reproductive technologies (ARTs) can work around many cases (Huang JY and Rosenwaks Z, Meth Mol Biol 1154, 171 a 231 (2014); incorporated by reference here; Leridon H, Human Reproduction 19, 1548 to 1553 (2004); Trounson A and Mohr L, Nature 305, 707 to 709 (1983); all of which are incorporated by reference), its effectiveness is particularly limited by the number and quality of oocytes that decrease with advanced maternal age (Leridon 2004 above). Therefore, the development of additional sources of competent oocytes, genetically related to patients, is desirable.
[003]Talvez a abordagem final envolva a diferenciação de células-tronco pluripotentes em células germinativas primordiais (PGCs) e, finalmente, em oócitos maduros (Daley GQ e outros, Science 316, 409 a 410 (2007); Handel MA e outros, Cell 157, 1257 a 1261 (2014), Hayashi Y e outros, Fértil Steril 97, 1250 a 1259 (2012), Matthews TJ e outros, NCHS Data Brief 1-8 (2009), todos os quais são aqui incorporados por referência). No entanto, a complexidade de estabelecer um sistema in vitro para produzir oócitos humanos haploides funcionais atualmente limita esta aplicação (Irie N e outros, Cell 160, 253 a 268 (2015) e Sasaki K e outros, Cell Stem Cell 17, 178 a 194 (2015), ambos os quais são aqui incorporados por referência).[003] Perhaps the final approach involves differentiating pluripotent stem cells into primordial germ cells (PGCs) and finally mature oocytes (Daley GQ et al., Science 316, 409 to 410 (2007); Handel MA et al., Cell 157, 1257 to 1261 (2014), Hayashi Y et al., Fertil Steril 97, 1250 to 1259 (2012), Matthews TJ et al., NCHS Data Brief 1-8 (2009), all of which are incorporated by reference) . However, the complexity of establishing an in vitro system to produce functional haploid human oocytes currently limits this application (Irie N et al., Cell 160, 253 to 268 (2015) and Sasaki K et al., Cell Stem Cell 17, 178 to 194 (2015), both of which are incorporated by reference).
[004]Mutações de mtDNA maternalmente herdadas podem causar doenças[004] Maternally inherited mtDNA mutations can cause disease
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 8/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 8/95
2/55 debilitantes fatais ou graves em crianças (Archer SL, Engl J Med 369, 2236 a 2251 (2013); Koopman WJ e outros, N Engl J Med 366, 1132 a 1141 (2012); e Schon E e outros, Nat Rev Genet 13, 878 a 890 (2012), todos os quais são aqui incorporados por referência). A gravidade da doença depende da mutação genética específica e da relação de mtDNA patogênico para ocorrência natural (nível de heteroplasmia) em cada célula e tecido (Wallace DC & Chalkia D, Cold Spr Harb Perspect Biol 5, a021220 (2013); incorporado aqui como referência). Mutações patogênicas de mtDNA são relativamente comuns com um número estimado de 778 crianças afetadas nascidas a cada ano nos Estados Unidos (Gorman GS e outros, N Engl J Med 372, 885 a 887 (2015); incorporado aqui por referência). Atualmente, não há cura efetiva para pacientes com mutações do mtDNA. Portanto, técnicas de substituição mitocondrial (MRTs) foram desenvolvidas para prevenir a transmissão de mtDNA mutante de mães para seus filhos (Wolf DP e outros, Tendências Mol Med 21,68 a 76 (2015); Wang T e outros, Cell 157, 1591 a 1604 (2014), Tachibana M e outros, Nature 493, 627 a 631 (2013), Craven L e outros, Nature 465, 82 a 85 (2010) e Tachibana M e outros, Nature 461,367 a 372 (2009) todos os quais são aqui incorporados por referência). Agências reguladoras nos EUA e Reino Unido estão atualmente avaliando aplicações clínicas de MRT projetadas para avaliar a eficácia e a segurança. Até o momento, os aspectos clínicos de MRT não foram estudados, incluindo questões de elegibilidade do paciente, desenvolvimento do embrião e manutenção do mtDNA do doador pós-MRT.2/55 debilitating fatal or severe in children (Archer SL, Engl J Med 369, 2236 to 2251 (2013); Koopman WJ et al., N Engl J Med 366, 1132 to 1141 (2012); and Schon E et al., Nat Rev Genet 13, 878 to 890 (2012), all of which are incorporated by reference). The severity of the disease depends on the specific genetic mutation and the naturally occurring pathogenic mtDNA ratio (level of heteroplasm) in each cell and tissue (Wallace DC & Chalkia D, Cold Spr Harb Perspect Biol 5, a021220 (2013); incorporated here as reference). Pathogenic mtDNA mutations are relatively common with an estimated 778 affected children born each year in the United States (Gorman GS et al., N Engl J Med 372, 885 to 887 (2015); incorporated here by reference). Currently, there is no effective cure for patients with mtDNA mutations. Therefore, mitochondrial replacement techniques (MRTs) have been developed to prevent transmission of mutant mtDNA from mothers to their children (Wolf DP et al., Mol Med Trends 21.68 to 76 (2015); Wang T et al., Cell 157, 1591 1604 (2014), Tachibana M et al., Nature 493, 627 to 631 (2013), Craven L et al., Nature 465, 82 to 85 (2010) and Tachibana M et al., Nature 461,367 to 372 (2009) all which are hereby incorporated by reference). Regulatory agencies in the US and the UK are currently evaluating clinical MRT applications designed to assess efficacy and safety. To date, the clinical aspects of MRT have not been studied, including issues of patient eligibility, embryo development and maintenance of the post-MRT donor's mtDNA.
[005]Permanece a necessidade de métodos melhorados de assistência com fertilização, implantação e gravidez bem-sucedida em pacientes com oócitos em declínio ou de outro modo incompetentes.[005] There remains a need for improved methods of assisting with fertilization, implantation and successful pregnancy in patients with declining or otherwise incompetent oocytes.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [006]São aqui fornecidos métodos para a preparação de oócitos para fertilização e implantação uterina.SUMMARY OF THE INVENTION [006] Methods are provided here for preparing oocytes for fertilization and uterine implantation.
[007]É aqui descrita a reconstrução de novo de oócitos humanos haploides[007] Here again described the reconstruction of human haploid oocytes
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3/55 através da reciclagem de genomas PB1 através de transferência nuclear em citoplasma doador (Gurdon JB, Rambam Maimonides Med J 6 (2015), aqui incorporado por referência).3/55 through the recycling of PB1 genomes through nuclear transfer in donor cytoplasm (Gurdon JB, Rambam Maimonides Med J 6 (2015), incorporated herein by reference).
[008]Os defeitos dos oócitos estão no coração de algumas formas de infertilidade, e poderíam potencialmente ser tratados terapeuticamente por rotas alternativas para a formação de oócitos. É aqui descrita a geração de oócitos humanos funcionais após transferência nuclear de genomas do primeiro corpo polar (PB1) a partir de oócitos da metáfase II (Mil) para o citoplasma Mil do doador enucleado (transferência nuclear de corpo polar, PBNT). Os oócitos reconstruídos suportaram a formação de fusos meióticos de novo e, após a fertilização com espermatozóides, a finalização da meiose e a formação de zigotos diploides normais. Enquanto os zigotos PBNT evoluíram para blastocistos com menor frequência (42%) que controles (75%), análises genéticas, epigenéticas e transcricionais de PBNT e células-tronco embrionárias de controle (ESCs) indicaram números comparáveis de variações estruturais e perfis de transcriptoma e metilação de DNA similares. O material genético PB1 através da introdução no citoplasma do doador pode fornecer oócitos para tratamento de infertilidade ou terapia de reposição mitocondrial para doença de mtDNA.[008] Oocyte defects are at the heart of some forms of infertility, and could potentially be treated therapeutically by alternative routes for the formation of oocytes. The generation of functional human oocytes after nuclear transfer of genomes from the first polar body (PB1) from metaphase II (Mil) oocytes to the enucleated donor Mil cytoplasm (polar body transfer, PBNT) is described here. The reconstructed oocytes supported the formation of meiotic spindles again and, after fertilization with sperm, the completion of meiosis and the formation of normal diploid zygotes. While PBNT zygotes evolved to blastocysts less frequently (42%) than controls (75%), genetic, epigenetic and transcriptional analyzes of PBNT and control embryonic stem cells (ESCs) indicated comparable numbers of structural variations and transcriptome profiles and similar DNA methylation. PB1 genetic material through introduction into the donor cytoplasm can provide oocytes for infertility treatment or mitochondrial replacement therapy for mtDNA disease.
[009]Este método permite gerar oócitos adicionais que correspondem ao paciente para o tratamento de infertilidade. Utilizando cada oócito Mil do paciente e seu PB1 (mais citoplasma do doador), os oócitos / embriões relacionados ao paciente podem ser teoricamente duplicados. Realisticamente, o desenvolvimento de embriões PBNT para blastocistos é menor. Assim, pode-se estimar que o número de embriões viáveis para transferência e, portanto, taxas de gravidez pode aumentar em 40%.[009] This method allows the generation of additional oocytes corresponding to the patient for the treatment of infertility. Using each patient's Mil oocyte and its PB1 (plus donor cytoplasm), the patient-related oocytes / embryos can be theoretically duplicated. Realistically, the development of PBNT embryos for blastocysts is less. Thus, it can be estimated that the number of viable embryos for transfer and therefore pregnancy rates can increase by 40%.
[010]É aqui descrito um método para gerar um oócito humano viável. O método envolve enuclear um primeiro oócito no estágio Mil, criando assim um citoplasto, isolando um corpo polar de um segundo oócito por aspiração, e colocando[010] A method for generating a viable human oocyte is described here. The method involves enuclearing a first oocyte in the Mil stage, thus creating a cytoplasm, isolating a polar body from a second oocyte by aspiration, and placing
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4/55 o corpo polar no espaço perivitelino do citoplasto. O método também pode envolver fertilizar o oócito humano viável, criando assim um embrião. O método pode ainda compreender implantar o embrião em um revestimento uterino receptivo (endometrial). A enucleação do primeiro oócito pode ser realizada em um meio compreendendo ao menos 10% de fluido tubário humano, um tampão, e citocalasina B utilizando um Sistema de Imagiologia de Microscópio de Polarização. O isolamento do corpo polar pode ser realizado em um meio compreendendo ao menos 10% de fluido tubário humano, tampão, citocalasina B, e a fusão com o citoplasto de doador pode ser induzida com o extrato de HVJ-E (vírus hemaglutinante do envelope de vírus do Japão / Sendai).4/55 the polar body in the perivitelline space of the cytoplasm. The method may also involve fertilizing the viable human oocyte, thereby creating an embryo. The method may also comprise implanting the embryo in a receptive (endometrial) uterine lining. Enucleation of the first oocyte can be performed in a medium comprising at least 10% human tubal fluid, a buffer, and cytochalasin B using a Polarizing Microscope Imaging System. The isolation of the polar body can be carried out in a medium comprising at least 10% of human tubal fluid, buffer, cytochalasin B, and the fusion with the donor cytoplasm can be induced with the HVJ-E extract (hemagglutinating virus from the envelope of Japan / Sendai virus).
[011]É fornecido um método para preparar um oócito para fertilização, o método compreendendo as etapas de:[011] A method is provided to prepare an oocyte for fertilization, the method comprising the steps of:
a) isolar um primeiro oócito contendo um corpo polar;a) isolate a first oocyte containing a polar body;
b) ganhar acesso através da zona pelúcida do primeiro oócito;b) gain access through the pellucid zone of the first oocyte;
c) remover o corpo polar do primeiro oócito;c) removing the polar body from the first oocyte;
d) remover o fuso nuclear de um segundo oócito para criar um citoplasto enucleado;d) removing the nuclear spindle from a second oocyte to create an enucleated cytoplasm;
e) colocar o corpo polar removido do primeiro oócito no espaço perivitelino do citoplasto enucleado.e) placing the polar body removed from the first oocyte in the perivitelline space of the enucleated cytoplasm.
[012]É também fornecido um método para produzir um oócito humano in vitro, o método compreendendo:[012] A method for producing a human oocyte in vitro is also provided, the method comprising:
a) determinar uma sequência de DNA mitocondrial da caixa II de sequência conservada de um oócito do doador;a) determine a box II mitochondrial DNA sequence of conserved sequence from a donor oocyte;
b) enuclear o oócito do doador enquanto o oócito do doador está preso na metáfase II, isolando assim o material genético nuclear do doador;b) enuclear the donor's oocyte while the donor's oocyte is trapped in metaphase II, thus isolating the donor's nuclear genetic material;
c) introduzir o material genético nuclear do doador em um oócito do receptor enucleado, desde que o DNA mitocondrial do oócito do doador tenha o mesmoc) introducing the donor's nuclear genetic material into an enucleated recipient's oocyte, provided that the donor's oocyte's mitochondrial DNA has the same
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5/55 genótipo da caixa II de sequência conservada que o oócito do receptor.5/55 box II genotype of conserved sequence than the oocyte of the recipient.
[013]Modalidades adicionais de ambos os métodos acima envolvem uma etapa adicional de fertilizar o oócito recém-criado através de fertilização in vitro. Em modalidades adicionais, o oócito / embrião fertilizado é cultivado no estágio de blastocisto antes da implantação em um receptivo revestimento uterino / endometrial.[013] Additional modalities of both methods above involve an additional step of fertilizing the newly created oocyte through in vitro fertilization. In additional modalities, the fertilized oocyte / embryo is cultured in the blastocyst stage before implantation in a receptive uterine / endometrial lining.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [014]Figuras coloridas foram enviadas como parte da descrição original e referências a cores nas figuras são fornecidas nesta descrição. Os requerentes se reservam o direito de apresentar versões em cores das figuras descritas neste documento em procedimentos posteriores.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS [014] Colored figures were sent as part of the original description and references to colors in the figures are provided in this description. Applicants reserve the right to submit color versions of the figures described in this document in later procedures.
[015]A Figura 1A mostra a geração de oócitos humanos haploides por PBNT. Ο PB1 de um oócito do doador é recuperado e introduzido em um citoplasto Mil do receptor. Após a fertilização, os zigotos do PBNT são cultivados no estágio de blastocisto antes de serem transferidos para um paciente. Alternativamente, eles podem ser usados para derivar células-tronco embrionárias para posterior análise.[015] Figure 1A shows the generation of human haploid oocytes by PBNT. Ο PB1 of a donor oocyte is recovered and introduced into a Mil cytoplasm of the recipient. After fertilization, the zygotes of the PBNT are grown in the blastocyst stage before being transferred to a patient. Alternatively, they can be used to derive embryonic stem cells for further analysis.
[016]A Figura 1B mostra microscopia confocal detectando estruturas cromossômicas do fuso meiótico em PB1 (primeiro painel da esquerda), oócitos Mil intactos (segundo painel) e oócitos PBNT (terceiro painel) marcados com DAPI (azul) para DNA e a- e β-tubulinas (verde) para microtúbulos. Observa-se a ausência de fuso meiótico em PB1 (primeiro painel) e fusos anormais em prófase (terceiro painel) ou anáfase (último painel) em alguns oócitos PBNT. Barras de escala de 5 pm.[016] Figure 1B shows confocal microscopy detecting chromosomal structures of the meiotic spindle in PB1 (first panel from the left), Mil intact oocytes (second panel) and PBNT oocytes (third panel) marked with DAPI (blue) for DNA and a- and β-tubulins (green) for microtubules. It is observed the absence of meiotic spindle in PB1 (first panel) and abnormal spindles in prophase (third panel) or anaphase (last panel) in some PBNT oocytes. 5 pm scale bars.
[017]A Figura 1C mostra que a maioria dos PB1s em oócitos Mil humanos recentemente recuperados estavam intactos com morfologia circular (painel esquerdo). Outros oócitos Mil continham PB1 fragmentados ou desintegrados, inadequados para o PBNT (painéis do meio e direito). Barra de escala, 100 pm.[017] Figure 1C shows that most PB1s in recently recovered 1,000 human oocytes were intact with circular morphology (left panel). Other Mil oocytes contained fragmented or disintegrated PB1, unsuitable for PBNT (middle and right panels). Scale bar, 100 pm.
[018]A Figura 1D mostra a formação do fuso (seta), detectada usando o sistema de imagem OosightTM, 60 min após ο PB1 ter sido introduzido em um[018] Figure 1D shows the spindle formation (arrow), detected using the OosightTM imaging system, 60 min after ο PB1 was introduced into a
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 12/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 12/95
6/55 citoplasto Mil enucleado. Barra de escala, 100 pm.6/55 enucleated Mil cytoplasm. Scale bar, 100 pm.
[019]A Figura 1E mostra a conclusão da meiose e formação de pronúcleos em oócitos PBNT humanos após a fertilização. Observa-se o zigoto normal com 2 pronúcleos (2PN) e um segundo corpo polar (PB2) no painel esquerdo e 1PN, 3PN ou 2PN anormais sem extrusão de PB2 em outras imagens. Barras de escala, 100 pm.[019] Figure 1E shows the completion of meiosis and pronucleus formation in human PBNT oocytes after fertilization. The normal zygote with 2 pronuclei (2PN) and a second polar body (PB2) is observed in the left panel and 1PN, 3PN or 2PN abnormal without extrusion of PB2 in other images. Scale bars, 100 pm.
[020]A Figura 1F mostra um blastocisto de eclosão a partir de um zigoto PBNT, com ICM proeminente indicado por asterisco. Barra de escala, 100 pm.[020] Figure 1F shows an outbreak blastocyst from a PBNT zygote, with prominent ICM indicated by an asterisk. Scale bar, 100 pm.
[021 ]A Figura 1G mostra um resumo da fertilização e desenvolvimento in vitro de blastocistos de oócitos PBNT. Barras de erro são média ± SEM. Significância estabelecida com o teste t de Student. Controle = oócitos Mil intactos.[021] Figure 1G shows a summary of the in vitro fertilization and development of PBNT oocyte blastocysts. Error bars are mean ± SEM. Significance established with the Student t test. Control = Thousand oocytes intact.
[022]A Figura 2A mostra uma análise de bandas G citogenética das linhagens PBNT 1, PBNT2, e hESO-14, hESO-15, hESO-16 e hESO-17 de controle. Nota-se que os cariótipos femininos normais em PBNT1 e hESO-14 de controle e cariótipos masculinos normais em hESO-16 de controle e hESO-17. PBNT2 exibiu um cariótipo triploide anormal enquanto hESO-15 de controle teve um cariótipo anormal com a monossomia do cromossomo 21.[022] Figure 2A shows a cytogenetic G-band analysis of the PBNT 1, PBNT2, and hESO-14, hESO-15, hESO-16 and hESO-17 strains. Note that normal female karyotypes in PBNT1 and hESO-14 control and normal male karyotypes in hESO-16 control and hESO-17. PBNT2 exhibited an abnormal triploid karyotype while control hESO-15 had an abnormal karyotype with chromosome 21 monosomy.
[023]A Figura 2B mostra um diagrama de Venn exibindo os resultados da análise de variação estrutural em PBNT 1, hESO-14 em comparação com o doador de óvulos. PBNT1 (azul) e hESO-14 (vermelho) apresentaram números similares de SVs quando comparados com o doador de óvulos.[023] Figure 2B shows a Venn diagram showing the results of the structural variation analysis in PBNT 1, hESO-14 compared to the egg donor. PBNT1 (blue) and hESO-14 (red) showed similar numbers of SVs when compared to the egg donor.
[024]A Figura 2C mostra um diagrama de Venn exibindo os resultados da análise de variação estrutural em PBNT 1, hESO-14 em comparação com o doador de esperma. PBNT1 (azul) e hESO-14 (vermelho) apresentaram números similares de SVs quando comparados com o doador de esperma.[024] Figure 2C shows a Venn diagram showing the results of the structural variation analysis in PBNT 1, hESO-14 compared to the sperm donor. PBNT1 (blue) and hESO-14 (red) showed similar numbers of SVs when compared to the sperm donor.
[025]A Figura 2D mostra um resumo de SVs em PBNT1 e hESO-14.[025] Figure 2D shows a summary of SVs in PBNT1 and hESO-14.
[026]A Figura 3A mostra a porcentagem de CGs metilados em PBNT1 e hESO-14 do total de sítios CG.[026] Figure 3A shows the percentage of CGs methylated in PBNT1 and hESO-14 of the total CG sites.
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 13/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 13/95
7/55 [027]A Figura 3B mostra taxas de metilação não CG em PBNT1 e hESO-14 entre todos os sítios não-CG.7/55 [027] Figure 3B shows rates of non-CG methylation in PBNT1 and hESO-14 among all non-CG sites.
[028]A Figura 3C mostra que um total de 116 CG DMRs foi identificado entre PBNT1 e hESO-14. Características genômicas de DMRs (sobreposição de ao menos 1 pb) - CGI, ilhas CG; DHS, sítios de hipersensibilidade à DNase I, TSS, sítios de início da transcrição; TES, sítios de fim de transcrição.[028] Figure 3C shows that a total of 116 CG DMRs were identified between PBNT1 and hESO-14. Genomic characteristics of DMRs (overlap of at least 1 bp) - CGI, CG islands; DHS, hypersensitivity sites to DNase I, TSS, transcription initiation sites; TES, transcription end sites.
[029]A Figura 3D mostra uma captura de tela representativa mostrando uma CG DMR hipometilada em PBNT1 em comparação com hESO-14.[029] Figure 3D shows a representative screenshot showing a hypomethylated DMR CG in PBNT1 compared to hESO-14.
[030]A Figura 3E é um conjunto de capturas de tela mostrando quatro DMRs não-CG identificados em PBNT1 em comparação com hESO-14.[030] Figure 3E is a set of screen shots showing four non-CG DMRs identified in PBNT1 compared to hESO-14.
[031 ]A Figura 4A é um gráfico de manchas que resume a análise de expressão diferencial (DE). A variação log-fold de cada um dos 14877 genes usados na análise é representada contra a abundância média (log de contagens por milhão) de cada gene. Os pontos vermelhos representam os genes com expressão significativamente diferente (FDR < 0,05). As linhas azuis indicam aumentos de 2 vezes.[031] Figure 4A is a spot plot that summarizes the differential expression (DE) analysis. The log-fold variation of each of the 14877 genes used in the analysis is plotted against the average abundance (log counts per million) for each gene. The red dots represent genes with significantly different expression (FDR <0.05). The blue lines indicate 2-fold increases.
[032]A Figura 4B é um mapa de calor que mostra o perfil de expressão dos genes 186 DE. Dois grupos distintos foram aparentes com genes expressos altamente em células PBNT1 em comparação com células hESO-14 e vice-versa (n = 6).[032] Figure 4B is a heat map showing the expression profile of the 186 DE genes. Two distinct groups were apparent with genes expressed highly in PBNT1 cells compared to hESO-14 cells and vice versa (n = 6).
[033]A Figura 5A mostra análises histológicas de tumores de teratoma produzidos após injeções de PBNT1 em camundongos SCID. Barras de escala, 100 pm. As setas indicam tecidos similares à crista neural (ectoderma), tecidos similares à cartilagem (mesoderma) e epitélio da mucosa de tecidos similares a intestino (endoderme).[033] Figure 5A shows histological analyzes of teratoma tumors produced after PBNT1 injections in SCID mice. Scale bars, 100 pm. The arrows indicate tissues similar to the neural crest (ectoderm), tissues similar to cartilage (mesoderm) and mucosal epithelium of intestine-like tissues (endoderm).
[034]A Figura 5B mostra análises histológicas de tumores de teratoma produzidos após injeções de hESO-14 em camundongos SCID. Barras de escala, 100 pm. As setas indicam tecidos similares à crista neural (ectoderma), tecidos similares à cartilagem (mesoderma) e epitélio da mucosa de tecidos similares a intestino[034] Figure 5B shows histological analyzes of teratoma tumors produced after injections of hESO-14 in SCID mice. Scale bars, 100 pm. Arrows indicate tissues similar to the neural crest (ectoderm), tissues similar to cartilage (mesoderm) and mucosal epithelium of intestine-like tissues
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 14/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 14/95
8/55 (endoderme).8/55 (endoderm).
[035]A Figura 6A é uma genealogia das famílias 1 e 2 da Síndrome de Leigh.[035] Figure 6A is a genealogy of families 1 and 2 of Leigh's Syndrome.
[036]A Figura 6B é uma genealogia da família 3 G13513A da Síndrome de Leigh.[036] Figure 6B is a genealogy of the Leigh Syndrome family 3 G13513A.
[037]A Figura 6C é uma genealogia da família 5 A3243G da síndrome MELAS de genealogia grande (ver também a Figura 10B).[037] Figure 6C is a genealogy of family 5 A3243G of the MELAS syndrome of great genealogy (see also Figure 10B).
[038]Para todas as Figuras 6A, 6B e 6C, os níveis de heteroplasma sublinhados foram obtidos a partir de relatórios anteriores. Em todas as famílias, os níveis de heteroplasmia para as mutações de mtDNA foram diversos entre tecidos e indivíduos, e associados à doença clínica. Preto preenchido, diagnosticado como uma doença mitocondrial. LS = síndrome de Leigh, y = anos de idade, quadrado = macho; círculo = fêmea, B = sangue; SF = fibroblastos da pele; U = urina.[038] For all Figures 6A, 6B and 6C, the underlined levels of heteroplasm were obtained from previous reports. In all families, the levels of heteroplasm for mtDNA mutations were diverse between tissues and individuals, and associated with clinical disease. Filled black, diagnosed as a mitochondrial disease. LS = Leigh's syndrome, y = years of age, square = male; circle = female, B = blood; SF = skin fibroblasts; U = urine.
[039]A Figura 7A é um conjunto de gráficos que mostram oócitos individuais que abrigam diferentes níveis de heteroplasmia. cED = doador de oócito portador.[039] Figure 7A is a set of graphs showing individual oocytes that harbor different levels of heteroplasm. cED = carrier oocyte donor.
[040]A Figura 7B é um conjunto de dois gráficos que mostram que o nível médio de heteroplasmia em oócitos está correlacionado com níveis em crianças existentes, em vez daqueles em doadores de oócitos portadores. Os níveis de heteroplasmia de portadores e crianças foram medidos no sangue. R = valores r de Pearson.[040] Figure 7B is a set of two graphs showing that the average level of heteroplasm in oocytes is correlated with levels in existing children, rather than those in carriers of oocyte carriers. Heteroplasm levels in patients and children were measured in the blood. R = Pearson's r-values.
[041 ]A Figura 7C é um gráfico que mostra variantes de mtDNA comparáveis entre oócitos com mtDNA saudável e aqueles carregando mutações de mtDNA (p > 0,05).[041] Figure 7C is a graph showing comparable mtDNA variants between oocytes with healthy mtDNA and those carrying mtDNA mutations (p> 0.05).
[042]A Figura 7D é um gráfico que mostra que o número total de cópias de mtDNA era comparável em oócitos com mtDNA saudável e aqueles carregando mtDNA patogênico (p > 0,05). Os carioplastos foram isolados de oócitos portadores para ST, exceto os oócitos de cED2, que exibiram luteinização prematura. Os oócitos de doadores de óvulos saudáveis eram Mil maduros, n = o número de oócitos. LS:[042] Figure 7D is a graph showing that the total number of mtDNA copies was comparable in oocytes with healthy mtDNA and those carrying pathogenic mtDNA (p> 0.05). Karyoplasts were isolated from oocytes carrying ST, except for cED2 oocytes, which exhibited premature luteinization. The oocytes of healthy egg donors were one thousand mature, n = the number of oocytes. LS:
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 15/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 15/95
9/55 síndrome de Leigh; MELAS: encefalomiopatia mitocondrial com acidose lática e episódios tipo acidente vascular cerebral, teste t, ns = não significativo (p > 0,05).9/55 Leigh syndrome; MELAS: mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes, t test, ns = not significant (p> 0.05).
[043]A Figura 8A é um conjunto de gráficos que mostram o desenvolvimento do embrião ST após várias manipulações experimentais. Resultados de desenvolvimento similares foram observados entre os grupos, exceto a taxa de fertilização normal, que foi significativamente menor nos grupos ST congelados (p < 0,05). Combinações = mistura de diferentes haplótipos de mtDNA entre o carioplasto e o citoplasto; Controle intacto = não manipulado, somente ICSI.[043] Figure 8A is a set of graphs showing the development of the ST embryo after several experimental manipulations. Similar developmental results were observed between the groups, except for the normal fertilization rate, which was significantly lower in the frozen ST groups (p <0.05). Combinations = mixture of different mtDNA haplotypes between the karyoplast and the cytoplasm; Control intact = not manipulated, only ICSI.
[044]A Figura 8B é um conjunto de gráficos que mostra que os embriões ST portadores de diferentes tipos de mutação apresentaram um padrão de desenvolvimento similar.[044] Figure 8B is a set of graphs showing that ST embryos carrying different types of mutations showed a similar pattern of development.
[045]A Figura 8C é um conjunto de gráficos que mostra o desenvolvimento do embrião ST como uma função das distâncias de correspondência do mtDNA do doador. Os números no topo das barras são porcentagem (%) do desenvolvimento embrionário. N = o número de embriões, ns = não significativo (p > 0,05).[045] Figure 8C is a set of graphs showing the development of the ST embryo as a function of the donor's mtDNA matching distances. The numbers at the top of the bars are percent (%) of embryonic development. N = the number of embryos, ns = not significant (p> 0.05).
[046]A Figura 8D é um conjunto de gráficos de NPCs derivados de ST ESCs com diferenças de 6 e 49 SNP em taxas de consumo de oxigênio (OCR) exibidas de mtDNA do doador similares aos controles não manipulados. No entanto, NPCs com 33 SN Ps mostraram OCR significativa reduzida em comparação a controles ou com mtDNA de doador ou materno (p < 0,05). O ensaio de cavalos-marinhos foi repetido 3 vezes diferentes com 6 a 18 repetições de cada vez. Ver também a Figura 13A. NPCs = células progenitoras neurais. SNPs = polimorfismos de nucleotídeo único, teste t ou ANOVA Unidirecional.[046] Figure 8D is a set of graphs of NPCs derived from ST ESCs with differences of 6 and 49 SNP in oxygen consumption rates (OCR) displayed from donor mtDNA similar to unhandled controls. However, NPCs with 33 SN Ps showed significantly reduced OCR compared to controls or donor or maternal mtDNA (p <0.05). The seahorse test was repeated 3 different times with 6 to 18 repetitions each time. See also Figure 13A. NPCs = neural progenitor cells. SNPs = single nucleotide polymorphisms, t-test or Unidirectional ANOVA.
[047]A Figura 9A é uma imagem de um gel mostrando polimorfismo na região CSBII do mtDNA do doador que resulta em uma eficiência reduzida de geração de iniciadores de replicação por RNA-polimerase mitocondrial. O polimorfismo 311315CCCCC é um encurtamento do primeiro alongamento G na região G-quadruplex[047] Figure 9A is an image of a gel showing polymorphism in the CSBII region of the donor mtDNA that results in reduced efficiency in generating mitochondrial RNA polymerase primers. The 311315CCCCC polymorphism is a shortening of the first G elongation in the G-quadruplex region
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 16/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 16/95
10/55 do mtDNA (alongamento G5 vs. G6), responsável pela terminação da transcrição e geração de iniciador de replicação em mitocôndrias humanas.10/55 of mtDNA (stretching G5 vs. G6), responsible for the termination of transcription and generation of replication primer in human mitochondria.
[048]A Figura 9B é um gráfico mostrando taxas de heteroplasmia para o mtDNA materno (haplótipo H49) aumentadas gradualmente durante a cultura estendida in vitro de 3243ST-ES1 e atingiu homoplasmia.[048] Figure 9B is a graph showing rates of heteroplasm for maternal mtDNA (haplotype H49) gradually increased during the extended in vitro culture of 3243ST-ES1 and reached homoplasm.
[049]A Figura 9C é um gráfico que mostra que os níveis de heteroplasmia também aumentaram durante a subcultura de colônia ESC única.[049] Figure 9C is a graph showing that the levels of heteroplasm also increased during the single ESC colony subculture.
[050]A Figura 9D é um gráfico que mostra a manutenção da heteroplasmia estável na progênie de células cultivadas individualmente.[050] Figure 9D is a graph showing maintenance of stable heteroplasm in the progeny of individually cultured cells.
[051 ]A Figura 9E é um gráfico que mostra taxas mais rápidas de crescimento e proliferação celular em clones contendo maior heteroplasmia de mtDNA materno.[051] Figure 9E is a graph showing faster rates of cell growth and proliferation in clones containing greater maternal mtDNA heteroplasm.
[052]A Figura 9F é um conjunto de três gráficos que mostram alterações da heteroplasmia do mtDNA materno em linhagens celulares 3243ST-ES1, ST-ES7 e NTES8 reversas durante a diferenciação in vitro e in vivo. ANOVA Unidirecional. Média ±SD.[052] Figure 9F is a set of three graphs showing changes in maternal mtDNA heteroplasm in reverse 3243ST-ES1, ST-ES7 and NTES8 cell lines during differentiation in vitro and in vivo. Unidirectional ANOVA. Mean ± SD.
[053]A Figura 10A é uma tabela que mostra famílias com doença mitocondrial e mulheres em idade reprodutiva recrutadas para MRT. Todas as famílias LS tinham uma criança gravemente afetada. F, família; não-sin, não sinônimo; n/a, não aplicável.[053] Figure 10A is a table showing families with mitochondrial disease and women of reproductive age recruited for MRT. All LS families had a severely affected child. F, family; non-sin, not synonymous; n / a, not applicable.
[054]A Figura 10B mostra que a Família 5 foi selecionada a partir de uma genealogia de síndrome MELAS extensiva. Os fenótipos clínicos da síndrome MELAS A3243G variaram mesmo com níveis similares de heteroplasmia. Quadrados, machos vs. Círculos, fêmeas; B = sangue e U = urina, n/t, não testado. *, o primeiro paciente MELAS diagnosticado clinicamente. Heteroplasmia no sangue (superior) e na urina (inferior).[054] Figure 10B shows that Family 5 was selected from an extensive MELAS syndrome genealogy. The clinical phenotypes of MELAS A3243G syndrome varied even with similar levels of heteroplasm. Squares, males vs. Circles, females; B = blood and U = urine, n / t, not tested. *, the first MELAS patient clinically diagnosed. Heteroplasmia in the blood (upper) and urine (lower).
[055]A Figura 11A é um gráfico que mostra que a idade dos doadores de oócitos foi similar entre os grupos de portadores e saudáveis.[055] Figure 11A is a graph showing that the age of the oocyte donors was similar between the carrier and healthy groups.
[056]A Figura 11B é um gráfico que mostra que a reserva ovariana foi[056] Figure 11B is a graph showing that the ovarian reserve has been
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 17/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 17/95
11/55 significativamente inferior nos doadores portadores em relação aos doadores de oócitos saudáveis.11/55 significantly lower in carrier donors compared to healthy oocyte donors.
[057]A Figura 11C é um gráfico que mostra que a contagem de folículos antrais (AFC) foi significativamente menor nos doadores portadores em relação aos doadores de oócitos saudáveis.[057] Figure 11C is a graph showing that the count of antral follicles (AFC) was significantly lower in donor carriers compared to donors of healthy oocytes.
[058]A Figura 11D é um gráfico que mostra que a duração de COS foi maior nos portadores.[058] Figure 11D is a graph showing that the duration of COS was longer in patients.
[059]A Figura 11E é um gráfico que mostra que o pico de estradiol (E2) no dia de hCG tendeu a reduzir nos portadores.[059] Figure 11E is a graph showing that the peak of estradiol (E2) on hCG day tended to decrease in carriers.
[060]A Figura 11F é um gráfico que mostra que o rendimento total de oócitos foi significativamente menor em portadores do que os doadores de oócitos saudáveis.[060] Figure 11F is a graph showing that total oocyte yield was significantly lower in carriers than healthy oocyte donors.
[061 ]A Figura 11G é um gráfico que mostra que o número de oócitos maduros foi significativamente menor nos doadores portadores do que nos doadores de oócitos saudáveis.[061] Figure 11G is a graph showing that the number of mature oocytes was significantly lower in carrier donors than in healthy oocyte donors.
[062]A Figura 11H é uma tabela de características basais e resultados de ciclo. Portadores tiveram maior IMC e menores níveis de AMH. Os menores níveis de pico de estradiol foram medidos em cED1 e cED2. Método de controle de natalidade: contraceptive oral combinado. Medroxiprogesterona.[062] Figure 11H is a table of baseline characteristics and cycle results. Patients had a higher BMI and lower levels of AMH. The lowest peak levels of estradiol were measured in cED1 and cED2. Birth control method: combined oral contraceptive. Medroxyprogesterone.
[063]A Figura 111 é um conjunto de dois gráficos de pizza mostrando a análise de variantes de mtDNA heteroplásmicas detectadas em oócitos Mil. De novo indica mutações únicas encontradas em oócitos individuais; hereditária significa mutações compartilhadas com outros oócitos, irmãos ou doadores de óvulos, n = número de mutações em oócitos individuais.[063] Figure 111 is a set of two pie charts showing the analysis of heteroplastic mtDNA variants detected in Mil oocytes. Again, it indicates unique mutations found in individual oocytes; hereditary means mutations shared with other oocytes, siblings or egg donors, n = number of mutations in individual oocytes.
[064]A Figura 11J é um conjunto de dois gráficos que mostram que os níveis de AMH, uma medida da reserva ovariana, não estavam correlacionados com o número de cópias do mtDNA. n = o número de oócitos. ns = não significativo.[064] Figure 11J is a set of two graphs that show that AMH levels, a measure of ovarian reserve, were not correlated with mtDNA copy number. n = the number of oocytes. ns = not significant.
[065]A Figura 12A é uma tabela que mostra os resultados do sequenciamento[065] Figure 12A is a table showing the results of the sequencing
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 18/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 18/95
12/55 de mtDNA integral realizado para identificar haplótipos de todos os doadores de óvulos e ST foi realizado para combinar vários haplótipos. Cyto, citoplasto; Karyo, carioplasto.12/55 of integral mtDNA performed to identify haplotypes from all egg donors and ST was performed to combine several haplotypes. Cyto, cytoplasm; Karyo, carioplasto.
[066]A Figura 12B é um conjunto de imagens que mostram a fertilização normal (2PN, esquerda) e fertilização anormal (1 ou 3 PN). Ver as setas.[066] Figure 12B is a set of images showing normal fertilization (2PN, left) and abnormal fertilization (1 or 3 PN). See the arrows.
[067]A Figura 12C é uma tabela que mostra que o portador ST apresentou maior fertilização anormal que os controles. Um zigoto de 3 PN do grupo controle ST evoluiu para um blastocisto e exibiu um cariótipo 69, XXY. * p < 0,05.[067] Figure 12C is a table showing that the ST carrier showed greater abnormal fertilization than the controls. A 3 PN zygote in the ST control group evolved into a blastocyst and exhibited a 69, XXY karyotype. * p <0.05.
[068]A Figura 12D é uma tabela que mostra que a taxa de blastulação era similar entre citoplasma vitrificado com fusos frescos e fusos vitrificados com citoplasma fresco (p > 0,05).[068] Figure 12D is a table showing that the rate of blastulation was similar between cytoplasm vitrified with fresh spindles and spindles vitrified with fresh cytoplasm (p> 0.05).
[069]A Figura 12E é um conjunto de gráficos que mostram o desenvolvimento do embrião com DNA mitocondrial de diferentes doadores.[069] Figure 12E is a set of graphs showing the development of the embryo with mitochondrial DNA from different donors.
[070]A Figura 13A é um conjunto de 15 gráficos que mostram os resultados em que o metabolismo energético (OCR / ECAR) foi medido e comparado entre células progenitoras neurais (NPCs) derivadas de MRT e embriões de controle portadores ou de mtDNA de doador ou de mtDNA materno. OCR = taxa de consumo de oxigênio (representando OXPHOS), ECAR = taxa de acidificação extracelular (representando a glicólise). NPCs de MRT ESCs com 6 e 49 diferenças de SNP apresentaram OCR comparável para NPCs portadores de mtDNA materno ou de mtDNA de doador, exceto a respiração máxima em grupo de 49 SNP. OCR foi reduzido em NPCs com 33 SNPs. Os dados de OCR foram normalizados pelo teor de DNA de células vivas. * vs. mtDNA de hospedeiro, ** vs. mtDNA de doador, *** vs. ST (p < 0,05, teste t ou ANOVA Unidirecional, n = 16-18 réplicas técnicas). Média ± SEM.[070] Figure 13A is a set of 15 graphs showing the results in which energy metabolism (OCR / ECAR) was measured and compared between MRT-derived neural progenitor cells (NPCs) and donor or mtDNA control embryos or maternal mtDNA. OCR = oxygen consumption rate (representing OXPHOS), ECAR = extracellular acidification rate (representing glycolysis). MRT NPCs ESCs with 6 and 49 SNP differences showed OCR comparable to NPCs with maternal mtDNA or donor mtDNA, except for maximum group breathing of 49 SNP. OCR has been reduced on NPCs with 33 SNPs. OCR data was normalized by the DNA content of living cells. * vs. host mtDNA, ** vs. donor mtDNA, *** vs. ST (p <0.05, t test or Unidirectional ANOVA, n = 16-18 technical replicates). Mean ± SEM.
[071 ]A Figura 13B é um conjunto de gráficos que mostram a atividade enzimática da cadeia respiratória mitocondrial em células diferenciadas de ST-ESCs. Atividades do complexo mitocondrial I e IV em células diferenciadas de ST-ESCs[071] Figure 13B is a set of graphs showing the enzymatic activity of the mitochondrial respiratory chain in cells differentiated from ST-ESCs. Mitochondrial complex activities I and IV in differentiated cells of ST-ESCs
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 19/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 19/95
13/55 portadoras de mtDNA do doador com 49 diferenças de SNP foram comparáveis aos controles ou com mtDNA de doador ou mtDNA materno.13/55 donor mtDNA carriers with 49 differences in SNP were comparable to controls or donor mtDNA or maternal mtDNA.
[072]A Figura 14A é uma tabela que mostra um resumo da diferenciação in vitro e in vivo de ESCs derivados de embriões ST ou SCNT portadores de mtDNA de doador. De forma similar ao controle de IVF-ESCs, todos os MRT ESCs testados produziram tumores de teratoma in vivo e formaram células progenitoras neurais (NPCs) e cardiomiócitos in vitro.[072] Figure 14A is a table showing a summary of the in vitro and in vivo differentiation of ESCs derived from ST or SCNT embryos carrying donor mtDNA. Similar to the control of IVF-ESCs, all MRT ESCs tested produced teratoma tumors in vivo and formed neural progenitor cells (NPCs) and cardiomyocytes in vitro.
[073]A Figura 14B é uma análise histológica de tecidos diferenciados a partir de MRT-ESCs. Os tecidos representativos foram coletados e utilizados para análise de transporte de mtDNA e medições da função mitocondrial.[073] Figure 14B is a histological analysis of tissues differentiated from MRT-ESCs. Representative tissues were collected and used for mtDNA transport analysis and measurements of mitochondrial function.
[074]A Figura 15A é um gráfico e uma tabela que mostram que a taxa de aneuploidia em blastocistos, determinada por arranjo CGH, não foi significativamente diferente nos grupos ST em comparação com o controle.[074] Figure 15A is a graph and table showing that the rate of aneuploidy in blastocysts, determined by the CGH arrangement, was not significantly different in the ST groups compared to the control.
[075]A Figura 15B é um gráfico e uma tabela que mostram que uma taxa de anormalidade de Cariótipo em ESCs determinada por análise de bandas G também foi comparável entre os grupos ST. Barras = média ± s.d. Número dentro das barras = o número de blastocistos ou linhas ESC. Testes simples de χ2.[075] Figure 15B is a graph and table showing that a rate of Karyotype abnormality in ESCs determined by G-band analysis was also comparable between the ST groups. Bars = mean ± s.d. Number inside bars = the number of blastocysts or ESC lines. Simple χ2 tests.
[076]A Figura 16A é um conjunto de dois gráficos que mostram que a heteroplasmia do mtDNA materno (haplótipo X2c) aumentou durante o cultivo in vitro prolongado e atingiu a homoplasmia em culturas agrupadas ou em subculturas de colônias individuais.[076] Figure 16A is a set of two graphs showing that the heteroplasm of maternal mtDNA (haplotype X2c) increased during prolonged in vitro culture and reached homoplasm in clustered cultures or in subcultures of individual colonies.
[077]A Figura 16B é um conjunto de dois gráficos que mostram que as atividades enzimáticas do complexo da cadeia respiratória 1 (COM I) e do complexo 4 (COM IV) foram medidas em fibroblastos que transportam vários haplótipos de mtDNA humano utilizados neste estudo. Não foram observadas diferenças significativas.[077] Figure 16B is a set of two graphs that show that the enzymatic activities of the respiratory chain 1 (COM I) and complex 4 (COM IV) enzymes were measured in fibroblasts carrying several human mtDNA haplotypes used in this study . No significant differences were observed.
[078]A Figura 17 é uma tabela que resume o arranjo CGH em blastocistos[078] Figure 17 is a table that summarizes the CGH arrangement in blastocysts
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 20/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 20/95
14/55 intactos e ST.14/55 intact and ST.
[079]A Figura 18 é uma tabela que resume as bandas G de linhas ESC derivadas de blastocistos de controle e ST.[079] Figure 18 is a table that summarizes the G bands of ESC lines derived from control and ST blastocysts.
DESCRIÇÃO DETALHADA [080]É aqui fornecido um método para gerar um oócito humano viável, o método compreendendo as etapas de:DETAILED DESCRIPTION [080] Here is provided a method for generating a viable human oocyte, the method comprising the steps of:
a) enuclear um primeiro oócito no estágio Mil, criando assim um citoplasto;a) enuclear a first oocyte in the Mil stage, thus creating a cytoplasm;
b) isolar um corpo polar a partir de um segundo oócito por aspiração; eb) isolating a polar body from a second oocyte by aspiration; and
c) colocar o corpo polar no espaço perivitelino, fundindo assim o corpo polar com o citoplasto e gerando o oócito humano viável.c) placing the polar body in the perivitelline space, thus merging the polar body with the cytoplasm and generating the viable human oocyte.
[081 ]Em outras modalidades, os métodos aqui incluídos envolvendo transplante de corpo polar compreendem ainda uma etapa de fertilizar o oócito humano viável via fertilização in vitro, criando assim um embrião. Em outras modalidades, o método compreende ainda implantar o embrião em um revestimento uterino endometrial receptivo.[081] In other modalities, the methods included here involving polar body transplantation further comprise a stage of fertilizing the viable human oocyte via in vitro fertilization, thus creating an embryo. In other modalities, the method also involves implanting the embryo in a receptive endometrial uterine lining.
[082]Em outras modalidades dos métodos, a enucleação do primeiro oócito é realizada em um meio compreendendo ao menos 10% de fluido tubário humano, tampão HEPES e citocalasina B. Em outras modalidades, a etapa de enucleação é completada utilizando um Sistema de Imagiologia de Microscópio de Polarização.[082] In other modalities of the methods, the enucleation of the first oocyte is carried out in a medium comprising at least 10% of human tubal fluid, HEPES buffer and cytochalasin B. In other modalities, the enucleation step is completed using an Imaging System Polarization Microscope.
[083]Ainda em outras modalidades, a etapa do método de isolar o corpo polar é realizada em um meio compreendendo ao menos 10% de fluido tubário humano, tampão HEPES, citocalasina B e fusão com citoplasto de doador induzido com extrato de HVJ-E.[083] In yet other modalities, the method step of isolating the polar body is carried out in a medium comprising at least 10% of human tubal fluid, HEPES buffer, cytochalasin B and fusion with donor cytoplasm induced with HVJ-E extract .
[084]Em outras modalidades, a zona pelúcida é aberta por meio de métodos selecionados a partir de corte de zona, perfuração a laser (tal como com um laser de nitrogênio compacto) e perfuração ácida (como com meio ácido de Tyrode).[084] In other modalities, the pellucid zone is opened using methods selected from zone cutting, laser drilling (such as with a compact nitrogen laser) and acid drilling (such as with Tyrode's acidic medium).
[085]É também fornecido um método para produzir um oócito humano in vitro,[085] A method for producing a human oocyte in vitro is also provided,
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 21/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 21/95
15/55 compreendendo:15/55 comprising:
a) determinar uma sequência de DNA mitocondrial da caixa de sequência II conservada de um oócito do doador;a) determine a mitochondrial DNA sequence from the conserved sequence II box of a donor oocyte;
b) enuclear o oócito do doador enquanto o oócito do doador está preso na metáfase II, isolando assim o material genético nuclear do doador;b) enuclear the donor's oocyte while the donor's oocyte is trapped in metaphase II, thus isolating the donor's nuclear genetic material;
c) introduzir o material genético nuclear do doador em um oócito do receptor enucleado, desde que o DNA mitocondrial do oócito do doador tenha o mesmo genótipo da caixa de sequência II conservada que o oócito do receptor.c) introducing the donor's nuclear genetic material into an enucleated recipient's oocyte, provided that the donor's oocyte's mitochondrial DNA has the same conserved sequence II genotype as the recipient's oocyte.
[086]Em algumas modalidades, o método imediatamente acima é realizado quando o oócito do doador e o oócito do receptor têm ambos o genótipo G5A8 ou ambos têm o genótipo G6A8. Ainda em outras modalidades do método, o DNA mitocondrial do oócito do doador compreende uma mutação que resulta em uma doença mitocondrial, incluindo mas não limitada à Síndrome de Leigh ou MELAS.[086] In some embodiments, the method immediately above is performed when the donor oocyte and the recipient oocyte both have the G5A8 genotype or both have the G6A8 genotype. In yet other modalities of the method, the mitochondrial DNA of the donor oocyte comprises a mutation that results in a mitochondrial disease, including but not limited to Leigh's Syndrome or MELAS.
[087]Também é fornecido um método de produzir um oócito humano in vitro, o oócito humano produzido compreendendo DNA mitocondrial materno mínimo e o método compreendendo as etapas de:[087] Also provided is a method of producing a human oocyte in vitro, the human oocyte produced comprising minimal maternal mitochondrial DNA and the method comprising the steps of:
a) determinar a sequência da região não codificante principal do DNA mitocondrial de um oócito do doador, em que a sequência principal da região não codificante inclui uma região de D-loop;a) determining the sequence of the main non-coding region of the mitochondrial DNA of a donor oocyte, wherein the main sequence of the non-coding region includes a D-loop region;
b) enuclear o oócito do doador enquanto o oócito do doador está preso na metáfase II, isolando assim o material genético nuclear do doador; eb) enuclear the donor's oocyte while the donor's oocyte is trapped in metaphase II, thus isolating the donor's nuclear genetic material; and
c) introduzir o material genético nuclear do doador em um oócito do receptor, desde que o DNA mitocondrial do oócito do doador tenha a mesma sequência da região não codificante principal do oócito do receptor.c) introduce the donor's nuclear genetic material into a recipient's oocyte, provided that the donor's oocyte's mitochondrial DNA has the same sequence as the main non-coding region of the recipient's oocyte.
[088]Em modalidades adicionais do método imediatamente acima, o oócito do doador e o oócito do receptor têm ambos o haplótipo de mtDNA H56, H1b, U5a, F1a, X2c, D4a, H49 ou B2k. Em outras modalidades, o DNA mitocondrial a partir do oócito[088] In additional modalities of the method immediately above, the donor oocyte and the recipient oocyte both have the mtDNA H56, H1b, U5a, F1a, X2c, D4a, H49 or B2k haplotype. In other modalities, mitochondrial DNA from the oocyte
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 22/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 22/95
16/55 do doador compreende uma mutação que resulta em uma doença mitocondrial, tal como Síndrome de Leigh ou MELAS.16/55 of the donor comprises a mutation that results in a mitochondrial disease, such as Leigh's syndrome or MELAS.
[089]Outras doenças mitocondriais para as quais a utilização dos presentes métodos pode ser considerada incluem, mas não estão limitadas à possível ocorrência de miopatia mitocondrial; diabetes mellitus e surdez; poliodistrofia infantil progressiva (doença de Alpers); neuropatia óptica hereditária de Leber; Síndrome de Barth / Cardiomiopatia Letal Infantil (LIC); neuropatia, ataxia, retinite pigmentosa, e ptose (NARP); encefalopatia gastrointestinal mioneurogênica (MNGIE); deficiência de carnitina-acil-carnitina; deficiência de carnitina; síndromes de deficiência de creatina; deficiência de co-enzima Q10; deficiência do complexo I; deficiência do complexo II; deficiência do complexo III; deficiência de complexo IV / deficiência de COX; deficiência do complexo V; epilepsia mioclônica com fibras vermelhas irregulares (MERRF); miopatia mitocondrial, encefalomiopatia, acidose lática, sintomas similares a AVC (MELAS); depleção de mtDNA; Síndrome de Oftalmoplegia Externa Progressiva Crônica (CPEO); deficiência de CPT I; deficiência de CPT II; Síndrome de Kearns-Sayre (KSS); acidose lática; LBSL-Leucodistrofia; deficiência de Acil-CoA Desidrogenase de Cadeia Longa (LCAD); LCHAD; Doença de Luft; Deficiência múltipla de Acil-CoA Desidrogenase; Deficiência de Acil-CoA Desidrogenase de Cadeia Curta; Deficiência de Acil-CoA Desidrogenase de Cadeia Média; Deficiência de Acil-CoA Desidrogenase de Cadeia Muito Longa; Encefalomiopatia Mitocondrial Acidose Lática e Episódios tipo Acidente Vascular Cerebral (MELAS); Síndrome de Ataxia Recessiva Mitocondrial; Citapatia Mitocondrial; Depleção de DNA mitocondrial; encefalopatia mitocondrial; Transtorno e Encefalopatia Mioneurogastrointestinal; Síndrome de Pearson; deficiência de Piruvato Carboxilase; deficiência de piruvato desidrogenase; e Mutações de POLG2.[089] Other mitochondrial diseases for which the use of the present methods can be considered include, but are not limited to, the possible occurrence of mitochondrial myopathy; diabetes mellitus and deafness; progressive childhood polyiodistrophy (Alpers disease); Leber's hereditary optic neuropathy; Barth Syndrome / Infantile Lethal Cardiomyopathy (SCI); neuropathy, ataxia, retinitis pigmentosa, and ptosis (NARP); myioneurogenic gastrointestinal encephalopathy (MNGIE); carnitine-acyl-carnitine deficiency; carnitine deficiency; creatine deficiency syndromes; co-enzyme deficiency Q10; complex I deficiency; complex II deficiency; complex III deficiency; complex IV deficiency / COX deficiency; complex V deficiency; myoclonic epilepsy with irregular red fibers (MERRF); mitochondrial myopathy, encephalomyopathy, lactic acidosis, stroke-like symptoms (MELAS); depletion of mtDNA; Chronic Progressive External Ophthalmoplegia Syndrome (CPEO); CPT I deficiency; CPT II deficiency; Kearns-Sayre syndrome (KSS); lactic acidosis; LBSL-Leukodystrophy; Long-chain Acyl-CoA dehydrogenase (LCAD) deficiency; LCHAD; Luft's disease; Multiple deficiency of Acyl-CoA Dehydrogenase; Short Chain Acyl-CoA Dehydrogenase Deficiency; Deficiency of Medium Chain Acyl-CoA Dehydrogenase; Acyl-CoA Deficiency Very Long Chain Dehydrogenase; Mitochondrial Encephalomyopathy Lactic Acidosis and Stroke-like Episodes (MELAS); Mitochondrial Recessive Ataxia Syndrome; Mitochondrial Cytopathy; Depletion of mitochondrial DNA; mitochondrial encephalopathy; Mioneurogastrointestinal Disorder and Encephalopathy; Pearson's syndrome; pyruvate carboxylase deficiency; pyruvate dehydrogenase deficiency; and POLG2 mutations.
Definições [090]0 termo “corpo polar” refere-se a células haploides, significativamenteDefinitions [090] The term “polar body” refers to haploid cells, significantly
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 23/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 23/95
17/55 menores que um oócito que é formado em conjunto com um oócito durante a oogênese. Em particular, os corpos polares incluem a metade do conjunto cromossômico diploide não incluído no oócito após a divisão meiótica. Os corpos polares compreendem polinucleotídeos (por exemplo, DNA) que codificam a informação sobre o indivíduo. O material genético nuclear inclui, mas não está limitado a cromossomos e cromatina. O termo inclui material genético nuclear produzido por divisão celular meiótica, tal como a divisão ou uma célula diploide, a um oócito haploide. Assim, uma célula inclui material genético nuclear derivado de um corpo polar de doador se o corpo polar tiver sido transferido para um citoplasto enucleado via transferência nuclear de célula somática.17/55 smaller than an oocyte that is formed together with an oocyte during oogenesis. In particular, the polar bodies include half of the diploid chromosome set not included in the oocyte after meiotic division. Polar bodies comprise polynucleotides (for example, DNA) that encode information about the individual. Nuclear genetic material includes, but is not limited to, chromosomes and chromatin. The term includes nuclear genetic material produced by meiotic cell division, such as division or a diploid cell, to a haploid oocyte. Thus, a cell includes nuclear genetic material derived from a donor polar body if the polar body has been transferred to an enucleated cytoplasm via somatic cell nuclear transfer.
[091 ]O termo “oócito” refere-se a um gameta feminino ou célula germinativa envolvida na reprodução, também chamada de óvulo. Um oócito maduro é uma célula haploide com um único conjunto de cromossomos maternos (23, X em um primata humano) e é interrompido na metáfase II. Um oócito “híbrido” tem o citoplasma de um primeiro oócito de primata (denominado “receptor”), mas não tem o material genético nuclear do receptor; ele tem o material genético nuclear de outro oócito ou de um corpo polar e é denominado oócito do “doador”.[091] The term "oocyte" refers to a female gamete or germ cell involved in reproduction, also called an egg. A mature oocyte is a haploid cell with a single set of maternal chromosomes (23, X in a human primate) and is disrupted at metaphase II. A "hybrid" oocyte has the cytoplasm of a first primate oocyte (called a "receptor"), but does not have the nuclear genetic material of the receptor; it has nuclear genetic material from another oocyte or a polar body and is called the "donor" oocyte.
[092]Meiose é um processo de divisão redutora no qual o número de cromossomos por célula é reduzido pela metade. Nos animais, a meiose sempre resulta na formação de gametas. Durante a meiose, o genoma de uma célula germinativa diploide, que é composta de longos segmentos de DNA empacotados em cromossomos, sofre replicação de DNA seguida de dois ciclos de divisão, resultando em quatro células haploides. Cada uma dessas células contém um conjunto completo de cromossomos, ou metade do conteúdo genético da célula original. A meiose I separa cromossomos homólogos, produzindo duas células haploides (23 cromossomos, N em humanos), então a meiose I é chamada de uma divisão redutora. Uma célula humana diploide regular contém 46 cromossomos e é considerada 2N[092] Meiosis is a process of reducing division in which the number of chromosomes per cell is reduced by half. In animals, meiosis always results in the formation of gametes. During meiosis, the genome of a diploid germ cell, which is composed of long segments of DNA packed into chromosomes, undergoes DNA replication followed by two cycles of division, resulting in four haploid cells. Each of these cells contains a complete set of chromosomes, or half the genetic content of the original cell. Meiosis I separates homologous chromosomes, producing two haploid cells (23 chromosomes, N in humans), so meiosis I is called a reducing division. A regular diploid human cell contains 46 chromosomes and is considered 2N
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 24/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 24/95
18/55 porque contém 23 pares de cromossomos homólogos. No entanto, após a meiose I, embora a célula contenha 46 cromossomos, ela é considerada apenas N, porque mais tarde, na anáfase I, as cromátides irmãs permanecerão juntas enquanto o fuso puxa o par em direção ao polo da nova célula. Na meiose II, ocorre uma divisão equacionai similar à mitose, por meio da qual as cromátides irmãs são finalmente separadas, criando um total de 4 células haploides (23 cromossomos, N) por célula-filha a partir da primeira divisão.18/55 because it contains 23 pairs of homologous chromosomes. However, after meiosis I, although the cell contains 46 chromosomes, it is considered only N, because later, in anaphase I, the sister chromatids will remain together as the spindle pulls the pair towards the pole of the new cell. In meiosis II, an equational division similar to mitosis occurs, whereby the sister chromatids are finally separated, creating a total of 4 haploid cells (23 chromosomes, N) per daughter cell from the first division.
[093]Um “fuso meiótico” é uma estrutura que separa os cromossomos em células filhas durante a divisão celular meiótica. Ele faz parte do citoesqueleto em células eucarióticas. O aparelho de fuso inclui os microtúbulos do fuso, proteínas associadas, e quaisquer centrossomas ou asters presentes nos polos do fuso. O aparelho do fuso tem uma forma vagamente elipsoide e afunila nas extremidades, mas se espalha no meio. Na porção média ampla, conhecida como fuso-mediano, os microtúbulos antiparalelos são agrupados por cinesinas. Nas extremidades pontiagudas, conhecidas como polos fusiformes, os microtúbulos são nucleados pelos centrossomas na maioria das células animais.[093] A "meiotic spindle" is a structure that separates chromosomes into daughter cells during meiotic cell division. It is part of the cytoskeleton in eukaryotic cells. The spindle apparatus includes the spindle microtubules, associated proteins, and any centrosomes or asters present in the spindle poles. The spindle apparatus is vaguely ellipsoid in shape and tapers at the ends, but spreads in the middle. In the broad medium portion, known as the median spindle, the antiparallel microtubules are grouped by kinesins. At the pointed ends, known as spindle poles, microtubules are nucleated by centrosomes in most animal cells.
[094]O termo “DNA mitocondrial” ou “mtDNA” refere-se ao DNA da mitocôndria, uma estrutura situada no citoplasma da célula e não no núcleo (onde todos os outros cromossomos estão localizados). In vivo, todo o mtDNA é herdado da mãe. Existem 2 a 10 cópias do genoma do mtDNA em cada mitocôndria. O DNA mitocondrial é uma molécula circular de fita dupla. Ele é muito pequeno em relação aos cromossomos do núcleo e inclui apenas um número limitado de genes, como aqueles que codificam várias subunidades do complexo mitocondrial da cadeia respiratória e os genes de alguns RNAs ribossômicos e RNAs de transferência. Uma célula inclui o mtDNA derivado da mitocôndria baseada na replicação citoplasmicamente continuada, que no caso da transferência do corpo polar é baseada no citoplasto do receptor.[094] The term "mitochondrial DNA" or "mtDNA" refers to the DNA of the mitochondria, a structure located in the cell's cytoplasm and not in the nucleus (where all other chromosomes are located). In vivo, all mtDNA is inherited from the mother. There are 2 to 10 copies of the mtDNA genome in each mitochondria. Mitochondrial DNA is a circular double-stranded molecule. It is very small in relation to the chromosomes of the nucleus and includes only a limited number of genes, such as those that encode several subunits of the respiratory chain mitochondrial complex and the genes of some ribosomal RNAs and transfer RNAs. One cell includes mtDNA derived from mitochondria based on cytoplasmic continuation replication, which in the case of polar body transfer is based on the cytoplasm of the receptor.
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 25/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 25/95
19/55 [095]O termo “metilação do DNA” refere-se à adição pós-sintética de grupos metila a sítios específicos em moléculas de DNA; a reação é catalisada por enzimas chamadas DNA metiltransferases que são específicas para nucleotídeos e posição de metilação. Em eucariotas, a metilação está envolvida na expressão gênica, e desempenha um papel em uma variedade de mecanismos epigenéticos, incluindo o desenvolvimento, a inativação do cromossomo X, a impressão genômica, a mutabilidade do DNA, e o crescimento celular descontrolado no câncer.19/55 [095] The term “DNA methylation” refers to the post-synthetic addition of methyl groups to specific sites on DNA molecules; the reaction is catalyzed by enzymes called DNA methyltransferases that are specific for nucleotides and methylation position. In eukaryotes, methylation is involved in gene expression, and plays a role in a variety of epigenetic mechanisms, including X chromosome development, inactivation, genomic printing, DNA mutability, and uncontrolled cell growth in cancer.
[096]O termo “inativação do cromossomo X” refere-se à inativação de um de cada par de cromossomos X para formar o corpo de Barr em células somáticas de mamíferos fêmeas. Assim, os tecidos cujo zigoto original continha genes heterozigóticos que transportam X deveríam ter células individuais expressando um ou outro, mas não ambos, dos produtos gênicos codificados por X. Acredita-se que a inativação ocorra no início do desenvolvimento e leve ao mosaicismo de expressão desses genes no corpo.[096] The term "X chromosome inactivation" refers to the inactivation of one of each pair of X chromosomes to form Barr's body in female mammalian somatic cells. Thus, tissues whose original zygote contained heterozygous genes that carry X should have individual cells expressing one or the other, but not both, of the gene products encoded by X. Inactivation is believed to occur early in development and lead to expression mosaicism of these genes in the body.
[097]A frase “compensação de dosagem” refere-se a um mecanismo que detecta a dosagem de genes e regula a expressão consequentemente. Em mamíferos, há expressão monoalélica de genes ligados ao X que diferem em dose entre fêmeas (XX) e machos (XY). “XIST” refere-se a um gene que codifica um RNA não codificante grande que demonstrou ser necessário para o silenciamento do cromossomo X regulado pelo desenvolvimento em fêmeas. O XIST RNA tem aproximadamente 18 kb e não é traduzido, ele é spliced, e poliadenilado. Ele também é organizado em blocos de sequência repetitiva. In vivo, o XIST RNA revela-se associado de forma estável com o cromossomo X silenciado. A expressão do XIST RNA é sempre limitada por cis, e está associada ao cromossomo X silenciado nas fêmeas.[097] The phrase “dosage compensation” refers to a mechanism that detects the dosage of genes and regulates expression accordingly. In mammals, there is monoallelic expression of X-linked genes that differ in dose between females (XX) and males (XY). "XIST" refers to a gene that encodes a large non-coding RNA that has been shown to be necessary for silencing the X-chromosome regulated by development in females. The XIST RNA is approximately 18 kb and is not translated, it is spliced, and polyadenylated. It is also organized in repetitive sequence blocks. In vivo, XIST RNA is found to be associated with the silenced X chromosome. XIST RNA expression is always limited by cis, and is associated with the silenced X chromosome in females.
[098]O termo “quantidade eficaz” ou “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se à quantidade de agente ou célula que é suficiente para prevenir, tratar,[098] The term "effective amount" or "therapeutically effective amount" refers to the amount of agent or cell that is sufficient to prevent, treat,
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 26/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 26/95
20/55 reduzir e/ou melhorar os sintomas e/ou causas subjacentes de qualquer distúrbio ou doença, ou a quantidade de um agente suficiente para produzir um efeito desejado em uma célula. Em uma modalidade, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” é uma quantidade de uma célula ou um agente suficiente para reduzir ou eliminar um sintoma de uma doença. Em outra modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade suficiente para superar a própria doença.20/55 reduce and / or ameliorate the symptoms and / or underlying causes of any disorder or disease, or the amount of an agent sufficient to produce a desired effect in a cell. In one embodiment, a "therapeutically effective amount" is an amount of a cell or an agent sufficient to reduce or eliminate a symptom of a disease. In another embodiment, a therapeutically effective amount is an amount sufficient to overcome the disease itself.
[099]Como aqui utilizado, o termo “embrião” refere-se geralmente a uma massa celular obtida por uma ou mais divisões de um zigoto ou um oócito ativado com um núcleo artificialmente reprogramado. Uma “mórula” é o embrião pré-implantação 3-4 dias após a fertilização, quando é uma massa sólida, geralmente composta de 1232 células (blastômeros). Um “blastocisto” refere-se a um embrião pré-implantação em mamíferos placentários (aproximadamente 3 dias após a fertilização no camundongo, aproximadamente 5 dias após a fertilização em humanos) de aproximadamente 30-150 células. O estágio de blastocisto segue o estágio de mórula, e pode ser distinguido por sua morfologia única. O blastocisto é geralmente uma esfera formada por uma camada de células (o trofectoderma), uma cavidade cheia de fluido (o blastocelo ou cavidade de blastocisto), e um aglomerado de células no interior (o ICM).[099] As used herein, the term "embryo" generally refers to a cell mass obtained by one or more divisions of a zygote or an activated oocyte with an artificially reprogrammed nucleus. A "morula" is the pre-implantation embryo 3-4 days after fertilization, when it is a solid mass, usually composed of 1232 cells (blastomeres). A "blastocyst" refers to a pre-implantation embryo in placental mammals (approximately 3 days after fertilization in mice, approximately 5 days after fertilization in humans) of approximately 30-150 cells. The blastocyst stage follows the morula stage, and can be distinguished by its unique morphology. The blastocyst is usually a sphere formed by a layer of cells (the trophectoderm), a fluid-filled cavity (the blastocele or blastocyst cavity), and a cluster of cells inside (the ICM).
[0100]“Transferência nuclear” refere-se à inserção de um núcleo do corpo polar de doador em uma célula hospedeira do receptor enucleada.[0100] "Nuclear transfer" refers to the insertion of a nucleus from the donor's polar body into a host cell of the enucleated recipient.
[0101 ]A menos que seja explicado de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que o comumente entendido por um versado na técnica ao qual esta descrição pertence. Os termos singulares “um”, “uma” e “o”, ‘a” incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra “ou” deve incluir “e”, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Entende-se ainda que todos os tamanhos de base ou tamanhos de aminoácidos, e todos os pesos moleculares ou valores de massa[0101] Unless otherwise explained, all technical and scientific terms used here have the same meaning as is commonly understood by one versed in the technique to which this description belongs. The singular terms “one”, “one” and “o”, ‘a” include plural referents, unless the context clearly indicates otherwise. Likewise, the word "or" must include "and", unless the context clearly indicates otherwise. It is further understood that all base sizes or sizes of amino acids, and all molecular weights or mass values
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 27/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 27/95
21/55 molecular, dados para ácidos nucleicos ou polipeptídeos são aproximados, e são fornecidos para descrição. As quantidades que são “aproximadamente” um determinado intervalo ou valor numérico incluem o intervalo ou valor numérico exato. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou teste desta descrição, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. O termo “compreende” significa “inclui”. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência em sua totalidade. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo explicações de termos, controlará. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não são destinados a ser limitantes.21/55 molecular data for nucleic acids or polypeptides are approximate, and are provided for description. Quantities that are “approximately” a given range or numerical value include the exact range or numerical value. Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of this description, suitable methods and materials are described below. The term "comprises" means "includes". All publications, patent applications, patents and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In the event of a conflict, this specification, including explanations of terms, will control. In addition, the materials, methods and examples are illustrative only and are not intended to be limiting.
[0102]O desenvolvimento de oócitos haploides normais e competentes depende de duas divisões consecutivas de células meióticas na ausência de uma fase S de replicação de DNA intermediária (Petronczki e outros, 2003). Em mamíferos, as células germinativas primordiais formam oócitos primários que sofrem recombinação cromossômica durante o desenvolvimento fetal e então param na prófase da meiose I. A meiose é retomada, por sua vez, em oócitos primários selecionados após a puberdade, durante ciclos menstruais periódicos, levando à conclusão da primeira divisão meiótica, abstração de PB1 e formação de um oócito secundário que fica preso novamente na metáfase da meiose II. Mil recomeça após a ovulação, durante a fertilização, resultando na segregação do segundo corpo polar (PB2) e na formação de um genoma de oócito haploide (Clift D e Schuh M, Mol Cell Biol 14, 549 a 562 (2013); incorporado aqui por referência). As contribuições de DNA haploide do esperma e óvulo se misturam durante a preparação para a primeira divisão mitótica e conclusão da fertilização.[0102] The development of normal and competent haploid oocytes depends on two consecutive divisions of meiotic cells in the absence of an intermediate DNA replication S phase (Petronczki et al., 2003). In mammals, primordial germ cells form primary oocytes that undergo chromosomal recombination during fetal development and then stop at the prophase of meiosis I. Meiosis is resumed, in turn, in selected primary oocytes after puberty, during periodic menstrual cycles, leading the completion of the first meiotic division, abstraction of PB1 and formation of a secondary oocyte that gets trapped again in the metaphase of meiosis II. A thousand resumes after ovulation, during fertilization, resulting in the segregation of the second polar body (PB2) and the formation of a haploid oocyte genome (Clift D and Schuh M, Mol Cell Biol 14, 549 to 562 (2013); incorporated here by reference). The contributions of haploid DNA from the sperm and egg mix during the preparation for the first mitotic division and completion of fertilization.
[0103]Núcleos interfásicos de fibroblastos da pele transplantados em oócitos Mil humanos enucleados (citoplastos) sofrem remodelação rápida e reprogramação do ciclo celular resultando na formação de fusos presos a Mil tipo oócito (Ma H e[0103] Interphasic nuclei of skin fibroblasts transplanted into oocytes Thousand enucleated humans (cytoplasts) undergo rapid remodeling and reprogramming of the cell cycle resulting in the formation of spindles attached to Mil oocyte type (Ma H and
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 28/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 28/95
22/55 outros, Nature 511, 177 a 183 (2014); Tachibana M e outros, Cell 153, 1228 a 1238 (2013), os quais são aqui incorporados por referência). A atividade meiótica residual em citoplastos capazes de formar fusos Mil de novo é crucial para a reprogramação e subsequente desenvolvimento embrionário após transferência nuclear de células somáticas (SCNT). Como o principal objetivo do SCNT humano é produzir ESCs autólogos, os oócitos SCNT presos em Mil não são fertilizados com esperma, mas ativados artificialmente para sair da prisão meiótica, enquanto a segregação dos cromossomos durante a segunda divisão meiótica é suprimida para preservar o genoma da célula somática diploide. O potencial de reprogramação do citoplasma do oócito meiótico, como demonstrado por SCNT, sugeriu a possibilidade de produzir oócitos haploides com genomas de doadores no contexto de um tratamento para infertilidade. Estudos anteriores em camundongos demonstraram que ambos os genomas PB1 e PB2 podem ser reconstituídos por transferência para Mil compatível ou citoplasma zigótico e contribuem para o desenvolvimento de descendentes viáveis (Wakayama T e outros., J Reprod Fértil 110, 263 a 266 (1997); Wakayama T e Yanagimachi R, Biol of Reproduction 59, 100 a 104 (1998); incorporados aqui como referência). No entanto, estes estudos em murinos não foram traduzidos para outras espécies, incluindo primatas e humanos. É aqui descrita a geração de oócitos humanos haploides após a transferência de genomas PB1 para oócitos Mil enucleados e a indução de meiose II de novo após fertilização com esperma (Figura 1 A). O desenvolvimento pré-implantação de oócitos PBNT para blastocistos e ESCs também foi estudado e suas propriedades genéticas e epigenéticas determinadas.22/55 others, Nature 511, 177 to 183 (2014); Tachibana M et al., Cell 153, 1228 to 1238 (2013), which are hereby incorporated by reference). Residual meiotic activity in cytoplasts capable of forming Mil spindles again is crucial for reprogramming and subsequent embryonic development after nuclear somatic cell transfer (SCNT). As the main objective of human SCNT is to produce autologous ESCs, SCNT oocytes trapped in Mil are not fertilized with sperm, but are artificially activated to leave the meiotic prison, while the segregation of chromosomes during the second meiotic division is suppressed to preserve the diploid somatic cell. The potential for reprogramming the cytoplasm of the meiotic oocyte, as demonstrated by SCNT, suggested the possibility of producing haploid oocytes with donor genomes in the context of an infertility treatment. Previous studies in mice have shown that both PB1 and PB2 genomes can be reconstituted by transfer to compatible Mil or zygotic cytoplasm and contribute to the development of viable offspring (Wakayama T et al., J Reprod Fértil 110, 263 to 266 (1997); Wakayama T and Yanagimachi R, Biol of Reproduction 59, 100 to 104 (1998); incorporated herein by reference). However, these studies in mice have not been translated into other species, including primates and humans. The generation of human haploid oocytes is described here after the transfer of PB1 genomes to enucleated Mil oocytes and the induction of meiosis II again after sperm fertilization (Figure 1 A). The pre-implantation development of PBNT oocytes for blastocysts and ESCs has also been studied and their genetic and epigenetic properties determined.
[0104]Estudos anteriores com camundongos demonstraram que ambos os genomas do corpo polar mantêm o potencial de participar no desenvolvimento normal ou formar ESCs se reintroduzidos no correspondente oócito ou citoplasma zigótico (Wakayama S e outros, Stem Cells 25, 986 a 993 (2007) e Wang T e outros, Cell 157, 1591 a 1604 (2014), ambos aqui incorporados por referência). É aqui descrita a[0104] Previous studies with mice have shown that both polar body genomes retain the potential to participate in normal development or form ESCs if reintroduced into the corresponding zygotic oocyte or cytoplasm (Wakayama S et al., Stem Cells 25, 986 to 993 (2007) and Wang T et al., Cell 157, 1591 to 1604 (2014), both of which are incorporated herein by reference). Here is described the
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 29/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 29/95
23/55 tradução destas descobertas em camundongos e a demonstração de que o PBNT pode resgatar o material genético de genomas de PB1 humanos descartados pelo desenvolvimento. A atividade meiótica residual em oócitos Mil enucleados é suficiente para induzir a formação de fusos similares a Mil funcionais de novo que resultam em oócito haploide após a fertilização. Usando imagens de birrefringência não invasivas, verificou-se que a maioria dos oócitos PBNT (67%) formou fusos visíveis dentro de 60 min de fusão. No entanto, uma análise mais detalhada da morfologia do fuso em oócitos revelou que alguns fusos meióticos estavam em prófase ou anáfase, sugerindo conteúdo nuclear comprometido em PB1. Além disso, aproximadamente metade dos zigotos PBNT normalmente fertilizados param antes de atingir o estágio de blastocisto, sugerindo que os esforços para otimizar os protocolos no momento da coleta de oócitos para isolar PBs viáveis são apropriados.23/55 translating these findings into mice and demonstrating that PBNT can rescue genetic material from human PB1 genomes discarded by development. Residual meiotic activity in enucleated Mil oocytes is sufficient to induce the formation of functional Mil-like spindles again that result in haploid oocyte after fertilization. Using non-invasive birefringence images, it was found that the majority of PBNT oocytes (67%) formed visible spindles within 60 min of fusion. However, a more detailed analysis of the spindle morphology in oocytes revealed that some meiotic spindles were in prophase or anaphase, suggesting compromised nuclear content in PB1. In addition, approximately half of the normally fertilized PBNT zygotes stop before reaching the blastocyst stage, suggesting that efforts to optimize protocols at the time of oocyte collection to isolate viable PBs are appropriate.
[0105]A aneuploidia em embriões IVF é relativamente comum (Alfarawati S e outros, Fértil Steril 95, 520 a 524 (2011) e Angell RR e outros, Nature 303, 336 a 338 (1983); aqui incorporados por referência) e, como mostrado aqui, também ocorre em blastocistos PBNT. As taxas de aneuploidia em embriões humanos aumentam com a idade materna como um resultado de erros de meiose I ou II (Hassold T e Hunt P, Nat Rev Genet 2, 280 a 291 (2001); Nagaoka SI e outros, Nat Rev Genet 13, 493 a 504). (2012), Petronczki M e outros, Cell 112, 423 a 440 (2003), incorporados aqui por referência). Além disso, podem ocorrer erros mitóticos durante as divisões pósclivagem zigótica, produzindo blastômeros em mosaico contendo múltiplos cariótipos distintos dentro de um embrião pré-implantação (McCoy RC e outros., PLoS Genetics 11, e1005601 (2015); incorporado por referência aqui). Embora seja improvável que o PBNT corrija erros de meiose I, o citoplasma funcional de doadores jovens pode reduzir a incidência de aneuploidia resultante de meiose II ou erros mitóticos. As taxas de aneuploidia em blastocistos PBNT fertilizados normalmente no presente estudo foram similares aos controles baseados em análises de STR e Arranjo-CGH. É[0105] Aneuploidy in IVF embryos is relatively common (Alfarawati S et al., Fertil Steril 95, 520 to 524 (2011) and Angell RR et al., Nature 303, 336 to 338 (1983); incorporated herein by reference) and, as shown here, it also occurs in PBNT blastocysts. Aneuploidy rates in human embryos increase with maternal age as a result of meiosis I or II errors (Hassold T and Hunt P, Nat Rev Genet 2, 280 to 291 (2001); Nagaoka SI et al., Nat Rev Genet 13 , 493 to 504). (2012), Petronczki M et al., Cell 112, 423 to 440 (2003), incorporated by reference). In addition, mitotic errors can occur during post-zygotic divisions, producing mosaic blastomers containing multiple distinct karyotypes within a pre-implantation embryo (McCoy RC et al., PLoS Genetics 11, e1005601 (2015); incorporated by reference here). Although PBNT is unlikely to correct errors in meiosis I, the functional cytoplasm of young donors can reduce the incidence of aneuploidy resulting from meiosis II or mitotic errors. Aneuploidy rates in PBNT blastocysts normally fertilized in the present study were similar to controls based on STR and CGH-Arrangement analyzes. IS
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 30/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 30/95
24/55 provável que outras otimizações dos protocolos PBNT reduzam as taxas de aneuploidia. No entanto, a implementação da triagem genética pré-implantação (PGS) é crucial antes das aplicações clínicas dos oócitos PBNT.24/55 other optimizations of the PBNT protocols are likely to reduce aneuploidy rates. However, the implementation of pre-implantation genetic screening (PGS) is crucial before clinical applications of PBNT oocytes.
[0106]Devido à tendência atual de atraso na procriação no mundo ocidental, a infertilidade relacionada à idade com concomitantes decréscimos na reserva ovariana é comum (Bellieni CV, World J Clin Pediatr 1, 34 a 36 (2012); aqui incorporada por referência). É aqui descrito que a geração de oócitos adicionais resgatando PB1 aumentaria o rendimento de blastocistos relacionados ao paciente disponíveis para transferência a partir de um único ciclo de estimulação. Isto implica que a utilização de PBNT pode melhorar significativamente os resultados de ART e as taxas de gravidez, particularmente para as mulheres de idade avançada com diminuição da reserva ovariana. No entanto, esta terapia é baseada na disponibilidade de PB1 do paciente e, portanto, não é aplicável para mulheres que não podem produzir oócitos maduros (Bilgin EM e Kovanci E, Curr Opin Obst Gynecol 27, 167 a 174 (2015); Grynberg M e outros, Fértil Steril 105, 13 a 19 (2016), ambos aqui incorporados por referência). Além disso, a tecnologia PBNT será limitada a países, tais como os Estados Unidos, onde os programas de fertilização in vitro podem coordenar os ciclos de doação de oócitos com a compensação dos doadores. A biópsia do corpo polar é uma técnica estabelecida em IVF e sua remoção de oócitos do paciente não afeta a fertilização e o desenvolvimento subsequente do embrião (Cimadomo D e outros., Biomed Res Int 2016, 7193075 (2016). Uma vez que PBNT conta com oócitos de doadores, essa estratégia permite a complementação de genomas PB de mulheres mais velhas com citoplasto de doadores jovens.[0106] Due to the current tendency to delay procreation in the western world, age-related infertility with concomitant decreases in the ovarian reserve is common (Bellieni CV, World J Clin Pediatr 1, 34 to 36 (2012); incorporated here by reference) . It is described here that the generation of additional oocytes rescuing PB1 would increase the yield of patient-related blastocysts available for transfer from a single stimulation cycle. This implies that the use of PBNT can significantly improve ART results and pregnancy rates, particularly for women of advanced age with decreased ovarian reserve. However, this therapy is based on the patient's availability of PB1 and is therefore not applicable to women who cannot produce mature oocytes (Bilgin EM and Kovanci E, Curr Opin Obst Gynecol 27, 167 to 174 (2015); Grynberg M and others, Fértil Steril 105, 13 a 19 (2016), both of which are incorporated herein by reference). In addition, PBNT technology will be limited to countries, such as the United States, where in vitro fertilization programs can coordinate oocyte donation cycles with donor compensation. Polar body biopsy is an established technique in IVF and its removal of oocytes from the patient does not affect fertilization and subsequent embryo development (Cimadomo D et al., Biomed Res Int 2016, 7193075 (2016). Since PBNT counts with donor oocytes, this strategy allows the complementation of PB genomes of older women with cytoplasts from young donors.
[0107]O uso expandido de PBNT, além da transferência do fuso (ST), podería fornecer uma técnica adicional para apoiar a terapia de reposição mitocondrial (MRT); uma abordagem promissora para evitar a transmissão materna de doença baseada em mtDNA (Tachibana M e outros, Nature 493, 627 a 631 (2013) e Tachibana M e[0107] The expanded use of PBNT, in addition to spindle transfer (ST), could provide an additional technique to support mitochondrial replacement therapy (MRT); a promising approach to prevent maternal mtDNA-based disease transmission (Tachibana M et al., Nature 493, 627 to 631 (2013) and Tachibana M and
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 31/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 31/95
25/55 outros, Nature 461,367 a 372 (2009); ambos são aqui incorporados por referência). Em camundongos, foi demonstrado que um transporte mínimo de mtDNA pode ser conseguido em descendentes gerados por transferência de corpo polar (Wang T e outros, Cell 157, 1591 a 1604 (2014) e Yamada M e outros, Cell Stem Cell 18, 749 a 754 (2016), ambos aqui incorporados por referência). São aqui descritos dados que sugerem que, em conjunto com ST, o PBNT podería aumentar potencialmente o número de oócitos MRT reconstruídos para famílias com defeitos baseados em mtDNA. Similar a outras tecnologias MRT, o PBNT terá que atender às exigências de segurança e eficácia das agências reguladoras antes da aprovação de aplicações clínicas de rotina (Wolf DP e outros, Trends Mol Med 21,68 a 76 (2015); incorporado por referência aqui). Além disso, o PBNT fornece uma ferramenta para estudar mecanismos básicos da biologia do desenvolvimento relacionados à meiose feminina e expande a compreensão da estabilidade genética em oócitos.25/55 others, Nature 461,367 to 372 (2009); both are incorporated by reference). In mice, it has been shown that minimal mtDNA transport can be achieved in offspring generated by polar body transfer (Wang T et al., Cell 157, 1591 to 1604 (2014) and Yamada M et al., Cell Stem Cell 18, 749 a 754 (2016), both of which are incorporated by reference). Data are described here that suggest that, together with ST, PBNT could potentially increase the number of reconstructed MRT oocytes for families with mtDNA-based defects. Similar to other MRT technologies, PBNT will have to meet the safety and efficacy requirements of regulatory agencies before approving routine clinical applications (Wolf DP and others, Trends Mol Med 21.68 to 76 (2015); incorporated by reference here ). In addition, PBNT provides a tool to study basic mechanisms of developmental biology related to female meiosis and expands the understanding of genetic stability in oocytes.
EXEMPLOS [0108] Os exemplos a seguir são apenas para ilustração. Face a esta descrição, os versados na técnica reconhecerão que as variações destes exemplos e outros exemplos da invenção descrita são possíveis sem experimentação desnecessária.EXAMPLES [0108] The following examples are for illustration only. In view of this description, those skilled in the art will recognize that variations of these examples and other examples of the described invention are possible without unnecessary experimentation.
[0109]Exemplo 1 - Formação de novo de Fusos Mil a partir dos Genomas de PB1 [0110]Foi determinado primeiro se a atividade meiótica residual em oócitos Mil humanos enucleados é suficiente para induzir a formação de fusos similares a Mil morfologicamente normais a partir do genoma de PB1, carregando um complemento genético de cromossomos Mil (Hou Y e outros, Cell 155, 1492 a 1506 (2013), incorporado aqui por referência). Para este fim, oócitos frescos Mil doados por e recuperados a partir de 11 voluntários saudáveis (25 a 31 anos) foram utilizados após protocolos de estimulação ovariana controlada (COS) e aspirações foliculares[0109] Example 1 - Formation of New Mil Spindles from PB1 Genomes [0110] It was first determined whether residual meiotic activity in enucleated human Mil oocytes is sufficient to induce the formation of morphologically normal Mil-like spindles from the PB1 genome, carrying a genetic complement of Mil chromosomes (Hou Y et al., Cell 155, 1492 to 1506 (2013), incorporated by reference). For this purpose, fresh Mil oocytes donated by and recovered from 11 healthy volunteers (25 to 31 years old) were used after protocols for controlled ovarian stimulation (COS) and follicular aspirations
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 32/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 32/95
26/55 transvaginais.26/55 transvaginal.
[0111 ]Utilizando imunoquimica com anticorpos contra a e β tubulinas e 4’,6diamidino-2-fenilindol (DAPI) para coloração de DNA, foi determinado que PB1s intactos em oócitos Mil humanos maduros não contêm fusos metafásicos detectáveis, possivelmente devido a um declínio rápido nos fatores meióticos após a abstrição (Figura 1B). Os oócitos PBNT reconstruídos foram produzidos por fusão de PB1 intacto redondo com citoplastos Mil (Figuras 1A e 1C). A imagiologia não invasiva indicou que a maioria dos oócitos PBNT (67%) formou fusos visíveis dentro de 60 minutos de fusão (Figura 1 D). A marcação com anticorpos para α e β tubulinas e DAPI demonstrou que todos os oócitos PBNT (n = 5) continham complexos fusocromossômicos. No entanto, apenas 2 oócitos experimentais formaram fusos metafásicos similares aos oócitos Mil intactos. Os fusos PBNT restantes estavam na prófase (n = 2) ou na anáfase (n = 1) (Figura 1B) provavelmente refletindo o conteúdo nuclear comprometido.[0111] Using immunochemistry with antibodies against a and β tubulins and 4 ', 6diamidino-2-phenylindole (DAPI) for DNA staining, it has been determined that intact PB1s in oocytes Thousand mature humans do not contain detectable metaphase spindles, possibly due to a rapid decline in meiotic factors after abstraction (Figure 1B). The reconstructed PBNT oocytes were produced by fusing round intact PB1 with Mil cytoplasts (Figures 1A and 1C). Noninvasive imaging indicated that the majority of PBNT oocytes (67%) formed visible spindles within 60 minutes of fusion (Figure 1 D). Antibody staining for α and β tubulins and DAPI demonstrated that all PBNT oocytes (n = 5) contained fusochromosomal complexes. However, only 2 experimental oocytes formed metaphasic spindles similar to the intact Mil oocytes. The remaining PBNT spindles were in prophase (n = 2) or anaphase (n = 1) (Figure 1B) probably reflecting the compromised nuclear content.
[0112]Exemplo 2 - Retomada e conclusão da meiose II em oócitos PBNT após fertilização com esperma [0113]Quando a funcionalidade dos fusos meióticos em oócitos PBNT reconstruídos foi examinada após a fertilização, por injeção de esperma intracitoplasmática (ICSI), a conclusão da meiose II foi evidenciada pela abstrição de PB2 e formação de pronúcleos. A maioria dos oócitos PBNT sobreviveu à ICSI (97%; 31/32) e formou pronúcleos visíveis (81%; 25/31) em taxas similares aos controles intactos não manipulados (Tabela 1). A maioria dos zigotos PBNT fertilizados (76%; 19/25) continha 2 pronúcleos (PN) e um segundo corpo polar (PB2) indicativo de conclusão normal da meiose II (Figura 1E). Os zigotos restantes continham números irregulares de pronúcleos (1 ou 3) ou não conseguiram extrudar PB2 (Figura 1E; Tabela 1). Estes resultados foram ligeiramente inferiores aos do controle (Tabela 1) indicativos de que a maioria dos oócitos PBNT formou fusos funcionais capazes de[0112] Example 2 - Resumption and completion of meiosis II in PBNT oocytes after fertilization with sperm [0113] When the functionality of meiotic spindles in reconstructed PBNT oocytes was examined after fertilization, by intracytoplasmic sperm injection (ICSI), the completion of the meiosis II was evidenced by the abstraction of PB2 and the formation of pronuclei. The majority of PBNT oocytes survived ICSI (97%; 31/32) and formed visible pronuclei (81%; 25/31) at rates similar to the unhandled intact controls (Table 1). Most of the fertilized PBNT zygotes (76%; 19/25) contained 2 pronuclei (PN) and a second polar body (PB2) indicative of normal meiosis II completion (Figure 1E). The remaining zygotes contained irregular numbers of pronuclei (1 or 3) or were unable to extrude PB2 (Figure 1E; Table 1). These results were slightly inferior to those of the control (Table 1) indicating that the majority of PBNT oocytes formed functional spindles capable of
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27/55 recapitular a meiose II após a fertilização.27/55 recap of meiosis II after fertilization.
Tabela 1Table 1
[0114]Exemplo 3 - Desenvolvimento pré-implantação e ploidiade blastocistos[0114] Example 3 - Pre-implantation development and ploidy of blastocysts
PBNT [0115]Para examinar a competência do desenvolvimento, os zigotos PBNT normalmente fertilizados e controles foram cultivados até o estágio de blastocisto. Similar aos controles, 95% (18 / 19) dos zigotos PBNT clivaram, 74% (14 / 19) alcançaram d8 células e 68% (13/19) formaram embriões em estágio de morula compactos (Tabela 2). No grupo de controle, 75% (12/16) dos zigotos atingiram blastocistos, enquanto apenas 42% (8 /19) dos zigotos PBNT o fizeram (teste t de Student, p < 0,05, Figura 1F, 1G e Tabela 2). Como a aneuploidia embrionária resultante de anormalidades cromossômicas numéricas levando à falha na implantação ou perda espontânea da gestação é comum, independente da morfologia do blastocisto, blastocistos PBNT (n = 2) e de controle (n = 3) foram submetidos à análise de repetições curtas em tandem (STR). O exame dos marcadores microssatélites mapeados para 22 lóci autossômicos humanos e um locus ligado ao cromossomo X revelou que dois blastocistos PBNT amostrados continham cromossomos diploides normais que contribuíam tanto a partir do oócito quanto do esperma. Esses resultados minimizaram a possibilidade de erros na segregação cromossômica meiótica do oócito. Três blastocistos PBNT adicionais foram submetidos à biópsia de trofectoderma e realizaram a análise de hibridização genômica comparativa de arranjo (Arranjo-CGH) e determinaram que dois eram normais, mas um blastocisto era aneuploide (perda de 17). Este resultado foiPBNT [0115] To examine developmental competence, normally fertilized PBNT zygotes and controls were grown to the blastocyst stage. Similar to controls, 95% (18/19) of the PBNT zygotes cleaved, 74% (14/19) reached d8 cells and 68% (13/19) formed compact morula stage embryos (Table 2). In the control group, 75% (12/16) of the zygotes reached blastocysts, while only 42% (8/19) of the PBNT zygotes did it (Student's t test, p <0.05, Figure 1F, 1G and Table 2 ). As embryonic aneuploidy resulting from numerical chromosomal abnormalities leading to implantation failure or spontaneous loss of pregnancy is common, regardless of the morphology of the blastocyst, PBNT (n = 2) and control (n = 3) blastocysts were subjected to the analysis of short repetitions in tandem (STR). Examination of microsatellite markers mapped to 22 autosomal human loci and an X-linked locus revealed that two sampled PBNT blastocysts contained normal diploid chromosomes that contributed from both the oocyte and sperm. These results minimized the possibility of errors in the meiotic chromosomal segregation of the oocyte. Three additional PBNT blastocysts underwent a tropectoderma biopsy and underwent a comparative array genomic hybridization analysis (Arrangement-CGH) and determined that two were normal, but one blastocyst was aneuploid (loss of 17). This result was
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 34/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 34/95
28/55 comparável aos controles com um blastocisto aneuploide de três testados (perda de28/55 comparable to controls with a three-tested aneuploid blastocyst (loss of
21).21).
Tabela 2Table 2
a’b Diferentes sobrescritos dentro de uma coluna indicam diferenças significativas (P <0,05). a ' b Different superscripts within a column indicate significant differences (P <0.05).
[0116]Exemplo 4 - Integridade genética em ESCs derivados de embriões PBNT [0117]Em um esforço para definir melhor a potencial utilidade clínica de oócitos PBNT haploides reconstruídos, uma linhagem ESC foi derivada de cinco blastocistos PBNT. A linhagem foi designada PBNT1 (Figura 1F). Outras quatro linhagens ESC foram desenvolvidas a partir de nove blastocistos de controle. Isso incluiu o hESO-14, que era um irmão geneticamente relacionado de PBNT 1, derivado dos mesmos doadores de óvulos e esperma. A menor eficiência de derivação ESC (20%, 1/5) dos embriões PBNT em comparação com os controles (44%, 4/9) pode indicar má qualidade dos blastocistos PBNT, mas o número total foi baixo para conclusões definitivas. Uma linhagem ESC (PBNT2) foi derivada de dois blastocistos desenvolvidos a partir de zigotos PBNT anormais (3PN). A banda G citogenética revelou que ο PBNT1 e três dos quatro ESCs de controle exibiam cariótipos diploides normais, sem evidência de anormalidades cromossômicas numéricas ou estruturais detectáveis (Figura 2A). O hESO-15 de controle restante era aneuploide com a monossomia do cromossomo 21 (Figura 2A). Além disso, a análise STR de PBNT1 e hESO-14 confirmou sua relação normal de ploidia e irmãos (Tabela 3). Como[0116] Example 4 - Genetic integrity in ESCs derived from PBNT embryos [0117] In an effort to better define the potential clinical utility of reconstructed haploid PBNT oocytes, an ESC lineage was derived from five PBNT blastocysts. The lineage was designated PBNT1 (Figure 1F). Another four ESC strains were developed from nine control blastocysts. This included hESO-14, which was a genetically related brother of PBNT 1, derived from the same egg and sperm donors. The lower efficiency of ESC derivation (20%, 1/5) of PBNT embryos compared to controls (44%, 4/9) may indicate poor quality of PBNT blastocysts, but the total number was low for definitive conclusions. An ESC strain (PBNT2) was derived from two blastocysts developed from abnormal PBNT zygotes (3PN). The cytogenetic G band revealed that ο PBNT1 and three of the four control ESCs exhibited normal diploid karyotypes, with no evidence of detectable numerical or structural chromosomal abnormalities (Figure 2A). The remaining control hESO-15 was aneuploid with chromosome 21 monosomy (Figure 2A). In addition, the STR analysis of PBNT1 and hESO-14 confirmed their normal relationship between ploidy and siblings (Table 3). How
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29/55 esperado, ο PBNT2 exibiu um cariótipo triploide 66-69, XXX (Figura 2A). A impressão digital do DNA por STR corroborou a presença de três alelos para os cromossomos 2, 6, 13, 18 e 22 e quatro alelos no cromossomo 12 nesta linhagem celular (Tabela 3). Com base na análise de herança alélica, o cariótipo triploide foi causado por falha na conclusão da meiose II com retenção de material genético de PB2. Isto foi consistente com a observação de 3 pronúcleos e falha em segregar um segundo corpo polar após a fertilização nestes zigotos. Além disso, o esperma também contribuiu com um segundo alelo para a tetraploidia de cromossomo 12. Tanto a linhagem PBNT1 quanto a linhagem hESO-14 de controle mantiveram a morfologia de ESC típica e formaram tumores de teratoma contendo células e tecidos de todas as três camadas germinativas (Figuras 5A e 6B).29/55 expected, ο PBNT2 exhibited a triple karyotype 66-69, XXX (Figure 2A). DNA fingerprinting by STR corroborated the presence of three alleles for chromosomes 2, 6, 13, 18 and 22 and four alleles on chromosome 12 in this cell line (Table 3). Based on the allelic inheritance analysis, the triploid karyotype was caused by failure to complete meiosis II with retention of PB2 genetic material. This was consistent with the observation of 3 pronuclei and failure to segregate a second polar body after fertilization in these zygotes. In addition, sperm also contributed to a second allele for chromosome 12 tetraploidy. Both the PBNT1 and the hESO-14 control lines maintained the typical ESC morphology and formed teratoma tumors containing cells and tissues from all three layers. germinative (Figures 5A and 6B).
Tabela 3 [0118]Análise Paternidade de PBNT1, PBNT2 e hESO-14 determinado por Ensaio de Repetições Curtas em Tandem (STR)Table 3 [0118] PBNT1, PBNT2 and hESO-14 Paternity Analysis determined by Short Tandem Repeat Assay (STR)
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 36/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 36/95
30/5530/55
Somente amostras masculinas mostram uma marca de DXS2506 no cromossomoOnly male samples show a DXS2506 mark on the chromosome
X.X.
[0119]Para avaliar se o PBNT introduziu alterações subcromossômicas indetectáveis por bandas G, mapas físicos genômicos de alta resolução ao longo do genoma das linhagens PBNT1 e hESO-14, bem como o DNA de doador de óvulo e de doador de esperma foram gerados. A plataforma BioNano Genomics Irys (Mak AC[0119] To assess whether PBNT introduced undetectable G-band subchromosomal changes, high resolution genomic physical maps across the genome of the PBNT1 and hESO-14 strains, as well as the egg donor and sperm donor DNA were generated. The BioNano Genomics Irys platform (Mak AC
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 37/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 37/95
31/55 e outros, Cell Stem Cell 5, 11 a 14 (2016); aqui incorporada por referência) permite a detecção de variações estruturais (SVs) incluindo inserções, deleções e inversões em resolução de 1 kb. Quando comparado ao genoma de doador de óvulo, 372 SVs foram identificados em PBNT1 e 380 SVs em hESO-14, dos quais 157 foram compartilhados entre estas linhagens de células irmãs (Figura 2B). Em comparação com o genoma do doador de esperma, 268 SVs foram detectados em PBNT1 e 265 SVs em hESO14 com 124 SVs comuns (Figura 2C). Além disso, números comparáveis de SVs únicos foram identificados em PBNT1 (281) e hESO-14 (297) (Figura 2D). Nenhum gene foi encontrado dentro ou perto de SVs que foram diferencialmente expressos entre PBNT1 e hESO-14.31/55 et al., Cell Stem Cell 5, 11 to 14 (2016); incorporated herein by reference) allows the detection of structural variations (SVs) including insertions, deletions and inversions in 1 kb resolution. When compared to the egg donor genome, 372 SVs were identified in PBNT1 and 380 SVs in hESO-14, of which 157 were shared between these sister cell lines (Figure 2B). In comparison with the sperm donor genome, 268 SVs were detected in PBNT1 and 265 SVs in hESO14 with 124 common SVs (Figure 2C). In addition, comparable numbers of unique SVs were identified in PBNT1 (281) and hESO-14 (297) (Figure 2D). No genes were found in or near SVs that were differentially expressed between PBNT1 and hESO-14.
[0120]Exemplo 5 - Assinaturas epigenéticas e transcricionais de PBNT ESCs [0121 ]A metilação do DNA envolvendo a transferência covalente de um grupo metila para o quinto átomo de carbono do anel citosina um importante mecanismo epigenético que define a identidade celular (Smith ZD e Meissner A, Nat Rev Genet 14, 204 a 220 (2013); incorporado aqui por referência. Este processo sofre mudanças dinâmicas durante e após a fertilização, refletindo a reprogramação do desenvolvimento (Canovas S e Ross PJ, Theriogenology 86, 69 a 79 (2016); incorporado aqui como referência). Além disso, o estabelecimento de ESCs estáveis está associado a grandes mudanças nos perfis de metilação, conforme o genoma se reconfigura para o estado pluripotente (Lister R e outros, Nature 462, 315 a 322 (2009); Lister R e outros, Nature 471, 68 a 73 (2011), ambos aqui incorporados por referência). Para avaliar a normalidade destas alterações, foram realizadas análises de metilação de DNA ao longo do genoma das linhagens de células PBNT1 e hESO14 utilizando MethylC-seq de resolução base de alta cobertura (Lister 2009 acima). Ambas as linhagens apresentaram níveis similares de metilação CG, uma diferença de apenas 0,7% entre PBNT1 (86,1%) e hESO-14 (85,4%) e metilação não-CG, uma diferença de apenas 0,4% entre PBNT1 (1,3%) e hESO-14 (0,9%) (Figura 3A e 3B).[0120] Example 5 - Epigenetic and transcriptional signatures of PBNT ESCs [0121] DNA methylation involving the covalent transfer of a methyl group to the fifth carbon atom of the cytosine ring an important epigenetic mechanism that defines cell identity (Smith ZD and Meissner A, Nat Rev Genet 14, 204 to 220 (2013); incorporated here by reference. This process undergoes dynamic changes during and after fertilization, reflecting the reprogramming of development (Canovas S and Ross PJ, Theriogenology 86, 69 to 79 ( 2016); incorporated here as a reference.) In addition, the establishment of stable ESCs is associated with major changes in methylation profiles, as the genome reconfigures itself to the pluripotent state (Lister R et al., Nature 462, 315 to 322 (2009 ); Lister R et al., Nature 471, 68 to 73 (2011), both of which are incorporated herein by reference.) To assess the normality of these changes, DNA methylation analyzes were carried out at l ongo of the genome of the PBNT1 and hESO14 cell lines using high coverage base resolution MethylC-seq (Lister 2009 above). Both strains showed similar levels of CG methylation, a difference of only 0.7% between PBNT1 (86.1%) and hESO-14 (85.4%) and non-CG methylation, a difference of only 0.4% between PBNT1 (1.3%) and hESO-14 (0.9%) (Figure 3A and 3B).
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 38/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 38/95
32/5532/55
Comparações entre pares dessas duas amostras identificaram apenas 116 regiões diferencialmente metiladas CG (DMRs) e 4 mega DMRs não-CG abrangendo aproximadamente 500kb (He Y e Ecker JR, Ann Rev Genom Hum Genet 16, 55 a 77 (2015); incorporado por referência aqui) (Figura 3C; Tabela S5, FDR < 0,01). A inspeção visual implicou a conformação dessas DMRs (Figura 3D e 3E), mas não houve enriquecimento em termos de ontologia genética (GO), características genéticas (Figura 3C) ou correlação com o perfil transcricional. Estes resultados sugerem que o perfil global de metilação do PBNT1 experimental foi muito similar ao hESO-14 de controle.Pairwise comparisons of these two samples identified only 116 differentially methylated CG regions (DMRs) and 4 mega non-CG DMRs covering approximately 500kb (He Y and Ecker JR, Ann Rev Genom Hum Genet 16, 55 to 77 (2015); incorporated by reference here) (Figure 3C; Table S5, FDR <0.01). Visual inspection implied the formation of these DMRs (Figure 3D and 3E), but there was no enrichment in terms of genetic ontology (GO), genetic characteristics (Figure 3C) or correlation with the transcriptional profile. These results suggest that the overall methylation profile of the experimental PBNT1 was very similar to the control hESO-14.
[0122]Finalmente, os padrões globais de expressão gênica foram examinados nas linhagens PBNT1 e hESO-14. Sequenciamento profundo (50M leituras) por RNAseq foi realizado em triplicados para cada uma das duas linhagens. A análise da expressão diferencial foi realizada usando o pacote edgeR (Robinson MD e Smyth GK, Biostatistics 9, 321 a 332 (2008); incorporado aqui por referência) e mostrou que apenas 1,25% dos genes examinados (186 de 14.876) foram expressos diferencialmente entre PBNT1 e hESO-14 (Figuras 4A e 4B, FDR < 0,05). Usando a análise de Ontologia Genética (GO), vários termos GO foram alocados. No entanto, não foram identificadas categorias funcionais estatisticamente enriquecidas para os genes diferencialmente expressos. Estes dados indicaram que os padrões globais de expressão gênica de células PBNT1 se assemelham aos das células hESO-14 de controle.[0122] Finally, global patterns of gene expression were examined in the PBNT1 and hESO-14 strains. Deep sequencing (50M readings) by RNAseq was performed in triplicates for each of the two strains. Differential expression analysis was performed using the edgeR package (Robinson MD and Smyth GK, Biostatistics 9, 321 to 332 (2008); incorporated here by reference) and showed that only 1.25% of the examined genes (186 out of 14,876) were differentially expressed between PBNT1 and hESO-14 (Figures 4A and 4B, FDR <0.05). Using the analysis of Genetic Ontology (GO), several GO terms were allocated. However, no statistically enriched functional categories were identified for the differentially expressed genes. These data indicated that the global patterns of gene expression of PBNT1 cells are similar to those of control hESO-14 cells.
[0123]Assim, dentro dos limites dessas análises, o genoma de PB1 interage com o citoplasma dos oócitos estabelecendo características epigenéticas e transcriptomais que emulam o estado pluripotente.[0123] Thus, within the limits of these analyzes, the PB1 genome interacts with the cytoplasm of the oocytes, establishing epigenetic and transcriptome characteristics that emulate the pluripotent state.
[0124]Exemplo 6 - Doação de Gametas [0125] Doadores de oócitos de 25 a 31 anos de idade foram recrutados através da OHSU Women’s Health Research Unit. Dois doadores saudáveis de esperma[0124] Example 6 - Gamete Donation [0125] Oocyte donors from 25 to 31 years of age were recruited through the OHSU Women’s Health Research Unit. Two healthy sperm donors
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33/55 também foram recrutados. Os participantes elegíveis participaram de uma sessão de informações descrevendo as metas do estudo e os procedimentos relacionados. Consentimento informado por escrito foi obtido a partir de todos os doadores de gametas afirmando que os oócitos serão fertilizados para criar embriões para fins de pesquisa e não serão usados para fins reprodutivos, mas serão estudados in vitro, incluindo a geração de células-tronco embrionárias.33/55 were also recruited. Eligible participants participated in an information session describing the study's goals and related procedures. Written informed consent was obtained from all gamete donors stating that the oocytes will be fertilized to create embryos for research purposes and will not be used for reproductive purposes, but will be studied in vitro, including the generation of embryonic stem cells.
[0126]Exemplo 7 - Métodos [0127]Para produzir citoplasto Mil de receptor, os oócitos foram colocados em uma gotícula de manipulação de 50 μΙ de fluido tubário humano com meio HEPES a 10% contendo 5 pg / ml de citocalasina B (HTF com HEPES 10% CB) em um prato de fundo de vidro. A gotícula foi coberta com óleo de cultura de tecidos e os oócitos foram mantidos a 37° C durante 10 min antes da enucleação. O prato foi montado no estágio de um microscópio invertido (Olympus 1X71) equipado com um aquecedor de estágio (http://www.tokaihit.com), micromanipuladores Narishige, Oosight Imaging System (http://wwwcri-inc.com), e objetiva a laser (http://www.hamiltonthome.com) (sítios da rede e conteúdo incorporados aqui por referência). Um oócito foi posicionado usando uma pipeta de retenção de modo que o fuso estivesse situado em uma posição de aproximadamente 2 a 4 horas. A zona pelúcida próxima ao fuso foi perfurada a laser e, em seguida, uma pipeta de enucleação foi introduzida através da fenda. O fuso foi extraído por aspiração para a pipeta com uma quantidade mínima de citoplasma e membrana plasmática circundante e descartado.[0126] Example 7 - Methods [0127] To produce Mil receptor cytoplasty, oocytes were placed in a 50 μΙ manipulation droplet of human tubal fluid with 10% HEPES medium containing 5 pg / ml cytochalin B (HTF with HEPES 10% CB) in a glass bottom dish. The droplet was covered with tissue culture oil and the oocytes were maintained at 37 ° C for 10 min before enucleation. The dish was mounted on the stage of an inverted microscope (Olympus 1X71) equipped with a stage heater (http://www.tokaihit.com), Narishige micromanipulators, Oosight Imaging System (http://wwwcri-inc.com), and laser objective (http://www.hamiltonthome.com) (network sites and content incorporated here by reference). An oocyte was positioned using a holding pipette so that the spindle was in a position of approximately 2 to 4 hours. The pellucid zone near the spindle was laser drilled and then an enucleation pipette was introduced through the slit. The spindle was extracted by aspiration into the pipette with a minimal amount of cytoplasm and surrounding plasma membrane and discarded.
[0128]Para o isolamento do corpo polar, um oócito foi posicionado com o primeiro corpo polar (PB1) às 2 horas, e a zona pelúcida foi perfurada antes de uma pipeta de transferência ser introduzida e ο PB1 aspirado. Ο PB1 foi então transferido brevemente para uma gota contendo extrato de HVJ-E (Ishihara Sangyo Kaisha) diluído 1:3 com HTF com HEPES 10% CB, transferido e enxaguado em HTF com HEPES 10% CB, e colocado no espaço perivitelino do citoplasto do receptor. Os pares[0128] For the isolation of the polar body, an oocyte was positioned with the first polar body (PB1) at 2 am, and the pellucid zone was punctured before a transfer pipette was introduced and ο PB1 aspirated. Ο PB1 was then transferred briefly to a drop containing extract of HVJ-E (Ishihara Sangyo Kaisha) diluted 1: 3 with HTF with HEPES 10% CB, transferred and rinsed in HTF with HEPES 10% CB, and placed in the perivitelline space of the cytoplast receiver. The peers
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34/55 foram lavados em HTF com HEPES a 10%, transferidos para meio Global 10%, e incubados a 37° C em CO2 a 6% durante 60 minutos para permitir a fusão. A fusão foi confirmada 30 a 60 min após a transferência nuclear e os oócitos PBNT foram fertilizados após uma cultura adicional de 50 min usando injeção intracitoplasmática de esperma (ICSI) usando esperma fresco de doador. Os oócitos fertilizados foram então cultivados em meio Global 10% 37° C em 6% de CO2, 5% de O2 e 89% de N2. A fertilização foi determinada 16 horas após ICSI, observando-se a formação de pronúcleos e a extrusão do corpo polar. Oócitos Mil intactos não manipulados serviram como controles que foram fertilizados e cultivados de forma similar ao grupo PBNT.34/55 were washed in HTF with 10% HEPES, transferred to Global 10% medium, and incubated at 37 ° C in 6% CO2 for 60 minutes to allow fusion. The fusion was confirmed 30 to 60 min after nuclear transfer and the PBNT oocytes were fertilized after an additional 50 min culture using intracytoplasmic sperm injection (ICSI) using fresh donor sperm. The fertilized oocytes were then cultured in Global medium 10% 37 ° C in 6% CO2, 5% O2 and 89% N2. Fertilization was determined 16 hours after ICSI, observing the formation of pronuclei and the extrusion of the polar body. Un-manipulated Thousand Oocytes served as controls that were fertilized and cultured similarly to the PBNT group.
[0129]Os seguintes exemplos também ajudam a demonstrar exemplos dentro do presente escopo em relação aos oócitos preparados para superar problemas com a pobre genômica mitocondrial.[0129] The following examples also help to demonstrate examples within the present scope regarding oocytes prepared to overcome problems with poor mitochondrial genomics.
[0130]Exemplo 8 - Critérios de Inclusão e Exclusão [0131]Uma vez que a doença mitocondrial pode ser atribuída a mutações do genoma no mtDNA e/ou DNA nuclear (Wallace DC, J Clin Invest 123, 1405 a 1412 (2013); incorporado como referência), um desafio clínico importante é confirmar mutações patogênicas de mtDNA em famílias elegíveis para MRT. Cinco famílias quatro com diagnóstico de síndrome de Leigh (LS) e uma com MELAS - foram recrutadas e testes genéticos realizados para confirmar mutações de mtDNA herdadas da mãe. O DNA foi coletado a partir do sangue, fibroblastos da pele (SF) e/ou urina de crianças e mães, e 0 sequenciamento completo do mtDNA foi realizado. A primeira família LS teve uma criança afetada de 2 anos de idade com uma substituição T8993G homoplásmica tanto no sangue quanto em amostras SF enquanto sua mãe de 22 anos teve a mesma mutação com 70% de heteroplasmia no sangue e 100% em SF (Figura 6A , esquerda).[0130] Example 8 - Inclusion and Exclusion Criteria [0131] Since mitochondrial disease can be attributed to genome mutations in mtDNA and / or nuclear DNA (Wallace DC, J Clin Invest 123, 1405 to 1412 (2013); incorporated as a reference), an important clinical challenge is to confirm pathogenic mtDNA mutations in families eligible for MRT. Five families - four diagnosed with Leigh's syndrome (LS) and one with MELAS - were recruited and genetic tests carried out to confirm mtDNA mutations inherited from the mother. DNA was collected from blood, skin fibroblasts (SF) and / or urine from children and mothers, and complete mtDNA sequencing was performed. The first LS family had an affected 2-year-old child with a homoplastic T8993G replacement in both blood and SF samples, while his 22-year-old mother had the same mutation with 70% blood heteroplasm and 100% SF (Figure 6A , left).
[0132]Na segunda família LS relacionada, uma criança afetada de 2,5 anos portava a mesma mutação T8993G em 95% heteroplasmática no sangue e 100% em[0132] In the second related LS family, an affected 2.5-year-old child carried the same T8993G mutation in 95% heteroplasmic blood and 100% in
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SF enquanto em um segundo irmão assintomático de 1 ano de idade, a carga de mutação era de 50% no sangue e 62% em SF. Sua mãe de 23 anos, que era a irmã mais velha do indivíduo da primeira família, carregava essa mutação em 13% no sangue e 16% em SF (Figura 6A, direita).While in a second asymptomatic sibling aged 1 year, the mutation load was 50% in the blood and 62% in the SF. His 23-year-old mother, who was the older sister of the individual in the first family, carried this mutation by 13% in blood and 16% in SF (Figure 6A, right).
[0133]Na terceira família LS, o menino afetado de 12 anos sofreu uma substituição G13513A em 56%, 86% e 97% de heteroplasmia no sangue, SF e urina, respectivamente. Seu irmão de 19 anos, assintomático, apresentava a mesma mutação nos níveis de heteroplasma de 10%, 14% e 23% no sangue, SF e urina, respectivamente. Sua mãe de 36 anos de idade também abrigava a mutação nos níveis de 3%, 98% e 39% no sangue, SF e urina, respectivamente (Figura 6B).[0133] In the third LS family, the affected 12-year-old boy underwent a G13513A replacement in 56%, 86% and 97% of heteroplasmia in blood, SF and urine, respectively. Her asymptomatic 19-year-old brother had the same mutation in heteroplasma levels of 10%, 14% and 23% in blood, SF and urine, respectively. His 36-year-old mother also harbored the mutation at levels of 3%, 98% and 39% in blood, SF and urine, respectively (Figure 6B).
[0134]Uma quarta família também apresentou uma criança de 1 ano de idade com diagnóstico de LS. No entanto, a triagem genética não revelou quaisquer mutações patogênicas do mtDNA na criança ou na mãe.[0134] A fourth family also had a 1 year old child diagnosed with LS. However, genetic screening did not reveal any pathogenic mutations of mtDNA in the child or mother.
[0135]A quinta família provém de um grande linhagem de MELAS bem estudada carregando uma mutação patogênica A3243G (Figura 10B) (McClelland K, 2014, https://scholarworks.csustan.edu/bitstream/handle/011235813/793/McClellandK.sum mer2014%20.pdf?Sequence=1; sítio da rede acessado pela última vez em 28 de novembro de 2016 e incorporado por referência neste documento). A mãe de 32 anos carregou a mutação em 14%, 47% e 35% no sangue, SF e urina, respectivamente. Todos os seus 3 filhos herdaram essa mutação (Figura 6C).[0135] The fifth family comes from a large, well-studied strain of MELAS carrying an A3243G pathogenic mutation (Figure 10B) (McClelland K, 2014, https://scholarworks.csustan.edu/bitstream/handle/011235813/793/McClellandK. sum mer2014% 20.pdf? Sequence = 1; network site last accessed on November 28, 2016 and incorporated by reference in this document). The 32-year-old mother carried the mutation in 14%, 47% and 35% in blood, SF and urine, respectively. All of her 3 children inherited this mutation (Figure 6C).
[0136]Esses resultados indicaram que mutações patogênicas de mtDNA transmitidas pela mãe foram implicadas em quatro das cinco famílias estudadas. O fenótipo de LS clínico na quarta família não foi associado a nenhuma mutação patogênica do mtDNA e, portanto, foi excluído de análises posteriores. Isso destaca a importância do teste genético para doenças de mtDNA herdadas pela mãe antes de MRT. Além disso, uma vez que os níveis de heteroplasmia podem variar entre os[0136] These results indicated that pathogenic mtDNA mutations transmitted by the mother were implicated in four of the five families studied. The clinical LS phenotype in the fourth family was not associated with any pathogenic mtDNA mutation and, therefore, was excluded from further analysis. This highlights the importance of genetic testing for mtDNA diseases inherited by the mother before MRT. In addition, since levels of heteroplasm can vary between
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36/55 diferentes tecidos, é crucial amostrar e testar o sangue, a pele e a urina, tanto em mães quanto em crianças (Monnot S e outros., Hum Mutat 32, 116-125, 2011); incorporado aqui por referência).36/55 different tissues, it is crucial to sample and test blood, skin and urine, both in mothers and children (Monnot S et al., Hum Mutat 32, 116-125, 2011); incorporated here by reference).
[0137]Doadores de oócitos voluntários saudáveis foram também triados e foi confirmado que não possuíam quaisquer mutações patogênicas de mtDNA herdadas. As suas sequências de mtDNA e o correspondente haplótipo foram subsequentemente utilizados para combinações de MRT correspondentes.[0137] Healthy voluntary oocyte donors were also screened and it was confirmed that they did not have any inherited pathogenic mtDNA mutations. Its mtDNA sequences and the corresponding haplotype were subsequently used for corresponding combinations of MRT.
[0138]Exemplo 9 - COS (estimulação ovariana controlada), recuperação de oócitos e mutações em oócitos [0139]Mulheres com doença de mtDNA exibem taxas de nascidos vivos comparáveis à população geral, portanto, aceita-se que elas tenham fertilidade normal. No entanto, a resposta ovariana à estimulação de gonadotrofinas e à recuperação de oócitos em mulheres portadoras de mutações patogênicas de mtDNA (portadores) foi avaliada.[0138] Example 9 - COS (controlled ovarian stimulation), oocyte recovery and oocyte mutations [0139] Women with mtDNA disease exhibit rates of live births comparable to the general population, so it is accepted that they have normal fertility. However, the ovarian response to gonadotropin stimulation and oocyte recovery in women with pathogenic mtDNA mutations (carriers) was evaluated.
[0140]A idade foi similar entre portadores e doadores saudáveis. Os níveis de AMH, uma medida da reserva ovariana, foram mais baixos nos portadores do que nos doadores saudáveis (1,1 vs. 4,8 ng / ml). A contagem de folículos antrais (AFC) também foi menor nos portadores em comparação com os doadores saudáveis (10,3 vs. 22,3). Além disso, a duração da COS foi de aproximadamente um dia a mais nos portadores e o nível de pico de estradiol no sangue (E2) antes da administração de hCG também foi menor. Finalmente, o número total e o número de oócitos Mil maduros recuperados também foram significativamente menores nos portadores (5,8 vs. 16,6 e 3,8 vs. 13,2, respectivamente) (Figuras 11 A, 11B, 11C, 11 D, 11E, 11F e 11G). Nota-se que um portador (cED2) exibiu luteinização prematura, evidenciada pelo aumento dos níveis de progesterona antes do surto de LH (Figura 11H). Portanto, as análises de mutação foram realizadas apenas em oócitos atrésicos recuperados.[0140] Age was similar between healthy carriers and donors. AMH levels, a measure of ovarian reserve, were lower in patients than in healthy donors (1.1 vs. 4.8 ng / ml). The count of antral follicles (AFC) was also lower in patients compared to healthy donors (10.3 vs. 22.3). In addition, the duration of COS was approximately one day longer in patients and the peak level of estradiol in the blood (E2) before the administration of hCG was also lower. Finally, the total number and number of mature Thousand oocytes recovered were also significantly lower in the carriers (5.8 vs. 16.6 and 3.8 vs. 13.2, respectively) (Figures 11 A, 11B, 11C, 11 D, 11E, 11F and 11G). It is noted that one carrier (cED2) exhibited premature luteinization, evidenced by the increase in progesterone levels before the LH outbreak (Figure 11H). Therefore, mutation analyzes were performed only on recovered atretic oocytes.
[0141 ]Embora os números na coorte tenham sido baixos (Smeets HJ e outros,[0141] Although the numbers in the cohort were low (Smeets HJ and others,
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Ann NY Acad Sci 1350, 29 a 36 (2015); aqui incorporado por referência), os resultados sugerem que a mutação do mtDNA podería levar à redução da resposta ovariana. A idade avançada e o IMC mais elevado nos portadores também poderíam ter afetado o resultado (Kelsey TW e outros, PLoS One 6, e22024 (2011) e Kelsey TW e outros, Mol Hum Reprod 18, 79 a 87 (2012); ambos são aqui incorporados por referência). Outro potencial fator contribuinte é a contracepção hormonal a longo prazo em que essas mulheres estavam antes da estimulação ovariana.Ann NY Acad Sci 1350, 29-36 (2015); incorporated herein by reference), the results suggest that the mtDNA mutation could lead to a reduction in the ovarian response. Advanced age and higher BMI in patients could also have affected the result (Kelsey TW and others, PLoS One 6, e22024 (2011) and Kelsey TW and others, Mol Hum Reprod 18, 79 to 87 (2012); both are incorporated herein by reference). Another potential contributing factor is the long-term hormonal contraception these women were in before ovarian stimulation.
[0142]Mutações de MtDNA foram então identificadas em oócitos individuais dos portadores. Após a remoção do fuso Mil (genoma nuclear), os citoplastos (mtDNA) foram utilizados para o sequenciamento. No primeiro portador, dois oócitos recuperados continham a mutação T8993G nos níveis de 86% e 96%. No segundo portador irmão, os níveis de heteroplasmia em 5 oócitos atrésicos variaram de 72% a 100%. Em 4 oócitos do terceiro portador de LS, os níveis de mutação G13513A em 3 óvulos foram muito baixos (0,6 a 3%), enquanto no quarto foi de 40%. Finalmente, em nove oócitos do portador A3243G de MELAS, a mutação não foi detectada em um óvulo, enquanto o restante continha 9 a 52% (Figura 7A). Na busca de um método para prever os níveis de mutação de oócitos, os níveis médios de heteroplasmia no sangue de crianças irmãs altamente foram correlacionados com os níveis de oócitos (Brown DT e outros, Am J Hum Genet 68, 533 a 536 (2001); incorporado aqui por referência) (R2 = 0,52 vs. 0,85, Figura 7B).[0142] MtDNA mutations were then identified in individual carriers' oocytes. After removing the Mil spindle (nuclear genome), cytoplasts (mtDNA) were used for sequencing. In the first carrier, two retrieved oocytes contained the T8993G mutation at levels of 86% and 96%. In the second sibling, the levels of heteroplasm in 5 atresic oocytes ranged from 72% to 100%. In 4 oocytes from the third carrier of LS, the levels of G13513A mutation in 3 eggs were very low (0.6 to 3%), while in the fourth it was 40%. Finally, in nine oocytes of the MEL24 carrier A3243G, the mutation was not detected in an egg, while the rest contained 9 to 52% (Figure 7A). In the search for a method to predict mutation levels of oocytes, the mean levels of heteroplasmia in the blood of sister children were highly correlated with the levels of oocytes (Brown DT et al., Am J Hum Genet 68, 533 to 536 (2001) ; incorporated here by reference) (R 2 = 0.52 vs. 0.85, Figure 7B).
[0143]Em seguida, sequências de mtDNA integrais foram analisadas em oócitos portadores em um esforço para rastrear mutações secundárias de mtDNA. Comparações foram feitas com oócitos de doadores saudáveis. Os oócitos de portadores continham variantes heteroplásmicas secundárias do mtDNA, no entanto, o número médio por oócito não foi significativamente diferente dos controles saudáveis (2,2 vs. 1,3; p > 0,05) (Figura 7C). Algumas destas variantes estavam presentes em vários oócitos do mesmo portador e também foram encontradas no[0143] Next, whole mtDNA sequences were analyzed in carrier oocytes in an effort to track secondary mtDNA mutations. Comparisons were made with oocytes from healthy donors. The carrier oocytes contained secondary heteroplastic variants of mtDNA, however, the mean number per oocyte was not significantly different from healthy controls (2.2 vs. 1.3; p> 0.05) (Figure 7C). Some of these variants were present in several oocytes from the same carrier and were also found in
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38/55 sangue, pele ou em crianças irmãs sugerindo mutações na linhagem germinativa recorrentes. No entanto, essas variantes foram mutações D-loop não codificantes. Outras foram encontradas apenas em um oócito dentro do grupo indicativo de mutações de novo (45%). A maioria (83%) dessas variantes secundárias eram mutações heteroplásmicas de baixo nível (< 15%) (Figura 111). O número de cópias de MtDNA por oócito foi usado como uma medida indireta da qualidade do oócito (Monot S e outros, Hum Mol Genet 22, 1867 a 1872 (2013) e Fragouli E e outros, PLoS Genet 11, e1005241 (2015); incorporados aqui por referência). Não foram observadas diferenças significativas entre oócitos saudáveis e portadores (média de 348.954 vs. 283.605, respectivamente) (Figura 7D). Um número baixo de cópias de mtDNA pode desempenhar um papel na redução da reserva ovariana (Boucret e outros, Hum Reprod 30, 1653 a 1664 (2015); aqui incorporada por referência), mas nenhuma correlação entre o número de cópias de oócitos e os níveis de AMH foi observada aqui (Figura 11J).38/55 blood, skin or in sister children suggesting recurrent germline mutations. However, these variants were non-coding D-loop mutations. Others were found only in one oocyte within the group indicative of de novo mutations (45%). The majority (83%) of these secondary variants were low-level heteroplastic mutations (<15%) (Figure 111). The number of copies of MtDNA per oocyte was used as an indirect measure of oocyte quality (Monot S et al., Hum Mol Genet 22, 1867 to 1872 (2013) and Fragouli E et al., PLoS Genet 11, e1005241 (2015); incorporated here by reference). There were no significant differences between healthy and carrier oocytes (average of 348,954 vs. 283,605, respectively) (Figure 7D). A low number of mtDNA copies may play a role in reducing ovarian reserve (Boucret et al., Hum Reprod 30, 1653 to 1664 (2015); incorporated herein by reference), but no correlation between the number of oocyte copies and the AMH levels were observed here (Figure 11J).
[0144]Em conclusão, os oócitos de portadores foram de qualidade normal e os níveis de mutações no sangue de crianças irmãs parecem ser de valor preditivo para a mutação em coortes de oócitos.[0144] In conclusion, the carrier oocytes were of normal quality and the levels of mutations in the blood of sister children appear to be of predictive value for the mutation in oocyte cohorts.
[0145]Exemplo 10 - Transferência de fuso (ST) em oócitos de portadores de mutação de mtDNA [0146]Fusos meióticos (carioplastos; com mtDNA materno de transporte) recuperados a partir de oócitos de portador de Mil (n = 13) foram transferidos para oócitos de doadores enucleados (citoplastos; mtDNA do doador) (Figura 8A) enquanto controles envolveram ST entre oócitos saudáveis (n = 36) com haplótipos de mtDNA pré-selecionados (Figura 12A). Todos os carioplastos e citoplastos sobreviveram às micromanipulações e fusão, com exceção de um no grupo controle. Oócitos ST, juntamente com controles intactos (não manipulados), foram então fertilizados por injeção intracitoplasmática de esperma (ICSI) e cultivados em blastocistos. Altas taxas[0145] Example 10 - Spindle transfer (ST) in oocytes of carriers of mtDNA mutation [0146] Meiotic spindles (carioplasts; with maternal transport mtDNA) recovered from Mil carrier oocytes (n = 13) were transferred for enucleated donor oocytes (cytoplasts; donor mtDNA) (Figure 8A) while controls involved ST among healthy oocytes (n = 36) with pre-selected mtDNA haplotypes (Figure 12A). All karyoplasts and cytoplasts survived micromanipulation and fusion, with the exception of one in the control group. ST oocytes, together with intact (unhandled) controls, were then fertilized by intracytoplasmic sperm injection (ICSI) and cultured in blastocysts. High taxes
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39/55 de fertilização, comparáveis aos controles intactos, foram observadas em ambos os grupos ST (Figura 8A e Figuras 12B e 12C). O desenvolvimento subsequente de zigotos ST portadores diploides para o estágio de blastocisto foi de 75%, similar aos controles. Um padrão similar de desenvolvimento foi observado entre portadores de ST com diferentes tipos de mutação (8993ST, 13513ST e 3243ST) (Figura 8B).39/55 of fertilization, comparable to intact controls, were observed in both ST groups (Figure 8A and Figures 12B and 12C). The subsequent development of ST diploid zygotes for the blastocyst stage was 75%, similar to controls. A similar pattern of development was observed among ST patients with different types of mutations (8993ST, 13513ST and 3243ST) (Figure 8B).
[0147]Para abordar a assincronia de COS, idealmente, tanto os doadores portadores quanto os doadores saudáveis seriam submetidos a recuperações no mesmo dia com o ponto final de um número similar de oócitos maduros para ST. Uma abordagem alternativa para alcançar esses objetivos envolve congelamento, armazenamento e descongelamento de oócitos. ST entre oócitos frescos e vitrificados (ST congelado) foi conduzido. A taxa de fertilização geral usando oócitos vitrificados foi comparável à ST fresca, enquanto a formação de zigotos diploides normais foi menor (Figura 8A). Não foram observadas diferenças na fertilização entre a vitrificação do carioplasto e do citoplasto (Figura 12D).[0147] To address COS asynchrony, ideally, both donor carriers and healthy donors would undergo recovery on the same day with the end point of a similar number of mature oocytes for ST. An alternative approach to achieving these goals involves freezing, storing and thawing oocytes. ST between fresh and vitrified oocytes (frozen ST) was conducted. The general fertilization rate using vitrified oocytes was comparable to fresh ST, while the formation of normal diploid zygotes was lower (Figure 8A). There were no differences in fertilization between the vitrification of the carioplasty and the cytoplasty (Figure 12D).
[0148]Uma vez que o risco de falhas de comunicação entre genomas nucleares e mitocondriais levou a preocupações quanto à potencial disfunção metabólica secundária (Woodson JD & Chory J, Nat Rev Genet 9, 383 a 395 (2008); aqui incorporado por referência), o desenvolvimento do embrião ST foi analisado como uma função da distância da sequência do mtDNA do doador. Os oócitos e embriões ST foram agrupados com base no número de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) entre o mtDNA original (materno) e o mtDNA do doador de oócitos, variando do próximo (6 SNPs) ao meio (33 SNPs) e ao distante (57 SNPs) (Figura 12A). As taxas de fertilização e blastulação foram similares entre os três grupos ST, sugerindo que o desenvolvimento embrionário não é comprometido (Figura 8C). Linhagens ESC foram estabelecidas a partir de blastocistos ST e diferenciadas em cardiomiócitos de células progenitoras neurais (NPCs) e teratomas. Foram observadas eficiências de diferenciação comparáveis entre a atividade enzimática da[0148] Since the risk of communication failures between nuclear and mitochondrial genomes has led to concerns about potential secondary metabolic dysfunction (Woodson JD & Chory J, Nat Rev Genet 9, 383 to 395 (2008); incorporated herein by reference) , the development of the ST embryo was analyzed as a function of the donor mtDNA sequence distance. ST oocytes and embryos were grouped based on the number of single nucleotide polymorphisms (SNPs) between the original (maternal) mtDNA and the oocyte donor mtDNA, ranging from the next (6 SNPs) to the middle (33 SNPs) and the distant (57 SNPs) (Figure 12A). Fertilization and blastulation rates were similar between the three ST groups, suggesting that embryonic development is not compromised (Figure 8C). ESC lines were established from ST blastocysts and differentiated into neural progenitor cell cardiomyocytes (NPCs) and teratomas. Comparable differentiation efficiencies have been observed between the enzyme activity of
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 46/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 46/95
40/55 cadeia respiratória mitocondrial (RC) e as taxas de consumo de oxigênio (OCR) entre os derivados ESC contendo 6 ou 49 diferenças de SNP (Figuras 8D, 13A, 13B, 16A e 16B). Curiosamente, as células diferenciadas de uma linhagem ST-ESC com 33 diferenças de SNP mostraram níveis de OCR significativamente reduzidos, aludindo possível incompatibilidade nuclear a mitocondrial.40/55 mitochondrial respiratory chain (CR) and oxygen consumption rates (OCR) between ESC derivatives containing 6 or 49 SNP differences (Figures 8D, 13A, 13B, 16A and 16B). Interestingly, cells differentiated from an ST-ESC strain with 33 SNP differences showed significantly reduced OCR levels, alluding to possible nuclear to mitochondrial incompatibility.
[0149]Em resumo, o MRT em oócitos portadores por ST resultou em alta fertilização e desenvolvimento de blastocistos similar aos controles. Além disso, o desenvolvimento embrionário, a derivação e a diferenciação de ESC não foram afetados pelo background genético do mtDNA do doador. No entanto, é possível que determinado mtDNA de doador possa não funcionar adequadamente, um processo que foi independente das diferenças totais de SNP.[0149] In summary, MRT in oocytes carrying ST resulted in high fertilization and development of blastocysts similar to controls. In addition, the embryonic development, derivation and differentiation of ESC were not affected by the genetic background of the donor's mtDNA. However, it is possible that a given donor mtDNA may not function properly, a process that was independent of the total SNP differences.
[0150]Exemplo 11 - Anormalidades do Genoma Nuclear [0151]Como os embriões ST podem estar em risco de anormalidades cromossômicas ou subcromossômicas, os blastocistos expandidos derivados de embriões ST e de controle foram biopsiados e examinados por arranjo CGH (hibridização comparativa do genoma). Uma taxa de aneuploidia ligeiramente maior foi observada em ambos os grupos ST em relação aos controles intactos, mas a diferença não foi significativa. Isso pode estar relacionado à maior idade materna no grupo de portadores (Figuras 14A e 17). Em seguida, foi realizada análise cariotípica de bandas G em ST e ESCs de controle. Cariótipos anormais foram observados em todos os grupos, mas não foram encontradas diferenças significativas. Bandas G também detectaram casos de mosaicismo cromossômico e poliploidia (Figuras 14B e 18). Assim, para detectar anormalidades cromossômicas, o diagnóstico genético préimplantação pode ser realizado antes da transferência de embrião MRT.[0150] Example 11 - Nuclear Genome Abnormalities [0151] Since ST embryos may be at risk for chromosomal or subchromosomal abnormalities, expanded blastocysts derived from ST and control embryos were biopsied and examined by CGH (comparative genome hybridization) . A slightly higher rate of aneuploidy was observed in both ST groups compared to intact controls, but the difference was not significant. This may be related to the higher maternal age in the group of patients (Figures 14A and 17). Then, a karyotype analysis of G bands in ST and control ESCs was performed. Abnormal karyotypes were observed in all groups, but no significant differences were found. G bands also detected cases of chromosomal mosaicism and polyploidy (Figures 14B and 18). Thus, to detect chromosomal abnormalities, the preimplantation genetic diagnosis can be performed before the transfer of the MRT embryo.
[0152]Variações no número de cópias (CNVs) foram examinadas em linhagens de células ST-ES selecionadas para explorar possíveis anormalidades subcromossômicas (deleção ou duplicação) (Lupski JR, Trends Genet 14, 417 a 422[0152] Copy number variations (CNVs) were examined in selected ST-ES cell lines to explore possible subchromosomal abnormalities (deletion or duplication) (Lupski JR, Trends Genet 14, 417 to 422
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 47/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 47/95
41/55 (1998) e Sharp AJ e outros, Nat Genet 38, 1038 a 1042 (2006), ambos aqui incorporados por referência). CNVs de novo foram detectadas em ambos os controles, ST e intactos, mas foram consideradas de significado clínico incerto (Kearny HM e outros, Genet Med 13, 680 a 685 (2011); aqui incorporado por referência).41/55 (1998) and Sharp AJ et al., Nat Genet 38, 1038 to 1042 (2006), both of which are incorporated herein by reference). Again CNVs were detected in both controls, ST and intact, but were considered of uncertain clinical significance (Kearny HM et al., Genet Med 13, 680 to 685 (2011); incorporated herein by reference).
[0153]Em resumo, um total de 6 blastocistos ST foi produzido a partir de 4 ciclos de estimulação ovariana em portadores (Tabela 4). Um blastocisto foi aneuploide e quatro foram elegíveis para transferência com base em avaliações de qualidade morfológica. Esses resultados foram comparáveis aos controles.[0153] In summary, a total of 6 ST blastocysts were produced from 4 cycles of ovarian stimulation in patients (Table 4). One blastocyst was aneuploid and four were eligible for transfer based on morphological quality assessments. These results were comparable to controls.
[0154]Tabela 4. Resultados de MRT para famílias com mutações patogênicas de mtDNA[0154] Table 4. MRT results for families with pathogenic mtDNA mutations
Seis embriões ST derivados de oócitos carregando mutações patogênicas de mtDNA alcançaram o estágio de blastocisto. Ao menos 2 blastocistos foram elegíveis para transferência. *, mtDNA em ESCs a partir desse blastocisto reverteu para haplótipo de mtDNA materno, mas era de ocorrência natural (não carregava mutação A3243G). n/a, não aplicável; n/t, não testado.Six ST embryos derived from oocytes carrying pathogenic mtDNA mutations have reached the blastocyst stage. At least 2 blastocysts were eligible for transfer. *, mtDNA in ESCs from that blastocyst reverted to a maternal mtDNA haplotype, but it was naturally occurring (did not carry A3243G mutation). n / a, not applicable; n / t, not tested.
[0155]Exemplo 12 - Manutenção do mtDNA do doador em embriões ST e[0155] Example 12 - Maintenance of donor mtDNA in ST embryos and
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 48/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 48/95
42/55 linhagens ESC [0156]A eficácia e a segurança de MRT dependem não somente do grau de mtDNA materno inicialmente cotransferido com o carioplasto, mas também de sua subsequente persistência e possível amplificação em embriões. Estudos recentes observaram que, devido à deriva genética, alguns MRT ESCs restauraram o mtDNA materno (Yamada M e outros, Cell Stem Cell 18, 749 a 754 (2016) e Hyslop LA e outros, Nature 534, 383 a 386 (2016); que são aqui incorporados por referência). Claramente, uma pequena quantidade de transporte de mtDNA materno é comum durante ST resultando em baixa heteroplasmia em embriões humanos e em descendentes de primatas não humanos (tipicamente abaixo de 2%) (Pauli D e outros, Nature 493, 632 a 637 (2013); incorporado aqui por referência). Aqui, todos os zigotos ST examinados e embriões clivantes (n = 22) continham > 99% do mtDNA do doador (Tabela 5) e resultados similares foram observados em 13 das 15 linhagens de células ES (87%) estabelecidas a partir de blastocistos ST controlados, independentemente do haplótipo do mtDNA do doador. No entanto, 2 linhagens ESC de embriões ST irmãos (ST-ES7 e ST-ES8), geradas pela combinação de U5a materno e mtDNA H1 b de doador (33 SNPs), apresentaram níveis elevados de mtDNA materno (81 % e 94%) (Tabela 5). A passagem prolongada resultou em uma perda completa do mtDNA do doador e retornou ao haplótipo do mtDNA materno original (100%). Curiosamente, duas outras linhagens de ESC geneticamente relacionadas (ST-ES5 e ST-ES6) derivadas da combinação recíproca de H1 b materno e U5a de doador mostraram alta manutenção do mtDNA do doador (> 99%). Outra linhagem ESC gerada a partir de U5a materno e mtDNA V3 de doador (ST-ES9; 33 SNPs) também carregou predominantemente mtDNA do doador.42/55 ESC strains [0156] The efficacy and safety of MRT depend not only on the degree of maternal mtDNA initially co-transferred with the karyoplast, but also on its subsequent persistence and possible amplification in embryos. Recent studies have observed that, due to genetic drift, some MRT ESCs have restored maternal mtDNA (Yamada M et al., Cell Stem Cell 18, 749 to 754 (2016) and Hyslop LA et al., Nature 534, 383 to 386 (2016); which are hereby incorporated by reference). Clearly, a small amount of maternal mtDNA transport is common during TS resulting in low heteroplasm in human embryos and offspring of non-human primates (typically below 2%) (Pauli D et al., Nature 493, 632 to 637 (2013) ; incorporated here by reference). Here, all examined ST zygotes and cleaving embryos (n = 22) contained> 99% of donor mtDNA (Table 5) and similar results were observed in 13 of the 15 ES cell lines (87%) established from ST blastocysts controlled, regardless of the donor's mtDNA haplotype. However, 2 ESC strains of ST sibling embryos (ST-ES7 and ST-ES8), generated by the combination of maternal U5a and donor H1 b mtDNA (33 SNPs), showed high levels of maternal mtDNA (81% and 94%) (Table 5). The prolonged passage resulted in a complete loss of the donor's mtDNA and returned to the original maternal mtDNA haplotype (100%). Interestingly, two other genetically related ESC strains (ST-ES5 and ST-ES6) derived from the reciprocal combination of maternal H1 b and donor U5a showed high maintenance of donor mtDNA (> 99%). Another ESC strain generated from maternal U5a and donor mtDNA V3 (ST-ES9; 33 SNPs) also carried predominantly donor mtDNA.
[0157]Tabela 5. mtDNA do doador em embriões MRT humanos préimplantação e linhagens ESC[0157] Table 5. mtDNA from donor in pre-implantation human MRT embryos and ESC lines
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 49/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 49/95
43/5543/55
Diferenças de SNPsSNP differences
TratamentoTreatment
LinhagensStrains
Estágio do emhriãsjStage of emhriãsj
Embriões · çxrvv· pré^mplaataçâo : ΧΧν&ΛίEmbryos · çxrvv · pre-implantation: ΧΧν & Λί
Haptôtip-o Hajstétípo matem© do doadorHaptôtip-o Hajstétípo matem © donor
cel-tdas 0.1 cè-testos 0 § eôEuias (14 íâceiuias p.,4 1: sj&füia 0 4 2 O fcel-tdas 0.1 cè-tests 0 § eôEuias (14 âceeuias p., 4 1: sj & füia 0 4 2 O f
ST ê séltdas (Its fSórtdaST ê séltdas (Its fSórtda
1: séfiiia h$èruta cetoia1: séfiiia h $ èruta cetoia
1- ee-tuis eékda cs Euia .MS1- ee-tuis eékda cs Euia .MS
EuJa c-ekaias ©elidasPortador gy 1 cetuiaEuJa c-ekaias © elidasPortador gy 1 cetuia
S oeiniasS oeinias
H4<H4 <
[0158]Dentre as três linhagens ST-ESC portadoras, 3243ST-ES1 também continha um nível significativo de mtDNA materno (20%) (Tabela 5). No entanto, este haplótipo H49 materno não incluiu a mutação A3243G. Os níveis de mtDNA materno nesta linhagem celular aumentaram gradualmente durante a cultura estendida para[0158] Among the three carrier ST-ESC strains, 3243ST-ES1 also contained a significant level of maternal mtDNA (20%) (Table 5). However, this maternal H49 haplotype did not include the A3243G mutation. The levels of maternal mtDNA in this cell line gradually increased during the extended culture to
90% na passagem 8 e para homoplasmia na p.10 (Figura 9A). Notavelmente, outra linhagem ESC de irmão (3243ST-ES2) gerada pela mesma combinação de mtDNA materno e de doador não mostrou nenhum aumento no mtDNA materno,90% in passage 8 and for homoplasm on p.10 (Figure 9A). Notably, another sibling ESC strain (3243ST-ES2) generated by the same combination of maternal and donor mtDNA did not show any increase in maternal mtDNA,
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 50/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 50/95
44/55 presumivelmente devido a efeitos estocásticos ou de gargalo (Tabela 5).44/55 presumably due to stochastic or bottleneck effects (Table 5).
[0159]O estudo foi ampliado para incluir oito linhagens ESC derivadas por SCNT (NT-ESCs) que também carregam mtDNA de oócito de doador (Tabela 5) (Tachibana M e outros, Cell 153, 1228 a 1238 (2013); Ma H e outros, Nature 524, 234 a 238 (2015), e Kang E e outros, Cell Stem Cell 18, 625ã 636 (2016); aqui incorporados por referência). A dinâmica da heteroplasmia de mtDNA foi analisada durante a passagem estendida e identificou que o NT-ES8 apresentou um aumento gradual do mtDNA materno (somático) de 19% em p. 2 para 100% em p.10 (Tabela 5, Figura 15A). Nota-se que esta linhagem NT-ESC foi gerada por combinação de haplótipos de mtDNA materno X2c e de doador D4a (39 SNPs).[0159] The study was expanded to include eight SCNT-derived ESC strains (NT-ESCs) that also carry donor oocyte mtDNA (Table 5) (Tachibana M et al., Cell 153, 1228 to 1238 (2013); Ma H and others, Nature 524, 234-238 (2015) and Kang E and others, Cell Stem Cell 18, 625 to 636 (2016); incorporated herein by reference). The dynamics of mtDNA heteroplasm was analyzed during the extended passage and identified that the NT-ES8 showed a gradual increase in maternal (somatic) mtDNA of 19% in foot. 2 to 100% in p.10 (Table 5, Figure 15A). Note that this NT-ESC strain was generated by a combination of maternal mtDNA X2c and donor D4a haplotypes (39 SNPs).
[0160]Em conclusão, o ST permite a substituição eficiente do mtDNA do oócito com o mtDNA transportado muito baixo nos embriões resultantes pré-implantação. A maioria dos ESCs derivados dos blastocistos ST manteve predominantemente o mtDNA do doador. No entanto, algumas linhagens ESC apresentaram perda gradual mtDNA do doador e reversão para o mtDNA materno, exigindo mais pesquisas para compreender melhor os mecanismos subjacentes.[0160] In conclusion, the ST allows efficient replacement of the oocyte's mtDNA with very low transported mtDNA in the resulting pre-implantation embryos. Most ESCs derived from ST blastocysts maintained predominantly the donor's mtDNA. However, some ESC strains showed gradual loss of donor mtDNA and reversion to maternal mtDNA, requiring further research to better understand the underlying mechanisms.
[0161 ]Exemplo 13 - Mecanismos moleculares e celulares que contribuem para a manutenção do mtDNA do doador [0162]Com base na observação de que combinações de haplótipos específicos levaram à reversão para o mtDNA materno, assumiu-se que isso podería ser devido à replicação preferencial de haplótipos específicos de mtDNA ou que certos mtDNAs dotavam células com vantagens de crescimento (Burgstaller JP e outros, Mol Hum Reprod 21, 11 a 22 (2015) e Agaronyan K e outros, Science 347, 548 a 551 (2015), ambos aqui incorporados por referência).[0161] Example 13 - Molecular and cellular mechanisms that contribute to the maintenance of donor mtDNA [0162] Based on the observation that combinations of specific haplotypes led to the reversion to maternal mtDNA, it was assumed that this could be due to replication preferential use of specific mtDNA haplotypes or that certain mtDNAs endowed cells with growth advantages (Burgstaller JP et al., Mol Hum Reprod 21, 11 to 22 (2015) and Agaronyan K et al., Science 347, 548 to 551 (2015), both incorporated herein by reference).
[0163]A região D-loop altamente polimórfica do mtDNA, denominada caixa de sequência II conservada (CSBII) foi focada em primeiro lugar. Foi anteriormente demonstrado que um polimorfismo raro na CSBII, ou seja, G5AG7, afeta a eficiência[0163] The highly polymorphic D-loop region of mtDNA, called conserved sequence II box (CSBII) was focused on first. It has previously been shown that a rare polymorphism in CSBII, that is, G5AG7, affects efficiency
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 51/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 51/95
45/55 da terminação da transcrição mitocondrial e da geração de iniciadores de replicação. Quando o mtDNA do doador e o mtDNA materno foram comparados em urn total de 26 linhagens ESC com 18 diferentes combinações de haplótipos, observou-se que dois irmãos “reversos” ST-ES7 e ST-ES8 carregavam mtDNA do doador com um polimorfismo G5AG8 enquanto o mtDNA materno era G6AG8. Utilizando ensaios de transcrição in vitro, determinou-se se a síntese do iniciador de replicação pela RNA polimerase mitocondrial foi afetada no mtDNA do doador. Verificou-se que a deleção de um único resíduo de guanosina (G5AG8 vs. G6AG8) no mtDNA do doador resulta em uma redução de 4 vezes da síntese do iniciador de replicação (Figura 9a). Portanto, certos haplótipos de mtDNA variando na sequência de CSBII fornecem uma síntese mais eficiente do iniciador de replicação e, subsequentemente, podem alcançar uma vantagem replicativa. Sem estar limitado pela teoria, esse mecanismo podería explicar o fenômeno da replicação preferencial do mtDNA materno em algumas das linhagens ESC. A análise de sequências não encontrou diferenças de CSBII SNP nos restantes dois 3243ST-ES1 e NT-ES8 revertidos. Foram observados vários outros polimorfismos de D-loop, incluindo a região do núcleo TAS, que também está implicada na regulação da replicação de mtDNA (Jemt E e outros, Nucl Acids Res 43, 9262 a 9275 (2015); aqui incorporado por referência). Embora o mecanismo exato pelo qual esses polimorfismos afetam a replicação permaneça obscuro, podese especular que, similar às regiões CSBII eTAS, algumas variantes de D-loop podem resultar em viés de replicação de um haplótipo particular de mtDNA.45/55 of mitochondrial transcription termination and generation of replication primers. When donor mtDNA and maternal mtDNA were compared in a total of 26 ESC strains with 18 different combinations of haplotypes, it was observed that two “reverse” brothers ST-ES7 and ST-ES8 carried donor mtDNA with a G5AG8 polymorphism while the maternal mtDNA was G6AG8. Using in vitro transcription assays, it was determined whether the synthesis of the replication primer by mitochondrial RNA polymerase was affected in the donor's mtDNA. It was found that the deletion of a single guanosine residue (G5AG8 vs. G6AG8) in the donor mtDNA results in a 4-fold reduction in the replication primer synthesis (Figure 9a). Therefore, certain mtDNA haplotypes varying in the CSBII sequence provide a more efficient synthesis of the replication primer and, subsequently, can achieve a replicative advantage. Without being limited by theory, this mechanism could explain the phenomenon of preferential replication of maternal mtDNA in some of the ESC strains. Sequence analysis found no differences in CSBII SNP in the remaining two 3243ST-ES1 and NT-ES8 reversed. Several other D-loop polymorphisms have been observed, including the TAS nucleus region, which is also involved in the regulation of mtDNA replication (Jemt E et al., Nucl Acids Res 43, 9262 to 9275 (2015); incorporated herein by reference) . Although the exact mechanism by which these polymorphisms affect replication remains unclear, it can be speculated that, similar to the CSBII and TAS regions, some D-loop variants may result in replication bias for a particular mtDNA haplotype.
[0164]Também foi considerado se os mecanismos independentes de replicação adicionais afetam a reversão para o mtDNA materno e examinado o aumento do mtDNA materno em 3243ST-ES1 e NT-ES8 revertidos em culturas integrais ou clones de células individuais. Os níveis iniciais de mtDNA materno aumentaram com a passagem em culturas integrais (Figuras 9B, 9C e 15A). No entanto, quando as ESCs foram desassociadas em células individuais e clones[0164] It was also considered whether the additional independent replication mechanisms affect the reversion to maternal mtDNA and examined the increase in maternal mtDNA by 3243ST-ES1 and NT-ES8 reversed in whole cultures or individual cell clones. The initial levels of maternal mtDNA increased with the passage in whole cultures (Figures 9B, 9C and 15A). However, when ESCs were disassociated in individual cells and clones
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 52/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 52/95
46/55 isolados de células individuais cultivadas, os níveis iniciais de mtDNA materno variaram em diferentes clones, mas a heteroplasmia no se alterou com a cultura estendida (Figura 9D). Diferenças significativas na proliferação celular e nas taxas de crescimento entre os diferentes clones foram observadas. Os clones com maiores níveis de mtDNA materno exibiram taxas de crescimento significativamente mais rápidas do que os clones com menor heteroplasmia de mtDNA materno (Figura 9E). Estes resultados sugerem que certos haplótipos de mtDNA conferem às ESCs crescimento mais rápido e vantagens proliferativas. Assim, em culturas mistas consistindo de células com variada heteroplasmia, uma subpopulação de células com maior mtDNA materno pode supercrescer células com mtDNA do doador.46/55 isolated from individual cultured cells, the initial levels of maternal mtDNA varied in different clones, but the heteroplasm did not change with the extended culture (Figure 9D). Significant differences in cell proliferation and growth rates between different clones were observed. Clones with higher levels of maternal mtDNA exhibited significantly faster growth rates than clones with lower maternal mtDNA heteroplasm (Figure 9E). These results suggest that certain mtDNA haplotypes give ESCs more rapid growth and proliferative advantages. Thus, in mixed cultures consisting of cells with varying heteroplasm, a subpopulation of cells with greater maternal mtDNA can overgrow cells with donor mtDNA.
[0165]As atividades enzimáticas do complexo I e do complexo IV da cadeia respiratória mitocondrial foram medidas em células carregando vários haplótipos de mtDNA, mas não foram encontradas diferenças significativas. Isto sugere que a reversão para o mtDNA materno é independente da atividade mitocondrial (Figura 15B).[0165] The enzyme activities of complex I and complex IV of the mitochondrial respiratory chain were measured in cells carrying several mtDNA haplotypes, but no significant differences were found. This suggests that the reversion to maternal mtDNA is independent of mitochondrial activity (Figure 15B).
[0166]Em seguida, foi examinado se a reversão é específica para ESCs não diferenciadas ou podería ocorrer durante a diferenciação. Diversas ESCs revertidas e não revertidas foram diferenciadas in vitro em NPCs e cardiomiócitos, e em teratomas in vivo. Os níveis de mtDNA materno foram medidos antes e depois da diferenciação (Figuras 16A, 16B). Os níveis de mtDNA materno em 3243ST-ES1 revertido reduziram-se a níveis indetectáveis em alguns tecidos, mas foram levemente elevados em outros tipos de células em comparação com os 4% iniciais em ESCs não diferenciados (Figura 9F). O mtDNA materno era indetectável durante a diferenciação in vivo e in vitro da linhagem de células irmãs não revertidas 3243ST-ES2. Em contraste, os níveis de mtDNA materno aumentaram em todos os tecidos diferenciados testados em ST-ES7 e NT-ES8 revertidos (Figura 9F). Estes resultados demonstram que o fenômeno de reversão do mtDNA não é exclusivo das ESCs e[0166] Next, it was examined whether the reversal is specific for non-differentiated ESCs or could occur during differentiation. Several reversed and non-reversed ESCs were differentiated in vitro into NPCs and cardiomyocytes, and in teratomas in vivo. Maternal mtDNA levels were measured before and after differentiation (Figures 16A, 16B). The levels of maternal mtDNA in reversed 3243ST-ES1 reduced to undetectable levels in some tissues, but were slightly elevated in other cell types compared to the initial 4% in undifferentiated ESCs (Figure 9F). Maternal mtDNA was undetectable during in vivo and in vitro differentiation of the 3243ST-ES2 non-reversed sibling cell line. In contrast, maternal mtDNA levels increased in all differentiated tissues tested in reversed ST-ES7 and NT-ES8 (Figure 9F). These results demonstrate that the mtDNA reversal phenomenon is not exclusive to ESCs and
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 53/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 53/95
47/55 ocorre durante a diferenciação, aumentando a possibilidade de que o retorno para o mtDNA mutante possa ocorrer em algumas crianças MRT.47/55 occurs during differentiation, increasing the possibility that the return to the mutant mtDNA may occur in some MRT children.
[0167]Exemplo 14 - Conclusões [0168]A praticabilidade e os resultados clínicos após MRT em oócitos portadores de mutações patogênicas de mtDNA foram investigados 8, 10. Como mutações nos genes nucleares ou mtDNA podem causar síndromes mitocondriais similares, é fundamental realizar testes genéticos para confirmar a elegibilidade de mulheres com mutações patogênicas no DNA para MRT.[0167] Example 14 - Conclusions [0168] Practicality and clinical results after MRT in oocytes carrying pathogenic mtDNA mutations have been investigated 8, 10. Since mutations in nuclear genes or mtDNA can cause similar mitochondrial syndromes, it is essential to perform genetic tests to confirm the eligibility of women with pathogenic DNA mutations for MRT.
[0169]Uma faixa de heteroplasmia para o mtDNA mutante foi observada entre os diferentes tecidos testados em mulheres portadoras e seus filhos. Como esperado, mutações patogênicas de mtDNA foram detectadas em oócitos de todos os portadores.[0169] A range of heteroplasm for the mutant mtDNA was observed between the different tissues tested on women carriers and their children. As expected, pathogenic mtDNA mutations were detected in oocytes from all carriers.
[0170]O transporte do mtDNA materno, embora detectável, foi inferior a 1% em embriões ST pré-implantação. No entanto, a reversão para o original mtDNA materno foi observada em algumas MRT ESCs (15%, 4 / 26) durante a sua cultura estendida ou diferenciação. O mtDNA materno em macacos ST estava em níveis baixos esperados e não aumentou com a idade em adultos. No entanto, um aumento moderado no mtDNA materno (16%) foi observado em oócitos selecionados a partir de fêmeas ST (Lee HS e outros, Cell Rep 1,506 a 515 (2012); incorporado aqui por referência). Isso implica que, apesar da substituição eficiente do mtDNA mutante em oócitos, algumas crianças MRT ainda podem desenvolver altas cargas de mutação e doença mitocondrial.[0170] Maternal mtDNA transport, although detectable, was less than 1% in pre-implantation ST embryos. However, reversion to the original maternal mtDNA was observed in some MRT ESCs (15%, 4/26) during their extended culture or differentiation. Maternal mtDNA in ST monkeys was at expected low levels and did not increase with age in adults. However, a moderate increase in maternal mtDNA (16%) was observed in oocytes selected from ST females (Lee HS et al., Cell Rep 1.506 to 515 (2012); incorporated here by reference). This implies that, despite the efficient replacement of mutant mtDNA in oocytes, some MRT children may still develop high loads of mutation and mitochondrial disease.
[0171]Dentre os fatores que podem contribuir para a reversão do mtDNA, parece que esse fenômeno foi independente dos métodos MRT (ST, PNT ou SCNT), presença de mutações patogênicas de mtDNA e a distância genética medida em SNPs totais entre mtDNA de doador e mtDNA materno. No entanto, algumas combinações de haplótipos específicos produziram aumento preferencial do mtDNA[0171] Among the factors that may contribute to mtDNA reversal, it appears that this phenomenon was independent of MRT methods (ST, PNT or SCNT), presence of pathogenic mtDNA mutations and the genetic distance measured in total SNPs between donor mtDNA and maternal mtDNA. However, some combinations of specific haplotypes produced preferential increases in mtDNA
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 54/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 54/95
48/55 materno e perda gradual do mtDNA do doador. Um dos possíveis mecanismos responsáveis pela reversão observada podería ser a síntese de iniciadores de replicação mais eficiente e, assim, inclinar-se para a amplificação preferencial de haplótipos de mtDNA com polimorfismos específicos da sequência de CSBII. A seleção de mtDNA de doador compatível contendo CSBII ou outras sequências de Dloop similares ao mtDNA materno resolvería este problema. Embora o número de combinações testadas no estudo descrito seja pequeno, a possível ordem de vantagem de replicação nos haplótipos de mtDNA pode ser H56 > H1b, U5a > H1b> F1a, U5a > X2c > D4a e H49 > B2k. No entanto, a amplificação estocástica ou de gargalo do mtDNA durante o desenvolvimento embrionário precoce também pode coexistir.48/55 maternal and gradual loss of donor mtDNA. One of the possible mechanisms responsible for the observed reversal could be the synthesis of more efficient replication primers and, thus, inclination towards the preferential amplification of mtDNA haplotypes with specific polymorphisms of the CSBII sequence. Selecting compatible donor mtDNA containing CSBII or other Dloop sequences similar to maternal mtDNA would solve this problem. Although the number of combinations tested in the study described is small, the possible order of replication advantage in the mtDNA haplotypes can be H56> H1b, U5a> H1b> F1a, U5a> X2c> D4a and H49> B2k. However, stochastic or bottleneck amplification of mtDNA during early embryonic development can also coexist.
[0172]As mitocôndrias não apenas geram energia, mas também regulam a proliferação celular e a apoptose (Chan DC e outros, Cell 125, 1241 a 1252 (2006); aqui incorporadas por referência). Descreve-se aqui que os haplótipos de mtDNA podem afetar o crescimento e a proliferação celular, fornecendo assim vantagem seletiva para as células com mtDNA materno. Futuras aplicações de MRT exigirão estudos adicionais avaliando haplótipos de mtDNA de doadores compatíveis para evitar disfunção de OXPHOS, diferençaas na replicação de mtDNA, crescimento celular e recuperação de mtDNA mutante (Koehler CM e outros., Genetics 129, 247 a 255 (1991); incorporado aqui por referência).[0172] Mitochondria not only generate energy, they also regulate cell proliferation and apoptosis (Chan DC et al., Cell 125, 1241 to 1252 (2006); incorporated herein by reference). It is described here that mtDNA haplotypes can affect cell growth and proliferation, thus providing selective advantage for cells with maternal mtDNA. Future applications of MRT will require additional studies evaluating mtDNA haplotypes from compatible donors to prevent OXPHOS dysfunction, differences in mtDNA replication, cell growth and recovery of mutant mtDNA (Koehler CM et al., Genetics 129, 247 to 255 (1991); incorporated here by reference).
[0173]Exemplo 15 - Sequenciamento de mtDNA [0174]As mutações específicas de mtDNA e haplótipos gerais foram determinadas em oócitos, sangue, fibroblastos da pele (SF) e/ou urina por sequenciamento completo de mtDNA utilizando MiSeq ou sistema de mutação refratário de amplificação - reação em cadeia da polimerase quantitativa (ARMSqPCR).[0173] Example 15 - mtDNA sequencing [0174] Specific mtDNA mutations and general haplotypes were determined in oocytes, blood, skin fibroblasts (SF) and / or urine by complete mtDNA sequencing using MiSeq or refractory mutation system amplification - quantitative polymerase chain reaction (ARMSqPCR).
[0175]Exemplo 16 - Estimulação Ovariana Controlada (COS)[0175] Example 16 - Controlled Ovarian Stimulation (COS)
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 55/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 55/95
49/55 [0176]A triagem basal foi realizada incluindo um histórico médico e exame físico, avaliação do índice de massa corporal (IMC), nível de hormônio antimulleriano (AMH) e contagem de folículos antrais (AFC). Os indivíduos foram submetidos à estimulação ovariana e à recuperação de oócitos, empregando protocolos e procedimentos padrão de IVF.49/55 [0176] Baseline screening was performed including a medical history and physical examination, assessment of body mass index (BMI), antimullerian hormone level (AMH) and antral follicle count (AFC). The individuals were submitted to ovarian stimulation and oocyte recovery, using standard IVF protocols and procedures.
[0177]Exemplo 17 - Transferência de Fuso (ST) [0178]O ST foi realizado da seguinte forma: os fusos metafásicos meióticos II (Mil) foram visualizados sob microscopia polarizada e isolados com citoplasma mínimo (carioplasto, mtDNA hospedeiro). O carioplasto foi então colocado no espaço perivitelino de um oócito enucleado (citoplasto, mtDNA do doador) e fundido usando HVJ-E (vírus hemaglutinante do Japão envelopado).[0177] Example 17 - Spindle Transfer (ST) [0178] The ST was performed as follows: meiotic metaphasic spindles II (Mil) were visualized under polarized microscopy and isolated with minimal cytoplasm (karyoplast, mtDNA host). The karyoplast was then placed in the perivitelline space of an enucleated oocyte (cytoplasm, donor mtDNA) and fused using HVJ-E (enveloped hemagglutinating virus from Japan).
[0179]Exemplo 18 - Vitrificação de Oócitos [0180]A vitrificação dos oócitos foi realizada como anteriormente descrito utilizando kits de vitrificação e descongelamento de oócitos humanos comercialmente disponíveis(kit de Vitrificação e kit de aquecimento Vit., Life Global).[0179] Example 18 - Oocyte Vitrification [0180] Oocyte vitrification was performed as previously described using commercially available human oocyte vitrification and thawing kits (Vit. Kit and Vit. Heating kit, Life Global).
[0181]Exemplo 19 - Derivação de Células ES e Cultura [0182]Os blastocistos ST foram libertos de sua zona pelúcida e plaqueados em camadas alimentadoras mEF em placas de cultura de 4 poços por 5 a 7 dias a 37° C, 3% CO2, 5% O2 e 92% N2 em meio (DMEM / F12 com 10 % De FBS, 10% de KSR, aminoácidos não essenciais a 0,1 mM, l-glutamina a 1 mM, β-mercaptoetanol a 0,1 mM, 5 ng / ml de fator de crescimento de fibroblastos básico, inibidor de ROCK a 10μΜ). Os excrescimentos de blastocisto anexados foram manualmente cortados em pequenos pedaços, re-plaqueados em placas novas e mantidos em meio DMEM nocaute (Invitrogen) suplementado com 20% de KSR, aminoácidos não essenciais a 0,1 mM, l-glutamina a 1 mM, β- mercaptoetanol a 0,1 mM, penicilina - estreptomicina e 4 ng / ml de bFGF para posterior propagação e análise. Todas as linhas celulares foram negativas para contaminação por micoplasma.[0181] Example 19 - Derivation of ES Cells and Culture [0182] ST blastocysts were released from their pellucid zone and plated in mEF feed layers in 4-well culture plates for 5 to 7 days at 37 ° C, 3% CO2 , 5% O2 and 92% N2 in medium (DMEM / F12 with 10% FBS, 10% KSR, 0.1 mM non-essential amino acids, 1 mM l-glutamine, 0.1 mM β-mercaptoethanol, 5 ng / ml basic fibroblast growth factor, 10μΜ ROCK inhibitor). The attached blastocyst excrements were manually cut into small pieces, re-plated on new plates and kept in DMEM knockout medium (Invitrogen) supplemented with 20% KSR, 0.1 mM non-essential amino acids, 1 mM l-glutamine, β-mercaptoethanol at 0.1 mM, penicillin - streptomycin and 4 ng / ml bFGF for further propagation and analysis. All cell lines were negative for mycoplasma contamination.
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 56/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 56/95
50/55 [0183]Exemplo 20 - Ensaios de transcrição de mtDNA [0184]Os ensaios antiterminação de transcrição in vitro foram realizados utilizando modelos amplificados por PCR contendo a região 202-481 de mtDNA de doador (H1b) ou hospedeiro (U5a). Os produtos das reações de transcrição foram resolvidos por PAGE a 20% contendo 6 M de ureia e visualizado por PhosphoImager (GE Health).50/55 [0183] Example 20 - mtDNA transcription assays [0184] In vitro antitermination transcription assays were performed using PCR amplified models containing the donor (H1b) or host (U5a) mtDNA region 202-481. The transcription reaction products were resolved by 20% PAGE containing 6 M urea and visualized by PhosphoImager (GE Health).
[0185]Exemplo 21 - Ensaios de Crescimento e Proliferação Celular [0186]As ESCs foram adaptadas para crescer sob condições isentas de alimentação na matriz de Matrigel em meio mTeSRTMI (tecnologias STEMCELL) (Wu J e outros, Nature 521,316 a 321 (2015); aqui incorporado por referência). As células foram dissociadas com Accutase (Life Technologies) durante 2 min e aproximadamente 105 células foram semeadas em cada placa de 60 mm. As células foram colhidas periodicamente e contadas utilizando o Contador Automático de Células Condensadas (Invitrogen).[0185] Example 21 - Cell Growth and Proliferation Assays [0186] ESCs were adapted to grow under feeding-free conditions in the Matrigel matrix in mTeSRTMI medium (STEMCELL technologies) (Wu J et al., Nature 521,316 to 321 (2015) ; incorporated herein by reference). The cells were dissociated with Accutase (Life Technologies) for 2 min and approximately 10 5 cells were seeded on each 60 mm plate. The cells were harvested periodically and counted using the Automatic Condensed Cell Counter (Invitrogen).
[0187]Exemplo 22 - Diferenciação e Cultura de Células Progenitoras Neurais (NPC) [0188]Um protocolo publicado anteriormente com pequenas modificações foi usado para a diferenciação de NPC. Resumidamente, as ESCs foram mantidas em MEFs em meio CDF12 antes da diferenciação de NPC. O meio CDF12 continha DMEM / F12 (Life Technology), 20% de substituição de soro nocaute (Life Technologies), 2 mM de Glutamax (Life Technologies), 0,1 mM de NEAA (Life Technology), 0,1 mM de β-mercaptoetanol (Life Technologies) e 4 ng / ml de FGF2 (Peprotech). As ESCs foram desagregadas com Colagenase IV (Life Technologies) e permitidas crescer até aproximadamente 40% de confluência. Para iniciar a indução neural, as células foram lavadas duas vezes com DPBS 1x sem cálcio e magnésio (Corning Cellgro) e mudadas para Meio de Indução Neural 1 (NIM-1: 50% DMEM Avançado / F12 (Invitrogen), 50% Neurobasal (Invitrogen), 1x B27 (Invitrogen), 1x N2[0187] Example 22 - Differentiation and Culture of Neural Progenitor Cells (NPC) [0188] A previously published protocol with minor modifications was used for the differentiation of NPC. Briefly, ESCs were maintained in MEFs in CDF12 medium prior to NPC differentiation. The CDF12 medium contained DMEM / F12 (Life Technology), 20% knockout serum replacement (Life Technologies), 2 mM Glutamax (Life Technologies), 0.1 mM NEAA (Life Technology), 0.1 mM β -mercaptoethanol (Life Technologies) and 4 ng / ml FGF2 (Peprotech). ESCs were disaggregated with Collagenase IV (Life Technologies) and allowed to grow to approximately 40% confluence. To initiate neural induction, cells were washed twice with 1x DPBS without calcium and magnesium (Corning Cellgro) and changed to Neural Induction Medium 1 (NIM-1: 50% Advanced DMEM / F12 (Invitrogen), 50% Neurobasal ( Invitrogen), 1x B27 (Invitrogen), 1x N2
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 57/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 57/95
51/55 (Invitrogen), 2mM de GlutaMAX e 10 ng / ml de hLIF (Peprotech), 4uM de CHIR99021 (Selleckchem), 3 uM de SB431542 (Selleckchem), 2 uM de Dorsomorfina (Sigma) e 0,1 uM de Composto E (SEM Chemicals Inc.). Após 2 dias de cultura no meio NIM-1, as células foram mudadas para o Meio de Indução Neural 2 (NIM-2: 50% de DMEM Avançado / F12, 50% de Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 2mM de GlutaMAX e 10 ng / ml de hLIF, 4 uM de CHIR99021,3 uM de SB431542 e 0,1 uM de Composto E.) As células foram ainda cultivadas em NIM-2 durante 5 dias com mudança de meio diariamente. No timo dia no meio NIM-2, as células foram tratadas de um dia para o outro com 10 uM de Y27632 (Selleckchem) e 20 a 30 colônias em forma de “domo” foram colhidas manualmente e digeridas com Accumax (Innovative Cell Technologies) durante 10 minutos a 37° C. As células de tratamento Accumax foram suavemente desagregadas em células individuais e plaqueadas novamente em placas de 6 poços revestidas com Matrigel a uma densidade de aproximadamente 3,5 x 104 por cm2 em Meio de Manutenção de Células Progenitoras Neurais (NPMM: 50% DMEM Avançado / F12, 50% Neurobasal, 1x B27, 1x N2, 2 mM de GlutaMAX, 10ng / ml de hLIF, 3 mM de CHIR99021 e 2 mM de SB431542) suplementado com 10 uM de Y27632. As NPCs foram mantidas em placas revestidas com Matrigel em NPMM. As NPCs foram passadas quando atingiram aproximadamente 70% a 80% de confluência usando Accumax e replaqueadas a uma densidade de 3 x 104 por cm2 com mudança diária média. Para as 6 passagens iniciais, as NPCs foram pré-tratadas com Y27632 a 10 μΜ durante a noite antes e durante a divisão celular. O estudo foi randomizado e os investigadores foram cegos para alocações de tratamento em laboratórios de colaboradores.51/55 (Invitrogen), 2 mM GlutaMAX and 10 ng / ml hLIF (Peprotech), 4 µM CHIR99021 (Selleckchem), 3 µM SB431542 (Selleckchem), 2 µM Dorsomorphine (Sigma) and 0.1 µM Compound E (SEM Chemicals Inc.). After 2 days of culture in the NIM-1 medium, the cells were switched to Neural Induction Medium 2 (NIM-2: 50% Advanced DMEM / F12, 50% Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 2mM GlutaMAX and 10 ng / ml hLIF, 4 µM CHIR99021.3 µM SB431542 and 0.1 µM Compound E.) The cells were further cultured in NIM-2 for 5 days with a change of medium daily. On the last day in the NIM-2 medium, the cells were treated overnight with 10 µM Y27632 (Selleckchem) and 20 to 30 “dome” colonies were harvested manually and digested with Accumax (Innovative Cell Technologies) for 10 minutes at 37 ° C. Accumax treatment cells were gently disaggregated into individual cells and plated again in 6-well plates coated with Matrigel at a density of approximately 3.5 x 10 4 per cm 2 in Cell Maintenance Medium Neural progenitors (NPMM: 50% Advanced DMEM / F12, 50% Neurobasal, 1x B27, 1x N2, 2 mM GlutaMAX, 10ng / ml hLIF, 3 mM CHIR99021 and 2 mM SB431542) supplemented with 10 uM Y27632. The NPCs were maintained on plates coated with Matrigel in NPMM. The NPCs were passed when they reached approximately 70% to 80% confluence using Accumax and re-plated at a density of 3 x 10 4 per cm 2 with average daily change. For the initial 6 passages, the NPCs were pretreated with Y27632 at 10 μΜ during the night before and during cell division. The study was randomized and the researchers were blinded to treatment allocations in collaborators' laboratories.
[0189]Exemplo 23 - Diferenciação de Cardiomiócitos [0190]A diferenciação de cardiomiócitos foi realizada com base em um protocolo GiWi (inibidor de GSK3 e inibidor de Wnt) descrito anteriormente (Lian X e outros, Nat Protoc 7, 1235 a 1246 (2012); aqui incorporado por referência).[0189] Example 23 - Cardiomyocyte Differentiation [0190] Cardiomyocyte differentiation was performed based on a GiWi protocol (GSK3 inhibitor and Wnt inhibitor) described previously (Lian X et al., Nat Protoc 7, 1235 to 1246 (2012 ); incorporated herein by reference).
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 58/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 58/95
52/5552/55
Resumidamente, as ESCs foram cultivadas em placas revestidas com Matrigel em meio mTeSRI a 80-90% de confluência antes da passagem com Accutase e então novamente semeadas em 0,5-1,5 milhões de células por poço em placas de 12 poços em 1 ml de mTeSRI mais 10 μΜ de Y27632. No dia 5, as células foram incubadas com 6 a 12 μΜ de CHIR99021 (Selleckchem) durante 16-24 h e depois substituídas por 2 ml de RPMI / B27 (insulina) e cultivadas durante dois dias. No dia 8, um meio combinado de 2 ml foi preparado misturando 1 ml de meio coletado a partir da placa de 12 poços e 1 ml de meio RPMI / B27 (-insulina) fresco. As células foram então substituídas por 2 ml de meio combinado com 5 μΜ de IWP2 (Tocris) e cultivadas por 48 h. No dia 10, 2 ml de RPMI / B27 (insulina) fresco foram adicionados a cada poço da placa de 12 poços. A partir do dia 12, o meio foi trocado a cada três dias por 2 ml / poço de RMPI / B27 (+ insulina). Os cardiomiócitos contraídos foram observados já no dia 17 a partir da passagem inicial de ESCs. Tipos celulares diferenciados foram identificados por imunocitoquímica como descrito anteriormente.Briefly, ESCs were cultured in Matrigel-coated plates in mTeSRI medium at 80-90% confluence prior to passage with Accutase and then seeded again in 0.5-1.5 million cells per well in 12-well plates in 1 ml of mTeSRI plus 10 μΜ of Y27632. On day 5, the cells were incubated with 6 to 12 μΜ of CHIR99021 (Selleckchem) for 16-24 h and then replaced with 2 ml of RPMI / B27 (insulin) and cultured for two days. On day 8, a 2 ml combined medium was prepared by mixing 1 ml of medium collected from the 12-well plate and 1 ml of fresh RPMI / B27 (-insulin) medium. The cells were then replaced with 2 ml of medium combined with 5 μΜ of IWP2 (Tocris) and cultured for 48 h. On day 10, 2 ml of fresh RPMI / B27 (insulin) was added to each well of the 12-well plate. From day 12, the medium was changed every three days for 2 ml / well of RMPI / B27 (+ insulin). The contracted cardiomyocytes were already observed on the 17th from the initial passage of ESCs. Differentiated cell types were identified by immunocytochemistry as previously described.
[0191]Exemplo 24 - Ensaio de Teratoma [0192]ESCs foram injetadas na região femoral de camundongos machos SCID com 6 semanas de idade (Charles River). Os camundongos com tumores foram eutanasiados e os teratomas foram isolados, seccionados e caracterizados histologicamente quanto à presença de tecidos representativos como descrito anteriormente.[0191] Example 24 - Teratoma Assay [0192] ESCs were injected into the femoral region of 6 week old male SCID mice (Charles River). Mice with tumors were euthanized and teratomas were isolated, sectioned and histologically characterized for the presence of representative tissues as previously described.
[0193]Exemplo 25 - Avaliação da Função Mitocondrial [0194]As atividades enzimáticas da cadeia respiratória mitocondrial (complexos I e IV) foram medidas por espectrofotometria, como descrito, por exemplo, por Spinazzi M e outros, Nat Protoc 7, 1235 a 1246 (2012); incorporado aqui por referência. Resumidamente, as mitocôndrias intactas foram isoladas de fibroblastos e tratadas com e sem 3 mM de rotenona a um comprimento de onda de 340 nm durante 5 min. Diferenças de absorbância por minuto foram obtidas, e a especificidade da[0193] Example 25 - Assessment of Mitochondrial Function [0194] The enzymatic activities of the mitochondrial respiratory chain (complexes I and IV) were measured by spectrophotometry, as described, for example, by Spinazzi M et al., Nat Protoc 7, 1235 to 1246 (2012); incorporated here by reference. Briefly, intact mitochondria were isolated from fibroblasts and treated with and without 3 mM rotenone at a wavelength of 340 nm for 5 min. Differences in absorbance per minute were obtained, and the specificity of
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 59/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 59/95
53/55 atividade COMI foi estimada pela porcentagem de inibição da rotenona. Para o consumo de oxigênio das células vivas, um analisador de fluxo extracelular XF96 (Seahorse Biosciences) foi usado para medir as taxas de consumo de oxigênio (OCR) e taxas de acidificação extracelular (ECAR), conforme descrito anteriormente. Resumidamente, as células progenitoras neurais (NPCs) foram semeadas a uma densidade de 30.000 células por poço de uma microplaca de cultura de células XF96 e incubadas durante 24 h para permitir que as células se ligassem. Antes do ensaio, as NPCs foram equilibradas durante 1 h em meio de ensaio XF não tamponado suplementado com glucose a 25 mM, piruvato de sódio a 1 mM, glutamax a 2 mM, 1x aminoácidos não essenciais e 1% (em volume) de FBS em uma incubadora não-C02. Injeções sequenciais de composto de oligomicina (0,5 μΙ / ml), carbonil cianeto 4(trifluorometoxi) fenilidrazona (FCCP, 1 μΜ) e rotenona (0,5 μΜ) / antimicina A (1 μΜ) foram utilizados para medir os parâmetros chave da respiração mitocondrial. índices de função mitocondrial foram calculados como taxa respiratória basal (OCR basal OCR de rotenona / antimicina A), dependente de ATP (taxa respiratória basal - OCAR oligomicina), taxa respiratória máxima (FCCP OCR - OCR rotenona / antimicina A) e reserva oxidativa (máxima taxa de respiração - taxa de respiração basal). Cada valor representado foi a média de um mínimo de 4 poços replicados, e foi normalizado para o número total de células plaqueadas. Os resultados foram apresentados como média ± SEM. ANOVA unidirecional foi usado para três comparações entre grupos e o teste t de Student foi usado para comparações entre pares. Um valor P menor que 0,05 foi considerado significativo. O estudo foi randomizado, e os investigadores foram cegos para alocação de amostras entre diferentes grupos.53/55 COMI activity was estimated by the percentage of rotenone inhibition. For oxygen consumption of living cells, an XF96 extracellular flow analyzer (Seahorse Biosciences) was used to measure oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR), as previously described. Briefly, neural progenitor cells (NPCs) were seeded at a density of 30,000 cells per well of an XF96 cell culture microplate and incubated for 24 h to allow the cells to bind. Prior to the trial, NPCs were equilibrated for 1 hr in non-buffered XF assay medium supplemented with 25 mM glucose, 1 mM sodium pyruvate, 2 mM glutamax, 1x non-essential amino acids and 1% (by volume) FBS in a non-C02 incubator. Sequential injections of oligomycin compound (0.5 μΙ / ml), carbonyl cyanide 4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP, 1 μΜ) and rotenone (0.5 μΜ) / antimycin A (1 μΜ) were used to measure key parameters of mitochondrial breathing. mitochondrial function indices were calculated as baseline respiratory rate (baseline OCR of rotenone / antimycin A), dependent on ATP (basal respiratory rate - OCAR oligomycin), maximum respiratory rate (FCCP OCR - OCR rotenone / antimycin A) and oxidative reserve ( maximum breath rate - basal breath rate). Each value represented was the average of a minimum of 4 replicated wells, and was normalized to the total number of cells plated. The results were presented as mean ± SEM. Unidirectional ANOVA was used for three comparisons between groups and Student's t test was used for comparisons between pairs. A P value less than 0.05 was considered significant. The study was randomized, and the researchers were blinded to allocating samples between different groups.
[0195]Exemplo 26 - Sequenciamento de mtDNA por MiSeq [0196]O DNA foi extraído de fibroblastos da pele, sangue integral, urina, ESCs e tecidos de teratoma usando o kit de extração de DNA Centra (Qiagen), e de oócitos usando o kit de extração de DNA Pico Pure (Life Technologies). O mtDNA foi[0195] Example 26 - Sequencing of mtDNA by MiSeq [0196] DNA was extracted from skin fibroblasts, whole blood, urine, ESCs and teratoma tissues using the Centra DNA extraction kit (Qiagen), and oocytes using the DNA extraction kit Pico Pure (Life Technologies). MtDNA was
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 60/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 60/95
54/55 amplificado por uma única reação de PCR. A amplificação de mtDNA de oócitos individuais foi realizada utilizando 2 conjuntos de iniciadores: 7272F 5GGCTCATTCATTTCTCTAACAG-3, 15712R 5-TTGGCTTAGTGGGCGAAATA-3 e 15635F 5-TCCATCCTCATCCTAGCAAT-3, 7401R 5GGGGGCATCCATATAGTCAC-3 e o sequenciamento mitocondrial realizado.54/55 amplified by a single PCR reaction. The amplification of individual oocyte mtDNA was performed using 2 sets of primers: 7272F 5GGCTCATTCATTTCTCTAACAG-3, 15712R 5-TTGGCTTAGTGGGCGAAATA-3 and 15635F
[0197]Exemplo 27 - Detecção de variantes de mtDNA por sequenciamento de Sanger [0198]As variantes de mtDNA presentes em mais de 10% de heteroplasmia foram corroboradas independentemente pelo sequenciamento de Sanger. Regiões de mtDNA contendo mutações da linhagem germinativa ou SNPs foram amplificadas por PCR com conjuntos de iniciadores previamente descritos usando o kit de alta fidelidade PCR Platinum SuperMix (Life Technologies). Os produtos de PCR foram purificados, sequenciados e analisados por Sequencher v. 5.0 (GeneCodes).[0197] Example 27 - Detection of mtDNA variants by Sanger sequencing [0198] The mtDNA variants present in more than 10% heteroplasm were independently corroborated by Sanger sequencing. MtDNA regions containing germline mutations or SNPs were amplified by PCR with sets of primers previously described using the PCR Platinum SuperMix high-fidelity kit (Life Technologies). The PCR products were purified, sequenced and analyzed by Sequencher v. 5.0 (GeneCodes).
[0199]Exemplo 28 - Medição de ARMS-qPCR e Número de Cópias [0200]0 ensaio de PCR quantitativo do sistema de mutação refratário de amplificação (ARMs-qPCR) foi realizado para verificar a heteroplasmia em mt8993T> G, mt13513G>A e mt3243A>G e para medir o transporte em embriões ST de controle e células ES em 7843A>G, 16519T>C e 16278T>C8. A medição do número de cópias de mtDNA foi realizada.[0199] Example 28 - Measurement of ARMS-qPCR and Number of Copies [0200] The quantitative PCR assay of the refractory amplification mutation system (ARMs-qPCR) was performed to check for heteroplasm in mt8993T> G, mt13513G> A and mt3243A> G e to measure transport in control ST embryos and ES cells in 7843A> G, 16519T> C and 16278T> C8. Measurement of the number of copies of mtDNA was performed.
[0201]Exemplo 29 - Análises Genéticas e Citogenéticas [0202]A cariotipagem por banda G foi realizada em 20 células metafásicas de cada linhagem celular humana. Arranjo CGH foi realizado por IVI Gen. As CNVs foram identificadas por genotipagem de SNP como previamente descrito por MaH e outros, Nature 511, 177 a 183 (2014) aqui incorporado por referência e analisado por um laboratório de diagnóstico genético clínico.[0201] Example 29 - Genetic and Cytogenetic Analysis [0202] G-band karyotyping was performed on 20 metaphasic cells from each human cell line. CGH arrangement was performed by IVI Gen. CNVs were identified by SNP genotyping as previously described by MaH et al., Nature 511, 177 to 183 (2014) incorporated by reference and analyzed by a clinical genetic diagnostic laboratory.
[0203]Exemplo 30 - Análise Estatística [0204]0s resultados são apresentados como médias ± SD, ou SEM. p < 0,05[0203] Example 30 - Statistical Analysis [0204] The results are presented as means ± SD, or SEM. p <0.05
Petição 870190064911, de 10/07/2019, pág. 61/95Petition 870190064911, of 10/07/2019, p. 61/95
55/55 foi considerado significativo. Os dados foram analisados pelo teste não paramétrico de Pearson para correlação, teste t de grupo independente ou teste do qui-quadrado para comparação pareada e ANOVA com análise de Bonferroni para múltiplas comparações (IBM SPSS).55/55 was considered significant. Data were analyzed using Pearson's nonparametric test for correlation, independent group t test or chi-square test for paired comparison and ANOVA with Bonferroni analysis for multiple comparisons (IBM SPSS).
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