BR112018017343B1

BR112018017343B1 - Método e aparelho para detectar a presença de micotoxinas em cereais, e, meio legível por computador.

Info

Publication number: BR112018017343B1
Application number: BR112018017343-6A
Authority: BR
Inventors: Hugo Thienpont; Wendy Meulebroeck; Lien Smeesters
Original assignee: Tomra Sorting N.V.
Priority date: 2016-02-24
Filing date: 2017-02-23
Publication date: 2023-03-14
Also published as: CA3015575A1; RU2018130827A3; EP3211400A1; CN109073546A; CN109073546B; EP3211400B1; US10429295B2; AU2017222946A1; BR112018017343A2; RU2721896C2; US20190056319A1; AU2017222946B2; JP2019510968A; CA3015575C; JP6832947B2; RU2018130827A; WO2017144608A1

Abstract

Um método e aparelho para detectar a presença de micotoxinas em cereais, o método compreendendo: capturar pelo menos um espectro de absorção de luz difusa de uma coleção de grãos de cereal; capturar pelo menos um espectro de absorção de luz difusa de pelo menos um grão de cereal individual da coleção de grãos de cereal; e classificar o nível de contaminação por micotoxinas em pelo menos um grão de cereal por realização de análise de dados multivariados no pelo menos um espectro de absorção de luz difusa da coleção de grãos de cereal e no pelo menos um espectro de absorção de luz difusa do pelo menos um grão de cereal individual.

Description

Campo técnico

[001] A presente invenção refere-se à contaminação de cereais. Em particular, a presente invenção provê um método e um aparelho para a detecção da presença de micotoxinas em cereais.

Fundamentos da técnica

[002] A presença de micotoxinas, metabólitos secundários de fungos tóxicos, em mercadorias agrícolas é um grande problema no mundo todo. De acordo com as estimativas da Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO), 25% das culturas de alimentos do mundo são afetadas por fungos produtores de micotoxinas (Rasch, Kumke, & Lohmannsroben, 2010). As micotoxinas mais importantes na produção de alimentos e ração, que representam uma grande ameaça à saúde pública e à agroeconomia, incluem aflatoxinas, desoxinivalenol (DON), ocratoxina A, fumonisina, zearalenona, patulina e toxina T-2 (Miller, 1995; Traar, 2013).

[003] DON está entre as micotoxinas mais prevalentes e é produzido principalmente pelos fungos fusarium graminearum e fusarium culmorum. Ele ocorre frequentemente em mercadorias de cereais, como trigo, milho, cevada, aveia e centeio, que podem ser infectados antes ou depois da colheita (Sobrova et al., 2010). Além disso, porque DON não pode ser destruído durante o processamento de alimentos, como ao cozinhar, congelar e assar, ela aparece tanto nos produtos crus como nos processados. A ingestão de produtos contaminados com DON pode causar efeitos agudos e crônicos para a saúde, como diarreia, náusea, imunossupressão e neurotoxicidade (Abysique, Tardivel, Troadec, & Félix, 2015; Pestka, 2007). A detecção de DON é uma questão importante na indústria de alimentos, pois está presente em mais de 90% de todas as amostras de cereais contaminados com micotoxinas e sua ocorrência é considerada como sendo um indicador da presença de outras micotoxinas. (Ran et al., 2013)

[004] DON é um importante contaminante do milho (Pleadin et al., 2012) e o milho é o alimento dominante em muitos países. Atualmente, a presença de DON em produtos de alimentos e rações é rigorosamente regulamentada na maioria das regiões do mundo. Com relação aos núcleos dos grãos de milho cru, a Comissão Europeia afirma que a concentração máxima permitida de DON é de 1750ppb, enquanto nos Estados Unidos e na China é imposto um limite de 1000ppb de DON (European Commission, 2007). Para atender a esses limites, a presença de DON é hoje em dia detectada principalmente pelo uso de análises químicas, como cromatografia líquida - espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) e ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA). No entanto, essas técnicas analíticas são demoradas, caras e destrutivas (Ran et al., 2013). Devido à presença irregular da toxina tanto nos produtos alimentícios como nas culturas, estas análises baseadas em amostras com frequência oferecem uma visão limitada do grau de contaminação. É um objetivo da presente invenção prover um método espectroscópico não destrutivo que possa ser usado para a triagem de núcleos de grãos do cereal individual e de outros produtos alimentícios susceptíveis à contaminação com micotoxinas não fluorescentes.

[005] Técnicas de detecção espectroscópica já são amplamente usadas em agricultura e indústrias químicas para a determinação de compostos orgânicos em matéria, como proteínas, umidade, amido e pigmentos (Baye, Pearson, & Settles, 2006; K.C. Volkers, M. Wachendorf, R. Loges, N.J. Jovanovic, 2003; Meulebroeck & Thienpont, 2012). Até agora, há um grande interesse em aplicar as técnicas de detecção espectroscópica para a identificação de DON. O uso de espectroscopia de infravermelho próximo e médio de transformada de Fourier (FT-NIR e FT-MIR) para detecção de DON em trigo e milho já é amplamente discutido (Abramovic, Jajic, Abramovic, Cosic, & Juric, 2007; De Girolamo, Cervellieri, Visconti, & Pascale, 2014; Kos, Lohninger, & Krska, 2003). No entanto, medições atuais publicadas usam amostras trituradas e homogeneamente contaminadas e requerem o uso de quimiometria para classificar as amostras em seus vários níveis de contaminação. É um objetivo da presente invenção prover um método espectroscópico que permita a medição da contaminação localizada em núcleos de grãos de cereal individual não triturados, como os núcleos de grãos de milho. Além disso, devido à sua sensibilidade à vibração, espectroscopia de transformada de Fourier dificilmente pode ser implementada em um ambiente industrial.

Sumário da invenção

[006] De acordo com a presente invenção, é provido um método para detectar a presença de micotoxinas em cereais, o método compreendendo: capturar pelo menos um espectro de absorção de luz difusa de uma coleção de grãos de cereal; capturar pelo menos um espectro de absorção de luz difusa de pelo menos um grão de cereal individual da coleção de grãos de cereal; classificar o nível de contaminação por micotoxinas em pelo menos um grão de cereal por realização da análise de dados multivariados no pelo menos um espectro de absorção de luz difusa da coleção de grãos de cereal e no pelo menos um espectro de absorção de luz difusa do pelo menos um grão de cereal individual.

[007] Preferivelmente, cada espectro de absorção de luz difusa é capturado usando uma esfera de integração. Preferivelmente, o espectro de absorção de luz difusa do grão de cereal individual é capturado usando uma esfera de integração que é menor do que a usada para capturar cada espectro de absorção de luz difusa da coleção de grãos de cereal. Preferivelmente, o ou cada espectro de absorção de luz difusa da coleção de grãos de cereal é capturado por iluminação da coleção no centro de uma esfera de integração. Preferivelmente, o espectro de absorção de luz difusa de cada grão de cereal é capturado por iluminação do grão de cereal enquanto está na frente de uma abertura de um orifício de amostra de uma esfera de integração.

[008] Preferivelmente, a etapa de capturar pelo menos um espectro de absorção de luz difusa de um grão de cereal individual compreende capturar múltiplos espectros de absorção de luz difusa por iluminação de múltiplas regiões do grão de cereal.

[009] Em uma modalidade, a etapa de classificar o nível de contaminação por micotoxinas em pelo menos um grão de cereal compreende calcular a razão entre a refletância em um primeiro comprimento de onda selecionado e a refletância em um segundo comprimento de onda selecionado; e classificar o nível de contaminação por micotoxinas em pelo menos um grão de cereal com base na razão calculada. Preferivelmente, os comprimentos de onda selecionados estão na região de comprimento de onda de 700 nm a 1500 nm. Em modalidades alternativas, a razão pode ser calculada com base na refletância em mais do que dois comprimentos de onda selecionados.

[0010] Em uma modalidade adicional, a etapa de classificação do nível de contaminação por micotoxinas em pelo menos um grão de cereal usa técnicas quimiométricas. Um método quimiométrico, como análises de componentes principais, pode ser usado para classificar o nível de contaminação por micotoxinas em um grão de cereal individual. Métodos quimiométricos são técnicas avançadas requerendo uma grande potência aritmétrica da máquina em que eles são usados.

[0011] O método pode compreender adicionalmente calcular um espectro médio de absorção de luz difusa de uma coleção de grãos de cereal se múltiplos espectros de absorção de luz difusa forem capturados e em que a etapa de classificar o nível de contaminação por micotoxinas em pelo menos um grão de cereal compreende realizar análise de dados multivariados em um espectro médio.

[0012] O método pode compreender adicionalmente calcular um espectro médio de absorção de luz difusa de pelo menos um grão de cereal se múltiplos espectros de absorção de luz difusa do grão de cereal forem capturados e em que a etapa de classificar o nível de contaminação por micotoxinas em pelo menos um grão de cereal compreende realizar a análise de dados multivariados em um espectro médio.

[0013] Cada espectro de absorção de luz difusa capturado pode ser um espectro de absorção de luz difusa NIR. Alternativamente, cada espectro de absorção de luz difusa capturado pode ser um espectro de absorção de luz difusa visível e NIR.

[0014] Classificar o nível de contaminação por micotoxinas em pelo menos um grão de cereal pode compreender comparar pelo menos um espectro capturado com um espectro de um grão não contaminado e identificar diferenças entre os espectros. Classificar o nível de contaminação por micotoxinas em pelo menos um grão de cereal pode compreender comparar pelo menos um espectro capturado com mais de um espectro de pelo menos um grão não contaminado e identificar diferenças entre os espectros. O método pode compreender adicionalmente obter o espectro de um grão não contaminado a partir de uma base de dados de espectros de grão. O método pode compreender adicionalmente identificar o tipo de cereal da coleção de grãos de cereal por comparação de pelo menos um espectro capturado com uma pluralidade de espectros de amostra na base de dados para encontrar o melhor ajuste. Alternativamente, o método pode compreender adicionalmente identificar o tipo de cereal a partir de uma entrada de usuário.

[0015] A presente invenção provê adicionalmente um meio legível por computador contendo instruções de programa que, quando executadas por um processador, levam o processador a realizar o método acima.

[0016] A presente invenção provê adicionalmente um aparelho para detectar a presença de micotoxinas em cereais, compreendendo: meio para capturar pelo menos um espectro de absorção de luz difusa de uma coleção de grãos de cereal; meio para capturar pelo menos um espectro de absorção de luz difusa de pelo menos um grão de cereal individual da coleção de grãos de cereal; e meio para classificar o nível de contaminação por micotoxinas em pelo menos um grão de cereal por realização da análise de dados multivariados no pelo menos um espectro de absorção de luz difusa da coleção de grãos de cereal e no pelo menos um espectro de absorção de luz difusa de pelo menos um grão de cereal individual.

[0017] Preferivelmente, cada meio para capturar um espectro de absorção de luz difusa compreende uma esfera de integração. Preferivelmente, o meio para capturar pelo menos um espectro de absorção de luz difusa do grão de cereal individual compreende uma esfera de integração que é menor do que a usada para capturar cada espectro de absorção de luz difusa da coleção de grãos de cereal.

[0018] Preferivelmente, o aparelho compreende adicionalmente meio para capturar múltiplos espectros de absorção de luz difusa por iluminação de múltiplas regiões do grão de cereal. O meio para capturar pelo menos um espectro de absorção de luz difusa pode compreender meio para capturar pelo menos um espectro de absorção de luz difusa NIR. O meio para capturar pelo menos um espectro de absorção de luz difusa pode compreender meio para capturar pelo menos um espectro de absorção de luz difusa UV, visível e NIR.

[0019] O meio para classificar o nível de contaminação por micotoxinas em pelo menos um grão de cereal pode compreender meio para comparar pelo menos um espectro capturado com um espectro de um grão não contaminado e meio para identificar diferenças entre os espectros.

[0020] O aparelho pode compreender adicionalmente meio para obter o espectro de um grão não contaminado a partir de uma base de dados de espectros de grão.

[0021] O aparelho pode compreender adicionalmente meio para identificar o tipo de cereal da coleção de grãos de cereal por comparação de pelo menos um espectro capturado com uma pluralidade de espectros de amostra na base de dados para encontrar o melhor ajuste. O aparelho pode compreender adicionalmente meio para identificar o tipo de cereal a partir de uma entrada do usuário.

[0022] A presente invenção é apropriada para qualquer tipo de cereal, incluindo mas não limitado a trigo, milho, cevada, aveia e centeio. Em produtos alimentícios, a micotoxina está ligada a várias substâncias (como proteínas). Estas ligações influenciam o espectro de reflexão do produto alimentício. Consequentemente, é possível observar indiretamente contaminação por micotoxinas medindo sua influência sobre a matriz de um produto alimentício. Quanto maior a contaminação por micotoxinas dentro de um produto alimentício, maior sua influência sobre a matriz e, assim, também sua influência no espectro de reflexão do produto.

[0023] Quando uma fonte de luz ilumina uma amostra, os raios de luz incidente serão absorvidos, transmitidos e refletidos, dependendo da composição química e das propriedades físicas da amostra. Para identificar opticamente a contaminação por micotoxinas, a presente invenção usa espectroscopia de absorção de luz difusa para estudar as propriedades de reflexão independente da dispersão de produtos. Isto pode ser obtido através do uso de uma esfera de integração que coleta toda a luz refletida, independente do ângulo de reflexão.

[0024] Usando uma esfera de integração, toda a luz dispersa e refletida (então tanto a reflexão direta (especular) como a difusa) é coletada. Quando um feixe de luz ilumina a amostra, luz será dispersa, transmitida, refletida e absorvida. Somente a luz que é absorvida pela amostra não será coletada pelo detector. Uma esfera de integração permite que a quantidade de luz entrando que é absorvida pela amostra seja medida. Portanto, é possível detectar um sinal de luz retransmitido após interação com o grão, a luz tendo penetrado no ponto de iluminação (onde reflexão direta e difusa poderia ocorrer), sendo dispersa e de outra forma interagida com o produto e então reemitida a partir do grão na proximidade de mas não no ponto de iluminação.

[0025] Em uma primeira etapa, uma grande esfera de integração, em que diferentes núcleos de grão de cereal podem ser posicionados, pode ser usada, de modo que regiões de comprimento de onda ótimas possam ser identificadas. Além disso, quando considerando uma amostra contaminada e não classificada, essa configuração permite a medição rápida de uma grande quantidade de núcleos de grão de cereal, permitindo uma pré-classificação aproximada das amostras. Na segunda etapa, os espectros de reflexão de núcleos de grãos de cereal individuais com uma esfera de integração menor podem ser investigados, para classificar os núcleos de grão de acordo com seu nível de contaminação localizada.

[0026] A presente invenção usa espectroscopia de absorção de luz difusa como uma técnica de detecção ótica não destrutiva para a identificação de micotoxinas como DON em núcleos de grão de cereal sólido. Os resultados da presente invenção podem permitir a detecção rápida, precisa e não destrutiva de micotoxinas, como DON, que é apropriada para implementação em máquinas de varredura industrial em linha. Devido à contaminação não homogênea por micotoxinas, a capacidade de monitorar a contaminação por núcleos de grãos de cereal individuais é indispensável para aumentar a segurança dos alimentos e reduzir perdas econômicas.

Breve descrição dos desenhos

[0027] Modalidades da invenção serão descritas, apenas a título de exemplo, com referência aos desenhos em anexo, em que: a Figura 1 mostra uma primeira parte de um aparelho para a detecção de micotoxinas em cereais, de acordo com uma modalidade da invenção.

[0028] A Figura 2 mostra uma segunda parte de um aparelho para a detecção de micotoxinas em cereais, de acordo com uma modalidade da invenção.

[0029] A Figura 3 mostra os espectros médios de reflexão dos núcleos de grão de milho de teste e um pó de milho contaminado com DON de referência, medido com uma esfera de integração de reflexão de 250 mm: (a) espectro vis-NIR; (b) faixa de comprimento de onda NIR mostrando o maior contraste espectral entre os núcleos de grãos de milho contaminados em níveis baixo e alto.

[0030] A Figura 4 mostra a diferença espectral entre amostras de teste e de referência, medida com uma esfera de integração de reflexão de 250 mm: (a) contraste entre núcleos de grãos de milho contaminados em níveis baixo e alto; (b) razão de refletâncias a 940nm e 830nm; (c) razão de refletâncias a 1220nm e 830nm.

[0031] A Figura 5 mostra o espectro médio de reflexão de amostras de milho de teste e de referência, medido com uma esfera de integração de reflexão de 30 mm.

[0032] A Figura 6 mostra uma comparação entre as razões de refletância de amostras de teste e de referência, medidas com uma esfera de integração de reflexão de 30 mm: (a) razão das refletâncias a 940 nm e 830 nm; (b) razão entre as refletâncias a 1220nm e 830nm.

[0033] A Figura 7 mostra classificação de uma batelada de milho, com base em uma configuração de esfera de integração com reflexão a 250 mm: (a) razões de refletância; (b) espectros médios das placas de Petri selecionadas.

[0034] A Figura 8 mostra uma comparação das razões de refletância das amostras de milho contaminadas em níveis baixo e alto, medidas com uma esfera de integração de reflexão de 30 mm, após pré-classificação com a configuração de medição do primeiro estágio: (a) razão das refletâncias a 940nm e 830nm; (b) razão das refletâncias a 1220nm e 830nm.

Descrição das modalidades

[0035] Um aparelho para a detecção de micotoxinas em cereais, de acordo com uma modalidade da invenção, é mostrado na Figura 1. O aparelho mostrado na Figura 1 facilita um procedimento de medição de dois estágios. Ambos os estágios medem os espectros de absorção de luz difusa, mas usam um tipo diferente de esfera de integração. O primeiro estágio usa uma esfera de integração de reflexão maior, permitindo uma triagem rápida de uma coleção de núcleos de grão de cereal, enquanto o segundo estágio usa uma esfera de integração de reflexão menor, permitindo a medição de núcleos de grão individual. Por exemplo, a esfera de integração maior pode ter um diâmetro de 25 cm, enquanto a esfera de integração menor pode ter um diâmetro de 6 cm. Outras combinações de tamanho são, claro, possíveis.

[0036] A configuração de medição de primeiro estágio é usada para capturar pelo menos um espectro de absorção de luz difusa de uma coleção de grãos de cereal. O primeiro estágio da figura 1 consiste em uma fonte de luz supercontinuum 1, uma esfera de integração de reflexão maior 2, fibras óticas 3, 4 e um analisador de espectro 5. Uma coleção de núcleos de grão de cereal 6 pode estar posicionada dentro da esfera. Os núcleos de grão podem estar contidos em uma placa de Petri ou contidos de outro modo. O exterior da esfera 2 contém orifícios diferentes, aos quais a fonte de luz de iluminação e a fibra de detecção podem ser conectadas. Uma fonte de luz brilhante é preferível para reduzir a duração da medição, enquanto se obtém uma grande razão sinal-para-ruído. A fonte de luz usada para iluminar a amostra sob teste pode ser uma fonte supercontinuum tipo de rabicho. A luz refletida é capturada pela fibra de detecção 4. Quando nenhuma amostra está presente na esfera de integração, a luz de iluminação será quase completamente coletada pela fibra de detecção, após suas reflexões difusas sobre o revestimento refletivo dentro da esfera.

[0037] Quando uma amostra é inserida na esfera, a luz capturada será influenciada por sua absorbância e, assim, também por sua composição específica. Considerando as placas de Petri com cereal, quase toda a superfície dos núcleos de grãos é iluminada, resultando na medição de seu nível médio de contaminação, porque os espectros de refletância das áreas contaminadas tanto em nível baixo como elevado são capturados. Subsequentemente, a fibra de detecção guia a luz capturada a partir da esfera de integração para o analisador de espectro, que mede a intensidade de luz como função do comprimento de onda. O analisador de espectro pode ser um analisador de espectro de banda larga, consistindo em dois canais diferentes com arranjos de detector linear, permitindo a medição simultânea de tanto o espectro visível como NIR. O primeiro canal pode ser capaz de medir o espectro entre 200nm e 1100nm, com uma resolução de 1,4nm. O segundo canal pode ser capaz de medir o espectro entre 1000nm e 1700nm, com uma resolução de 4nm. Os espectros podem ser visualizados usando software.

[0038] Antes de cada medição, um espectro escuro e de referência pode ser capturado. O espectro de referência representa o espectro da fonte de luz e pode ser obtido enquanto medindo uma placa de Petri vazia. O espectro escuro visualiza a luz de fundo e foi obtido quando capturando o espectro sem fonte de iluminação. O espectro de reflexão de cada placa de Petri de cereal pode ser capturado múltiplas vezes, após o que o espectro médio pode ser calculado.

[0039] Com base na intensidade de luz refletida dos núcleos de grãos de cereal (Icereal), a intensidade do espectro escuro (Iescuro) e a intensidade do espectro de referência (Ireferência), a refletância, para cada comprimento de onda (À), pode ser calculada usando a seguinte fórmula:

[0040] Porque essa configuração de primeiro estágio permite a medição da contaminação cumulativa, as diferenças de reflexão entre amostras de cereais contaminadas em níveis baixo e alto são aumentadas, resultando em uma determinação precisa do contraste espectral.

[0041] A configuração de medição do segundo estágio é usada para medir a refletância de núcleos de grãos de cereal individual usando uma esfera de integração compacta. Figura 2 mostra a configuração de medição de segundo estágio de acordo com uma modalidade da invenção, que permite a investigação de núcleos de cereal individual, usando uma esfera de integração compacta 7. O aparelho compreende uma fonte de luz de banda larga espectral 8, fibras óticas 9, 10 uma lente de colimação, uma esfera de integração pequena de reflexão 7 e um analisador de espectro 11. No entanto, a amostra 12 pode agora não estar posicionada no interior da esfera, mas precisa estar posicionada na frente da abertura do orifício da amostra. Esta abertura limita a área iluminada da superfície do núcleo do grão de cereal e permite a investigação de sua contaminação localizada. O exterior da esfera de integração contém dois conectores, nos quais a fibra de iluminação e detecção pode estar conectada. Como a esfera de integração é menor do que a usada na configuração do primeiro estágio, a potência de iluminação pode ser diminuída, permitindo o uso de uma lâmpada de deutério e halogênio em vez da fonte supercontinuum de alta potência. A combinação de uma fonte de deutério e halogênio com rabicho, emitindo luz de 200nm a 2500nm, mostra um espectro mais estável do que a fonte supercontinuum e permite o estudo da região espectral de UV. A luz na extremidade da fibra de fonte de deutério e halogênio com rabicho é acoplada na fibra de iluminação, que é conectada à esfera de integração. Para minimizar a perda de luz durante este acoplamento, uma lente de colimação é afixada à fibra de iluminação, transmitindo luz de 200nm a 2500nm. Após a iluminação da amostra, toda luz refletida é capturada pela esfera de integração, permitindo uma análise quantitativa. Subsequentemente, a luz refletida é coletada pela fibra de detecção, que guia essa luz para o analisador de espectro. O mesmo analisador de espectro de dois canais como na configuração de primeiro estágio é usado, medindo o espectro de 200nm até 1700nm.

[0042] A refletância é calculada usando equação (1). Antes da medição dos núcleos de grãos de cereal, os espectros de referência e de escuro podem ser determinados. O espectro de referência, correspondendo com o espectro de fonte, pode ser medido quando posicionando um ladrilho refletor a 99,9% na abertura da esfera de integração. O espectro de escuro mede a intensidade de luz capturada pela fibra de detecção sem uma amostra no topo da esfera de integração. Após as medições de escuro e de referência, os espectros de reflexão dos núcleos de grãos de cereal individual podem ser capturados. Cada núcleo de grão de cereal pode ser iluminado em posições múltiplas. Para evitar que a luz de fundo entre na abertura da esfera, todas as medições podem ser realizadas em um ambiente escuro.

[0043] Figura 3 mostra os espectros médios de reflexão de núcleos de grãos de milho de teste e o pó de milho contaminado com DON de referência, medidos com a esfera de integração de reflexão de 250 mm: (a) espectro vis- NIR; (b) faixa de comprimento de onda NIR mostrando o maior contraste espectral entre os núcleos de grãos de milho contaminados em níveis baixo e alto.

[0044] Figura 4 mostra a diferença espectral entre as amostras de teste e de referência, medida com a esfera de integração de reflexão de 250 mm: (a) contraste entre núcleos de grãos de milho contaminados em níveis baixo e alto; (b) razão de refletâncias a 940nm e 830nm; (c) razão de refletâncias a 1220nm e 830nm.

[0045] Figura 4 mostra a razão das refletâncias a 940nm e 830nm e a razão das refletâncias a 1220nm e 830nm para visualizar o contraste espectral entre a amostra contaminada em níveis baixo e alto. Como mostrado na Figura 4a, um claro desvio entre a amostra de milho contaminada em níveis baixo e alto pode ser obtido. Além disso, quando considerando o pó de milho contaminado com DON de referência, razões de refletância muito maiores foram obtidas, notadamente, 1,004 ± 0,002 para a razão das refletâncias a 940nm e 830nm e 0,985 ± 0,004 para a razão das refletâncias a 1220nm e 830nm (Figura 4a, Figura 4b). Geralmente, pode ser observado que níveis maiores de contaminação geram maiores razões de refletância. Os núcleos de grãos de milho contaminados em nível baixo mostram um contraste maior com o pó de milho contaminado com DON do que com os núcleos de grãos de milho contaminados em nível alto, como uma consequência da contaminação homogênea maior do pó de milho.

[0046] Na próxima etapa, os espectros de reflexão de núcleos de grãos de milho individuais contaminados em níveis baixo e alto, medidos com a esfera de integração de reflexão de 30mm são investigados. Cada amostra foi iluminada em diferentes posições, permitindo monitorar as diferenças locais de contaminação. Considerando a refletância média, a batelada de milho testada e o pó de milho contaminado com DON de referência mostram novamente máximos de refletância similares na região NIR, como mostrado na Figura 5. Figura 5 mostra o espectro de reflexão média das amostras de milho de teste e de referência, medidas com a esfera de integração de reflexão de 30mm. Para avaliar a contaminação local e o contraste espectroscópico entre as amostras, as razões das refletâncias a 830nm, 940nm e 1220nm são calculadas.

[0047] Figura 6 mostra uma comparação entre as razões de refletância das amostras de teste e de referência, medidas com a esfera de integração de reflexão a 30 mm: (a) razão das refletâncias a 940 nm e 830 nm; (b) razão das refletâncias a 1220nm e 830nm.

[0048] Considerando as razões de refletância, um contraste entre as amostras contaminadas em níveis baixo e alto pode ser identificado na Figura 6. As áreas contaminadas em nível alto mostram ainda as maiores razões de refletância. No entanto, em comparação com as medições do primeiro estágio, as razões de refletância mostram uma variação muito maior e um contraste menos pronunciado. Essa variação maior é causada pela contaminação local da amostra. Um núcleo de grão de milho contaminado na maioria das vezes não mostra uma contaminação homogênea, resultando em diferentes razões medidas para vários pontos de iluminação. A razão média do pó contaminado com DON de referência, 1,002 ± 0,018 e 0,849 ± 0,062 para a razão das refletâncias a 940nm e 830nm e a razão das refletâncias a 1220nm e 830nm, respectivamente, está situada entre as razões de refletância dos núcleos de grãos de milho contaminados. Os núcleos de grãos de milho contaminados em nível alto, mostrando um nível médio de contaminação de 1388 ppb, podem mostrar localmente uma contaminação maior. Um núcleo de grão de milho contaminado em nível alto pode, por exemplo, conter uma área pequena com um nível de contaminação maior do que 1840 ppb, enquanto a outra parte do milho não está contaminada. Consequentemente, para evitar a presença de áreas de contaminação localizada em nível alto, o nível de contaminação local deve ser investigado, em vez da contaminação média do núcleo do grão de milho. Quando medindo a contaminação média de uma coleção de núcleos de grãos de milho, as áreas saudáveis no núcleo do grão de milho diminuirão o nível médio de contaminação, mesmo na presença de núcleos de grãos de milho contaminados em nível alto. Para evitar que estes núcleos de grãos de milho contaminados em nível alto entrem na cadeia de abastecimento de alimentos, uma varredura dos núcleos de grãos de milho individuais é indispensável

[0049] Para comparar quantitativamente o desempenho de ambas as configurações de medição e para avaliar a capacidade de diferenciação de ambas as razões de refletância, diferença de classes pode ser calculada. A diferença de classes (D) é uma medida para a diferença entre os valores médios (μ) de dois grupos de produtos, levando em conta o desvio padrão (o) e a quantidade de amostras medidas (N) (Downie & Health, 1970):

[0050] Quanto maior a diferença espectral entre os núcleos de grãos de milho contaminados em níveis baixo e alto, maior a diferença de classes (Tabela 1). Consequentemente, as medições com a esfera de integração de reflexão de 250 mm mostram uma diferença de classe maior do que as medições com a esfera de integração de reflexão de 30 mm. No entanto, quando considerando as razões médias de refletância, é possível observar que a esfera de integração de reflexão de 30mm também é capaz de distinguir claramente entre os níveis de contaminação com DON baixos e altos. Sua diferença de classe menor resulta de sua maior variação, causada pelos níveis variados de contaminação local. Comparando a diferença de classe das duas razões de refletâncias, pode ser observado que ambas as razões mostram um desempenho comparável. Geralmente, pode ser concluído que as refletâncias a 830nm, 940nm e 1220nm permitem diferenciar entre núcleos de grãos de milho contaminados com DON em níveis baixo e alto. Tabela 1: Diferença de classe das duas razões de refletâncias, para ambas as configurações de medição.

[0051] Para validar a capacidade de classificação das configurações de medição de refletância difusa descritas acima, o método da presente invenção foi usado para classificar uma batelada de milho contaminado em uma subamostra contaminada em níveis baixo e alto. Para obter uma classificação eficiente, os requerentes primeiro realizaram uma pré- classificação aproximada com a configuração de medição do primeiro estágio. Especificamente, os requerentes mediram 50 placas de Petri de milho, cada uma consistindo em 15 núcleos de grãos de milho, com a esfera de integração de reflexão de 250mm e calcularam suas razões de refletância. Figura 7 mostra a classificação da batelada de milho contaminado, com base na configuração da esfera de integração de reflexão de 250 mm: (a) razões de refletância; (b) espectros médios das placas de Petri selecionadas. As placas de Petri com as maiores razões foram classificadas como contaminadas em nível alto, aquelas com as menores razões como contaminadas em nível baixo (indicado pelo círculo preto e verde na Figura 7a). As placas de Petri com razões intermediárias não foram consideradas durante este processo de classificação, para maximizar o contraste entre as subamostras contaminadas em níveis baixo e alto obtidas. Considerando os espectros médios das placas de Petri de milho selecionadas, diferenças espectrais similares às para as amostras contaminadas em níveis baixo e alto (francesas) podem ser observadas (Figura 7b).

[0052] A seguir, os requerentes mediram os núcleos de grãos de milho individuais das placas de Petri de milho selecionadas, usando a esfera de integração de reflexão de 30 mm. Estudando as razões de refletância medidas, as maiores razões correspondem aos núcleos de grãos de milho das placas de Petri selecionadas contaminadas em nível alto. Figura 8 mostra uma comparação das razões de refletância das amostras de milho contaminadas em níveis baixo e alto, medidas com a esfera de integração de reflexão de 30 mm, após pré-classificação com a configuração de medição do primeiro estágio: (a) razão das refletâncias a 940nm e 830nm; (b) razão das refletâncias a 1220nm e 830nm. Além disso, como com as medições anteriores na batelada de milho de teste, as duas razões de refletância mostram um desempenho de classificação similar. No entanto, uma grande variação nas razões de refletância das placas de Petri de milho contaminadas em níveis baixo e alto é observada. Quando a configuração de medição do primeiro estágio mostra uma razão de refletância elevada, isso indica a presença de um ou mais núcleos de grãos de milho contaminados em nível alto. Porque que a esfera de integração de reflexão de 250 mm mede a refletância média das placas de Petri de milho, ainda diferentes núcleos de grãos de milho saudáveis ou com contaminação em nível baixo podem estar presentes nas placas de Petri classificadas como contaminadas em nível alto. Além disso, também, nas placas de Petri de contaminadas em nível baixo, a presença de áreas localizadas contaminadas em nível alto é ainda possível, desde que elas não afetem de modo significante o espectro óptico médio. Consequentemente, isso enfatiza a importância de uma segunda etapa de classificação, com base nas medições da contaminação local.

[0053] Para obter uma subamostra final contaminada em níveis baixo e alto da batelada de milho contaminado, os requerentes classificaram os núcleos de grãos de milho das placas de Petri de milho selecionadas com base em suas razões de refletância localizadas. Considerando as placas de Petri selecionadas contaminadas em nível alto, o núcleo de grão de milho foi classificado como contaminado em nível alto quando pelo menos um ponto de iluminação apresentou uma razão de refletância extremamente alta (acima de 1,03 para a razão das refletâncias a 940nm e 830nm ou acima de 0,80 para a razão das refletâncias a 1220nm e 830nm) ou quando três ou mais pontos de iluminação mostraram uma razão de refletância alta (acima de 1,00 para a razão das refletâncias a 940nm e 830nm ou acima de 0,75 para a razão das refletâncias a 1220nm e 830nm). Os núcleos de grãos de milho foram considerados como contaminados em nível baixo se todos os cinco pontos de medição derem uma razão de refletância baixa (abaixo de 0,99 para a razão das refletâncias a 940nm e 830nm ou abaixo de 0,70 para a razão das refletâncias a 1220nm e 830nm). Após a aplicação desta técnica de classificação, duas subamostras de 100g cada foram obtidas, que foram quimicamente analisadas por CODA-CERVA, o Laboratório de Referência da Bélgica para Micotoxinas. As análises de LC-MS/MS realizadas indicaram uma contaminação com DON de 18184ppb para a subamostra contaminada em nível alto, enquanto uma contaminação com DON de 654 ppb foi obtida para a amostra com contaminada em nível baixo. Como um resultado, esses níveis de contaminação validam a técnica de classificação da invenção, com base nos valores de refletância a 830nm, 940nm e 1220nm.

[0054] O método da presente invenção foi testado em uma amostra de cereal contaminado naturalmente em níveis baixo e alto, com uma concentração com DON conhecida a priori de 150ppb e 1388ppb, respectivamente. Estudando os espectros de refletância, um contraste óptico entre 700nm e 1400nm pode ser observado para ambos os estágios de medição. Com base nas refletâncias a 830nm, 940nm e 1220nm, um critério de detecção ótica pode ser definido. Este critério de detecção foi validado, primeiro, pela medição de um pó de milho contaminado com DON de referência. Depois, ele foi usado para dividir com sucesso uma batelada contaminada, com uma concentração de DON desconhecida a priori, em uma subamostra contaminada em níveis baixo e alto, as subsequentes análises químicas da mesma indicando uma concentração de DON de 645ppb e 18184ppb, respectivamente. Como o critério de detecção usa linhas de laser disponíveis comercialmente, este resultado abre o caminho para uma detecção ótica à base de laser ultrarrápida, utilizável imediatamente após a colheita, sem pré-processamento ou moagem do cereal.

[0055] Os resultados das medições acima indicam claramente o uso de espectroscopia de refletância difusa como uma técnica de detecção promissora para a identificação de DON em núcleos de grãos de milho. Além disso, a disponibilidade comercial das linhas de laser NIR, filtros ópticos e detectores sensíveis permitem sua integração em sistemas práticos. Em contraste com as análises químicas atuais à base de amostras, a técnica de classificação ótica da presente invenção provê uma alternativa ultrarrápida e não destrutiva, que não requer qualquer pré-processamento ou moagem do cereal.

[0056] Pelo nível médio de contaminação de uma coleção de núcleos de grãos de milho oferecer frequentemente uma interpretação errada dos níveis de contaminação localizados, uma triagem localizada de núcleos de grãos de milho individuais é benéfica.

[0057] As palavras “compreende/compreendendo” e as palavras “tendo/incluindo”, quando usadas aqui com referência à presente invenção, são usadas para especificar a presença de características, números inteiros, etapas ou componentes declarados, mas não exclui a presença ou adição de uma ou mais de outras características, números inteiros, etapas, componentes ou grupos dos mesmos.

[0058] É reconhecido que certas características da invenção, que são, para maior clareza, descritas no contexto de modalidade separadas, também podem ser providas em combinação em uma única modalidade. Inversamente, várias características da invenção que são, por brevidade, descritas no contexto de uma única modalidade, podem também ser providas separadamente ou em qualquer subcombinação apropriada.

Claims

1. Método para detectar a presença de micotoxinas em cereais, o método caracterizado pelo fato de que compreende: capturar pelo menos um espectro de absorção de luz difusa de uma coleção de grãos de cereal não processados usando uma esfera de integração; capturar pelo menos um espectro de absorção de luz difusa de um grão de cereal individual da coleção de grãos de cereal não processados usando uma esfera de integração; e classificar o nível de contaminação por micotoxinas em um grão de cereal individual por realização da análise de dados multivariados no pelo menos um espectro de absorção de luz difusa da coleção de grãos de cereal e no pelo menos um espectro de absorção de luz difusa do grão de cereal individual.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de capturar pelo menos um espectro de absorção de luz difusa de um grão de cereal individual compreende capturar espectros múltiplos de absorção de luz difusa por iluminação de regiões múltiplas do grão de cereal.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa de classificar o nível de contaminação por micotoxinas no grão de cereal individual compreende calcular a razão entre a refletância em um primeiro comprimento de onda selecionado e a refletância em um segundo comprimento de onda selecionado; e classificar o nível de contaminação por micotoxinas no grão de cereal individual com base na razão calculada.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os comprimentos de onda selecionados estão na região de comprimento de onda de 700nm a 1500nm.

5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa de classificar o nível de contaminação por micotoxinas no grão de cereal individual usa técnicas quimiométricas.

6. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa de classificar o nível de contaminação por micotoxinas no grão de cereal individual compreende comparar pelo menos um espectro capturado com um espectro de um grão não contaminado e identificar diferenças entre os espectros.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente obter o espectro de um grão não contaminado de uma base de dados de espectros de grão.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente identificar o tipo de cereal da coleção de grãos de cereal por comparação de pelo menos um espectro capturado com uma pluralidade de espectros de amostra na base de dados para encontrar o melhor ajuste.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente calcular um espectro médio de absorção de luz difusa de uma coleção de grãos de cereal se múltiplos espectros de absorção de luz difusa forem capturados e em que a etapa de classificar o nível de contaminação por micotoxinas em um grão de cereal individual compreende realizar análise de dados multivariados em um espectro médio.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente calcular um espectro médio de absorção de luz difusa de um grão de cereal individual se múltiplos espectros de absorção de luz difusa do grão de cereal forem capturados e em que a etapa de classificar o nível de contaminação por micotoxina em um grão de cereal individual compreende realizar análise de dados multivariados em um espectro médio.

11. Aparelho para detectar a presença de micotoxinas em cereais, caracterizado pelo fato de que compreende: meio (2, 4, 5) para capturar pelo menos um espectro de absorção de luz difusa de uma coleção de grãos de cereal não processados, em que os meios para capturar um espectro de absorção de luz difusa compreendem uma esfera de integração; meio (7, 10, 11) para capturar pelo menos um espectro de absorção de luz difusa de um grão de cereal individual da coleção de grãos de cereal não processados, em que os meios para capturar um espectro de absorção de luz difusa compreendem uma esfera de integração; e meio para classificar o nível de contaminação por micotoxinas em um grão de cereal individual por realização da análise de dados multivariados no pelo menos um espectro de absorção de luz difusa da coleção de grãos de cereal e no pelo menos um espectro de absorção de luz difusa do grão de cereal individual.

12. Aparelho de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o meio para capturar pelo menos um espectro de absorção de luz difusa do grão de cereal individual compreende uma esfera de integração (7) que é menor do que a usada para capturar cada espectro de absorção de luz difusa da coleção de grãos de cereal.

13. Meio legível por computador, caracterizado pelo fato de que contém instruções de programa que, quando executadas por um processador, levam o aparelho como definido nas reivindicações 11 a 12 a realizar o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.