BR112018009851B1 - Polipeptídio da proteína p-orf2 do vírus da hepatite e, processos in vitro de determinação por imunoensaio: da presença de uma resposta mediada por anticorpos direcionada contra a proteína p-orf2, e da taxa de anticorpos direcionados contra a proteína p-orf-2, seus usos, e kit - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDIOS MUTADOS DE HEV E USO DOS MESMOS PARA A CONTAGEM DE ANTICORPOS ANTI-HEV. A presente invenção refere-se a polipeptídio da proteína p-ORF2 do vírus da hepatite E compreendendo pelo menos a sequência de aminoácidos 394-660, numerados em relação a uma proteína p-ORF2 de 660 aminoácidos, na qual as três cisteínas nas posições 627, 630 e 638 foram mutadas ou, para uma proteína p-ORF2 de comprimento diferente, pelo menos a sequência de aminoácidos correspondente aos aminoácidos 394-660 da proteína p-ORF2 de 660 aminoácidos, na qual as três cisteínas situadas nas três posições correspondentes às posições 627, 630 e 638 da proteína p-ORF2 de 660 aminoácidos foram mutadas. Ela também se refere a processos de determinação da presença de resposta humoral ou da taxa de anticorpos direcionados contra a proteína p-ORF2 utilizando esses polipeptídios, assim como seu uso no contexto de uma infecção pelo vírus da hepatite E. Sem desenhos.

Description

[001] A presente invenção refere-se ao campo das infecções pelo vírus da hepatite E (HEV). Em particular, a invenção refere-se à detecção de hepatites causadas pelo vírus da hepatite E.

[002] Hepatites são lesões inflamatórias do fígado cujas causas podem ser múltiplas: infecciosas, medicamentosas, autoimunes etc. Danos hepáticos agudos de origem viral são frequentes, sempre assintomáticos. Eles são devidos a uma ação citopática direta do vírus, ou, mais frequentemente, à reação imunológica direcionada contra as células hepáticas infectadas. Os sintomas, quando existem, são associados a uma icterícia febril, pruriginosa, a uma descoloração das fezes, a um escurecimento da urina e a um aumento mais ou menos significativo das transaminases, revelando citólise e disfuncionamento hepático.

[003] Numerosos vírus são capazes de causar a lesões hepáticas, por exemplo, o vírus de Epstein-Barr (EBV) ou o citomegalovírus (CMV), mas apenas seis vírus são reconhecidos como responsáveis daquilo que é comumente chamado de “hepátites virais”. Esses vírus são os vírus das hepatites A, B, C, Delta, E e G, que são vírus que pertencem a famílias bem diferentes.

[004] O vírus da hepatite G é muito pouco descrito.

[005] O vírus da hepatite A, ou VHA ou HAV, pertence à família dos Picornaviridae e é o único representante do gênero Hepatovírus. Trata-se de um vírus nu de RNA. O reservatório do vírus é o indivíduo infectado, doente ou não. Os modos de transmissão são determinados pela excepcional resistência do vírus e sua concentração elevada nas fezes. O principal modo de transmissão é essencialmente fecal-oral. Um risco particular está associado ao consumo de moluscos e alimentos crus sujos.

[006] O vírus da hepatite B, ou VHB ou HBV, pertence à família dos hepadnaviridas. Trata-se de um vírus de DNA circular, bicaternário em 3/4 de sua circunferência. Este vírus expõe ao risco de hepatite fulminante, hepatite crônica ativa, cirrose e hepatocarcinoma. O principal vetor do vírus é o sangue, mas ele pode ser transmitido por via sexual. Mundialmente falando, estima-se em 350 milhões o número de pessoas cronicamente infectadas por esse vírus e que é a origem de mais de um milhão de mortes por ano.

[007] O vírus da hepatite C, ou VHC ou HCV ou NANBH para “NonA, Non-B Hepatitis”, um vírus de genoma de RNA de polaridade positiva, tem uma organização próxima daquela dos flavivírus com 9500 nucleotídeos (9,5 kb), de extremidades 5' e 3' não codificadoras, e partindo da extremidade 5’ dos genes de capsídio (C), de envelope (E1 e E2) e de proteínas não estruturais (NS1 a NS5). O HCV é um vírus estritamente humano. O modo de contaminação se dá principalmente por via venosa, por exemplo, pelo uso de agulhas não esterilizadas, contaminação por transfusão de sangue estando ainda mais presente nos países em desenvolvimento onde não há triagem dos doadores. O elemento mais inquietante da hepatite C é que, além de uma infecção primária geralmente assintomática (90% dos casos), sua evolução em 70 a 80 % dos casos chega à cronicidade, com risco de cirrose e câncer primário do fígado em 20 % dos infectados crônicos depois de uma incubação de 20 anos em média para a cirrose e de 30 anos para o câncer.

[008] O vírus da hepatite DELTA, ou VHD ou HDV, é um vírus muito pequeno de RNA, incapaz de se replicar o HBV que lhe empresta sem antígeno de superfície HBs. A infecção pelo vírus DELTA só ocorre ao mesmo tempo que uma infecção por HBV cujo prognóstico fica agravado: risco aumentado de hepatite fulminante e de transformação em hepatite crônica ativa.

[009] O vírus da hepatite E, ou VHE ou HEV ou ET-NANBH para “Enterically Transmitted Non-A, Non-B Hepatitis”, é um vírus pequeno nu não envelopado cujo genoma é um RNA de fita simples de polaridade positiva. Inicialmente classificado na família dos Caliciviridae dos quais ele é próximo, o conhecimento de seu genoma inteiro leva atualmente a classificá-lo à parte, como o único membro do gênero Hepevirus, da família dos Hepeviridra (Emerson, S. U., & Purcell, R. H., 2007). A transmissão deste vírus entre humanos se dá principalmente por via fecal-oral (água suja, alimento). As infecções são endêmicas em certas regiões da Ásia, África e América Central e América do Sul. O vírus da hepatite E é identificado como o principal agente de epidemias de hepatites agudas nos países com baixo nível de higiene. Mais recentemente, ele foi claramente definido como responsável por verdadeiros casos esporádicos de hepatites agudas nos países industrializados em pacientes que jamais estiveram em zona endêmica. Hoje está nitidamente demonstrado que a hepatite E é uma zoonose e que de numerosas espécies de animais domésticos e selvagens são infectados pelo HEV, constituindo o reservatório do vírus. A hepatite E, assim como a hepatite A, geralmente não chega à cronicidade, exceto em certos grupos de pacientes como aqueles que tenham recebido um transplante de órgão sólido. Todavia, ele apresenta uma particularidade mal explicada: embora geralmente se resolva espontaneamente, foi observado que, na Índia, a mortalidade poderia atingir 20% em mulheres grávidas, à medida que idade gestacional aumenta, o que poderia fazer da infecção pelo HEV a mais grave hepatite de todas as hepatites virais durante a gravidez. É, portanto, fundamental dispor de ferramentas de detecção da infecção pelo HEV de bom desempenho e confiáveis.

[0010] O genoma do vírus da hepatite E tem um comprimento aproximado de 7,5 kb e apresenta 3 estruturas de leitura (ORF1, ORF2 e ORF3) parcialmente sobrepostas inseridas na extremidade 5' de uma sequência não codificadora de 27 a 32 nucleotídeos e na extremidade 3' de uma sequência de 65 a 74 bases acompanhada por uma extremidade poliadenilada de comprimento variável de acordo com os vírus. A ORF1 codifica para uma poliproteína de cerca de 186 kDa, denominada proteína p-ORF1, posteriormente clivada em proteínas não estruturais, uma delas sendo uma metil-transferase, demonstrando que o vírus é coberto em sua extremidade 5', e de RNA polimerase RNA dependente. A ORF2 codifica para a proteína de capsídio glicosilada, chamada proteína p-ORF2, tendo de 659 a 674 aminoácidos segundo as variantes descritas até hoje, a maioria das proteínas p-ORF2 das variantes tendo 660 aminoácidos. Esta proteína p-ORF2 apresenta vários sítios imunogênicos com um epítopo imunodominante conformacional entre os aminoácidos 394 e 457, numerados em relação à proteína de 660 aminoácidos, e um epítopo alvo de anticorpos neutralizantes, igualmente conformacional, situado entre os aminoácidos 452 e 617, com a mesma numeração (Meng J, et al., 2001). Ela compreende igualmente um outro epítopo imunodominante, chamado epítopo 406.3-2, que corresponde aos aminoácidos 613-654 de uma variante ORF2 de 660 aminoácidos (W093/14116). A fosfoproteína de peso molecular de 13 kDa, codificada pela ORF3, chamada proteína p-ORF3, é muito variável de acordo com os vírus. Esta proteína cujo papel ainda não foi estabelecido, estaria envolvida nas funções de regulação da replicação viral ou na montagem do nucleocapsídio.

[0011] O diagnóstico atual baseia-se na detecção do vírus por amplificação gênica a partir de amostras de fezes e soro, ou ainda bile ou biópsia hepática, ou na detecção da resposta mediada por anticorpo sérico anti-HEV.

[0012] A amplificação gênica é feita por RT-PCR, PCR aninhada, ou PCR em tempo real usando vários pares de iniciadores de acordo com os genótipos, a partir das regiões mais conservadas do genoma. Com um limiar de detecção de 10 a 103 moléculas de cDNA/reação, de acordo com as técnicas, a excreção viral nas fezes pode atingir 106 moléculas de cDNA. A caracterização do genótipo pode ser efetuada em um segundo tempo. Essas técnicas são essencialmente úteis para detecção precoce da viremia no sangue da infecção, antes do aparecimento dos sintomas e dos anticorpos. Todavia, essas técnicas que visam a detecção de ácidos nucleicos virais têm como inconvenientes o fato de que o período de viremia é curto (1 a 2 semanas no sangue, 3 a 4 semanas nas fezes) e de que elas requerem uma aparelhagem onerosa e que não pode ser utilizada tão perto do paciente.

[0013] O diagnóstico sorológico da infecção por HEV baseia-se na detecção de anticorpos específicos anti-HEV do tipo IgM e/ou IgG cujo alvo principal é a p-ORF2. Diversos kits são comercializados. Assim sendo, a MP Diagnostic™ propõe o kit ASSURE® HEV IgM que é um dispositivo de teste imunocromatográfico destinado à detecção rápida de anticorpos IgM direcionados contra a proteína p-ORF2 do vírus da hepatite E. Para tanto, o kit usa um polipeptídio recombinante, o polipeptídio 394-660, numerado em relação à sequência 1-660 da p- ORF2, também chamado polipeptídio p-ORF2.1, correspondente aos 267 últimos aminoácidos da proteína. Anticorpos de camundongo direcionados contra IgM humanas são imobilizados sobre a membrana de imunocromatografia, o que permite capturar as diferentes IgM humanas presentes na amostra. A presença de IgM direcionadas especificamente contra HEV é revelada utilizando-se, como parceiro de detecção, o polipeptídio recombinante 394-660 complexado a um anticorpo monoclonal anti-HEV marcado com ouro. Os motivos para o uso do polipeptídio recombinante 394-660 e não da proteína inteira estão divulgados no pedido WO95/08632. De acordo com os ensinamentos deste pedido de patente, a reatividade imunológica da proteína completa p-ORF2 expressa em E. coli não é ideal, uma parte da molécula podendo reduzir ou mesmo inibir a imunorreatividade de uma outra parte da molécula. Para superar este efeito inibidor, o pedido de patente WO95/08632 propôs o uso de proteínas p-ORF2 deletadas ou truncadas. Entre as diferentes construções testadas, o polipeptídio recombinante 394-660, deletado dos 393 primeiros aminoácidos, apresentou a melhor imunorreatividade.

[0014] A caracterização detalhada da estrutura antigênica do polipeptídio 394-660 e sua comparação com aqueles de “virus-like particles” ou VLP, formados por automontagem in vitro e antigenicamente próximos da partícula viral HEV, estão descritas em Riddell M.A., et al., 2000.

[0015] O inconveniente de usar o polipeptídio 394-660 é que ele contém em sua parte C-terminal um domínio que inibe, pelo menos parcialmente, a automontagem do polipeptídio em oligômeros e VLP. Isto pode interferir na boa apresentação de epítopos conformacionais.

[0016] Para superar esses inconvenientes, a Wantai modificou o polipeptídio 394-660 eliminando os aminoácidos 607-660 (numerados em relação a uma sequência 1-660 de p-ORF2) que interferem na oligomerização e na capacidade de automontagem. O polipeptídio assim obtido foi denominado polipeptídio pE2, como descrito no pedido de patente WO01/22916. A vantagem deste polipeptídio pE2, de sequência 394-606, é que ele dimeriza naturalmente e que a imunorreatividade do pE2 dimérico é bem superior àquela do pE2 monomérico favorecendo a boa apresentação dos epítopos conformacionais. O inconveniente é que tal polipeptídio truncado não compreende um epítopo importante, o epítopo 406.3-2 correspondente aos aminoácidos 613-654 de uma variante ORF2 de 660 aminoácidos, como indicado no pedido de patente W093/14116. Tal deleção pode levar ainda a uma diminuição da sensibilidade de um exame diagnóstico que utiliza temperatura ambiente polipeptídio truncado.

[0017] A Requerente descobriu surpreendentemente que era possível superar os inconvenientes dos polipeptídios da técnica anterior efetuando, no peptídio 394-660 de ORF2 de HEV, numerado em relação a uma proteína p-ORF2 de 660 aminoácidos, 3 mutações nas posições 627, 630 e 638, e melhorando assim sua antigenicidade e sua imunorreatividade. Assim, o peptídio mutado, denominado p-ORF2- MUT, possui todos os epítopos importante, dimeriza naturalmente de forma não covalente, é capaz de oligomerizar sem agregação e apresenta uma imunorreatividade superior à aquela do polipeptídio recombinante 394-660 não mutado.

[0018] A invenção também se refere a um polipeptídio derivado da proteína p-ORF2 do vírus da hepatite E compreendendo (i) pelo menos a sequência de aminoácidos 394-660, numerados em relação a uma proteína p-ORF2 de 660 aminoácidos, na qual as três cisteínas nas posições 627, 630 e 638 foram mutadas, ou (ii) para uma proteína p- ORF2 de comprimento diferente, pelo menos a sequência de aminoácidos correspondente aos aminoácidos 394-660 da proteína p- ORF2 de 660 aminoácidos, na qual as três cisteínas situadas nas três posições correspondentes às posições 627, 630 e 638 da proteína p- ORF2 de 660 aminoácidos foram mutadas.

[0019] Um outro objeto da invenção refere-se aos ácidos nucleicos isolados compreendendo umas sequências de nucleotídeos codificando para os polipeptídios da invenção ou uma sequência complementar à referida sequência codificadora, assim como os vetores de expressão compreendendo essas sequências.

[0020] Ainda um outro objeto da invenção refere-se às células hospedeiras compreendendo essas mesmas sequências nucleicas, inseridas diretamente ou por intermediário de vetores de expressão.

[0021] Ela se refere ainda ao uso dos polipeptídios da invenção para a determinação da presença de uma resposta de anticorpo direcionada contra a proteína p-ORF-2 do vírus da hepatite E ou ainda para a determinação da taxa desses anticorpos.

[0022] Assim sendo, um outro objeto da invenção refere-se a um processo de determinação por imunoensaio da presença de uma resposta de anticorpo direcionada contra a proteína p-ORF-2 do vírus da hepatite E em uma amostra biológica obtida de um indivíduo, suscetível de conter os anticorpos da referida resposta, que compreende as seguintes etapas:- colocar a referida amostra biológica em contato com um polipeptídio da invenção,- detectar um sinal emitido pela ligação entre o referido polipeptídio e os referidos anticorpos, se estiverem presentes, utilizando um marcador capaz de emitir um sinal detectável,- comparar o sinal assim obtido com um sinal de referência S previamente determinado com duas populações de controle, uma delas tendo desenvolvido os referidos anticorpos e a outra não tendo desenvolvido os referidos anticorpos,- um sinal inferior ao referido sinal de referência S significando que a amostra não contém os referidos anticorpos, e- um sinal superior ao referido sinal de referência S significando que a amostra contém os referidos anticorpos.

[0023] Um outro objeto refere-se ainda a um processo de determinação por imunoensaio da taxa de anticorpos direcionados contra a proteína p-ORF-2 do vírus da hepatite E em uma amostra biológica obtida de um indivíduo, suscetível de conter os referidos anticorpos, que compreende as seguintes etapas:- colocar a referida amostra biológica em contato com um polipeptídio da invenção,- detectar um sinal emitido pela ligação entre o referido polipeptídio e os referidos anticorpos, se estiverem presentes, utilizando um marcador capaz de emitir um sinal detectável,- transformar o sinal detectado em uma taxa de anticorpos.

[0024] Ainda um outro objeto refere-se ao uso desses processos para ajudar no diagnóstico in vitro, para o diagnóstico in vitro de uma infecção pelo vírus da hepatite E em um indivíduo suscetível de ser infectado, para o acompanhamento terapêutico de um indivíduo infectado pelo vírus da hepatite E, para a realização de estudos epidemiológicos da soroprevalência de anticorpos anti-HEV em uma população ou em um dado território geográfico ou para determinar se um indivíduo precisa ser vacinado ou revacinado contra o vírus da hepatite E.

[0025] Por fim, um último objeto refere-se a kits para a determinação por imunoensaio da presença de resposta humoral ou da taxa de anticorpos direcionados contra a proteína p-ORF2 do vírus da hepatite E em um indivíduo suscetível de ter produzido esses anticorpos, compreendendo um polipeptídio da invenção.

[0026] A invenção será mais bem compreendida a partir da leitura da descrição não limitativa que segue e das figuras 1 a 6 em anexo, nas quais:- A Figura 1 dá um alinhamento de sequências de aminoácidos de diferentes proteínas p-ORF2 das principais variantes do vírus HEV obtidas a partir da base de dados Uniprot, a primeira coluna correspondendo à referência UNIPROT, a segunda coluna correspondendo ao nome da cepa de HEV e a última coluna correspondendo ao alinhamento de sequências. O alinhamento de sequências foi realizado pelo programa Clustal Oméga que pode ser acessado do website da UNIPROT. A linha abaixo de cada alinhamento de sequências mostra a identidade de aminoácidos ou não entre cada variante, “*” indicando uma posição totalmente conservada, com aminoácidos idênticos em todas as variantes, “:” indicando uma posição bem conservada, com aminoácidos tendo propriedades bastante semelhantes e um escore >0,5 na matriz Gonnet PAM 250, “.” indicando uma posição bastante conservada, com aminoácidos tendo propriedades pobremente semelhantes e um escore <0,5 na matriz Gonnet PAM 250. As outras posições estão marcadas por “°”. As diferentes partes do alinhamento estão distribuídas nas Figuras 1A a 1R. As Figuras 1A a IL dão o alinhamento de proteínas inteiras de diferentes variantes. A sequência 394-660 da variante Q81871, de 660 aminoácidos (SEQ ID N° l l), está sublinhada como referência. As setas na Figura 1G indicam o primeiro aminoácido da sequência mínima dos polipeptídios da invenção e o retângulo na Figura 1K mostra a sequência de 12 aminoácidos da variante Q81871 na qual se encontram as 3 cisteínas a serem mutadas. As Figuras 1M a 1R dão o alinhamento das sequências mínimas dos polipeptídios da invenção de diferentes variantes extraídas das Figuras 1A a IL a partir das setas. A sequência 394-660 do polipeptídio de referência da variante Q81871 (SEQ ID N° 26) está sublinhada.- A Figura 2 mostra as representações de mapas de densidade eletrônica das cadeias laterais de aminoácido naturais, obtidos por difração de raios X, calculados a uma resolução de 1,5 Angstrom, impressos do site (referência na data de 13 de novembro de 2015): http://people.mbi.ucla.edu/sawaya/m230ci/Modelbuikling/modelbuilding .htinL - A Figura 3 é a fotografia de um gel de análise SDS-PAGE (4-12%) colorido de azul de Coomassie para visualizar um polipeptídio da invenção, ORF2-MUT, e um polipeptídio não mutado, ORF2-REF que corresponde ao polipeptídio p-ORF2.1 (aminoácidos 394-660) divulgado na patente WO95/08632. Antes da análise sobre gel, os polipeptídios ORF2-REF e ORF2-MUT purificados e dialisados passaram uma redução por adição de ditiotreitol (DTT), por uma desnaturação por aquecimento (10 min a 75°C), pelos dois tratamentos ao mesmo tempo, por nenhum tratamento, como mostrado na tabela acima do gel. A linha M corresponde ao marcador de peso molecular Page Ruler (Pierce), sendo que os pesos moleculares aparentes das bandas estão indicados à esquerda em quiloDaltons (kDa).- A Figura 4 representa os cromatogramas de exclusão estérica obtidos seguindo a absorvência UV a 280 nm para o polipeptídio da técnica anterior ORF2-REF (Figura 4A) e o polipeptídio da invenção ORF2-MUT (Figura 4B). Para permitir uma boa visualização dos diferentes picos da Figura 4A os dois cromatogramas não estão representados na mesma escala para o eixo das ordenadas.- A Figura 5 representa o gráfico que mostra os resultados obtidos pela técnica AsFlFFF-MALS (“asymetric flow field fow fractionation-multi angle light scattering”) para o polipeptídio da invenção ORF2-MUT. A absorvência nce UV a 280 nm (linha cheia fina), o sinal de difusão de luz multiângulos (MALS, linha hachurada) e a estimativa da massa molar (linha cheia grossa) estão representadas de forma superposta na ordenada em função do tempo de análise (min).

[0027] - A Figura 6 é uma representação em caixa de bigodes (“enboite à moustache”) das distribuições de sinas RFV obtidos com um imunoensaio (autômato VIDAS®, bioMérieux) utilizando como antígeno de captura o polipeptídio da técnica anterior ORF2-REF ou o polipeptídio da invenção ORF2-MUT, em amostras que não contém anticorpos anti-ORF2 (Neg) e em amostras HEV-positivas, que contêm anticorpos anti-ORF2 (Pos). As caixas de bigodes foram traçadas de acordo com o método de Tukey: os limites superior e inferior da caixa corresponde ao 25° e ao 75° percentil de distribuições, respectivamente. O valor traçado em direção à metade da caixa é a mediana. O bigode superior corresponde ao 75° percentil + 1,5 x o desvio interquartil e o bigode inferior ao 25° percentil - 1,5 x o desvio interquartil. Os valores além e aquém dos bigodes estão representados na forma de pontos individuais, pois trata-se de valores extremos, pouco frequentes.

[0028] A Requerente demonstrou, portanto, surpreendentemente, que era possível, para tratamento de indivíduos acometidos por uma infecção de hepatite E, utilizar polipeptídios derivados da proteína p- ORF2 do vírus da hepatite E compreendendo pelo menos a sequência de aminoácidos 394-660, numerados em relação a uma proteína p- ORF2 de 660 aminoácidos, evitando os inconvenientes da técnica anterior quando os aminoácidos 607-660 são incluídos nos polipeptídios, e convém saber que eles possuem todos os epítopos importantes, dimerizam naturalmente de forma não covalente, são capazes de oligomerizar sem agregação. Além disso, os polipeptídios da invenção são produzidos de forma homogênea, ao contrário dos polipeptídios da técnica anterior. De fato, na sua produção, o produto final apresenta reprodutivelmente mais de 75% de dímeros não covalentes, o restante sendo constituído de dodecâmeros, embora a proporção de dímeros não covalentes, dímeros covalentes e agregados de polipeptídios da técnica anterior varie de uma produção à outra. Além disso, os polipeptídios da invenção apresentam uma imunorreatividade superior àquela do polipeptídio recombinante 394-660 não mutado. Por fim, os polipeptídios da invenção permitem, quando eles são utilizados em um imunoensaio, aumentar a especificidade diagnóstica do teste, sem modificar sua sensibilidade diagnóstica, o que é fundamental para um exame de detecção do vírus da hepatite E.

[0029] Como indicado anteriormente e como bem ilustrado na Figura 1, a proteína p-ORF2 d vírus HEV tem comprimentos diferentes, de 659 a 674 aminoácidos (vide Figura IL que mostra os últimos aminoácidos da proteína p-ORF2). A maioria das proteínas tendo 660 aminoácidos, é sempre uma proteína de 660 aminoácidos que é tomada como referência. No presente pedido a sequência de referência de 660 aminoácidos é aquela da variante Q81871 (SEQ ID N° 11). Todavia as proteínas de outras variantes, ainda que tenham uma sequência de aminoácidos diferentes, por exemplo, de 674 aminoácidos (SEQ ID N° l à 7), de 672 aminoácidos (SEQ ID N° 8), de 671 aminoácidos (SEQ ID N° 9), de 668 aminoácidos (SEQ ID N° 10) ou de 659 aminoácidos (SEQ ID N° 24), como aquelas de variantes cuja proteína tem o mesmo comprimento (SEQ ID N° 12 à 23) também estão incluídas no escopo da invenção.

[0030] Assim, para encontrar todos os polipeptídios da invenção, que são definidos como compreendendo:- quando a proteína p-ORF2 tem 660 aminoácidos, pelo menos a sequência de aminoácidos 394-660, numerados em relação a uma proteína p-ORF2 de 660 aminoácidos, na qual as três cisteínas nas posições 627, 630 e 638 são mutadas e,- quando a proteína p-ORF2 é de comprimento diferente, pelo menos a sequência de aminoácidos correspondente aos aminoácidos 394-660 da proteína p-ORF2 de 660 aminoácidos, na qual as três cisteínas situadas nas três posições correspondentes às posições 627, 630 e 638 da proteína p-ORF2 de 660 aminoácidos são mutadas, basta que o especialista na técnica realize um alinhamento em relação a uma proteína de 660 aminoácidos. Assim, por exemplo, se nos referirmos à Figura 1, se usarmos como proteína de referência de 660 aminoácidos aquela que pertence àvarianteQ81871 (na qual a sequência 394-660 está sublinhada na Figura 1) e se considerarmos, por exemplo, as proteínas das variantes, de 672, 671, 659, 668 e 674 aminoácidos, os polipeptídios da invenção compreendem pelo menos:- a sequência de aminoácidos 394-660 (SEQ ID N° 26, e SEQ ID N° 38 à 49) cujas cisteínas nas posições 627, 630 e 638 são mutadas (proveniente das variantes Q81871, P29326, Q6J8F7, Q04611, Q68965, Q9YLQ9, P33426, Q9YLR2, Q0QC51, Q69411, A0A024D9U6, A0A024D9R2, Q8V729), ou- a sequência de aminoácidos 408-674 (SEQ ID N° 28 à 34) cujas cisteínas nas posições 641, 644 e 652 são mutadas (proveniente das variantes Q8JJN2, Q80IR5, Q806D7, Q6BD83, Q6BD78, B6VC89, Q6PMR3).- a sequência de aminoácidos 406-672 (SEQ ID N° 35) cujas cisteínas nas posições 639, 642 e 650 são mutadas (proveniente da variante Q9IVZ8), ou- a sequência de aminoácidos 405-671 (SEQ ID N° 36) cujas cisteínas nas posições 638, 641 e 649 são mutadas (proveniente da variante Q8JJM1), ou- a sequência de aminoácidos 405-668 (SEQ ID N° 37) cujas cisteínas nas posições 638, 641 e 649 são mutadas (proveniente da variante Q2PYP3) ou- a sequência de aminoácidos 393-659 (SEQ ID N° 50) cujas cisteínas nas posições 626, 629 e 637 são mutadas (proveniente da variante Q03500).

[0031] Assim os diferentes fragmentos 394-660, 408-674, 406-672, 405-671, 405-668 e 393-659 das variantes descritas nas Figuras 1M a 1R e extraídas das Figuras 1G a IL a partir da seta na Figura 1G, correspondem às seguintes sequências: Fragmentos 394-660Q81871 P29326 Q6J8F7 Q04611 Q68985 Q9YLQ9SEQ ID N° 26 SEQ ID N° 38 SEQ ID N° 39 SEQ ID N°40 SEQ ID N°41 SEQ ID N° 42P33426 Q9YLR2 Q0QC51 Q69411 A0A024D9U6 A0A024D9R2SEQ ID N°43 SEQ ID N°44Q8V729SEQ ID N° 49Fragmentos 408-674 SEQ ID N°45 SEQ ID N°46 SEQ ID N°47 SEQ ID N°48Q8JJN2 Q80IR5 Q806D7 Q6BD83 Q6BD78 B6VC89SEQ ID N° 28 SEQ ID N° 29 SEQ ID N° 30 SEQ ID N° 31 SEQ ID N° 32 SEQ ID N° 33Q6PMR3SEQ ID N° 34Fragmento 406-672Q9IVZ8SEQ ID N° 35Fragmento 405-671Q8JJM1SEQ ID N° 36Fragmento 405-668Q2PYP3SEQ ID N° 37Fragmento 393-659Q03500SEQ ID N° 50

[0032] A Figura 1 também mostra que se tomarmos a sequência de aminoácidos 394- 660 da variante Q81871 como sequência de referência (SEQ ID N° 26) para todas as proteínas de 660 aminoácidos, as sequências de aminoácidos 394-660 das outras variantes (SEQ ID N° 38 à 49) têm entre 90,64% e 99,25% de identidade com a sequência SEQ ID N° 26, enquanto que se tomarmos a sequência total da proteína de 660 aminoácidos desta mesma variante (SEQ ID N° 11), as sequências de 660 aminoácidos das outras variantes (SEQ ID N° 12 à 23) apresentam entre 90,45% e 99,09% de identidade com esta sequência SEQ ID N° 11.

[0033] Da mesma forma, se tomarmos a sequência de aminoácidos 408-674 da variante Q8JJN2 como sequência de referência (SEQ ID N° 28) para todas as proteínas de 674 aminoácidos, as sequências de aminoácidos 408-674 das outras variantes (SEQ ID N° 29 à 34) têm entre 98,50% e 98,88% de identidade com a sequência SEQ ID N° 28, enquanto que se tomarmos a sequência total da proteína de 674 aminoácidos desta mesma variante (SEQ ID N° 1), as sequências de 674 aminoácidos das outras variantes (SEQ ID N° 2 à 7) apresentam entre 98,22% e 98,37% de identidade com esta sequência SEQ ID N° 1.

[0034] Mais geralmente, se tomarmos a sequência de aminoácidos 394-660 da variante Q81871 como sequência de referência (SEQ ID N° 26), as sequências de aminoácidos correspondentes das outras variantes (SEQ ID N° 28 à 50) apresentam entre 90,64%> e 99,25%) de identidade com a sequência SEQ ID N° 26, portanto pelo menos 90%> de identidade, tandis que se tomarmos a sequência total da proteína de 660 aminoácidos desta mesma variante (SEQ ID N° l l), as sequências totais das proteínas das outras variantes (SEQ ID N° l à 10 e 12 à 24) apresentam entre 89,97%> e 99,09%> de identidade com esta sequência SEQ ID N° 11, portanto pelo menos 89% de identidade.

[0035] A percentagem de identidade entre 2 sequências é calculada a partir do alinhamento de múltiplas sequências. O programa Clustal Oméga que pode ser acessado em uma versão com mais parâmetros no website EMBL-EMI (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) ger junto com o alinhamento múltiplo, um escore de alinhamento. Este escore está associado à taxa de similaridade entre 2 sequências comparadas e àquela para todas as sequências, como ilustrado na Figura 1.

[0036] Como mostrado na Figura 1K, as 3 cisteínas a serem mutados se encontram em uma sequência de 12 aminoácidos definida a seguir: CPECRX1LGX2QGC (SEQ ID N° 25), na qual X1 representa P, T, S ou A e X2 representa L ou F.

[0037] As mutações no nível das três cisteínas acima são feitas por substituição das referidas cisteínas por qualquer aminoácido diferente de cisteína bastante conhecido pelo especialista na técnica, tal como, por exemplo, os aminoácidos proteinogénicos Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenilalanina, Treonina, Triptofano, Valina, Alanina, Arginina, Ácido aspártico, Asparagina, Ácido glutâmico, Glutamina, Glicina, Prolina, Serina, e Tirosina.

[0038] Todavia, é preferível escolher o aminoácido de substituição de acordo com os dois critérios que se seguem:1) o “tamanho ou volume” da cadeia lateral de aminoácidos com base nas representações de mapas da densidade eletrônica obtida por difração de raios X, como, por exemplo, mostrado na Figura 2 que apresenta tal representação, calculada a uma resolução de 1,5 Angstrom, e obtida no site (impresso no dia 13 de novembro de 2013): http://people.mbi.ucla.edu/sawaya/rn230d/Modelbuilding/modelbuilding .html.

[0039] De fato, a partir desses mapas, são escolhidos os aminoácidos cuja densidade eletrônica é mais semelhante àquela da cisteína (por exemplo, Serina, Valina, e Treonina) ou de aminoácidos “menores” que a cisteína (por exemplo, Glicina, Alanina). Os aminoácidos “volumosos” de mais (por exemplo, Lisina, Histidina, FenilAlanina, Tirosina, Arginina e Triptofano) são de preferência descartados.2) As reatividades possíveis. Não se deseja que o aminoácido substituído reaja facilmente com outros aminoácidos vizinhos. Os aminoácidos carregados tais como os aminoácidos básicos (já excluídos pelo 1o critério) e os aminoácidos ácidos são de preferência descartados.

[0040] De acordo com uma modalidade, as mutações nos polipeptídios da invenção são efetuadas por substituição das três cisteínas por qualquer aminoácido exceto prolina, aminoácidos cujas cadeias laterais são carregadas tais como Lisina, Arginina, Histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico e aminoácidos cujas cadeias laterais compreendem um ciclo aromático benzênico, tais como Tirosina, fenilAlanina, triptofano.

[0041] De preferência, as mutações nos polipeptídios da invenção são efetuadas por substituição das três cisteínas por um aminoácido selecionado dentre alanina, glicina, treonina, valina e serina.

[0042] As 3 cisteínas podem ser substituídas pelo mesmo aminoácido ou por aminoácidos diferentes, de preferência de acordo com os critérios acima.

[0043] De acordo com uma outra modalidade, as mutações efetuadas consistem em substituir as 3 cisteínas pelo mesmo aminoácido e de preferência por serina.

[0044] Os polipeptídios da invenção compreendem pelo menos a sequência de aminoácidos 394-660, numerados em relação a uma proteína p-ORF2 de 660 aminoácidos, e, para uma proteína p-ORF2 de comprimento diferente, eles compreendem pelo menos a sequência de aminoácidos correspondente aos aminoácidos 394-660 da proteína p- ORF2 de 660 aminoácidos, as referidas sequências sendo mutadas como indicado anteriormente.

[0045] Por polipeptídio derivado da proteína p-ORF2 do vírus da hepatite E, entende-se um encadeamento contínuo de aminoácidos nas posições 394-660 ou posições equivalentes, provenientes da proteína p-ORF2 do vírus da hepatite E. Também se pode dizer o mesmo do polipeptídio proveniente da proteína p-ORF2, de polipeptídio da proteína p-ORF2, de polipeptídio p-ORF2, do polipeptídio mutado p- ORF2, da proteína derivada da proteína p-ORF2, de proteína proveniente da proteína p-ORF2 ou da proteína p-ORF2 mutada.

[0046] Pela expressão “compreende pelo menos a sequência”, entende-se que o polipeptídio tem o referido encadeamento contínuo dos aminoácidos provenientes da proteína p-ORF2, ou ainda que ele tem este encadeamento de aminoácidos aos quais se pode adicionar:- i) um ou mais aminoácidos que pertencem à proteína p- ORF2, situados antes da referida sequência, e/ou- ii) um ou mais aminoácidos que não pertencem a proteína p-ORF2, tal como uma etiqueta poli-histidina, uma etiqueta polisina, ou uma proteína de fusão, por exemplo, GST (Glutation S Transferase), MBP (Proteína de Ligação de Maltose), CBP (Peptídio de Ligação de Calmodulina), CBD (Domínio de Ligação de Quitina), Proteína A, Tioredoxina, e/ou- iii) uma marcação, por exemplo, (a) por acoplamento a uma molécula marcadora conhecida pelo especialista na técnica tal como biotina, uma enzima, um marcador fluorescente, uma molécula radioativa ou qualquer outro marcador tal como definido mais adiante, ou (b) por fosforilação. Portanto, de acordo com uma modalidade, os polipeptídios da invenção compreendem uma ou mais das seguintes características:- eles consistem nos polipeptídios de sequência de aminoácidos 394-660, numerados em relação a uma proteína p-ORF2 de 660 aminoácidos, na qual as três cisteínas nas posições 627, 630 e 638 foram mutadas ou, para uma proteína p-ORF2 de comprimento diferente, de sequência de aminoácidos correspondente aos aminoácidos 394-660 da proteína p-ORF2 de 660 aminoácidos, na qual as três cisteínas situadas nas três posições correspondentes às posições 627, 630 e 638 da proteína p-ORF2 de 660 aminoácidos foram mutadas ;- eles compreendem um ou mais aminoácidos que não pertencem à proteína p-ORF2;- eles são marcados, por exemplo, como ilustrado acima.

[0047] Os polipeptídios da invenção podem ser produzidos por técnicas bastante conhecidos pelo especialista na técnica. Por exemplo, os polipeptídios da invenção podem ser obtidos por engenharia genética usando etapas, tradicionalmente conhecidas pelo especialista na técnica, que consistem em:- preparar o DNA que codifica para os polipeptídios da invenção,- inserir este DNA por clonagem em um vetor de expressão tal como um plasmídio, um cosmídio, um fago À ou um vetor viral (baculovírus (vírus da poliedrose nuclear causada por Autographa califomica), vírus da vacínia, vírus da floresta de Semliki, adenovírus, lentivírus, ...), cujo vetor compreende ainda uma origem de replicação (para plasmídios ou cosmídios) ou um sistema de replicação que permite sua amplificação na célula hospedeira e um ou mais promotores que permitem a transcrição de RNAs mensageiros que serão traduzidos em proteínas,- introduzir o vetor para expressão em uma célula hospedeira, tal como uma célula procariótica (por exemplo, uma bactéria como Escherichia coli, Bacillus subtilis) por transformação ou infecção ou uma célula eucariótica (por exemplo, leveduras (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris), células de insetos (células Sf9, Sf21, High5), células de mamíferos (CHO, 293, Per.C6, BHK-21, Vero, ...) por transfecção transitória ou permanente, ou ainda infecção viral,- cultura e opcionalmente multiplicação da célula hospedeira contendo o vetor de expressão, opcionalmente com amplificação do vetor na célula hospedeira,- se necessário, indução da transcrição e da síntese proteica para produção dos polipeptídios recombinantes da invenção, e- purificação para extrair os referidos polipeptídios, por exemplo, graças a uma etiqueta poli-histidina. Os polipeptídios então chamados de recombinantes.

[0048] Assim sendo, a invenção tem também como objeto:

[0049] - ácidos nucleicos isolados compreendendo sequências denucleotídeos que codificam para os polipeptídios da invenção tais como definidos anteriormente ou sequências complementares às referidas sequências codificadoras,- vetores de expressão compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos tal como definida acima,- células hospedeiras, procarióticas ou eucarióticas, compreendendo uma sequências de nucleotídeos codificando para os polipeptídios da invenção tais como definidos acima ou uma sequência complementar à referida sequência codificadora ou um vetor de expressão tal como definido acima.

[0050] Quando os polipeptídios da invenção compreendem outros componentes tais como marcadores de natureza polipeptídica ou proteínas de fusão, como descrito acima, a sequência de ácidos nucleicos codificando para esses componentes também pode ser inserida na mesma estrutura de leitura no vetor de modo a permitir uma produção em fusão.

[0051] A adição de marcadores não proteicos aos polipeptídios da invenção pode ser realizada por técnicas conhecidas pelo especialista na técnica por meio de ligações -NH-OC- formadas a partir de grupos - NH2 e -COOR (R sendo, por exemplo, um grupo éster ativo) de marcadores e polipeptídios da invenção. Assim, por exemplo, quando o marcador for biotina, o especialista na técnica poderá utilizar reagentes comerciais, tais como os reagentes EZ-Link® NHS-Biotin (ThermoScientific N° 20217, 21336 e 21343), os quais compreendem um grupo -COO-éster ativo a ser reagido com o grupo -NH2 dos polipeptídios da invenção de acordo com as instruções do fornecedor.

[0052] Como indicado acima, os polipeptídios da invenção são particularmente úteis para determinação da presença de uma resposta de anticorpo direcionada contra a proteína p-ORF-2 do vírus da hepatite E.

[0053] A determinação da presença de uma resposta de anticorpo direcionada contra a proteína p-ORF-2 do vírus da hepatite E em uma amostra biológica obtida de um indivíduo, suscetível de conter os anticorpos da referida resposta, pode ser feita por imunoensaio e compreende ou consiste nas seguintes etapas:- colocar a referida amostra biológica em contato com um polipeptídio tal como anteriormente,- detectar um sinal emitido pela ligação entre o referido polipeptídio e os referidos anticorpos, se estiverem presentes, utilizando um marcador capaz de emitir um sinal detectável,- comparar o sinal assim obtido com um sinal de referência S previamente determinado com duas populações de controle, uma delas tendo desenvolvido os referidos anticorpos e a outra não tendo desenvolvido os referidos anticorpos,- um sinal inferior ao referido sinal de referência S significando que a amostra não contém os referidos anticorpos, e- um sinal superior ao referido sinal de referência S significando que a amostra contém os referidos anticorpos.-

[0054] Os indivíduos suscetíveis à infecção pelo vírus HEV, para os quais é realizada a determinação da presença de resposta mediada por anticorpos ou da taxa de anticorpos, podem ser qualquer indivíduo e em particular:. indivíduos com sintomas de hepatite aguda, como por exemplo, amarelecimento da pele e dos olhos (amarelão ou icterícia), urina escura, fezes descoloridas, fadiga extrema, náuseas, vômitos, febre, dores abdominais ou síndrome “pseudo-gripal”. Estes sintomas podem estar acompanhados de uma elevação das enzimas hepáticas (ALAT/ASAT) ou não. Estes indivíduos já foram testados positivos para os vírus HAV, HBV ou HCV ou não;. indivíduos assintomáticos com uma elevação das enzimas hepáticas (ALAT/ASAT). Estes indivíduos já foram testados positivos para os vírus HAV, HBV ou HCV ou não;. indivíduos que pertencem a uma população chamada de risco de cronicização, ou de forme severa fulminante tais como:• os imunodeprimidos por qualquer motivo, incluindo os indivíduos transplantados, os indivíduos que recebem uma ou mais terapias imunomoduladores ou imunossupressores como quimioterapia, tratamento anti-TNF alfa ou ainda corticoterapia, indivíduos com uma coinfecção por HIV, idosos (imunossenescência),• mulheres grávidas,• indivíduos com histórico de hepatopatia crônica.

[0055] Os indivíduos podem ser mamíferos tais como seres humanos, animais domésticos (cachorros, gatos, cavalos, etc.) e animais de criação (ovinos, bovinos, caprinos), de preferência seres humanos.

[0056] Como amostras biológicas de indivíduos suscetíveis de portarem anticorpos anti-p-ORF2 do vírus da hepatite E, podemos citar os fluidos biológicos tais como sangue total ou seus derivados, por exemplo, soro ou plasma, urina, saliva e efusões, assim como fezes. Sangue ou seus derivados, assim como fezes, são preferidos. Estas amostras podem ser usadas no estado em que se encontram no processo da invenção ou ter passado por um pré-tratamento de acordo com métodos conhecidos pelo especialista na técnica.Por determinação da resposta mediada por anticorpos direcionada contra a proteína p- ORF-2 do vírus da hepatite E na amostra biológica proveniente de um indivíduo, entende-se a determinação da presença ou não de anticorpos produzidos pelo indivíduo no caso de uma infecção pelo vírus HEV, estes anticorpos sendo direcionados contra a proteína p-ORF2.

[0057] Esta determinação é realizada por imunoensaio que é um ensaio bastante conhecido pelo especialista na técnica. Em poucas palavras, ele consiste em determinar um analito, no presente caso os anticorpos anti-p-ORF2 da resposta mediada por anticorpos (também denominada humoral), utilizando pelo menos um parceiro de ligação ao analito.

[0058] Bem entendido, o prefixo “imuno” no termo “imunoensaio”, por exemplo, não deve considerado no presente pedido como indicando estritamente que o parceiro de ligação seja necessariamente um parceiro de origem imunológica, tal como um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Na verdade, como bem sabe o especialista na técnica, este termo é mais largamento usado para designar também exames e processos nos quais o parceiro de ligação não é de origem/de natureza imunológica, mas consiste, por exemplo, em um receptor de analito que se deseja detectar e/ou quantificar. A condição essencial é que o parceiro de ligação em questão seja capaz de se ligar ao analito procurado, no presente caso por natureza anticorpos, de preferência especificamente. Portanto, pode-se mencionar o ensaio ELISA como ensaios que usam parceiros de ligação não imunológicos stricto sensu, mais conhecido em inglês como “ligand binding assay”, que se pode traduzir para o português por “ensaio que utiliza a ligação a um ligante”, ainda que o termo “imuno” esteja incluído no título por extenso correspondente ao acrônima ELISA. A título de clareza e uniformidade, o termo “imuno” é empregado no presente pedido para designar qualquer análise biológica que utiliza pelo menos um parceiro de ligação adaptado para se ligar ao analito procurado e detectar e/ou quantificar este último, de preferência especificamente, mesmo quando o referido parceiro de ligação não é de natureza ou de origem imunológica no sentido estrito.

[0059] Por parceiro de ligação aos anticorpos anti-p-ORF2, entende-se qualquer molécula capaz de se ligar a esses anticorpos. A título de exemplo desses parceiros de ligação, pode-se citar antígenos tais como a proteína p-ORF2 nativa ou recombinante, fragmentos desta proteína, e em particular polipeptídios tais como descritos anteriormente, anticorpos tais como os anticorpos anti-Ig, por exemplo, anti-Ig totais para uma espécie dada, ou ainda anti-IgG ou anti-IgM no caso de estarem pesquisadas IgG ou IgM (usando uma espécie anti- IgG ou anti-IgM para detecção de IgG ou IgM nessa espécie), análogos de anticorpos (moléculas capazes de mimetizar os anticorpos) tais como nanofitinas, aptâmeros ou ainda “DARPins”, ou qualquer outra molécula que sabidamente tenha uma interação com os anticorpos. A condição essencial para realização do processo de determinação da presença de resposta mediada por anticorpos de acordo com a invenção é usar, como parceiro de ligação, pelo menos os polipeptídios da invenção tais como descritos anteriormente.

[0060] Os parceiros de ligação anticorpos são, por exemplo, anticorpos policlonais ou anticorpos monoclonais, cuja obtenção é bastante conhecida pelo especialista na técnica.

[0061] A título de exemplo de fragmentos de anticorpo, pode-se citar os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 assim como os scFv (fragmento variável de fita simples), dsFv (fragmento variável de fita dupla). Estes fragmentos funcionais podem ser principalmente obtidos por engenharia genética.

[0062] Os análogos de anticorpo nanofitinas são pequenas proteínas que, assim como os anticorpos, são capazes de se ligar a um alvo biológico permitindo assim detectar o mesmo, capturar o mesmo ou simplesmente direcioná-lo para o centro de um organismo.

[0063] Os análogos de anticorpo aptâmeros são oligonucleotídeos, geralmente RNA ou DNA, identificados em bancos que contêm até 1015 sequências diferentes, por um método combinatório de seleção in vitro chamado SELEX de “Systematic Evolution of Ligands by Exponentiel Enrichment” (Ellington AD e Szostak JW., 1990). A maioria dos aptâmeros são compostos de RNA, devido à capacidade do RNA de adotar estruturar variadas e complexas, o que permite criar em sua superfície cavidades de geometrias variadas, permitindo fixar ligantes diversos. Trata-se de ferramentas bioquímicas de interesse que podem ser usadas em aplicações biotecnológicas, diagnósticas ou terapêuticas. Sua seletividade e suas propriedades de fixação de ligantes são equiparáveis aqueles dos anticorpos.

[0064] Os análogos de anticorpo “DARPins” de Designed Ankyrin Repeat ProteINS (Boersma YL e Plutckthun A, 2011) constituem uma outra classe de proteínas que permitem mimetizar os anticorpos e o poder de fixação com uma afinidade e uma seletividade elevadas às proteínas alvo. Eles derivam da família de proteínas anquirinas que são proteínas adaptadoras que permitem fixar as proteínas de membrana integrais à rede espectrina/actina que constitui “a coluna vertebral” da membrana plasmática celular. A estrutura das anquirinas baseia-se na repetição de um motivo de cerca de 33 aminoácidos e o mesmo ocorre com as DARPins. Cada motivo tem uma estrutura secundária do tipo hélice-volta-hélice (“helix-turn-helix”). As DARPins contêm pelo menos três, de preferência quatro a cinco motivos repetidos e são obtidas por rastreamento de bancos combinatoriais.

[0065] O imunoensaio que consiste em determinar a resposta mediada por anticorpo é um ensaio qualitativo, semi-quantitativo ou quantitativo bastante conhecido pelo especialista na técnica que utiliza de preferência dois parceiros de ligação aos anticorpos. Um dos dois parceiros pode ser acoplado a um marcador para formar um conjugado ou um traçador. O outro parceiro de ligação pode ser capturado sobre um suporte sólido. Usa-se então o termo parceiro de captura para este último e parceiro de detecção para o primeiro.

[0066] Os formatos que usam dois parceiros de ligação são formatos do tipo sanduíche bastante conhecidos pelo especialista na técnica, a saber:• um formato comumente chamado sanduíche duplo antígeno, que utiliza na captura e na detecção dois antígenos, de mesma natureza ou de natureza diferente, capazes de serem reconhecidos pelo anticorpo procurado, ficando entendido que pelo menos um dos antígenos é um polipeptídio da invenção• um formato comumente chamado imunocaptura, que utiliza na captura um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou um análogo de anticorpo, como descrito acima, e na detecção um polipeptídio da invenção e• um formato comumente chamado sanduíche indireto, que utiliza na captura um polipeptídio da invenção e na detecção um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou um análogo de anticorpo.

[0067] De preferência, o parceiro de captura é um polipeptídio da invenção e o parceiro de detecção é um anticorpo anti-IgG ou IgM humana (formato sanduíche indireto).

[0068] O sinal medido emitido por ocasião do imunoensaio é então proporcional à quantidade de anticorpo da amostra biológica.

[0069] Por marcador, entende-se, principalmente, qualquer molécula que contenha um grupo reativo com um grupo do parceiro de ligação, diretamente sem modificação química, ou depois de modificação química para incluir tal grupo, molécula esta que é capaz de gerar diretamente ou indiretamente um sinal detectável. Uma lista não limitativa desses marcadores de detecção direta consiste em: • enzimas que produzem um sinal detectável, por exemplo, por colorimetria, fluorescência, luminescência, tal como peroxidade de raiz-forte, fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicose-6-fosfato desidrogenase,• cromóforos tais como compostos fluorescentes, luminescentes, corantes,• moléculas radioativas tais como 32P, 35S ou 125I,• moléculas fluorescentes tais como Alexa ou ficocianinas, e• sais eletroquimioluminescentes tais como os derivados organometálicos à base de acridínio ou rutênio.

[0070] Sistemas indiretos de detecção também podem ser usados, como por exemplo, ligantes capazes de reagir com um antiligante. O ligante corresponde então ao marcador para constituir, com o parceiro de ligação, o conjugado.

[0071] Os pares ligante/antiligante são bastante conhecidos pelo especialista na técnica, o que é o caso, por exemplo, dos seguintes pares: biotina/estreptavidina, hapteno/anticorpo, antígeno/anticorpo, peptídio/anticorpo, açúcar/lectina, polinucleotídeo/complementar do polinucleotídeo.

[0072] O antiligante pode ser então diretamente detectável pelos marcadores de detecção descritos anteriormente ou ser ele próprio detectável por um outro par ligante/antiligante, e assim por diante.

[0073] Estes sistemas indiretos de detecção podem levar, em certas condições, a uma amplificação do sinal. Esta técnica de amplificação do sinal é bastante conhecida pelo especialista na técnica, e pode-se fazer referência aos pedidos de patentes anteriores FR 2781802 ou WO 95/08000 da mesma Requerente.

[0074] Estes diferentes marcadores podem ser acoplados aos polipeptídios da invenção da maneira indicada acima.

[0075] De acordo com o tipo de marcação usada, o especialista na técnica acrescentará reagentes que permitam a visualização da marcação ou da emissão de um sinal detectável por qualquer tipo de aparelho de medição apropriado, como, por exemplo, um espectrofotômetro, um espectrofluorímetro, um densitômetro, um luminômetro ou ainda uma câmera de alta definição.

[0076] O imunoensaio também pode compreender outras etapas conhecidas pelo especialista na técnica, tais como etapas de lavagem e etapas de incubação.

[0077] O imunoensaio pode ser um ensaio de uma etapa ou de duas etapas, como bastante conhecido pelo especialista na técnica. Em poucas palavras, um imunoensaio de uma etapa compreende colocar amostra a ser examinada na presença simultânea dos dois parceiros de ligação, ou seja, os polipeptídios da invenção tais como definidos acima, ao passo que um imunoensaio em duas etapas compreende colocar amostra a ser examinada na presença, de um lado, do primeiro parceiro de ligação, e depois o complexo analito-primeiro parceiro de ligação assim formado é colocado na presença do segundo parceiro de ligação, um dos dois parceiros de ligação sendo um polipeptídio da invenção tal como definido acima.

[0078] O sinal de referência S usado no processo de acordo com a invenção é um sinal previamente obtido com duas populações de controle, uma delas tendo desenvolvido uma resposta mediada por anticorpo direcionada contra a proteína p-ORF2 subsequente a uma infecção pelo vírus HEV e a outra não tendo desenvolvido uma resposta mediada por anticorpo. Este tipo de determinação é bastante conhecido pelo especialista na técnica. Ela consiste principalmente em realizar um imunoensaio idêntico àquele realizado no processo da invenção, em amostras biológicas dessas duas populações (de natureza idêntica às amostras que serão utilizadas no processo de determinação da presença de resposta mediada por anticorpos nos indivíduos testados), e determinar o valor do teste (sinal) permitindo uma discriminação entre essas duas populações.

[0079] O sinal detectado, comparado ao sinal de referência, usada para saber se a amostra contém os anticorpos procurados ou não, pode corresponder ao sinal emitido pelo marcador, ou ainda ele pode ser transformado em um índice que é a razão sinal detectado/sinal de referência. De acordo com um exemplo simples, para o qual não existe uma zona cinza, se o índice de referência for fixado em “1”, um índice para a amostra testada superior a “1” significa que a amostra contém os referidos anticorpos e um índice inferior a “1” significa que a amostra não contém os referidos anticorpos.

[0080] Bem entendido, todas as definições dadas acima em relação aos polipeptídios também se aplicam ao processo de determinação da presença de uma resposta de anticorpo direcionada contra a proteína p-ORF-2 do vírus da hepatite E descrito acima.

[0081] Os polipeptídios da invenção também podem ser úteis para determinação da taxa de anticorpos direcionados contra a proteína p- ORF-2 do vírus da hepatite E em uma amostra biológica obtida de um indivíduo, suscetível de conter os referidos anticorpos. Esta determinação pode ser feita por imunoensaio e compreende ou consiste nas seguintes etapas:- colocar a referida amostra biológica em contato com um polipeptídio tal como definido acima,- detectar um sinal emitido pela ligação entre o referido polipeptídio e os referidos anticorpos, se estiverem presentes, utilizando um marcador capaz de emitir um sinal detectável,- transformar o sinal detectado em uma taxa de anticorpos.

[0082] Bem entendido, mais uma vez, o todas as definições dadas acima em relação aos polipeptídios, assim como aquelas associadas ao processo de determinação da presença de resposta mediada por anticorpo, aplicam-se ao processo de determinação da taxa de anticorpos. A única diferença consiste no resultado dado, que não é um resultado do tipo “sim”/”não” após comparação do sinal detectado com um sinal de referência, mas sim um resultado do tipo concentração, ou título, ou quantidade, depois da última etapa que consiste em transformar o sinal detectado em uma taxa de anticorpos.

[0083] Esta etapa de transformação do sinal detectado em taxa de anticorpos é bastante conhecida pelo especialista na técnica. Ela consiste em usar um modelo matemático pré-estabelecido a partir de um padrão gama. Este padrão gama deve ser previamente obtido de forma conhecida. Em poucas palavras, a obtenção de um padrão gama consiste em medir o sinal gerado por quantidades ou concentrações crescentes e conhecidas no anticorpo alvo, traçar a curva que dá o sinal em função da taxa de anticorpos e encontrar um modelo matemático que representa da forma mais fiel possível esta relação. O modelo matemático será usado para determinar as quantidades, os títulos ou as concentrações de anticorpos anti-p-ORF2 desconhecidos, contidos na amostra biológica a ser examinada.

[0084] Os anticorpos procurados na amostra biológica dos indivíduos são de diversas naturezas: IgM, IgG, IgA, IgE, os anticorpos do tipo IgG e IgM sendo preferidos. Pode-se buscar por anticorpos de mesma natureza, por exemplo, IgG isoladas ou IgM isoladas, ou ainda pode-se buscar por anticorpos de naturezas diferentes de forma combinada, por exemplo, IgG e IgM simultaneamente ou todos os outros tipos de imunoglobulinas anti-ORF2 ao mesmo tempo (Ig totais).

[0085] Qualquer que seja a natureza dos anticorpos procurados, e de preferência quando estes são IgG ou IgM, os processos de determinação da presença de resposta mediada por anticorpos ou da taxa de anticorpos tais como descritos acima são particularmente úteis para o tratamento de indivíduos com uma infecção pelo vírus da hepatite E.

[0086] Por infecção pelo vírus da hepatite E, entende-se tanto uma infecção presente, o quer dizer que o indivíduo em quem o teste de imunoensaio é realizado tem uma infecção, quanto uma infecção passada, o que dizer que o indivíduo em quem o teste de imunoensaio é realizado não apresenta mais sintomas, mas que esteve em contato com o vírus ou com uma vacina contra o vírus.

[0087] Portanto, um outro objeto da invenção refere-se ao uso de um processo tal como definido acima para ajudar no diagnóstico in vitro, para o diagnóstico in vitro de uma infecção pelo vírus da hepatite E em um indivíduo suscetível de ser infectado, para o acompanhamento terapêutico de um indivíduo infectado pelo vírus da hepatite E ou para a realização de estudos epidemiológicos da soroprevalência de anticorpos anti-HEV em uma população ou em um dado território geográfico.

[0088] Todos esses usos são bastante conhecidos pelo especialista na técnica, sendo a única condição é que eles sejam realizados pelos processos descritos acima e, por conseguinte, com os polipeptídios descritos acima.

[0089] Quando os anticorpos procurados são IgG, os processos definidos acima são igualmente particularmente úteis para determinar se um indivíduo precisa ser vacinado ou revacinado contra o vírus da hepatite E, o que constitui um outro objeto da invenção.

[0090] De fato, para determinar o indivíduo precisa ser vacina ou revacinado contra HEV ou não, as seguintes etapas podem ser realizadas:1. determinar a taxa de anticorpos IgG anti-HEV em uma amostra biológica, principalmente em uma amostra de sangue ou um derivado de sangue, de acordo com um processo tal como definido acima, em um indivíduo saudável ou de preferência em pacientes de risco, tais como aqueles descritos acima,2. comparar a resposta obtida com um limiar, este limiar sendo previamente determinado de acordo com as normas em vigor,3. a resposta obtida sendo inferior ao limiar significando que é conveniente vacinar ou revacinar o indivíduo,4. a resposta obtida sendo superior ao limiar significando que não é necessário vacinar ou revacinar o indivíduo.

[0091] Bem entendido, as características descritas acima no contexto dos processos de determinação da presença de resposta mediada por anticorpos ou da taxa de anticorpos aplicam-se aos usos que são feitos desses processos, como, por exemplo, os polipeptídios e seus diversos comprimentos e mutações, as amostras biológicas e os indivíduos em questão.

[0092] Para realização dos processos da invenção, usados principalmente de acordo com os usos descritos acima, os polipeptídios da invenção podem estar contidos em kits.

[0093] Por conseguinte, um outro objeto da invenção refere-se a kits para a determinação por imunoensaio da presença de resposta mediada por anticorpos ou da taxa de anticorpos direcionados contra a proteína p-ORF-2 do vírus da hepatite E em um indivíduo suscetível de ter produzido esses anticorpos, compreendendo um polipeptídio tal como definido acima.

[0094] Mais uma vez, as características descritas acima no contexto de polipeptídios e processos da invenção aplicam-se aos kits da invenção.

[0095] De acordo com uma modalidade particular, os kits compreendem ou contêm ainda pelo menos um controle positivo. Este controle positivo compreende um composto capaz de ligar aos parceiros de ligação utilizados quando o kit é usado, o composto estando presente em uma taxa predeterminada.

[0096] A título de exemplos não limitativos de tais compostos, podemos citar as imunoglobulinas naturais anti-ORF2 (neste caso, o controle positivo pode ser uma amostra biológica soropositiva ORF2), as imunoglobulinas anti-ORF2 não naturais, por exemplo, humanizadas, os anticorpos monoclonais anti-ORF2, por exemplo, de camundongo.

[0097] Os kits também podem conter quaisquer compostos necessários para destacar da reação entre o ou os parceiros de ligação e os anticorpos alvo, tais como tampões de lavagem ou reagentes que permitem a visualização de uma marcação ou da emissão de um sinal detectável.

[0098] A invenção será melhor compreendida com a ajuda dos exemplos que se seguem, que são dados a título ilustrativo, e não limitativo.

EXEMPLOS

[0099] Exemplo 1: Construção, expressão e purificação dos fragmentos mutados e não mutados 394-660 da proteína de capsídio OR 1 2 do vírus da hepatite E

[00100] A sequência ORF2 expressa é aquela do isolado Human/China/HeBei/1987 do vírus da hepatite E que é de genótipo 1 (N° de acesso Uniprot Q81871 - Vide também a Figura 1 - SEQ ID N° 11). Para a construção de referência (ORF2-REF), a sequência correspondente aos aminoácidos 394-660 de ORF2 (SEQ ID N° 26) foi fundida na extremidade N-terminal com uma tag poli-histidinas (8-his). Para a construção de acordo com a invenção (ORF2-MUT), 3 mutações não conservativas (cisteína para serina) foram feitas no fragmento 394660 de ORF2 no nível das 3 cisteínas nas posições 627, 630 e 638 (SEQ ID N° 27). Assim como a ORF2-REF, a ORF2-MUT compreende uma tag 8-his na extremidade N-terminal.SEQ ID N° 26:QLFYSRP VVSANGEPTV KLYTSVENAQ QDKGIAIPHD IDLGESRVVI QDYDNQHEQD RPTPSPAPSR PFSVLRANDV LWLSLTAAEY DQSTYGSSTG PVYVSDSVTL VNVATGAQAV ARSLDWTKVTLDGRPLSTTQ QYSKTFFVLP LRGKLSFWEA GTTKAGYPYNYNTTASDQLL VENAAGHRVA I STYTTSLGA GPVSISAVAV LAPHSALALL EDTMDYPARA HTFDDFCPEC RPLGLQGCAFQSTVAELQRL KMKVGKTRELSEQ ID N° 27:QLFYSRP VVSANGEPTV KLYTSVENAQ QDKGIAIPHD IDLGESRVVI QDYDNQHEQD RPTPSPAPSR PFSVLRANDV LWLSLTAAEY DQSTYGSSTG PVYVSDSVTL VNVATGAQAV ARSLDWTKVTLDGRPLSTTQ QYSKTFFVLP LRGKLSFWEA GTTKAGYPYNYNTTASDQLL VENAAGHRVA I STYTTSLGA GPVSISAVAV LAPHSALALL EDTMDYPARA HTFDDFSPES RPLGLQGSAFQSTVAELQRL KMKVGKTREL

[00101] Os fragmentos de DNA correspondentes às construções ORF2-REF e ORF2-MUT foram adquiridos na forma de genes sintéticos na GeneArt® (Life Technologies). Eles foram clonados entre os sítios Nco I (5') e Bam HI (3') no vetor pET3d (Novagen, EMD Millipore) sob controle do promotor T7 induzível em IPTG (isopropil beta-D-1- tiogalactopiranosida). Os plasmídios obtidos foram verificados por sequenciamento no nível dos insertos para garantir que eles não compreenderiam falhas.

[00102] Os plasmídios de expressão são introduzidos em bactérias E. coli BL21 DE3 (Stratagene, Agilent Technologies) por transformação com choque térmico. Após isolamento das colônias em uma placa de Pétri LB-ágar contendo ampicilina, uma colônia correspondente à ORF2-REF e uma colônia correspondente à ORF2-MUT são coletadas e semeadas em 200 mL de meio de cultura 2x YT, glicose 0,5%, na presença de ampicilina 100 μg/mL, 1 noite a 37°C, com agitação de 250 rpm. Um volume de 16 mL de cada pré-cultura é usado para semear 400 mL de meio 2x YT-glucose 0,5%-ampicilina 100 μg/mL. Estas culturas são incubadas a 37°C com agitação 250 rpm. Quando a densidade ótica (DO) medida a 600 nm atinge cerca de 1 unidade de DO, a indução da expressão de proteínas é feita por adição de 1 mM de IPTG. O crescimento de culturas é acompanhado por medição da densidade ótica em intervalos regulares. Ao fim de cerca de 3 horas de indução, quando as culturas atingem a fase estacionária, as culturas são interrompidas e as bactérias são coletadas por centrifugação (5000 g, 20 min, +2/8°C). As massas bacterianas são pesadas e em seguida congeladas a -80°C até serem purificadas.

[00103] Para a purificação, as massas (2 à 2,2 g) são recuperadas em 30 mL de tampão de lise (Tris HCl 20 mM, NaCl 100 mM, glicerol 5%, Benzonase® Nuclease 5U/mL (Novagen), MgCl2 0,48 g/L, inibidores de proteases complete EDTA free (Roche, Ref 045-66462) 1 pastilha/50 mL, pH 7,4). As bactérias são lisados por desintegração, utilizando-se um Cell Disruption System (Constant Systems Ltd, Northants, Reino Unido), a 1600 bar mantendo-se a refrigeração do sistema a +2/8°C. O desintegrador é enxaguado com mais 30 mL de tampão de lise para recuperar a totalidade do lisado. Os lisados são em seguida centrifugados a 10.000 g, 40 min, +2/8°C e as massas são recuperadas.

[00104] Para solubilizar os corpos de inclusão, cada massa é recuperada em 30 mL de um tampão Tris HCl 20 mM, NaCl 100 mM, glicerol 5%, ureia 5M, pH 7,4 e agitada por 1:30 h a +18/25°C. Os sobrenadantes são recuperados por centrifugação a 10.000 g, 20 min, temperatura ambiente, e em seguida filtrados sucessivamente através de filtros de nitrocelulose de 1,2 μm e 0,8 μm.

[00105] A purificação das proteínas ORF2-REF e ORF2-MUT é feita por cromatografia de afinidade metal quelato em uma etapa, graças a suas tags poli-histidinas. A purificação é realizada em um sistema automatizado do tipo ÃKTA (GE Healthcare Lifesciences). O sobrenadante obtido depois da centrifugação é carregado em uma coluna de resina Ni-NTA (Roche, Ref 058-93682001) equilibrada em tampão Tris HCl 20 mM, NaCl 100 mM, glicerol 5%, ureia 5M, pH 7,4 (tampão de equilíbrio, idêntico ao tampão de solubilização). O tampão de eluição é o tampão de equilíbrio contendo 300 mM de imidazol e cujo pH foi reajustado em 7,4. Um ciclo de lavagem é efetuado com o tampão de equilíbrio contendo 40 mM de imidazol. Em seguida proteína é eluída em uma placa com 100% de tampão de eluição, isto é, 300 mM de imidazol. As frações de purificação são analisados em gel SDS-PAGE colorido com azul de Coomassie. Esta análise permite verificar o desenvolvimento do processo de purificação e a seleção das frações que contêm a proteína de interesse.

[00106] As frações selecionadas são reunidas e dialisadas em tampão Tris HCl 40 mM, NaCl 250 mM, manitol 10%, Arginina 0,4 M, ureia 2M, pH 7,4. São feitas duas diálises sucessivas a +18/25°C contra um volume de tampão 100 vezes maior que aquela da amostra. As proteínas dialisadas são quantificadas em termos de proteína total medindo-se a densidade ótica a 280 nm, e em seguida conservadas - 80°C.Exemplo 2: Caracterização por análise SDS-PAGE das proteínas ORF2-REF e ORF2-MUT

[00107] Uma primeira caracterização das proteínas purificadas ORF2-REF e ORF2-MUT foi feita por análise SDS-PAGE em um gel NuPAGE® Bis-Tris 4-12% em tampão NuPAGE® MES SDS (Life Technologies). Antes de serem colocadas sobre o gel (10 μm/poço), as proteínas foram diluídas em tampão NuPAGE® LDS Sample Buffer 4X (Life Technologies) (3/1, volume/volume) e passaram por diferentes tratamentos. A redução é feita por adição de 50 mM final de ditiotreitol (DTT). O aquecimento é de 10 min a 75°C. As combinações testadas foram as seguintes:

[00108] AQUECIDA e REDUZIDA (com DTT)

[00109] AQUECIDA e NÃO REDUZIDA (sem DTT)

[00110] NÃO AQUECIDA e REDUZIDA (com DTT)

[00111] NÃO AQUECIDA e NÃO REDUZIDA (sem DTT)

[00112] Uma fotografia do gel de SDS-PAGE colorido com azul de Coomassie para visualização das proteínas totais está apresentada na Figura 3. Reduzidas e aquecidas (bandas sob as colunas + e + na tabela), as proteínas ORF2-REF e ORF2-MUT têm o mesmo pelo menos que é ligeiramente superior a 30 kDa. Esta condição de análise permite visualizar a forma monomérica das duas proteínas.

[00113] Na condição não reduzida e aquecida (bandas sob as colunas + para aquecida e - para reduzida na tabela), PORF2-REF apresenta 4 bandas cuja maioria dos pesos moleculares parece inferior a 70 kDa. Esta banda corresponde a uma forma dimérica da proteína ORF2-REF: os dois monômeros estão ligados por pelo menos uma ligação covalente (ponte dissulfeto) que não é destruída por uma desnaturação térmica e que precisa da adição de um redutor. Nas mesmas condições de análise, a PORF2-MUT apresenta uma banda única, portanto, ela é monomérica.

[00114] Na condição não aquecida, com ou sem a presença de redutor (banda sob as colunas - para aquecimento e, respectivamente, + ou - para reduzida na tabela), a ORF2-REF apresenta um perfil de migração complexo com numerosas bandas, salientando a diversidade das interações que ocorrem entre os monômeros. A heterogeneidade das formas oligoméricas na presença de ORF2-REF está bem destacada na linha analisada das condições não desnaturantes, isto é, não aquecidas e não reduzidas. Observa-se a presença de pelo menos 5 bandas de alto peso molecular além das bandas que correspondem ao dímero covalente e não covalente. Em contraste, a ORF2-MUT não aquecida, reduzida ou não (banda sob as colunas - para aquecida e, respectivamente, + ou - para reduzida na tabela), apresenta um perfil de migração muito simples, com uma banda largamente majoritária que corresponde ao dímero não covalente. Notam-se igualmente traços de monômero e uma banda que migra a cerca de 80 kDa que é bem provavelmente a forma tetramérica não covalente.

[00115] Portanto, a proteína ORF2-MUT é bem mais homogênea que a proteína ORF2-REF e encontra-se essencialmente na forma de um dímero não covalente. A ORF2-REF, muito heterogênea, contém ao mesmo tempo dímeros covalentes (forma majoritária), dímeros não covalentes e diversas formas de alto peso molecular.

Exemplo 3: Caracterização das proteínas ORF2-REF e ORF2-MUT por marcação fluorescente das cisteínas livres

[00116] Para refinar os resultados anteriores, nos propusemos a determinar, para cada preparação proteica, a proporção de cisteínas livres e de cisteínas presas por pontes dissulfeto. A amostra proteica foi dividida em duas: a primeira porção sofreu uma alquilação direta dos tióis livres das cisteínas acessíveis; a segunda porção sofreu uma alquilação depois de redução e aquecimento, tratamento este que deixou todas as cisteínas acessíveis.

[00117] A alquilação foi feita por meio do reagente fluorescente BODIPY® FL iodoacetamida (Life Technologies, Réf. D-6003) que apresenta características espectrais muito similares à fluoresceína. A marcação foi feita de acordo com as instruções do fabricante. Bem resumidamente, é necessário preparar de maneira extemporânea uma solução-mãe de BODIPY® FL iodoacatamida a 1 ou 10 mM e diluir as proteínas a 100 μm. Ao abrigo da luz, adiciona-se gota a gota a BODIPY® FL iodoacetamida na solução de proteína a ser marcada (10 a 20 moles de BODIPY® FL iodoacetamida por 1 mole de proteína) e incuba-se por 30 a 60 min no escuro. A proteína assim é transferida para um gel de SDS-PAGE para separar o excesso de fluoróforo. O gel é em seguida visualizado em um sistema de imagem por fluorescência (ChemiDocTM XRS+, Bio-Rad) e a intensidade de fluorescência no nível da banda de proteína é medida. Esta fluorescência é específica e proporcional ao número de cisteínas marcadas.

[00118] A análise é realizada em quantidade relativa tomando-se como referência a intensidade de fluorescência do monômero ORF2- REF obtido após aquecimento e redução. Nesta molécula, há 3 cisteínas e, teoricamente, nestas condições todas as cisteínas são marcadas (100% de fluorescência). A proteína ORF2-MUT não é marcada pela BODIPY® FL iodoacetamida. Detecta-se cerca de 1% de fluorescência para a proteína ORF2-MUT, trata-se do ruído de fundo inespecífico. No que diz respeito à proteína ORF2-REF, não se detecta fluorescência na amostrada não aquecida e não reduzida. Isto indica que nenhuma está acessível para o agente alquilante, o que está de acordo com o perfil observada SDS-PAGE (Figura 3). Para a amostra de ORF2-REF aquecida, banda de monômero corresponde a uma intensidade de fluorescência de 5%, o que indica que 5% das cisteínas de ORF2-REF não estão ligadas às pontes dissulfeto, mas encravadas no coração da proteína e, portanto, inacessíveis quando a amostra não é aquecida.

[00119] Esta análise permite confirmar que a proteína ORF2-REF é principalmente não monomérica. Formando ao mesmo tempo dímeros covalentes e dímeros não covalentes, a proteína ORF2-REF é bem mais heterogênea que a proteína ORF2-MUT.

Exemplo 4: Caracterização das proteínas ORF2-REF e ORF2-MUT por cromatografia de exclusão estérica (SEC - “cromatografia de exclusão por tamanho”)

[00120] A cromatografia de exclusão estérica permite separar as moléculas segundo seus tamanhos. Cada resina de cromatografia de exclusão é caracterizada por um domínio de fracionamento específico, expresso em massa molecular, em cujo interior é possível separação das moléculas. As moléculas cujo tamanho é inferior ao limite inferior do domínio de fracionamento ou superior ao seu limite superior não são fracionadas de forma eficaz. As moléculas cujo tamanho ultrapassa o limite de exclusão, também expresso em massa molecular, não são fracionadas e juntas são eluídas no volume morto da coluna.

[00121] As análises por cromatografia de exclusão estérica foram efetuadas em uma cadeia de HPLC (“cromatografia líquida de alta eficiência”) Waters Alliance com uma coluna Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) em tampão PBS (“solução salina tamponada com fosfato”). O domínio de fracionamento eficaz da resina Superdex 200 é de 10 à 600 kDa e seu limite de exclusão é de 1300 kDa. Para cada proteína ORF2, 100 μL de amostra (cerca de 175 μg) foram injetados a 0,5 mL/min. A detecção é feita por medição da absorvência a 280 nm. Os cromatogramas obtidos para cada proteína estão mostrados na Figura 4. O cromatograma da ORF2-REF (Figura 4A) mostra 3 populações, uma população majoritária representando 86,9% das formas observadas, e duas populações complementares, correspondendo a 8,5% e 4,2% das formas observadas, eluindo um pouco antes e um depois do pico principal, respectivamente. Em contrapartida, no cromatograma da ORF2-MUT (Figura 4B), observa-se a presença de um pico único, representando 99,9% das formas observadas.

[00122] Para cada um dos cromatogramas, a integração do sinal de absorvência a 280 nm no nível dos picos permite determinar a quantidade total de proteína que foi fracionada por ocasião da análise. Para a proteína ORF2-REF, a soma das áreas sob cada um dos 7 picos é de 6800 mU*seg. Para a proteína ORF2-MUT, a área sob o único pico é de 16100 mU*seg. A quantidade de ORF2-REF fracionada por ocasião da análise representa apenas 42% da quantidade de ORF2- MUT fracionada (razão das áreas), embora inicialmente tenha sido injetada a mesma quantidade de cada uma das proteínas. Pode-se deduzir que fração importante de ORF2-REF não penetrou a resina e encontra-se, portanto, na forma de precipitado retido no nível do pré- filtro da coluna. A precipitação por agregação beneficia-se do fato de que, ao contrário da eletroforese SDS-PAGE, nenhum reagente da análise por cromatografia SEC contém SDS ou qualquer outro detergente que poderia contribuir para a solubilização das proteínas.

[00123] Concluindo, a análise por cromatografia de exclusão estérica permitiu confirmar por uma técnica independente que a proteína ORF2- MUT (1 forma observada) é bem mais homogênea que a proteína ORF2-REF (3 formas observadas). Nas condições da análise, uma grande parte da proteína ORF2-REF encontra-se na forma de precipitado e, portanto, não pode ser estudada. Por outro lado, não se pode excluir o fato de que tenha ocorrido um fenômeno de precipitação similar ou então de automontagem para a proteína ORF2-MUT e que pelo menos uma parte desta não pôde ser analisado. Para completar a análise SEC e poder demonstrar de forma mais precisa que a proteína ORF2-MUT não contém agregados, é necessário utilizar uma técnica de caracterização biofísica alternativa, que permite efetuar análises em uma grande bem grande de tamanhos moleculares.

Exemplo 5: Caracterização das proteínas ORF2-REF e ORF2-MUT pela técnica AsFIFFF-MALS (“asymetric flow field flow fractionation-multi angle light scattering”)

[00124] Para poder estudar o estado de agregação das proteínas ORF2-REF e ORF2-MUT nas condições nativas, utilizamos uma técnica que possibilita a separação de uma grande gama de moléculas que variam de 5 kDa a 10 μm. trata-se do fracionamento por acoplamento de fluxo/força com fluxo assimétrico (“asymetric flow field flow fractionation”, AsFIFFF ou AF4) acoplado a uma detecção por difusão da luz em múltiplos ângulos (“multi-angle light scattering ou MALS”). As macromoléculas são separadas segundo seu coeficiente de difusão, sob o efeito de fluxos cruzados, sem qualquer fase estacionária e nas condições nativas. A ausência de fase estacionária constitui uma vantagem considerável porque a mesma pode interagir com uma espécie ou com uma parte das espécies moleculares que se deseja separar e assim distorcer a análise.

[00125] A análise AsFIFFF-MALS foi realizada pela equipe Qualités Biologique et Technologique des Matières Premières Végétales de l’INP de Toulouse (Ecole d'ingénieurs Purpan, Toulouse). As condições experimentais da análise tal como realizada foram as seguintes: HPLC Ultimate 3000 DionexAsFIFFF Eclipse 2 WyattMALS Heleos II Wyatt (633nm)Eluente PBS 1x + 500 mM de NaCIVolume de amostra injetado 30 μL e 60 μLCélula AsFIFFF PequenaMembrana RC 5 kDaEspaçador 350 μm WFluxo linear 1 mL/minFluxo cruzado 3 a 0,1Vazão de injeção 0,2 mL/minDetectores UV 280 nm lAParâmetros tratamentos dados MALS: Modelo Zimmdn/dc: 0,185 mL/gUV extinção: 1246 mL/(g cm)

[00126] O perfil do fratograma obtido para a proteína ORF2-REF não está mostrado porque a análise é de difícil interpretação. Com efeito, um primeiro pico destrói todo o sinal MALS da análise, o que faz com que as estimativas de massa molecular sejam pouco precisas e pouco confiáveis. Todavia, pode-se concluir pela presença de agregados muito grandes cujo tamanho está estimado em 105 - 106 kDa.

[00127] Os perfis dos fratogramas obtidos para os sinais UV (linha cheia fina) e MALS (linha hachurada) da proteína ORF2-MUT estão mostrados na Figura 5. Observa-se em UV (linha reta fina) um pico principal com um ressalto que elui de 9 a 15 minutos. O caráter bimodal deste pico, sugerido em UV, aparece bem nitidamente em MALS (linha hachurada). Neste, verifica-se a presença de uma primeira população de massa molar estimada em cerca de 70 kDa (75% da amostra, eluição entre 9,2 e 11,7 min) e de uma segunda população de massa molar estimada em cerca de 356 kDa (25% da amostra, eluição entre 11,7 e 15,0 min). Para um monômero da proteína ORF2-MUT, a mossa molar teórica calculada a partir de sua sequência é de 31 kDa. Este cálculo teórico foi confirmado experimentalmente por ocasião da análise SDS- PAGE descrita no Exemplo 2. Assim sendo, a massa molar observada de cerca de 70 kDa corresponde a um dímero e aquela de 356 kDa corresponde a um dodecâmero (12-mer) d'ORF2-MUT. Por fim, e ao contrário da ORF2-REF, a ORF2-MUT não contém de grandes agregados detectáveis que eluem de forma estérica no início do fratograma.

[00128] Concluindo, a análise AsFIFFF-MALS, um método sofisticado que permite uma caracterização das espécies moleculares nas condições nativas, sem eventuais interações com uma fase estacionária, e que permite mostrar que a proteína ORF2-MUT i) é uma mistura de 75% de dímeros não covalentes e 25% de dodecâmeros não covalentes, ii) não contém agregados no estado nativo, e iii) é bem mais homogênea que a ORF2-REF. A heterogeneidade das espécies moleculares na proteína ORF2-REF é tão importante que mesmo uma técnica tão sofisticada como a AsFlFFF-MALS não permite uma caracterização confiável da distribuição das diferentes formas.

Exemplo 6: Comparação das reatividades imunológicos dos antígenos ORF2-REF e ORF2-MUT e dos desempenhos diagnósticos dos imunoensaios que utilizam estes antígenos para detecção das IgM anti- ORF2

[00129] A antigenicidade das proteínas ORF2-REF e ORF2-MUT foi comparada em um imunoensaio usando o autômato de imunoanálise VIDAS® (bioMérieux). O cone descartável funciona ao mesmo como fase sólida para a reação e como sistema de pipetagem. O cartucho é composto de 10 poços (X0 a X9) revestidos com uma folha de alumínio selada e etiquetada. O primeiro poço (X0) comporta uma parte previamente recortada para facilitar a introdução da amostra. O último poço (X9) é uma cubeta ótica na qual se mede a fluorescência do substrato. Os diferentes reagentes necessários para a análise estão contidos nos poços intermediários (X1 a X8). Todas as etapas do exame são realizadas automaticamente pelo instrumento. Elas são constituídas por uma sucessão de ciclos de aspiração/descarga do meio reacional.

a) Sensibilização e passivação dos cones (revestimento)

[00130] Os cones foram sensibilizados com 300 μL de uma solução de ORF2-REF ou de ORF2-MUT a 2 μg/mL em um tampão carbonato 77 mM, pH 9,2. Depois de cerca de 20 horas de incubação a +18/25°C com a solução de sensibilização, os cones são esvaziados. Em seguida, são adicionados 300 μL de uma solução de Tris 200 mM contendo de 5 g/L de albumina bovina. A passivação prossegue a +18/25°C durante a noite. Os cones são esvaziados, secados, e em seguida conservados a +4°C até sua utilização, ao abrigo da umidade.

b) Modo operacional do imunoensaio

[00131] O autômato VIDAS® mistura 600 μL de amostra diluente contendo Tris 20 mM pH 7,4, NaCl 300 mM e 5 g/L de albumina sérica com 38,3 μL da amostra de soro ou plasma a ser testada. Assim que o cone VIDAS® entra em contato com a amostra, a primeira etapa da reação imunológica tem início. Esta etapa permite a ligação específica de IgM anti-ORF2, presentes ou não na amostra de soro ou plasma, à proteína ORF2 adsorvida sobre o cone. Depois de 4 minutos de incubação a 37°C, os componentes não ligados são eliminados por lavagem com um tampão Tris 200 mM pH 9, NaCl 300 mM, Triton X-100 0,275%. Na segunda etapa, o cone é incubado com uma solução de conjugado contendo cerca de 60 ng/mL de uma IgG de camundongo anti-IgM humana (bioMérieux), acoplado à fosfatase alcalina, em um tampão fosfato 10 mM, contendo 300 mM de NaCl e 5 g/L de albumina sérica bovina. O poço X5 contém 400 μL desta solução que o cone aspira/descarrega durante 5 minutos, sempre a 37°C. A segunda etapa leva à formação de um complexo entre as IgM anti-ORF2 presentes na amostra e do conjugado anti-IgM acoplado à fosfatase alcalina. A esta etapa seguem-se 2 lavagens sucessivas para eliminar os compostos não fixados.

[00132] Na etapa final de revelação, o substrato fosfato de 4- metilombeliferila é aspirado e em seguida descarregado no cone; a fosfatase alcalina do conjugado catalisa a reação de hidrólise deste substrato em 4-metilombeliferona cuja fluorescência emitida é medida a 450 nm. O valor do sinal de fluorescência (RFV= valor relativo da fluorescência) é proporcional à concentração das IgM anti-ORF2 presentes na amostra.

[00133] O procedimento do imunoensaio para detecção de IgM anti- ORF2 foi realizado em 18 amostras IgM HEV positivas e 21 amostras IgM HEV negativas. Essas amostras, soro ou plasma, foram principalmente adquiridas em Estabelecimentos Franceses de Sangue (“Etablissements Français du Sang”) (EFS) e foram previamente caracterizadas por diversos testes comerciais: Wantai HEV-IgM ELISA (Réf. WE-7196), recomWell HEV IgM (Ref. 5005, Mikrogen Diagnostik) ou EIAgen HEV IgM kit (Ref. 071050 Adaltis). O status IgM HEV positivo das amostras era definido quando a amostra era positiva em pelo menos um dos testes mencionados acima. As amostras ditas HEV negativas são negativos no conjunto das técnicas comerciais utilizadas.

[00134] Imunorreatividade. Em igual quantidade, a proteína ORF2- MUT apresenta uma reatividade antigênica bastante superior àquela da proteína ORF2-REF. Esta superioridade é muito significativa estatisticamente (P < 0,0001, teste de Wilcoxon pareado unilateral) e está ilustrado na Figura 6 que representa as distribuições dos sinais RFV obtidos pelos imunoensaios IgM utilizando o antígeno ORF2-REF (doravante denominado teste IgM ORF2-REF), ou o antígeno ORF2- MUT (doravante denominado teste IgM ORF2-MUT), nas amostras HEV positivas (Tabela 1) e nas amostras HEV negativas (Tabela 2). Para todas as amostras positivas, os sinais RFV obtidos com o antígeno ORF2-MUT são superiores àqueles obtidos com o antígeno ORF2-REF. para as amostras 155797, 154183, 154053 e 154050, o ganho em RFV, consequentemente, atinge cerca de 1000 RFV. Além disso, os sinais RFV obtidos nas amostras HEV negativas pelos testes IgM ORF2-REF e ORF2-MUT são equiparáveis e permanecem muito baixos (Figura 6).

[00135] Sensibilidade diagnóstica. No painel de amostras positivas analisadas apresentado na Tabela 1, o teste IgM ORF2-REF, da técnica anterior, apresenta dois falsos negativos (amostras 155118 e 136997), o que corresponde a uma sensibilidade de apenas 88,9%, enquanto que o teste IgM ORF2-MUT não mostra nenhum falso negativo, o que se traduz por uma sensibilidade aumentada para 100%.

[00136] Além disso, o painel analisado foi previamente testado pelo teste Wantai para poder identificar amostras para as quais este último é negativo, mas que foram confirmadas positivas por dois outros kits IgM. O objetivo desta seleção era salientar as vantagens dos polipeptídios 394-660 da invenção. O kit IgM de Wantai é o único kit comercial IgM que compreende somente um antígeno ORF2, chamado pE2, e, portanto, diretamente comparável a um imunoensaio IgM que usa ORF2-REF ou ainda ORF2-MUT. Contudo, ao contrário dos polipeptídios 394-660, a sequência do antígeno pE2 não compreende o epítopo C-terminal (aa 613-654). No painel de amostras positivas testadas, o teste Wantai apresenta 6 falsos negativos, ou seja, uma sensibilidade de apenas 66,6%. Entre essas amostras, 4/6 são detectadas positivas pelo teste IgM ORF2-REF, ilustrando o interesse diagnóstico do epítopo C-terminal e sobretudo 6/6 são detectadas pelo teste IgM ORF2-MUT, ilustrando mais uma vez a superioridade desse ce polipeptídio, bem como sua contribuição para a sensibilidade melhorada de um imunoensaio.Tabela 1. Procura por IgM anti-ORF2 no soro de pacientes com uma infecção por hepatite E aguda de forma segura. Estudo da sensibilidade em amostras positivas confirmadas.

[00137] Especificidade diagnóstica. No painel de amostras negativas analisadas (Tabela 2), o teste IgM ORF2-REF apresenta dois falsos positivos (amostras 129534 e 137163), o que corresponde a uma especificidade de apenas 88,9%, enquanto que o teste IgM ORF2-MUT não mostra nenhum falso positivo, o que se traduz por uma especificidade aumentada para 100%.

[00138] Deve-se observar que a sensibilidade melhorada do teste IgM ORF2-MUT não depende de sua especificidade.

[00139] Tabela 2. Procura por IgM anti-ORF2 no soro de pacientes sem infecção por hepatite E de forma segura. Estudo da sensibilidade em amostras negativas confirmadas.

[00140] Concluindo, o antígeno ORF2-MUT apresenta uma imunorreatividade melhor que o antígeno ORF2-REF, o que se traduz por desempenhos diagnósticos superiores tanto em sensibilidade como em especificidade. Esta melhor imunorreatividade da proteína ORF2- MUT poderia ser explicada por uma melhor apresentação de epítopos conformacionais imunodominantes devido a sua estrutura mais homogênea e mais oligomérica, como mostrado no Exemplo 2 (mais dímeros não covalentes) e no Exemplo 5 (formação de dodecâmeros), o que lhe permitiria apresentar em geral uma estrutura antigênico muito mais próxima daquela da partícula viral.

[00141] Exemplo 7: Reprodutibilidade dos testes de detecção de IgM anti-vírus da hepatite E utilizando ORF2-REF ou ORF2-MUT

[00142] A mesma amostra positiva foi dosada em duplicata, em duas séries diferentes, 3 dias seguidos, pelo teste IgM ORF2-REF e pelo teste IgM ORF2-MUT segundo o modo operacional descrito no Exemplo 6. Os resultados estão apresentados na Tabela 3. O coeficiente de variação (CV) é a relação do desvio padrão para a média e permite comparar as distribuições de valores cujas escalas de medida não são comparáveis. Quanto mais baixo for o valor do coeficiente de variação, menor será a dispersão em torno da média, e, por conseguinte, mais reproduzível é a medida. O coeficiente de variação é de 5,4% para o teste IgM ORF2-REF e de 2,1% para o teste IgM ORF2-MUT. Os dois imunoensaios são bem reproduzíveis, mas o teste IgM ORF2-MUT parece melhor.Tabela 3. Reprodutibilidade dos testes de detecção de IgM anti-ORF2 utilizando a proteína ORF2-REF ou ORF2-MUT.

[00143] Para poder determinar se a diferença observada entre os 2 CV é estatisticamente significativa, a incerteza de cada um deles é estimada. Aceitando um risco α = 0,05, (intervalo de confiança IC de 95%) e supondo que o risco é distribuído simétrica e bilateralmente (i.e., o mesmo risco de o CV ser superestimado e subestimado), deduz-se daí o CV limite superior aplicando-se a seguinte fórmula:Khi2 (0,025, ddl) é o valor da lei Khi2 para um risco de 0,025 (a metade de α = 0,05) e um grau de liberdade (ddl) dado. Para as séries apresentadas, o número de repetições é n = 12 e ddl = n-1, isto é, 11. O valor da lei Khi2 (0,025, 11) é de 21,92. O limite superior do IC 95% do CV é dado pela fórmula. O limite inferior do IC 95% é deduzido subtraindo do CV observado a diferença entre o limite superior e o CV observado. Isso leva às seguintes estimativas:CV observado CV limite superior CV limite inferiorORF2-REF 5,4% 7,7% 3,2%OFR2-MUT 2,1% 3,0% 1,3%

[00144] De acordo com estes cálculos, o CV do exame IgM ORF2- REF pode estar compreendido entre 3,2%> e 7,7% e aquele do exame IgM ORF2-MUT entre 1,3% e 3,0%. Os dois intervalos não se sobrepõem, e os dois CV observados, de 5,4%> e de 2,1%>, são, portanto, significativamente diferentes.

[00145] Como consequência, o exame IgM ORF2-MUT é mais reprodutível que o teste IgM ORF2-REF.Referências Bibliográficas- Boersma YL, Plúckthun A, 2011, Curr. Opin. Biotechnol, 22: 849-857- Ellington AD e Szostak JW., 1990, Nature, 346: 818-822- Emerson, S. U., & Purcell, R. H., 2007, Hepatitis E Virus. In D. M. Knipe, P. M. Howley, D. E. Griffin, R. A. Lamb, M. A. Martin & B. a. S. Roizman S.E. (Eds.), Fields Virology (5th éd., pp. 3047-3058). Philadelphia, USA: Lippincott Williams & Wilkins- Fields e Noble, 1990, Int J Pept Protein Res., 35: 161-214- Meng J, et al., 2001, Virology, 288: 203-211- Merrifield 1963, J Am Chem Soc. 85:2149-2154- Riddell M.A., et al., 2000, Journal of Virology, 74(17): 8011-8017

Claims (14)

1. Polipeptídio da proteína p-ORF2 do vírus da hepatiteE, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos a sequência de aminoácidos 394-660, numerados em relação a uma proteína p- ORF2 de 660 aminoácidos, na qual as três cisteínas nas posições 627, 630 e 638 foram mutadas ou, para uma proteína p-ORF2 de comprimento diferente, pelo menos a sequência de aminoácidos correspondente aos aminoácidos 394-660 da proteína p-ORF2 de 660 aminoácidos, na qual as três cisteínas situadas nas três posições correspondentes às posições 627, 630 e 638 da proteína p-ORF2 de 660 aminoácidos foram mutadas,em que que as mutações são efetuadas substituindo-se as três cisteínas por um aminoácido escolhido dentre alanina, glicina, treonina, valina e serina.

2. Polipeptídio de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as mutações consistem em substituir as cisteínas pelo mesmo aminoácido.

3. Polipeptídio de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as mutações são efetuadas substituindo- se as três cisteínas por serina.

4. Polipeptídio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que consiste no polipeptídio de sequência de aminoácidos 394-660, numerados em relação a uma proteína p-ORF2 de 660 aminoácidos, na qual as três cisteínas nas posições 627, 630 e 638 foram mutadas ou, para uma proteína p-ORF2 de comprimento diferente, de sequência de aminoácidos correspondente aos aminoácidos 394-660 da proteína p- ORF2 de 660 aminoácidos, na qual as três cisteínas situadas nas três posições correspondentes às posições 627, 630 e 638 da proteína p- ORF2 de 660 aminoácidos foram mutadas.

5. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é um polipeptídio marcado.

6. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende:o polipeptídeo da proteína p-ORF2 do vírus da hepatite E, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, epelo menos um ou mais aminoácidos que não pertencem à proteína p-ORF2.

7. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo da proteína p- ORF2 é acoplado a uma cauda de poli-histidina, uma cauda de polilisina, glutationa S-transferase, proteína de ligação de maltose, peptídeo de ligação de calmodulina, domínio de ligação de quitina, proteína A ou tiorredoxina.

8. Processo in vitro de determinação por imunoensaio da presença de uma resposta mediada por anticorpos direcionada contra a proteína p-ORF-2 do vírus da hepatite E em uma amostra biológica obtida de um indivíduo, suscetível de conter os anticorpos da referida resposta, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:- colocar a referida amostra biológica em contato com um polipeptídio, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7,- detectar um sinal emitido pela ligação entre o referido polipeptídio e os referidos anticorpos, se estiverem presentes, utilizando um marcador capaz de emitir um sinal detectável,- comparar o sinal assim obtido com um sinal de referência S previamente determinado com duas populações de controle, uma delas tendo desenvolvido os referidos anticorpos e a outra não tendo desenvolvido os referidos anticorpos, - um sinal inferior ao referido sinal de referência S significando que a amostra não contém os referidos anticorpos, e- um sinal superior ao referido sinal de referência S significando que a amostra contém os referidos anticorpos.

9. Processo in vitro de determinação por imunoensaio da taxa de anticorpos direcionados contra a proteína p-ORF-2 do vírus da hepatite E em uma amostra biológica obtida de um indivíduo, suscetível de conter os referidos anticorpos, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:- colocar a referida amostra biológica em contato com um polipeptídio, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7,- detectar um sinal emitido pela ligação entre o referido polipeptídio e os referidos anticorpos, se estiverem presentes, utilizando um marcador capaz de emitir um sinal detectável,- transformar o sinal detectado em uma taxa de anticorpos.

10. Processo de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que os anticorpos procurados são IgM ou IgG.

11. Uso de um processo como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de ser para auxiliar no diagnóstico in vitro, para o diagnóstico in vitro de uma infecção pelo vírus da hepatite E em um indivíduo suscetível de ser infectado, para o acompanhamento terapêutico de um indivíduo infectado pelo vírus da hepatite E ou para a realização de estudos epidemiológicos da soroprevalência de anticorpos anti-HEV em uma população ou em um dado território geográfico.

12. Uso de um processo como definido na reivindicação 8 ou 9 para determinar se um indivíduo precisa ser vacinado ou revacinado contra o vírus da hepatite E, caracterizado pelo fato de que os anticorpos procurados são IgG.

13. Kit para a determinação por imunoensaio da presença de resposta mediada por anticorpos ou da taxa de anticorpos direcionados contra a proteína p-ORF-2 do vírus da hepatite E em um indivíduo suscetível de ter produzido esses anticorpos, caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptídio como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

14. Kit de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos uma amostra de controle positivo que é uma amostra contendo uma dada taxa de anticorpos direcionados contra a proteína p-ORF-2 do vírus da hepatite E.