BR112018002140B1 - Uso de marcadores moleculares il-3, il-33 e il-12p40 para caracterizar as gravidades das infecções respiratórias por vírus respiratório sincitial e metapneumovírus humano - Google Patents

Uso de marcadores moleculares il-3, il-33 e il-12p40 para caracterizar as gravidades das infecções respiratórias por vírus respiratório sincitial e metapneumovírus humano Download PDF

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Abstract

uso de marcadores moleculares il-3, il-33 e il-12p40 para caracterizar as gravidades das infecções respiratórias por vírus respiratório sincitial e metapneumovírus humano. a presente invenção está relacionada à detecção de doenças respiratórias utilizando marcadores moleculares como ferramenta prognóstica da evolução dos casos de infecção respiratória. concretamente, durante o diagnóstico diferencial de infecções respiratórias causadas pelo vírus respiratório sincitial e metapneumovírus humano, será estabelecido o padrão de expressão dos marcadores de gravidade de il-3, il-33 e il12p40. o padrão de expressão dos marcadores moleculares pode ser definido em amostras biológicas usando ensaios elisa, citometria de fluxo ou pcr em tempo real. a confirmação do agente etiológico da infecção em combinação com a definição do padrão dos marcadores moleculares il-3, il-33 e il12p40 indicará um prognóstico da gravidade da doença.

Description

CAMPO DE INVENÇÃO
[001] A presente invenção está relacionada ao uso de marcadores moleculares, como uma ferramenta de detecção da evolução dos eventos de infecção respiratória. Especificamente, durante o diagnóstico diferencial de infecções respiratórias causadas pelo Vírus Respiratório Sincitial (SRV) e metapneumovírus humano (MPV).
[002] Especificamente, Na Presente Invenção, O Uso De Marcadores Il-3, Il-12p40 E Il-33 É Descrito, Para Prognóstico Da Ocorrência De Eventos Respiratórios Recorrentes, Como Consequência Da Bronquiolite Causada Por Srv.
ESTADO DA TÉCNICA
[003] O Vírus Respiratório Sincitial (SRV) é a causa mais prevalente de infecção da via respiratória e a primeira causa de hospitalização por infecção aguda da via respiratória inferior em bebês. A bronquiolite por SRV tem sido relacionada à asma e ao chiado recorrente, porém os mecanismos responsáveis por esta associação não foram esclarecidos.
[004] O SRV é um vírus encapsulado pertencente à família Paramyxoviridae e é um dos agentes etiológicos mais prevalentes de infecções agudas da via respiratória, causando alta carga nos sistemas públicos de saúde.
[005] O SRV causa doenças na via respiratória inferior em pacientes de todas as idades, sendo a infecção mais grave em bebês com menos de 6 meses de idade e, especialmente, em pacientes com doenças crônicas ou doenças básicas. Muitos bebês que sofrem de bronquiolite por SRV durante os primeiros meses de vida desenvolvem chiado recorrente e asma, mas os mecanismos específicos envolvidos na imunopatogênese da bronquiolite por SRV ainda estão mal definidos. Além disso, os parâmetros clínicos atuais não permitem prever a possibilidade de sofrer algumas dessas doenças crônicas mais tarde na vida de bebês, uma vez que sofreram de bronquiolite por SRV.
[006] A inflamação causada por este vírus caracteriza-se pela presença de uma infiltração celular massiva, principalmente, neutrófilos, na via respiratória inferior. Tais mudanças nos pulmões foram descritas como uma consequência na infecção por SRV em células epiteliais da via aérea, macrófagos alveolares e neutrófilos de periferia do sangue, o que induz a secreção de citocinas e quimiocinas específicas. Essas moléculas mostram propriedades quimiotáticas sobre células inflamatórias e outro tipo de células. Um desequilíbrio de citocinas tipo Th1/Th2 também foi proposto como um evento chave na inflamação com recrutamento celular, causada pela infecção por SRV, que pode ser mediada por eosinófilos e outras células relacionadas à indução alérgica, como basófilos e mastócitos que podem contribuir para o desenvolvimento da asma. Além disso, é conhecido que algumas citocinas produzidas pelas células epiteliais da via aérea estão diretamente envolvidas na indução alérgica e asma, incluindo IL-25, IL-33 e linfopoietina estromal tímica (TSL).
[007] No estado da técnica, alguns documentos são encontrados, os quais se referem ao uso de marcadores, como ferramenta de diagnóstico diferencial de doenças respiratórias, entre as quais são encontrados:
[008] O pedido de patente WO2012169887A2 está relacionado a um método do prognóstico da gravidade de SRV, no entanto, este documento funciona com os marcadores OLFM4, CD177, MMP8, MMP9, PTX3, IL-8, RANTES e CD4 e combinação destes, sem mencionar o uso de marcadores IL-3, IL-12p40 e IL-33. Não é dedutível a partir deste documento que as citocinas IL-33, IL12p40 ou IL-3 teriam uma relação nos pacientes que manifestaram chiado recorrente ou a possibilidade de desenvolver asma no futuro após a infecção pelo SRV.
[009] O documento EP1867734A1 descreve o uso de marcadores moleculares para diagnóstico e prognóstico de doenças. No entanto, as doenças para as quais é dirigida são de tipo cerebrovascular, e não faz referência aos marcadores para diagnosticar doenças respiratórias.
[0010] Apenas alguns estudos analisaram as regiões superiores e inferiores da via respiratória durante uma bronquiolite por SRV em bebês. O objetivo da presente invenção é divulgar a utilização das citocinas IL-3, IL- 12p40 e IL-33, os marcadores moleculares para o prognóstico da ocorrência de chiato recorrente no futuro (IL-3 e IL12p40) ou possível desenvolvimento de asma (IL-33), nos estágios posteriores da vida desses bebês, devido a uma bronquiolite produzida pela infecção por SRV.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0011] Figura 1. A Figura 1 mostra o padrão de produção de citocinas e quimiocinas em fluidos de lavagem broncoalveolar (BALF) de pacientes infectados por SRV em comparação com os controles. A concentração de citocinas e quimiocinas foi definida no BALF de bebês com bronquiolite por SRV e de bebês saudáveis como controle, analisadas por Luminex. A concentração de citocinas e quimiocinas é expressa em pg/ml e agrupada de acordo com sua média interquartil e faixa para sua comparação. A significância da bronquiolite por SRV (N = 14) em comparação com o controle de bebês saudáveis (N = 5) foi definida pelo teste não paramétrico U de Mann-Whitney (*Valor P <0,05 foi considerado como significante estatisticamente). A produção de IL-3, IL-4, IL-10 e IL-13 (a), IL-1 β, IL-6, IL-7 e TNF-β (b), quimiocinas CCL2/MCP-1, CCL3/MIP 1 α, Eotaxina e IL-8 (c) e IL-12p40, IL-12p70, IFN-y e IL-17 (d) foi analisada em amostras BALF.
[0012] Figura 2. A Figura 2 mostra os padrões de produção de citocinas e quimiocinas em amostras de aspirado nasofaríngeo (NPA) de pacientes infectados por SRV, em comparação com indivíduos de controle. A expressão dos mediadores em NPA de bebês com bronquiolite por SRV (N = 14) foi comparada com bebês de controle (N = 5) por quantificação relativa (RQ), usando sondas TaqMan em uma RT-PCR quantitativa. As sondas específicas TaqMan foram utilizadas para ampliar as citocinas IL-1α, IL-1β, TNFα, IL-6 e IL-8 (a); quimiocinas CXCL10, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α e CCL4/MIP- 1β (b). As concentrações relativas dos mediadores são expressas como tempos crescentes em relação à indução relativa dos controles. Seus valores médios e interquartil são mostrados como barra horizontal e retângulos, respectivamente (foi considerado um *valor P <0,05 como significante estatisticamente).
[0013] Figura 3. A Figura 3 mostra a produção de citocinas e quimiocinas e amostras BALF de bebês com bronquiolite por SRV de acordo com a evolução da asma no período de acompanhamento. As concentrações de citocinas e quimiocinas: Eotaxina, IL-3, IL-5, TNF-β (a) e IL-12p40, IL- 12p70 e IL-7 (b), detectadas por Luminex nas amostras BALF de bebês com bronquiolite causada por SRV (N = 14), foram analisadas de acordo com o desenvolvimento da asma no período de acompanhamento. As concentrações dos mediadores são expressas em pg/ml e os valores de suas médias e interquartil são mostrados como barras e retângulos horizontais, respectivamente (foi considerado um *valor P <0,05 como significante estatisticamente).
[0014] Figura 4. A Figura 4 mostra a quantificação relativa da indução do mensageiro RNA da IL-33 no aspirado nasofaríngeo de bebês com bronquiolite por SRV, analisada de acordo com o histórico familiar da atopia. A expressão genética da IL-33 foi definida no aspirado nasofaríngeo de bebês com bronquiolite por SRV (N = 14) com ou sem histórico familiar de atopia. Os resultados são mostrados como tempos crescentes na indução relativa dos controles. Os valores médio e interquartil, de cada grupo, são mostrados como barras e retângulos horizontais, respectivamente (foi considerado um *valor de P <0,05 como significante estatisticamente).
[0015] Figura 5. A Figura 5 mostra a correlação entre IL-12p40 e IL-3 em amostras BALF de pacientes infectados por SRV com o número de episódios de chiado recorrente. Foi estabelecida uma correlação de Pearson entre IL-12p40 (a) ou IL-3 (b) e episódios de chiado recorrente em amostras BALF de bebês com SRV (14). Os resultados são expressos como pg/ml para citocinas e número de episódios durante o período de seguimento (foi considerado um *valor de P <0,05 como significante estatisticamente).
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[0016] A presente invenção descreve a utilização dos marcadores moleculares IL-3, IL-12p40 e IL-33 como marcadores moleculares de predição do chiado recorrente (IL- 3, IL-12p40) e provável desenvolvimento de asma (IL-33), em estágios posteriores da vida desses bebês após a bronquiolite causada por SRV, especificamente em pacientes com menos de 12 meses de vida.
[0017] O método para prognóstico da gravidade de uma doença desenvolvida por uma infecção por SRV e MPV consiste em: - ampliar uma amostra de secreção respiratória usando um procedimento de biologia molecular, como PCR, utilizando marcadores IL-3, IL-12p40 e IL-33; - quantificar com algum método de quantificação molecular, tal como ELISA, a superexpressão da sequência alvo complementar aos marcadores IL-3, IL-33 ou lL-12p40; - correlacionar com base na quantificação da superexpressão obtida, o desenvolvimento da doença causada por SRV: alta probabilidade de desenvolver chiado se uma concentração maior que 500pg/ml de IL-12p40 ou IL-3 for encontrada na lavagem broncoalveolar; alta probabilidade de desenvolver asma se uma concentração maior que 500 pg/ml de IL-33 for encontrada na lavagem broncoalveolar.
EXEMPLO
[0018] Bebês previamente saudáveis menores de 12 meses de idade, hospitalizados por bronquiolite viral foram registrados no estudo. Para entrar no registro, os pacientes devem ser positivos por imunofluorescência para SRV e ter menos de 12 meses, sem fatores de risco de doenças graves e com evolução durante a primeira semana de doença leve a moderada, definida por uma contagem clínica. Os bebês com condições médicas crônicas ou que receberam corticosteróides no momento do registro foram excluídos do estudo. Durante o mesmo período de tempo foram registrados bebês normais que foram submetidos a um procedimento invasivo por uma doença não infecciosa (hérnia inguinal = 4 e fístula tiroglosa = 1). Suas amostras foram usadas como controle.
[0019] Os perfis de citocinas e quimiocinas foram avaliados nas vias aéreas superiores e inferiores nas crianças afetadas por bronquiolite por infecção de SRV. Além disso, o resultado clínico foi considerado durante um período de acompanhamento de três anos. O aspirado nasofaríngeo e o BALF de bebês hospitalizados, devido à bronquiolite por SRV e controles saudáveis, foram conectados e analisados para detectar citocinas e quimiocinas pela Luminex e em RT-PCR quantitativa em tempo real. Como resultado, os níveis elevados de citocinas do tipo Th2 (IL-3, IL-4, IL-10 e IL- 13), citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL- 6, TNF-β, MCP-1/CCL2, MIP-1α/CCL3 e IL-8) foram observados em BALF de bebês com bronquiolite por SRV, em comparação com os controles. Identificou-se que os pacientes mostrando histórico familiar de atopia produziram níveis maiores de IL-33 do que os pacientes que não possuíam esse quadro familiar (Figura 4). Extraordinariamente, uma correlação direta foi encontrada dos níveis de IL-3 e IL-12p40 em bebês infectados por SRV com o desenvolvimento de chiado recorrentes mais tarde em sua vida. De fato, uma correlação direta significativa foi encontrada entre os níveis de IL- 12p40 e IL-3 nas amostras BALF de pacientes infectados por SRV com o número de chiados recorrentes, durante o período de acompanhamento (correlação de Pearson: r = 0,68; p = 0,0071; r = 0,71; p = 0,0058, respectivamente) (Figura 5). Estes resultados sugerem que IL-3 e IL-12p40 são preditores moleculares para chiado recorrente, em bebês com bronquiolite causada por SRV.
[0020] Quatorze pacientes com bronquiolite por SRV e cinco controles foram inscritos. Os bebês com bronquiolite por SRV foram internados no hospital por um período de 4,5 dias como média (intervalo: 1 a 9 dias), com uma pontuação de gravidade equivalente à média de 4. Todos os pacientes foram capazes de deixar a terapia com oxigênio nos primeiros dois dias antes do procedimento. Eles não apresentaram complicações devido ao procedimento e foram liberados em boas condições. Todos os pacientes foram monitorados por três anos, sem relatos de internação por outras causas. Um paciente no grupo de controle não pôde ser seguido após 24 meses. As variáveis clínicas avaliadas foram: chiado recorrente relatado por um médico, diagnóstico de asma relatado por um médico e uso crônico de terapia com corticosteróides, características que não mostraram diferenças significantes entre ambos os grupos durante o acompanhamento clínico. As características clínicas estão resumidas na Tabela 1. Tabela 1. Características clínicas dos pacientes registrados. Produção de citocinas e quimiocinas em amostras BALF de bebês com bronquiolite por SRV.
[0021] Os níveis de concentração de proteína de citocinas e quimiocinas em amostras de BALF de bebês com bronquiolite por SRV, em comparação com aqueles em bebês de controle, foram medidos pela Luminex. Observaram-se níveis elevados de IL-3, IL-4, IL-10, IL-13 (citocinas relacionadas a Th2); IL-1β, IL-6, TNF-β (citocinas pró-inflamatórias); MCP-1/CCL2, MIP-1α/CCL3, IL-8 (quimiocinas); IL-12p40 (citocinas relacionadas a Th1); e IL-7 (fatores de crescimento) em amostras BALF de bebês com bronquiolite por SRV em comparação com controles. Além disso, foram encontrados níveis significativamente reduzidos de Eotaxina (quimiocinas) e IL-12p70 em amostras BALF de bebês com bronquiolite por SRV em comparação com bebês de controle. A produção de IFN-Y (citocina relacionada a Th1) e IL-17 (citocina relacionada a Th17) não foi detectada em BALF, nem no paciente infectado, nem no controle saudável (Figura 1).
[0022] Elevados níveis significantes de IL-12p40, IL-12p70 (citocinas relacionadas a Th1), IL-3, IL-5 (citocinas relacionadas a Th2), TNF-β (citocinas pró- inflamatórias), Eotaxina (quimiocinas) e IL-7 (fator de crescimento) foram observados em amostras de BALF de pacientes infectados por SRV, que desenvolveram asma no período de acompanhamento, em comparação com pacientes que não o desenvolveram (Figura 3). Além disso, um aumento significativo do RNA mensageiro de IL-33, normalizado para GAPDH foi observado no aspirado nasofaríngeo de pacientes infectados por SRV que tinham histórico familiar de atopia, em comparação com pacientes que não o tinham (Figura 4).

Claims (4)

1. Uso de marcadores moleculares IL-3, IL-12p40 e IL- 33, CARACTERIZADO pelo fato de que servem para o prognóstico do chiado recorrente e da asma após uma bronquiolite causada pelo Vírus Respiratório Sincitial (SRV).
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que uma das infecções respiratórias é bronquiolite.
3. Método para prognóstico de chiado recorrente e asma após uma bronquiolite causada por Vírus Respiratório Sincitial (SRV), CARACTERIZADO pelo fato de que o método consiste em: - ampliar e detectar usando um procedimento de biologia molecular, como PCR e ELISA, usando marcadores IL-3, IL- 12p40 e IL-33; - quantificar a superexpressão da sequência alvo complementar aos marcadores IL-3, IL-33 ou IL-12p40; - correlacionar com base na quantificação da superexpressão obtida, o desenvolvimento da doença causada por SRV: alta probabilidade de desenvolver chiados se uma concentração superior a 500 pg/ml de IL-12p40 ou IL-3 for encontrada na lavagem broncoalveolar; alta probabilidade de desenvolver asma se uma concentração superior a 500 pg/ml de IL-33 for encontrada na lavagem broncoalveolar.
4. Uso de marcadores moleculares IL-3, IL-12p40 e IL- 33, CARACTERIZADO pelo fato de serem utilizados para preparar uma composição para o prognóstico do chiado recorrente e da asma após uma bronquiolite causada pelo Vírus Respiratório Sincitial (SRV).
BR112018002140-7A 2015-07-31 2016-07-25 Uso de marcadores moleculares il-3, il-33 e il-12p40 para caracterizar as gravidades das infecções respiratórias por vírus respiratório sincitial e metapneumovírus humano BR112018002140B1 (pt)

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