BR112017028601B1 - Uso de clemizol - Google Patents

Abstract

USO DE COMPOSTOS DE CLOROQUINA E CLEMIZOL PARA TRATAMENTO DE CONDIÇÕES INFLAMATÓRIAS E CANCEROSAS. São aqui divulgados métodos para a utilização de R-cloroquina ou clemizol ou combinações de R-cloroquina e clemizol para o tratamento de um individuo que gele necessite. Os usos incluem métodos de tratamento de condições inflamatórias, tratamento de câncer de fígado ou redução do risco de desenvolver câncer de fígado em um indivíduo. Os usos também incluem métodos para tratar a esteato-hepatite não alcoólica em um indivíduo.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. 62/187,061, depositado em 30 de junho de 2015, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

DECLARAÇÃO SOBRE PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADO PELO GOVERNO FEDERAL

[002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob R42 AI088793/NIAID NIH HHS/Estados Unidos concedido pelo Instituto Nacional de Saúde e Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas. O governo tem certos direitos na invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção é dirigida ao campo da medicina e, mais especificamente, ao uso de certos compostos para o tratamento e prevenção de condições inflamatórias e cancerosas, especialmente no fígado.

ANTECENDENTES DA INVENÇÃO

[004] O tratamento e prevenção de condições cancerosas e inflamatórias representam grande necessidade médica não atendida. As condições inflamatórias no fígado, tais como esteato-hepatite não alcoólica (NASH), em particular, necessitam de terapias melhoradas. Deixar a NASH não tratada, e outras doenças inflamatórias do fígado, tais como aquelas resultantes de infecções virais, pode levar ao carcinoma hepatocelular. A presente invenção aborda estas necessidades ao proporcionar métodos para o tratamento e/ou prevenção de condições inflamatórias e/ou cancerosas, tal como descrito abaixo.

SUMÁRIO

[005] É aqui revelado um método que compreende a administração de uma quantidade eficaz de clemizol e/ou cloroquina, ou um análogo dos mesmos, a um indivíduo em necessidade da mesma. Em alguns aspectos da invenção, os indivíduos são administrados ou com R-cloroquina, clemizol ou R-cloroquina em combinação com clemizol.

[006] Em alguns aspectos da invenção, o indivíduo tem uma condição inflamatória.

[007] Em outros aspectos da invenção, o indivíduo tem uma condição inflamatória do fígado. Em alguns aspectos da invenção, o indivíduo tem esteato-hepatite não alcoólica, e em que o método compreende ainda o tratamento da esteato- hepatite não alcoólica. Em alguns aspectos, o método reduz a inflamação lobular do fígado. Em outros aspectos, o método reduz o risco de câncer de fígado. Em ainda outros aspectos da invenção, o indivíduo tem câncer de fígado, e em que o método compreende ainda o tratamento do câncer de fígado.

[008] Em alguns aspectos da invenção, clemizol e/ou R- cloroquina é administrado a um indivíduo com esteato- hepatite não alcoólica. Em outros aspectos, a administração de clemizol ou R-cloroquina a um indivíduo resulta nos níveis de alanina aminotransferase reduzidos no plasma em comparação com os controles de veículo. Em outros aspectos, a administração de clemizol e/ou R-cloroquina a um indivíduo resulta em uma contagem de atividade da doença do fígado gorduroso não alcoólico reduzida, conforme determinado por análise histológica de tecido do fígado. Em alguns aspectos, a administração de clemizol e/ou R-cloroquina resulta na esteatose reduzida. Em outros aspectos, a administração de clemizol e/ou R-cloroquina resulta no balonismo de hepatócitos reduzido. Em ainda outros aspectos, a administração de clemizol e/ou R-cloroquina resulta em inflamação lobular reduzida.

[009] Em alguns aspectos da invenção, clemizol e/ou R- cloroquina é administrado a um indivíduo para reduzir o risco de desenvolvimento de câncer de fígado. Em outros aspectos da invenção, o indivíduo foi diagnosticado com esteato- hepatite não alcoólica. Em outros aspectos da invenção, clemizol e/ou R-cloroquina é administrado a um indivíduo que sofre de câncer de fígado. Em ainda outros aspectos, a administração de clemizol e/ou de R-cloroquina resulta em carga tumoral reduzida no indivíduo ou sobrevivência aumentada do indivíduo.

[010] Em alguns aspectos da invenção, 0,5 a 50 mg/kg de clemizol é administrado a um indivíduo. Em alguns aspectos, clemizol é administrado uma vez ao dia, duas vezes ao dia ou três vezes ao dia. Em outros aspectos, clemizol é administrado diariamente durante 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais semanas.

[011] Em alguns aspectos da invenção, 0,5 a 50 mg/kg de R-cloroquina são administrados a um indivíduo. Em outros aspectos, a R-cloroquina é administrada uma vez ao dia, todos os dias ou semanalmente. Em alguns aspectos, a R-cloroquina é administrada por 1,2,3,4,5,6 ou mais semanas. Ainda em outros aspectos, a R-cloroquina é administrada como uma dose de carga dupla diariamente durante os dois primeiros dias de tratamento, seguida de uma dose única, que é metade da dose de carga dupla durante o restante do tratamento.

BREVE DESCRIÇÃO DAS DIVERSAS VISTAS DOS DESENHOS

[012] Estas e outras características, aspectos, e vantagens da presente invenção serão melhor compreendidos com relação à descrição seguinte e dos desenhos anexos, onde:

[013] Figura 1: um esquema para o processo de síntese de R-cloroquina é ilustrado.

[014] Figura 2: As estruturas químicas dos metabólitos de clemizol e de clemizol são mostradas.

[015] Figura 3: A Figura 3 ilustra o esquema de síntese para a síntese de boa prática de fabricação (GMP) de clemizol.

[016] Figura 4: As estruturas químicas dos metabólitos de cloroquina são mostradas.

[017] Figura 5: As estruturas químicas de hidroxicloroquina (rac-1) e R-hidroxicloroquina são mostradas (R)-1.

[018] Figura 6: um esquema para o processo de síntese de enantiômeros de hidroxicloroquina é ilustrado.

[019] Figura 7: As estruturas químicas dos metabólitos de hidroxicloroquina são mostradas.

[020] Figura 8: Imagens representativas de fígados de camundongo que descrevem a inibição de formação de tumores em camundongos tratados com clemizol (composto D) são mostradas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Vantagens e utilidade

[021] Resumidamente, e como descrito em mais detalhes abaixo, são aqui descritas composições e métodos para tratar a esteato-hepatite não alcoólica ou reduzir o risco ou a gravidade do câncer de fígado usando clemizol e/ou R- cloroquina. As vantagens dessa abordagem incluem, mas não estão limitadas à redução da inflamação em um indivíduo que sofre de uma condição inflamatória, redução da inflamação lobular do fígado, função hepática melhorada e risco reduzido de desenvolvimento ou progressão do câncer de fígado quando os pacientes são tratados com clemizol e/ou R-cloroquina do que pacientes não tratados com clemizol e/ou R-cloroquina.

Definições

[022] Os termos usados nas reivindicações e no relatório descritivo são definidos como estabelecidos abaixo a menos que especificado de outra forma.

[023] O termo “tratamento” se refere a qualquer resultado terapeuticamente benéfico no tratamento de um estado de doença, por exemplo, um estado de doença causado por condições inflamatórias do fígado, incluindo profilaxia, diminuição na gravidade ou progressão, remissão ou cura da mesma.

[024] O termo “in situ” se refere a processos que ocorrem em uma célula viva crescente separada a partir de um organismo vivo, por exemplo, crescendo em cultura de tecidos.

[025] O termo “in vivo” se refere a processos que ocorrem em um organismo vivo.

[026] O termo “mamífero”, tal como aqui utilizado, inclui seres humanos e não humanos e inclui, mas não está limitado a seres humanos, primatas não humanos, caninos, felinos, murinos, bovinos, equídeos e porcinos.

[027] O termo “quantidade eficaz” significa uma quantidade suficiente para produzir um efeito desejado, por exemplo, uma quantidade suficiente para prevenir o câncer de fígado ou reduzir a quantidade de câncer de fígado em um indivíduo.

[028] O termo “indivíduo” se refere a células, animais humanos e não-humanos.

[029] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” é uma quantidade que é eficaz para melhorar um sintoma de uma doença. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser uma “quantidade eficaz profilaticamente” conforme a profilaxia pode ser considerada terapia.

[030] O termo “administração” se refere à introdução de um agente da presente divulgação dentro de um hospedeiro. Uma via preferida de administração dos agentes é a administração oral. Uma outra via preferida é a administração intravenosa. No entanto, qualquer via de administração, tal como tópica, subcutânea, peritoneal, intra-arterial, por inalação, vaginal, retal, nasal, introdução no fluido cerebrospinal, ou instilação em compartimentos do corpo podem ser utilizadas.

[031] O termo “controle de veículo” se refere amplamente a qualquer meio inerte em que o ingrediente ativo é administrado, incluindo, mas não se limitando a, solventes, veículos ou ligantes para o ingrediente ativo.

[032] O termo “análogo deuterado” se refere a versões ou análogos modificados dos compostos da invenção, em que o composto contém pelo menos um isótopo de deutério.

[033] O termo “metabólito de clemizol” se refere aos compostos metabólitos de clemizol, M1, M12 e M14, como descrito na Figura 1 do presente pedido de patente.

[034] O termo “metabólito de R-cloroquina” se refere aos compostos metabólitos de cloroquina, como descrito na Figura 6 do presente pedido de patente.

[035] O termo “metabólito de R-hidroxicloroquina” se refere aos compostos metabólitos de hidroxicloroquina, como descrito na Figura 7 do presente pedido de patente.

[036] O termo, “agente anti-NASH” se refere a fármacos ou compostos que são usados para tratar esteato-hepatite não alcoólica ou condições associadas com esteato-hepatite não alcoólica, que incluem, mas não estão limitadas a, agonistas de FXR (por exemplo, ácido obeticólico e PX-104), inibidores de LOXL2 (por exemplo, Simtuzumabe), inibidores de protease de caspase (por exemplo, Emricasan e éster etílico icosapent), bitartrato de cisteamina (por exemplo, Proscysbi ou RP103), inibidores de galectina-3 (por exemplo, GR-MD-02 e LJPC-1010), inibidores da via de CCR2 e de CCR5 (por exemplo, Cenicriviroc), agonistas de PPAR (por exemplo, GFT505, DUR-928, Saroglitazar e Pioglitazona), agentes de depleção de cisteína (por exemplo, RP103), inibidores de SGLT-2 (por exemplo, etabonato de remogliflozin), GLP-1 (por exemplo, liraglutida), ácidos biliares (ácido ursodesoxicólico), conjugados de ácido graxo sintético e de ácidos biliares (por exemplo, Aramchol), estimulantes de Sirtuína (por exemplo, MB 12066), inibidores 1 da quinase (ASK1) reguladora de sinal de apoptose (por exemplo, GS- 4997) e imunomoduladores (por exemplo, IMM124E).

[037] Tal como aqui utilizado, o termo “condição inflamatória” se refere a problemas médicos que são diretamente causados por citocinas inflamatórias ou células envolvidas na inflamação. As condições inflamatórias incluem, mas não estão limitadas a, esteato-hepatite não alcoólica, artrite onde as citocinas inflamatórias destroem e conduzem a lesões na membrana sinovial e destruição da cartilagem articular e óssea; insuficiência renal, onde as citocinas inflamatórias restringem a circulação e danificam néfrons; lúpus, em que as citocinas inflamatórias induzem um ataque autoimune; asma, onde as citocinas inflamatórias fecham as vias aéreas; hipertensão arterial pulmonar, onde as citocinas inflamatórias induzem uma elevação da pressão arterial pulmonar; psoríase, onde as citocinas inflamatórias induzem à dermatite; pancreatite, onde as citocinas inflamatórias induzem à lesão celular do pâncreas; alergia, onde as citocinas inflamatórias induzem a reações autoimunes; fibrose, onde as citocinas inflamatórias levam ao tecido traumatizado; complicações cirúrgicas, onde as citocinas inflamatórias impedem a cura; anemia, onde as citocinas inflamatórias interferem com a produção de eritropoietina; e fibromialgia, onde as citocinas inflamatórias são elevadas em pacientes com fibromialgia. Outras doenças associadas com a inflamação crônica incluem o câncer, que é provocado por inflamação crônica; ataque cardíaco, em que a inflamação crônica contribui para aterosclerose da coronária; doença de Alzheimer, em que a inflamação crônica destrói as células cerebrais; insuficiência cardíaca congestiva, em que a inflamação crônica provoca perda de massa muscular cardíaca; acidente vascular cerebral, em que a inflamação crônica promove eventos tromboembólicos; e estenose aórtica, em que a inflamação crônica danifica as válvulas cardíacas. Arteriosclerose, osteoporose, doença de Parkinson, infecção, doença inflamatória do intestino, incluindo, doença de Crohn e colite ulcerativa, assim como a esclerose múltipla (uma doença relacionada com a doença inflamatória autoimune típica) estão também relacionadas com a inflamação. Algumas doenças em estágios avançados podem ser fatais. Várias metodologias estão disponíveis para o tratamento de tais doenças inflamatórias; os resultados, no entanto, são geralmente insatisfatórios, como evidenciado por uma falta de eficácia e efeitos secundários relacionados com o fármaco associado ao mesmo.

[038] Tal como aqui utilizado, o termo “contagem da atividade da doença do fígado gorduroso não alcoólico” se refere aos resultados do exame histológico do tecido do fígado, pelo que o tecido foi examinado para a esteatose, balonismo de hepatócitos e/ou inflamação lobular.

[039] Tal como aqui utilizado, o termo “câncer de fígado” se refere a doenças hiperproliferativas do fígado, incluindo, mas não limitadas a carcinoma hepatocelular, carcinoma hepatocelular fibrolamelar, colangiocarcinoma, angiossarcoma, câncer de fígado secundário ou metastático e hepatoblastoma.

[040] Tal como aqui utilizado, o termo “agentes quimioterápicos” se refere a compostos que podem ser úteis no tratamento de doenças (por exemplo, câncer). Agentes quimioterápicos da presente invenção podem incluir qualquer fármaco quimioterápico adequado ou combinações de fármacos quimioterápicos (por exemplo, um coquetel). Agentes quimioterápicos exemplares incluem, sem limitação, agentes alquilantes, platinas, antimetabólitos, antraciclinas, taxanos, camptotecinas, nitrosoureias, inibidores de EGFR, antibióticos, inibidores de HER2/neu, inibidores de angiogênese, inibidores de quinase (por exemplo, sorafenibe), inibidores de proteassoma, imunoterapias, terapias hormonais, terapias fotodinâmicas, vacinas contra o câncer, inibidores de histona desacetilase, moduladores de esfingolipídeos, oligômeros, outros fármacos quimioterápicos não classificados e combinações dos mesmos. Agentes quimioterápicos exemplares eficazes efetivos contra o câncer, incluem, sem limitação, daunorrubicina, dactinomicina, doxorrubicina, bleomicina, mitomicina, mostarda de nitrogênio, clorambucil, melfalano, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina (CA), 5-fluorouracila (5-FU), floxuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxotere, vincristina, vimblastina, etoposídeo, teniposídeo, cisplatina e dietilstilbestrol (DES).

[041] O termo, um “excipiente farmaceuticamente aceitável”, “diluente farmaceuticamente aceitável”, “veículo farmaceuticamente aceitável”, ou “adjuvante farmaceuticamente aceitável”, significa um excipiente, diluente, veículo e/ou adjuvante que são úteis na preparação de um composição farmacêutica que é geralmente segura, não tóxica e nem biologicamente ou de outro modo indesejável, e inclui um excipiente, diluente, veículo e adjuvante que são aceitáveis para uso veterinário e ou uso farmacêutico humano. “Um excipiente, diluente, veículo, e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável”, tal como utilizado no relatório descritivo e nas reivindicações incluem um ou mais de tais excipientes, diluentes, veículos e adjuvantes.

[042] “Sal farmaceuticamente aceitável” se refere àqueles sais que retêm a eficácia biológica e, opcionalmente, outras propriedades das bases livres e que são obtidos por reação com ácidos inorgânicos ou orgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico, ácido málico, ácido maleico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido cítrico e semelhantes. O termo “sal farmaceuticamente aceitável” também se refere aos compostos que podem ser combinados com base de cloroquina livre (por exemplo, fosfato e difosfato).

[043] No caso de modalidades que os agentes descritos formam sais, esses sais estão dentro do escopo da presente descrição. A referência a um agente de qualquer uma das fórmulas do presente documento é entendida para incluir a referência aos sais dos mesmos, a menos que indicado de outra forma. O termo “sal(is)”, como aqui utilizado, designa sais ácidos e/ou básicos formados com ácidos e bases inorgânicos e/ou orgânicos. Além disso, quando um agente contém ambas porção básica e porção ácida, podem ser formados zwitteriônicos (“sais internos”) e estão incluídos dentro do termo “sal(is)” tal como aqui utilizado. Os sais farmaceuticamente aceitáveis (por exemplo, não tóxicos, fisiologicamente aceitáveis) são preferidos, embora outros sais também sejam úteis, por exemplo, em etapas de isolamento ou purificação que podem ser utilizadas durante a preparação.

[044] O termo “composição farmacêutica” tal como aqui utilizado, pretende englobar uma composição adequada para administração a um indivíduo, tal como um mamífero, especialmente um ser humano. Em geral, “uma composição farmacêutica” é estéril, e, de preferência livre de contaminantes que são capazes de desencadear uma resposta indesejável dentro do indivíduo.

[045] O termo “pró-fármaco” se refere a um precursor inativo de um agente que é convertido em uma forma biologicamente ativa in vivo. Os compostos da presente invenção incluem versões de R-cloroquina e clemizol, clemizol deuterado ou metabólitos de clemizol que atuam como pró-fármacos modificados. Exemplos de modificações dos compostos da invenção que poderiam ser usados para produzir pró-fármacos incluem, mas não estão limitados a, a adição de ésteres, glicosídeos (derivados de açúcar) ou adição ou remoção de outros grupos químicos não tóxicos que são enzimaticamente alterados durante o metabolismo in vivo (por exemplo, fosforilação, desfosforilação, desalquilação, deshidroilação ou modificação de derivados de açúcar). Os pró-fármacos são muitas vezes úteis porque, em algumas situações, eles podem ser mais fáceis de administrar do que o composto original. Eles podem, por exemplo, estar biodisponíveis por administração oral, ao passo que o composto de origem não está. O pró-fármaco também pode ter solubilidade melhorada em composições farmacêuticas sobre o fármaco de origem. Um pró-fármaco pode ser convertido no fármaco de origem por vários mecanismos, incluindo processos enzimáticos e hidrólise metabólica.

Abreviações

[046] As abreviações utilizadas neste pedido incluem as seguintes: Deve ser notado que, como usado no relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma” e “o” incluem referentes plurais a menos que o contexto dite claramente o contrário. Composto A = mistura racêmica de R-cloroquina e S- cloroquina Composto B = R-cloroquina Composto C = S-cloroquina Composto D = clemizol ALT = Alanina aminotransferase HE = Hematoxilina e eosina HFD = Dieta rica em gordura NAFLD= Doença hepática gordurosa não alcoólica NASH = Esteato-hepatite não alcoólica SD = Desvio padrão SPF = Livre de patógeno específico STZ = Estreptozotocina

Compostos da invenção

[047] A fórmula para a R-cloroquina e o processo de síntese de R-cloroquina é descrito na Figura 1. Em alternativa, a R-cloroquina está comercialmente disponível e pode ser adquirida a partir de Entidades Químicas de Interesse Biológico (ChEBI™); (Número de catálogo, CHEBI: 48811).

[048] As estruturas de clemizol e dos metabólitos de clemizol principais humanos (M1, M6) e de roedores (M12, M14) são mostradas na Figura 2. O cloridrato de Clemizol está comercialmente disponível em APExBIO™ (Número de Catálogo A3316).

[049] No fígado humano, o clemizol é primeiramente convertido para um intermediário A, em que várias enzimas CYP450 (CYP3A4, CYP2C19 ou CYP2D6) podem oxidar à M1. Na presença de CYP2C9 ou CYP1A2, M2 é gerado, mas eles não podem produzir M1. Cyp2C9 parece ser a única fonte de M4, que é um metabólito menor em humanos. CYP3A4, que é a enzima CYP450 mais abundantemente expressa no fígado humano, medeia a maioria desta reação de biotransformação do fármaco. A capacidade do ritonavir, o qual é um inibidor da atividade de CYP3A4, para inibir o metabolismo de clemizol in vitro sugeriu que o CYP3A4 desempenha um papel importante no metabolismo de clemizol em seres humanos. Em contraste, um tipo diferente (tipo CYP2C) de reação de oxidação aromática produz os metabólitos predominantes de roedores (M12, M14 e M15), por meio da via principal para o metabolismo de clemizol no fígado de roedores.

Síntese de Cloridrato de Clemizol

[050] O cloridrato de clemizol está comercialmente disponível a partir de APExBIO™ (Número de catálogo A3316). A Figura 3 descreve o esquema sintético para a produção da boa prática de fabricação de clemizol (GMP). Em certas modalidades, os análogos deuterados de clemizol podem ser produzidos por substituição de uma pirrolidina deuterada para a matéria de partida de pirrolidina. Pirrolidina- 2,2,5,5-d4 pode ser adquirida a partir de ©CDN Isotopes, Inc. (Produto No. D-5946).

[051] A pirrolidina totalmente substituída, pirrolidina- 2,2,3,3,4,4,5,5-d8, pode ser adquirida a partir de ©CDN Isotopes, Inc. (Produto No. D-3532).

Síntese de R-cloroquina

[052] Tal como descrito na Figura 1, (R)-(-)-cloroquina foi preparada por condensação de (R)-(-)-4-amino-1- (dietilamino)pentano com 4,7-dicloroquinolina conhecida. O (R)-(-)-4-amino-1-(dietilamino)pentano foi preparado por resolução de (4-amino-1-(dietilamino)pentano conhecido racêmico através da formação de um sal com ácido (D)-(-)- mandélico conhecido e separando os sais de ácido (D)-(-)- mandélico dos dois enantiômeros por cristalização.

Preparação de (R)-(-)-4-amino-1-(dimetilamino)pentano

[053] A uma solução de ácido (D)-(-)- mandélico (100 g, 658 mmol) em 350 mL de álcool etílico, foi lentamente adicionado 4-amino-1-(dietilamino)pentano racêmico (98 g, 658 mmol). A mistura foi semeada com cristais de sal de ácido (D)-(-)-mandélico do composto do título e, após o repouso durante a noite, o sólido resultante foi recolhido por filtração e rapidamente lavado duas vezes com etanol arrefecido com gelo para dar o sal de ácido (D)-(-)-mandélico do composto de título como cristais brancos (Cultura 1). O licor mãe foi concentrado até se observar turvação, então reaquecido até uma solução homogênea resultante. Após semear e repousar durante a noite, o sólido resultante foi recolhido por filtração e lavado rapidamente duas vezes com etanol arrefecido com gelo para dar uma segunda Cultura do sal desejado sob a forma de cristais brancos (Cultura 2). As duas culturas de sal (Culturas 1 e 2) foram combinadas para dar um total de 44 g do sal de ácido (D)(-)-mandélico do composto de título. O processo acima foi repetido 4 vezes. Vários lotes do sal de ácido (D)(-)-mandélico do composto de título (150 g no total) foram combinados e, em seguida, dissolvidos em álcool etílico, com aquecimento e sonicação. A solução foi semeada e, após repouso durante a noite, o sólido resultante foi recolhido por filtração e rapidamente lavado duas vezes com etanol arrefecido com gelo para dar sal de ácido (D)-(-)-mandélico do composto de título (Cultura Recristalizada 1). O licor mãe foi concentrado, e o resíduo dissolvido em álcool etílico, com aquecimento e sonicação. A solução foi então semeada e, após repouso durante a noite, o sólido resultante foi recolhido por filtração para dar uma segunda cultura do sal de ácido (D)-(-)-mandélico do composto de título (Cultura Recristalizada 2). O licor mãe foi concentrado, e o resíduo foi dissolvido em álcool etílico com aquecimento e sonicação. A solução foi então semeada e, após repouso durante a noite, o sólido resultante foi recolhido por filtração, para dar uma terceira cultura do sal de ácido (D)-(-)-mandélico do composto de título (Recristalizado a partir da Cultura 3). As três culturas recristalizadas (Culturas recristalizadas 1, 2 e 3) foram combinadas e secas em vácuo para dar um total de 100 g de sal de ácido (D)-(-)-mandélico do composto do título, [α]D = - 56,2 (1% em H2O). Este sal foi suspenso em diclorometano e lavado três vezes com solução de hidróxido de sódio de 1M. A camada orgânica foi seca (Na2SO4) e concentrada em vácuo para dar o composto do título, o qual foi utilizado diretamente na etapa seguinte.

Preparação de (R)-(-)-Cloroquina

[054] Uma mistura do produto em bruto (R)-(-)-4-amino- 1-(dietilamino)pentano a partir do anterior (aproximadamente 45 g, 285 mmol, 1,00 equivalentes), 4,7-dicloroquinolina (56 g, 285 mmol, 1,00 equivalentes) e fenol (53,6 g, 570 mmol, 2,0 equivalentes) foi aquecida a 120°C durante 18 h, em seguida arrefecida até à temperatura ambiente e diluída com diclorometano. A mistura resultante foi lavada com uma solução de hidróxido de sódio 1,5 M e a lavagem foi retro- extraída com diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram extraídas com ácido clorídrico 1 M. O extrato aquoso foi basificado até pH 12 com solução de carbonato de sódio saturado e extraído com diclorometano. O extrato orgânico foi seco e concentrado em vácuo. O resíduo foi então purificado por cromatografia em coluna (gel de sílica, eluindo com 2,5% de NH3/MeOH de 7N) para dar 42,8 g do composto do título, [α]D = -101,3 (1% em EtOH).

[055] Este material foi convertido no seu sal de difosfato por aquecimento de uma solução de 42,8 g (133 mmol) do composto do título em álcool etílico a 90°C durante 15 minutos, e adicionando gota a gota dois equivalentes (314 g, 267 mmol) de ácido fosfórico a 85%. Após o aquecimento da suspensão resultante a refluxo (90°C) durante 1 h, e em seguida arrefecimento até à temperatura ambiente, o sólido foi recolhido por filtração, lavado com etanol e éter dietílico, e seco em vácuo para dar 68 g de difosfato de (R)-(-)-cloroquina, [α]D = -82,96 (2,1% em H2O).

[056] 1H RMN (Metanol-d4): δ 8,59 (d, J = 9,2 Hz, IH), 8,36 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 7,92 (s, 1H), 7,61 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 4,05-4,14 (m, 1H), 3,07-3,17 (m, 6H), 1,73-1,96 (m, 4H), 1,39-1,41 (m, 3H) e 1,27-1,31 (m, 6H).

Síntese e purificação de R-hidroxicloroquina

[057] O processo para a síntese e purificação de enantiômeros (R) e (S) de hidroxicloroquina é completamente descrito em Blaney, P. et al., “A Practical Synthesis of the Enantiomers of Hydroxycloroquina”, Tetrahedron: Asymmetry, 1994, pp. 1815 -1822, Vol. 5. Um resumo desse processo foi incluído abaixo.

[058] Tal como mostrado na Figura 6, a diamina racêmica rac-2 é resolvida por cristalização de seu sal com ácido S(+)mandélico. O acoplamento subsequente com 4,7 dicloroquinolina dá S(+)-hidroxicloroquina ((S)-1a). Da mesma forma, usando o enantiômero oposto do ácido mandélico obtém-se (R)-2 e R(-)-hidroxicloroquina ((R)-1a). Resolução de (R)-2 e (S)-2 envolve a cristalização dos seus sais mandelato de diasteroisômeros a partir de iso-propanol. Usando 0,5 equivalentes molares de ácido S(+)-mandélico e semeando a mistura com diasteroisômero puro a 45°C, 67% de (S)-3 é recuperado após uma única cristalização com um excesso de diasteroisômeros (d.e.) de 92%. Em seguida, (S)- 3 ou (R)-3 é hidrolisado à (S)-2 ou (R)-2 diamina correspondente. As razões e os rendimentos são calculados sem ter em conta a presença de uma quantidade variável (até 10%) de água em (S)-2 ou (R)-2.

Preparação de S(+)-5-[N-etil-N-(2-hidroxietil)amino]-2- pentanamina ((S)-2)

[059] Uma solução de cloridrato de rac-2 (200 g, 1,15 mol) em 2-propanol (350 ml) foi adicionada a uma solução de ácido (+)-mandélico (87,4g, 0,575 mol) em 2-propanol (500 ml). 2-propanol adicional foi adicionado para levar o volume total a 900 ml, e a solução foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. A filtração deu origem a cristais brancos (235 g) que foram recristalizados duas vezes mais a partir de 2-propanol (1800 rnJ e 1600 ml, respectivamente) para se obter (S)-3 (145, 4g) como cristais brancos. O sólido foi suspenso em 35% de hidróxido de sódio aquoso (350 ml) e extraído com éter terc-butil metílico (5 x 600 ml). Os extratos foram combinados, secos (MgSO4) e concentrados para dar (S)-2 (55,5 g, 55%) como um óleo incolor. 1H RMN (CDC13) δ 0,98 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,025 (3H, d, J = 6,3 Hz), 1,25-1,35 (2H, m), 1,35-1,55 (2H,m),ca, 1,9(3H,brs), 2,42(H,t,J = 7,3Hz), 2,51 (2H,q,J=7,1Hz), 2,54(2H,t,J=5,5Hz), 2,85(1H,tq,J = 6,3 e 5,2 Hz), 3,50 (2H,t,j = 5,5 Hz); MS (Cl, Amônia) 175 ([MH]+), HRMS Calc., para C9H22N2O:175,181039; Verificado: 175,180493.

Preparação de R(-)-5-[N-etil-N-(2-hidroxietil)amino]-2- pentanamina ((R)-2)

[060] O licor mãe da primeira cristalização anterior foi concentrado. O resíduo foi suspenso em hidróxido de sódio aquoso a 35% (250 ml) e extraído com éter terc-butil metílico (5 x 550 ml). Os extratos foram combinados, secos (MgSO4) e concentrados para dar um óleo amarelo (70,6 g). Este foi novamente dissolvido em 2-propanol (200 ml) e adicionado a uma solução de ácido (-)-mandélico (64,00 g, 0,421 mol) em 2-propanol (300 ml). 2-propanol adicional foi adicionado para levar o volume total até 600 ml e a solução foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. A filtração deu origem a cristais brancos (111g) que foram recristalizados duas vezes mais a partir de 2-propanol (1100 ml e 800 ml, respectivamente) para proporcionar (R)-3 (77,2 g) como cristais brancos. 1H RMN DMSO-d6) δ 0,92 (3H, t), 1,09 (3H, d), 1,35-1,55 (4H, m), 2,3-2,55 (6H, m), 3,03 (lH, tq), 3,43 (2H, t), 4,48 (IH, s), 7,1-7,25 (3H, m), 7,39 (2H, dd). (R)- 3 foi suspenso em hidróxido de sódio aquoso a 35% (200 ml) e extraído com éter terc-butil metílico (5 x 400 ml). Os extratos foram combinados, secos (MgSO4) e concentrados para dar (R)-2 (29,3 g, 29%) como um óleo incolor. 1RMN (CDC13) δ 0,97 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,025 (3H, d, J = 6,3 Hz), 1,251,35 (2H, m), 135- 1,5 (2H, m), ca ,2,1(3H,br s), 2,41 (2H,t,J=7,3Hz), 2,51 (2H, q ,J=7,1Hz), 2,53 (2H, t, J = 5,5Hz), 2,85 (lH, tq, J = 6,3 and 5,2 Hz), 3,49 (2H, t, J = 5,5 Hz); HRMS (CLAmmonia) Calc. para C9H22N2O: 175,181039; Verificado: 175,181039.

Preparação de S(+)-Hidroxicloroquina ((S)-1a)

[061] Uma mistura de (S)-2 (55,47 g, 0,32 mol), 4,7- dicloroquinolina (63,03 g, 0,32 mol) e di-isopropiletilamina (63,9 ml, 0,37 mol) foi aquecida a 125°C sob refluxo em uma atmosfera de nitrogênio por quatro dias. Após o arrefecimento, a mistura foi transferida para um funil de separação usando hidróxido de sódio aquoso 1M (500 ml) e diclorometano (500 ml). A fase orgânica foi separada e a fase aquosa foi re-extraída com diclorometano (2 x 500 ml). As fases orgânicas foram combinadas, secas (MgSO4) e concentradas para dar um óleo amarelo (116g) que foi cromatografado sobre gel de sílica em 95:32 de diclorometano:trietilamina:metanol para dar (S)-1a (73 g, 78%) como um óleo amarelo pálido. Alternativamente, o produto em bruto foi cromatografado em alumina em 2:2:1 acetona:hexano:metanol, para dar (S)-1a, como um óleo incolor. 1H RMN (CDC13) δ 0,99 (3H, t, J = 7 Hz, CH2CH3), 1,285 (3H, d, J = 6 Hz, CHCH3), 1,45-1,85 (4H, m), 2,35-2,75 (6H, m), 3,4-3,95 (3H, m), 5,18 (lH,br d, J=8Hz,NH), 6,37 (lH, d,J=6Hz, 3-H), 7,28 (lH, dd, Jo = 9 Hz, Jm = 2 Hz, 6H), 7,74 (lH, d, J = 9 Hz, 5-H), 7,91 (lH, d,J = 2 Hz, 8-H), 8,465 (lH,d, J = 6 Hz, 2-H); 13C RMN (CDCl3) 11,5 (CH2CH3), 20,2 (CH-CH3), 23,9 (CH2CH2CH2N), 34,2 (CH2CH2CH2N), 47,5 (CH2CH3), 48,3 (CH), 53,1 (CH2H2CH2N), 54,9 (CH2CH2OH), 58,5 (CH2CH2OH), 99,0 (C3), 117,2 (C4a), 121,3 (C6), 125,0 (C8), 128,4 (C5), 134,7 (C7), 149,1 (C4), 151,65 (C2); MS (EI,70EV) 337,335 (15,44%, M+), 306,304 (20, 62%, [M-CH2OH]+), 247 (81%), 102 (100%); Verificado: 335,175518

Preparação de R(-Hidroxicloroquina ((R)-1a)

[062] Uma mistura de (R)-2 (29,34 g, 0,168 mol), 4,7- dicloroquinolina (33,34 g, 0,168 mol) e diisopropiletilamina (33,8 ml, 0,194 mol) foi aquecida a 135°C sob refluxo em uma atmosfera de nitrogênio por três dias. O tratamento e purificação como descrito para (S)-la deu (R)-1a (39,8 g, 84%) como óleo amarelo pálido. Purificação alternativa: dissolveu-se (R)-1a bruto (18,7 g) em ácido clorídrico (1M, 50 ml) e lavou-se com acetato de etila (2 x 50 ml) para remover a 2,7-dicloroquinolina. Após a neutralização a pH 7,5 com hidróxido de sódio aquoso 1 M, a fase aquosa foi lavada novamente com acetato de etila (2 x 50 ml), depois agitada durante a noite com carvão ativado. Após a filtração através de celite, a mistura foi basificada para pH 12, e extraída com acetato de etila (4 x 50 ml). Os extratos foram combinados, secos (MgSO4) e concentrados para dar (R)-1a como um óleo amarelo pálido (17,2 g). 1H RMN (CDCl3) δ0,99 (3H, t), 1,285 (3H, d), 1,45-1,85 (4H, m), 2,35-2,75 (6H, m), 3,4-3,95 (3H, m), 5,18 (lH, brd), 6,37 (lH, d), 7,28 (IH, dd), 7,74 (lH, d), 7,91 (lH, d), 8,465 (lH, d); 13C RMN (CDCl3) δ 11,5, 20,2, 23,9, 34,2, 47,5, 48,3, 53,1, 54,9, 58,5, 99,0, 117,2, 121,3,125,0, 128,4, 134,7, 149,1, 151,65; MS (pulverização térmica) 338, 336 ([MH]+); íons de fragmentos maiores em 247 (100%, [M-EtNHCH2CH2OH]+), 158.

O procedimento para ensaiar as purezas enantioméricas de (R)-2 e (S)-2

[063] (R)-2 ou (S)-2 totalmente resolvido tem um [α]D na região de 6. Métodos fiáveis para a determinação da pureza enantiomérica envolvem 1H-RMN dos derivados diastereoméricos de (R)-2 e (S)-2. O resultado da adição de um equivalente molar de ácido (R)-a-metoxi-a-trifluorometilfenilacético (MTPA) para soluções de clorofórmio de (R)-2 e (S)-2 provoca ressonâncias devido a Ha nos dois diasteroisômeros para alargar e mover a uma maior frequência, enquanto o excesso de MTPA forma sais diastereoméricos, em que as ressonâncias devidas para Ha e Hb mudam de posição. Neste último caso, há uma grande separação entre as ressonâncias devido ao Hb dos dois diasteroisômeros. Esta técnica permite a detecção de tão pouco como 1% do enantiômero o menor. Sugere-se que a monoprotonação dá uma espécie que existe em uma forma pseudocíclica, enquanto que as espécies desprotonadas existem em uma forma acíclica. De modo semelhante, no espectro de 1H RMN das canforsulfonamidas diastereoméricas, as ressonâncias, devido ao grupo metila terminal da fração de diamina, são totalmente resolvidas, mesmo em baixa intensidade de campo. A conversão de diaminas resolvidas (R)-2 e (S)-2 para os enantiômeros de hidroxicloroquina, (R)-1a e (S)-1a envolve aquecimento de (R)-2 e (S)-2 com 4,7-dicloroquinolina na presença de diisopropiletilamina. As condições ideais são diferentes para os dois enantiômeros: a 135°C, (S)-2 é consistentemente mais propenso à degradação do que (R)-2, e a conversão é correspondentemente menos limpa. A maior escala de purificação de (R)-1a e (S)-1a é realizada por extração ácido-base. Abaixo de pH 5, o excesso de dicloroquinolina é removido a partir da fase aquosa, e as impurezas restantes são removidas por extração adicional entre o pH 7 e pH 8, seguido por tratamento com carvão da fase aquosa para remover um vestígio de material altamente colorido. Acima de pH 8 (o pH mais conveniente sendo cerca de 12), a hidroxicloroquina pura é extraída. Ambos (R)-1a e (S)-1a são óleos, e necessitam de uma proteção da luz durante a armazenagem, desenvolvendo uma cor amarela caso contrário. Após purificação, os enantiômeros (R)-1a e (S)-1a são convertidos em sais de bis(di-hidrogenofosfato), ((R)-b e ((S)-1b), por tratamento com ácido fosfórico (dois equivalentes molares). Onde a trietilamina manteve-se a partir da etapa de cromatografia anterior, esta é removida por trituração com acetona, para deixar um hidrato deliquescente. O ácido fosfórico (19,7 ml, 0,29 mol) foi adicionado a (S)-1a (43,4 g, 0,144 mol) com arrefecimento com gelo para moderar a reação. A goma resultante foi triturada sob a acetona e o sólido deliquescente resultante foi filtrado rapidamente, imediatamente suspenso em acetona fresca (200 ml), depois agitado durante a noite. A desidratação por aquecimento em suspensão etanólica dá sólidos brancos friáveis. A filtração rápida deu um pó branco que foi transferido imediatamente para um balão contendo etanol (200 ml). A suspensão resultante foi submetida a refluxo durante quatro dias, depois foi filtrada, e o sólido foi lavado com etanol. Depois de secagem sob vácuo até peso constante, o rendimento de (S)-1b foi de 52,6 g (69%). (R)- 1a é convertido para sal de bis(di-hidrogenofosfato) de uma maneira análoga. Ambos amostra anidra e mono-hidratos fundem a 192°C, substancialmente mais elevado do que o ponto de fusão de 168-170°C referido para o racemato. Os enantiômeros deram rotações substanciais e reprodutíveis, e tão pouco como 0,5% do enantiômero menor pode ser detectado por HPLC usando uma fase estacionária AGP quiral. Assim, ambas polarimetria e HPLC são adequadas para determinação da pureza ótica dos enantiômeros. O sulfato de hidroxicloroquina também está comercialmente disponível, e pode ser comprado da 3B Scientific Corporation™, (Número de catálogo: DR001622).

Métodos de uso

[064] Os métodos para o tratamento de condições inflamatórias, esteato-hepatite e câncer de fígado associado à inflamação também são englobados pela presente invenção. Os referidos métodos da invenção incluem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de clemizol e/ou R- cloroquina a um indivíduo em necessidade do mesmo.

[065] A presente invenção também fornece métodos para o tratamento de uma condição inflamatória, que compreende a administração a um indivíduo de um ou mais compostos ou de uma composição compreendendo um ou mais compostos da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. A presente invenção também fornece métodos para o tratamento ou prevenção de condições inflamatórias, em combinação com tratamentos anti-inflamatórios atualmente utilizados na clínica. Exemplos de tratamentos anti-inflamatórios incluem, mas não estão limitados a fármacos anti-inflamatórios não- esteroides tais como, aspirina, ibuprofeno e naproxeno, corticosteroides, compostos bioativos anti-inflamatórios, tais como, plumbagina ou derivados anti-inflamatórios seletivos imunes.

[066] A presente invenção proporciona métodos para o tratamento da esteato-hepatite não alcoólica que compreende a administração a um indivíduo de um ou mais compostos ou de uma composição compreendendo um ou mais compostos da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal como aqui utilizado, o termo “esteato-hepatite não alcoólica” se refere a doenças hepáticas caracterizadas por inflamação do fígado com acumulação de gordura concomitante no fígado. A invenção também fornece métodos para o tratamento da esteato- hepatite não alcoólica em combinação com os tratamentos atualmente utilizados na clínica para o tratamento de condições normalmente associadas com esteato-hepatite não alcoólica, como a síndrome metabólica e/ou diabetes mellitus. Exemplos de tratamentos não limitativos para a síndrome metabólica e/ou diabetes mellitus incluem, tratamentos para reduzir a resistência à insulina, colesterol e triglicerídeos. Exemplos de tratamentos que reduzem a resistência à insulina, incluem, mas não estão limitados a metformina, tiazolidinodionas, pioglitazona e rosiglitazona. Exemplos de tratamentos para a hipercolesterolemia incluem, mas não estão limitados a estatinas, sequestrantes de ácidos biliares, inibidores de absorção de colesterol, um derivado de ácido fíbrico, ou ácido nicotínico.

[067] A presente invenção proporciona métodos para o tratamento ou prevenção de câncer de fígado, que compreende a administração a um indivíduo de um ou mais compostos ou de uma composição compreendendo um ou mais compostos da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal como aqui utilizado, o termo “câncer de fígado” se refere a doenças hiperproliferativas do fígado, incluindo, mas não limitadas a carcinoma hepatocelular, carcinoma hepatocelular fibrolamelar, colangiocarcinoma, angiossarcoma, câncer de fígado metastático ou secundário e hepatoblastoma. A presente invenção também fornece métodos para o tratamento ou prevenção de câncer de fígado em combinação com os tratamentos atualmente utilizados na clínica para o tratamento ou prevenção de câncer de fígado, incluindo, mas não limitados a agentes quimioterápicos.

Composições farmacêuticas da invenção

[0076] O clemizol e a R-cloroquina da invenção podem ser formulados em composições farmacêuticas. Estas composições podem compreender, além de clemizol e/ou R-cloroquina, um excipiente, veículo, tampão, estabilizador ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis, bem conhecidos dos técnicos no assunto. Tais materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir com a eficácia do ingrediente ativo. A natureza precisa do veículo ou material mais oleoso pode depender da via de administração, por exemplo, oral, intravenosa, cutânea ou subcutânea, nasal, intramuscular, intraperitoneal.

[068] As composições farmacêuticas para administração oral podem estar na forma de comprimido, cápsula, pó ou líquido. Um comprimido pode incluir um veículo sólido, tal como gelatina ou um adjuvante. As composições farmacêuticas líquidas incluem genericamente um veículo líquido tal como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. A solução salina fisiológica, dextrose ou solução de outro sacarídeo ou glicóis, tais como etilenoglicol, propilenoglicol ou polietilenoglicol podem ser incluídas.

[069] Para a injeção intravenosa, cutânea ou subcutânea, ou injeção no local afetado, o ingrediente ativo estará na forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável que é isenta de pirogênios e tem pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Os técnicos no assunto são bem capazes de preparar as soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotônicos, tais como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Ringer Lactato. Conservantes, estabilizadores, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser incluídos, conforme requerido.

[070] O composto útil de pequena molécula de acordo com a presente invenção, que é para ser dado a um indivíduo, a administração está preferivelmente em uma “quantidade terapeuticamente eficaz” ou “quantidade profilaticamente eficaz” (como pode ser o caso, embora a profilaxia possa ser considerada terapia), sendo esta suficiente para apresentar benefício ao indivíduo. A quantidade real administrada e a taxa e decurso da administração, dependerão da natureza e severidade da condição a ser tratada. A prescrição do tratamento, por exemplo, decisões sobre a dosagem etc., está dentro da responsabilidade dos médicos de clínica geral e outros médicos, e tipicamente tem em conta o distúrbio a ser tratado, a condição do paciente individual, o local de administração, o método de administração, e outros fatores conhecidos dos praticantes. Exemplos das técnicas e protocolos mencionados acima podem ser encontrados em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. (ed), 1980.

[071] Uma composição pode ser administrada sozinha ou em combinação com outros tratamentos, quer simultaneamente ou sequencialmente, dependendo da condição a ser tratada.

EXEMPLOS

[072] A seguir estão exemplos de modalidades específicas para realizar a presente invenção. Os exemplos são oferecidos apenas para fins ilustrativos, e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção em qualquer forma. Esforços foram feitos para garantir a precisão com respeito aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperaturas, etc.), mas alguns erros experimentais e desvios devem, é claro, serem permitido para.

[073] A prática da presente invenção empregará, salvo indicação ao contrário, métodos convencionais de química de proteínas, bioquímica, as técnicas de DNA recombinantes e farmacologia, dentro da especialidade da técnica. Tais técnicas são explicadas por completo na literatura. Ver, por exemplo, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A e B(1992).

[074] Quaisquer termos não diretamente definidos aqui neste documento devem ser entendidos como tendo os significados normalmente associadas com eles, tal como entendido dentro da técnica da invenção. Determinados termos são aqui discutidos para proporcionar orientação adicional para o praticante na descrição das composições, dispositivos, métodos e semelhantes dos aspectos da invenção, e como fazer ou usá-los. Será apreciado que a mesma coisa pode ser dita em mais de uma maneira. Por conseguinte, a linguagem alternativa e sinônimos podem ser utilizados para qualquer um ou mais dos termos aqui discutidos. Sem importância, é para ser colocado sobre se deve ou não um termo ser elaborado ou aqui discutido. Alguns métodos sinônimos ou substituíveis, materiais e semelhantes são fornecidos. Considerando que um ou alguns sinônimos ou equivalentes não exclui o uso de outros sinônimos ou equivalentes, a menos que seja explicitamente declarado. O uso de exemplos, incluindo os exemplos de termos, é apenas para fins ilustrativos e não limita o escopo e significado dos aspectos da invenção aqui descritos.

MÉTODOS Indução da esteato-hepatite não alcoólica

[075] NASH foi induzida em 55 camundongos machos por uma única injeção subcutânea de 200 μg de solução de estreptozotocina (STZ, Sigrna-Aldrich, EUA) 2 dias após o nascimento e alimentação com dieta rica em gordura (HFD, 57 kcal% fat, cat#: HFD32, CLEA Japan, Inc., Japão) após 4 semanas de idade. Os camundongos que foram induzidos têm NASH por este método, são referidos abaixo como camundongos NASH.

Composições farmacêuticas e via de administração de fármacos

[076] Os compostos A, B, C, D e veículo foram administrados por via oral em um volume de 5 mL/kg. O composto A compreendeu uma mistura racêmica de R-cloroquina e S-cloroquina.

[077] O Composto B compreendeu R-cloroquina. Composto C compreendeu S-cloroquina.

[078] O Composto D compreendeu clemizol. Todos os compostos de teste foram pesados e dissolvidos em veículo (5% DMSO/água).

Doses de tratamento de fármaco

[079] Os compostos A, B, e C foram administrados por via oral em doses de 258 mg/kg nos primeiros 2 dias e 129 mg/kg uma vez ao dia depois disso. Composto D foi administrado por via oral em doses de 89 mg/kg duas vezes ao dia. A Tabela 1 abaixo resume o esquema de tratamento. Tabela 1: Esquema de tratamento para grupos de estudo

Animais

[080] Camundongos C57BL/6 (fêmeas de 14 dias -grávidas) foram obtidas a partir de SEIS Japão, Inc. (Shizuoka, Japan). Todos os animais utilizados no estudo foram alojados e atendidos de acordo com as Diretrizes da Sociedade Farmacológica Japonesa para Uso Animal.

Amostragem de Plasma e determinação de sangue total e bioquímica de plasma

[081] O sangue não-jejum foi coletado em tubos de polipropileno com anticoagulante (Novo-heparin, Mochida Pharmaceutical, Japão) de sangramento submandibular a 6 (antes da dosagem), 7 e 8 semanas de idade. As amostras de sangue coletadas foram centrifugadas e o sobrenadante foi coletado como plasma heparinizado.

[082] A glicose no sangue em não jejum no sangue total foi medida usando LIFE CHECK (EIDIA Co. Ltd., Japan). Plasma ALT foi medido por FUJI DRI-CHEM 7000 (Fujifilm Corporation, Japan).

Análises histopatológicas

[083] Para a coloração de HE, as seções foram cortadas a partir de blocos de parafina de tecido hepático prefixado na solução de Bouin, e coradas com Hematoxilina de Lillie- Mayer (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Japão) e solução de eosina (Wako Pure Chemical Industries). O índice de atividade de NAFLD (NAS) foi calculado de acordo com os critérios de Kleiner (Kleiner DE et al., Hepatology, 2005; 41: 1313). Para visualizar a deposição de colágeno, as seções fixas de fígado de Bouin foram coradas com solução vermelha de picro- Sirius (Waldeck, Germany).

[084] Para análise quantitativa de áreas de fibrose, as imagens de campo brilhante de seções coradas com vermelho Sirius foram capturadas em torno da veia central para fígados usando uma câmera digital (DFC280; Leica, Alemanha) com uma ampliação de 200 vezes, e as áreas positivas em 5 campos/seção foram medidas usando o software ImageJ (National Institute of Health, EUA).

Análise macroscópica de fígados

[085] Foi medido o número de nódulos de tumor visíveis macroscopicamente formados na superfície do fígado. Foi medido o diâmetro máximo dos nódulos de tumor visíveis macroscopicamente na superfície do fígado.

Testes estatísticos

[086] As análises estatísticas foram realizadas utilizando o Teste de Comparação Múltipla de Bonferroni em GraphPad Prism 4 (GraphPad Software Inc., EUA). Foram considerados estatisticamente significativos os valores de p <0,05.

EXEMPLO 1: Administração de S-cloroquina resulta em peso do fígado e do corpo reduzidos em camundongos com NASH.

[087] O peso corporal em todos os grupos não mudou obviamente durante o período de tratamento (Tabela 2). Não houve diferenças significativas no peso corporal médio entre o grupo de veículo e todos os grupos de compostos. Durante o período de tratamento, os camundongos morreram antes de atingir a semana 9 como se segue; um de 11 camundongos morreu em todos os grupos.

[088] O grupo do Composto C diminuiu significativamente o peso corporal médio no dia do sacrifício (Tabela 2). Não houveram diferenças significativas no peso corporal médio no dia do sacrifício entre o grupo de veículo e os grupos do composto A, composto B e composto D.

[089] O grupo do Composto C diminuiu significativamente o peso médio do fígado (Tabela 2). Não há diferenças significativas no peso médio do fígado no dia do sacrifício entre o grupo de Veículo e os grupos de Composto A, Composto B e Composto D. Não houveram diferenças significativas na proporção média do peso fígado-a-corpo no dia do sacrifício entre o grupo do Veículo e os grupos do composto A, composto B, composto C e composto D Tabela 2. Peso corporal e o peso do fígado em camundongos NASH

EXEMPLO 2: Bioquímica de Sangue Total em camundongos administrados com cloroquina ou clemizol em camundongos NASH.

[090] Não foram observadas diferenças significativas em todo os níveis de glicose no sangue durante o período de estudo entre o grupo do veículo e grupos do composto A, composto B, composto C e o composto D. Os níveis de ALT no plasma foram medidos na altura do sacrifício entre o grupo do veículo e grupos do Composto A, Composto B, Composto C e Composto D (Tabela 3). Tabela 3: níveis de ALT de camundongos NASH tratados com compostos de teste.

EXEMPLO 3: É observada uma contagem de atividade NAFLD reduzida em camundongos NASH tratados com R-cloroquina ou clemizol.

[091] Coloração de Hematoxilina e Eosina foi realizada em seções de tecido do fígado de camundongos tratados com compostos de teste e contagens de atividade de NAFLD foram calculadas (Tabela 4). Os grupos de Composto B e Composto D mostraram redução significativa no NAS em comparação com o grupo de Veículo. Tabela 4: contagens de atividade de NAFLD de camundongos NASH tratados com compostos de teste

EXEMPLO 4: A área de fibrose do fígado não é afetada pela administração de compostos de teste em camundongos NASH.

[092] A coloração vermelha de sirius no fígado foi realizada em seções de fígado de camundongos de NASH tratados com compostos de teste (Tabela 5). Não houveram diferenças significativas na área de fibrose no momento do sacrifício entre o grupo de Veículo e os grupos de Composto A, Composto B, Composto C e Composto D. TABELA 5: Área de fibrose dos fígados de camundongos NASH administrados com os compostos de Teste.

EXEMPLO 5: Peso do corpo e o peso do fígado de camundongos com carcinoma hepatocelular induziu NASH administrados com os compostos de teste.

[093] O peso corporal em todos os grupos de estudo não mudou obviamente durante o período de tratamento (Tabela 6). Não houveram diferenças significativas no peso corporal médio entre o grupo de veículo e todos os grupos de compostos (Tabela 6). Durante o período de tratamento, os camundongos morreram antes de atingir a semana 18 do seguinte modo; um de 4 camundongos morreram no Veículo e os grupos de Composto D. Dois dos 4 camundongos morreram nos grupos de Composto B e Composto C. Três de 4 camundongos morreram no grupo de Composto A. A média(s) ± SD foram apresentadas na Tabela 6. Tabela 6. Proporção de peso corporal do órgão e do fígado-para-o corpo de camundongos HCC induzidos por NASH tratados com compostos de teste

EXEMPLO 6: Administração de clemizol em camundongos com carcinoma hepatocelular reduz o diâmetro do tumor do fígado e do número de nódulos tumorais.

[094] O número de nódulos tumorais macroscopicamente visíveis formados sobre a superfície do fígado foi medido. O diâmetro máximo de nódulos tumorais macroscopicamente visíveis formados sobre a superfície do fígado foi medido (Tabela 7). Ali os camundongos sobreviventes (n = 3) mostraram nódulos de tumor visíveis na superfície do fígado no grupo do veículo. Ausência de nódulos de tumor visíveis na superfície do fígado foi observada em 2 dos 3 camundongos sobreviventes no grupo do Composto D (clemizol) (Figura 8). A média (s) ± SD são mostradas na Tabela 7. Tabela 7: Diâmetro máximo de nódulos de tumor visíveis em camundongos com HCC tratados com compostos de teste.

EXEMPLO 7: Pacientes humanos com carcinoma hepatocelular (HCC) tratados com clemizol.

[095] Um estudo piloto aberto de fase IIa é conduzido para testar a segurança, tolerabilidade, farmacocinética e atividade farmacodinâmica de 200 mg vs. 400 mg vs. 500 mg de cloridrato de clemizol administrado oralmente três vezes ao dia, a pacientes com carcinoma hepatocelular (HCC), que ou estão aguardando transplante hepático ou têm uma lesão irressecável. O estudo concluído trata até 40 pacientes. Resultados clínicos iniciais a partir de dois pacientes com carcinoma hepatocelular que foram administrados 200 mg de clemizol para 3 ou 5 meses são descritos abaixo.

Paciente #1 Resumo:

[096] Paciente #1 é um homem de 70 anos, com diagnóstico de HCC no cenário de cirrose crônica induzida por hepatite B. O diagnóstico foi determinado pelo CT dinâmico do fígado. Paciente # 1 recebeu o tratamento de ablação com radiofrequência para HCC em 2011, mas experimentou uma progressão da doença de pós-tratamento. Paciente #1 também recebeu três cursos de quimo embolização transarterial (TACE) em Abril-Maio 2015 e Junho 2015. Paciente #1 apresentou doença estável por um período de cerca de 5 meses antes da progressão do HCC. O paciente então iniciou o tratamento com clemizol com administração oral de 200 mg de clemizol três vezes ao dia. Após 3 meses de tratamento com clemizol, o paciente foi submetido a um exame de tomografia computadorizada hepática dinâmica, e quando um aumento significativo no tamanho do tumor teria sido esperado na ausência de qualquer terapia, o HCC permaneceu estável. Naquela época, o paciente sentiu-se bem sem queixas ou efeitos colaterais.

Paciente #2 Resumo:

[097] Paciente #2 é um idoso de 77 anos, com diagnóstico de HCC multifocal no cenário da cirrose crônica induzida por hepatite B. O diagnóstico foi determinado pela imagem de ressonância magnética dinâmica do fígado. Paciente #2 tinha falhado e/ou não tolerado o tratamento com sorafenibe e apresentado com a progressão da doença pós-tratamento. Paciente #2 depois iniciou um tratamento com clemizol com a administração oral de 200 mg três vezes ao dia de clemizol. Após 5 meses de tratamento com clemizol, o paciente foi acompanhado por imagem de ressonância magnética dinâmica do fígado, e quando um aumento significativo no tamanho do tumor seria esperado na ausência de qualquer terapia, o HCC permaneceu estável. Nessa altura, o paciente se sentia muito bem sem queixas ou efeitos colaterais.

[098] Apesar de um pequeno número de pacientes terem tratados até agora, a eficácia e tolerabilidade observadas com a baixa dose de clemizol utilizada (isto é, 200 mg vs. até 500 mg em pacientes subsequentes) são muito excitantes no seu próprio direito, especialmente quando em comparação com a única terapia aprovada para o HCC, sorafenibe. No estudo de fase 2 de sorafenibe (Abou-Alpha et al. Journal Clinical Oncology 2006, 24(26): 4293-4300), o tempo mediano até à progressão (TTP) foi de 4,2 meses. Toxicidade incluiu diarreia em mais de 40%, a reação cutânea de mão-pé em mais de 30%, e a fadiga em 30%, incluindo toxicidades relacionadas com o fármaco de grau 3/4, tais como fadiga (9,5%), diarreia (8,0%), e Abou-Alpha et al. Journal Clinical Oncology 2006, 24(26): 4293-4300 (5,1%). No estudo de fase 3 de sorafenibe (Llovet et al. NEJM 2008;359:378-90), o tempo mediano até à progressão radiológica foi de 5,5 meses no grupo de sorafenibe e 2,8 meses no grupo de placebo. A incidência global de eventos adversos relacionados com o tratamento foi de 80% no grupo de sorafenibe. Estes eram predominantemente de natureza gastrointestinal, constitucional, ou dermatológica (grau 1 ou 2 em termos de gravidade), bem como hipofosfatia (11% de grau 3) e trombocitopenia (4% de grau 3 ou 4).

[099] Embora a invenção tenha sido particularmente mostrada e descrita com referência a uma modalidade preferida e várias modalidades alternativas, deverá ser entendido pelos técnicos especialistas na técnica relevante que várias alterações na forma e detalhes podem ser feitas na mesma sem se afastar do espírito e escopo da invenção.

[100] Todas as referências, patentes emitidas e pedidos de patentes citados no interior do corpo do presente relatório descritivo são aqui incorporadas por referência na sua totalidade, para todos os fis.

Claims (6)

1. Uso de clemizol, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica para tratar câncer de fígado em um indivíduo que foi diagnosticado com de câncer de fígado, em que o câncer de fígado é um carcinoma hepatocelular.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do referido indivíduo ter sido diagnosticado com esteato-hepatite não alcoólica (NASH).

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do referido indivíduo ter sido diagnosticado com doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD).

4. Uso de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do referido indivíduo ter sido diagnosticado com infecção por Hepatite B.

5. Uso de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do referido indivíduo ter sido diagnosticado com cirrose do fígado.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato do referido indivíduo ter sido diagnosticado com carcinoma hepatocelular.