BR112017025763B1 - Uso de heparina com teor reduzido de ou esgotada em pentassacarídeo - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA PREVENIR A REJEIÇÃO DE UM TRANSPLANTE EM UM HOSPEDEIRO. Esta invenção refere-se ao campo do tratamento médico, em particular a invenção fornece um método para prevenir, melhorar ou reduzir a rejeição de um enxerto após transplante em um organismo hospedeiro. Mais particularmente, a invenção fornece uma heparina com baixo teor de pentassacarídeo para uso na prevenção, melhora ou redução na falha de um transplante de um órgão ou tecido estranhos do corpo de um humano ou animal em um receptor..

Description

Campo da Invenção

[001] Esta invenção refere-se ao campo do tratamento médico, em particular a invenção fornece um método para prevenir, melhorar ou reduzir a rejeição de um enxerto após transplante em um receptor.

Antecedentes da invenção

[002] O transplante é um tratamento médico complexo que permite o transplante de órgãos de um doador para um receptor, cujos órgãos não conseguiram trabalhar o suficiente, melhorando a qualidade de vida do receptor, aumentando a expectativa de vida e salvando vidas.

[003] A rejeição de um transplante é um dos maiores desafios para o transplante. Depois do transplante de um órgão, há uma resposta inevitável no hospedeiro e no enxerto. Essa resposta pode ocorrer como resultado de trauma, associado com a captação, perfusão, preservação do órgão e a cirurgia. Esta resposta também pode envolver reconhecimento específico pelo sistema imune de diferenças antigênicas entre o doador e o receptor (1). Juntos, esses mecanismos podem se desenvolver de modo agudo ou após semanas, meses ou mesmo anos e levar a uma resposta destrutiva que, em última instância, leva à perda do enxerto. Este processo também é frequentemente referido como rejeição de transplante.

[004] A perda de um enxerto é resultado de uma variedade de respostas e começa com processos de morte celular, que, se não forem interrompidos, aumentarão e causarão a falha do enxerto. A lesão traumática que leva à morte celular e que é causada pela captação, preservação e lesão de isquemia/reperfusão do órgão, não pode ser totalmente evitada. Portanto, estratégias de tratamento adequadas para diminuir os efeitos negativos são vitais. Lamentavelmente, não há muitas opções disponíveis.

[005] A rejeição é o resultado da resposta natural do sistema imune a uma substância estranha ou antígeno. Este processo complexo é principalmente mediado pelo linfócito T, embora envolva interações em série entre antígenos estranhos, anticorpos, linfócitos T, macrófagos, citocinas (também conhecidas como linfocinas ou interleucinas), moléculas de adesão (ou seja, moléculas co- estimuladoras) e proteínas de membrana que aumentam a ligação de linfócitos T e linfócitos B.

[006] A terapia imunossupressora é frequentemente realizada para prevenir e tratar a rejeição do transplante, assim como para prolongar a sobrevida do transplante e do paciente. No entanto, devido à potência dos agentes imunossupressores e à variabilidade inter e intra-individual na farmacocinética, a individualização da dose é necessária para manter uma imunossupressão adequada, minimizando as reações adversas. A pouca solubilidade em água e biodisponibilidade contribuem para a complexidade da administração de agentes imunossupressores, tais como ciclosporina e sirolimus. A rejeição do transplante pode ser hiperaguda (nas primeiras horas após o transplante ou durante os primeiros dias) causada por anticorpos pré- formados, aguda (durante os primeiros dias ou meses) causada por linfócitos T ou crônica (meses ou mesmo anos depois) causada principalmente por anticorpos.

[007] Existe uma escassez contínua de doadores de órgãos. Isso causa grandes problemas de saúde, porque os pacientes na lista de espera de um órgão para transplante provavelmente morrerão sem transplante do órgão. Eles são um pesado fardo financeiro para o sistema de saúde devido aos grandes custos de seu tratamento (2-10).

[008] Portanto, métodos para aumentar a taxa de sucesso dos transplantes são urgentemente necessários.

Sumário da invenção

[009] Descobrimos que uma heparina com uma diminuição da atividade anticoagulante, em particular uma heparina com teor reduzido de pentassacarídeos, pode ser usada para reduzir, melhorar ou prevenir a falha de transplante de um órgão estranho em um receptor. A heparina com teor reduzido de pentassacarídeos tem uma atividade anticoagulante notavelmente diminuída. Além disso, mostrou uma habilidade notável para neutralizar a citotoxicidade mediada por histona. Essa citotoxicidade mediada por histona é considerada responsável pela falha do enxerto em um transplante. Assim, a invenção refere-se a uma heparina com teor reduzido de pentassacarídeo para uso no tratamento ou prevenção de falha de transplante no corpo humano ou animal.

Descrição detalhada da invenção

[0010] A heparina é uma mistura de cadeias de polissacarídeos (Casu, B. (1989 ). "Structure of heparin and heparin fragments." Ann N Y Acad Sci 556: 1-17). A composição das cadeias de polissacarídeos e seu comprimento variam. As cadeias com o assim chamado domínio de pentassacarídeo se ligam fortemente à antitrombina (AT), que é uma das principais proteínas anticoagulantes circulantes (Casu, B. et al. Biochem J 197 (3) (1981) 599-609).

[0011] A heparina com uma atividade anticoagulante diminuída é conhecida na técnica e existem vários métodos conhecidos para a sua preparação. Primeiro, a heparina pode ser esgotada dos seus pentassacarídeos por cromatografia de afinidade, obtendo assim heparina não anticoagulante ou heparina com uma atividade anticoagulante diminuída. A heparina também pode ser tratada quimicamente para obter heparina com uma atividade anticoagulante diminuída.

[0012] A heparina com teor reduzido de pentassacarídeo pode ser obtida a partir de heparina não fracionada (UFH) por métodos conhecidos na técnica. Em um método preferido, a heparina com teor reduzido de pentassacarídeo é obtida por cromatografia de afinidade. Nesse sentido, a UFH é passada através de uma coluna que contém AT imobilizada. As moléculas que contêm a sequência de pentassacarídeo se ligam à coluna, enquanto outros materiais passam. O material não ligado é denominado Material de Baixa Afinidade (Low Affinity Material, LAM), enquanto o material que se liga é chamado de Material de Alta Afinidade (High Affinity Material, HAM). LAM é substancialmente reduzido em pentassacarídeos e subsequentemente na sua atividade anticoagulante, enquanto que HAM tem atividade anticoagulante completa.

[0013] LAM também pode ser descrito como a fração de heparina natural com teor reduzido de pentassacarídeos.

[0014] A expressão heparina com teor reduzido de pentassacarídeos, neste contexto, é usada para se referir a uma fração de heparina na qual o conteúdo de pentassacarídeos está substancialmente reduzido em comparação com heparina comercialmente disponível.

[0015] A expressão substancialmente reduzido ou diminuído, tal como aqui usada, significa reduzido em pelo menos 10%, tal como 20% ou 30%, mais preferencialmente 40 ou 50%, ainda mais preferido, mais do que 60% ou 70% ou 80%, tal como 90% ou mais de 98%, tal como mais do que 99% ou mesmo 100%. É o mais preferido quando a fração com baixo teor de pentassacarídeos não contém quaisquer pentassacarídeos detectáveis quando testados quanto a geração de trombina como descrito por Hemker et al., (2003) infra. Por outro lado, a heparina com uma atividade anticoagulante diminuída significa heparina com uma atividade anticoagulante reduzida, tal como reduzida em pelo menos 10%, tal como 20% ou 30%, mais preferencialmente 40 ou 50%, ainda mais preferido, mais do que 60% ou 70% ou 80%, tal como 90% ou mais do que 98%, tal como mais de 99% ou mesmo 100%. É o mais preferido quando a heparina com uma atividade anticoagulante diminuída não contém nenhuma atividade anticoagulante detectável quando testada para geração de trombina como descrito por Hemker et al., (2003) infra.

[0016] Na seção experimental está descrito em detalhes como pode ser obtida uma heparina com baixo teor de pentassacarídeo. É chamada de LAM, abreviatura de Material de Baixa Afinidade.

[0017] Descobrimos que, pela remoção da fração de heparina anticoagulante de UFH, é obtida uma heparina com baixo teor de pentassacarídeo que neutraliza a citotoxicidade mediada por histona e que pode ser vantajosamente usada para prevenir falha no transplante de órgãos e tecidos do doador, tais como coração, pulmão, fígado, córnea, pele, útero, rim, pâncreas e intestino.

[0018] A expressão falha de transplante ou falha no enxerto, tal como aqui utilizada, significa a falha do órgão transplantado em desempenhar a sua função normal. Isso pode significar que o órgão transplantado não executa sua função completa ou apenas em parte. A falha de transplante também pode se referir a uma condição do órgão transplantado em que a sua função está substancialmente reduzida ou diminuída.

Legenda das figuras

[0019] Figura 1. Separação de UFH em LAM e HAM. Foram aplicados 2 mg de UFH. A figura mostra a densidade óptica a 254 nm, em que o primeiro pico representa o LAM coletado, o segundo pico contém o HAM coletado. O segundo gráfico representa a condutividade do material eluído. O LAM foi eluído com 1 ml/min e HAM com 4 ml/min.

[0020] Figura 2: Atividade anticoagulante de várias preparações de heparina. O diagrama mostra que a dessulfatação e a depleção de pentassacarídeos produzem frações de heparina com uma atividade anticoagulante diminuída.

[0021] Figura 3: Neutralização da citotoxicidade da histona H3. Diagrama mostrando que a citotoxicidade da histona H3 está reduzida na fração de heparina dessulfatada, mas totalmente intacta na heparina com baixo teor de pentassacarídeo.

Exemplos Exemplo 1: Preparação de uma coluna AT

[0022] A coluna AT foi preparada de acordo com a instrução da embalagem de uma Coluna HiTrap 5 ml (GE Healthcare®). Após lavar o isopropanol da coluna, ~2,5 mg AT em 5 ml de tampão de acoplamento foram aplicados à coluna. Em seguida, o procedimento descrito para imobilizar a proteína no material da coluna e lavar a coluna foi empregado (de acordo com a instrução da embalagem). Finalmente, a coluna foi equilibrada com NaCl 140 mM, Tris 20 mM (pH 7,4).

Exemplo 2: Separação de UHF em LAM e HAM

[0023] Foram aplicados 2 mg de heparina não fracionada à coluna. LAM foi eluído com NaCl 140 mM, Tris 20 mM (pH 7,4) e HAM com NaCl 2 M, Tris 20 mM (pH 7,4). O último tampão foi aplicado em um gradiente em bloco. Na Fig. 1 é mostrado um exemplo do padrão de eluição.

[0024] Para obter uma maior quantidade de LAM, o procedimento descrito na Figura 1 foi repetido várias vezes.

[0025] Para determinar se LAM estava livre de HAM, foram utilizados dois testes. Em primeiro lugar, o HAM coletado foi reaplicado à coluna AT e corrido como descrito acima. Nenhum pico de HAM foi encontrado. Em segundo lugar, o efeito da LAM sobre a geração de trombina foi medido. A mistura de reação (120 μl) continha o plasma combinado normal em uma diluição de 1,5x, LAM ou tampão de 3 μl, DOPL de 4 μM (DOPC 60%, DOPC 20% e DOPE 20%), fator tecidual 5 pM (Innovin), CaCI2 100 mM e ZGGR-AMC 417 μM. A reação foi iniciada com CaCI2 + ZGGR-AMC. A geração de trombina foi medida como descrito por Hemker, H. C, P. Giesen, et al. ( 2003). "Calibrated automated thrombin generation mesurement in clotting plasma". Pathophysiol Haemost Thromb 33 (1): 4-15. A geração de trombina não foi inibida pela adição de 3 μl de HAM.

[0026] As frações da coluna contendo LAM foram coletadas. O tampão foi trocado para bicarbonato de amônia (pH 7,8) com meio Sephadex G-25 e as frações foram liofilizadas. O LAM seco foi pesado e dissolvido em solução salina tamponada com fosfato para atingir a concentração desejada.

Exemplo 3: Prevenção da rejeição do transplante

[0027] Nós fizemos nossas observações em um modelo de transplante de rim em que transplantamos rins de camundongos. Nós determinamos as condições sob as quais os rins para o transplante apresentaram maior chance de falha e, em seguida, realizamos um experimento em que 30 camundongos foram tratados com 0,1 e 10 mg de LAM por camundongo por injeção. Um grupo de camundongos de controle apropriado não recebeu nenhum tratamento, outro grupo de controle recebeu quantidades comparáveis de HAM ou heparina natural.

[0028] Observou-se que o grupo que recebeu LAM apresentou menor índice de falhas no enxerto.

Atividade anticoagulante de várias preparações de heparina

[0029] A heparina não fracionada (UFH) teve diminuição do teor de pentassacarídeos por cromatografia de afinidade em uma coluna com antitrombina imobilizada. O fluxo não ligado continha a heparina com baixo teor de pentassacarídeos (LAM).

[0030] A heparina não fraccionada foi dessulfatada de acordo com o método descrito por Yuko Inoue e Kinzo Nagasawa, Carbohydrate Research (1976) 46: 87-95.

[0031] A heparina dessulfatada (DS), UFH e LAM foram testados no Teste de Potencial de Trombina Endógena (ETP) para determinar a sua atividade anticoagulante (Figura 2). Nós concluímos que a dessulfatação, assim como a depleção de pentassacarídeo, abolem quase completamente a atividade anticoagulante da UFH, pelo menos até uma extensão inferior a 10% da atividade original da UFH.

Exemplo 5: Neutralização da citotoxicidade de histona H3

[0032] DS, UFH e LAM foram testados no ensaio de citotoxicidade Histona H3 como descrito por Wildhagen et al. (Blood 2014; 123: 1098-1101) para determinar a sua atividade de proteção em relação à citotoxicidade da Histona H3 (Figura 3). Observou-se que o efeito protetor contra a citotoxicidade da histona H3 estava preservado na fração LAM (100% da atividade da heparina não fracionada (figura 3)), enquanto que a heparina dessulfatada apresentou redução significativa (mais de 50%) no efeito protetor em comparação com heparina não fracionada. Nós concluímos que a UFH e LAM neutralizam a atividade citotóxica da Histona H3 na mesma medida, enquanto que a dessulfatação da heparina (DS) resulta em uma perda de habilidade de neutralizar a atividade citotóxica da Histona H3. Referências 1. Morris PJ, Knechtle SJ. Kidney transplantation: princípios e práticas. Sexta ed. Filadélfia: Saunders Elsevier; 2008. 2. Foundation E. Annual report 2013. 2013. 3. Colvin-Adams M, Smith JM, Heubner BM, Skeans MA, Edwards LB, Waller CD, et ai. OPTN/SRTR 2013 Annual Data Report: heart. Am J Transplant. 2015; 15 SuppI 2: 1-28 4. Israni AK, Zaun DA, Rosendale JD, Snyder JJ, Kasiske BL. OPTN/SRTR 2013 Annual Data Report: doação de órgãos de cadáver. Am J Transplant. 2015; 15 SuppI 2: 1-13. 5. Kandaswamy R, Skeans MA, Gustafson SK, Carrico RJ, Tyler KH, Israni AK, et ai. OPTN/SRTR 2013 Annual Data Report: pancreas. Am J Transplant. 2015; 15 Supp. 2: 1-20. 6. Kim WR, Lake JR, Smith JM, Skeans MA, Schladt DP, Edwards EB, et al OPTN/SRTR 2013 Annual Data Report: liver. Am J Transplant. 2015; 15 SuppI 2: 1-28. 7. Matas AJ, Smith JM, Skeans MA, Thompson B, Gustafson SK, Stewart DE, et al. OPTN/SRTR 2013 Annual Data Report: kidney. Am J Transplant. 2015; 15 SuppI 2: 1-34. 8. Schnitzler MA, Skeans MA, Axelrod DA, Lentine KL, Tuttle- Newhall JE, Snyder JJ, et al. OPTN/SRTR 2013 Annual Data Report: economics. Am J Transplant. 2015; 15 SuppI 2: 1-24. 9. Smith JM, Skeans MA, Horslen SP, Edwards EB, Harper AM, Snyder JJ, et al. OPTN/SRTR 2013 Annual Data Report: intestine. Am J Transplant. 2015; 15 SuppI 2: 1-16. 10. Valapour M, Skeans MA, Heubner BM, Smith JM, Hertz Ml, Edwards LB, et al. OPTN/SRTR 2013 Annual Data Report: lung. Am J Transplant. 2015; 15 SuppI 2: 1-28.

Claims (6)

1. Uso de heparina com teor reduzido de ou esgotada em pentassacarídeo, caracterizada pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para prevenir, melhorar ou reduzir a falha do enxerto após transplante em um receptor.

2. Uso de composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o enxerto é um órgão ou um tecido.

3. Uso de composto de acordo com a reivindicação 2, ca-racterizada pelo fato de que o órgão é pele, coração, fígado, pulmão, pâncreas, intestino ou rim.

4. Uso de composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a heparina com teor reduzido de pentassacarídeo é obtida por cromatografia de afinidade.

5. Uso de composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a cromatografia de afinidade foi realizada utilizando anti-trombina imobilizada.

6. Uso de composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a heparina com teor reduzido de pentassacárideo neutraliza a citotoxicidade mediada pela histona H3 tão eficazmente como a heparina não fracionada