BR112017021854B1 - MÉTODOS PARA PREVENIR UM MICRO-RNA (miRNA) INDESEJADO DE PARTICIPAR EM REAÇÕES EM CADEIA DA POLIMERASE DA TRANSCRIÇÃO REVERSA (RT-PCR) - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA BLOQUEAR miRNA. Ácido nucleico de bloqueio para o uso em reduzir a abundância de um micro-RNA (miRNA) não-alvo em uma biblioteca de miRNA é fornecido, incluindo: uma região complementar de fita única em uma da extremidade 5' do ácido nucleico de bloqueio ou da extremidade 3' do ácido nucleico de bloqueio, que associa com uma região de ligação em uma primeira extremidade do miRNA indesejado; uma região formadora de hairpin loop ou outra região de fita dupla adjacente à região de complementaridade, em que todas as extermidades terminais do ácido nucleico de bloqueio exceto um não estão disponíveis para participar em reações de ligase. Métodos e kits para usar o ácido nucleico de bloqueio também são fornecidos.

Description

FUNDAMENTOS A. CAMPO DA DIVULGAÇÃO

[001]A presente divulgação geralmente refere-se ao campo de biologia molecular. Em particular, a presente divulgação refere-se à geração de uma biblioteca de sequenciamento de micro RNA (miRNA). Mais especificamente, a presente divulgação refere-se à redução da frequência de miRNAs específicos em uma biblioteca de sequenciamento.

B. FUNDAMENTOS

[002]Micro RNAs são RNAs não-codificantes pequenos que ocorrem naturalmente que têm cerca de 17 a 25 bases de nucleotídeo em comprimento em sua forma biologicamente ativa. Os miRNAs regulam pós-transcricionalmente a expressão do gene reprimindo-se a tradução de mRNA alvo e alvejando-se as transcrições para a destruição. Considera-se que os miRNAs funcionam como reguladores negativos, tais que quantidades maiores de um miRNA específico correlacionarão com níveis mais baixos de expressão do gene alvo.

[003]Dado o seu importante papel na regulação de gene e, portanto, na saúde humana, o sequenciamento em larga escala de miRNA tornou-se uma ferramenta científica muito valiosa no estudo de doença humana. Existem vários métodos conhecidos na técnica de criar uma biblioteca de miRNA a ser sequenciada.

[004]RNAs pequenos podem ser medidos com uma variedade de tecnologias, incluindo qPCR, micro-arranjos e hibridização à base de solução, entre outros. Sequenciamento de DNA de próxima geração (NGS) também é um método poderoso para a descoberta e quantificação de RNAs pequenos devido ao seu desempenho técnico, baixa despesa, rendimento ultra-alto e sua capacidade de detectar e medir agnosticamente novas espécies.

[005]Por exemplo, tal como geralmente mostrado na FIG. 1, em um protocolo utilizado por Illumina, Inc. e outras companhias comerciais que fazem kits compatíveis Illumina, para gerar uma biblioteca de sequenciamento de miRNA, um adaptador 3’ de DNA adenilado 40 com uma extremidade 3’ bloqueada é ligado a uma extremidade 3’ 20 de molécula de RNA 10 usando uma T4 RNA ligase 2 50 truncada. Esta T4 RNA ligase 2 50 truncada exige o substrato do adaptador 3’ 40 a ser adenilado. O resultado são fragmentos de outras espécies de RNA na amostra de RNA total não são ligados juntos nesta reação; apenas o oligonucleotídeo pré- adenilado pode ser ligado às extremidades 3’ de RNA 20 livres resultando em uma molécula de miRNA com um adaptador 3’ ligado a ela 60. Além disso, visto que o adaptador 3’ 20 está bloqueado 3’, pode não servir como um substrato para a auto- ligação. Na próxima etapa, um adaptador 5’ 70 é adicionado junto com RNA ligase 1 80. Apenas as moléculas de RNA 10 cujas extremidades 5’ 30 são fosforiladas serão substratos eficazes para a reação de ligação subsequente. Depois desta segunda ligação, um miRNA com ambos os adaptadores 3’ e 5’ ligados a ele 90 é formado. Em seguida, a amplificação da reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) 100 é realizada. Depois da amplificação da RT-PCR 100, a biblioteca pode ser sequenciada e analisada 110. Este método de preparação de biblioteca resulta em uma biblioteca orientada tal que o sequenciamento sempre lê da extremidade 5’ 30 à extremidade 3’ 20 da molécula de RNA original 10.

[006]Entretanto, NGS de RNAs pequenos tem vários desafios técnicos. Entre estes, está o comportamento tendencioso bem relatado das formas modificadas de T4 RNA ligase 2 comumente usadas em protocolos de geração de biblioteca de sequenciamento. Esta tendência se manifesta em bibliotecas de RNA pequenas como ligação diferencial, criando uma sobre-representação de certas espécies e uma sub-representação de outras. Quando as bibliotecas de RNA pequenas são construídas de muitos tipos de amostra, estas tendências em eficiência de ligação, combinadas com diferenças de abundância inerentes, podem produzir resultados imprecisos. Espécies de RNA pequenas altamente abundantes podem ser preferencialmente ligadas tais que sua representação na biblioteca torna- se excessivamente alta, diminuindo a capacidade de medir outras espécies menos abundantes. A detecção precisa destas espécies sub-representadas exigiria assim profundidade de sequenciamento muito alta e custos proporcionalmente mais altos. Adicionalmente, as espécies altamente abundantes interferem com muitas técnicas de normalização, limitando a utilidade das leituras coletadas.

[007]Em bibliotecas de RNA pequenas feitas de plasma e soro humano, muitas das espécies mais abundantes são provavelmente derivadas de populações de células sanguíneas. Embora estas podem ser de interesse em algumas aplicações, miRNAs e outros RNAs pequenos que agem como biomarcadores para muitas doenças, tais como câncer e doença neurodegenerativa, podem ser de baixa abundância no sangue de pacientes afligidos. Consequentemente, o problema enfrentado pelos pesquisadores interessados em biomarcadores de miRNA à base de sangue é como medir precisamente espécies de baixa abundância em um fundo de espécies altamente abundantes e menos informativas que compreendem a maioria das leituras na biblioteca de sequenciamento.

[008]Consequentemente, existe uma necessidade de um método eficaz para reduzir a frequência de miRNAs sobre-representados ou abundantes 10 em bibliotecas de sequenciamento de miRNA.

SUMÁRIO

[009]Os problemas acima (assim como outros) são dirigidos pelas invenções fornecidas nesta divulgação, embora não a cada forma de realização divulgada aqui endereçará a cada problema divulgado acima.

[010]Em um primeiro aspecto, um ácido nucleico de bloqueio para o uso em reduzir a abundância de um micro-RNA (miRNA) indesejado em uma biblioteca de miRNA é fornecido, o ácido nucleico de bloqueio compreendendo: uma extremidade 5’ do ácido nucleico de bloqueio e uma extremidade 3’ do ácido nucleico de bloqueio; uma região de complementaridade de fita simples em uma da extremidade 5’ do ácido nucleico de bloqueio ou da extremidade 3’ do ácido nucleico de bloqueio, que se associa com uma região de ligação em uma primeira extremidade do miRNA indesejado sob condições rigorosas, em que a dita primeira extremidade é a extremidade 5’ ou a extremidade 3’ do miRNA indesejado, e em que a região de complementaridade tem uma extremidade terminal; uma região formadora de hairpin loop adjacente à região de complementaridade, a região formadora de hairpin loop tendo uma extremidade terminal ligante; e uma primeira porção de bloqueio ligada à extremidade terminal da região formadora de hairpin loop, em que a dita primeira porção de bloqueio pode não servir como um substrato para ligases.

[011]Em um segundo aspecto, um ácido nucleico de bloqueio para o uso em reduzir a abundância de um miRNA indesejado em uma biblioteca de miRNA é fornecido, o ácido nucleico de bloqueio compreendendo: uma fita Crick tendo uma extremidade 3’ e uma extremidade 5’; uma região de complementaridade de fita simples em uma da extremidade 5’ da fita Crick ou da extremidade 3’ da fita Crick, que se associa com uma região de ligação em uma primeira extremidade do miRNA indesejado sob condições rigorosas, em que a dita primeira extremidade é a extremidade 5’ ou a extremidade 3’ do miRNA indesejado; uma região de fita dupla na fita Crick adjacente à região de complementaridade, a região de fita dupla compreendendo uma fita Watson que está associado à fita Crick, a fita Watson tendo uma extremidade 5’ e uma extremidade 3’; uma primeira porção de bloqueio ligada à extremidade 3’ da fita Crick, em que a primeira porção de bloqueio pode não servir como um substrato para ligases; uma segunda porção de bloqueio ligada à extremidade 5’ da fita Crick, em que a segunda porção de bloqueio pode não servir como um substrato para ligases; uma terceira porção de bloqueio ligada à extremidade 3’ da fita Watson se a região de complementaridade for na extremidade 3’ da fita Crick, ou ligada à extremidade 5’ da fita Watson se a região de complementaridade for na extremidade 5’ da fita Crick, em que a terceira porção de bloqueio pode não servir como um substrato para ligases; e uma extremidade terminal ligante na fita Watson, a extremidade terminal ligante localizada na extremidade 3’ da fita Watson se a região de complementaridade for na extremidade 5’ da fita Crick, ou na extremidade 5’ da fita Watson se a região de complementaridade for na extremidade 3’ da fita Crick.

[012]Em um terceiro aspecto, um método de prevenir um miRNA indesejado de participar de reações em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) é fornecido, o miRNA indesejado tendo uma extremidade 5’ e uma extremidade 3’, o método compreendendo: anelamento da região de complementaridade de qualquer um dos ácidos nucleicos de bloqueio acima com o sítio de ligação na primeira extremidade do miRNA indesejado, em que a primeira extremidade do miRNA indesejado é uma da extremidade 5’ ou da extremidade 3’. O produto do método também é fornecido.

[013]Em um quarto aspecto, um método de reduzir a abundância de um miRNA indesejado em uma biblioteca de miRNA é fornecido, o miRNA indesejado tendo uma extremidade 5’ e uma extremidade 3’, o método compreendendo: purificar RNA a partir de uma amostra compreendendo uma pluralidade de miRNAs; introduzir um adaptador de ácido nucleico adenilado e uma primeira DNA/RNA ligase sob condições para permitir o adaptador de ácido nucleico adenilado se ligar à extremidade 3’ da pluralidade de miRNAs; introduzir qualquer um dos ácidos nucleicos de bloqueio acima sob condições para permitir a região de complementaridade do ácido nucleico de bloqueio anelar a região de ligação do miRNA indesejado, para produzir uma amostra bloqueada; introduzir um adaptador de RNA e uma RNA ligase sob condições para permitir o adaptador de RNA se ligar à extremidade 5’ da pluralidade de miRNAs; introduzir uma transcriptase reversa à amostra bloqueada sob condições para permitir a transcrição reversa da pluralidade de miRNAs produzir uma amostra de cDNA; e realizar a reação em cadeia da polimerase (PCR) na amostra de cDNA para produzir a biblioteca de miRNA com abundância reduzida de miRNA indesejado. A biblioteca de miRNA com abundância reduzida de miRNA não-alvo que é o produto deste método também é fornecido.

[014]Em um quinto aspecto, um kit para reduzir a frequência de um miRNA em uma biblioteca de miRNA é fornecido, o kit compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos de bloqueio acima.

[015]Em um sexto aspecto, um complexo de miRNA bloqueado é fornecido, compreendendo: um miRNA; e qualquer um dos ácidos nucleicos de bloqueio acima renaturou à região de ligação na primeira extremidade do miRNA, em que a primeira extremidade é uma da extremidade 5’ ou da extremidade 3’.

[016]Em um sétimo aspecto, um ácido nucleico é fornecido, compreendendo uma sequência tendo pelo menos um certo nível de identidade para uma das SEQ ID NO: 1 - 4 e 13. Em um oitavo aspecto, um ácido nucleico é fornecido que se associa sob condições altamente rigorosas com o ácido nucleico do sétimo aspecto. Em um nono aspecto, um organismo ou vetor é fornecido compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos do sétimo e oitavo aspecto.

[017]O sumário acima apresenta um sumário simplificado de modo a fornecer um entendimento básico de alguns aspectos da matéria objeto reivindicada. Este sumário não é uma visão geral extensiva. Não é intencionado identificar elementos chave ou críticos ou apresentar o escopo da matéria objeto reivindicada. Seu único propósito é apresentar alguns conceitos em uma forma simplificada como um prelúdio para a descrição mais detalhada que é apresentada posteriormente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[018]Uma descrição mais particular da invenção será feita por referência às formas de realização específicas que são ilustradas nos desenhos. É avaliado que estes desenhos não são intencionados a limitar o escopo das reivindicações.

[019]FIG. 1 Fluxograma de um protocolo anterior, em que um adaptador pré- adenilado é ligado à extremidade 3’ de um banco de RNA pequeno usando T4 RNA ligase 2 truncada. Subsequentemente, um segundo adaptador é adicionado à extremidade 5’ do miRNA com T4 RNA ligase 1, seguido por transcrição reversa e PCR.

[020]FIG. 2 Fluxograma em uma forma de realização exemplar do método, em que um oligonucleotídeo hairpin com um ressalto complementar à extremidade 5’ do miRNA alvejado é ligado por intermédio da ligação com T4 DNA ligase à extremidade 5’ do miRNA subsequente à ligação do adaptador à extremidade 3’. Isto evita a ligação do segundo adaptador à extremidade 5’ do miRNA, resultando em um produto que não amplifica durante a PCR.

[021]FIG. 3 Gráfico mostrando a fração de hsa-miR-16-5p presente em uma biblioteca bloqueada gerada a partir de RNA total de coração humano usando uma titulação de um oligonucleotídeo de bloqueio alvejando hsa-miR-16-5p em comparação com a biblioteca desbloqueada é mostrado no eixo y.

[022]FIG. 4 Bloqueio de hsa-miR-16-5p em amostras de plasma humano. (AC) Resultados de sequenciamento de cinco amostras de plasma humano diferentes são mostrados em A-E. Contagens de leitura da média (veja, Materiais e Métodos) de bibliotecas desbloquadas e bloqueadas de hsa-miR-16-5p duplicadas são mostradas nos eixos x e y respectivamente. Todas as bibliotecas foram amostradas para 6 milhões de leituras de miRNA alinhadas antes da apresentação e análise. Um miRNA é considerado significantemente expressado diferencialmente entre as duas condições se o valor P ajustado como calculado por DESeq2 for <0,01. Não significantemente, miRNAs expressados diferencialmente são mostrados como círculos abertos. Significantemente, miRNAs expressados diferencialmente são mostrados como círculos pretos cheios. (F) Sequências dos membros da família mir- 16 são mostradas com a região de semente (bases 2-8) realçada em cinza.

[023]FIG. 5 Efeito de bloquear hsa-miR-16-5p em profundidade de leitura em amostras de plasma humano. Um conjunto de limiares de contagem é apresentado no eixo x versus a diferença entre o número de miRNAs que passa este limiar nas amostras bloqueadas de hsa-miR-16-5p versus nas amostras desbloqueadas é apresentado no eixo y. As diferênças entre amostras individuais são mostradas como linhas tracejadas cinzas. A diferença média é mostrada como uma linha preta sólida. Todas as bibliotecas foram amostradas para 6 milhões de leituras de miRNA alinhadas antes da apresentação.

[024]FIG. 6 Efeito de bloquear hsa-miR-16-5p em reprodutibilidade e medição de expressão diferencial em amostras de plasma humano. (a) Dispersões foram calculadas para cada conjunto de bibliotecas de amostra de plasma com base nas bibliotecas desbloqueadas duplicadas e bibliotecas bloqueadas de hsa-miR-16- 5p duplicadas usando DESeq2. Os valores de dispersão são apresentados no eixo y versus as contagens de leitura médias de base, também calculados por DESeq2, no eixo x. As dispersões desbloqueadas são apresentadas em cinza, enquanto que as dispersões bloqueadas são apresentadas em preto. (B) Razão de mudanças foi calculado entre todos os pares de amostra possíveis (10) em ambas as bibliotecas desbloqueadas e hsa-miR-16-5p. O log2 (razão de mudanças) para todos esses pares é apresentado nos mesmos eixos, com o log2 (razão de mudança) para a biblioteca desbloqueada no eixo x e o log2 (razão de mudança) para a biblioteca bloqueada de hsa-miR-16-5p no eixo y. Assim, cada ponto representa uma única combinação do par de miRNA-amostra. Apenas aqueles miRNAs para os quais ambas as amostras tiveram uma média de bases calculada para DESeq2 >10 foram apresentados. A média e desvio padrão do conjunto de 10 rô de Spearmans da correlação do razão de mudanças entre bibliotecas desbloquadas e bloqueadas de hsa-miR-16-5p são listados no desenho.

[025]FIG. 7 Bloqueio de hsa-miR-451a sozinho e em combinação com hsa- miR-16-5p de bloqueio em amostras de plasma humano. (A-B) Resultados de sequenciamento de duas amostras de plasma humano são mostrados. Contagens de leitura de uma biblioteca desbloqueada e uma biblioteca bloqueada de hsa-miR- 451a são mostradas nos eixos x e y respectivamente. (C-D) Resultados de sequenciamento a partir das mesmas duas amostras de plasma humano são mostrados. Contagens de leitura a partir de uma biblioteca desbloqueada e uma biblioteca simultaneamente bloqueada de hsa-miR-451a e hsa-miR-16-5p são mostradas nos eixos x e y respectivamente. Um miRNA é considerado significantemente expressado diferencialmente entre as duas condições se o valor P ajustado como calculado por DESeq2 for <0,01 e se sua contagem da média de bases for acima de 50. Não significantemente, miRNAs expressados diferencialmente são mostrados como círculos abertos. Significantemente, miRNAs expressados diferencialmente são mostrados como círculos pretos cheios. Todas as bibliotecas foram amostradas para 6 milhões de leituras de miRNA alinhadas antes da apresentação e análise.

[026]FIG. 8 Distribuição categórica de leituras de um conjunto de bibliotecas de plasma humano desbloqueadas. A fração de leituras cai em seis categorias para 27 bibliotecas derivadas de amostras de plasma humano é mostrada. Linhas horizontais sólidas indicam leituras que alinham para miRNAs, mas não para hsa- miR-16-5p. Linhas tracejadas verticais indicam leituras que mapeiam o genoma humano, mas não são miRNAs. Linhas sólidas verticais indicam leituras que alinham para hsa-miR-16-5p. Quadriculados horizontais indicam leituras que alinham para spike-ins. Verificações são leituras que falhariam para alinhar para miRNAs ou genoma humano. Linhas horizontais tracejadas são leituras que são adaptador- dímero.

[027]FIG. 9 Distribuição categórica de leituras de um conjunto de bibliotecas de plasma humano bloqueadas de hsa-miR-16-5p. A fração de leituras que caem em seis categorias para 23 bibliotecas derivadas de amostras de plasma humano em que hsa-miR-16-5p foi bloqueado é mostrada. Linhas horizontais sólidas indicam leituras que alinham para miRNAs, mas não para hsa-miR-16-5p. Linhas tracejadas verticais indicam leituras que mapeiam o genoma humano, mas não são miRNAs. Linhas sólidas verticais indicam leituras que alinham para hsa-miR-16-5p. Quadriculados horizontais indicam leituras que alinham para spike-ins. Verificações são leituras que falhariam para alinhar para miRNAs ou genoma humano. Linhas horizontais tracejadas são leituras que são adaptador-dímero.

[028]FIG. 10 Efeito da reação de ligação de bloqueio ao alvejar a extremidade 5’ versus alvejar a extremidade 3’. Apresenta-se a concentração de biblioteca total conforme determinada usando o Kit de Quantificação de Biblioteca - Illumina/ABI Prisma (KAPA Biosystems). As barras pontilhadas são bibliotecas em que uma ligação de bloqueio simulada (todos os reagentes exceto o oligonucleotídeo de bloqueio) foi conduzida como seria realizada para bloquear a extremidade 5’ de um miRNA alvejado. As barras cruzadas são bibliotecas em que uma ligação de bloqueio simulada foi conduzida como seria realizada para bloquear a extremidade 3’ de um miRNA alvejado.

[029]FIG. 11 Ilustração de variações da extremidade 3’ em hsa-miR-16-5p efeitos em eficácia de bloqueio por um bloqueador que alveja a extremidade 3’. São mostradas várias variantes de sequência de hsa-miR-16-5p, com a forma canônica exibida como a sequência mais à esquerda. Juntamente, os seis apresentados aqui compreendem mais de 91 % do alinhamento de sequências para hsa-miR-16-5p neste experimento. A altura de barra indica a fração remanescente na biblioteca bloqueada quando comparada à biblioteca desbloqueada.

[030]FIG. 12 Reprodutibilidade de contagens de leitura em bibliotecas com e sem bloquear hsa-miR-16-5p. (A-E) Contagens de leitura para bibliotecas desbloqueadas duplicadas a partir de cinco amostras de plasma humano são apresentadas versus entre si. (F-J) Contagens de leitura para bibliotecas bloqueadas de hsa-miR-16-5p duplicadas a partir de cinco amostras de plasma humano são apresentadas versus entre si. Para todos os experimentos, as leituras alinhadas foram amostradas a 6 milhões antes da apresentação. O coeficiente de correlação de rô de Spearman é mostrado para cada par duplicado.

[031]FIG. 13 Ilustração de variações da extremidade 5’ em hsa-miR-16-5p efeitos em eficácia de bloqueio por um bloqueador que alveja a extremidade 5’. São mostradas várias variantes de sequência de hsa-miR-16-5p, com a forma canônica exibida como a sequência mais à esquerda. Sublinhados representam “falta de” bases a partir da forma canônica. Variantes mais curtas do que a forma canônica, e certas formas mais longas mostram eficiência de bloqueio diminuída. Uma vez que estas variantes representam uma fração muito pequena das leituras totais (<2 %), não está claro se as chamadas bases representam variantes verdadeiras ou erros de sequenciamento.

[032]FIG. 14 Comparação lado a lado de abundância de hsa-miR-16-5p em biblioteca desbloqueada e biblioteca bloqueada usando bloqueador 3’ de hsa-miR- 15-5p.

[033]FIG. 15 Comparação lado a lado de abundância de hsa-miR-26a-5p em biblioteca desbloqueada e biblioteca bloqueada usando bloqueador 5’ de hsa-miR- 26a-5p.

[034]FIG. 16 Comparação lado a lado de abundância de hsa-miR-486-5p em biblioteca desbloqueada e biblioteca bloqueada usando bloqueador 5’ hsa-miR-486- 5p.

[035]FIG. 17 Comparação lado a lado de abundância de hsa-miR-16-5p em biblioteca desbloqueada e biblioteca bloqueada usando banco de bloqueadores.

[036]FIG. 18 Comparação lado a lado de abundância de hsa-miR-26a-5p em biblioteca desbloqueada e biblioteca bloqueada usando banco de bloqueadores.

[037]FIG. 19 Comparação lado a lado de abundância de hsa-miR-451a-5p em biblioteca desbloqueada e biblioteca bloqueada usando banco de bloqueadores.

[038]FIG. 20 Comparação lado a lado de abundância de hsa-miR-486-5p em biblioteca desbloqueada e biblioteca bloqueada usando banco de bloqueadores.

[039]FIG. 21 Efeito de bloquear hsa-miR-16-5p em reprodutibilidade e medição de expressão diferencial em amostras de plasma humano. Razão de mudanças foi calculado entre todos os pares de amostra possíveis (10) em ambas as bibliotecas desbloqueadas e de hsa-miR-16-5p. O log2 (razão de mudanças) para todos aqueles pares são apresentados nos mesmos eixos, com o log2 (razão de mudança) para a biblioteca desbloqueada no eixo x e o log2 (razão de mudança) para a biblioteca bloqueada de hsa-miR-16-5p no eixo y. Assim, cada ponto representa uma única combinação do par de miRNA-amostra. Apenas aqueles miRNAs para que ambas as amostras tivessem uma média de bases calculada de DESeq2 >10 foram apresentados. A média e desvio padrão do conjunto de 10 rô de Spearmans da correlação do razão de mudanças entre bibliotecas desbloquadas e bloqueadas de hsa-miR-16-5p é listado no desenho.

[040]FIG. 22 Uma forma de realização do ácido nucleico de bloqueio sem um hairpin loop no método de bloquear um miRNA. A FIG. 22A mostra ácido nucleico de bloqueio 5’. A FIG. 22B mostra um ácido nucleico de bloqueio 3’.

DESCRIÇÃO DETALHADA C. DEFINIÇÕES

[041]A menos que de outro modo definido, todos os termos (incluindo termos técnicos e científicos) usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica desta divulgação. Será entendido ainda que os termos, tais como aqueles definidos em dicionários comumente usados, devem ser interpretados como tendo um significado que seja compatível com o seu significado no contexto da especificação e não devem ser interpretados em um sentido idealizado ou excessivamente formal a menos que expressamente definido aqui. Funções ou construções bem conhecidas podem não ser descritas em detalhe para brevidade ou clareza.

[042]A terminologia usada aqui é para o propósito de descrever formas de realização particulares apenas e não é intencionada a ser limitativa. Tais como usadas aqui, as formas singulares “um/uma” e “o/a” são intencionadas a incluir também as formas plurais, a menos que o contexto indique claramente de outro modo.

[043]Os termos “primeiro”, “segundo” e semelhantes são usados aqui para descrever várias características ou elementos, mas estas características ou elementos não devem ser limitados por estes termos. Estes termos são apenas usados para distinguir uma característica ou elemento a partir de outra característica ou elemento. Assim, uma primeira característica ou elemento debatido abaixo pode ser denominado uma segunda característica ou elemento e, similarmente, uma segunda característica ou elemento debatido abaixo pode ser denominado uma primeira característica ou elemento sem divergir dos ensinamentos da presente divulgação.

[044]Com referência ao uso da(s) palavras(s) “compreendem” ou “compreende” ou “compreendendo” na descrição acima exposta e/ou nas seguintes reivindicações, essas palavras são usadas no entendimento básico e claro que devem ser interpretadas inclusivamente, ao invés de exclusivamente, e que cada uma dessas palavras devem ser interpretadas de modo a interpretar a descrição acima exposta e/ou as reivindicações seguintes.

[045]O termo “consistindo essencialmente em” significa que, além dos elementos recitados, o que é reivindicado também pode conter outros elementos (etapas, estruturas, ingredientes, componentes, etc.) que não afetam adversamente a operabilidade do que é reivindicado para seu propósito intencionado como estabelecido nesta divulgação. Com importância, este termo exclui tais outros elementos que adversamente afetam a operabilidade do que é reivindicado para seu propósito intencionado como estabelecido nesta divulgação, mesmo que tais outros elementos possam realçar a operabilidade do que é reivindicado para algum outro propósito.

[046]O termo “indivíduo”, “sujeito” ou “paciente”, tal como usado aqui, refere- se a qualquer animal, incluindo mamíferos, tais como camundongos, ratos, outros roedores, coelhos, cães, gatos, suínos, gado, ovelha, cavalos ou primatas, e seres humanos. O termo pode especificar macho ou fêmea ou ambos, ou excluir macho ou fêmea.

[047]Os termos “cerca de” e “aproximadamente” devem geralmente significar um grau aceitável de erro ou variação para a quantidade medida dada a natureza ou precisão das medições. Graus típicos exemplares de erro ou variação estão dentro de 20 por cento (%), preferivelmente dentro de 10 %, e mais preferivelmente dentro de 5 % de um dado valor ou faixa de valores. Para sistemas biológicos, o termo “cerca de” refere-se a um desvio padrão aceitável de erro, preferivelmente não mais do que 2 vezes de um dado valor. Quantidades numéricas fornecidas aqui são aproximadas a menos que estabelecido de outro modo, significando que o termo “cerca de” ou “aproximadamente” pode ser inferido quando não expressamente estabelecido.

[048]O termo “nucleotídeos”, tal como usado aqui, refere-se a quaisquer tais grupos conhecidos, naturais ou sintéticos. Inclui bases de DNA ou RNA convencionais (A, G, C, T, U), análogos de bases, por exemplo, inosina, 5- nitroindazol e outros, derivados de imidazol-4-carboxamida, pirimidina ou purina, por exemplo, bases de pirimidina modificada 6H,8H-3,4-di-hidropirimido[4,5- c][1,2]oxazin-7-ona (às vezes designadas bases “P” que lidam A ou G) e bases de purina modificada N6-metóxi-2,6-diaminopurina (às vezes designadas bases “K” que ligam C ou T), hipoxantina, N-4-metil desoxiguanosina, 4-etil-2’-desoxicitidina, análogos de nucleosídeo 4,6-difluorobenzimidazol e 2,4-difluorobenzeno, análogos de nucleosídeo de LNA funcionalizados por pireno, purinas e pirimidinas modificadas com deaza ou aza, pirimidinas com substituintes na posição 5 ou 6 e purinas com substituintes na posição 2, 6 ou 8, 2-aminoadenina (nA), 2-tiouracila (sU), 2-amino-6- metilaminopurina, O-6-metilguanina, 4-tio-pirimidinas, 4-amino-pirimidinas, 4- dimetilhidrazina-pirimidinas, O-4-alquil-pirimidinas e nucleobases hidrofóbicas que formam DNA duplex sem união de hidrogênio. Nucleobases podem ser reunidas por uma variedade de ligações ou conformações, incluindo ligações de fosfodiéster, fosforotioato ou metilfosfonato, ligações de peptídeo-ácido nucleico.

[049]O termo “polinucleotídeo”, tal como usado aqui, refere-se a um composto multimérico compreendendo nucleotídeos ligados juntos para formar um polímero, incluindo RNA, DNA, LNA e BNA convencionais, copolímeros de qualquer um dos acima expostos, e análogos destes.

[050]O termo “ácido nucleico”, tal como usado aqui, refere-se a um polinucleotídeo de fita simples ou um duplex de dois polinucleotídeos. Tais duplex não necessitam ser renaturados em todas as localizações, e podem conter lacunas ou ressaltos.

[051]O termo “nick”, tal como usado aqui, refere-se a uma descontinuidade em uma molécula de ácido nucleico de fita dupla onde não existe ligação de fosfodiéster entre nucleotídeos adjacentes de uma fita.

[052]O termo “miRNA” é usado aqui de acordo com seu significado habitual e simples na técnica, e refere-se a uma molécula de microRNA encontrada em eucariotas que está envolvida em regulação de gene à base de RNA. O termo será usado para referir-se à molécula de RNA de fita simples processada a partir de um precursor. MiRNAs individuais foram identificados e sequenciados em organismos diferentes, e eles receberam nomes. Os métodos e composições não devem ser limitados a miRNAs identificados no pedido, conforme eles são fornecidos como exemplos, não necessariamente como limitações da invenção.

[053]Ácidos nucleicos são “complementares” entre si, tais como usados aqui, quando uma sequência de nucleotídeo em uma fita de um ácido nucleico, devido à orientação de seus átomos de hidrogênio nucleotídicos, ligações de hidrogênio a outra sequência em uma fita de ácido nucleico oposta (certamente, uma fita de um ácido nucleico também pode ser auto-complementar). As bases complementares tipicamente são, em DNA, A com T e C com G, e em RNA, C com G e U com A. Complementaridade pode ser perfeita ou substancial/suficiente. Complementaridade perfeita entre dois ácidos nucleicos significa que os dois ácidos nucleicos podem formar um duplex em que a cada base no duplex é ligada a uma base complementar por anelamento de Watson-Crick. Complementaridade “substancial” ou “suficiente” significa que uma sequência em uma fita não é perfeitamente complementar a uma sequência em uma fita oposta, mas a união suficiente ocorre entre bases nas duas fitas para formar um complexo híbrido estável a um dado conjunto de condições de hibridização (por exemplo, concentração de sal e temperatura). Tais condições podem ser prognosticadas usando-se as sequências e modelos padrão para prever a Tm de fitas hibridizadas, ou por determinação empírica de Tm usando-se métodos estabelecidos. Tm refere-se à temperatura a qual uma população de complexos de hibridização formados entre duas fitas de ácido nucleico são 50 % desnaturados. A uma temperatura abaixo da Tm, a formação de um complexo de hibridização é favorecida, ao passo que uma temperatura acima da Tm, fusão ou separação das fitas no complexo de hibridização é favorecida.

[054]O termo “ligase”, tal como usado aqui, refere-se a uma enzima que catalisa a formação de uma ligação de fosfodiéster entre dois polinucleotídeos, ou entre as extremidades de um único polinucleotídeo. Ligases incluem ligases de polinucleotídeo de fita dupla dependente de ATP, ligases de DNA ou RNA de fita dupla dependente de NAD+ e ligases de polinucleotídeo de fita simples. Exemplos específicos de ligases incluem, mas não são limitados às ligases bacterianas tais como DNA ligase de E. coli e DNA ligase de Taq, DNA ligase termoestável Ampligase® (Epicentre® Technologies Corp., parte de Illumina®, Madison, Wis.), ligases de fago tais como T3 DNA ligase, T4 DNA ligase e T7 DNA ligase e mutantes destas e T4 RNA ligase 1 e T4 RNA ligase 2 e mutantes destas tais como proteínas de fusão Sso7, T4 RNA Ligase 2 truncada e mutada (K227Q). Nesta divulgação, o termo “DNA/RNA ligase” ou “RNA/DNA ligase” refere-se a uma ligase que catalisa a formação de uma ligação de fosfodiéster entre uma molécula de RNA e uma molécula de DNA. Exemplos de ligases de DNA/RNA incluem T4 DNA ligase e T4 RNA ligase 2.

[055]O termo “ligante” significa disponível para uma reação de ligação, ou um substrato adequado para uma ligase.

D. ÁCIDOS NUCLEICOS DE BLOQUEIO

[056]Um ácido nucleico de bloqueio 120 para o uso em reduzir a abundância de um micro-RNA (miRNA) não-alvo em uma biblioteca de miRNA é fornecido, incluindo: uma região de complementaridade de fita simples 130 em uma da extremidade 5’ do ácido nucleico de bloqueio 120 ou da extremidade 3’ do ácido nucleico de bloqueio 120, que se associa com uma região de ligação em uma primeira extremidade do miRNA indesejado 10; uma região formadora de hairpin loop 140 ou outra região de fita dupla 170 adjacente à região de complementaridade 130, em que todas as extermidades terminais do ácido nucleico de bloqueio 120 exceto uma não estão disponíveis para participar em reações de ligase. A extremidade terminal disponível será imediatamente adjacente ao miRNA quando o miRNA está associado à região de complementaridade 130, deixando um nick que pode ser depositado usando uma ligase apropriada. As extermidades terminais tornaram-se não disponíveis para participar em reações de ligase removendo-se ou mascarando-se o grupo fosfato 4’ ou grupo hidroxila 3’. Nesta divulgação, se a região de complementaridade 130 do ácido nucleico de bloqueio 120 for complementar à extremidade 5’ do miRNA indesejado 30 em questão, refere-se como um “ácido nucleico de bloqueio 5’”. Similarmente, se a região de complementaridade 130 do ácido nucleico de bloqueio for complementar à extremidade 3’ do miRNA indesejado 20 em questão, refere-se como um “ácido nucleico de bloqueio 3’”.

[057]Um primeiro aspecto do ácido nucleico de bloqueio 120 compreende uma região formadora de hairpin loop 140. Formas de realização do primeiro aspecto compreendem uma região de complementaridade de fita simples 130 em uma da extremidade 5’ do ácido nucleico de bloqueio 120 ou da extremidade 3’ do ácido nucleico de bloqueio 120, que se associa com uma região de ligação em uma primeira extremidade do miRNA indesejado 10 sob condições rigorosas, em que a dita primeira extremidade é a extremidade 5’ ou a extremidade 3’ do miRNA indesejado 20, e em que a região de complementaridade 130 tem uma extremidade terminal 132; uma região formadora de hairpin loop 140 adjacente à região de complementaridade, a região formadora de hairpin loop 140 tendo uma extremidade terminal ligante 136; e uma primeira porção de bloqueio 180 ligado à extremidade terminal da região formadora de hairpin loop 140, em que a dita primeira porção de bloqueio 180 pode não servir como um substrato para ligases. A presença de hairpin loop reduz o número de extermidades terminais que deve ser apresentado não disponível para reações de ligase. Portanto, tem a vantagem de simplificar o protocolo. Uma forma de realização do primeiro aspecto do ácido nucleico de bloqueio 120 é mostrada na FIG. 2.

[058]Um segundo aspecto do ácido nucleico de bloqueio 120 não necessita de ter uma região formadora de hairpin loop 140, mas ter uma região de fita dupla 170 que pode ser formada por uma segunda fita (ou por um hairpin loop ou outra estrutura da primeira fita). Formas de realização do segundo aspecto do ácido nucleico de bloqueio 120 compreendem: uma fita Crick 220; uma região de complementaridade de fita simples 130 em uma da extremidade 5’ da fita Crick 220 ou da extremidade 3’ da fita Crick 220, que se associa com uma região de ligação em uma primeira extremidade do miRNA indesejado 10 sob condições rigorosas, em que a dita primeira extremidade é a extremidade 5’ ou a extremidade 3’ do miRNA indesejado (30 e 20, respectivamente); uma região de fita dupla 170 na fita Crick 220 adjacente à região de complementaridade 130, a região de fita dupla 170 compreendendo uma fita Watson 230 que está associado à fita Crick 220; uma primeira porção de bloqueio 180 ligada à extremidade 3’ da fita Crick 220, em que a primeira porção de bloqueio 180 pode não servir como um substrato para ligases; uma segunda porção de bloqueio 190 ligada à extremidade 5’ da fita Crick 220, em que a segunda porção de bloqueio 190 pode não servir como um substrato para ligases; uma terceira porção de bloqueio 200 ligada à extremidade 3’ da fita Watson 230 se a região de complementaridade 130 for na extremidade 3’ da fita Crick 220, ou ligada à extremidade 5’ da fita Watson 230 se a região de complementaridade 130 for na extremidade 5’ da fita Crick 220, em que a terceira porção de bloqueio 200 pode não servir como um substrato para ligases; e uma extremidade terminal ligante 210 na fita Watson 230, a extremidade terminal ligante 210 localizada na extremidade 3’ da fita Watson 230 se a região de complementaridade 130 for na extremidade 5’ da fita Crick 220, ou na extremidade 5’ da fita Watson 230 se a região de complementaridade 130 for na extremidade 3’ da fita Crick 220. Uma forma de realização do segundo aspecto do ácido nucleico de bloqueio 120 é mostrada na FIG. 22.

[059]O miRNA é referido como “indesejado”, como uma aplicação útil do ácido nucleico de bloqueio 120 é reduzir a abundância de miRNAs sobre- representados em bibliotecas de miRNA, mas o ácido nucleico de bloqueio 120 pode ser usado para se ligar a uma extremidade de qualquer molécula de RNA para uma variedade de aplicações. O descritor “indesejado” não deve ser observado como uma indicação de que o ácido nucleico de bloqueio 120 não pode ou não deve ser usado com qualquer RNA ou tipo de RNA.

[060]A região de complementaridade 130 é descrita como de fita simples como deve ser não-renaturada de modo a anelar com o miRNA, que é fundamental para o seu funcionamento. Certamente, o ácido nucleico de bloqueio 120 pode ser preparado tal que a região de complementaridade 130 está associada com outro polinucleotídeo antes do uso (por exemplo, para auxiliar em estabilidade durante o armazenamento e prevenir a dimerização), e depois desnaturada em preparação para o uso. A região de complementaridade 130 será projetada para ser de comprimento suficiente para ser específica a seu(s) alvo(s) intencionado(s), mas suficientemente curta para se ligar facilmente à região de ligação na temperatura de renaturação. Algumas formas de realização da região de complementaridade 130 têm cerca de 5 a 50 nucleotídeos em comprimento. Outras formas de realização da região de complementaridade 130 têm cerca de 8 a 20 nucleotídeos em comprimento. Ainda em outras formas de realização da região de complementaridade 130 têm cerca de 10 a 15 nucleotídeos em comprimento. Em uma forma de realização específica do ácido nucleico de bloqueio 120, a região de complementaridade 130 tem 12 nucleotídeos em comprimento.

[061]A região de complementaridade 130 é descrita como sendo na extremidade 5’ ou na extremidade 3’ de seu polinucleotídeo associado para garantir que a extremidade terminal respectiva 210 esteja disponível para a ligação. É possível, entretanto, que um polinucleotídeo de bloqueio possa ser projetado para colocar a região de complementaridade 130 próxima à extremidade 3’ ou 5’, mas não na extremidade terminal 210 em si; em uma forma de realização, depois de anelar com o miRNA indesejado 10, a cauda não-renaturada pode ser cortada com uma endonuclease. Depois de tal remoção de endonuclease, e antes da ligação, a região de complementaridade 130 estaria de fato na extremidade 5’ ou 3’ do polinucleotídeo.

[062]A região de complementaridade 130 pode ser projetada para anelar com uma sequência conhecida na extremidade 3’ ou 5’ de um miRNA por aquele habilitado na técnica sem experimentação indevida. Milhares de miRNAs são conhecidos, e suas sequências podem ser pesquisadas usando fontes online tais como PHENOMIR 2.0 (fornecido pelo Helmholtz Zentrum München - German Research Center for Environmental Health IBIS Institute of Bioinformatics and Systems Biology, e disponível em http://mips.helmholtz- muenchen.de/phenomir/main/list?query=&detailedquery1=&detailedquery2=&search scope1=&searchscope2=&logic=&selectedview=mirs&sort=pm.mir.name&manorder= asc&offset=11850&max=30) e MIRBASE.org, administrado pelo laboratório de Griffiths-Jones na Faculdade de Ciências da Vida, Universidade de Manchester.

[063]Por exemplo, uma das moléculas de miRNA 10 sobre-representadas comumente em bibliotecas de sequenciamento de miRNA é mir-16, um miRNA que foi implicado no desenvolvimento de leucemia linfocítica de células B além de cânceres de mama, cólon, cérebro, pulmão, próstata e estômago. mir-16 é expressado em muito tipos de tecido e é frequentemente sobre-representado em bibliotecas de sequenciamento de miRNA. Consequentemente, a capacidade de diminuir a frequência global de mir-16 em bibliotecas de sequenciamento seria benéfica. Outros miRNAs sobre-representados ou abundantes incluem, mas não são limitados a mir-486, mir-451a e mir-26. A Tabela 1 mostra as sequências de nucleotídeo de vários ácidos nucleicos de bloqueio (DNAs) 120 e seus miRNAs 10 alvos respectivos. As regiões complementares 130 de cada são mostradas em fonte branca em fundo preto. As regiões formadoras de stem e loop de cada são mostradas em sublinhado. Observe a sequência consenso entre todos os quatro ácidos nucleicos de bloqueio na Tabela 1 nas posições 13 - 58 (SEQ ID NO: 5). Também observe que todas as SEQ ID NO. 1 - 4 têm regiões formadoras de stem e loop, e assim formam ácidos nucleicos de bloqueio tendo apenas uma fita. Deve ser observado que em algumas situações um único ácido nucleico de bloqueio 120 pode reduzir eficazmente a frequência de mais do que um miRNA 10 indesejado, sobre- representado ou abundante simultaneamente.

[064]Considera-se que a região de complementaridade 130 de qualquer um dos ácidos nucleicos de bloqueio 5’ 120 compartilhará um certo nível de identidade com posições 1 - 12 de uma das SEQ ID NO: 1 - 4. O certo nível de identidade pode ser selecionado de pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % e 100 %. Em uma outra forma de realização, o certo nível de identidade é maior do que 95 %. Em ainda outras formas de realização específicas, o nucleotídeo de bloqueio compreende uma das SEQ ID NO: 1 - 4.

[065]Algumas formas de realização de bloqueadores de ácido nucleico 3’ específicos para hsa-miR-16-5p compreendem uma sequência com um certo nível de identidade com SEQ ID NO: 13. O certo nível de identidade pode ser selecionado de pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % e 100 %.Em uma outra forma de realização, o certo nível de identidade é maior do que 95 %. A extremidade 3’ da SEQ ID NO: 13 é a região de complementaridade 130 para uma região de ligação na extremidade 3’ de hsa-miR-16-5p.

[066]A região de complementaridade 130 irá anelar com uma região de ligação na primeira extremidade do miRNA indesejado 10 sob condições rigorosas. Tal rigidez é fundamentada na temperatura de fusão (Tm) do complexo de ligação ao ácido nucleico, como ensinado em Berger e Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, 152, Academic Press, San Diego Calif.). A Tm de um duplex renaturado depende da composição de base do duplex, o desajuste da frequência de base, e a concentração iônica do meio de reação. A Tm de um duplex pode ser calculada por aqueles de habilidade comum na técnica com base nestes dois fatores usando algoritmos aceitos. Rigidez máxima tipicamente ocorre a cerca de 5 °C abaixo de Tm; rigidez alta a cerca de 5 a 10 °C abaixo de Tm; rigidez intermediária a cerca de 10 a 20 °C abaixo de Tm; e rigidez baixa a cerca de 20 a 25 °C abaixo de Tm. Como será entendido por aqueles de habilidade na técnica, uma hibridização de rigidez máxima pode ser usada para identificar ou detectar sequências de nucleotídeo idênticas enquanto que uma hibridização de rigidez intermediária (ou baixa) pode ser usada para identificar ou detectar sequências similares ou relacionadas. O termo “rigorosa” por si só neste contexto refere-se à rigidez intermediária. Termos tais como maximamente rigorosa, altamente rigorosa e deficientemente rigorosa, referem-se às condições de rigidez máxima, rigidez alta e rigidez baixa respectivamente.

[067]Um exemplo de condições maximamente rigorosas é fornecido no exemplo de trabalho abaixo. Especificamente, as condições rigorosas podem ser as condições apresentadas na seção “Métodos Suplementares” do Exemplo de Trabalho 1, sob “Ligação de Bloqueio”. Observe que a temperatura de hibridização nesse exemplo foi 30 °C, enquanto que a Tm calculada do duplex entre o ácido nucleico de bloqueio 120 e o miRNA foi de 35 °C.

[068]A região de complementaridade 130 funcionará geralmente para anelar sob condições rigorosas com pelo menos 5 bases consecutivas no miRNA. Exemplos das sequências de miRNAs sobre-representados em bibliotecas de miRNA são fornecidos nas SEQ ID NO: 6 - 11. Em formas de realização do ácido nucleico de bloqueio 120 úteis para bloquear estes miRNAs, a região de complementaridade 130 pode anelar sob condições rigorosas com pelo menos 5 bases consecutivas de pelo menos uma das SEQ ID NO: 6 - 11. Em algumas tais formas de realização, a região de complementaridade 130 pode anelar sob condições rigorosas com pelo menos 8 bases consecutivas de pelo menos uma das SEQ ID NO: 6 - 11. Em outras formas de realização, a região de complementaridade 130 pode anelar sob condições rigorosas com pelo menos 10 bases consecutivas de pelo menos uma das SEQ ID NO: 6 - 11. Em outras formas de realização, a região de complementaridade 130 pode anelar sob condições rigorosas com posições 2 - 8 de pelo menos uma das SEQ ID NO: 6 - 11 (SEQ ID NO: 12). Em formas de realização específicas, a região de complementaridade 130 pode anelar sob condições rigorosas com posições 1 - 9 de pelo menos uma das SEQ ID NO: 6 - 11.

[069]Em outras formas de realização do ácido nucleico de bloqueio 120, a região de complementaridade 130 irá anelar com uma região de ligação na primeira extremidade do miRNA indesejado 10 sob condições altamente rigorosas. Em ainda outras formas de realização do ácido nucleico de bloqueio 120, a região de complementaridade 130 irá anelar com uma região de ligação na primeira extremidade do miRNA indesejado 10 sob condições maximamente rigorosas.

[070]As porções de bloqueio são porções que não estão disponíveis para as reações de ligação, isto é, elas podem não servir como substratos para ligases. Várias ligases conhecidas são capazes de ligar ácidos nucleicos específicos, mas não outros. Todas as ligases exigem que os nucleotídeos a ser ligados tenham um grupo hidroxila 3’ disponível e um grupo fosfato 5’ disponível. Algumas formas de realização das porções de bloqueio são nucleotídeos a partir dos quais o grupo hidroxila 3’ foi removido ou o grupo fosfato 5’ foi removido (ou possivelmente ambos). As porções de bloqueio também podem ser grupos não-nucleotídicos ligados ao nucleotídeo terminal na fita. Tais grupos não-nucleotídicos incluem “espaçadores” tais como espaçador C3 (fosforamidita), Espaçador 9 (trietileno glicol) e Espaçador 18 (hexa-etilenoglicol). Outros espaçadores não-nucleotídicos podem incluir um grupo propila, um grupo propanol, outros álcoois orgânicos e outros compostos glicol. Exemplos de porções de bloqueio de nucleotídeo incluem um desoxinucleotídeo invertido, um didesoxinucleotídeo e um didesoxinucleotídeo invertido. A primeira, segunda e terceira porções de bloqueio quando presentes podem ser as mesmas porções, ou elas podem ser independentemente selecionadas, desde que cada uma impeça eficazmente o polinucleotídeo associado de se submeter à ligação.

[071]A porção de bloqueio pode ser ligada direta ou indiretamente ao ácido nucleico de bloqueio 120. Se ligado indiretamente, um grupo ligante pode estar presente entre o grupo de bloqueio e o nucleotídeo terminal. Tais grupos ligantes podem incluir, por exemplo, Espaçador 9 (trietileno glicol) e Espaçador 18 (hexa- etilenoglicol).

[072]Ao contrário, o ácido nucleico de bloqueio 120 também tem uma extremidade terminal ligante (136 ou 210). No primeiro aspecto (hairpin loop) do ácido nucleico, a extremidade terminal ligante 136 é encontrata na extremidade da região formadora de hairpin-loop 140. No segundo aspecto, a extremidade terminal ligante 210 é encontrada em uma extremidade da fita Watson 230. A extremidade terminal ligante (136 ou 210) é intencionada a ser ligada a uma das extremidades do miRNA. A extremidade terminal ligante (136 ou 210) será em muitas formas de realização um nucleotídeo terminal com um grupo hidroxila 3’ disponível, um grupo fosfato 5’ disponível, ou ambos. Em algumas formas de realização do ácido nucleico de bloqueio 120, a extremidade terminal ligante (136 ou 210) é um nucleotídeo natural (por exemplo, A, T, C, G, U) com um grupo hidroxila 3’ disponível, um grupo fosfato 5’ disponível, ou ambos. Em outras formas de realização, a extremidade terminal ligante (136 ou 210) é um nucleotídeo não-natural com um grupo hidroxila 3’ disponível, um grupo fosfato 5’ disponível, ou ambos. Um grupo está “disponível” se tiver pelo menos um átomo de oxigênio que pode formar uma ligação de fosfodiéster, e não é estericamente impedido (ou de outro modo impedido) de fazer isso.

[073]Algumas formas de realização do ácido nucleico de bloqueio 120 compreendem a região formadora de hairpin. A presença da região formadora de hairpin que reduz o número de extermidades terminais que exige bloqueio para evitar ligação indesejada. Um hairpin loop ocorre quando duas regiões da mesma fita, usualmente complementar em sequência de nucleotídeo quando lida em direções opostas, par de base para formar um hélice dupla que termina em um loop não anelado. A formação de uma estrutura stem-loop é dependente da estabilidade das regiões de hélice e loop. O primeiro pré-requisito é a presença de uma sequência que pode dobrar-se sobre si mesma para formar uma hélice dupla anelada. A estabilidade desta hélice é determinada por seu comprimento, o número de desajustes ou saliências contém (um pequeno número é tolerável, especialmente em uma hélice longa) e a composição de base da região anelada. A estabilidade do loop também influencia a formação da estrutura stem-loop. Loops que são menores do que três bases longas são estericalmente impossíveis e não se formam. Grandes loops sem nenhuma estrutura secundária própria (tal como anelamento pseudoknot) também são instáveis. O comprimento de loop ideal tende a ser cerca de 4 a 8 bases longas. Loops de 4 pares de bases comumente usados (“tetraloops”) incluem ANYA, CUYG, GNRA, UMAC e UNCG. Estruturas de hairpin loop adequadas podem ser projetadas por aqueles de habilidade comum na técnica. Formas de realização específicas da região formadora de hairpin loop 140 compreendem uma sequência com um certo nível de identidade com SEQ ID NO: 5. O certo nível de identidade pode ser selecionado de pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % e 100 %. Em uma outra forma de realização, o certo nível de identidade é maior do que 95 %.

[074]No segundo aspecto do bloqueador de ácido nucleico, uma região de fita dupla está presente que não é necessariamente uma estrutura formadora de hairpin loop. É descrito como tendo uma fita Watson 230 e uma fita Crick 220, embora em alguns casos pode ser a mesma fita dobrada sobre si mesma. Os termos “Watson” e “Crick” não têm significado descritivo ou restritivo, exceto para significar que as duas fitas são pelo menos parcialmente renaturadas entre si. Na absência de um hairpin loop, porções de bloqueio, tais como descritas acima, estão presentes em ambas extremidades da fita Crick 220. Uma porção de bloqueio também estará presente na extremidade da fita Watson 230 mais distante da região de fita simples. Neste contexto particular, as porções de bloqueio nas duas extermidades terminais (em Watson e Crick) mais distantes da região de fita simples podem ser incorporadas em uma ligação polinucleotídica de Watson e Crick. Tal como descrito acima, um hairpin loop pode atender a esta função, mas a ligação polinucleotídica de Watson e Crick não necessita ter uma estrutura hairpin loop para atender o propósito de tornar as duas extermidades terminais mais distantes da região de complementaridade de fita simples 130 não disponível para a ligação.

[075]No segundo aspecto do nucleotídeo de bloqueio, a fita Watson 230 tem apenas uma porção de bloqueio, referida como a “terceira porção de bloqueio” (200). Tal como mostrada na FIG. 22, a terceira porção de bloqueio 200 será na extremidade terminal de Watson mais distante da região de complementaridade de fita simples 130. Conforme a extremidade terminal de Watson que é mais próxima da região de complementaridade 130 deve ser ligada com o miRNA, não será bloqueada.

E. MÉTODOS DE EXCLUIR miRNA DE RT-PCR

[076]Um método de prevenir o miRNA indesejado 10 de participar de RT- PCR é fornecido. Em uma forma de realização geral, o método compreende anelar qualquer um dos ácidos nucleicos de bloqueio 120 descritos acima à região de ligação do miRNA indesejado 160. Depois de anelar, o ácido nucleico de bloqueio 120 pode ser ligado à “primeira extremidade” do miRNA onde a região de ligação 160 está localizada. Conforme deve ser evidente a partir dos esquemas mostrados nas FIGS. 2 e 22, a região de ligação 160 será na extremidade 5’ do miRNA se a região de complementaridade 130 for na 5’ do ácido nucleico de bloqueio 120, e a região de ligação 160 será na extremidade 3’ do miRNA se a região de complementaridade 130 for na extremidade 3’ do ácido nucleico de bloqueio 120.

[077]A etapa de renaturamento geralmente será realizada sob pelo menos condições intermediárias rigorosas. Quanto maior a estringência, menos provável será que a região de complementaridade 130 se liga a um miRNA não intencionado. Em algumas formas de realização do método, a etapa de renaturamento será realizada sob condições altamente rigorosas ou condições maximamente rigorosas.

[078]A etapa de ligação é realizada usando a ligase apropriada. Se o ácido nucleico de bloqueio 120 for um RNA, então uma RNA/RNA ligase deve ser usada. Se o ácido nucleico de bloqueio 120 for um DNA, então uma DNA/RNA ligase deve ser usada. Muitas ligases de ambos os tipos são comercialmente disponíveis, e suas propriedades e protocolos para seu uso são conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica. Se o ácido nucleico de bloqueio 120 for um DNA, então a ligase pode ser, por exemplo, T4 DNA ligase, que liga RNA ao DNA quando um RNA/DNA duplex foi formado.

[079]O método pode ser realizado em qualquer RNA e, tal como explicado acima, o termo “indesejado” para caracterizar o miRNA refere-se apenas a um uso intencionado do método, e não limita a estrutura ou fonte do RNA envolvido. Algumas formas de realização do método são para o propósito de impedir um ou mais miRNA indesejados 10 de participar de RT-PCR, e em tais formas de realização o miRNA pode ser “indesejado” uma vez que é um miRNA muito abundante ou super-representado em uma amostra. Exemplos de tal miRNA abundante incluem mir-16, mir-486, mir-451 e mir-26. Consequentemente, em algumas formas de realização do método, o miRNA indesejado 10 é selecionado a partir daqueles miRNAs. Em alguns casos, a região de complementaridade 130 e condições de renaturamento podem ser projetadas para permitir a região de complementaridade 130 anelar com mais do que um miRNA, e quaisquer tais miRNAs adicionais podem ser ensinados para ser adequados no método por si mesmos.

[080]O produto do método será um miRNA que é renaturado para o polinucleotídeo de bloqueio (“complexo de miRNA bloqueado” 500). Tal complexo de miRNA bloqueado 500 será incapaz de participar de pelo menos uma de uma reação de ligação 5’ ou uma reação de ligação 3’.

F. REDUZIR A ABUNDÂNCIA DE miRNA INDESEJADO EM UMA BIBLIOTECA DE miRNA

[081]Um método de reduzir a abundância de um miRNA indesejado 10 em uma biblioteca de miRNA é fornecido, usando qualquer um dos ácidos nucleicos de bloqueio 120 fornecidos acima. Uma forma de realização geral do método compreende as seguintes etapas em nenhuma ordem particular: (a) purificar RNA a partir de uma amostra compreendendo uma pluralidade de miRNAs; (b) introduzir um adaptador de ácido nucleico adenilado 40 e uma primeira DNA/RNA ligase 50 sob condições para permitir o adaptador de ácido nucleico adenilado 40 se ligar à extremidade 3’ da pluralidade de miRNAs; (c) introduzir qualquer um dos ácidos nucleicos de bloqueio 120 divulgados acima sob condições para permitir a região de complementaridade 130 do ácido nucleico de bloqueio 120 anelar a região de ligação do miRNA indesejado 160, para produzir uma amostra bloqueada 450; (d) introduzir um adaptador de RNA 70 e uma RNA ligase 80 sob condições para permitir o adaptador de RNA 70 ligar a extremidade 5’ da pluralidade de miRNAs; (e) introduzir uma transcriptase reversa à amostra bloqueada 450 sob condições para permitir transcrição reversa da pluralidade de miRNAs, para produzir uma amostra de cDNA; e (f) realizar PCR na amostra de cDNA para produzir a biblioteca de miRNA com abundância reduzida do miRNA indesejado 10.

[082]As etapas tais como a purificação de RNA de uma amostra biológica, ligação dos adaptadores à extremidade 3’ e extremidade 5’ do miRNA, transcrição reversa in vitro, e PCR podem ser realizadas de acordo com qualquer protocolo adequado conhecido na técnica. Alguns protocolos exemplares podem ser encontrados em TruSeq®RNA Access Library Prep Guide, Illumina, Inc., San Diego, CA (2014).

[083]Algumas formas de realização do método compreendem introduzir uma segunda DNA/RNA ligase 150 sob condições para permitir o ácido nucleico de bloqueio 120 se ligar a uma da extremidade 5’ e a extremidade 3’ do miRNA indesejado (30 e 20, respectivamente). Como é evidente nas FIGS. 2 e 22, o ácido nucleico de bloqueio 120 se ligará à extremidade do miRNA onde a região de ligação 160 está localizada.

[084]O adaptador de ácido nucleico adenilado 40 pode ser qualquer tipo de ácido nucleico, incluindo, mas não limitado a DNA ou RNA. Adaptadores de DNA adenilados 40 têm a vantagem de estabilidade superior, e não são vulneráveis a RNAses onipresentes. Algumas formas de realização do adaptador de ácido nucleico adenilado 40 compreendem um sítio de ligação ao iniciador da transcriptase reversa. Como é conhecido na técnica, enzimas de transcriptase reversa necessitam de ligação de um iniciador antes de RNA de transcrição reversa. A maioria das enzimas de transcriptase reversa conhecidas usam tRNAs como iniciadores. Em retrovírus, pararetrovírus de plantas, e transposões contendo repetições terminais longas, transcrição reversa é iniciada por tRNAs específicos. Todos estes retroelementos contêm um sítio de ligação do iniciador complementar ao tRNA iniciador. Os tRNAs mais amplamente usados como iniciadores são tRNA(Trp), tRNA(Pro), tRNA(1,2Lys), tRNA(3Lys), tRNA(iMet). Outros tRNAs tais como tRNA(Gln), tRNA(Leu), tRNA(Ser), tRNA(Asn) e tRNA(Arg) são também ocasionalmente usados como iniciadores. Nos retrovírus e pararetrovírus de plantas, o sítio de ligação do iniciador é complementar à extremidade 3’ do tRNA iniciador. No caso de retrotransposões, o sítio de ligação do iniciador é complementar à extremidade 3’ ou a uma região interna do tRNA iniciador. Aqueles de habilidade comum na técnica selecionarão o sítio de ligação de iniciador de transcriptase reversa no adaptador de ácido nucleico adenilado 40 para ligar qualquer iniciador é conhecido funcionar com a transcriptase reversa que foi selecionada para o método.

[085]Se um ácido nucleico de bloqueio 5’ 120 é usado, o adaptador de ácido nucleico adenilado 40 pode ser ligado ao miRNA antes de ou depois de anelar ao ácido nucleico de bloqueio 120. Nesta situação o adaptador de ácido nucleico adenilado 40 frequentemente será ligado à extremidade 3’ do miRNA antes da ligação do ácido nucleico de bloqueio 120, para evitar a necessidade de reduzir ATP residual a partir da etapa anterior. Ao usar um ácido nucleico de bloqueio 5’ 120, a etapa em que o ácido nucleico de bloqueio 120 é ligado ao miRNA precederá a ligação do adaptador de RNA 70 à extremidade 5’ do miRNA; de outro modo o bloqueio seria ineficaz.

[086]Se um ácido nucleico de bloqueio 3’ 120 for usado, o adaptador de ácido nucleico adenilado 40 deve ser ligado à extremidade 3’ do miRNA depois do renaturamento ao ácido nucleico de bloqueio 120, ou senão o bloqueio seria ineficaz. Em tais casos pode ser desejável remover o excesso de ATP deixado a partir da ligação do ácido nucleico de bloqueio 120 antes de ligar o adaptador de ácido nucleico adenilado 40 à extremidade 3’ do miRNA. Isto pode ser feito por qualquer um de vários métodos. Por exemplo, a amostra pode ser conduzida através de uma coluna cromatográfica depois de ligar o ácido nucleico de bloqueio 120 à extremidade 3’ do miRNA, e antes de ligar o adaptador de ácido nucleico adenilado 40 à extremidade 3’ do miRNA. O excesso de ATP também pode ser removido por reação química, eletroforese, ou outros métodos. Quando um ácido nucleico de bloqueio 3’ 120 é usado, a ligação do adaptador de RNA 70 à extremidade 5’ do miRNA pode ocorrer antes de ou depois de ligação do ácido nucleico de bloqueio 120 à extremidade 3’ do miRNA.

[087]As etapas de transcrição reversa da amostra bloqueada 450 e PCR amplificando a amostra de cDNA ocorrerão nessa ordem, e ocorrerão depois das etapas marcadas (a) a (d) acima.

[088]O renaturamento será realizado sob condições rigorosas, tal como descrito em seções anteriores desta divulgação. Em algumas formas de realização do método, o renaturamento será realizado sob condições altamente rigorosas ou condições maximamente rigorosas. A criação de um duplex entre o nucleotídeo de bloqueio e o miRNA deixará um nick entre eles que será ligado pela DNA/RNA ligase.

[089]A primeira DNA/RNA ligase 50 será uma ligase capaz de ligar o adaptador de ácido nucleico adenilado 40 a um RNA. Um exemplo é T4 RNA ligase 2 truncada. A versão truncada tem a propriedade desejável de exigir que o DNA tenha uma extremidade terminal 5’ adenilada, e assim funcionará para ligar especificamente um adaptador de ácido nucleico adenilado 40 à extremidade 3’ do miRNA. De modo a evitar produtos de ligação indesejados, o adaptador de ácido nucleico adenilado 40 pode ter uma porção de bloqueio na sua extremidade 3’. A porção de bloqueio pode ser qualquer que seja descrita acima como adequada para o uso no ácido nucleico de bloqueio 120.

[090]A segunda DNA/RNA ligase 150 será uma ligase capaz de ligar a região de ligação 160 do miRNA à região de fita dupla 170 do ácido nucleico de bloqueio 120. Como tal, é preferivelmente capaz de ligar um nick em um duplex entre um polinucleotídeo de DNA e um polinucleotídeo de RNA onde uma saliência existe. Um exemplo específico de tal DNA/RNA ligase é T4 DNA ligase.

[091]A RNA ligase 80 será uma ligase capaz de ligar a extremidade 5’ do miRNA à extremidade 3’ do adaptador de RNA 70. Quaisquer tais ligases conhecidas na técnica podem ser usadas. Em algumas formas de realização do método, a RNA ligase 80 será T4 RNA ligase 1, que é capaz de ligar RNA e DNA de fita simples assim como pirofosfatos de dinucleosídeo.

[092]O adaptador de RNA 70 serve para fornecer um sítio de ligação do iniciador conhecido durante a PCR. Consequentemente, pode corresponder em comprimento a um comprimento adequado para um sítio de ligação do iniciador. Várias formas de realização do adaptador de RNA 70 podem ter comprimentos selecionados de 5 a 30 bases e 18 a 22 bases.

[093]A biblioteca de miRNA com abundância reduzida do miRNA indesejado 10 que é um produto do método é também fornecido. Neste contexto, “abundância reduzida” refere-se a que há significantemente menos do miRNA indesejado na biblioteca de miRNA do que seria observado em uma biblioteca da mesma amostra ou uma amostra similar em que nenhum bloqueador é usado. As FIGS. 14 a 20 são ilustrações claras de tal abundância reduzida. Em algumas formas de realização da biblioteca de miRNA, a abundância do miRNA indesejado foi reduzida por pelo menos 50 %. Em outra forma de realização da biblioteca de miRNA, a abundância de miRNA indesejado foi reduzida pelo menos por uma quantidade selecionada do grupo consistindo em: 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97,5 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99 % e 100 %. Por outras palavras, a abundância reduzida pode ser pelo menos uma redução de 2 vezes em abundância. Em algumas formas de realização do método, a abundância reduzida pode ser pelo menos uma redução de 4 vezes, pelo menos uma redução de 6 vezes, ou pelo menos uma redução de 8 vezes.

G. KITS

[094]Os kits são fornecidos para reduzir a frequência de um miRNA em uma biblioteca de miRNA, compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos de bloqueio 120 divulgados acima. O kit pode ainda compreender os reagentes, tampões, enzimas, livretos de instruções, controles positivos e negativos e outros materiais úteis ou necessários para realizar os métodos aqui descritos. Tais materiais adicionais podem incluir aqueles úteis para a ligação de RNA/RNA, ligação de RNA/DNA, PCR, transcrição reversa, hibridização in situ, e purificação de RNA. Exemplos não limitantes específicos de componentes de kit adicionais incluem um recipiente de qualquer um dos seguintes: DNA/RNA ligase 610 capaz de ligar DNA ao RNA quando renaturado (por exemplo, T4 DNA ligase 620); RNA/RNA ligase 630 (por exemplo, T4 RNA ligase 1 (640)); uma RNA/DNA ligase 650 (por exemplo, T4 RNA ligase 2 truncada (660)); uma pluralidade de iniciadores de DNA 680; uma solução de nucleotídeo 690; um tampão de PCR 700; uma DNA polimerase termofílica 710, um adaptador de ácido nucleico adenilado 720, e um adaptador de RNA 730. Os componentes do kit adicionais listados podem ser quaisquer que são descritos como adequados para os métodos acima. Um “recipiente do” componente listado pode ser qualquer tipo de recipiente como pode ser facilmente projetado por aquele de habilidade comum na técnica. O recipiente pode conter mais do que um componente listado, ou pode conter outros componentes além dos listados. Em algumas formas de realização do kit, o recipiente contém apenas o componente listado para a exclusão de outros (embora não necessariamente à exclusão de substâncias inativas tais como tampões, solventes, etc.). Tal como um resultado, referência a um kit compreendendo “um recipiente de X e um recipiente de Y” deve ser lido para abranger um kit compreendendo dois recipientes separados contendo X e y respectivamente, e um kit compreendendo um recipiente contendo X e Y. Em algumas formas de realização do kit, um determinado componente pode ter seu próprio recipiente.

H. ÁCIDOS NUCLEICOS

[095]Moléculas de ácido nucleico são fornecidas para o uso nos ácidos nucleicos de bloqueio 120, métodos e kits acima. Estes incluem um ácido nucleico compreendendo uma sequência tendo pelo menos um certo nível de identidade com qualquer uma de SEQ ID NO: 1 - 4 e 13. O nível de identidade pode ser > 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % e 100 %. Em uma forma de realização específica o nível de identidade é > 95 %. Os ácidos nucleicos também incluem aqueles que se renaturam sob condições rigorosas com qualquer um dos anteriores. Algumas formas de realização do renaturamento do ácido nucleico a qualquer um dos anteriores sob condições altamente rigorosas. Em algumas outras formas de realização do ácido nucleico, o ácido nucleico associa-se a qualquer um dos anteriores sob condições maximamente rigorosas. Em uma forma de realização específica do ácido nucleico, o ácido nucleico é o complemento exato a qualquer um dos ácidos nucleicos anteriores. Estas moléculas podem ser qualquer tipo de ácido nucleico, incluindo copolímeros de RNA, DNA, LNA, BNA, de qualquer um dos anteriores e análogos dos mesmos. Em uma forma de realização específica, o ácido nucleico é DNA.

[096]Um complexo de miRNA bloqueado 500 também é fornecido, compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos de bloqueio 120 divulgados acima, e o miRNA indesejado 10 renaturado à região de complementaridade 130. Em algumas formas de realização do complexo de miRNA bloqueado, o ácido nucleico de bloqueio 120 é ligado à primeira extremidade do miRNA. Algumas formas de realização do complexo de miRNA bloqueado 500 são o produto de qualquer um dos métodos de impedir um micro-RNA (miRNA) indesejado de participar de RT-PCR fornecido acima. Como tais métodos podem ser usados para evitar RT-PCR em miRNAs muito abundantes ou super-representados em uma amostra, o miRNA pode ser qualquer um de mir-16, mir-15a, mir-15b, mir-195, mir- 424, mir-497, mir-486, mir-451 e mir-26. O miRNA pode compreender uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 6 (miR-16), 7 (miR-15a), 8 (miR-15b), 9 (miR- 195), 10 (miR-424), 11 (miR-497), e 12 (posições de consenso 2-8 do anterior).

[097]Organismos e vetores compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos acima também são fornecidos. Exemplos de usos para tais organismos e vetores são produção dos ácidos nucleicos, clonagem dos ácidos nucleicos e armazenamento estável destes. Muitos vetores adequados são conhecidos na técnica, tais como vírus, plasmídeos, cosmídeos, fosmídeos, fagomídeos, cromossomos artificiais, cromossomos artificiais de levedura, cromossomos artificiais humanos, vetores de transformação de planta e lipossomas. Os organismos unicelulares são particularmente úteis em clonagem, explicação e na manutenção de ácidos nucleicos de interesse. Modelo de organismos unicelulares que são comumente usados para este propósito incluem leveduras, outros fungos, bactérias, protistas e arqueias. Modelo de organismos específicos são bem conhecidos na técnica, e incluem bactérias tais como Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis, Mycoplasma genitalium, e vários Synechocystis sp.; protistas tais como Dictyostelium discoideum, Tetrahymena thermophila, Emiliania huxleyi, e Thalassiosira pseudonana; e fungos tais como Aspergillus sp., Neurospora crassa, Saccharomyces cerevisiae, e Schizosaccharomyces pombe.

I. EXEMPLOS I. Exemplo de Trabalho #1: Ligação de Ácidos Nucleicos de Bloqueio à Extremidade 5’ de miRNA MATERIAIS E MÉTODOS Isolamento de RNA Total

[098]O protocolo para coleta de amostras de sangue periférico foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional na Universidade do Alabama em Birmingham, e todos os doadores forneceram consentimento informado por escrito. O sangue foi coletado em tubos de EDTA. Dentro de 30 min de coleta, o plasma foi isolado (~5 ml) e armazenado a -80 °C. Um mililitro de plasma foi centrifugado a 14.000 de força centrífuga relativa por 15 min e RNA total foi isolado a partir do sobrenadante usando o Kit de Purificação de RNA Exossomal e Circulante de Soro/plasma (Formato de Iodo) (Norgen Biotek) seguindo as instruções do fabricante. O eluato deste kit foi ainda concentrado usando o Kit de Concentração e Limpeza de RNA (Norgen Biotek) usando 20 μl de tampão de eluição para coletar o RNA.

Sequenciamento de RNA pequeno e bloqueio de miRNA

[099]O RNA total isolado contendo miRNA foi convertido para bibliotecas de sequenciamento de cDNA de acordo com o método descrito em Vigneault et al. (2012) e Eminaga et al. (2013), com modificação (o protocolo total pode ser encontrado em Métodos Suplementares). Brevemente, para cada biblioteca, 4 μl de RNA isolado foram combinados com um μl de 10 μl de adaptador 3’ e 1 μl de T4 RNA ligase 2 truncada (NEB) no tampão apropriado por 1 h. Simultaneamente, 1 μl de oligonucleotídeo de bloqueio de miRNA 0,5 μM foi incubado por 5 min a cada uma das seguintes temperaturas: 95 °C, 65 °C, 55 °C, 45 °C e 35 °C para garantir a formação apropriada da estrutura hairpin. Em seguida, o oligonucleotídeo de bloqueio incubado foi adicionado ao produto de ligação do adaptador 3’ e incubado por 1 h a 30 °C e 15 min a 65 °C na presença de T4 DNA Ligase (NEB) no tampão apropriado para anelar e bloquear o miRNA alvejado de reações adicionais. Um microlitro de iniciador de transcrição reversa 10 μM foi renaturado ao produto de ligação do adaptador 3’ por 5 min a 75 °C, 30 min a 37 °C e 15 min a 25 °C antes da adição do adaptador 5’ de modo a reduzir a formação de produtos de adaptadores- dímero. Um microlitro de adaptador 5’ agrupado 20 μM foi incubado por 2 min a 70 °C e, depois ligado com T4 RNA Ligase 1 (NEB) a cada produto de reação por 1 h a 25 °C. Os produtos de reação ligados foram transcritos reversos usando SuperScript II (Invitrogen) e amplificados por intermédio de PCR usando Phusion High-Fidelity PCR Master Mix (NEB). As condições de ciclagem térmica foram 94 °C por 30 s, seguido por 15 ciclos de 94 °C por 10 s e 72 °C por 45 s e uma extensão final a 65 °C por 5 min.

[0100]As bibliotecas foram limpas e concentradas usando um Kit de Purificação de PCR MinElute (Qiagen), seguindo as instruções do fabricante, e eluídas em um volume final de 20 μl. As bibliotecas foram separadas em um gel de acrilamida de TBE-Ureia a 10 % (Bio-Rad) com tampão quente por 50 min. A banda correspondente a miRNAs (-135 a 145 pares de base) foi excisada, eluída a partir do gel, precipitada e recolocada em suspensão em 10 μl de Tampão EB (Qiagen). A concentração da biblioteca de RNA pequena foi quantificada pelo Kit de Quantificação da Biblioteca - Illumina/ABI Prisma (KAPA Biosystems) e sequenciada em um HiSeq2000 ou aMiSeq de acordo com protocolos Illumina padrão.

Processamento e análise de dados

[0101]As sequências de adaptadores foram reduzidas a partir dos arquivos fastq em bruto usando Cutadapt (37). As leituras reduzidas foram alinhadas às sequências de pré-miRNA (miRBase versão 19) (38) usando Bowtie2 (39). Os alinhamentos foram filtrados para manter apenas aqueles alinhamentos que tiveram duas ou menos inadequações de base e produziram um único alinhamento melhor conforme medido pelo escore de alinhamento Bowtie2. As leituras não alinhadas remanescentes foram depois, alinhadas ao genoma de referência hg19 usando Bowtie2. Novamente, as leituras únicas melhores foram necessárias. Para miRNAs, contagens de leitura foram obtidas contando-se as sobreposições das leituras alinhadas aos pré-miRNAs com os limites da forma madura canônica (miRBase versão 19) usando BEDtools (40). Qualquer sobreposição com a região madura foi contada. As contagens de leitura de miRNA para cada experimento foram amostradas a um nível comum usando amostragem aleatória implementada em R (pacote básico). Quando a ‘média’ de duas repetições foi tomada (geralmente para representar graficamente), o seguinte procedimento foi usado: as duas bibliotecas foram amostradas a um valor de contagem total comum e, depois, as contagens para cada espécie foram somadas. Esta biblioteca somada depois, foi então amostrada ao valor de contagem total comum original. Estes processos são favorecidos para a média de bibliotecas replicadas uma vez que preserva a natureza da contagem dos dados e consequentemente a distribuição subjacente. A expressão diferencial foi calculada usando o pacote DESeq2 (41) em R usando estimativas de dispersão ‘local’ e testes ‘LRT’. Um resultado significante foi definido como um valor de P <0,01 ajustado de Benjamini-Hochberg. As estimativas de dispersão foram calculadas com DESeq2 assim como usando o modo ‘local’. Antes de reprensentar graficamente na Fig. 6A, as estimativas foram analisadas usando a função spline em R (pacote básico).

RESULTADOS hsa-miR-16-5p de bloqueio em bibliotecas de sequenciamento

[0102]Em um conjunto de bibliotecas de sequenciamento de RNA pequenas de 27 amostras de plasma humano que foram preparadas usando-se uma versão levemente modificada do protocolo descrito por Alon et al. (28), mapeamento de leituras para hsa-miR-16-5p compreendidos entre 20 e 60 % das leituras alinhadas totais nas bibliotecas (Fig. 8). Além disso, compatível com outros relatórios (32, 33), níveis de hsa-miR-16-5p correlacionaram-se com o grau de hemólise presente na amostra. A abundância maciça de hsa-miR-16-5p nestas bibliotecas torna o sequenciamento a uma profundidade suficiente para detectar miRNAs abundantes modestos muito caros. A normalização apropriada de bibliotecas em que uma ou poucas espécies dominam as leituras é problemática. Também, uma vez que o nível de hsa-miR-16-5p varia, amostras de sequenciamento múltiplo a uma profundidade comum, em termos de leituras de não-hsa-miR-16-5p, é difícil.

[0103]Para resolver estes problemas, um método foi desenvolvido para remover hsa-miR-16-5p a partir das bibliotecas de sequenciamento bloqueando-o como um substrato de T4 RNA Ligase 1 durante a ligação do adaptador à extremidade 5’ (Fig. 2). No protocolo padrão (Fig. 1), um adaptador de oligonucleotídeo de DNA pré-adenilado é ligado às extremidades 3’ do grupo de espécies de RNA pequeno usando T4 RNA Ligase 2 truncada. Subsequentemente, um adaptador de oligonucleotídeo de RNA é ligado às extremidades 5’ usando T4 RNA Ligase 1 não modificada. O produto resultante é transcrito reverso e amplificado com PCR. No protocolo modificado (Fig. 2), o uso foi feito de um oligonucleotídeo compreendido de um hairpin auto-complementar com uma saliência de 12 bases na extremidade 5’ que é o complemento reverso das primeiras 12 bases da extremidade 5’ da sequência canônica do miRNA alvejado. A extremidade 5’ do oligonucleotídeo é modificada com um espaçador C3 (grupo propila) para proibir sua participação em quaisquer reações de ligação indesejadas. Este oligonucleotídeo ‘bloqueador’ é introduzido depois da ligação do adaptador pré- adenilado às extremidades 3’ do grupo de RNA pequeno, mas antes da ligação do adaptador às extremidades 5’. As porções complementares das espécies de miRNA alvejado e o bloqueador participam em anelamento de base Watson-Crick para formar um RNA:DNA de fita dupla híbrido com uma ligação de fosfodiéster ausente entre a extremidade 3’ do bloqueador e a extremidade 5’ do miRNA alvejado, compreendendo um ‘nick’. T4 DNA Ligase reconhece esta molécula híbrida e sela o nick (literatura do produto NEB), resultando no bloqueador sendo covalentemente ligado à extremidade 5’ do alvo miRNA. A presença de hairpin e o bloqueador C3 evita a ligação subsequente do adaptador à extremidade 5’ deste produto. Sem a sequência de ligação do iniciador contida no adaptador, este produto ‘bloqueado’ não é amplificado na PCR a jusante, eficazmente removendo-a a partir da final biblioteca.

[0104]Para demonstrar a eficácia deste método, várias concentrações de um bloqueador alvejando hsa-miR-16-5p foram tituladas em reações de geração de biblioteca usando RNA total de coração humano como entrada. O RNA total de coração humano é uma amostra de teste adequada visto que hsa-miR-16-5p é abundante em bibliotecas derivadas de, compreendendo ~10 % das leituras de miRNA. O efeito em abundâncias de leitura de hsa-miR-16-5p nas bibliotecas sequenciadas totais mostra comportamento de dose-resposta (Fig. 3), com um efeito máximo na faixa de 5 a 20 nM. Além disso, este método de bloqueio foi aplicado usando-se o oligonucleotídeo que bloqueia hsa-miR-16-5p a 20 nM em um conjunto de bibliotecas derivadas de 23 amostras de plasma humano. Nas bibliotecas sequenciadas, hsa-miR-16-5p foi reduzido a <1 % das leituras em todos os casos (Fig. 9), muito menor do que no conjunto anterior sem bloqueio (Fig. 8).

[0105]Uma vez que foi antecipado que alvejando miRNAs a suas extremidades 5’ levaria à atividade fora do alvo devido à homologia de sequência dentro de famílias de miRNA, inicialmente tentou alvejar e bloquear miRNAs a partir da extremidade 3’. Análogo ao método 5’, um oligonucleotídeo hairpin foi usado com uma saliência 3’ complementar, um fosfato 5’ e bloqueador C3 3’. A ligação de bloqueio com T4 DNA Ligase ocorre primeiro, antes da ligação do adaptador às extremidades 3’ do banco de RNA pequeno. Embora este método eficazmente bloqueia hsa-miR-16-5p em RNA total de coração humano (dados não mostrados), teve um efeito adverso nos rendimentos da biblioteca final. De fato, mesmo em bibliotecas submetidas a uma reação de ligação de bloqueio simulada que incluía todos os reagentes exceto o oligonucleotídeo bloqueador, este método 3’ produziu concentrações de biblioteca final aproximadamente cinco vezes menores do que o método 5’ (Fig. 10). Esta diminuição no rendimento no método 3’ é provavelmente devido à ATP restante a partir da ligação de bloqueio inicial com T4 DNA Ligase inibindo a T4 RNA Ligase 2 truncada na ligação subsequente do adaptador às extremidades 3’ do banco de RNA pequeno. Embora T4 RNA Ligase 2 truncada não seja o ATP em rotação, ATP pode ainda se ligar aos restos do sítio ativo, levando à inibição da enzima (comunicação pessoal com NEB). Assim, um método 3’ pode provavelmente ser implementado sem consequências indesejadas se os componentes de reação da ligação de bloqueio fossem removidos por intermédio da purificação em coluna ou algum outro método adequado. Entretanto, a recuperação parcial do RNA pequeno a partir destes métodos pode ser baixa. Considerando a aplicação intencionada deste método às amostras de plasma humano em que as concentrações de RNA já são baixas, a redução adicional da entrada de RNA eficaz é indesejável. Além disso, os miRNAs são conhecidos ter considerável variação de suas extremidades 3’ devido às diferenças em sítios de corte Dicer e adições de nucleotídeo sem modelo (42, 43). Uma vez que o método baseia-se em T4 DNA Ligase, que é sensível aos desajustes e lacunas de par de base (44), estas variações podem afetar adversamente a eficácia do bloqueio (Fig. 11). Embora, a variação na extremidade 5’ tem efeitos similares no método de bloqueio de 5’ (Fig. 13), variantes da extremidade 5’ geralmente representam uma fração menor do total. Considerando estas limitações do método 3’, foi decidido focar no método 5’ para estudos adicionais.

Avaliando o desempenho quantitativo de bibliotecas de bloqueio

[0106]Para avaliar rigorosamente o efeito de bloquear hsa-miR-16-5p na medição das espécies de miRNA não alvejado na biblioteca, bibliotecas foram geradas de cinco amostras de plasma humano. Para cada amostra, duas bibliotecas foram geradas que foram desbloqueadas, isto é, submetidas à reação de ligação de bloqueio sem um oligonucleotídeo de bloqueio. Adicionalmente, duas bibliotecas foram geradas usando um oligonucleotídeo de bloqueio alvejando hsa-miR-16-5p, para um total de quatro bibliotecas por amostra. As amostras de plasma foram escolhidas para ter um alto grau de hemólise tal que o bloqueio de hsa-miR-16-5p deve ter grandes efeitos.

[0107]Para cada amostra, as bibliotecas bloqueadas de hsa-miR-16-5p e desbloqueadas de réplica foram analisadas usando-se a aplicação DESeq2 (veja, Materiais e Métodos) para estabelecer aqueles miRNAs diferencialmente afetados pelo bloqueio. A análise foi limitada às espécies de miRNA sozinhas uma vez que o alinhamento exato de espécies de não-miRNA não foi universalmente preciso o suficiente para levar em consideração as comparações significativas. Tal como esperado, os membros da família mir-16 também são bloqueados por este método, devido à similaridade de sequência a suas extremidades 5’ (Fig. 4A-E). Curiosamente, os membros da família mir-16 has-miR-424-5p e hsa-miR-497-5p não são bloqueados, provavelmente uma vez que eles têm uma citosina na primeira posição em vez da uracila que os outros quatro membros têm (Fig. 4D). Esta é compatível com a incapacidade de T4 DNA Ligase selar nicks nas posições onde um par de base de inadequação está presente no sítio nick (44). Foi observado que em duas das cinco amostras, um número pequeno de miRNA não alvejado é significantemente menor nas bibliotecas de bloqueio assim como (Fig. 4A-C). Alguns destes miRNAs têm várias bases de similaridade de sequência com o oligonucleotídeo bloqueador e formariam um duplex com uma lacuna de uma base entre a extremidade 5’ e a extremidade 3’ do oligonucleotídeo de bloqueio. A ineficiência em selar estas lacunas explica a razão moderada de mudanças. Outras espécies diminuídas não têm similaridade de sequência óbvia. Elas são apenas significantemente menores em uma amostra (Fig. 4C) e têm o número pequeno de alterações, sugerindo que possivelmente a correção de FDR usado por DESeq2 não corrigiu suficientemente o efeito de hipótese múltipla. Vários miRNAs são realmente significantemente mais altos nas bibliotecas de bloqueio (Figs. 4B e C). Presumivelmente, estes miRNAs foram capazes de ser mais ligados eficazmente durante a ligação do adaptador 5’ na ausência do hsa-miR-16-5p do substrato de ligação altamente abundante e preferido.

[0108]Uma motivação importante para bloquear hsa-miR-16-5p nestas amostras foi aumentar a detecção das espécies de baixa abundância. Com uma base de um número equivalente de leituras alinhadas, a comparação das bibliotecas desbloqueadas com as bibliotecas de bloqueio mostra um aumento acentuado no número de espécies de miRNA detectado a uma variedade de limites de contagem em todas as cinco amostras de plasma (Fig. 5). A um corte comumente escolhido de 10 contagens, entre 180 e 450 mais miRNAs são detectados neste limite em amostras bloqueadas em comparação com amostras desbloqueadas. Esta melhoria na detecção das espécies de baixa abundância foi realizada com aumento insignificante em custos de geração de biblioteca e nenhum aumento em custos de sequenciamento.

[0109]Uma preocupação crítica é que o protocolo de bloqueio impacta adversamente a reprodutibilidade da medição de miRNAs menos abundantes e por extensão, a capacidade de medir precisamente a expressão diferencial. Embora, seja reconfortante que as abundâncias medidas da grande maioria dos miRNA não sejam afetadas pelo protocolo de bloqueio (Fig. 4), é importante notar que os determinados desvios conhecidos causados pelas RNA ligases usadas no protocolo de geração de biblioteca, a abundância absoluta dos miRNAs na biblioteca não representa uma medição estritamente significativa da abundância real na amostra. Não obstante, o objetivo de muitos estudos é medir a expressão diferencial entre grupos de amostra. Nestes casos, a abundância de miRNAs necessita apenas ser medida de forma reproduzível.

[0110]Para avaliar a reprodutibilidade das cinco bibliotecas de amostra de plasma humano, o coeficiente de correlação de rô de Spearman foi calculado entre bibliotecas replicadas (Fig. 12). Para todas as cinco amostras, o rô de Spearman foi mais alto para as bloqueadas. Entretanto, havia preocupação de que a correlação pudesse não ser a melhor medição de reprodutibilidade nestas bibliotecas uma vez que os desvios introduzidos pelas RNA ligases são consistentes. Assim, a correlação pode ser imposta sobre um conjunto de duas bibliotecas simplesmente uma vez que elas foram submetidas aos mesmos desvios. Tal como uma alternativa, DESeq2 foi usado para estimar as dispersões de cada biblioteca com base nas repetições (veja, Materiais e Métodos). DESeq2 propõe uma distribuição binomial negativa como a distribuição apropriada para contagem de dados (41) e estima a dispersão como função de profundidade de leitura. Tal como observado nos dados, a dispersão é geralmente mais alta a baixas contagens e diminui com o aumento da profundidade de leitura (Fig. 6A). As bibliotecas de bloqueio não mostram maior dispersão em qualquer regime de contagem, e podem ser menos dispersas, particularmente na faixa de contagem de média a alta.

[0111]Por último, para estudos de biomarcadores à base de sangue, a capacidade de medir a expressão diferencial é primordial. Usando DESeq2, a razão de mudanças foi calculada entre todos os pares possíveis de amostras (10 pares) separadamente em ambas as bibliotecas desbloqueadas e as bibliotecas de bloqueio de hsa-miR-16-5p. A medição da razão de mudança de miRNAs entre duas amostras é altamente similar nas bibliotecas de hsa-miR-16-5p desbloqueadas e bloqueadas (Fig. 21). Com a exceção de uns poucos valores abertos, a grande maioria da razão de mudanças dispersa em torno da linha de inclinação de unidade (linha tracejada na Fig. 21). O coeficiente de correlação de Spearman foi calculado entre as bibliotecas de hsa-miR-16-5p desbloqueadas e bloqueadas para cada um dos 10 pares. Os valores de coeficiente foram muito altos, com uma média de 0,86 (Fig. 21). Estes dados indicam que o bloqueio de hsa-miR-16-5p tem muito pouco efeito na medição de expressão diferencial neste conjunto de amostra.

Extensão da técnica de bloqueio para outros miRNAs e multiplexação

[0112]Para estabelecer a capacidade do método de bloqueio para bloquear espécies exceto hsa-miR-16-5p, hsa-miR-451a foi bloqueado com um oligonucleotídeo bloqueador apropriadamente projetado em um conjunto de duas amostras de plasma humano. Uma seleção de hsa-miR-451a foi feita uma vez que também é abundante nas bibliotecas preparadas de amostras de plasma humano e uma vez que foi implicado para ser derivado de células sanguíneas, como hsa-miR- 16-5p (32). A análise encontrada de hsa-miR-451a para ser eficazmente bloqueado por este método com efeitos fora do alvo mínimo (Fig. 7A e B). Exceto o alvo intencionado, hsa-miR-451a, apenas hsa-miR-451b foi significantemente afetado pelo bloqueio. Embora a forma madura canônica de hsa-miR-451b carece de similaridade de sequência significante para hsa-miR-451a, foi descoberto que o mapeamento de leituras para hsa-miR-451b hairpin alinhou realmente perto de sua porção stem-loop e mostra a similaridade de sequência com a porção 5’ da forma madura canônica de hsa-miR-451a.

[0113]A capacidade de combinar oligonucleotídeos de bloqueio em uma reação de bloqueio única levaria em consideração a redução de um conjunto de miRNAs escolhidos. Os oligonucleotídeos de bloqueio foram combinados alvejando hsa-miR-16-5p e hsa-miR-451a em uma reação de bloqueio única. A combinação resultou em ambos oligonucleotídeos de bloqueio comportando-se como isoladamente (Fig. 7C e D). Além dos miRNAs que se esperam que mudem com base nos experimentos de bloqueador único, apenas hsa-miR-503-5p foi significantemente regulado para baixo, embora com uma razão de mudança pequeno. O hsa-miR-503-5p compartilha sete bases de sequência idêntica com hsa- miR-16-5p na extremidade 5’. A combinação de oligonucleotídeos de bloqueio não teve efeito discernível no rendimento da biblioteca total. Em geral, a combinação de oligonucleotídeos de bloqueio múltiplos parece ser uma estratégia viável. A medida em que os oligonucleotídeos de bloqueio podem ser multiplexados é o objeto de pesquisa futura.

DEBATE

[0114]Os miRNAs marginalmente informativos altamente abundantes e prováveis em conjuntos de dados NGS de soro e plasma humano impedem a capacidade de descobrir espécies de RNA pequenas e verdadeiras funcionando como biomarcadores. Este problema foi melhorado demonstrando-se um método para bloquear miRNAs da representação em bibliotecas de sequenciamento. Este método usa reagentes baratos e não necessita de etapas de limpeza adicionais. A aplicação do método em amostras de plasma humano resultou em um bloqueio robusto de hsa-miR-16-5p, um contaminante de célula do sangue abundante.

[0115]Tal como um resultado deste bloqueio, a profundidade de leitura de miRNAs de baixa abundância foi dramaticamente aumentada, levando à detecção de um número maior de espécie e uma medição mais exata de expressão diferencial. Os efeitos fora do alvo ocorrem com base em homologia de sequência à extremidade alvejada do miRNA, neste caso a extremidade 5’, especialmente dentro de membros da família do miRNA. Entretanto, estes efeitos fora do alvo são limitados e prognosticáveis. O método não diminui a reprodutibilidade da medição de miRNAs de baixa abundância e não tem efeitos negativos na medição de expressão diferencial.

[0116]O método foi generalizado alvejando-se um segundo miRNA, hsa- miR-451a. Novamente, o desempenho do método de bloqueio em hsa-miR-451a é específico e tem efeitos muito pequenos em espécie não-alvejada. Adicionalmente, a combinação de dois oligonucleotídeos de bloqueio alvejados para hsa-miR-16-5p e hsa-miR-451a em uma reação de ligação de bloqueio produziu os mesmos resultados observados por cada um separadamente e sem quaisquer efeitos de interação. Este resultado envolve a capacidade de combinar vários oligonucleotídeos de bloqueio em uma única reação, embora continue a ser testado.

[0117]Antecipa-se que esta tecnologia pode preencher um papel em sequenciamento de RNA pequeno similar àquele que métodos de redução de RNA ribossomal e RNA de globina têm em sequenciamento de RNA mensageiro. Embora a pesquisa tenha focado em sequenciamento de RNA pequeno em amostras de plasma humano, o método pode ser útil em outros tipos de tecido. Os bancos personalizados de oligonucleotídeos de bloqueio podem ser adaptados à uma aplicação particular para maximizar o uso de recursos de sequenciamento. Também, ainda, a experimentação focada no uso da plataforma Illumina, espera-se que este método seja aplicável a outras plataformas assim como o método de geração de biblioteca baseia-se na ligação de adaptadores diretamente à RNAs pequenos. Ao antecipar-se que os RNAs pequenos de interesse são raros e expressados modestamente, como é provavelmente verdade em muitas aplicações, o método difere de uma maneira robusta e econômica de medir com precisão.

MÉTODOS SUPLEMENTARES Visão geral

[0118]Este protocolo descreve a preparação de bibliotecas multiplexadas (código de barras) de miRNA de amostras de RNA total adequadas para sequenciamento nas plataformas Illumina HiSeq e GAII. O RNA total deve ser preparado por uma técnica que captura espécies de RNA curtas (15nt---25nt). As técnicas aceitáveis são extração de fenol---clorofórmio seguido por precipitação de etanol ou colunas NorGen, entre outras. As espécies de MicroRNA nas amostras têm um adaptador oligo (referido como o adaptador 3’) ligado a suas extremidades 3’. Em seguida, um oligo diferente (referido como o adaptador 5’) é ligado à extremidade 5’. O adaptador 3’ fornece um sítio de ligação para um iniciador de RT complementar. Isto permite que o cDNA seja feito a partir do complexo do miRNA--- adaptador por intermédio de transcrição reversa. O cDNA é depois usado como um modelo para várias rodadas de PCR. Os iniciadores de PCR têm caudas longas (~30 nt) que estendem o comprimento do produto. A caudas contêm as sequências de código de barras (com um sítio de ligação do iniciador de leitura do índice), o sítio iniciador de sequenciamento Illumina, e o cluster Illumina --- gerando sequências.

Considerações

[0119]A primeira etapa, a ligação 3’, é provavelmente a etapa mais importante no protocolo. As dobradiças no uso de uma forma truncada de T4 RNA ligase. O truncamento torna a enzima incapaz de usar ATP para energia e em vez disso deve usar um oligo já adenilado como um substrato. Consequentemente, o adaptador de oligo 3’ é adenilado na extremidade 3’. Se uma RNA ligase completamente funcional capaz de usar ATP fosse usado nesta etapa, ligaria as várias espécies de RNA presentes em concatâmeros, em vez de apenas ligar o adaptador às espécies de RNA alvo. Entretanto, um deve apreciar que todas as espécies de RNA são alvos, não apenas os miRNAs, levando à formação de numerosos produtos de ligação involuntários. Não apenas estes produtos devem ser removidos antes do sequenciamento, as outras espécies de RNA distraem o adaptador a partir da população de miRNA. Embora seja difícil calcular diretamente, a eficiência eficaz de ligação dos miRNAs presentes, em termos da porcentagem de miRNAs que realmente obtém ligação a um adaptador 3’, é provavelmente baixa. O adaptador 3’ também tem um espaçador de 3 carbonos na extremidade 5’. Isto é para evitar que o RNA seja ligado à extremidade 5’ na reação de ligação 5’ subsequente, que usa T4 RNA ligase de comprimento total.

[0120]Embora os produtos de ligação involuntários que ocorrem quando uma molécula de RNA presente na amostra além de um miRNA é ligada sejam um pouco problemáticos, o produto mais problemático formado neste protocolo surge quando o adaptador 3’ não ligado é ligado ao adaptador 5’ criando um dímero adaptador na segunda etapa de ligação.

[0121]Isto cria um produto curto que após a PCR é altamente complementar ao produto de ligação do miRNA intencionado. De fato, apenas diferem pelo interno ~22 bp do miRNA. O dímero adaptador hibridizará eficientemente ao produto do miRNA intencionado, tornando-se difícil a separação dos dois. Este problema é um pouco ajudado hibridizando-se o iniciador RT ao produto de ligação 3’. Visto que, o iniciador RT é complementar a todo o comprimento do adaptador 3’, a hibridização serve para ligar algum do adaptador 3’ não ligado, evitando a formação de dímero adaptador na reação de ligação 5’. Embora esta técnica reduza a formação do dímero adaptador, mais ainda persista e esteja presente depois de PCR. Deve ser separado a partir do produto intencionado por eletroforese em gel. Entretanto, por causa da forte hibridização entre o dímero adaptador e o produto do miRNA intencionado, o gel deve ser conduzido sob condições extremamente desnaturantes. Para realizar isto, os géis de TBE-Ureia acrilamida a 10 % são usados. Além disso, os géis são conduzidos em tampão pré-aquecido (90 °C). Embora seja inconveniente conduzir os géis quentes, os estudos mostraram que os géis de TBE- Ureia acrilamida a 10 % conduzidos na temperatura ambiente não são suficientemente desnaturantes por esta aplicação.

Procedimento Detalhado Notas Gerais

[0122]Para aquelas etapas em que componentes múltiplos são adicionados à reação, a melhor prática é fazer uma “mistura principal” dos componentes suficiente para que todas as reações sejam realizadas. As amostras ao longo do curso do protocolo devem sempre ser mantidas em gelo ou à temperatura do gelo quando não sendo de outro modo incubadas. No desenvolvimento deste protocolo, as amostras foram mantidas em um bloco de metal que foi mantido frio em um refrigerador quando não em uso. (Por simplicidade, o protocolo, entretanto, irá dizer “no gelo”). Além disso, a T4 RNA ligase 2 truncada; o Inibidor de RNAse, murino; a T4 RNA Ligase 1, o SuperScript II, e o Phusion PCR Master Mix devem todos ser mantidos em gelo. Na seguinte etapa, “ponto de paragem” é escrito em pontos onde o protocolo pode ser interrompido durante a noite. Este protocolo pode ser concluído em 3 dias. Se precipitar durante a noite, as incubações a -30 °C são reduzidas a 2 horas de incubações a -80 °C, o protocolo pode ser feito em 2 dias ocupados. Ligação 3’ 1. Preparar o seguinte tampão de estoque, chamado “Tampão de Ligação 3’ 2X”. Esta fórmula é suficiente para muitas reações e não precisa ser preparada fresca cada vez que o protocolo é conduzido. Armazenar a -20 °C entre os usos: 250 μL de PEG 8000 a 50 % (de kit T4 RNA Ligase) 200 μL de Tampão T4 RNA Ligase 10 X (de kit T4 RNA Ligase) 550 μL de DNAse, água livre de RNAse 2. Fazer uma solução de estoque dos controles em spike. Fazer um grande lote adequado para múltiplas rodadas deste protocolo. Armazenar a -80 °C. As concentrações listadas aqui são adequadas para amostras de plasma humano. Entretanto, espera-se que a entrada total das pontas necessite ser ajustada para tipos de amostra diferentes. Concentrações Finais: miRNASeq Multiplex 22 bp Spike In 20 pM miRNASeq Multiplex 25 bp Spike In 2 pM miRNASeq Multiplex 20bp Spike In 0,2 pM 3. Combinar o seguinte em um tubo de PCR de 0,2 mL. 1 μL de estoque de 10 μM miRNASeq Multiplex 3’ Adaptor 1 μL Spike In (da etapa 2) 4. μL de RNA total 5. Misturar suavemente agitando-se o tubo e desacelerando-se o tubo em uma mini-centrífuga na mesa. Incubar por 2 min a 70 °C em um termociclador pré- aquecido. Imediatamente refrigerar em gelo após incubação. 6. A cada amostra adicionar o seguinte: 10 μL de Tampão de ligação 3’ 2X 2 μL de T4 RNA ligase 2 truncada, 1 μL de Inibidor de RNAse, murino 7. Misturar suavemente os componentes e desacelerar. Incubar por 1 hora a 25 °C em um termociclador. (Nota: Tempos de incubação superiores a 1 hora foram mostrados para produzir produtos indesejados). Ligação de bloqueio 1. Pré-anelar o oligonucleotídeo de bloqueio (faça isso sempre). Incubar um estoque de oligonucleotídeo de bloqueio 0,5 μM em tampão de T4 DNA Ligase 1X como a seguir: 95 °C por 5 min, 65 °C por 5 min, 55 °C por 5 min, 45 °C por 5 min, 35 °C por 5 min, 25 °C por 5 min, 4 °C para o infinito. 2. Fazer uma mistura principal do seguinte: 1 μL de estoque de trabalho de oligonucleotídeo de bloqueio pré-renaturado 1 μL de ATP 10 mM 2 μL de T4 DNA Ligase 3. Adicionar 3 μL da mistura principal acima a cada reação de ligação 3’. Incubar a 30 °C por 1 hora seguido por 65 °C por 10 min e manter a 4 °C. Hibridização do Iniciador RT e Ligação 5’ 1. Para o produto de ligação 3’, adicionar 1 μL de 10 μM miRNASeq Multiplex RT Primer. Incubar como a seguir em um termociclador: 75 °C por 5 min, 37 °C por 30 min, 25 °C por 15 min, 4 °C para o infinito. 2. Enquanto as amostras estão incubando, descongelar o 20 μM miRNASeq Multiplex 5’ Adaptor. Uma vez descongelado, incubar o adaptador a 70 °C por 2 min e, depois imediatamente esfriar em gelo. 3. Um banco de 4 adaptadores 5’ é usado na próxima etapa. Estes são uma mistura equimolar de miRNASeq Multiplex 5’ Adaptor Mod 1, 2, 3, e 4 na concentração final de 5 μM cada, para uma concentração de adaptador de total de 20 μM. 4. Quando as amostras terminarem de incubar, transferí-las ao gelo. Adicionar o seguinte: 0,64 μL de T4 RNA Ligase 1 1 μL de Inibidor de RNAse, murino 0,86 μL de RNAse, água livre de DNAse 1 μL de 20 μM miRNASeq Multiplex 5’ Adaptor Mod banco 1 μL de Tampão T4 RNA Ligase 10X (kit T4 RNA Ligase) 1 μL de ATP 10 mM (kit T4 RNA Ligase) 5. Misturar suavemente e desacelerar brevemente. Incubar as amostras por 1 hora a 25 °C em um termociclador. O ponto de paragem (as amostras podem ser colocadas em -80 °C e deixadas durante a noite depois desta etapa, embora seja ideal fazer as amostras através da transcrição reversa antes de parar). Transcrição Reversa e PCR 1. Configurar a seguinte reação. O protocolo até este ponto gerou ~ 26,5 μL de produto ligado. Apenas 11 μL do produto são transferidos, de modo que o restante está disponível para uma repetição se necessária. O produto não usado deve ser armazenado a -80 °C. 4 μL de Tampão FS 5X (kit SuperScript II) 2 μL de DTT 0,1 M (kit SuperScript II) 1 μL de Mistura de Desoxinucleotídeo (10 mM cada) 1 μL de Inibidor de RNAse, murino 1 μL de SuperScript II (kit SuperScript II) 11L de produto de ligação (da etapa anterior) 2. Incubar as amostras em um termociclador como a seguir: 42 °C por 50 min, 70 °C por 15 min 4 °C para o infinito. 3. Adicionar o seguinte a cada amostra: 25 μL de Phusion High - Fidelity PCR Master Mix 2,5 μL de 20 μM miRNASeq Multiplex R Primer A cada amostra individual adicionar 2,5 μL de um dos doze diferentes 20 μM miRNASeq Multiplex F Primers indexados, certificando-se de observar qual amostra recebeu o iniciador de código de barras. Misturar as amostras e desacelerar. 4. Incubar as amostras em um termociclador como a seguir: 94 °C por 30 s 15 ciclos de: 94 °C por 10 s 72 °C por 45 s, 65 °C por 5 min 4 °C para o infinito. Ponto de paragem (As amostras podem ser armazenadas a -20 °C)

Concentração, Separação de Gel e Purificação

[0123]Os géis conduzidos neste protocolo são o formato Mini-PROTEAN BioRad e conduzidos no sistema em gel de Mini-PROTEAN Tetra Cell. Espera-se que usando um sistema em gel diferente exija que modificações extensivas sejam feitas para este protocolo. 1. Transferir cada amostra a um tubo micro-centrifugador de 1,7 mL. Adicionar 250 μL de Tampão PB (Kit MinElute). Misturar bem e transferir a uma coluna MinElute colocada em um tubo de coleta de 2 mL. Centrifugar por 1 min na velocidade máxima. Descartar o fluxo. 2. Adicionar 750 μL de Tampão PE (kit MinElute, garantir que o etanol seja adicionado) à coluna MinElute. Centrifugar por 1 min na velocidade máxima. Descartar o fluxo e colocar a coluna de volta no mesmo tubo de coleta. Centrifugar novamente por 1 min na velocidade máxima. 3. Transferir a coluna para um tubo micro-centrifugador de 1,7 mL limpo. Adicionar 17,5 μL de RNAse, água livre de DNAse. Deixar repousar por 5 min. Centrifugar por 1 min na velocidade máxima. Descartar a coluna, mantendo o fluxo através do tubo micro-centrifugador. 4. A cada amostra, adicionar 17,5 μL de Tampão de Amostra de Ureia---TBE 2X. Misturar bem e desacelerar. Colocar as amostras de lado na temperatura ambiente. 5. Preparar soluções de trabalho de escada de DNA. Esta fórmula faz o suficiente para várias rodadas e não necessita ser feita fresca. Armazenar a 4 °C. Escada de 20 bp 200 μL de Tampão de Amostra de Ureia---TBE 2X em 180 μL de DNAse, água livre de RNAse 20 μL de solução de estoque de escada de DNA de 20 bp (Bayou BioLabs) Escada de 100 bp 200 μL de Tampão de Amostra de Ureia---TBE 2X em 190 μL de DNAse, água livre de RNAse 10 μL de solução de estoque de escada de DNA 100 bp (NEB) 6. Neste ponto no protocolo, um gel quente será conduzido. Visto que, isto envolve usar tampão TBE perto de ferver, cuidado extremo deve ser usado. Adicionalmente, o equipamento de proteção tal como aventais e luvas devem ser usados. 7. Pré-aquecer um bloco de aquecimento a 95 °C. 8. Fazer tampão TBE 1X de estoque de tampão TBE 10X. Fazer 1 litro, suficiente para um ou dois géis. Um gel único pode acomodar quatro amostras sem nenhuma via espaçadora entre amostras. Cada amostra será dividida e conduzida em duas vias para evitar interferência a partir do dímero adaptador. Não é recomendado conduzir mais do que dois géis por vez. 9. Pré-aquecer géis de Mini-PROTEAN Ureia-TBE a 10 % em água quente da torneira (não mais quente do que a que sai da torneira). Deixá-los em suas embalagens e pesá-los para que não flutuem. Além disso, aquecer o suporte de gel na água. 10. Em um micro-ondas, aquecer 900 mL de tampão TBE 1X dividido em alíquotas de 450 mL em duas vasilhas Pyrex de 500 mL com invólucro Saran cobrindo parcialmente a parte superior entre 80 a 85 °C. Calor em incrementos de 2 a 5 min (dependendo da potência do micro-ondas). Entre incrementos de aquecimento, agitar cuidadosamente o tampão com um termômetro e verificar a temperatura. Não ferver o tampão. 11. Quando o aquecimento do tampão estiver quase concluído, colocar as amostras no bloco pré-aquecido de aquecimento a 95 °C. Também colocar as soluções de trabalho de 20 bp e 100 bp no bloco de aquecimento. Garantir que a cada amostra resida a 95 °C por pelo menos dois minutos antes de ser carregada no gel. Não é prejudicial para as amostras permanecerem no bloco de aquecimento por mais do que 2 min, até ~30 min. 12. Remover os géis e gel fixador a partir da água quente. Remover os géis a partir de seu empacotamento, garantindo a remoção da fita verde na parte inferior do gel e no pente. Juntar os géis no gel fixador. 13. Verter o tampão TBE 1X quente agora (80 a 85 °C) no conjunto de gel, enchendo para o topo. 14. Com um p20 ajustado para 15 μL, medir com pipeta para cima e para baixo em cada poço do gel. Isto é para remover qualquer ureia que muitas vezes cristaliza nos poços durante o armazenamento. Remover as bolhas nos poços. 15. Remover os dois tubos de escada (cuidadosamente, eles estão quentes). Girá-los para baixo brevemente em uma mini centrífuga de mesa. Adicionar 15 μL da escada de 20 bp à via 1 do gel, pipetando cuidadosamente para evitar a contaminação de outras vias. O tubo pode fazer um “pop” quando aberto. Adicionar 15 μL da escada de 100 bp à via 2. 16. Remover um par de tubos de amostra a partir do bloco de aquecimento. Girá-los para baixo brevemente em uma mini centrífuga de mesa. Carregar duas alíquotas de 15 μL de cada amostra em duas vias adjacentes do gel. Repetir para todas as amostras. Manipular prontamente uma vez que o gel é resfriado, mas com cuidado e deliberadamente. 17. Uma vez que todas as amostras são carregadas, coloque suavemente o conjunto de gel na caixa de gel. Reaquecer o tampão TBE 1X remanescente a 90 ° C no micro-ondas. Verter todo o TBE 1X remanescente na caixa de gel (não dentro do conjunto de gel). 18. Com uma pipeta de 10 mL, retire o tampão dentro do conjunto de gel com tampão na caixa de gel, enchendo-o o mais próximo do topo quanto o possível. Isto é importante uma vez que o tampão quente evaporará durante o curso do conduzido. 19. Começar a executar o gel a 200V. Monitorar de perto a corrente. Se a corrente começar a aumentar mais de 10 mA da corrente inicial (provável que isto aconteça), continuar a monitorar a corrente e ajustar a tensão mais baixa até que a corrente se estabilize. No entanto, não executar o gel abaixo de 160V. A corrente sobe uma vez que o gel e o tampão estão quentes. A condutividade do sistema é muito maior do que quando executado na temperatura ambiente. A condutividade aumentada permite que mais corrente flua, o que, por sua vez, aquece o gel, aumentando ainda mais a condutividade e criando um loop de realimentação positiva. Assim, a corrente deve ser monitorada de perto durante a execução. Nessas condições, o gel deve ser executado por 45 minutos. 20. Desligar a fonte de alimentação e desmontar a caixa de gel. Permitir que os géis esfriem no topo do banco antes de abrir seus estojos de plástico. Enquanto os géis estão esfriando, para cada gel, adicionar 50 mL de TBE 1X a um recipiente de coloração de gel de tamanho adequado. Adicionar 5 μL de estoque SYBR Gold 10.000X a cada alíquota de TBE de 50 mL e misturar. Enrolar o recipiente em papel alumínio para protegê-lo da luz. Abrir a caixa de plástico do gel agora arrefecido e colocar o gel no recipiente de coloração com o TBE e SYBR Gold. Re-cobrir o recipiente com o papel alumínio e balançar em um balancim de gel por 10 minutos. 21. Enquanto o gel está colorando, preparar o seguinte para cada amostra. Com uma agulha de calibre 20, puxar um orifício no fundo de um tubo de micro- centrífuga de 0,5 mL. Colocar este tubo em um tubo de centrífuga de 1,7 mL. 22. Colocar uma folha de Saran em um transiluminador UV. Transferir o gel da solução de coloração para a folha de invólucro Saran. Capturar uma imagem do gel sob iluminação UV com um sistema de visualização de gel apropriado (ou seja, sistema de imagem de UVP EC3). 23. Transferir o gel pegando o invólucro Saran para um transiluminador de UV que pode ser acessado para etapas de excisão de gel subsequentes (talvez o mesmo que a imagem tirada). Com lâminas de barbear e pinças, impedir cuidadosamente a banda de 135 pb por cada amostra. Uma vez que cada amostra foi carregada em duas alíquotas em vias adjacentes, cortar ambas as bandas da mesma amostra juntas. Substituir as lâminas de barbear e as pinças depois de tocar o gel para evitar a contaminação cruzada. Colocar os fragmentos de gel no tubo de micro-centrífuga de 0,5 mL com o orifício na parte inferior. 24. Transferir os tubos de micro-centrífuga de 0,5 mL aninhados em tubos de micro-centrífuga de 1,7 mL contendo os pedaços de gel em uma micro- centrífuga. Girar na velocidade máxima por 1 min. O fragmento de gel deve estar no fundo de um tubo de micro-centrífuga de 1,7 mL em pequenos pedaços. Se algum fragmento de gel for retido em 0,5 mL, girar a velocidade máxima por mais um minuto. 25. Preparar o seguinte estoque, chamado “Solução de Imersão”. Esta fórmula faz o suficiente para muitas amostras como não precisa ser preparada fresca a cada vez. Armazenar na temperatura ambiente. 26. mL de Acetato de amônio 5M em 2 mL de solução de SDS a 1 % 27. μL de EDTA 0,5M 28. L de RNAse, água livre de DNAse 26. Adicionar 300 μL da Solução de Imersão a cada amostra. Incubar com agitação a 70 °C por 2 horas. 27. Transferir cada amostra (incluindo peças de gel) a um Filtro de Tubo de Centrifugação Spin-X, Acetato de Celulose de 0,22 um, repousado no tubo de micro- centrífuga que o acompanha. Girar em uma micro-centrífuga na velocidade máxima durante 1 min. 28. Transferir o fluxo para um novo tubo de micro-centrífuga de 1,7 mL. Adicionar 1 μL de 10 μg/μL de glicogênio. Adicionar 300 μL de 100 % de isopropanol. Submeter a vórtice e girar rapidamente. Incubar durante a noite a -30 °C. Ponto de paragem (As amostras podem ser mantidas nas condições de precipitação a -3 °C durante vários dias). 29. Girar as amostras em uma centrífuga refrigerada (4 °C) durante 20 min a 14.000 rpm (velocidade máxima). Novamente, colocar as dobradiças dos tubos para fora, de modo que a localização da pelota seja previsível. 30. Enquanto as amostras estão na centrífuga, esfriar uma alíquota de 80 % de etanol através da colocação em água gelada ou por algum outro método adequado. 31. Depois da centrifugação, pipetar o sobrenadante. Usando um p200, colocar a ponta da pipeta perto da parte inferior do tubo afastada do lado da dobradiça e remover suavemente o líquido. Adicionar 100 μL do etanol a 80 % refrigerado e centrifugar novamente em uma centrífuga refrigerada (4C) durante 10 minutos a 14.000 rpm (velocidade máxima). 32. Remover cuidadosamente o sobrenadante com o p200 como descrito acima. Depois de remover o máximo possível com o p200, usar um p20 para obter o restante, deixando o menor líquido possível. 33. Ressuspender a pelota em 10 μL de tampão EB (Kit MinElute). Medir a concentração da amostra com um método adequado (o QBit HS DNA é preferido com 1 μL de amostra). A amostra está pronta para o sequenciamento. Normalmente, este protocolo produz 10 μL de 1--4 ng/μL de produto, dependendo da massa de entrada da amostra e do tipo de amostra. Embora dependa do nível de multiplexação, bibliotecas de 0,5 ng/μL ou superior estão concentradas o suficiente para o sequenciamento. Se um rendimento mais baixo for esperado, a pelota pode ser recolocada em suspensão em um volume mais baixo para produzir um produto de concentração mais alta.

[0124]É altamente recomendado conduzir KAPA qPCR para quantificar concentrações de biblioteca antes do sequenciamento. REFERÊNCIAS 1. Ivey,K.N. e Srivastava,D. (2010) MicroRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell, 7, 36-41. 2. Hu,H. e Gatti,R. a. (2011) MicroRNAs: new players in the DNA damage response. J. Mol. Cell Biol., 3, 151-158. 3. Carleton,M., Cleary,M.A. e Linsley,P.S. (2007) MicroRNAs and cell cycle regulation. Cell Cycle, 6, 2127-2132. 4. Wilson,R.C. e Doudna,J.A. (2013) Molecular mechanisms of RNA interference. Annu. Rev. Biophys., 42, 217-239. 5. Fabbri,M., Paone,A., Calore,F., Galli,R., Gaudio,E. e Santhanam,R. (2012) MicroRNAs bind to Toll-like receptors to induce prometastatic inflammatory response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 109, E2110-E2116. 6. Place,R.F., Li,L.-C., Pookot,D., Noonan,E.J. e Dahiya,R. (2008) MicroRNA-373 induces expression of genes with complementary promoter sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 105, 1608-1613. 7. Dumortier,O., Hinault,C. e Van Obberghen,E. (2013) MicroRNAs and metabolism crosstalk in energy homeostasis. Cell Metab., 18, 312-324. 8. Jin,Y., Yang,C.-J., Xu,X., Cao,J.- N., Feng,Q.-T. e Yang,J. (2015) MiR-214 regulates the pathogenesis of patients with coronary artery disease by targeting VEGF. Mol. Cell. Biochem., 402, 111-122. 9. Santa-maria,I., Alaniz,M.E., Renwick,N., Cela,C., Fulga,T. a, Van Vactor,D, Tuschl,T., Clark,L.N., Shelanski,M.L., Mccabe,B.D. et al. (2015) Dysregulation of microRNA-219 promotes neurodegeneration through post-transcriptional regulation of tau. J. Clin. Invest., 125, 681-686. 10. Heneghan,H.M.,Miller,N., McAnena,O.J., O’Brien,T. e Kerin,M.J. (2011) Differential miRNA expression in omental adipose tissue and in the circulation of obese patients identifies novel metabolic biomarkers. J. Clin. Endocrinol. Metab., 96, 846-850. 11. Mall,C., Rocke,D.M., Durbin-Johnson,B. e Weiss,R.H. (2013) Stability of miRNA in human urine supports its biomarker potential. Biomark Med., 7, 1-17. 12. Wang,K., Zhang,S., Weber,J., Baxter,D. e Galas,D.J. (2010) Export of microRNAs and microRNA-protective protein by mammalian cells. Nucleic Acids Res., 38, 7248-7259. 13. Turchinovich,A., Weiz,L., Langheinz,A. e Burwinkel,B. (2011) Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic Acids Res., 39, 7223-7233. 14. Mitchell,P.S., Parkin,R.K., Kroh,E.M., Fritz,B.R., Wyman,S.K., Pogosova-Agadjanyan,E.L., Peterson,A., Noteboom,J., O’Briant,K.C., Allen,A. et al. (2008) Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 105, 1051310518. 15. Weber,J., Baxter,D.H., Zhang,S., Huang,D.Y., Huang,K.H., Lee,M.J., Galas,D.J. e Wang,K. (2010) The microRNA spectrum in 12 body fluids. Clin. Chem., 56, 1733-1741. 16. Arroyo,J.D., Chevillet,J.R., Kroh,E.M., Ruf,I.K., Pritchard,C.C., Gibson,D.F.,Mitchell,P.S., Bennett,C.F., Pogosova-Agadjanyan,E.L., Stirewalt,D.L. et al. (2011) Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 108, 50035008. 17. Toiyama,Y., Okugawa,Y. e Goel,A. (2014) DNA methylation and microrna biomarkers for noninvasive detection of gastric and colorectal cancer.. Biochem. Biophys. Res. Commun., 455, 43-57. 18. Xu,L., Li,M., Wang,M., Yan,D., Feng,G. e A,G. (2014) The expression of microRNA-375 in plasma and tissue is matched in human colorectal cancer. BMC Cancer, 14, 714. 19. Schrauder,M.G., Strick,R., Schulz-Wendtland,R., Strissel,P.L., Kahmann,L., Loehberg,C.R., Lux,M.P., Jud,S.M., Hartmann,A., Hein,A. et al. (2012) Circulating micro-RNAs as potential blood-based markers for early stage breast cancer detection. PLoS One, 7, e29770. 20. Heneghan,H.M.,Miller,N., Lowery,A.J., Sweeney,K.J., Newell,J. e Kerin,M.J. (2010) Circulating microRNAs as novel minimally invasive biomarkers for breast cancer. Ann. Surg., 251, 499-505. 21. Zhou,W., Fong,M.Y., Min,Y., Somlo,G., Liu,L., Palomares,M.R., Yu,Y., Chow,A., O’Connor,S.T.F., Chin,A.R. et al. (2014) Cancer- Secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell, 25, 501-515. 22. Kumar,P., Dezso,Z., MacKenzie,C., Oestreicher,J., Agoulnik,S., Byrne,M., Bernier,F., Yanagimachi,M., Aoshima,K. e Oda,Y. (2013) Circulating miRNA biomarkers for Alzheimer’s disease. PLoS One, 8, e69807. 23. Duong Van Huyen,J.-P., Tible,M., Gay,A., Guillemain,R., Aubert,O., Varnous,S., Iserin,F., Rouvier,P., Francois,A., Vernerey,D. et al. (2014) MicroRNAs as non- invasive biomarkers of heart transplant rejection. Eur. Heart J., 35, 3194-3202. 24. Wang,K., Zhang,S., Marzolf,B., Troisch,P., Brightman,A., Hu,Z., Hood,L.E. e Galas,D.J. (2009) Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 106, 4402-4407. 25. Vickers,K.C., Palmisano,B.T., Shoucri,B.M., Shamburek,R.D. e Remaley,A.T. (2011) MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat. Cell Biol., 13, 423-433. 26. Mestdagh,P., Hartmann,N., Baeriswil,L., Andreasen,D., Bernard,N., Chen,C., Cheo,D., D’Andrade,P., DeMayo,M., Dennis,L. et al. (2014) Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat. Methods, 11, 809-815. 27. Vigneault,F., Sismour,a M. e Church,G.M. (2008) Efficient microRNA capture and bar-coding via enzymatic oligonucleotide adenylation. Nat. Methods, 5, 777-779. 28. Alon,S., Vigneault,F., Eminaga,S., Christodoulou,D.C., Seidman,J.G., Church,G.M. e Eisenberg,E. (2011) Barcoding bias in high-throughput multiplex sequencing of miRNA. Genoma Res., 21, 1506-1511. 29. Eminaga,S., Christodoulou,D.C., Vigneault,F., Church,G.M. e Seidman,J.G. (2013) Quantification of microRNA expression with next-generation sequencing. Curr. Protoc. Mol. Biol., doi:10,1002/0471142727.mb0417s103. 30. Hafner,M., Renwick,N., Brown,M., Mihailovic,A., Holoch,D., Lin,C., Pena,J.T.G., Nusbaum,J.D., Morozov,P., Ludwig,J. et al. (2011) RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep- sequenced small RNA cDNA libraries. RNA, 17, 1697-1712. 31. Zhang,Z., Lee,J.E., Riemondy,K., Anderson,E.M. e Yi,R. (2013) High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genoma Biol., 14, R109. 32. Pritchard,C.C., Kroh,E., Wood,B., Arroyo,J.D., Dougherty,K.J., Miyaji,M.M., Tait,J.F. e Tewari,M. (2012) Blood cell origin of circulating microRNAs: a cautionary note for cancer biomarker studies. Cancer Prev. Res., 5, 492-497. 33. Yamada,A., Cox,M. A., Gaffney,K. A., Moreland,A., Boland,C.R. e Goel,A. (2014) Technical factors involved in the measurement of circulating microRNA biomarkers for the detection of colorectal neoplasia. PLoS One, 9, e112481. 34. Williams,Z., Ben- Dov,I.Z., Elias,R., Mihailovic,A., Brown,M., Rosenwaks,Z. e Tuschl,T. (2013) Comprehensive profiling of circulating microRNA via small RNA sequencing of cDNA libraries reveals biomarker potential and limitations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 110, 4255-4260. 35. Leidner,R.S., Li,L. e Thompson,C.L. (2013) Dampening enthusiasm for circulating microRNA in breast cancer. PLoS One, 8, 1-11. 36. Witwer,K.W. (2014) Circulating microRNA biomarker studies: pitfalls and potential solutions. Clin. Chem., 61, 56-63. 37. Martin,M. (2011) Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal, 17, 10-12. 38. Kozomara,A. e Griffiths-Jones,S. (2014) MiRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Res., 42, 68-73. 39. Langmead,B. e Salzberg,S.L. (2012) Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods, 9, 357-359. 40. Quinlan,A.R. e Hall,I.M. (2010) BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics, 26, 841-842. 41. Anders,S. e Huber,W. (2010) Differential expression analysis for sequence count data. Genoma Biol., 11, R106. 42. Wyman,S.K., Knouf,E.C., Parkin,R.K., Fritz,B.R., Lin,D.W., Dennis,L.M., Krouse,M. A., Webster,P.J. e Tewari,M. (2011) Post- transcriptional generation of miRNA variants by multiple nucleotidyl transferases contributes to miRNA transcriptome complexity. Genoma Res., 21, 1450-1461. 43. Newman,M.A.,Mani,V. e Hammond,S.M. (2011) Deep sequencing of microRNA precursors reveals extensive 3’ end modification. RNA, 17, 1795-1803. 44. Landegren,U., Kaiser,R., Sanders,J. e Hood,L. (1988) A ligase-mediated gene detection technique. Science, 241, 1077-1080.

2. Exemplo de Trabalho #2: Determinação de Contagens Relativas de MiRNA Indesejado em Amostras Bloqueadas e Desbloqueadas

[0125]As tentativas iniciais de usar ácidos nucleicos de bloqueio que se ligam à extremidade 3’ do miRNA indesejado foram mal sucedidas, resultando em bibliotecas de miRNA com eficiência baixa de ligação do adaptador. Eventualmente foi hipotetizado que ATP residual usado na reação de ligação de DNA T4 estava inibindo a efetividade de T4 RNA ligase 2 truncada. O seguinte protocolo foi desenvolvido para resolver o problema.

Protocolo de Bloqueio 3’

[0126]Inicialmente, 1 μl de oligonucleotideo de bloqueio de miRNA 0,5 μM foi incubado por cinco minutos a cada uma das seguintes temperaturas: 95 °C, 65 °C, 55 °C, 45 °C, e 35 °C para garantir a formação apropriada da estrutura hairpin. O oligonucleotídeo de bloqueio incubado foi combinado com 4 μl de RNA isolado contendo microRNAs junto com 1 μl de T4 DNA Ligase (NEB), 1 μl de Tampão de T4 DNA Ligase 10X (NEB), 1 μl de inibidor de RNAse Murino (NEB), e 2 μl de água e incubado por uma hora a 30 °C e 15 minutos a 65 °C anelar e bloquear o miRNA indesejado de reações adicionais. Depois da incubação, os produtos de reação foram isolados usando uma coluna capaz de ligar microRNAs e eluídos em 20 μl de água de modo a remover o ATP presente a partir do tampão de T4 DNA Ligase 10X, que é inibitório para T4 RNA ligase 2 truncada. Depois da limpeza da coluna, 10 μl do eluente da coluna, 1 μl de adaptador 3’ 10 μM, 1 μl de T4 RNA ligase 2 truncada (NEB), 1 μl de inbidor de RNAse Murino (NEB), 2,5 μl de PEG 8000 a 50 % (NEB), 2 μl de Tampão de T4 RNA Ligase 10X (RNA), e 0,5 μl de água foram combinados a um volume final de 19 μl e incubados a 25 °C por uma hora. Um μl de iniciador de transcrição reversa 10 μM foi renaturado ao produto de ligação do adaptador 3’ por cinco minutos a 75 °C, 30 minutos a 37 °C, e 15 minutos a 25 °C antes da adição do adaptador 5’ de modo a reduzir a formação de produtos de dímero adaptador. Um μl de adaptador 5’ agrupado 20 μM foi incubado por dois minutos a 70 oC e, depois combinado com a reação anterior assim como 1 μl de T4 RNA Ligase 1 (NEB), 1 μl de Inibidor de RNAse de Murino (NEB) 1 μl de ATP10 mM, e 1 μl de Tampão de T4 RNA Ligase 10X, e incubado por uma hora a 25 °C. Os produtos de reação ligados foram transcritos reversos por combinação 11 μl da reação de ligação com 1 μl de SuperScript II (Invitrogen), 4 μl de Tampão de Reação da Primeira Fita 5X (Invitrogen), 2 μl de DTT 100 mM (Invitrogen), 1 μl de Inibidor de RNAse Murino (NEB), e 1 μl de dNTPs 10 mM cada e incubados por 50 minutos a 42 °C e 15 minutos a 70 °C. O cDNA resultante contendo reação foi amplificado por intermédio de PCR adicionando-se 25 μl de Phusion Alto-Fidelity PCR Master Mix 2X (NEB) ao longo de 2,5 μl cada um dos iniciadores anteriores e reversos 20 μM. As condições de ciclagem térmica foram 94 °C por 30 s, seguidos por 15 ciclos de 94 °C por 10 s, e 72 °C por 45 s, e uma extensão final a 65 °C por cinco minutos. As bibliotecas foram limpas e concentradas usando um Kit de Purificação de PCR MinElute (Qiagen), seguindo as instruções do fabricante, e eluídos em um volume final de 20 μl. As bibliotecas foram separadas em um gel de acrilamida a 10 por cento de TBE- Ureia (Bio-Rad) com tampão quente por 50 minutos. A banda correspondente aos miRNAs (~135 a 145 pares de base) foi excisada, eluída a partir do gel, precipitada, e recolocada em suspensão em 10 μl de Tampão EB (Qiagen). A concentração da biblioteca de RNA pequena foi quantificada pelo Kit de Quantificação da Biblioteca - Illumina/ABI Prisma (KAPA Biosystems) e sequenciada em um HiSeq2000 ou um MiSeq de acordo com protocolos Illumina padrão.

Estudo de Eficiência de Bloqueio Usando Bloqueadores 5’ e 3’ Isolados e Agrupados

[0127]Usando os mesmos métodos descritos acima, as bibliotecas de miRNA de miRNA do coração humano foram construídas usando o protocolo de bloqueio e sem o protocolo de bloqueio. O protocolo de bloqueio 3’ melhorado da seção anterior foi usado para testar a eficácia de um bloqueador 3’ para miR-16.

[0128]As comparações foram feitas para bibliotecas sem bloqueador e bibliotecas fabricadas usando um bloqueador 3’ de hsa-miR-16-5p (SEQ ID NO: 13 com um 3’ de espaçador de fosforamidita C3), um bloqueador 5’ de hsa-miR-26a-5p (SEQ ID NO: 2 com um 5’ espaçador de fosforamidita C3), e um bloqueador 5’ de hsa-miR-486-5p (SEQ ID NO: 1 com um 5’ de espaçador de fosforamidita C3). Tal como mostrado nas Figs. 14 a 16 respectivamente, em cada caso, as contagens normalizadas do miRNA bloqueado foram significantemente reduzidas em comparação com o controle.

[0129]O protocolo de bloqueio depois foi testado usando um grupo misto de bloqueadores. Um grupo de bloqueadores foi preparado contendo um bloqueador 3’ de hsa-miR-16-5p (SEQ ID NO: 13 com um 3’ de espaçador de fosforamidita C3), um bloqueador de 5’ de hsa-miR-26a-5p (SEQ ID NO: 2 com um 5’ de espaçador de fosforamidita C3), bloqueador 5’ de hsa-miR-451-5p (SEQ ID NO: 3 com um 5’ de espaçador de fosforamidita C3) e um bloqueador de 5’ de hsa-miR-486-5p (SEQ ID NO: 1 com um 5’ de espaçador de fosforamidita C3). As bibliotecas de miRNA de miRNA do coração humano foram construídas usando o protocolo de bloqueio com o grupo e sem o protocolo de bloqueio. As abundâncias de cada um de hsa-miR-16- 5p, hsa-miR-26a-5p, e hsa-miR-486-5p foram medidas. Conforme pode ser observado nas Figs. 17 a 20, os bloqueadores agrupados significantemente reduziram a abundância de cada um do miRNA indesejado na biblioteca resultante.

G. FORMAS DE REALIZAÇÃO SUSTENTADAS

[0130]Esta divulgação especificamente, mas não exclusivamente suporta reivindicações para as seguintes formas de realização: Emb 1. Um ácido nucleico de bloqueio para o uso em reduzir a abundância de um micro-RNA (miRNA) indesejado em uma biblioteca de miRNA, o ácido nucleico de bloqueio compreendendo: (a) uma fita Crick tendo uma extremidade 3’ e uma extremidade 5’; (b) uma região de complementaridade de fita simples em uma da extremidade 5’ da fita Crick ou a extremidade 3’ da fita Crick, que se associa com uma região de ligação em uma primeira extremidade do miRNA indesejado sob condições rigorosas, em que a dita primeira extremidade é a extremidade 5’ ou a extremidade 3’ do miRNA indesejado; (c) uma região de fita dupla na fita Crick adjacente à região de complementaridade, a região de fita dupla compreendendo uma fita Watson que é associado à fita Crick, a fita Watson tendo uma extremidade 5’ e uma extremidade 3’; (d) uma primeira porção de bloqueio ligada à extremidade 3’ da fita Crick, em que a primeira porção de bloqueio pode não servir como um substrato para ligases; (e) uma segunda porção de bloqueio ligada à extremidade 5’ da fita Crick, em que a segunda porção de bloqueio pode não servir como um substrato para ligases; (f) uma terceira porção de bloqueio ligada à extremidade 3’ da fita Watson se a região de complementaridade for na extremidade 3’ da fita Crick, ou ligada à extremidade 5’ da fita Watson se a região de complementaridade for na extremidade 5’ da fita Crick, em que a terceira porção de bloqueio pode não servir como um substrato para ligases; e (g) uma extremidade terminal ligante na fita Watson, a extremidade terminal ligante localizada na extremidade 3’ da fita Watson se a região de complementaridade for na extremidade 5’ da fita Crick, ou na extremidade 5’ da fita Watson se a região de complementaridade for na extremidade 3’ da fita Crick. Emb 2. Um ácido nucleico de bloqueio para o uso em reduzir a abundância de um micro- RNA (miRNA) indesejado em uma biblioteca de miRNA, o ácido nucleico de bloqueio compreendendo: (a) uma extremidade 5’ do ácido nucleico de bloqueio e uma extremidade 3’ do ácido nucleico de bloqueio; (b) uma região de complementaridade de fita simples em uma da extremidade 5’ do ácido nucleico de bloqueio ou da extremidade 3’ do ácido nucleico de bloqueio, que se associa com uma região de ligação em uma primeira extremidade do miRNA indesejado sob condições rigorosas, em que a dita primeira extremidade é a extremidade 5’ ou a extremidade 3’ do miRNA indesejado, e em que a região de complementaridade tem uma extremidade terminal; (c) uma região formadora de hairpin loop adjacente à região de complementaridade, a região formadora de hairpin loop tendo uma extremidade terminal ligante; e (d) uma primeira porção de bloqueio ligada à extremidade terminal da região de complementaridade, em que a dita primeira porção de bloqueio pode não servir como um substrato para ligases. Emb 3. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade associa-se com a região de ligação sob condições altamente rigorosas. Emb 4. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade associa-se com a região de ligação sob condições maximamente rigorosas Emb 5. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que o ácido nucleico de bloqueio compreende um grupo de ligação entre a primeira porção de bloqueio e a região de complementaridade. Emb 6. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que o ácido nucleico de bloqueio compreende um grupo de ligação entre a primeira porção de bloqueio e a região de complementaridade, em que o grupo de ligação é selecionado do grupo consistindo em: Espaçador 9 (trietileno glicol) e Espaçador 18 (hexa-etilenoglicol). Emb 7. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade é 5 - 50 nucleotídeos em comprimento. Emb 8. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade é 8 - 20 nucleotídeos em comprimento. Emb 9. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade é 10 - 15 nucleotídeos em comprimento. Emb 10. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade compreende uma sequência tendo pelo menos 90 % de identidade com posições 1 - 12 de uma de SEQ ID NO: 1 - 4. Emb 11. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade compreende uma sequência tendo mais do que 95 % de identidade com posições 1 - 12 de uma de SEQ ID NO: 1 - 4. Emb 12. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade compreende uma sequência tendo pelo menos 90 % de identidade com posições 1 - 12 de SEQ ID NO: 4. Emb 13. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade compreende uma sequência tendo mais do que 95 % de identidade com posições 1 - 12 de SEQ ID NO: 4. Emb 14. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a primeira porção de bloqueio é um nucleotídeo modificado que falta um grupo fosfato 5’ disponível, falta um grupo hidroxila 3’ disponível, ou ambos. Emb 15. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a primeira porção de bloqueio é selecionada do grupo consistindo em: um desoxinucleotídeo invertido, didesoxinucleotídeo, um didesoxinucleotídeo invertido, espaçador C3 (fosforamidita), Espaçador 9 (trietileno glicol), grupo propila, grupo propanol, e Espaçador 18 (hexa-etilenoglicol). Emb 16. O ácido nucleico de bloqueio de Emb 2, em que o dito grupo de região formadora de hairpin loop compreende uma sequência tendo pelo menos 90 % de identidade com SEQ ID NO: 5. Emb 17. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um de Emb 2 ou 16, em que o dito grupo de região formadora de hairpin loop compreende uma sequência tendo mais do que 95 % de identidade com SEQ ID NO: 5. Emb 18. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade associa-se sob condições rigorosas com pelo menos 5 bases consecutivas de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 6 - 11. Emb 19. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade associa-se sob condições rigorosas com pelo menos 8 bases consecutivas de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 6 - 11. Emb 20. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade associa-se sob condições rigorosas com pelo menos 10 bases consecutivas de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 6 - 11. Emb 21. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade associa-se sob condições rigorosas com posições 1 - 8 de pelo menos uma de SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 10. Emb 22. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade associa-se sob condições rigorosas com posições 1 - 9 de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 6 - 11. Emb 23. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade associa-se sob condições altamente rigorosas com pelo menos 5 bases consecutivas de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 6 - 11. Emb 24. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade associa-se sob condições altamente rigorosas com pelo menos 8 bases consecutivas de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 6 - 11. Emb 25. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade associa-se sob condições altamente rigorosas com pelo menos 10 bases consecutivas de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 6 - 11. Emb 26. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade associa-se sob condições altamente rigorosas com posições 1 - 8 de pelo menos uma de SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 10. Emb 27. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade associa-se sob condições altamente rigorosas com posições 1 - 9 de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 6 - 11. Emb 28. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade associa-se sob condições maximamente rigorosas com pelo menos 5 bases consecutivas de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 6 - 11. Emb 29. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade associa -se sob condições maximamente rigorosas com pelo menos 8 bases consecutivas de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 6 - 11. Emb 30. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade associa-se sob condições maximamente rigorosas com pelo menos 10 bases consecutivas de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 6 - 11. Emb 31. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade associa-se sob condições maximamente rigorosas com posições 1 - 8 de pelo menos uma de SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 10. Emb 32. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a região de complementaridade associa-se sob condições maximamente rigorosas com posições 1 - 9 de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 6 - 11. Emb 33. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que o ácido nucleico de bloqueio é composto de um ácido nucleico selecionado do grupo consistindo em: DNA, RNA, ácido nucleico fechado, e ácido nucleico ligado em ponte. Emb 34. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um de Emb 2, 16 e 17 em que o ácido nucleico de bloqueio é uma molécula de DNA compreendendo uma sequência tendo pelo menos 90 % de identidade com pelo menos uma de: SEQ ID NOS: 1 - 4. Emb 35. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um de Emb 2, 16, 17, e 34 em que o ácido nucleico de bloqueio é uma molécula de DNA compreendendo uma sequência tendo mais do que 95 % de identidade com pelo menos uma de: SEQ ID NOS: 1 - 4. Emb 36. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um de Emb 2, 16, 17, 34, e 35 em que o ácido nucleico de bloqueio é uma molécula de DNA compreendendo uma sequência tendo pelo menos 90 % de identidade com SEQ ID NO: 4. Emb 37. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um de Emb 2, 16, 17, e 34 - 36, em que o ácido nucleico de bloqueio é uma molécula de DNA compreendendo uma sequência tendo mais do que 95 % de identidade com SEQ ID NO: 4. Emb 38. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um de Emb 2, 16 e 17, em que o ácido nucleico de bloqueio é uma molécula de DNA compreendendo uma sequência tendo pelo menos 90 % de identidade com SEQ ID NO: 13. Emb 39. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um de Emb 2, 16, 17, e 38 em que o ácido nucleico de bloqueio é uma molécula de DNA compreendendo uma sequência tendo mais do que 95 % de identidade com SEQ ID NO: 13. Emb 40. O ácido nucleico de bloqueio de qualquer um dos acima, em que a extremidade terminal ligante é um nucleotídeo tendo um de um grupo fosfato 5’ disponível ou um grupo hidroxila 3’ disponível. Emb 41. Um método de prevenir um micro-RNA (miRNA) indesejado de participar de reações em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR), o miRNA indesejado tendo uma extremidade 5’ e uma extremidade 3’, o método compreendendo: anelar a região de complementaridade do ácido nucleico de bloqueio de qualquer um de Emb 1-Emb 40 ao sítio de ligação na primeira extremidade do miRNA indesejado, em que a primeira extremidade do miRNA indesejado é uma da extremidade 5’ ou da extremidade 3’. Emb 42. O método de Emb 41, em que a renaturação é conduzida sob condições rigorosas. Emb 43. O método de qualquer um de Emb 41 - 42, em que a renaturação é conduzida sob condições altamente rigorosas. Emb 44. O método de qualquer um de Emb 41 - 43, em que a renaturação é conduzida sob condições maximamente rigorosas. Emb 45. O método de qualquer um de Emb 41 - 44, compreendendo ligar o ácido nucleico de bloqueio à primeira extremidade do miRNA indesejado. Emb 46. O método de qualquer um de Emb 41 - 45, em que a primeira extremidade do miRNA indesejado é a extremidade 5’ e a região de complementaridade é na extremidade 5’ do ácido nucleico de bloqueio. Emb 47. O método de qualquer um de Emb 41 - 46, em que a primeira extremidade do miRNA indesejado é a extremidade 3’ e a região de complementaridade é na extremidade 3’ do ácido nucleico de bloqueio. Emb 48. O método de qualquer um de Emb 41 - 47, compreendendo ligar o ácido nucleico de bloqueio à primeira extremidade do miRNA indesejado, em que a etapa de ligação é realizada usando uma DNA/RNA ligase. Emb 49. O método de qualquer um de Emb 41 - 48, compreendendo ligar o ácido nucleico de bloqueio à primeira extremidade do miRNA indesejado, em que a etapa de ligação é realizada usando uma T4 DNA ligase. Emb 50. O método de qualquer um de Emb 41 - 49, em que o miRNA indesejado é selecionado do grupo consistindo em: mir-16, mir-15a, mir-15b, mir-195, mir-424, mir-497, mir-486, mir-451, e mir-26. Emb 51. Um complexo de micro RNA (miRNA) bloqueado que é o produto do método de qualquer um de Emb 41 - 50. Emb 52. Um método de reduzir a abundância de um micro-RNA (miRNA) indesejado em uma biblioteca de miRNA, o miRNA indesejado tendo uma extremidade 5’ e uma extremidade 3’, o método compreendendo: (a) purificar RNA de uma amostra compreendendo uma pluralidade de miRNAs; (b) introduzir um adaptador de ácido nucleico adenilado e uma primeira DNA/RNA ligase sob condições para permitir o adaptador de ácido nucleico adenilado se ligar à extremidades 3’ da pluralidade de miRNAs; (c) introduzir o ácido nucleico de bloqueio de qualquer um de Emb 1-Emb 40 sob condições para permitir a região de complementaridade do ácido nucleico de bloqueio anelar à região de ligação do miRNA indesejado, para produzir uma amostra bloqueada; (d) introduzir um adaptador de RNA e uma RNA ligase sob condições para permitir o adaptador de RNA ligar a extremidade 5’ da pluralidade de miRNAs; (e) introduzir uma transcriptase reversa à amostra bloqueada sob condições para permitir transcrição reversa da pluralidade de miRNAs, para produzir uma amostra de cDNA; e (f) realizar a reação em cadeia da polimerase (PCR) na amostra de cDNA para produzir a biblioteca de miRNA com abundância reduzida de miRNA indesejado. Emb 53. O método de Emb 52, compreendendo introduzir uma segunda DNA/RNA ligase sob condições para permitir o ácido nucleico de bloqueio se ligar a uma da extremidade 5’ e a extremidade 3’ do miRNA indesejado. Emb 54. O método de Emb 53, em que a segunda DNA/RNA ligase é T4 DNA ligase. Emb 55. O método de qualquer um de Emb 52 - 54, compreendendo incubar o ácido nucleico de bloqueio com o miRNA indesejado sob condições rigorosas para permitir a região de complementaridade do ácido nucleico de bloqueio anelar à região de ligação do miRNA indesejado. Emb 56. O método de qualquer um de Emb 52 - 55, compreendendo incubar o ácido nucleico de bloqueio com o miRNA indesejado sob condições altamente rigorosas para permitir a região de complementaridade do ácido nucleico de bloqueio anelar à região de ligação do miRNA indesejado. Emb 57. O método de qualquer um de Emb 52 - 56, compreendendo incubar o ácido nucleico de bloqueio com o miRNA indesejado sob condições maximamente rigorosas para permitir a região de complementaridade do ácido nucleico de bloqueio anelar à região de ligação do miRNA indesejado. Emb 58. O método de qualquer um de Emb 52 - 57, em que o dito adaptador de ácido nucleico adenilado compreende um sítio de ligação ao iniciador da transcriptase reversa. Emb 59. O método de qualquer um de Emb 52 - 58, em que o adaptador de ácido nucleico adenilado é um adaptador de DNA adenilado. Emb 60. O método de qualquer um de Emb 52 - 59, em que o adaptador de ácido nucleico adenilado é um adaptador de RNA adenilado. Emb 61. O método de qualquer um de Emb 52 - 60, em que a primeira DNA/RNA ligase é T4 ligase 2, truncada. Emb 62. O método de qualquer um de Emb 52 - 61, em que o adaptador de RNA é 5 - 30 pares de base em comprimento. Emb 63. O método de qualquer um de Emb 52 - 62, em que o adaptador de RNA é 18 - 22 pares de base em comprimento. Emb 64. O método de qualquer um de Emb 52 - 63, em que a RNA ligase é T4 RNA ligase 1. Emb 65. O método de qualquer um de Emb 52 - 64, em que etapa (c) é realizada antes de pelo menos uma das etapas (b) e (d). Emb 66. O método de qualquer um de Emb 52 - 65, em que a região de ligação do miRNA indesejado é a extremidade 5’ do miRNA indesejado. Emb 67. O método de qualquer um de Emb 52 - 66, em que a região de ligação do miRNA indesejado é a extremidade 5’ do miRNA indesejado, e em que as etapas são realizadas na seguinte ordem: (a), (b), (c), (d), (e), e (f). Emb 68. O método de qualquer um de Emb 52 - 67, em que a região de ligação do miRNA indesejado é a extremidade 3’ do miRNA indesejado. Emb 69. O método de qualquer um de Emb 52 - 68, em que a região de ligação do miRNA indesejado é a extremidade 3’ do miRNA indesejado; em que etapa (c) é realizada antes da etapa (b); e em que a concentração de ATP é reduzida entre as etapas (c) e (b). Emb 70. Uma biblioteca de miRNA com abundância reduzida de um miRNA indesejado que é o produto do método de qualquer um de Emb 52 - 69. Emb 71. A biblioteca de miRNA de Emb 70, em que a abundância de miRNA indesejado foi reduzida pelo menos por uma quantidade selecionada do grupo consistindo em: 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97,5 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99 %, e 100 %. Emb 72. Um kit para reduzir a frequência de um miRNA em uma biblioteca de miRNA, o kit compreendendo quaisquer ácidos nucleicos de bloqueio de qualquer um de Emb 1 - 40. Emb 73. O kit de Emb 72, compreendendo um recipiente de uma DNA/RNA ligase capaz de ligar DNA ao RNA quando renaturado. Emb 74. O kit de qualquer um de Emb 72 - 73, compreendendo um recipiente de T4 DNA ligase. Emb 75. O kit de qualquer um do kit de qualquer um de Emb 72 - 74, compreendendo um recipiente de uma RNA/RNA ligase. Emb 76. O kit de qualquer um do kit de qualquer um de Emb 72 - 75, compreendendo um recipiente de T4 RNA ligase 1. Emb 77. O kit de qualquer um do kit de qualquer um de Emb 72 - 75, compreendendo um recipiente de uma RNA/DNA ligase. Emb 78. O kit de qualquer um do kit Emb de qualquer um de Emb 72 - 77, compreendendo um recipiente de T4 RNA Ligase 2 truncada. Emb 79. O kit de qualquer um do kit Emb de qualquer um de Emb 72 - 78, compreendendo um recipiente de uma transcriptase reversa. Emb 80. O kit de qualquer um do kit Emb de qualquer um de Emb 72 - 79, compreendendo um recipiente de adaptador de ácido nucleico adenilado. Emb 81. O kit de qualquer um do kit Emb de qualquer um de Emb 72 - 80, compreendendo um recipiente de adaptador de ácido nucleico adenilado, em que o dito adaptador de ácido nucleico adenilado compreende um sítio de ligação ao iniciador da transcriptase reversa. Emb 82. O kit de qualquer um do kit Emb de qualquer um de Emb 72 - 81, compreendendo um recipiente de adaptador de ácido nucleico adenilado, em que o dito adaptador de ácido nucleico adenilado é um adaptador de DNA adenilado. Emb 83. O kit de qualquer um do kit Emb de qualquer um de Emb 72 - 82, compreendendo um recipiente de adaptador de ácido nucleico adenilado, em que o dito adaptador de ácido nucleico adenilado é um adaptador de RNA adenilado. Emb 84. O kit de qualquer um do kit Emb de qualquer um de Emb 72 - 83, compreendendo um recipiente de um adaptador de RNA. Emb 85. O kit de qualquer um do kit Emb de qualquer um de Emb 72 - 84, compreendendo uma pluralidade de iniciadores de DNA, uma solução de nucleotídeo, um tampão de PCR e uma DNA polimerase termofílica. Emb 86. Um complexo de micro RNA (miRNA) bloqueado, compreendendo um miRNA renaturado para o ácido nucleico de bloqueio de qualquer um de Emb 1 - 40 à região de ligação do miRNA, em que a primeira extremidade é uma da extremidade 5’ ou da extremidade 3’. Emb 87. Complexo de miRNA bloqueado de Emb 86, em que a primeira extremidade é a extremidade 5’ do miRNA. Emb 88. Complexo de miRNA bloqueado de Emb 86, em que a primeira extremidade é a extremidade 3’ do miRNA. Emb 89. Complexo de miRNA bloqueado de qualquer um de Emb 86 - 88, em que o miRNA é selecionado do grupo consistindo em: mir-16, mir-15a, mir-15b, mir-195, mir-424, mir-497, mir-486, mir-451, e mir-26. Emb 90. Uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência tendo pelo menos 90 % de identidade com um de SEQ ID NOS: 1 - 4 E 13. Emb 91. Uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência tendo mais do que 95 % de identidade com um de SEQ ID NOS: 1 - 4 E 13. Emb 92. Uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência que é um de SEQ ID NOS: 1 - 4 E 13. Emb 93. Uma molécula de ácido nucleico que se associa sob condições rigorosas com a molécula de ácido nucleico de qualquer um de Emb 90 - 92. Emb 94. Uma molécula de ácido nucleico que se associa sob condições altamente rigorosas com a molécula de ácido nucleico de qualquer um de 90 - 92. Emb 95. Uma molécula de ácido nucleico que se associa sob condições maximamente rigorosas com a molécula de ácido nucleico de qualquer um de Emb 90 - 92. Emb 96. Uma célula compreendendo quaisquer moléculas de ácido nucleico de qualquer um de Emb 90 - 95. Emb 97. A célula de Emb 96, em que a célula é uma célula procariótica. Emb 97. Um vetor compreendendo quaisquer moléculas de ácido nucleico de qualquer um de Emb 90 - 95.

H. CONCLUSÕES

[0131]Deve ser entendido que quaisquer determinados elementos das formas de realização divulgadas da invenção podem ser incorporados em uma estrutura única, uma etapa única, uma substância única, ou semelhantes. Similarmente, um determinado elemento da forma de realização divulgada pode ser incorporado em estruturas, etapas, substâncias múltiplas, ou semelhantes.

[0132]A descrição anterior ilustra e descreve os processos, máquinas, fabricações, composições de matéria, e outros ensinamentos da presente divulgação. Adicionalmente, a divulgação mostra e descreve apenas certas formas de realização dos processos, máquinas, fabricações, composições de matéria e outros ensinamentos divulgados, mas como mencionado acima, deve ser entendido que os ensinamentos da presente divulgação são capazes de serem usados em várias outras combinações, modificações, e ambientes e são capazes de alterações ou modificações dentro do escopo dos ensinamentos como expressado aqui, proporcional à habilidade e/ou conhecimento de uma pessoa tendo habilidade comum na técnica relevante. As formas de realização descritas aqui acima são ainda intencionadas a explicar melhor certos modos conhecidos de praticar os processos, máquinas, fabricações, composições de matéria, e outros ensinamentos da presente divulgação e permitir que outros habilitados na técnica utilizem os ensinamentos da presente divulgação em tais, ou outras, formas de realização e com as várias modificações necessárias pelas aplicações ou usos particulares. Consequentemente, os processos, máquinas, fabricações, composições de matéria, e outros ensinamentos da presente divulgação não são intencionados a limitar as formas de realização e exemplos exatos divulgados aqui. Quaisquer títulos da seção aqui são fornecidos apenas para consistência com as sugestões de 37 C.F.R. § 1.77 ou de outro modo fornecer filas organizacionais. Estes títulos não devem limitar ou caracterizar as invenções apresentadas aqui.

Claims (9)

1. Método para prevenir um micro-RNA (miRNA) indesejado de participar em reações em cadeia da polimerase da transcrição reversa (RT-PCR), o miRNA indesejado tendo uma extremidade 5’ e uma extremidade 3’, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) anelamento da região de complementaridade de um ácido nucleico de bloqueio ao sítio de ligação na primeira extremidade do miRNA indesejado, em que a primeira extremidade do miRNA indesejado é uma da extremidade 5’ ou da extremidade 3’, o ácido nucleico de bloqueio compreendendo: (i) uma extremidade 5’ do ácido nucleico de bloqueio e uma extremidade 3’ do ácido nucleico de bloqueio; (ii) uma região de complementaridade de fita simples em uma da extremidade 5’ do ácido nucleico de bloqueio ou da extremidade 3’ do ácido nucleico de bloqueio, que anela com uma região de ligação em uma primeira extremidade do miRNA indesejado sob condições severas, em que a dita primeira extremidade é a extremidade 5’ ou a extremidade 3’ do miRNA indesejado, e em que a região de complementaridade tem uma extremidade terminal; (iii) uma região formadora de hairpin loop adjacente à região de complementaridade, a região formadora de hairpin loop tendo uma extremidade terminal ligante; e (iv) uma primeira porção de bloqueio ligada à extremidade terminal da região de complementaridade, em que a dita primeira porção de bloqueio não serve como um substrato para ligases; e (b) introdução de um adaptador de RNA e uma RNA ligase sob condições para permitir que o adaptador de RNA se ligue à extremidade 5' da pluralidade de miRNAs, mas em que o adaptador de RNA é impedido de se ligar ao miRNA indesejado pelo ácido nucleico de bloqueio.

2. Método para prevenir um micro-RNA (miRNA) indesejado de participar em reações em cadeia da polimerase da transcrição reversa (RT-PCR), o miRNA indesejado tendo uma extremidade 5’ e uma extremidade 3’, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) anelamento da região de complementaridade de um ácido nucleico de bloqueio ao sítio de ligação na primeira extremidade do miRNA indesejado, em que a primeira extremidade do miRNA indesejado é uma da extremidade 5’ ou da extremidade 3’, o ácido nucleico de bloqueio compreendendo: (i) uma fita Crick tendo uma extremidade 3’ e uma extremidade 5’; (ii) uma região de complementaridade de fita simples em uma da extremidade 5’ da fita Crick ou da extremidade 3’ da fita Crick, que anela com uma região de ligação em uma primeira extremidade do miRNA indesejado sob condições severas, em que a dita primeira extremidade é a extremidade 5’ ou a extremidade 3’ do miRNA indesejado; (iii) uma região de fita dupla na fita Crick adjacente à região de complementaridade, a região de fita dupla compreendendo uma fita Watson que é anelada à fita Crick, a fita Watson tendo uma extremidade 5’ e uma extremidade 3’; (iv) uma primeira porção de bloqueio ligada à extremidade 3’ da fita Crick, em que a primeira porção de bloqueio não serve como um substrato para ligases; (v) uma segunda porção de bloqueio ligada à extremidade 5’ da fita Crick, em que a segunda porção de bloqueio não serve como um substrato para ligases; (vi) uma terceira porção de bloqueio ligada à extremidade 3’ da fita Watson se a região de complementaridade for na extremidade 3’ da fita Crick, ou ligada à extremidade 5’ da fita Watson se a região de complementaridade for na extremidade 5’ da fita Crick, em que a terceira porção de bloqueio não serve como um substrato para ligases; e (vii) uma extremidade terminal ligante na fita Watson, a extremidade terminal ligante localizada na extremidade 3’ da fita Watson se a região de complementaridade for na extremidade 5’ da fita Crick, ou na extremidade 5’ da fita Watson se a região de complementaridade for na extremidade 3’ da fita Crick; e (b) introdução de um adaptador de RNA e uma RNA ligase sob condições para permitir que o adaptador de RNA se ligue à extremidade 5' da pluralidade de miRNAs, mas em que o adaptador de RNA é impedido de se ligar ao miRNA indesejado pelo ácido nucleico de bloqueio.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o anelamento é conduzido sob condições severas.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o anelamento é conduzido sob condições maximamente severas.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ligar o ácido nucleico de bloqueio à primeira extremidade do miRNA indesejado.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira extremidade do miRNA indesejado é a extremidade 5’ e a região de complementaridade é na extremidade 5’ do ácido nucleico de bloqueio.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira extremidade do miRNA indesejado é a extremidade 3’ e a região de complementaridade é na extremidade 3’ do ácido nucleico de bloqueio.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ligar o ácido nucleico de bloqueio à primeira extremidade do miRNA indesejado, em que a etapa de ligação é realizada usando uma DNA/RNA ligase.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o miRNA indesejado é selecionado do grupo que consiste em: mir-16, mir-15a, mir-15b, mir-195, mir-424, mir-497, mir-486, mir-451 e mir-26.