BR112017020007B1 - Método para preparar um mosto com um nível aumentado de nitrogênio livre aminado (fan) e uso de uma protease - Google Patents

Abstract

Trata-se de um método para preparar um mosto com um nível aumentado de nitrogênio livre aminado (FAN) que compreende: a) preparar uma massa a partir de um grão para moagem que compreende malte e/ou adjunto; e b) adicionar uma protease que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

Description

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador. A forma legível por computador é incorporada no presente documento a título de referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se à produção de mosto para a fabricação de cerveja e de bebidas não alcoólicas. Mais particularmente, a mesma se refere a um método para aumentar o nível de nitrogênio livre aminado em um mosto.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] As cervejarias modernas precisam ter um alto nível de flexibilidade de matéria-prima em relação à inclusão de adjunto e qualidade de malte.

[0004] Quando adjuntos como grãos de milho, cevada ou arroz são usados no processo de infusão em vez do malte, ou quando malte de qualidade inferior submodificado é usado, isso resulta em um nível de nitrogênio livre aminado que é insuficiente para a fermentação de levedura apropriada.

[0005] O nitrogênio do mosto é normalmente determinado como FAN (nitrogênio livre aminado). O FAN inclui todas as aminas primárias livres e, assim, também inclui aminas de nucleotídeos e outros compostos que não são aminoácidos.

[0006] Os inventores alcançaram um método surpreendentemente bom de aumentar o nível de FAN em um mosto.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] Surpreendentemente, foi constatado que é possível aumentar significativamente o nível de FAN em um mosto, portanto reivindica-se:

[0008] Um método para preparar um mosto com um nível aumentado de nitrogênio livre aminado (FAN) que compreende: a) preparar uma massa a partir de um grão para moagem que compreende malte e/ou adjunto; e b) adicionar uma protease que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[0009] Em uma modalidade, a protease compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0010] Em uma modalidade, a protease é uma variante do polipeptí- deo de SEQ ID NO: 1 que compreende uma substituição, exclusão, e/ou inserção em uma ou mais posições.

[0011] Em uma modalidade, a protease é adicionada à massa ou ao mosto.

[0012] Em uma modalidade, a quantidade de nitrogênio livre aminado (FAN) é aumentada em pelo menos 20% em comparação com um mosto produzido na ausência da protease.

[0013] Em uma modalidade, adicionalmente, uma alfa amilase é adicionada à massa.

[0014] Em uma modalidade, adicionalmente, a beta glucanase é adicionada à massa.

[0015] Em uma modalidade, adicionalmente, a pululanase é adicionada à massa.

[0016] Em uma modalidade, adicionalmente, a xilanase é adicionada à massa.

[0017] Em uma modalidade, adicionalmente, a lipase é adicionada à massa.

[0018] Em uma modalidade, a protease é adicionada em uma quantidade de 1 a 100 mg de proteína de enzima por kg de grão para moagem.

[0019] Em uma modalidade, o grão para moagem compreende pelo menos 10% (p/p) de adjunto.

[0020] Em uma modalidade, o adjunto é selecionado a partir do grupo que consiste em cevada, arroz, milho, sorgo e mandioca.

[0021] Em uma modalidade, o mosto é fermentado para obter uma cerveja.

[0022] Em uma modalidade, a protease de acordo com a invenção encurta o tempo de fermentação total da cerveja.

[0023] A invenção também descreve o uso de uma protease que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 na produção de mosto.

DEFINIÇÕES Polipeptídeos Tendo Atividade de Protease

[0024] Os polipeptídeos tendo atividade de protease, ou proteases, são por vezes também designados peptidases, proteinases, peptídeo hidro- lases, ou enzimas proteolíticas.

[0025] O termo "protease" é definido no presente documento como uma enzima que hidrolisa ligações peptídicas. Essa definição de protease se aplica também à parte de protease dos termos "protease genitora" e "variante de protease", como usados no presente documento. O termo "protease" inclui qualquer enzima que pertença ao grupo de enzima EC 3.4 (o que inclui cada uma das treze subclasses da mesma). O número EC se refere à Nomenclatura de Enzima de 1992 de NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, Califórnia, que inclui os suplementos 1 a 5 publicados em Eur. J. Bio-chem. 1994, 223, 1 a 5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1 a 6; Eur. J. Bi- ochem. 1996, 237, 1 a 5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1 a 6; e Eur. J. Bio- chem. 1999, 264, 610 a 650. A nomenclatura é regularmente suplementada e atualizada; ver, por ex., a World Wide Web (WWW) em http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.

[0026] A atividade de protease pode ser medida com o uso de qualquer ensaio, em que um substrato é empregado, que inclua ligações de peptídeo relevantes para a especificidade da protease em questão. O pH do ensaio e a temperatura do ensaio devem igualmente ser adaptados para a protease em questão. Exemplos de valores de pH de ensaio são pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. Exemplos de temperaturas de ensaio são 15, 20, 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 ou 95 °C. Exemplos de substratos de protease são caseína, tal como Caseína Reticulada com Azu- rina (caseína AZCL).

[0027] Atividade de protease: O termo "atividade de protease" significa uma atividade proteolítica que catalisa a hidrólise de ligação amida ou uma proteína por hidrólise da ligação de peptídeo que liga aminoácidos em uma cadeia de polipeptídeo. Vários ensaios para determinação da atividade de protease estão disponíveis na técnica. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de protease pode ser determinada com o uso de tablete AK de Protazima (caseína reticulado e tingida; de Megazyme) ou suc- AAPF-pNA. Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% da atividade de protease do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[0028] Variante alélica: O termo “variante alélica” significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações genéticas podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos com sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[0029] Domínio catalítico: O termo "domínio catalítico" designa a região de uma enzima contendo a maquinaria catalítica da enzima.

[0030] cDNA: O termo “cDNA” designa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA madura, emendada, obtida a partir de uma célula eucariótica ou procarióti- ca. O cDNA não tem sequências de íntron que possam estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário inicial é um precursor do mRNA que é processado através de uma série de etapas, incluindo a emenda, antes de aparecer como mRNA maduro emendado.

[0031] Sequência de codificação: O termo "sequência de codificação" designa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. Os limites da sequência de codificação são geralmente determinados por um quadro de leitura aberta que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG ou TTG, e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG ou TGA. A sequência de codificação pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou uma combinação dos mesmos.

[0032] Sequências de controle: O termo “sequências de controle” designa sequências de ácidos nucleicos necessárias para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (isto é, do mesmo gene) ou estranha (isto é, de um gene diferente) em relação ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas sem limitação, um líder, uma sequência de polia- denilação, uma sequência de pró-peptídeo, um promotor, uma sequência de peptídeo de sinal e um terminador da transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de terminação de transcrição e tradução. As sequências de controle podem ser dotadas de ligan- tes com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das sequências de controle com a região de codificação do poli- nucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

[0033] Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção de um polipeptídeo, incluindo, mas sem limitação, transcrição, modificação pós-transcrição, tradução, modificação pós-tradução e segregação.

[0034] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” designa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotí- deo que codifica um polipeptídeo e está operacionalmente ligado a sequências de controle que fornecem a sua expressão.

[0035] Fragmento: O termo "fragmento" designa um polipeptídeo que tem um ou mais (por exemplo, diversos) aminoácidos ausentes no terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo ou domínio maduro; em que o fragmento tem atividade de protease.

[0036] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” designa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, trans- dução, ou similares, com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” abrange qualquer descendência de uma célula progenitora que não é idêntica à célula progenitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[0037] Isolado: O termo "isolado" designa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância que não ocorre naturalmente, (2) qualquer substância que inclui, mas sem limitação, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais, ou de todos, dentre os constituintes que ocorrem naturalmente com os quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão do homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes com os quais está naturalmente associada (por exemplo, múltiplas cópias de um gene que codifica a substância; uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene que codifica a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

[0038] Polipeptídeo maduro: O termo "polipeptídeo maduro" designa um polipeptídeo em sua forma final após a translação e quaisquer modificações pós-translacionais, tal como processamento N-terminal, truncamento C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo é aminoácido 1 a 301 de SEQ ID NO: 1.

[0039] Sequência de codificação de um polipeptídeo maduro: O termo "sequência de codificação do polipeptídeo maduro" designa um poli- nucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de protease.

[0040] Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” designa uma molécula de ácido nucleico, de cadeia simples ou dupla, que é isolada de um gene que ocorre naturalmente ou é modificado de modo a conter segmentos de ácidos nucleicos, que de outra forma não existiria na natureza ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências de controle.

[0041] Operacionalmente ligado: O termo "operacionalmente ligado" designa uma configuração, em que uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência de codificação de um polinucleotídeo, de modo que a sequência de controle direcione a expressão da sequência de codificação.

[0042] Identidade de sequência: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequência”.

[0043] Para finalidades da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle identificado como “identidade mais longa” (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a porcentagem de identidade e é calculado como a seguir: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento).

[0044] Para finalidades da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle identificado como “identidade mais longa” (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a porcentagem de identidade e é calculado como a seguir:

(Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)

[0045] Subsequência: O termo "subsequência" significa um polinu- cleotídeo tendo um ou mais (p. ex., vários) nucleotídeos ausentes da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência codificante do polipeptídeo maduro, em que a subsequência codifica um fragmento tendo atividade de protease.

[0046] Variante: O termo "variante" significa um polipeptídeo que tem atividade de protease que compreende uma alteração, isto é, uma substituição, inserção e/ou exclusão, em uma ou mais (por exemplo, diversas) posições. Uma substituição significa substituir o aminoácido que ocupa uma posição por um aminoácido diferente; uma exclusão significa a remoção do aminoácido que ocupa uma posição; e uma inserção significa adicionar um ou mais (por exemplo, diversos) aminoácidos, por exemplo, 1 a 5 aminoáci- dos adjacentes e que seguem imediatamente o aminoácido que ocupa uma posição. As variantes da presente invenção têm pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% da atividade de protease do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[0047] Bebida: O termo bebida, conforme usado no presente docu mento, tem o significado convencional na técnica e inclui, mas sem limitação, cerveja e qualquer bebida à base de mosto.

[0048] Cerveja: O termo "cerveja", conforme usado no presente do cumento, pretende cobrir pelo menos cerveja preparada a partir de massas preparadas a partir de cerais não maltados assim como massas preparadas a partir de cerais maltados, e todas as massas preparadas a partir de uma mistura de cerais maltados e não maltados. O termo "cerveja" também abrange cervejas preparadas com adjuntos, e cervejas com todos os possíveis teores de álcool.

[0049] Grão para moagem: O termo "grão para moagem" é compreendido como o amido ou açúcar que contém material que é a base para a produção de cerveja, por exemplo, a cevada malte e o adjunto. Geralmente, o malte moído não contém nenhuma água adicionada.

[0050] Malte: O termo "malte" é compreendido como qualquer grão de cereal maltado, em particular, cevada.

[0051] Adjunto: O termo "adjunto" é compreendido como a parte do grão para moagem que não é malte de cevada. O adjunto pode ser qual- quer amido rico em material de planta, por exemplo, grão não maltado, tal como, mas sem limitação, cevada, milho, arroz, sorgo e trigo e também inclui açúcar e/ou xarope prontamente fermentável. O amido de alguns dos adjuntos tem uma temperatura de gelatinização relativamente baixa que lhes permitem ser submetidos ao início da brassagem em conjunto com o malte, ao passo que outros adjuntos, como arroz, milho e sorgo, têm uma temperatura de gelatinização mais alta, tais adjuntos são tipicamente cozidos e liquefeitos em separado com uma alfa-amilase antes de serem adicionados à massa.

[0052] Massa: O termo "massa" é compreendido como um amido que contém pasta fluida que compreende malte de cevada triturada, e/ou grão não maltado triturado, e/ou outro amido que contém material, ou uma combinação dos mesmos, encharcado em água para produzir mosto.

[0053] Mosto: O termo "mosto" é compreendido como o escoamento de licor não fermentado que extrai o grão para moagem durante a brassa- gem.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0054] A vantagem da presente invenção é que a mesma permite que as infusões tenham um nível superior de flexibilidade de matéria-prima em relação à inclusão de adjunto e qualidade de malte.

[0055] Quando adjuntos como grãos de milho, cevada ou arroz para moagem são incluídos no processo de infusão em vez do malte, o nível de FAN (nitrogênio livre aminado) será insuficiente para uma fermentação de levedura apropriada. O mesmo problema ocorre quando um malte de qualidade baixa submodificado é usado.

[0056] Durante a brassagem, as proteases de malte endógenas têm capacidade para aumentar o nível geral de FAN. Esse aumento ocorre principalmente durante o resto da proteína (por exemplo, 20 minutos, 50 °C).

[0057] A adição da protease de acordo com a invenção à massa pode permitir que as infusões eliminem o resto de proteína sem perder FAN. Eliminar o resto de proteína economiza tempo e energia no processo de infusão e também minimiza a oxidação de lipídeo catalisado por lipoxigenase (LOX) o que leva a sabor de oxidação no produto final.

Produção de mosto

[0058] A presente invenção se refere a um método de produzir um mosto com um nível aumentado de FAN, em que uma protease que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1 foi adicionada à massa ou ao mosto.

[0059] A massa é obtenível por moagem de um grão para moagem que compreende malte e/ou adjunto. Água pode ser adicionada preferencialmente ao grão para moagem, e é normalmente pré-aquecida de modo que a massa alcance a temperatura de massa desejada no momento de formação de massa. Se a temperatura da massa formada for menor do que a temperatura de brassagem desejada, é preferencialmente fornecido calor adicional para alcançar a temperatura de processo desejada.

[0060] O perfil de temperatura do processo de brassagem pode ser um perfil de um processo de brassagem convencional em que as temperaturas são estabelecidas para alcançar degradação ideal da matéria seca de grão para moagem pelas enzimas de malte e as enzimas adicionadas.

[0061] O malte é preferencialmente derivado de um ou mais dentre os grãos selecionados dentre a lista que consiste em, por exemplo, milho, cevada, trigo, centeio, sorgo, milheto e arroz.

[0062] Preferencialmente, o malte é malte de cevada. O grão para moagem preferencialmente compreende de 0,5% a 99% (p/p) de malte, preferencialmente de 1% a 95% (p/p) de malte, mais preferencialmente de 5% a 90% (p/p) de malte, ainda mais preferencialmente de 10% a 80% (p/p) de malte.

[0063] Adicionalmente ao grão maltado, o grão para moagem pode compreender um ou mais adjuntos tais como milho não maltado, ou outro grão não maltado, tal como cevada, trigo, centeio, aveia, milho, arroz, sorgo tipo milo, milheto e/ou sorgo, ou amido bruto e/ou refinado e/ou as plantas que contém material derivado de plantas tipo trigo, centeio, aveia, milho, arroz, sorgo tipo milo, milheto, sorgo, ervilha, batata, batata doce, mandioca, tapioca, sagu, banana, beterraba e/ou cana de açúcar. De acordo com a presente invenção, adjuntos podem ser obtidos a partir de tubérculos, raízes, troncos, folhas, legumes, cereais e/ou grãos integrais.

[0064] Preferencialmente, o adjunto é obtido a partir de cevada, milho, arroz, sorgo e/ou mandioca; por exemplo, arroz amido, amido de milho e/ou grãos de milho para moagem.

[0065] O grão para moagem compreende tipicamente de 1% a 80% (p/p) de adjunto, por exemplo, de 5% a 75% (p/p) de adjunto, por exemplo, de 10% a 70% (p/p) de adjunto; em particular, o grão para moagem compreende pelo menos 10% (p/p) de adjunto. Em uma modalidade preferencial, o grão para moagem compreende de 30% a 70% (p/p) de adjunto.

[0066] Em um aspecto, a protease é introduzida no início da brassa- gem. Em outro aspecto, a protease é introduzida durante a brassagem. Em outro aspecto, a protease é adicionada ao mosto.

[0067] A quantidade de protease adicionada de acordo com a invenção geralmente depende de vários fatores. Para os propósitos desta inven- ção, a quantidade de protease usada geralmente será de 0,1 mg a 100 mg de EP (Proteína de Enzima) por kg de grão para moagem, preferencialmente, de 1 mg a 100 mg de EP (Proteína de Enzima) por kg de grão para moagem; preferencialmente de 1 mg a 50 mg de EP (Proteína de Enzima) por kg de grão para moagem.

[0068] Em uma modalidade preferencial, a quantidade de nitrogênio livre aminado no mosto é aumentada em pelo menos 20% em comparação com um mosto produzido na ausência da protease de acordo com a invenção, por exemplo, a quantidade de nitrogênio livre aminado no mosto é aumentada em pelo menos 30% em comparação com um mosto produzido na ausência da protease de acordo com a invenção, por exemplo, a quantidade de nitrogênio livre aminado no mosto é aumentada em pelo menos 40% em comparação com um mosto produzido na ausência da protease de acordo com a invenção, por exemplo, a quantidade de nitrogênio livre ami- nado no mosto é aumentada em pelo menos 50% em comparação com um mosto produzido na ausência da protease de acordo com a invenção.

[0069] Em outra modalidade preferencial, uma enzima (ou enzimas) adicionais é adicionada à massa, sendo que a dita enzima (ou enzimas) que inclui, mas sem limitação. alfa amilase, isoamilase, amilase maltogêni- ca, protease, celulase, beta glucanase, pululanase, lacase, xilanase, lipase, fosfolipase, fitase e esterase.

[0070] Em um aspecto do método, a enzima adicional adicionada inclui uma pululanase.

[0071] Em um aspecto do método, a enzima adicional adicionada inclui uma amilase, preferencialmente, uma alfa amilase.

[0072] Em um aspecto do método, a enzima adicional adicionada inclui uma beta glucanase.

[0073] Em um aspecto do método, a enzima adicional adicionada inclui uma xilanase.

[0074] Em um aspecto do método, a enzima adicional adicionada inclui uma lipase.

[0075] Em seguida à separação do mosto dos grãos usados do grão para moagem, o mosto pode ser usado como está ou o mesmo pode ser desidratado para fornecer um mosto concentrado e/ou seco. O mosto concentrado e/ou seco pode ser usado como extrato de infusão, como fla- vorizante de extrato de malte, para bebidas de malte não alcoólicas, vinagre de malte, cereais matinais, para confeitaria, etc.

[0076] Em uma modalidade preferencial, o mosto é fermentado para produzir uma bebida alcoólica, preferencialmente uma cerveja, por exemplo, estilo ale, ale forte, bitter, stout, porter, lager, cerveja de exportação, licor de malte, vinho de cevada, happoushu, cerveja de alto teor alcoólico, cerveja de baixo teor alcoólico, cerveja de baixa caloria ou cerveja light.

[0077] A fermentação do mosto pode incluir a inoculação do mosto com uma pasta fluida de levedura que compreende levedura fresca, isto é, levedura não usada anteriormente ou a levedura pode ser levedura reciclada. A levedura aplicada pode ser qualquer levedura adequada para infusão de cerveja, especialmente leveduras selecionadas a partir de Saccha- romyces spp. tais como S. cerevisiae e S. uvarum, o que inclui variantes natural ou artificialmente produzidas desses organismos.

[0078] É uma vantagem que a protease de acordo com a invenção possa encurtar o tempo de fermentação total.

[0079] Os métodos para fermentação de mosto para produção de cerveja são bem conhecidos a um indivíduo versado nas técnicas.

Proteases de acordo com a invenção

[0080] A protease SEQ ID NO:1 é obtenível a partir de Anoxybacillus rupiensis e revelada no documento no WO2014/194054 para uso em deter- gentes.

[0081] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um poli- peptídeo isolado que tem uma identidade de sequência ao polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pe- lo menos 83%, pelo menos 84% pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 99% ou 100% que têm atividade de protease.

[0082] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente com- preende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento que tem atividade de protease. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste do poli- peptídeo de SEQ ID NO: 1.

[0083] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um poli- peptídeo isolado que tem atividade de protease codificada por um polinu- cleotídeo que hibridiza em condições de baixa estringência, condições de média estringência, condições de estringência média para alta, ou condições de alta estringência com a sequência de codificação de polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, ou o seu complemento de comprimento total (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[0084] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a variantes do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 compreendendo uma substituição, de- leção, e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições.

[0085] Em uma modalidade, o número de substituições, exclusões e/ou inserções de aminoácido introduzidas no polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 é maior do que 20, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20.

[0086] As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas exclusões, tipicamente de 1 a 30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo de metionina amino-terminal; um pequeno peptídeo ligante de até 20 a 25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga líquida ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo anti- gênico ou um domínio de ligação.

[0087] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), amino- ácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de amino- ácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly.

[0088] Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade quanto ao substrato, mudar o pH ideal e similares.

[0089] Aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura da alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1.081 a 1.085). Na última técnica, mutações de alanina únicas são introduzidas em todos os resíduos da molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade de protease para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Consultar, também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4.699 a 4.708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica pode ser também determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou marcação por fotoafinidade, em conjunção com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Consultar, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306 a 312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899 a 904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59 a 64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

[0090] Podem ser feitas e testadas substituições, exclusões, e/ou inserções únicas ou múltiplas de aminoácidos usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação, e/ou rearranjo, seguidos de um procedimento de rastreamento relevante, tal como os divulgados por Reidhaar- Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53 a 57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86: 2.152 a 2.156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição de fagos (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10.832 a 10.837; Patente dos U.S. N.° 5.223.409; WO 92/06204), e muta- gênese sítio-dirigida (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[0091] Podem ser combinados métodos de mutagênese/rearranjo com métodos de rastreamento automatizados, de elevada capacidade, para detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados, expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893 a 896). As moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente se- quenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

[0092] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida ao N-terminal ou C-terminal de uma região de outro polipeptídeo.

[0093] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de fusão ou um poli- peptídeo de fusão clivável no qual outro polipeptídeo está fundido no N- terminal ou C-terminal do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptí- deo de fusão é produzido por fusão de um polinucleotídeo que codifica outro polipeptídeo com um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na arte, e incluem ligação das sequências codificantes codificando os polipeptídeos tal que fiquem em grelha e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja sob controle do mesmo promotor (ou promotores) e terminador. Polipeptídeos de fusão podem ser também construídos usando tecnologia de inteína na qual são criados polipeptídeos de fusão de modo pós-tradução (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776 a 779).

[0094] Um polipeptídeo de fusão pode compreender adicionalmente um local de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após a secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de sítios de clivagem incluem os, mas sem limitação, sítios divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568 a 576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245 a 251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498 a 503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378 a 381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505 a 512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982 a 987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240 a 248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35 a 48.

Composições de Enzimas

[0095] A presente invenção também se refere a composições que compreendem um polipeptídeo da presente invenção para uso na produção de mosto.

[0096] As composições de acordo com a invenção podem compreender um polipeptídeo da presente invenção como o componente enzimático principal, por exemplo, uma composição monocomponente.

[0097] Alternativamente, as composições podem compreender múltiplas atividades enzimáticas, tais como uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em hidrolase, isomerase, ligase, liase, oxidorreductase, ou transferase, por exemplo, uma alfa- galactosidase, alfa-glucosidase, aminopeptidase, amilase, betagalactosidase, beta-glucosidase, beta-xilosidase, carboidrase, carboxipepti- dase, catalase, celobioidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, endoglucanase, esterase, glucoa- milase, invertase, lacase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribo-nuclease, transglutaminase ou xilanase.

[0098] Preferencialmente, a composição para uso na produção de mosto pode compreender a protease que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1; ou uma composição para uso na produção de mosto pode compreender a protease que tem pelo menos 80% de identidade de sequência e uma ou mais enzimas selecionadas dentre o grupo que consiste em alfa amilase, beta glucanase, pulu- lanase, xilanase e lipase.

[0099] As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. As composições podem ser estabilizadas de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[00100] Abaixo são dados exemplos de usos preferenciais das composições da presente invenção. A dosagem da composição e outras condições sob as quais a composição é usada podem ser determinadas com base em métodos conhecidos na técnica.

[00101] A presente invenção é ainda descrita pelos exemplos que se seguem, que não devem ser interpretados como limitativos do escopo da invenção.

Exemplo 1 Adição de uma protease (SEQ ID NO:1) com geração de Nitrogênio Livre Aminado (FAN) aprimorado durante brassagem de pequena escala

[00102] A protease (SEQ ID NO:1) foi comparada com a protease Neu- trase™ (Novozymes A/S) com o uso do procedimento seguinte: 1. Adicionar 5 g de amido de milho a 100 ml de garrafas de Blue Cap com agitador magnético. 2. Moer o malte (do grupo Danish Malting Group (Prod n° 2012-0646)) no vão de 0,2 mm (moinho Bühler) e pesar 5 g em copos de plástico de medição. 3. Adicionar 25 ml a 95 °C de H2O, 300 μl de CaCl2 (0,2 M) e 300 ppm de Termamyl™ (Novozymes A/S) a cada garrafa com 5 g de amido de milho. 4. Fazer a decocção de acordo com o perfil de brassagem (consultar a Tabela 1 abaixo). 5. Resfriar até 50 °C adicionando-se gelo ou água fria ao banho de água, adicionar 5 g de malte, 25 ml a 52 °C de H2O, 0,3 ml de CaCl2 e protease de acordo com o preparo (5, 10 e 15 mg de proteína de enzima/kg de grão para moagem) a cada garrafa blue cap. 6. Preparar para brassagem, estabelecer tempo e fazer a brassagem manualmente definindo a temperatura no banho de água. 7. Resfriar a 30 °C e filtrar com pequenos funis, 50 ml de cilindros volu-métricos e filtros dobrados (Whatman 5971A 0 185 mm). 8. Medir o nível de Nitrogênio Livre Aminado usando-se ensaio de NO- PA e um Gallery Plus. (O ensaio de NOPA foi o kit de teste de Alfa-Amino Nitrogênio (NOPA) de Thermo Fisher Scientific (Cat. No 984342)). Tabela 1: Perfis de brassagem: Amido de Milho - decocção:

Brassagem de Malte e Milho com um resto de proteína:

Brassagem de Malte e Milho sem um resto de proteína:

RESULTADOS: Tabela 2: Resultados de FAN com um resto de proteína:

Tabela 3: Resultados de FAN sem um resto de proteína:

[00103] Pode ser observado, a partir da Tabela 2 e da Tabela 3, que a protease SEQ ID NO:1 gera surpreendentemente mais FAN do que Neutra- se. Exemplo 2 Adição de uma protease (SEQ ID NO:1) com Nitrogênio Livre Aminado (FAN) em fermentação de laboratório Brassagem: 1. Moer 1.000 g de malte (vão 0,2 mm) 2. Adicionar 75 g de malte a cada um dos 12 béqueres 3. Adicionar 300 ml a 52 °C de água e 4,5 ml de soluções de CaCl2 (0,2 M) 4. Produzir o seguinte perfil de brassagem:

5. Logo após o início, adicionar a protease (SEQ ID NO:1 ou Neutra- se™ - 10 mg de EP/kg de grão para moagem) e 300 ppm de Termamyl™ 6. Depois da brassagem, ajustar em 450 g com água em cada béquer 7. Filtrar as amostras usando carga Falten 597^ 8. Misturar 500 ml de mosto em 8 garrafas bluecap, de acordo com o preparo 9. Pesar 159 mg de hops (Hallertau Hallertauer Taurus (Alfa 17%)) em cada garrafa e ferver por 40 minutos 10. Resfriar e ajustar as garrafas para perda de água com água esterilizada 11. Centrifugar a 8.000 rpm por 30 minutos e transferir o sobrenadante para bluecaps esterilizadas Levedura: • Pesar 100 g de YPD (meios de levedura peptona dextrose para cultivar levedura) em um frasco Pyrex de 2.000 ml que contém 1 barra de agitação - adicionar 1.000 ml de água MQ e colocar em autoclave a solução • Deixar resfriar a 25 °C • "Em condição esterilizada" adicionar uma bolsa de levedura seca (Saflager w-34/70 (11.5 g; Lesafre)) aos meios de YPD • Colocar a solução em coifa e borbulhar ar esterilizado através da solução com agitação média à alta • Deixar borbulhar e agitar de um dia para o outro • Transferir a levedura para garrafas de centrifugação de 2 x 500 ml • Centrifugar a levedura a 2.000 rpm por 3 minutos • Descartar o sobrenadante e ressuspender o sobrenadante em 250 ml de água esterilizada Transferir toda a levedura para uma garrafa de centrifugação de 500 ml. Repetir esse processo 3 vezes • Depois do enxágue final, os péletes de levedura são ressuspensos em 200 ml de água esterilizada • Produzir uma série de diluições 1:10, 1:100 e 1:1.000. Contar as células de levedura na diluição 1:1000 • Adicionar levedura propagada no mosto para alcançar 2x107 célu- las/ml e fechar de modo frouxo a tampa Fermentação: • Colocar as bluecaps em mesa agitadora, 145 rpm a 12 °C por 5 dias • Depois de 5 dias - configurar a mesa agitadora para 120 rpm pelos próximos 2 dias • Resfriar a amostra até 0 °C (colocar a mesma em gelo em uma caixa de isopor com uma tampa e colocar a caixa na sala fria no subsolo a 5 °C) • Deixar repousar por 5 dias

RESULTADOS:

[00104] Os resultados confirmaram a brassagem em pequena escala (Exemplo 1):

[00105] A protease (SEQ ID NO:1) liberou significativamente mais FAN do que Neutrase™ (mais que 40%), quando 10 mg de EP/kg de grão para moagem foram adicionados.

[00106] A cerveja final foi analisada, e nenhum efeito adverso foi observado (dano à espuma, etc.).

Claims (12)

1. Método para preparar um mosto com um nível aumentado de nitrogênio livre aminado (FAN) caracterizado por compreender: a) preparar uma massa a partir de um grão para moagem que compreende malte e/ou adjunto; b) preparar o mosto a partir da massa; e c) adicionar uma protease de SEQ ID NO: 1 à massa ou ao mosto.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a quantidade de nitrogênio livre aminado (FAN) ser aumentada em pelo menos 20% em comparação com um mosto produzido na ausência da protease.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por, adicionalmente, uma alfa amilase ser adicionada à massa.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por, adicionalmente, uma beta glucanase ser adicionada à massa.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por, adicionalmente, uma pululanase ser adicionada à massa.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por, adicionalmente, uma xilanase ser adicionada à massa.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por, adicionalmente, uma lipase ser adicionada à massa.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por a protease ser adicionada em uma quantidade de 1 a 100 mg de proteína de enzima por kg de grão para moagem.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por o grão para moagem compreender pelo menos 10% (p/p) de adjunto.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por o adjunto ser selecionado a partir do grupo que consiste em cevada, arroz, milho, sorgo e mandioca.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por o mosto ser fermentado para obter uma cerveja.

12. Uso de uma protease caracterizado por ter a SEQ ID NO: 1 na produção de mosto.