BR112017016318B1 - Sal de ácido fumárico, inibidor de btk, composição farmacêutica e agente antitumoral compreendendo o dito sal e uso do dito sal - Google Patents

Abstract

sal de composto de pirimidina fundida e cristal do mesmo. é fornecido um sal possuindo alta seletividade para btk e útil como ingrediente medicamentoso para um produto farmacêutico. foi descoberto que o fumarato do composto a é livre da característica de hidrato canal, é estável e possui excelente propriedade absortiva, quando comparado ao composto a ou a outros sais deste.

Description

Campo Técnico

[001]A presente invenção refere-se a um novo sal de um composto possuindo atividade inibitória contra a tirosina quinase de Bruton (BTK) e um cristal do mesmo.

Antecedentes da Invenção

[002]É sabido que várias proteínas quinases existem in vivo e estão envolvidas na regulação de uma série de funções. A tirosina quinase de Bruton (BTK) é uma proteína quinase que pertence à família Tec de quinases, e é uma tirosina quinase não receptora que desempenha um importante papel relativo ao controle de, por exemplo, proliferação, sobrevivência, diferenciação e ativação das células B a jusante do sinal do receptor da célula B (BCR) (literatura não patentária 1). Um inibidor capaz de controlar a atividade de BTK é considerado útil como agente terapêutico para doenças associadas à hiperatividade anormal da via de sinalização de BTK (por exemplo, câncer).

[003]No que diz respeito a um composto possuindo atividade inibitória contra BTK, PCI-32765 (literatura não patentária 2) e os compostos descritos nas literaturas patentárias 1 e 2 são conhecidos.

[004]Os compostos descritos nas literaturas patentárias 1 e 2 são também conhecidos por exibir alta atividade inibitória para EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) e JAK3 (Janus quinase 3), por exemplo, em adição a BTK. No entanto, como um inibidor de multiquinase suprime, por exemplo, a proliferação celular pela inibição de várias vias de sinalização, há uma preocupação com relação à variedade de efeitos adversos. Por exemplo, é sabido que o EGFR se conecta ao seu ligante, por exemplo, o fator de crescimento epidérmico (EGF), e participa da proliferação e sobrevivência (por exemplo, inibição da apoptose) de várias células (literatura patentária 3). Entretanto, é reconhecido que inibidores que alvejam o EGFR causam efeitos adversos, tais como distúrbios de pele e disfunção gastrointestinal em geral, e é amplamente suposto que estes efeitos adversos podem estar relacionados à inibição da via de sinalização do EGFR tipo nativo (literatura não patentária 4).

[005]Assim, PCI-45292 é conhecido como um composto, que possui uma atividade inibitória contra BTK com uma atividade inibitória contra EGFR (literatura pa- tentária 5). Lista de Referências Literaturas Patentárias Literatura patentária 1: WO 2011/090760 Literatura patentária 2: WO 2009/158571 Literaturas Não Patentárias Literatura não patentária 1: Curr. Opin. Immunol., jun 2000; 12 (3): 282-8 Literatura não patentária 2: Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 20 jul 2010; 107 (29): 13075-80 Literatura não patentária 3: Nature Rev. Cancer, Vol. 6, pp. 803-811 (2006) Literatura não patentária 4: Nature Rev. Clin. Oncol, Vol 6, pp. 98-109 (2012) Literatura não patentária 5: American College of Rheumatology Annual Meeting, Atlanta, GA, 6-11 de novembro, 2010

Sumário da Invenção Problema Técnico

[006]Um objeto da presente invenção é fornecer um sal que é um inibidor de BTK com alta seletividade, possuindo uma alta atividade inibitória contra BTK e uma baixa atividade inibitória contra outras quinases, tais como EGFR, e que é útil como um ingrediente medicamentoso para um produto farmacêutico.

Solução para o Problema

[007]Como resultado de uma pesquisa cuidadosa para solução do problema, o presente Requerente descobriu que (R)-1-(1-acriloilpiperidin-3-il)-4-amino-N- (benzo[d]oxazol-2-il)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina-3-carboxamida (Composto A) representado pela fórmula abaixo (1) possui uma alta atividade inibitória contra BTK, com baixa atividade inibitória contra outras quinases, tais como EGFR, e é útil como medicamento para o tratamento de cânceres, doenças autoimunes ou doenças alérgicas.

[008]Então, durante uma pesquisa das propriedades físico-químicas do Composto A com o propósito de desenvolver uma formulação do Composto A, o presente Requerente descobriu que (1) o Composto A é difícil de ser utilizado como um ingrediente medicamentoso para um produto farmacêutico, pois possui uma característica como a de hidrato canal de absorver a umidade do ar quando uma forma livre do Composto A é exposta a uma atmosfera de alta umidade, e de liberar a umidade quando exposta a uma atmosfera de alta umidade, (2) um sal de adição de ácido é produzido apenas com ácido tartárico, ácido fosfórico ou ácido fumárico, com relação a um sal de adição de ácido do Composto A, e (3) surpreendentemente, dentre estes sais de adição de ácido, apenas o fumarato não apresenta a característica de hidrato canal, e atingiu os objetivos da presente invenção.

[009]Mais especificamente, na produção industrial de um produto farmacêutico, é necessário que o ingrediente medicamentoso possua estabilidade, etc. No entanto, a estabilidade, etc. dependem do atributo de cada composto. Logo, em um composto complexo, é difícil prever um sal possuindo propriedades adequadas como um ingrediente medicamentoso para um produto farmacêutico, e consequentemente, é desejado descobrir, para cada composto, vários sais que sejam úteis para produtos farmacêuticos. A partir de tal ponto de vista, o presente Requerente sintetizou vários sais do Composto A e pesquisou as propriedades, estabilidade, etc. dos mesmos. Como resultado, nossa pesquisa progrediu na formação de um sal de fumarato, sal de tartarato, sal de fosfato e sal de magnésio. Entretanto, dentre estes sais e uma forma livre, o tartarato e a forma livre apresentaram a característica de hidrato canal e uma estabilidade sólida fraca; o fosfato falhou em manter sua forma de cristal original em um teste de absorção/dessorção de umidade, e, além disso, apresentou uma estabilidade sólida fraca; e o sal de magnésio apresentou uma baixa pureza do cristal, para incluir inúmeras substâncias análogas. Foi descoberto que apenas o fumarato poderia evitar a característica de hidrato de canal e, ao mesmo tempo, era excelente na operabilidade de obtenção e reprodutibilidade, estável e excelente na propriedade absortiva, e, assim, a presente invenção foi conseguida.

[010]Assim, a presente invenção refere-se aos seguintes itens 1 a 18. 1)Fumarato de (R)-1-(1-acriloilpiperidin-3-il)-4-amino-N-(benzo[d]oxazol-2-il)- 1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina-3-carboxamida (Composto A). 2)Hemifumarato de (R)-1-(1-acriloilpiperidin-3-il)-4-amino-N-(benzo[d] oxazol -2-il)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina-3-carboxamida. 3)Monofumarato de (R)-1-(1-acriloilpiperidin-3-il)-4-amino-N-(benzo[d] oxazol-2-il)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina-3-carboxamida. 4)Inibidor de BTK contendo o fumarato do Composto A como ingrediente ativo. 5)Composição farmacêutica contendo o fumarato do Composto A. 6)Agente antitumoral ou agente terapêutico e/ou preventivo para doenças alérgicas, doenças autoimunes ou doenças inflamatórias contendo o fumarato do Composto A como ingrediente ativo. 7)Agente antitumoral contra um tumor hematológico ou agente terapêutico e/ou preventivo para rinite alérgica, polinose, dermatite atópica, artrite reumatoide e lúpus sistêmico eritematoso, que contém o fumarato do Composto A como ingrediente ativo. 8)Uso do fumarato do Composto A para produção de um inibidor de BTK. 9)Uso do fumarato do Composto A para produção de uma composição farmacêutica. 10)Uso do fumarato do Composto A para produção de um agente antitumoral ou agente terapêutico e/ou preventivo para doenças alérgicas, doenças autoimunes ou doenças inflamatórias. 11)Uso de fumarato do Composto A para produção de um agente antitumoral contra um tumor hematológico ou de um agente terapêutico e/ou preventivo para rinite alérgica, polinose, dermatite atópica, artrite reumatoide e lúpus sistêmico eritematoso. 12)Fumarato do Composto A para uso na inibição de BTK. 13)Fumarato do Composto A para uso como um medicamento. 14)Fumarato do Composto A para uso em um agente terapêutico e/ou preventivo para um tumor, doença alérgica, doença autoimune ou doença inflamatória. 15)O fumarato do Composto A para uso na prevenção ou tratamento de um tumor hematológico, rinite alérgica, polinose, dermatite atópica, artrite reumatoide ou lúpus sistêmico eritematoso. 16)Método para inibição de BTK, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do fumarato do Composto A a um paciente que necessite do mesmo. 17)Método para prevenção e/ou tratamento de um tumor, de uma doença alérgica, de uma doença autoimune ou de uma doença inflamatória, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do fumarato do Composto A a um paciente que necessite do mesmo. 18)Método para tratamento de um tumor hematológico, rinite alérgica, poli- nose, dermatite atópica, artrite reumatoide ou lúpus sistêmico eritematoso, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz do fumarato do Composto A a um paciente que necessite do mesmo.

Efeitos Favoráveis da Invenção

[011]O fumarato do Composto A da presente invenção possui uma excelente estabilidade sólida como ingrediente ativo para um produto farmacêutico, e é capaz de evitar a característica de hidrato canal, em comparação com o Composto A ou outros sais que não o fumarato do Composto A, e excelente na operabilidade de obtenção e reprodutibilidade. Além disso, o fumarato do Composto A da presente invenção exibe uma excelente propriedade de absorção oral, e é extremamente útil como um produto farmacêutico ou ingrediente ativo para um produto farmacêutico.

Breve Descrição dos Desenhos

[012]A figura 1 ilustra o espectro de difração por raio X em pó do monofuma- rato do Composto A (amorfo) sintetizado no Exemplo 1 (o eixo das ordenadas representa a intensidade (cps) e o eixo das abscissas representa o ângulo de difração (2θ ± 0,1°)).

[013]A figura 2 mostra o espectro de difração por raio X em pó do hemifuma- rato do Composto A (cristal) sintetizado no Exemplo 2 (o eixo das ordenadas representa a intensidade (cps) e o eixo das abscissas representa o ângulo de difração (2θ ± 0,1°)).

[014]A figura 3 ilustra a curva de calorimetria diferencial de varredura (DSC) do hemifumarato do Composto A (cristal) sintetizado no Exemplo 2.

[015]A figura 4 ilustra o espectro de difração por raio X em pó do monofuma- rato do Composto A (cristal) sintetizado no Exemplo 3 (o eixo das ordenadas representa a intensidade (cps) e o eixo das abscissas representa o ângulo de difração (2θ ± 0,1°)).

[016]A figura 5 mostra a curva de calorimetria diferencial de varredura (DSC) do monofumarato do Composto A (cristal) sintetizado no Exemplo 3.

[017]A figura 6 ilustra a curva isotérmica da absorção/dessorção de umidade do Composto A.

[018]A figura 7 ilustra a curva isotérmica de absorção/dessorção de umidade do monofumarato do Composto A (cristal).

[019]A figura 8 mostra a curva isotérmica de absorção/dessorção de umidade do hemifumarato do Composto A (cristal).

[020]A figura 9 ilustra a curva isotérmica de absorção/dessorção de umidade do hemitartarato do Composto A.

[021]A figura 10 ilustra a curva isotérmica de absorção/dessorção do mono- fosfato do Composto A.

[022]A figura 11 mostra o efeito do monofumarato do Composto A (cristal) em um exemplo de artrite induzida por colágeno em camundongos.

Descrição das Modalidades

[023]A seguir, a presente invenção será descrita detalhadamente.

[024]O Composto “A” descrito, de forma simples, no presente relatório descritivo refere-se a (R)-1-(1-acriloilpiperidin-3-il)-4-amino-N-(benzo[d]oxazol-2-il)-1H-pira- zolo[3,4-d]pirimidina-3-carboxamida, em sua forma livre.

[025]O “fumarato do Composto A” conforme descrito no presente relatório descritivo pode ser uma das formas de sal do Composto A com ácido fumárico, envolvendo monofumarato e hemifumarato. O termo é ainda utilizado com significado envolvendo ambos o cristal de fumarato do Composto e o amorfo de fumarato do Composto A. O fumarato do Composto A é preferencialmente monofumarato do Composto A (que pode ser abreviado como “Composto A^monofumarato”) e hemifumarato do Composto A (que pode ser abreviado como “Composto A^monofumarato”); mais preferencialmente monofumarato do Composto A (cristal), hemifumarato do Composto A (cristal) e monofumarato do Composto A (amorfo); e particular e preferencialmente monofumarato do Composto A (cristal) e hemifumarato do Composto A (cristal).

[026]No presente relatório descritivo, os termos “cristal” e “amorfo” são utilizados conforme significados usuais.

[027]As múltiplas formas de cristais que diferem umas das outras pela disposição atômica ordenada, em relação ao espaço, e pelas propriedades físico-químicas (polimorfismos) ocorrem em alguns casos. O sal da presente invenção pode ser qualquer um destes polimorfismos, e pode ser uma mistura de dois ou mais polimorfismos, ou uma mistura de um cristal e um amorfo.

[028]A presente invenção também compreende uma forma rotulada do fuma- rato do Composto A, isto é, um composto possuindo um ou mais átomos do Composto A ou um fumarato substituído com um elemento radioisotópico ou um elemento não radioisotópico.

[029]Neste sentindo, em um espectro de difração por raio X em pó, um ângulo de difração ou um padrão geral é importante para a identificação de uma identidade dos cristais, para uma natureza de dados. A intensidade relativa de um espectro de difração por raio X pode variar levemente dependendo da direção de crescimento do cristal, tamanho das partículas ou condição da medição, e, portanto, não deve ser rigorosamente interpretada.

[030]Um valor numérico obtido a partir de vários padrões pode estar acompanhado de um leve desvio devido à direção de crescimento do cristal, ao tamanho das partículas ou a sua condição da medição. Assim, no presente relatório descritivo, o termo ângulo de difração (2θ ± 0,1°) no espectro de difração por raio X em pó refere- se a um valor que pode estar na faixa de ± 0,1° de um valor.

[031]O termo “em torno de” que é utilizado para uma temperatura de pico de um pico endotérmico em uma curva de calorimetria diferencial de varredura (DSC) refere-se a um valor que é aproximadamente a temperatura, preferencialmente refere- se a um valor que pode estar dentro da faixa de ± 5°C. Mais preferencialmente, este refere-se a um valor que pode estar dentro da faixa de ± 2°C do valor.

[032]É preferível que o fumarato do Composto A (cristal) possua o espectro de difração por raio X em pó conforme mostrado na figura 4 e/ou a curva de calorimetria diferencial de varredura (DSC) conforme mostrado na figura 5.

[033]Aqui, picos característicos do monofumarato do Composto A (cristal) em um espectro de difração por raio X em pó podem incluir 7,2°, 12,4°, 15,6°, 25,9° e 27,6°, mais preferencialmente 7,2°, 12,4°, 14,4°, 15,0°, 15,6°, 19,0°, 22,3°, 22,6°, 23,4°, 25,5°, 25,9° e 27,6°, em termos do ângulo de difração (2θ ± 0,1°).

[034]O monofumarato do Composto A (cristal) da presente invenção é um cristal possuindo pelo menos dois ou mais picos selecionados dentre os picos preferenciais descritos acima, preferencialmente um cristal possuindo pelo menos três ou mais picos selecionados dentre os picos, mais preferencialmente um cristal possuindo pelo menos cinco ou mais picos selecionados dentre os picos, e ainda mais preferencialmente, um cristal possuindo pelo menos oito ou mais picos selecionados dentre os picos, e particular e preferencialmente um cristal possuindo todos os picos descritos acima.

[035]O pico endotérmico em uma curva de calorimetria diferencial de varredura (DSC) do monofumarato do Composto A (cristal) pode incluir aqueles em torno de 219°C a 224°C, e preferencialmente em torno de 223°C.

[036]Outra forma preferencial do monofumarato do Composto A (cristal) da presente invenção pode ser um cristal no qual o ângulo de difração (2θ ± 0,1°) possui pelo menos dois ou mais, preferencialmente pelo menos três ou mais, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco ou mais picos selecionados dentre 7,2°, 12,4°, 15,6°, 25,9° e 27,6° em um espectro de difração por raio X em pó; e uma temperatura de pico em uma curva de calorimetria diferencial de varredura (DSC) possui um pico endotérmico em torno de 219 a 224°C, e preferencialmente em torno de 223°C. Ainda outra forma preferencial pode ser um cristal no qual um ângulo de difração (2θ ± 0,1°) em um espectro de difração por raio X em pó possui pelo menos dois ou mais, preferencialmente pelo menos três ou mais, mais preferencialmente pelo menos cinco ou mais, ainda mais preferencialmente pelo menos oito ou mais, e ainda mais preferen-cialmente todos os picos selecionados centre 7,2°, 12,4°, 14,4°, 15,0°, 15,6°, 19,0°, 22,3°, 22,6°, 23,4°, 25,5°, 25,9° e 27,6°; e ao mesmo tempo, uma temperatura de pico em uma curva de calorimetria diferencial de varredura (DSC) possui um pico endotér- mico em torno de 219°C a 224°C, e preferencialmente em torno de 223°C.

[037]É preferível que o hemifumarato do Composto A (cristal) possua o espectro de difração por raio X em pó como mostrado na figura 2 e/ou a curva de calorimetria diferencial de varredura (DSC) como mostrada na figura 3.

[038]Aqui, picos característicos do hemifumarato do Composto A (cristal) em um espectro de difração por raio X em pó podem incluir 4,5°, 5,8°, 16,6°, 20,2° e 26,4°, e mais preferencialmente 4,5°, 5,8°, 11,2°, 12,1°, 12,4°, 13,4°, 16,6°, 17,3°, 18,2°, 20,2°, 26,4° e 27,1°, em termos do ângulo de difração (2θ ± 0,1°).

[039]O hemifumarato do Composto A (cristal) da presente invenção é um cristal possuindo pelo menos dois ou mais picos selecionados dentre os picos mais preferenciais descritos acima, preferencialmente um cristal possuindo pelo menos três ou mais picos selecionados dentre os picos, mais preferencialmente um cristal possuindo pelo menos cinco ou mais picos selecionados dentre os picos, e ainda mais preferencialmente um cristal possuindo pelo menos oito ou mais picos selecionados dentre os picos, e particular e preferencialmente um cristal possuindo todos os picos.

[040]O pico endotérmico em uma curva de calorimetria diferencial de varredura (DSC) do hemifumarato (cristal) do Composto A pode incluir aqueles em torno de 197°C a 199°C, e preferencialmente em torno de 198°C.

[041]Outras formas preferenciais do hemifumarato do Composto A (cristal) da presente invenção podem incluir um cristal no qual o ângulo de difração (2θ ± 0,1°) possui pelo menos dois ou mais, preferencialmente pelo menos três ou mais, e mais preferencialmente pelo menos cinco ou mais picos selecionados dentre 4,5°, 5,8°, 16,6°, 20,2° e 26,4° em um espectro de difração por raio X em pó; e a temperatura de pico em uma curva de calorimetria diferencial de varredura (DSC) possui um pico en- dotérmico em torno de 197 a 199°C, e preferencialmente em torno de 198°C. Ainda outras formas deste podem incluir um cristal no qual o ângulo de difração (2θ ± 0,1°) em um espectro de difração por raio X em pó possui pelo menos dois ou mais, preferencialmente pelo menos três ou mais, mais preferencialmente pelo menos cinco ou mais, ainda mais preferencialmente pelo menos oito ou mais, e ainda mais preferencialmente todos os picos selecionados dentre 4,5°, 5,8°, 11,2°, 12,1°, 12,4°, 13,4°, 16,6°, 17,3°, 18,2°, 20,2°, 26,4° e 27,1°; e ao mesmo tempo, a temperatura de pico na curva de calorimetria diferencial de varredura (DSC) possui um pico endotérmico em torno de 197°C e 199°C, e preferencialmente em torno de 198°C.

[042]É também possível obter o fumarato do Composto A da presente invenção como um amorfo. Especificamente, um amorfo do fumarato do Composto A da presente invenção possui uma imagem de difração exibindo um padrão halo que é amplo e pouco nítido no espectro de difração por raio X em pó, e mais preferencialmente possui o espectro de difração por raio X em pó como mostrado na figura 1.

[043]O Composto A pode ser sintetizado, por exemplo, de acordo com os Exemplos de Referência 1 e 2 que serão descritos posteriormente. O método de síntese do Composto A não está limitado aos Exemplos de Referência 1 e 2 que serão citados posteriormente.

[044]Mais especificamente, o cloreto de metanossulfonila é reagido com (S)- N-Boc-3-piperidinol na presença de uma amina terciária, tal como trietilamina, para obtenção de (S)-terc-butil-3-(metilsufoniloxi)piperidina-1-carboxilato. Subsequentemente, este composto é reagido com 3-iodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina-4-amina na presença de uma base, tal como carbonato de potássio, para obter-se (R)-terc-butil- 3-(4-amino-3-iodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)piperidina-1-carboxilato. Então, este composto é reagido com um catalisador de paládio e uma base na presença de benzo[d]oxazol-2-amina, sob uma atmosfera de monóxido de carbono, para obtenção de (R)-terc-butil-3-(4-amino-3-((benzo[d]oxazol-2-il)carbamoil)-1H-pirazolo[3,4-d]piri- midin-1-il)piperidina-1-carboxilato. Subsequentemente, um grupo protetor Boc é removido deste composto que é, então, reagido com cloreto de acriloíla, para, assim, obter- se o Composto A.

[045]O monofumarato do Composto A da presente invenção (amorfo) pode ser produzido, por exemplo, a partir do método a seguir.

[046]É adicionado, ao Composto A, tetraidrofurano (THF) em uma quantidade de 100 a 300 vezes este, e preferencialmente 150 vezes, e água em uma quantidade de 0,01 a 1 vez, preferencialmente 0,1 vez. À mistura, é adicionado e dissolvido ácido fumárico em uma quantidade molar igual à do Composto A.

[047]O solvente é destilado por destilação azeotrópica da mistura com THF, por diversas vezes, preferencialmente 2 a 5 vezes. Assim, é possível obter um amorfo do monofumarato do Composto A como um pó branco.

[048]O monofumarato do Composto A (cristal) da presente invenção pode ser obtido como um pó branco, por exemplo, pela suspensão do monofumarato do Composto A (amorfo) em acetonitrila em uma quantidade de 5 a 50 vezes este, preferencialmente 20 vezes, e pela condução de uma suspensão aquecida por 12 a 72 horas, preferencialmente 24 horas.

[049]O hemifumarato do Composto A (cristal) da presente invenção pode ser obtido como um pó branco, por exemplo, pela suspensão do monofumarato do Composto A (amorfo) em metiletilcetona em uma quantidade de 10 a 100 vezes este, preferencialmente 60 vezes, e pela condução de uma suspensão aquecida por 12 a 72 horas, preferencialmente 24 horas.

[050]De acordo com o fumarato do Composto A da presente invenção, é possível evitar a característica de hidrato canal do Composto A.

[051]Em geral, em um produto farmacêutico ou em um ingrediente medicamentoso para um produto farmacêutico que é preparado com um composto com a característica de hidrato canal evitada, é conhecido que os problemas de estocagem e de controle de qualidade da umidade de uma condição de estocagem deste são reduzidos; e também que, quando uma preparação solida como um comprimido ou cápsula é produzido, é possível reduzir os problemas na preparação devido à alteração de peso de um ingrediente ativo.

[052]Portanto, pode ser dito que, de acordo com o fumarato do Composto A da presente invenção, é possível esperar uma estocagem estável e um controle de qualidade simples, e também que, em termos de preparação, o fumarato do Composto A da presente invenção é um excelente composto que é fácil de ser manuseado.

[053]O fumarato do Composto A da presente invenção é excelente na opera- bilidade de obtenção e reprodutibilidade, comparado a outros sais do Composto A. Especificamente, por exemplo, um sal do Composto A com ácido clorídrico, ácido sul- fúrico, ácido succínico, ácido málico, ácido cítrico ou ácido acético não foi formado pelo método de pesquisa descrito no presente relatório descritivo. Por exemplo, em uma formação de sal de sódio do Composto A, ocorreu notavelmente uma decomposição. Quando um sal de hemi-magnésio do Composto A foi sintetizado, o número de substâncias análogas aumentou, e além disso, a operação para obtenção do sal foi complexa, e o sal difícil de ser redissolvido devido a sua baixa solubilidade em água e em solvente orgânico.

[054]O fumarato do Composto A da presente invenção é fácil de ser manuseado como um ingrediente medicamentoso, para um produto farmacêutico, e contribui para produção industrial do produto farmacêutico, possuindo qualidade estável.

[055]O fumarato do Composto A da presente invenção é excelente na estabilidade sólida. É importante para um composto candidato, a ser desenvolvido como um produto farmacêutico, possuir uma estabilidade sólida, em uma operação industrial e na manutenção da qualidade. Portanto, o fumarato do Composto A da presente invenção possui excelentes propriedades requeridas para um produto farmacêutico ou ingrediente medicamentoso para um produto farmacêutico.

[056]O fumarato do Composto A da presente invenção é excelente em relação à propriedade absortiva oral e contribui para o fornecimento de um produto farmacêutico excelente, com alta qualidade.

[057]Dentre os sais do Composto A, o fumarato do Composto A da presente invenção é excelente em qualquer aspecto dentre operabilidade de obtenção, repro- dutibilidade, estabilidade sólida, e propriedade absortiva oral, ao mesmo tempo que evita a característica de hidrato canal que o Composto A possui e mantém uma solubilidade suficiente como ingrediente medicamentoso para um produto farmacêutico.

[058]O fumarato do Composto A da presente invenção possui uma excelente atividade inibitória contra BTK, e é útil como um agente terapêutico e/ou preventivo de, por exemplo, cânceres, tumores e várias doenças imunes (por exemplo, doenças alérgicas, doenças autoimunes e doenças inflamatórias). Ademais, o fumarato possui uma excelente seletividade para BTK e tem a vantagem de possuir efeitos adversos reduzidos oriundos da inibição de outras quinases (por exemplo, EGFR).

[059]O fumarato do Composto A da presente invenção possui uma excelente atividade inibitória contra BTK. A “BTK”, de acordo com o presente relatório descritivo, inclui BTKs de mamíferos humanos e não humanos, e a BTK é preferencialmente uma BTK humana. Por acaso, o termo “BTK” inclui suas isoformas.

[060]Adicionalmente, devido a sua excelente atividade inibitória contra BTK, o fumarato do Composto A da presente invenção é útil como um medicamento para a prevenção ou tratamento de doenças associadas à BTK. As “doenças associadas à BTK” incluem doenças que sofrem uma diminuição na taxa de incidência e remissão, alívio e/ou completa recuperação dos sintomas como resultado da eliminação, supressão e/ou inibição das funções de BTK. Exemplos de tais doenças incluem cânceres ou tumores, doenças alérgicas, doenças autoimunes, doenças inflamatórias, a doença do enxerto contra hospedeiro sem limitação, e são preferencialmente cânceres, tumores, doenças alérgicas e doenças autoimunes.

[061]Não há nenhuma limitação particular para os cânceres e tumores alvo e exemplos destes incluem cânceres epiteliais (por exemplo, cânceres no sistema respiratório, cânceres no sistema gastrointestinal, cânceres no sistema reprodutivo e cânceres no sistema de secreção), sarcomas, tumores no sistema hematopoiético, tumores no sistema nervoso central e tumores nos nervos periféricos. Os exemplos preferenciais são os tumores no sistema hematopoiético (por exemplo, leucemia, mieloma múltiplo e linfoma maligno). Adicionalmente, não há nenhuma limitação particular para os tipos de órgãos de desenvolvimento do tumor, e exemplos destes incluem carcinomas de pescoço e cabeça, câncer esofágico, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer de reto, câncer de fígado, câncer de duto biliar/ vesícula biliar, câncer do trato biliar, câncer de pâncreas, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de útero, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de próstata, tumores testiculares, sarcoma de tecido mole/ ossos, tumores hematológicos, mi- eloma múltiplo, câncer de pele, tumores de cérebro e câncer mesotelial. Os exemplos preferenciais dos tumores no sistema hematopoiético incluem leucemia aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielogênica aguda, linfoma linfoblástico, neoplasmas mieloproliferativos, leucemia linfocítica crônica, lin- foma linfocítico de pequenas células, síndromes mielodisplásicas, linfoma folicular, linfoma MALT, linfoma de zona marginal, linfoma linfoplasmocítico, macroglobulinemia de Waldenstroem, linfoma de células do manto, linfoma difuso de células B, linfoma de Burkitt, linfoma extranodal de células T/ NK, linfoma Hodgkin e mieloma múltiplo. Particularmente, os exemplos preferenciais incluem tumores hematológicos tais como linfoma/ leucemia linfoblástica de células B, linfoma folicular, linfoma de células do manto, linfoma de zona marginal folicular nodal, linfoma difuso de células B, linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica crônica, linfoma linfocítico de pequenas células, macro- globulinemia de Waldenstroem, linfoma extranodal de células T/ NK, linfoma Hodgkin, síndromes mielodisplásicas, leucemia mielogênica aguda e leucemia linfocítica aguda.

[062]Não há nenhuma limitação particular para as doenças alérgicas alvo e exemplos desta incluem, por exemplo, asma brônquica, rinite alérgica, polinose, dermatite atópica, alergia alimentar, anafilaxia, alergia a medicamentos, urticária e con- juntivite. Os exemplos preferenciais destas incluem asma brônquica, rinite alérgica, polinose e dermatite atópica; e, particularmente, os exemplos preferenciais incluem rinite alérgica, polinose e dermatite atópica.

[063]Não há nenhuma limitação para as doenças autoimunes alvo e exemplos destas incluem artrite reumatoide, lúpus sistêmico eritematoso, esclerodermia, polimi- osite, síndrome de Sjogren e doença de Behcet. Os exemplos preferenciais destas incluem artrite reumatoide e lúpus sistêmico eritematoso, e o exemplo particularmente preferencial é a artrite reumatoide.

[064]Não há nenhuma limitação para as doenças inflamatórias alvo e exemplos destas incluem apendicite, blefarite, bronquiolite, bronquite, bursite, cervicite, colangite, colecistite, colite ulcerativa, doença de Crohn, síndrome do intestino irritável, cistite, dacrioadenite, dermatite de contato, dermatomiosite, cerebrite, endocardite, endometrite, epididimite, faciíste, fibrosite, gastroenterite, hepatite, abscesso sudorí- fero, laringite, mastite, meningite, mielite, miocardite, nefrite, ovarite, didimite, pancreatite, parotite, pericardite, peritonite, faringite, pleurite, flebite, pneumonia, rectite, prostatite, pielonefrite, salpingite, nasosinusite, estomatite, osteoartrite, sinovite, tendinite, tonsilite, uveíte, vaginite, vasculite e vulvite. Os exemplos preferenciais podem incluir colite ulcerativa, doença de Crohn, síndrome do intestino irritável, dermatite de contato, cistite e osteoartrite. Os exemplos particularmente preferenciais podem incluir dermatite de contato, cistite e osteoartrite.

[065]Quando o fumarato do Composto A da presente invenção é utilizado como uma composição farmacêutica, várias formas de dosagem podem ser empregadas de acordo com o propósito de prevenção ou tratamento incorporando veículos farmacêuticos conforme necessário. A forma de dosagem pode ser, por exemplo, qualquer uma dentre preparação oral, preparação injetável, preparação em supositório, pomada ou adesivo (patch). Qualquer uma destas formas de dosagem pode ser produzida por meio de um método de formulação que é publicamente conhecido e convencionalmente utilizado por técnicos no assunto. Particularmente, um comprimido para administração oral, um comprimido revestido, uma pílula, uma preparação granular, uma preparação em pó e uma preparação em cápsula que contêm um cristal do fumarato do Composto A como um ingrediente medicamentoso para produção apresentam vantagens como uma preparação sólida estável,

[066]Com relação aos veículos farmacêuticos, diversos materiais de veículos orgânicos ou inorgânicos que são convencionalmente utilizados como materiais para formulação são utilizados, e os veículos farmacêuticos são incorporados como, por exemplo, um excipiente, um ligante, um desintegrante, um lubrificante e um agente de revestimento em preparações sólidas; e como um solvente, um auxiliar de dissolução, um agente de suspensão, um agente isotônico, um agente de ajuste de pH, um agente de tamponamento e um agente analgésico em preparações líquidas. Além disso, se necessário, aditivos de formulação, tais como um antisséptico, um antioxidante, um corante, um agente de sabor/flavorizante e um estabilizante também podem ser utilizados.

[067]Os exemplos de excipiente incluem lactose, sacarose, D-manitol, amido, celulose cristalina e silicato de cálcio.

[068]Os exemplos de ligante incluem hidroxipropilcelulose, metilcelulose, po- livinilpirrolidona, pó de açúcar e hipromelose.

[069]Os exemplos de desintegrante incluem glicolato de amido sódico, carme- lose cálcica, croscarmelose sódica, crospovidona, hidroxiproprilcelulose pouco substituída e amido parcialmente gelatinizado.

[070]Os exemplos de lubrificante incluem talco, estearato de magnésio, ésteres de ácido graxo de sacarose, ácido esteárico e estearil fumarato de sódio.

[071]Os exemplos de agente de revestimento incluem etilcelulose, copolímero de metacrilato de aminoalquila RS, hipromelose e sacarose.

[072]Os exemplos de solvente incluem água, propileno glicol e soro fisiológico.

[073]Os exemplos de auxiliar de dissolução incluem polietileno glicol, etanol, α-ciclodextrina, Macrogol 400 e polissorbato 80.

[074]Os exemplos de agente de suspensão incluem carragenana, celulose cristalina, carmelose sódica e óleo de mamona hidrogenado com polioxietileno.

[075]Os exemplos de agente isotônico incluem cloreto de sódio, glicerina e cloreto de potássio.

[076]Os exemplos de agente de ajuste de pH e agente de tamponamento incluem citrato de sódio, ácido clorídrico, ácido lático, ácido fosfórico e fosfato monos- sódico.

[077]Os exemplos de agente analgésico incluem cloridrato de procaína e lido- caína.

[078]Os exemplos de agente antisséptico incluem para-oxibenzoato de etila, cresol e cloreto de benzalcônio.

[079]Os exemplos de antioxidante incluem sulfito de sódio, ácido ascórbico e vitamina E natural.

[080]Os exemplos de corante incluem óxido de titânio, sesquióxido de ferro, corante alimentício azul n° 1 e clorofila de cobre.

[081]Os exemplos de agente de sabor/ flavorizante incluem aspartame, sacarina, sucralose, L-mentol e flavorizante de menta.

[082]Os exemplos de estabilizador incluem pirossulfito de sódio, edetato de sódio, ácido eritórbico, óxido de magnésio e dibutilhidroxitolueno.

[083]Na fabricação de uma preparação sólida oral, um excipiente, um ligante, um desintegrante, um lubrificante, um corante e um agente de sabor/ flavorizante são opcionalmente adicionados ao fumarato do Composto A e, então, por exemplo, um comprimido, um comprimido revestido, uma preparação granular, uma preparação em pó ou uma preparação em cápsula pode ser produzido por meio de um método convencional.

[084]Na fabricação de uma preparação injetável, um agente de ajuste de pH, um agente de tamponamento, um estabilizador, um agente isotônico e um anestésico local são adicionados ao fumarato do Composto A e, assim, preparações injetáveis subcutânea, intramuscular e intravenosa podem ser produzidas por meio de um mé-todo convencional.

[085]As quantidades de fumarato do Composto A a serem incorporadas nas várias formas de dosagem unitária podem variar dependendo dos sintomas do paciente ao qual estas devem ser aplicadas, ou dependendo da forma de formulação; entretanto, é desejável, em geral, ajustar a quantidade para 0,05 a 1.000 mg na preparação oral, para 0,01 a 500 mg na preparação injetável, para 1 a 1.000 mg em uma preparação em supositório, por forma de dosagem unitária.

[086]Adicionalmente, a dose diária de um medicamento possuindo a forma de dosagem descrita acima pode variar com, por exemplo, os sintomas, peso corporal, idade e gênero do paciente, e não pode ser determinada indiscriminadamente. No entanto, a dose pode ser usualmente ajustada de 0,05 a 5.000 mg, e preferencialmente de 0,1 a 1.000 mg, por dia para um adulto (peso corporal: 50 kg), e é preferível administrar esta quantidade uma vez ao dia, ou em porções divididas em cerca de duas a três vezes por dia.

Exemplos

[087]A seguir, a presente invenção será descrita de forma mais específica por meio de Exemplos, mas a presente invenção não deve ser limitada a estes. Embora a presente invenção esteja suficientemente descrita pelos Exemplos, deve ser entendido que várias alterações ou modificações podem ser realizadas por técnicos no assunto. Consequentemente, tais alterações ou modificações também fazem parte da presente invenção, a menos que desviem do escopo da presente invenção.

[088]Com relação aos vários reagentes utilizados nos Exemplos, a menos que particularmente afirmado o contrário, foram utilizados produtos comercialmente disponíveis. Para cromatografia em coluna de sílica gel, foi utilizada uma PURIF-PACK (marca registrada) SI fabricada por Schott Moritex Corp., uma coluna pré-revestida de sílica, KP-Sil (marca registrada) fabricada por Biotage AB ou uma coluna pré-revestida de sílica, HP-Sil (marca registrada) fabricada por Biotage AB. Para cromatografia em coluna de sílica gel clássica, foi utilizada uma PURIF-PACK (marca registrada) NH fabricada por Moritex Corp ou uma coluna pré-revestida KP-NH (marca registrada) fabricada por Biotage AB. Para cromatografia em camada fina, para fracionamento, foi utilizada uma KIESELGEL TM60F254, Art. 5744 fabricada por Merck KGaA ou uma placa 60F254 de sílica gel com NH2 fabricada por Wako Pure Chemical Industries Ltd. O espectro de RMN foi medido com AL400 (400 MHz; JEOL, Ltd.), com um espectrô- metro tipo MERCURY400 (400 MHz; Agilent Technologies, Inc.) ou com um espectrô- metro tipo INOVA400 (400 MHz; Agilent Technologies, Inc.) equipado com uma sonda 400MNMR (Protasis Corp.), e com tetrametilsilano como referência interna no caso onde o solvente deuterado contém tetrametilsilano, enquanto, para os outros casos, um solvente de RMN como referência interna. Todos os valores δ estão expressos em ppm.

[089]O espectro de LCMS foi medido com um ACQUITY SQD (tipo quadrupo- lar) fabricado por Waters Corp. sob as condições descritas abaixo. Coluna: YMC-TRIART C18 fabricada por YMC Co., Ltd., 2,0 x 50 mm, 1,9 μm Detecção MS: ESI positiva Detecção UV: 254 nm e 210 nm Vazão na coluna: 0,5 ml/min Fase móvel: água/acetonitrila (ácido fórmico a 1%) Quantidade de injeção: 1 μl Gradiente (tabela 1) [Tabela 1 ]

[090]Adicionalmente, a purificação por HPLC preparativa de fase inversa foi realizada com um sistema preparativo fabricado por Waters Corp. sob as condições descritas abaixo. Coluna: YMC-ACTUS TRIART C18 fabricada por YMC Co., Ltd., 20 x 50 mm, 5 μm, conectada a YMC-ACTUS TRIART C18 fabricada por YMC Co., Ltd. 20 x 10 mm, 5 μm, foi utilizada. Detecção UV: 254 nm Detecção MS: ESI positiva Vazão na coluna: 25 ml/min Fase móvel: água/acetonitrila (ácido fórmico a 1%) Quantidade de injeção: 0,1 a 0,5 ml

[091]Os significados das abreviações estão mostrados abaixo. s: Singleto d: Dubleto t: Tripleto q: Quarteto dd: Duplo dubleto dt: Duplo tripleto td: Triplo dubleto tt: Triplo tripleto ddd: Duplo duplo dubleto ddt: Duplo duplo tripleto dtd: Duplo triplo dubleto tdd: Tripleto duplo dubleto m: Multipleto br: largo brs: singleto largo CDI: Carbonildiimidazol DMSO-d6: Sulfóxido de dimetila deuterado CDCl3: Clorofórmio deuterado CD3OD: Metanol deuterado THF: Tetraidrofurano DMF: N,N-dimetilformamida DMA: N,N-dimetilacetamida NMP: 1-Metil-2-pirrolidinona DMSO: Sulfóxido de dimetila TFA: Ácido trifluor acético WSC: Cloridrato de 1-(3-Dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida HOBt: Monoidrato de 1-hidroxibenzotriazol HATU: Hexafluorfosfato de (dimetilamino)-N,N-dimetil(3H-[1,2,3]triazolo[4,5- b]piridin-3-iloxi)metanoimínio DIAD: Azodicarboxilato de diisoprila TBAF: Fluoreto de tetrabutilamônio DIPEA: Diisopropiletilamina Boc: Terc-butoxicarbonila Boc2O: Dicarbonato de di-terc-butila DMAP: Dimetilaminopiridina Medição da difração por raio X em pó

[092]A difração por raio X em pó foi medida de acordo com as condições de teste abaixo, após uma substância de teste ser levemente pulverizada, conforme necessário, em uma argamassa de ágata. Aparelho: Rigaku MiniFlexII Alvo: Cu Ajuste de saída dos raios X: 15 mA, 30 kV Área de varredura: 2,0 a 40,0° Tamanho do passo: 0,010° Velocidade de varredura: 5,00°/min Fenda de divergência: 1,25° Fenda de espalhamento: aberta Fenda de recebimento de luz: aberta

[093]O manuseio dos aparelhos, incluindo o processamento dos dados, foi baseado no método e no processo indicados em cada aparelho.

[094]Os valores numéricos obtidos a partir de vários espectros podem flutuar levemente de acordo com a direção de crescimento do cristal, tamanho de partículas ou sua condição da medição. Consequentemente, os valores numéricos não devem ser rigidamente interpretados.

[095]Medição da análise térmica (medição da calorimetria diferencial de varredura (medição da DSC))

[096]A medição da DSC foi realizada de acordo com as condições de teste descritas abaixo. Aparelho: TA Instrument Q1000 Amostra: cerca de 1 mg Recipiente da amostra: fabricado em alumínio Velocidade de aumento da temperatura: aumentada em 5°C/min, até 250 °C Gás atmosférico: nitrogênio Vazão do gás nitrogênio: 50 ml/min

[097]O manuseio dos aparelhos, incluindo o processamento dos dados, foi baseado no método e no processo indicados em cada aparelho.

[098]Exemplo de Referência 1: Síntese de (R)-terc-butil-3-(4-amino-3-iodo- 1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)piperidina-1-carboxilato

[099](Etapa 1) Síntese de (S)-terc-butil 3-(metilsulfoniloxi)piperidina-1-carbo- xilato

[0100]20 g de (S)-N-Boc-3-piperidinol foram dissolvidos em 100 ml de tolueno, e 21 ml de trietilamina e 9,2 ml de cloreto de metanosulfonila foram adicionados a estes a 0°C. A mistura foi agitada por 1 hora sob resfriamento com gelo, subsequentemente, acetato de etila e água foram adicionadas à esta, e uma camada orgânica foi separada. A camada orgânica foi lavada com uma solução aquosa saturada de carbonato de hidrogênio sódico, uma solução aquosa saturada de cloreto de amônio e água, e, então, seca sobre sulfato de sódio anidro. O solvente foi destilado sob pressão reduzida e, assim, 26,8 g do composto título foram obtidos como um sólido incolor.

[0101](Etapa 2) Síntese de (R)-terc-butil 3-(4-amino-3-iodo-1H-pirazolo[3,4- d]pirimidin-1-il)piperidina-1-carboxilato

[0102]Uma solução em suspensão de 14,6 g de 3-iodo-1H-pirazolo[3,4-d]piri- midin-4-amina, sintetizado pelo método descrito em WO 2007/126841, 25 g de (S)- terc-butil 3-(metilsulfoniloxi)piperidina-1-carboxilato, obtido na Etapa 1, e 69 g de carbonato de potássio em 150 ml de DMA foi aquecida a 100°C e agitada por 10 horas. A solução em suspensão foi resfriada à temperatura ambiente e, então, 300 ml de água foram adicionados à esta. Um sólido, então, obtido foi coletado por filtração e lavado com água, e o sólido foi seco. Em seguida, 26,9 g do composto título foram obtidos como um sólido amarelo.

[0103]Exemplos de Referência 2: Síntese de (R)-1-(1-acriloilpiperidin-3-il)-4- amino-N-(benzo[d]oxazol-2-il)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina-3-carboxamida (Composto A)

[0104](Etapa 1) Síntese de (R)-terc-butil 3-(4-amino-3-((benzo[d]oxazol-2- il)carbamoil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)piperidina-1-carboxilato

[0105]300 mg de (R)-terc-butil 3-(4-amino-3-iodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin- 1-il)piperidina-1-carboxylato, obtido no exemplo de referência 1, foram dissolvidos em 3 ml de NMP. 118 mg de benzo[d]oxazol-2-amina, 20 mg de xantphos e 0,15 ml de N- metilmorfolina foram adicionados ao primeiro, e uma operação de desgaseificação foi realizada. Após, 7,6 mg de acetato de paládio foram adicionados, e sob uma atmosfera de monóxido de carbono, a mistura foi aquecida a 110°C e agitada por 2 horas. Após a mistura ser resfriada, 4,5 ml de metanol e 0,45 ml de uma solução aquosa de hidróxido de sódio 5 N foram adicionados a mesma, e a mistura foi agitada por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, o pH foi ajustado para 5,3 com HCl 2 N, e o sólido, então, obtido foi coletado por filtração. O produto cru foi purificado em uma coluna de sílica gel (clorofórmio- metanol), e, assim, 257 mg do composto título foram obtidos como um sólido branco.

[0106](Etapa 2) Síntese do Composto A

[0107]5,0 g de (R)-terc-butil 3-(4-amino-3-((benzo[d]oxazol-2-il)carbamoil)- 1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)piperidina-1-carboxilato, obtido na Etapa 1, foi colocado em suspensão em 50 ml de acetonitrila, e à mistura foram adicionados 7,85g de iodeto de sódio. 6,65 ml de cloreto de trimetilsilila foram adicionados, gota a gota, com agitação à temperatura ambiente, e a mistura foi agitada por 1 hora. 87,5 ml de água e 12,5 ml de uma solução aquosa de hidróxido de sódio 5 N foram adicionados à mistura, e, então, o sistema foi resfriado com gelo. Uma solução preparada pela dis-solução de 0,895 ml de cloreto de acriloíla em 4,1 ml de acetonitrila foi adicionada, gota a gota, à mistura, e esta foi agitada por 1 hora sob resfriamento com gelo. 50 ml de água foram adicionados à mistura, e um sólido, então produzido, foi coletado por filtração, lavado com água, e seco sob pressão reduzida. Assim, 4,13 g do composto título foi obtido como um sólido branco (Composto A).

[0108]RMN-1H (DMSO-d6): δppm 1,53-1,68 (m, 1H), 1,86-1,98 (m, 1H), 2,082,21 (m, 1H), 2,25-2,39 (m, 1H), 2,82-2,95 (m, 0,5H), 3,10-3,22 (m, 0,5H), 3,23-3,37 (m, 0,5H), 3,68-3,78 (m, 0,5H), 4,04-4,14 (m, 0,5H), 4,22-4,38 (m, 1H), 4,52-4,65 (m, 0,5H), 4,67-4,81 (m, 1H), 5,58-5,74 (m, 1H), 6,03-6,19 (m, 1H), 6,68-6,92 (m, 1H), 7,28-7,40 (m, 2H), 7,59-7,71 (m, 2H), 8,22 (brs, 2H), 8,28 (s, 1H), 12,15 (brs, 1H)

[0109]Exemplo de Referência 3: Pesquisa de (R)-1-(1-acriloilpiperidin-3-il)-4- amino-N-(benzo[d]oxazol-2-il)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina-3-carboxamida (Composto A) e sais de adição de base ou ácido

(1)Pesquisa de sais de adição de ácido do Composto A

[0110]Uma pesquisa foi realizada acerca da formação de sais com ácido clorídrico, ácido sulfúrico e ácido fosfórico, dentre os ácidos inorgânicos. Especificamente, o Composto A foi dissolvido em um solvente apropriado, e cada tipo de ácido, em uma quantidade adequada (de 0,5 a 1,5 equivalente), foi adicionado ao composto, e a agitação foi realizada durante toda a noite para determinar se houve a formação de sal ou não. Como resultado da adição de ácido clorídrico ou ácido sulfúrico ao Composto A, ocorreu uma notável decomposição e, consequentemente, a pesquisa foi interrompida. Com a adição do ácido fosfórico ao Composto A, foi obtido o monofosfato do Composto A (Exemplo de Referência 4).

[0111]Adicionalmente, foi realizada uma pesquisa de formação de sal com ácido fumárico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido málico, ácido cítrico e ácido acético. Especificamente, o Composto A foi dissolvido em um solvente apropriado, e cada tipo de ácido, em uma quantidade molar igual a do Composto A, foi adicionado ao composto, e, em seguida, o solvente foi destilado para preparar, assim, um amorfo de cada tipo de ácido orgânico. Subsequentemente, este amorfo foi colocado em suspensão com aquecimento em um solvente orgânico (por exemplo, metiletilcetona, eta- nol, acetato de etila e acetato de butila), para determinar se ocorreu ou não a formação do sal. Como resultado, não houve formação de sal com o ácido málico, ácido cítrico ou ácido acético. A partir do amorfo do ácido succínico, apesar da obtenção de uma substância cristalina, não foi possível obter o succinato em uma quantidade equivalente à quantidade teórica. A partir do ácido fumárico, foi obtido o monofumarato do Composto A (amorfo), e a partir do ácido tartárico, foi obtido o hemitartarato do Composto A (Exemplo 1 e Exemplo de Referência 5).

(2)Pesquisa de sais de adição de base do Composto A

[0112]Uma pesquisa foi realizada acerca da formação de sais com sódio e magnésio, dentre as bases inorgânicas. Especificamente, o Composto A foi dissolvido em um solvente apropriado, e cada tipo de base foi adicionada ao composto (de 0,5 a 1,5 equivalente), e a agitação foi realizada durante toda a noite para determinar se houve a formação de sal ou não. Como resultado, na formação de sal com sódio, ocorreu uma notável decomposição e, então, a pesquisa foi interrompida. A partir do magnésio, foi obtido o sal de hemi magnésio do Composto A (Exemplo de Referência 6). Entretanto, no sal de hemi magnésio do Composto A, o número de substâncias análogas foi elevado e, além disso, a operação de obtenção do sal foi complexa, e a redissolução foi difícil devido a sua baixa solubilidade em um solvente orgânico, e, consequentemente, este sal foi considerado inapropriado para uma produção prática.

[0113]Exemplo de Referência 4: Síntese do monofosfato de (R)-1-(1-acriloil- piperidin-3-il)-4-amino-N-(benzo[d]oxazol-2-il)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina-3-carbo- xamida (monofosfato do Composto A)

[0114]Ao Composto A (150 mg), obtido acima, foi adicionado THF (18 ml), e após a mistura ser aquecida para 70°C, foi adicionado ácido fosfórico (27,3 μl) à mesma. Em seguida, a mistura foi agitada na mesma condição de temperatura por 72 horas, e um sólido depositado foi coletado por filtração e, então, seco sob pressão reduzida, o composto título foi obtido como um sólido branco. Quantidade de rendimento: 158 mg, razão de rendimento: 85,9%

[0115]RMN-1H (DSMO-d6): δppm 1,51-1,69 (m, 1H), 1,87-1,97 (m, 1H), 2,092,21 (m, 1H), 2,25-2,41 (m, 1H), 2,84-2,95 (m, 0,5H), 3,09-3,22 (m, 0,5H), 3,22-3,38 (m, 0,5H), 3,67-3,83 (m, 0,5H), 4,04-4,17 (m, 0,5H), 4,23-4,40 (m, 1H), 4,54-4,65 (m, 0,5H), 4,66-4,83 (m, 1H), 5,58-5,76 (m, 1H), 6,05-6,22 (m, 1H), 6,70-6,96 (m, 1H), 7,32-7,48 (m, 2H), 7,61-7,75 (m, 2H), 8,15-8,26 (brs, 2H), 8,30 (s, 1H)

[0116]Exemplo de Referência 5: Síntese do hemi-L-(+)-tartarato de (R)-1-(1- acriloilpiperidin-3-il)-4-amino-N-(benzo[d]oxazol-2-il)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina-3- carboxamida (hemitartarato do Composto A)

[0117]O Composto A (600 mg), obtido acima, foi dissolvido em uma mistura de THF (90 ml) e água (60 μl) e, na mistura resultante, o L-(+)-tartarato (209 mg) foi despejado e completamente dissolvido. O solvente foi destilado por destilação azeo- trópica da mistura com THF por 2 vezes, para, assim, obter um sólido branco. Metile- tilcetona (1,5 ml) foi adicionada ao sólido branco (130 mg) e uma suspensão sob aquecimento foi realizada a 70°C por 21 horas. O sólido foi coletado por filtração e, então, seco sob pressão reduzida, e obtido como um sólido branco. Quantidade de rendimento: 96 mg, Razão de rendimento: 85,9%.

[0118]RMN-1H (DMSO-d6): δppm 1,55-1,68 (m, 1H), 1,89-1,97 (m, 1H), 2,102,21 (m, 1H), 2,25-2,40 (m, 1H), 2,85-2,95 (m, 0.5H), 3,15-3,65 (m, 1H), 3,68-3,80 (m, 0,5H), 4,05-4,15 (m, 0,5H), 4,24-4,36 (m, 1H), 4,30 (s, 2H), 4,53-4,62 (m, 0,5H), 4,674,79 (brs, 1H), 5,67 (dd, J = 9,99 Hz, 1H), 6,08-6,18 (m, 1H), 6,71-6,92 (m, 1H), 7,30-7,41 (m, 2H), 7,61-7,73 (m, 2H), 8,22 (brs, 2H), 8,29 (s., 1H)

[0119]Exemplo de Referência 6: Síntese do sal de hemi magnésio de (R)-1- (1-acriloilpiperidin-3-il)-4-amino-N-(benzo[d]oxazol-2-il)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina- 3-carboxamida (sal do hemi magnésio do Composto A)

[0120]Ao composto A (159,8 mg), obtido acima, foram adicionados THF (3 ml) e metanol (1 ml) para colocação em suspensão. Em seguida, uma solução aquosa de hidróxido de sódio 2M (185 μl) foi adicionada e o Composto A foi completamente dissolvido nesta. Em sequência, cloreto de magnésio (17,6 mg) foi despejado na mistura e esta foi agitada para, então, ser obtido um sólido branco. Após a adição de água (2 ml), o sólido foi coletado por filtração. O sólido foi lavado com água (1 ml) por duas vezes, e seco sob pressão reduzida para obtenção de um sólido branco. Metiletilce- tona (1 ml) foi adicionada a este sólido branco (50 mg) e uma suspensão sob aquecimento foi realizada a 70°C por 24 horas. O sólido foi coletado por filtração, e, então, seco sob pressão reduzida, e obtido como um sólido branco. Quantidade de rendimento: 44,7 mg, Razão de rendimento: 57,3%.

[0121]RMN-1H (DMSO-d6): δppm 1,52-1,67 (m, 1H), 1,88-2,01 (m, 1H), 2,19- 2,41 (m, 2H), 2,75-2,89 (m, 0,5H), 3,07-3,21 (m, 1H), 3,57-3,71 (m, 0,5H), 4,15-4,23 (m, 0,5H), 4,36-4,55 (m, 1H), 4,69-4,88 (m, 2H), 5,60-5,80 (m, 1H), 6,08-6,22 (m, 1H), 6,79-6,96 (m, 1H), 7,08-7,23 (m, 2H), 7,47-7,56 (m, 2H), 8,13-8,22 (brs, 2H), 8,49 (s, 1H), 10,42-10,50 (brs, 1H)

[0122]Exemplo 1: Síntese do monofumarato de (R)-1-(1-acriloilpiperidin-3-il)- 4-amino-N-(benzo[d]oxazol-2-il)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina-3-carboxamida (monofu- marato do Composto A (amorfo))

[0123]O Composto A obtido no Exemplo de Referência 2 (1,4 g) foi dissolvido em THF (210 ml) e água (140 μl) à temperatura ambiente, e, então, o ácido fumárico (376 mg) foi despejado e completamente dissolvido no primeiro. O solvente foi destilado pela destilação azeotrópica da mistura com THF por duas vezes para, assim, ser obtido o monofumarato do Composto A (forma amorfa) como um pó branco. Quantidade de rendimento: 1,57 g, Razão de rendimento: 90,1%.

[0124]RMN-1H (DMSO-d6): δppm 1,53-1,68 (m, 1H), 1,86-1,98 (m, 1H), 2,082,21 (m, 1H), 2,25-2,39 (m, 1H), 2,82-2,95 (m, 0,5H), 3,10-3,22 (m, 0,5H), 3,23-3,37 (m, 0,5H), 3,68-3,78 (m, 0,5H), 4,04-4,14 (m, 0,5H), 4,22-4,38 (m, 1H), 4,52-4,65 (m, 0,5H), 4,67-4,81 (m, 1H), 5,58-5,74 (m, 1H), 6,03-6,19 (m, 1H), 6,62 (s, 2H), 6,68-6,92 (m, 1H), 7,28-7,40 (m, 2H), 7,59-7,71 (m, 2H), 8,22 (brs, 2H), 8,28 (s, 1H), 12,15 (brs, 1H)

[0125]Espectro de difração por raio X em pó: mostrado na figura 1.

[0126]Exemplo 2: Síntese do hemifumarato de R)-1-(1-acriloilpiperidin-3-il)-4- amino-N-(benzo[d]oxazol-2-il)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina-3-carboxamida (hemifu- marato do Composto A (cristal))

[0127]O monofumarato do Composto A obtido no Exemplo 1 (amorfo) (450 mg) foi colocado em suspensão em metiletilcetona (27 ml), e uma suspensão sob aquecimento foi realizada a 80°C por 24 horas. Por meio da coleta por filtração e uma secagem subsequente sob pressão reduzida, o hemifumarato do Composto A (cristal) foi obtido como um pó branco. Quantidade de rendimento: 279 mg, Razão de rendimento: 62,0%.

[0128]RMN-1H (DMSO-d6): δppm 1,53-1,68 (m, 1H), 1,86-1,98 (m, 1H), 2,082,21 (m, 1H), 2,25-2,39 (m, 1H), 2,82-2,95 (m, 0,5H), 3,10-3,22 (m, 0,5H), 3,23-3,37 (m, 0,5H), 3,68-3,78 (m, 0,5H), 4,04-4,14 (m, 0,5H), 4,22-4,38 (m, 1H), 4,52-4,65 (m, 0,5H), 4,67-4,81 (m, 1H), 5,58-5,74 (m, 1H), 6,03-6,19 (m, 1H), 6,62 (s, 1H), 6,68-6,92 (m, 1H), 7,28-7,40 (m, 2H), 7,59-7,71 (m, 2H), 8,22 (brs, 2H), 8,28 (s, 1H), 12,15 (brs, 1H)

[0129]Espectro de difração por raio X em pó: mostrado na figura 2.

[0130]Ângulo de difração característico (2θ ± 0,1°): 4,5°, 5,8°, 11,2°, 12,1°, 12,4°, 13,4°, 16,6°, 17,3°, 18,2°, 20,2°, 26,4°, 27,1°.

[0131]Curva de calorimetria diferencial de varredura (DSC): mostrada na figura 3.

[0132]Pico endotérmico na curva de calorimetria diferencial de varredura (DSC): em torno de 197°C a 199°C.

[0133]Exemplo 3: Síntese do monofumarato de (R)-1-(1-acriloilpiperidin-3-il)- 4-amino-N-(benzo[d]oxazol-2-il)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina-3-carboxamida (monofu- marato do Composto A (cristal))

[0134]O monofumarato do Composto A obtido no Exemplo 1 (amorfo) (500 mg) foi colocado em suspensão em acetonitrila (10 ml), e uma suspensão sob aquecimento foi realizada a 80°C por 24 horas. Por meio da coleta por filtração e subsequente secagem sob pressão reduzida, o monofumarato do Composto A (cristal) foi obtido como um pó branco. Quantidade de rendimento: 448 mg, Razão de rendimento: 89,6%.

[0135]RMN-1H (DMSO-d6): δppm 1,53-1,68 (m, 1H), 1,86-1,98 (m, 1H), 2,082,21 (m, 1H), 2,25-2,39 (m, 1H), 2,82-2,95 (m, 0,5H), 3,10-3,22 (m, 0,5H), 3,23-3,37 (m, 0,5H), 3,68-3,78 (m, 0,5H), 4,04-4,14 (m, 0,5H), 4,22-4,38 (m, 1H), 4,52-4,65 (m, 0,5H), 4,67-4,81 (m, 1H), 5,58-5,74 (m, 1H), 6,03-6,19 (m, 1H), 6,62 (s, 2H), 6,68-6,92 (m, 1H), 7,28-7,40 (m, 2H), 7,59-7,71 (m, 2H), 8,22 (brs, 2H), 8,28 (s, 1H), 12,15 (brs, 1H)

[0136]Espectro de difração por raio X em pó: mostrado na figura 4.

[0137]Ângulo de difração característico (2θ ± 0,1°): 7,2°, 12,4°, 14,4°, 15,0°, 15,6°, 19,0°, 22,3°, 22,6°, 23,4°, 25,5°, 25,9° e 27,6°. Curva de calorimetria diferencial de varredura (DSC): mostrada na figura 5. Pico endotérmico na curva de calorimetria diferencial de varredura (DSC): em torno de 219°C a 224°C.

[0138]Exemplo Comparativo 1:Síntese de (R)-1-(3-(4-amino-3-(4-fenoxifenil)- 1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)piperidin-1-il)prop-2-en-1-ona (Composto comparativo 1)

[0139]A síntese foi realizada em conformidade com o método descrito em WO 2008/121742 para obtenção do composto título como um sólido branco.

[0140]RMN-1H (DMSO-d6): δppm 1,21-1,28 (m, 1H), 1,42-1,71 (m, 1H), 1,91 (brs, 1H), 2,04-2,36 (m, 2H), 2,91-3,10 (m, 1H), 3,13-3,27 (m, 1H), 3,59-3,76 (m, 1H), 4,04-4,26 (m, 2H), 4,47-4,80 (m, 2H), 5,51-5,78 (m, 1H), 5,96-6,21 (m, 1H), 6,64-6,95 (m, 1H), 7,14 (dd, J = 11,46, 8,54 Hz, 6H), 7,40-7,47 (m, 2H), 7,63-7,70 (m, 2H), 8,26 (s, 1H)

[0141]Os efeitos do fumarato do Composto A da presente invenção foram confirmados pelos Exemplos de Teste a seguir. Neste sentido, assim como o Composto A e seus sais dos presentes Exemplos de Teste, cristais deste também foram utilizados, a menos que descrito o contrário.

[0142]Exemplo de Teste 1: Teste de absorção/dessorção de umidade

[0143]O teste de absorção/dessorção de umidade foi realizado com o Composto A, o monofumarato do Composto A, o hemifumarato do Composto A, o hemitra- tarato do Composto A e o monofosfato do Composto A, para pesquisa da presença ou ausência da característica de hidrato canal.

[0144]No teste de absorção/dessorção de umidade, as medições foram efetuadas de acordo com as seguintes condições.

[0145]Um suporte (holder) de quartzo foi preenchido com cerca de 5 a 10 mg de amostra, e os pesos da amostra para cada determinado valor de umidade foram medidos e anotados, de maneira contínua, sob as seguintes condições. O manuseio dos aparelhos, incluindo processamento de dados, foi baseado no método e no pro-cesso indicado em cada equipamento. Aparelho: VTI AS+ (fabricado por TA Instruments Inc.) Temperatura de secagem: 60°C Velocidade de aumento da temperatura: 1°C/min Equilíbrio na secagem: é confirmado que não ocorre redução de 0,01% em peso em 5 minutos, em uma faixa que não excede 300 minutos Temperatura de medição: 25°C Equilíbrio na umidificação: É confirmado que não ocorre aumente do 0,01% em peso em 5 minutos, em uma faixa que não excede 120 minutos. Programa de umidade relativa: aumentado 5% de UR a partir de 5% de UR a 95% de UR, e diminuído 5% de UR a partir de 95% de UR a 5% de UR.

[0146]Os gráficos obtidos a partir destes testes estão apresentados nas figuras de 6 a 10. As alterações de peso na faixa de condição de medição estão mostradas nas tabelas 2-1 a 2-5. [Tabela 2-1] Resultado do teste de absorção/dessorção de umidade do Composto A [Tabela 2-2] Resultado do teste de absorção/dessorção de umidade do monofumarato do Composto A [Tabela 2-3] Resultado do teste de absorção/dessorção de umidade do hemifumarato do Composto A [Tabela 2-4] Resultado do teste de absorção/dessorção de umidade do hemitartarato do Composto A [Tabela 2-5] Resultado do teste de absorção/dessorção de umidade do monofosfato do Composto A

[0147]Como mostrado nas tabelas 2-1 a 205, quando o Composto A foi umidificado a uma umidade relativa de 5% a 95%, que está dentro da faixa da condição de medição, a sua alteração de peso foi de cerca de 4,4%, no máximo. Foi também confirmado que, quando a umidade foi diminuída a partir da umidade relativa de 95%, o Composto A quase retornou a sua condição original. Ou seja, foi descoberto que o Composto A possuía a característica de hidrato canal, absorvendo/dessorvendo a umidade dependendo da variação da mesma.

[0148]Similarmente, o hemitratarato do Composto A exibiu uma alteração de peso de cerca de 3,3%, no máximo, quando umidificado a uma umidade relativa de 5% a 95%. Foi também confirmado que, quando a umidade foi diminuída a partir da umidade relativa de 95%, o composto quase retornou a sua condição original. Ou seja, foi descoberto que o hemitartarato do Composto A possuía a característica de hidrato canal, absorvendo/dessorvendo a umidade dependendo da variação da mesma.

[0149]Foi também descoberto que, no monofosfato do Composto A, a forma do cristal original não foi mantida após o teste de absorção/dessorção de umidade.

[0150]Por outro lado, em ambos monofumarato do Composto A e hemifuma- rato do Composto A da presente invenção, a alteração de massa foi mantida abaixo de cerca de 1% de aumento, na umidade relativa de 95%, e foi descoberto que, com a diminuição da umidade, a condição original foi quase totalmente retomada. Assim, foi confirmado que o fumarato do Composto A da presente invenção é capaz de evitar a característica de hidrato canal, e possui propriedades superiores como um produto farmacêutico ou ingrediente medicamentoso para um produto farmacêutico.

[0151]Exemplo de Teste 2: Teste da estabilidade sólida (teste de aceleração)

[0152]A estabilidade sólida foi medida, sob as condições abaixo, no que diz respeito ao monofumarato do Composto A, ao hemifumarato do Composto A, ao he- mitartarato do Composto A e ao monofosfato do Composto A, que foram obtidos conforme Exemplos e Exemplos de Referência, quando estes foram estocados por 2 a 4 semanas a 40°C/75% UR (em condição selada e em condição aberta). Condição de estocagem: 40°C / 75% UR (selado e aberto) (aberto refere-se à condição onde o recipiente de vidro possui a tampa removida, e é coberto com lenço KimWipe). Pontos de medição: 2 semanas e 4 semanas Quantidade de estocagem: cerca de 30 mg Recipiente de estocagem: recipiente de vidro marrom Método para preparação da solução da amostra: a amostra foi dissolvida em acetonitrila a 50%, de tal forma que a concentração da amostra fosse de 0,4 mg/ml.

[0153]A massa da substância análoga na solução da amostra foi medida por análise em HPLC. O manuseio dos aparelhos, incluindo o processamento de dados, foi baseado no método e no processo indicados em cada aparelho. (Aparelho: Shi- madzu Corporation SIL-HTc/LC-20AB) Coluna: InterSustein C18, 4,6 x 150 mm, 3μm, fabricado por GL Sciences Inc. Detecção MS: ESI positiva Detecção UV: 220 nm Temperatura na coluna: 40°C Vazão na coluna: 1,0 ml/min Fase móvel: A; 10 mmol/l de tampão de fosfato (pH 6,0) : solução mista de acetonitrila (17:3), B; acetonitrila Quantidade de injeção: 5μl Gradiente: Tabela 3 [Tabela 3]

[0154]A tabela 4 mostra os resultados da avaliação acerca da massa da substância análoga. Os itens A, B e C da tabela referem-se às percentagens de massa total da substância análoga de menos de 0,1%, 0,1% ou mais e menos de 0,5%, e 0,5% ou mais, respectivamente. A propósito, aqueles marcados com * foram medidos em um período de 2 semanas e os demais foram medidos em um período de 4 semanas. [Tabela 4]

[0155]Como resultado disso, foi descoberto que o monofumarato do Composto A e o hemifumarato do Composto A produziram pequenas quantidades de substância análoga, e exibiram excelentes estabilidades sólidas, comparados ao hemitar- tarato do Composto A ou ao monofosfato do Composto A. Assim, foi confirmado que o fumarato do Composto A da presente invenção exibe uma excelente estabilidade sólida.

[0156]Exemplo de Teste 3: Teste de solubilidade sólida (teste severo)

[0157]A estabilidade sólida foi medida sob as seguintes condições, no que diz respeito ao monofumarato do Composto A, ao hemitartarato do Composto A e ao mo- nofosfato do Composto A, que foram obtidos conforme Exemplos e Exemplos de Referência, quando estes foram estocados por 2 semanas ou 4 semanas a 60°C. Condição de estocagem: 60°C (selado) Ponto de medição: 2 semanas e 4 semanas Quantidade de estocagem: cerca de 30 mg Recipiente de estocagem: recipiente de vidro marrom Método para preparação da solução da amostra: a amostra foi dissolvida em acetonitrila a 50%, de tal forma que a concentração da amostra fosse de 0,4 mg/ml.

[0158]Da mesma maneira do Exemplo de Teste 2, a tabela 5 mostra os resultados da avaliação de massa da substância análoga na solução da amostra, medida por análise em HPLC. Na tabela, A e B referem-se às percentagens de massa total da substância análoga de menos de 0,1%, e de 0,1% ou mais e menos de 0,5%, respectivamente. Aliás, o valor marcado com * foi medido por 2 semanas e os demais foram medidos por 4 semanas. [Tabela 5]

[0159]Como resultado, foi descoberto que o monofumarato do Composto A produziu uma quantidade pequena de substância análoga, e exibiu excelente estabilidade sólida, em comparação com o hemitartarato do Composto A ou com o mono- fosfato do Composto A. Assim, foi confirmado que o fumarato do Composto A da presente invenção exibe excelente estabilidade sólida.

[0160]Exemplo de Teste 4: Teste de medição da concentração no sangue

[0161]Com relação ao Composto A, ao hemifumarato do Composto A e ao monofumarato do Composto A obtidos nos Exemplos, suspensões de 50 mg/10ml/kg em termos do peso molecular do Composto A foram preparadas com 0,5% em HPMC. Estas soluções de administração foram oralmente administradas para camundongos (Balb/ cA) que foram reproduzidos sob uma condição de alimentação, a uma dose de 10 ml por 1 kg de peso corporal, com uma sonda para administração oral. Após a administração, os camundongos foram retornados a sua gaiola e as condições foram verificadas. Dentro da gaiola, foi fornecida uma condição onde água e comida estavam acessíveis à vontade. Após 0,25, 0,5, 1, 2, 4 e 6 horas da administração, os camundongos foram anestesiados com isoflurano, e 60 μl de sangue foram coletados do seio orbital com um tubo de coleta de sangue capilar.

[0162]O sangue coletado foi resfriado com gelo, e o plasma do sangue foi separado por uma operação centrífuga. Os camundongos, após a coleta de sangue, foram retornados a sua gaiola, e as condições após recuperação da anestesia foram verificadas. Quando a última coleta de sangue foi finalizada, os camundongos foram eutanasiados por deslocamento cervical, após verificação do nível da anestesia com isoflurano.

[0163]AUC0-6h, Cmax e Tmax foram calculados pelo método log-linear trapezoidal com Phoenix WinNonlin (v6.3.0) que é um software fabricado por Pharsight Corporation, a partir das concentrações do Composto A para cada plasma de sangue medido por método de RMN com LC-MS/MS.

[0164]Os resultados estão mostrados na tabela 6. A partir do teste, foi descoberto que, com relação ao Cmax (máxima concentração no sangue), o hemifumarato do Composto A exibiu um valor equivalente ao Composto A, e o monofumarato do Composto A exibiu um valor de aproximadamente o dobro da concentração do Composto A; e com relação ao AUCo-6h (curva de tempo - concentração de sangue sob a área, 0-6 horas a partir da administração), o hemifumarato do Composto A exibiu um valor de aproximadamente o dobro do Composto A, e o monofumarato do Composto A apresentou um valor cerca de 1,3 vezes maior que o do Composto A. Assim, foi confirmado que o fumarato do Composto A da presente invenção exibe uma excelente propriedade absortiva oral. [Tabela 6]

Exemplo de Teste 5: Medição da atividade inibitória contra BTK (in vitro)

[0165]Em uma condição ajustada para um método de medição de atividade inibitória in vitro dos compostos contra a atividade quinase de BTK, FL-peptídeo 2 foi utilizado como um substrato, já que estava descrito em uma lista de preços do LabChip (marca registrada) de série de consumíveis em amostra de PerkinElmer Co., Ltd. que o FL-peptide 2 corresponde a um peptídeo substrato em uma medição de atividade inibitória contra BTK. A proteína BTK humana recombinada refinada utilizada no teste foi comprada da Carna Biosciences, Inc.

[0166]No que diz respeito à medição da atividade inibitória dos compostos, primeiramente, o monofumarato do Composto A foi diluído passo a passo com sulfó- xido de dimetila (DMSO). Subsequentemente, a proteína BTK, um peptídeo substrato (a concentração final foi de 1 μM), cloreto de magnésio (a concentração final foi de 10 mM), ATP (a concentração final foi de 45 μM), e uma solução de DSMO dos compostos de teste (a concentração final de DSMO foi de 5%) foram adicionados a uma solução tampão para reação da quinase (20 mM HEPES (pH 7,5), ditioteitol 2mM, Triton X-100 a 0,01 %), e após a solução ser incubada por 40 minutos a 25°C, a reação da quinase foi realizada. A reação foi finalizada com a adição de EDTA a esta para obtenção de uma concentração final de 30 mM. Finalmente, um peptídeo substrato que não foi fosforilado (S) e um peptídeo fosforilado (P) foram separados e detectados por eletroforese capilar em microcanais com o LabChip EZ Reader II (PerkinElmer, Inc.). As quantidades da reação de fosforilação foram determinadas a partir das alturas de pico individual de S e P, e a concentração do composto na qual a reação de fosforila- ção poderia ser interrompida por 50% foi definida pelo valor de IC50 (nM). Os resultados estão apresentados na tabela 7 abaixo. [Tabela 7]

[0167]A partir do resultado do teste, foi descoberto que o fumarato do Composto A da presente invenção possui uma atividade inibitória contra BTK in vitro.

[0168]Exemplo de Teste 6: Seletividade de inibição de BTK comparada à atividade inibitória da quinase EGFR (in vitro)

Medição da atividade inibitória contra BTK

[0169]A atividade inibitória contra BTK foi medida da mesma maneira apresentada no Exemplo de Teste 5.

Medição da atividade inibitória contra BTK

[0170]Com relação ao ajuste das condições para um método de medição da atividade inibitória de um composto contra a quinase EGFR in vitro, é descrito na lista de preços de fontes de reagente consumíveis para LabChip (marca registrada) de série de PerkinElmer, Inc. que o FL-peptide 22 corresponde a um peptídeo substrato para medição da atividade da quinase EGFR. Portanto, um peptídeo biotinado (biotina - EEPLYWSFPAKKK) foi produzido por referência à sequência de aminoácidos do peptídeo. A proteína EGFR humana recombinante purificada utilizada no teste foi comprada da Carna Biosciences, Inc.

[0171]Com relação à medição da atividade inibitória dos compostos, primeiramente, o monofumarato do Composto A foi diluído passo a passo com sulfó- xido de dimetila (DMSO). Subsequentemente, a proteína EGFR, um peptídeo substrato (a concentração final foi de 250 nM), cloreto de magnésio (a concentração final foi de 10 mM), cloreto de manganês (a concentração final foi de 10 nM), ATP (a con-centração final foi de 1,5 μM), e uma solução de DSMO dos compostos de teste (a concentração final de DSMO foi de 2,5%) foram adicionados a uma solução tampão para reação da quinase (20 mM HEPES (pH 7,5), ditioteitol 2mM, Triton X-100 a 0,01%), e após a solução ser incubada por 120 minutos a 25°C, a reação da quinase foi realizada. A reação foi finalizada com a adição de EDTA a esta para obtenção de uma concentração final de 24 mM. Subsequentemente, um líquido de detecção contendo o anticorpo fosfotirosina marcado com Eu PT66 (PerkinElmer, Inc.) e SURELIGHT APC-AS (Perkin-Elmer, Inc.) foi adicionado, e o sistema foi deixado em repouso por 2 horas ou mais à temperatura ambiente . Finalmente, a quantidade de fluorescência após a irradiação com luz de excitação possuindo um comprimento de onda de 337 nm foi medido em dois comprimentos de onda de 620 nm e 665 nm, com PHERAstar FS (BMG Labtech GmbH). A quantidade da reação de fosforilação foi determinada a partir das razões das quantidades de fluorescência nos dois comprimentos de onda, e a concentração do composto na qual a reação de fosforilação poderia ser interrompida por 50% foi definida conforme valor de IC50 (nM).

Seletividade de inibição de BTK

[0172]O “valor de IC50 da atividade inibitória contra EGFR (nM) /valor de IC50 da atividade inibitória de BTK (nM)” foi calculado com base nos resultados obtidos nas seções 1) e 2), e, assim, a seletividade de inibição de BTK do composto de teste foi identificada. [Tabela 8]

[0173]A partir dos resultados, foi descoberto que a seletividade de inibição de BTK contra a quinase EGFR do monofumarato do Composto A da presente invenção foi aproximadamente 13 vezes maior que a do composto comparativo 1 in vitro, e o monofumarato do Composto A da presente invenção apresentou excelente seletividade de inibição de BTK. A partir destes resultados, foi demostrado que o fumarato do Composto A da presente invenção poderia ter reduzido os efeitos adversos em comparação com os inibidores de BTK existentes.

[0174]Exemplo de Teste 7: Teste para medir a atividade inibitória de proliferação contra as linhas de células que expressam BTK e EGFR (in vitro), e comparação de sua seletividade

[0175]As células TMD8, que são linha de células de linfoma difuso de células B que expressam BTK, foram colocadas em suspensão no meio RPMI1640 (fabricado por Life Technologies Corp.) contendo soro bovino fetal a 10%. As células A431, que são linha de células de carcinoma epidermóide humano altamente ativado que sobre- expressam EGFR, foram colocadas em suspensão em DMEM, meio de glicose alta (produzido por Life Technologies Corp.) contendo soro bovino fetal a 10%. As suspensões de células foram inoculadas em cada cavidade de microplacas de fundo plano 384, e as células foram mantidas em cultura por 1 dia a 37°C em uma incubadora contendo gás de dióxido de carbono a 5%. O monofumarato do Composto A e o com-posto comparativo 1 foram dissolvidos em DMSO, e as soluções foram diluídas a uma concentração equivalente a 500 vezes a concentração final do composto de teste, utilizando DMSO. Uma solução de DMSO dos compostos de teste foi diluída com o meio utilizado para a suspensão de cada célula, e esta foi adicionada a cada uma das cavidades das placas de cultura celular, de tal forma que a concentração final de DMSO fosse de 0,2%. As células foram ainda mantidas em cultura por 3 dias a 37°C em uma incubadora contendo gás de dióxido de carbono a 5%. A contagem do número de células antes da adição dos compostos e após a cultura de 3 dias na presença dos compostos foi realizada com CELLTITER GLO (fabricado por Promega Corp.), com base no protocolo recomendado pela Promega Corp. A razão de inibição da proliferação foi calculada pela fórmula a seguir, e a concentração do composto de teste inibindo 50% (GI50 (nM)) foi determinada. Razão de inibição da proliferação (%) = (C - T) / (C - C0) x 100 T: intensidade de luminescência de uma cavidade com o composto de teste C: intensidade de luminescência de uma cavidade sem o composto de teste C0: intensidade de luminescência de uma cavidade medida antes da adição do composto de teste

[0176]Com a comparação entre a atividade inibitória de proliferação contra as células A431 que depende da sinalização de proliferação da EGFR e a atividade inibitória de proliferação contra as células TMD8 que dependem da sinalização de proliferação da BTK, é possível avaliar a influência das respectivas quinases a nível celular. Isto é, pelo cálculo de “razão de inibição da proliferação de células A431/ razão de inibição da proliferação de células TMD8”, é contemplado que, quanto maior o valor da razão, maior a seletividade de BTK sobre EGFR nas células. Os valores de “razão de inibição da proliferação de células A431/ razão de inibição da proliferação de células TMD8” estão mostrados na tabela 9. [Tabela 9]

[0177]A partir dos resultados, foi descoberto que a seletividade de inibição de BTK contra a quinase EGFR do monofumarato do Composto A da presente invenção na razão de inibição da proliferação celular in vitro foi cerca de 65 vezes maior do que para o composto comparativo 1. Assim, foi descoberto que o fumarato do Composto A da presente invenção possui uma excelente seletividade de inibição de BTK, não apenas na quinase, mas também nas células. A partir dos resultados, foi demonstrado que o fumarato do Composto A da presente invenção poderia reduzir os efeitos adversos em comparação com os inibidores de BTK existentes.

[0178]Exemplo de Teste 8: Modelo de artrite induzida por colágeno em camundongos (efeito preventivo)

[0179]O teste foi realizado em conformidade com o método descrito em literatura não patentária (Brand DD, et al., Nat Protoc. 2007; 2, 1269-1275, Xu D. et al., JPET, abril 2012; 341 (1) : 90 - 103). Camundongos machos/DBA/1 com sete semanas de vida (CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC.) foram submetidos à aplicação de injeção intracutânea no dorso com 100 μl/corpo de uma solução mista de quantidade igual (emulsão) a 4 mg/ml de solução de colágeno bovino tipo 2 (Collagen Research Center) e adjuvante de Freund completo (imunização inicial). Após 21 dias, os camundongos foram submetidos à aplicação de injeção intracutânea na espinha dorsal com 100 μl/corpo de uma solução mista de quantidade igual (emulsão) a 4 mg/ml de solução de colágeno bovino tipo 2 (Collagen Research Center) e adjuvante de Freund completo (DIFCO) para fornecer uma imunização adicional. A administração oral, de 1 vez ao dia, foi continuada por 17 dias ajustando o dia de início da administração (dia 0) como o oitavo dia a partir da imunização adicional. Os sintomas da artrite no dia 0, dia 3, dia 7, dia 10, dia 14 e dia 17 foram pontuados macroscopicamente (0: sem alteração, 1: inchaço em um dedo, 2: inchaço em dois dedos ou mais, 3: inchaço no peito do pé, 4: inchaço de todos os dedos, se estendendo para o torno- zelo/pulso), e um total em 4 membros foi obtido como um ponto de corpo individual (máximo de 16 pontos). Os resultados estão mostrados na figura 11.

[0180]A figura 11 mostra que o grupo administrado com prednisolona (3 mg/kg), que foi ajustado como um composto de controle positivo do sistema de teste, ficou apenas a um grau de manutenção da pontuação da artrite aumentada, à medida que o grupo administrado com o monofumarato do Composto A da presente invenção (0,381 mg/kg) diminuiu a pontuação da artrite de maneira eficaz. A partir dos resultados, foi confirmado que o fumarato do Composto A da presente invenção possui excelente efeito terapêutico contra a artrite reumatoide que já havia aparecido.

Claims (15)

1. Sal de ácido fumárico CARACTERIZADO pelo fato de que é um fumarato de (R)-1-(1-acriloilpiperidin-3-il)-4-amino-N-(benzo[d]oxazol-2-il)-1H-pirazolo[3,4-d]pi- rimidina-3-carboxamida, em que o fumarato é hemifumarato ou monofumarato.

2. Sal, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que é hemifumarato de (R)-1-(1-acriloilpiperidin-3-il)-4-amino-N-(benzo[d]oxazol-2-il)-1H- pirazolo[3,4-d]pirimidina-3-carboxamida.

3. Sal, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que é um cristal tendo um ângulo de difração (2θ ± 0,1°) com pelo menos dois, de preferência pelo menos cinco, ou mais picos selecionados dentre 4,5°, 5,8°, 11,2°, 12,1°, 12,4°, 13,4°, 16,6°, 17,3°, 18,2°, 20,2°, 26,4° e 27,1° em um espectro de difração de raio X em pó.

4. Sal, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é um cristal tendo um ângulo de difração (2θ ± 0,1°) com picos em 4,5°, 5,8°, 11,2°, 12,1°, 12,4°, 13,4°, 16,6°, 17,3°, 18,2°, 20,2°, 26,4° e 27,1° em um espectro de difração de raio X em pó.

5. Sal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que é um cristal tendo uma temperatura de pico em uma curva de calorimetria diferencial de varredura (DSC) com um pico endotérmico em torno de 197 °C a 199 °C.

6. Sal, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que é monofumarato de (R)-1-(1-acriloilpiperidin-3-il)-4-amino-N-(benzo[d]oxazol-2-il)-1H- pirazolo[3,4-d]pirimidina-3-carboxamida.

7. Sal, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que é um cristal tendo um ângulo de difração (2θ ± 0,1°) com pelo menos dois, de preferência pelo menos cinco, ou mais picos selecionados dentre 7,2°, 12,4°, 14,4°, 15,0°, 15,6°, 19,0°, 22,3°, 22,6°, 23,4°, 25,5°, 25,9° e 27,6° em um espectro de difração de raio X em pó.

8. Sal, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, CARACTERIZADO pelo fato de que é um cristal tendo um ângulo de difração (2θ ± 0,1°) com picos selecionados dentre 7,2°, 12,4°, 14,4°, 15,0°, 15,6°, 19,0°, 22,3°, 22,6°, 23,4°, 25,5°, 25,9° e 27,6° em um espectro de difração de raio X em pó.

9. Sal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que é um cristal tendo uma temperatura de pico em uma curva de calorimetria diferencial de varredura (DSC) com um pico endotérmico em torno de 219 °C a 224 °C.

10. Sal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso na inibição de BTK ou para uso como um medicamento.

11. Inibidor de BTK ou composição farmacêutica CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o sal, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, como um ingrediente ativo.

12. Agente antitumoral que é de preferência contra um tumor hematológico, ou um agente terapêutico e/ou preventivo para uma doença alérgica, uma doença autoimune ou uma doença inflamatória, de preferência rinite alérgica, polinose, dermatite atópica, artrite reumatoide e lúpus sistêmico eritematoso, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito agente compreende o sal, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, como um ingrediente ativo.

13. Uso do sal, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a produção de um inibidor de BTK ou uma composição farmacêutica.

14. Uso do sal, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a produção de um agente antitumoral ou um agente terapêutico e/ou preventivo para uma doença alérgica, uma doença autoimune ou uma doença inflamatória, de preferência para a produção de um agente antitumoral contra um tumor hematológico ou um agente terapêutico e/ou preventivo para rinite alérgica, polinose, dermatite atópica, artrite reumatoide e lúpus sistêmico eritematoso.

15. Uso do sal, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a produção de um agente antitumoral ou um agente terapêutico e/ou preventivo para prevenir ou tratar um tumor, uma doença alérgica, uma doença autoimune ou uma doença inflamatória, de preferência para prevenir ou tratar um tumor hematológico, rinite alérgica, polinose, dermatite atópica, artrite reumatoide e lúpus eritematoso sistêmico.