BR112017006315B1 - Método in vitro para determinar se um sujeito com melanoma tem um risco maior de desenvolver metástase - Google Patents

Abstract

AGENTE TERAPÊUTICO, USO DE UM AGENTE TERAPÊUTICO, MÉTODOS IN VITRO PARA DETERMINAR SE UM SUJEITO COM MELANOMA TEM UM RISCO MAIOR DE DESENVOLVER METÁSTASE, DE DETERMINAÇÃO DE UM REGIME DE TRATAMENTO PARA UM SUJEITO QUE SOFRE DE MELANOMA, DE TRATAMENTO DE UM SUJEITO QUE SOFRE DE MELANOMA, ENSAIO IN VITRO PARA PREDIZER O RISCO AUMENTADO DE METÁSTASE E KITS. A presente invenção diz respeito, inter alia, aos agentes terapêuticos para uso no tratamento do melanoma, métodos de diagnóstico de um risco aumentado para o desenvolvimento de metástase em um sujeito que sofre de melanoma, métodos de tratamento de tais sujeitos, ensaios diagnósticos e kits. De modo mais específico, em determinados exemplos de realização, a invenção diz respeito a identificar se um sujeito que sofre de melanoma tem maior risco de metástase pela determinação da expressão de Ambra-1 e Loricrina em uma amostra de tecido obtida a partir do referido sujeito.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção diz respeito, inter alia, aos agentes terapêuticos para uso no tratamento do melanoma, métodos de diagnóstico de um risco aumentado para o desenvolvimento de metástase em um sujeito que sofre de melanoma, métodos de tratamento de tais sujeitos, ensaios diagnósticos e kits. De modo mais específico, em determinados exemplos de realização, a invenção diz respeito a identificar se um sujeito que sofre de melanoma tem maior risco de metástase pela determinação da expressão de Ambra-1 e Loricrina em uma amostra de tecido obtida a partir do referido sujeito.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] O melanoma é responsável por apenas 2,3% de todos os cânceres de pele, mas é a forma que exibe maior risco à vida, sendo responsável por mais de 75% das mortes por câncer de pele. O melanoma cutâneo é atualmente um importante problema de saúde pública devido às crescentes taxas de incidência em todo o mundo, provocando a morte de mais de 2.000 pessoas a cada ano apenas no Reino Unido. A taxa de aumento é maior do que para qualquer outro tipo de câncer e tem sido comparada a uma epidemia. Parte do aumento pode ser devido a melhoras na vigilância e detecção precoce, bem como mudanças nos critérios diagnósticos, entretanto, considera-se que uma proporção substancial do aumento é real. O aumento tem sido associado a um aumento da exposição ao sol e/ou aumento do uso de espreguiçadeiras de bronzeamento artificial.

[0003] As taxas de incidência normalizadas por idade em europeus aumentaram 4 vezes para as mulheres e 7 vezes para os homens ao longo dos últimos 30 anos. O melanoma é agora o quinto câncer mais comum no Reino Unido, sendo responsável por 4% de todos os novos casos de câncer. As taxas de mortalidade também aumentaram, mas a uma taxa desproporcionalmente inferior em relação à incidência, de tal modo que a proporção de mortes para casos de pacientes com melanoma caiu constantemente durante os últimos 50 anos. Mesmo assim, o melanoma responde por cerca de 50.000 mortes por ano, em todo o mundo.

[0004] Os fatores que afetam o prognóstico incluem a espessura do tumor em milímetros (profundidade de Breslow), a profundidade em relação às estruturas da pele (nível Clark), o tipo de melanoma, a presença de metástases e a presença de ulcerações. Os melanomas primários que demonstram ulceração epidérmica no momento do diagnóstico predizem taxas aumentadas de metástases e piores resultados em comparação com os tumores não ulcerados. No entanto, a biologia subjacente à ulceração permanece enigmática.

[0005] O tratamento no estágio inicial (estádio AJCC 1a ou 1b) do melanoma envolve a remoção do tecido circundante do melanoma, conhecido como excisão local ampla. Isto é normalmente seguido por análise periódica do paciente para a recorrência da doença ao longo de um período de 1-5 anos. A terapia, tal como a quimioterapia, não é dada a pacientes com melanoma em estágio inicial.

[0006] Para os pacientes com tumores mais espessos (estadiamento AJCC 2a, 2b, 2c) uma excisão local ampla pode ser seguida por uma biópsia de linfonodo sentinela para determinar se a doença se espalhou para os linfonodos. Se houve disseminação, a dissecção de linfonodos pode ser realizada. O tratamento após a cirurgia para auxiliar na prevenção da recidiva do melanoma ou de sua disseminação é conhecido como terapia adjuvante. A terapia adjuvante pode ser a quimioterapia ou terapia biológica (por exemplo, o tratamento com interferon). Entretanto, a terapia adjuvante só foi oferecida aos pacientes com melanoma em estádio 2 como parte de um ensaio clínico.

[0007] A quimioterapia, radioterapia e/ou terapia biológica podem ser utilizadas para tratar os melanomas recorrentes em pacientes que possuem um tumor estádio 2 removidos, para auxiliar no controle da progressão metastática em pacientes com doença confinada aos linfonodos (estádio 3) ou para diminuir os melanomas em pacientes com doença metastática avançada (estadiamento AJCC: 4), a fim de reduzir os sintomas.

[0008] Continua a haver uma necessidade de melhorar o tratamento dos pacientes que sofrem de melanoma e de diminuir a probabilidade de progressão para metástase.

[0009] O objetivo de alguns exemplos de realização da presente invenção é de atenuar, pelo menos parcialmente, alguns dos problemas identificados na técnica anterior.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0010] De acordo com um primeiro aspecto a presente invenção proporciona um agente terapêutico para uso no tratamento do melanoma em um sujeito, em que o referido sujeito foi identificado como tendo uma perda ou diminuição da expressão de Ambra-1 e Loricrina em uma amostra de tecido obtida a partir do sujeito.

[0011] A Ambra-1 (molécula ativadora na autofagia regulada por beclina-1) é uma proteína contendo WD40. Os estudos têm implicado a Ambra- 1 no controle da autofagia, pois acredita-se que a Ambra-1 funcione como uma plataforma de interação proteína-proteína. Acredita-se que o principal papel da Ambra-1 durante autofagia é o de ser um membro do complexo beclina-1/VPS34 que está envolvido na formação das membranas ricas em PI3K durante a fase de nucleação da autofagia. Estudos sugerem que a Ambra-1 também funciona diretamente como um regulador a montante da atividade autofágica. A sequência de aminoácidos da Ambra-1 é mostrada nas Figuras.

[0012] A Ambra-1 foi adicionalmente mostrada por desempenhar um papel na diferenciação celular. A inativação funcional da Ambra-1 em um modelo de camundongo levou a letalidade intraútero com graves defeitos do tubo neural associados com a insuficiência autofágica e proliferação celular desequilibrada. Por outro lado, foi demonstrado que a superexpressão de Ambra-1 diminui as taxas de proliferação celular no tecido neural, apoiando assim o seu papel como uma peça chave na proliferação epitelial.

[0013] A Loricrina é uma proteína rica em serina-glicina-cisteína que, em seres humanos, é codificada pelo gene LOR. O gene LOR é parte de um agrupamento (cluster) de genes no cromossomo 1 denominado de complexo de diferenciação epidérmica. Estes genes estão envolvidos na formação e manutenção da camada externa da pele (epiderme), particularmente a sua superfície exterior dura (estrato córneo). O estrato córneo, que é formado em um processo conhecido como cornificação, fornece uma barreira resistente entre o corpo e seu ambiente. Cada célula do estrato córneo, denominada de corneócito, é rodeada por um invólucro proteico denominado envelope cornificado (CE). A Loricrina é a proteína predominante do envelope córneo. As ligações entre a Loricrina e outros componentes dos envelopes mantêm os corneócitos unidos e auxiliam a conferir força ao estrato córneo. A sequência de aminoácidos da Loricrina é mostrada nas Figuras.

[0014] De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, é fornecido um agente terapêutico para uso no tratamento do melanoma em um sujeito, em que o referido sujeito foi identificado como tendo um risco aumentado de metástases, em que a identificação do aumento do risco é determinada pela: (i) determinação da expressão de Ambra-1 e Loricrina em uma amostra de tecido obtida a partir do sujeito, em que a amostra de tecido compreende o tecido suprajacente a um melanoma primário; e (ii) comparação da expressão obtida em (i) com um tecido de referência ou níveis de referência obtidos de tal tecido; em que uma diminuição na expressão de Ambra-1 e Loricrina na amostra de tecido em comparação com o tecido de referência ou níveis de referência, ou a perda da expressão de Ambra-1 e Loricrina na amostra de tecido é indicativa de um maior risco de metástase no sujeito.

[0015] Será compreendido que, em alguns exemplos de realização, a comparação da expressão de Ambra-1 e Loricrina na amostra tecidual com uma referência pode não ser necessária, por exemplo, quando a perda de expressão é determinada. Assim, em determinados exemplos de realização, uma diminuição ou perda da expressão de Ambra-1 e Loricrina é evidente sem a necessidade de comparar a expressão com um tecido de referência.

[0016] De acordo com um terceiro aspecto a presente invenção proporciona o uso de agente terapêutico para evitar ou reduzir a probabilidade de progressão de metástases em um sujeito que sofre de melanoma e que foi identificado como estando em maior risco de progressão para metástase, em que a referida identificação do risco compreende determinar se o sujeito tem diminuição ou perda da expressão de Ambra-1 e Loricrina nos queratinócitos que recobrem um melanoma primário do sujeito.

[0017] De acordo com um quarto aspecto a presente invenção proporciona um método in vitro para determinar se um sujeito com melanoma tem um maior risco de metástase, cujo método compreende: (i) a determinação da expressão de Ambra-1 e Loricrina em uma amostra de tecido obtida a partir do sujeito, em que a amostra de tecido compreende o tecido suprajacente de um melanoma primário; e (ii) a comparação da expressão obtida em (i) com um tecido de referência ou níveis de referência obtidos de tal tecido; em que uma diminuição na expressão de Ambra-1 e Loricrina na amostra de tecido em comparação com o tecido de referência ou níveis de referência, ou a perda da expressão de Ambra-1 e Loricrina na amostra de tecido é indicativa de um maior risco de metástase.

[0018] De acordo com um quinto aspecto a presente invenção provê um método de determinação de um regime de tratamento para um sujeito que sofre de melanoma, compreendendo a: a) obtenção de uma amostra de tecido do sujeito, em que a amostra de tecido compreende o tecido suprajacente de um melanoma primário; b) determinação da expressão de Ambra-1 e Loricrina na amostra de tecido; c) comparação da expressão obtida em (b) com um tecido de referência ou níveis de referência obtidos do tecido, e d) (i) se a expressão de Ambra-1 e Loricrina está normal ou aumentada, um protocolo de atendimento reconhecido normal é seguido, ou (11) se a expressão de Ambra-1 e Loricrina está diminuída ou foi perdida, o sujeito é tratado com um regime de tratamento anticâncer sistêmico.

[0019] De acordo com um sexto aspecto a presente invenção provê um método de tratamento de um sujeito que sofre de melanoma, cujo método compreende a administração de um agente terapêutico para o sujeito, em que o sujeito foi identificado como tendo uma diminuição ou perda da expressão de Ambra -1 e Loricrina em uma amostra de tecido obtida a partir do sujeito.

[0020] De acordo com um sétimo aspecto a presente invenção provê um método de tratamento de um sujeito que sofre de melanoma, em o referido método compreende a: (i) determinação da expressão de Ambra-1 e Loricrina em uma amostra de tecido obtida a partir do sujeito, em que a amostra de tecido compreende o tecido suprajacente a um melanoma primário; (ii) comparação da expressão obtida em (i) com um tecido de referência ou níveis de referência obtidos de tal tecido; e se há uma diminuição na expressão de Ambra-1 e Loricrina na amostra de tecido em comparação com o tecido de referência ou níveis de referência, ou se há uma perda da expressão de Ambra-1 e Loricrina na amostra de tecido, é feita a administração de um agente terapêutico ao sujeito.

[0021] De acordo com um oitavo aspecto a presente invenção proporciona um ensaio in vitro para predizer um risco aumentado de metástase em um sujeito que sofre de melanoma, em que o referido ensaio compreende as etapas de: (i) colocar uma amostra de tecido obtida a partir do sujeito em contato com um primeiro ligante específico para Ambra-1, em que a presença de Ambra-1 cria um complexo Ambra-1-ligante; (ii) colocar a amostra de tecido em contato com um segundo ligante específico para a Loricrina, em que a presença de Loricrina cria um complexo Loricrina-ligante; e (iii) detectar e/ou quantificar o complexo Ambra-1-ligante e o complexo Loricrina-ligante.

[0022] O sujeito pode ser um humano ou animal que sofre de melanoma. Em alguns exemplos de realização, o sujeito é um paciente humano. Em alguns exemplos de realização, o sujeito já foi diagnosticado com melanoma.

[0023] Em alguns exemplos de realização o sujeito está sofrendo de melanoma classificado pelo estadiamento AJCC em estádio 1, 2, 3 ou 4. Em alguns exemplos de realização o sujeito está sofrendo de melanoma classificado pelo estadiamento AJCC em estádio 1a, estádio 1b, estádio 2a, estádio 2b ou estádio 2c. Em alguns exemplos de realização, o sujeito está sofrendo de melanoma classificado pelo estadiamento AJCC em estádio 1a ou estádio 1b. Em alguns exemplos de realização, os métodos descritos na presente invenção compreendem o estadiamento de um tumor primário presente em uma amostra de tecido obtida de um sujeito seguindo os critérios de estadiamento do AJCC (Comitê Conjunto Americano sobre o Câncer).

[0024] O tratamento para o melanoma em estágio inicial tipicamente envolve a cirurgia para excisar o(s) tumor(es). A terapia é geralmente usada para controlar a propagação de metástases nas fases mais avançadas da doença, momento em que o prognóstico é geralmente ruim. A identificação de sujeitos que se encontram nas primeiras fases da doença, mas que possuem um maior risco de metástase, seria vantajosa, permitindo que o tratamento possa ser adaptado para casa caso. Por exemplo, a terapia pode ser administrada aos sujeitos de maneira mais precoce do que poderia normalmente ser administrada, e desse modo prevenindo, inibindo ou retardando as metástases e melhorando o prognóstico dos sujeitos.

[0025] Assim, em alguns exemplos de realização, o sujeito, antes da identificação, não é elegível para o tratamento com agente terapêutico. Em determinados exemplos de realização, um sujeito pode ser aduzido a um regime de tratamento em uma fase mais precoce ou menos avançada, em comparação com os métodos da técnica anterior de tratamento do melanoma no qual um paciente é tratado apenas com um agente terapêutico quando ele sofre de melanoma já em um estadiamento AJCC de estádios 3 ou 4, ou quando tem recorrência da doença após melanoma em estadiamento AJCC de estádios 2 ou 3.

[0026] Em alguns exemplos de realização, o sujeito tem um melanoma ulcerado.

[0027] Inesperadamente, os presentes inventores identificaram uma correlação entre os níveis de expressão de ambos Ambra-1 e Loricrina e a probabilidade de metástases em um sujeito com melanoma. Em particular, considera-se que uma diminuição no nível de expressão, ou a perda de expressão, tanto da Ambra-1 como da Loricrina, indica que o sujeito tem um maior risco de metástase.

[0028] Tal como utilizado na presente invenção, uma diminuição ou perda da expressão de Ambra-1 e Loricrina significa que o nível de expressão de ambas, Ambra-1 e Loricrina, é inferior a cerca de 75% do respectivo nível de referência.

[0029] Em alguns exemplos de realização, uma diminuição na expressão de Ambra-1 e Loricrina significa que o nível de expressão de ambas, Ambra-1 e Loricrina, é inferior a cerca de 25 a 75% do respectivo nível de referência. Em alguns exemplos de realização, uma perda da expressão de Ambra-1 e Loricrina significa que o nível de expressão de ambas, Ambra-1 e Loricrina, é inferior a cerca de 25% da proteína relevante. Entende-se como expressão normal uma expressão de Ambra-1 e Loricrina que é maior do que cerca de 75% do respectivo nível de referência.

[0030] Assim, em alguns exemplos de realização, o nível de expressão de Ambra-1 na amostra de tecido é de aproximadamente 25% a cerca de 75% do nível de referência. Em alguns exemplos de realização, o nível de expressão de Ambra-1 não é maior do que 75%, não é maior do que 70%, não é maior do que 60%, não é maior do que 50%, não é maior do que 40% ou não é maior do que 30% do nível de referência.

[0031] Em alguns exemplos de realização, o nível de expressão de Loricrina na amostra de tecido é de aproximadamente 25% a cerca de 75% do nível de referência. Em alguns exemplos de realização, o nível de expressão de Loricrina não é maior do que 75%, não é maior do que 70%, não é maior do que 60%, não é maior do que 50%, não é maior do que 40% ou não é maior do que 30% do nível de referência.

[0032] Em alguns exemplos de realização, substancialmente não há expressão de Ambra-1 e/ou Loricrina na amostra de tecido. Em determinados exemplos de realização, a expressão de Ambra-1 e/ou Loricrina é inferior a 25%.

[0033] Em alguns exemplos de realização, um aumento no risco de metástase significa uma taxa de sobrevida em 7 anos sem metástase (também conhecida como “livre de doença”) inferior a 50%, por exemplo, inferior a 40%, por exemplo, inferior a 30%, por exemplo, inferior a 20%, por exemplo, inferior a 10% ou menos do que 5%, por exemplo.

[0034] Consequentemente, Ambra-1 e Loricrina podem ser consideradas como biomarcadores para a progressão da doença do melanoma para metástase. Assim, exemplos de realização da presente invenção podem ser considerados como proporcionando métodos para predizer a progressão do melanoma em metástase em um sujeito. Em alguns exemplos de realização, a presente invenção provê ainda a utilização de Ambra-1 e Loricrina, em uma amostra tecidual que compreende um tecido suprajacente ao melanoma primário, como biomarcadores do prognóstico para a progressão da doença melanoma na forma de metástases. Apropriadamente, Ambra-1 e Loricrina podem ser consideradas como biomarcadores para estratificar pacientes com melanoma em pacientes mais propensos a desenvolver metástases e pacientes menos propensos a desenvolver metástases. Vantajosamente, os métodos de alguns exemplos de realização da presente invenção auxiliam a identificar quais pacientes com melanoma têm maior probabilidade de se beneficiar pelo tratamento com um agente terapêutico. Apropriadamente, certos exemplos de realização da presente invenção podem possibilitar o tratamento com um agente terapêutico para um paciente que, de outro modo, não seria elegível para tratamento com um agente terapêutico.

[0035] Ao invés de determinar os níveis de expressão de biomarcadores no próprio tumor, os métodos de alguns exemplos de realização da invenção compreendem a determinação dos níveis de expressão de Ambra- 1 e Loricrina nos tecidos suprajacentes a um melanoma primário. Sem se limitar pela teoria, acredita-se que a redução ou perda da expressão destas proteínas pode indicar uma avaria da epiderme suprajacente, e o tecido endotelial que reveste os vasos sanguíneos ou linfáticos subjacentes ao tumor, o que sugere que as células cancerosas podem ser capazes de migrar ou já migraram a partir do tumor primário. Tal migração pode conduzir à metástase.

[0036] Em alguns exemplos de realização, a amostra de tecido compreende tecido que recobre um melanoma primário. Em alguns exemplos de realização, a amostra de tecido compreende pelo menos uma porção da epiderme peritumoral suprajacente ao melanoma primário. Em alguns exemplos de realização, a amostra de tecido compreende ainda uma porção de tecido normal adjacente ao melanoma primário. Em alguns exemplos de realização, a porção de tecido normal proporciona uma referência. Apropriadamente, a referência é um tecido de referência e/ou fornece um nível de referência de Ambra-1 e Loricrina.

[0037] Em alguns exemplos de realização, o método compreende determinar os níveis de expressão de Ambra-1 e Loricrina na epiderme. Os queratinócitos são células que constituem cerca de 90% da epiderme. Assim, em alguns exemplos de realização, a amostra de tecido compreende queratinócitos suprajacente ao melanoma primário. Apropriadamente, o sujeito pode ser identificado como estando em maior risco de metástase quando a referida identificação compreende a determinação de que o sujeito tem uma diminuição ou perda da expressão de Ambra-1 e Loricrina nos queratinócitos suprajacentes ao melanoma primário do sujeito.

[0038] Em alguns exemplos de realização, a amostra de tecido foi previamente obtida a partir do sujeito de modo a que a própria amostragem não forma parte dos métodos da invenção. A amostra pode ter sido obtida imediatamente antes do método, ou um número de horas, dias ou semanas antes do método. Em outros exemplos de realização, um método da invenção pode compreender adicionalmente a etapa de se obter a amostra de tecido do sujeito.

[0039] Apropriadamente, a expressão da Ambra-1 e da Loricrina na amostra de tecido é comparada com uma ou mais referência. Apropriadamente, a referência é um tecido, ou os níveis de expressão obtidos a partir deste.

[0040] Em alguns exemplos de realização, a referência inclui os níveis de expressão de Ambra-1 e Loricrina que são característicos do tecido normal. Apropriadamente, os níveis de referência de Loricrina e Ambra-1 podem ser obtidos pela determinação da expressão de Loricrina e Ambra-1 em um tecido de referência. Em alguns exemplos de realização, os níveis de expressão de Loricrina e Ambra-1 em um tecido de referência são determinados pela avaliação visual ou automatizada.

[0041] Em alguns exemplos de realização, os níveis de expressão da referência de Ambra-1 e Loricrina que são característicos do tecido normal são obtidos por determinação dos níveis de expressão em amostras de tecido obtidas a partir de um ou mais sujeitos saudáveis (por exemplo, uma coorte de sujeitos saudáveis).

[0042] Em alguns exemplos de realização, o tecido de referência compreende tecido normal. Em alguns exemplos de realização, o tecido normal compreende a epiderme a partir de um sítio que não inclui um melanoma primário. Em alguns exemplos de realização, o tecido de referência (ou níveis obtidos a partir deste) é uma referência interna (ou seja, obtido a partir do sujeito). Em alguns exemplos de realização, o tecido de referência é obtido a partir de tecido normal de um sítio adjacente ao melanoma primário. Em outros exemplos de realização, o tecido de referência é obtido a partir de um sítio do sujeito que está distante do melanoma primário. Assim, em alguns exemplos de realização, o nível de referência é o nível de expressão de Loricrina e/ou Ambra- 1 no tecido normal. O tecido de referência é apropriadamente coletado a partir da epiderme normal e o nível de referência é um nível de expressão nos queratinócitos da epiderme normal. A expressão de Ambra-1 e/ou Loricrina no tecido de referência, por exemplo, para gerar níveis de referência, pode ser determinada utilizando os métodos descritos na presente invenção.

[0043] Adequadamente, a amostra de tecido pode ser uma biópsia, ou uma secção da mesma, obtida a partir do sujeito. Uma amostra de tecido, tal como uma biópsia, pode ser obtida por uma variedade de métodos de amostragem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto, incluindo uma biópsia por punção, biópsia por raspagem, excisão local ampla e outros meios. Adequadamente, a amostra de tumor é retirada de um local cirúrgico a partir do qual o melanoma primário foi removido de um sujeito.

[0044] As amostras podem ser congeladas, frescas, fixadas (por exemplo, fixada em formalina), centrifugada e/ou emblocada (por exemplo, emblocada em parafina), e etc. A amostra de tecido pode, naturalmente, ser submetida a uma série de técnicas preparativas de pós-coleta e armazenamento bem conhecidas (por exemplo, extração de ácido nucleico e/ou proteínas, fixação, armazenamento, congelamento, ultrafiltração, concentração, evaporação, centrifugação, etc.) antes de avaliar a quantidade de Ambra-1 e/ou Loricrina na amostra. Da mesma forma, biópsias também podem ser submetidas a técnicas preparativas pós-coleta e de armazenamento, por exemplo, fixação. Uma amostra de tecido, ou parte deste, pode ser montada sobre um suporte sólido, tal como uma lâmina.

[0045] Em alguns exemplos de realização, a determinação da expressão de Ambra-1 e Loricrina na amostra de tecido compreende a medição dos níveis de cada uma das proteínas presentes na amostra de tecido. Isto pode ser conseguido por métodos conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto. Tais métodos incluem imunoensaios, imuno-histoquímica, por exemplo, ELISA, Western blots, imunoprecipitação seguido por SDS-PAGE e imunocitoquímica, e similares.

[0046] Assim, em alguns exemplos de realização, a determinação dos níveis de expressão de Ambra-1 e Loricrina compreende a realização de um ensaio. Em alguns exemplos de realização, o ensaio é um ensaio in vitro.

[0047] Em alguns exemplos de realização, o sujeito é identificado como tendo um risco aumentado de metástases pela determinação da expressão de Ambra-1 e Loricrina na amostra de tecido em um método compreendendo: - o contato da amostra de tecido com um primeiro ligante específico para Ambra-1, em que a presença de Ambra-1 cria um complexo Ambra-1- ligante; - o contato da amostra de tecido com um segundo ligante específico para a Loricrina, em que a presença de Loricrina cria um complexo Loricrina-ligante; e - a detecção e/ou quantificação do complexo Ambra-1-ligante e do complexo Loricrina-ligante.

[0048] Em alguns exemplos de realização, o primeiro ligante compreende um aptâmero ou anticorpo anti-Ambra-1. Em alguns exemplos de realização o aptâmero ou anticorpo anti-Ambra-1 se liga especificamente a uma proteína possuindo a sequência mostrada na SEQ ID NO. 1.

[0049] Em alguns exemplos de realização, o segundo ligante compreende um aptâmero ou anticorpo anti-Loricrina. Em alguns exemplos de realização o aptâmero ou anticorpo anti-Loricrina se liga especificamente a uma proteína possuindo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 2.

[0050] As sequências de aminoácidos de Ambra-1 e Loricrina humanas são apresentadas como exemplos, no entanto, faz-se observar que formas variantes destas sequências podem ser conhecidas ou identificadas. Em alguns exemplos de realização, o sujeito é um mamífero não humano. Vale ressaltar, portanto, que as referências feitas na presente invenção para Ambra- 1 (ou SEQ ID NO: 1) e Loricrina (ou SEQ ID NO: 2) incluem as sequências homólogas não humanas das mesmas.

[0051] Em alguns exemplos de realização, o primeiro e/ou segundo ligante compreende uma porção de detecção (por exemplo, um marcador fluorescente). Uma porção de detecção permite a detecção direta ou indireta e/ou a quantificação dos complexos formados.

[0052] Em alguns exemplos de realização, o primeiro ligante compreende uma primeira porção de detecção e o segundo ligante compreende uma segunda porção de detecção. A primeira porção de detecção pode ser a mesma que a segunda porção de detecção, ou pode ser diferente.

[0053] Em alguns exemplos de realização, o método compreende o contato de uma primeira porção ou secção da amostra de tecido com o primeiro ligante, e o contato de uma segunda porção ou secção da amostra de tecido com o segundo ligante. Isto é particularmente adequado para exemplos de realização em que a primeira porção de detecção é a mesma que a segunda porção de detecção. Em alguns exemplos de realização alternativos, o método compreende o contato da amostra de tecido, ou uma porção ou secção da mesma, com o primeiro ligante e o contato da mesma amostra de tecido, ou uma porção ou secção da mesma, com o segundo ligante. Pode ser possível detectar e/ou quantificar tanto o complexo Ambra-1-ligante quanto o complexo Loricrina- ligante na mesma amostra, ou parte ou secção da mesma, particularmente se a primeira e segunda porções de detecção são diferentes.

[0054] Apropriadamente, o primeiro e/ou segundo ligantes podem ser utilizados em combinação com um ou mais agentes de captura. Assim, em alguns exemplos de realização, a etapa de detecção e/ou quantificação do complexo Ambra-1-ligante e complexo Loricrina-ligante compreende o contato da(s) amostra(s) de tecido (s) (ou a(s) porção(ões) ou secção(ões) da(s) mesma(s)) com pelo menos um agente de captura. Apropriadamente, um primeiro agente de captura que se liga especificamente ao primeiro ligante pode ser utilizado para detectar e/ou quantificar o complexo Ambra-1-ligante, enquanto que um segundo agente de captura que se liga especificamente ao segundo ligante pode ser utilizado para a detecção e/ou quantificação do complexo Loricrina-ligante. Alternativamente, pode ser usado um único agente de captura que é capaz de se ligar especificamente a ambos ligantes, primeiro e segundo.

[0055] Em alguns exemplos de realização, o agente de captura compreende uma porção de ligação e uma porção de detecção.

[0056] Em alguns exemplos de realização, a porção de ligação é um anticorpo secundário que se liga especificamente ao primeiro e/ou segundo ligantes. Por exemplo, a porção de ligação pode ser um anticorpo anti-IgG universal que é capaz de se ligar aos anticorpos primários utilizados como primeiro e segundo ligantes.

[0057] Em alguns exemplos de realização, o método compreende ainda uma ou mais etapas de lavagem para remover o primeiro e segundo ligantes não ligados e, opcionalmente, agentes de captura não ligados.

[0058] Em alguns exemplos de realização específicos, é fornecido um ensaio in vitro para predizer um risco aumentado de metástases em um sujeito que sofre de melanoma, em que o referido ensaio compreende: • o contato de uma primeira poção de uma amostra de tecido obtida a partir do sujeito com um primeiro ligante específico para Ambra-1, em que a presença de Ambra-1 cria um complexo Ambra-1-ligante; • o contato de uma segunda porção da amostra de tecido com um segundo ligante específico para a Loricrina, em que a presença de Loricrina cria um complexo Loricrina-ligante; • a lavagem da primeira e segunda porções da amostra de tecido para remover os ligantes não ligados; • o contato da primeira e segunda porções da amostra de tecido com um agente de captura, em que o agente de captura compreende uma porção de detecção e uma porção de ligação específica para o primeiro e segundo ligantes; • a lavagem da primeira e segunda porções da amostra de tecido para remover os agentes de captura não ligados; e • a detecção e/ou quantificação do agente de captura presente nas primeira e segunda porções da amostra de tecido.

[0059] Adequadamente, uma porção de detecção adequada é selecionada a partir de uma porção fluorescente, uma porção luminescente, uma porção bioluminescente, um material radioativo, uma porção colorimétrica, uma nanopartícula possuindo propriedades detectáveis adequadas, uma porção cromogênica, biotina ou enzima.

[0060] As porções fluorescentes adequadas incluem proteínas fluorescentes (tais como ficoeritrina (PE), complexo peridinina- clorofila-proteína (PerCP) e aloficocianina (APC)) corantes fluorescentes (tais como fluoresceína isotiocianato (FITC), rodaminas (RS) e cianinas (Cis)), complexos em tandem fluorescentes (tal como Aloficocianina-Cianina-7 (APC-Cy7), complexo peridinina-clorofila-proteína-Cianina 5 (PerCP-Cy5) e Ficoeritrina- vermelho do Texas (PE-TexasRed)), e nanocristais (como Qdot 525, Qdot 545 e Qdot 625). A presença de complexos Ambra-1-ligante e Loricrina-ligante pode ser detectada utilizando microscopia de fluorescência pelo uso de ligantes fluorescentes ou agentes de captura compreendendo uma porção de detecção fluorescente.

[0061] Em exemplos de realização em que a porção de detecção compreende uma enzima, a presença do complexo Ambra-1-ligante e complexo Loricrina-ligante pode ser detectada e/ou quantificada pela detecção e/ou quantificação do produto da reação de uma reação de um substrato catalisado pela a enzima. Nestes exemplos de realização, o método compreende ainda a adição de um substrato enzimático e a detecção e/ou quantificação do produto da reação realizada sobre o substrato pela enzima. Por exemplo, a reação pode resultar na produção de um precipitado colorido, o qual seria detectado utilizando a microscopia de luz. As enzimas adequadas incluem, por exemplo, a fosfatase alcalina e a peroxidase de rábano. Um substrato cromogênico da fosfatase alcalina é o PNPP (fosfato de p-nitrofenila, sal dissódico). O PNPP produz um produto da reação solúvel em água amarelo que absorve a luz a 405 nm. Os substratos cromogênicos da peroxidase de rábano incluem ABTS (sal diamônico do 2,2'-azinobis [ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico]), o qual produz um produto de reação verde, de OPD (dicloridrato de o-fenilenodiamina), que produz um produto da reação amarelo-laranja, e TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) que forma um produto da reação solúvel de cor azul pela detecção do HRP. Outras combinações enzima-substrato adequadas, métodos para detectar os complexos Ambra-1-ligante e Loricrina-ligante e porções de detecção adequadas serão conhecidas pelos técnicos hábeis no assunto.

[0062] Em alguns exemplos de realização, o primeiro e/ou segundo ligante ou o agente de captura é imobilizado em uma superfície de fase sólida, por exemplo, um microarranjo, lâmina, poço de uma placa ou grânulo.

[0063] Em alguns exemplos de realização, a expressão da Ambra- 1 e da Loricrina é detectada e/ou quantificada pela avaliação visual, por exemplo, por microscopia. Em outros exemplos de realização, a expressão da Ambra-1 e da Loricrina é detectada e/ou quantificada por um scanner de lâminas automatizado.

[0064] De acordo com um nono aspecto a presente invenção provê um kit para a predição de um risco aumentado de metástase em um sujeito que sofre de melanoma, em que o referido kit compreende: • um primeiro ligante específico para Ambra-1; e • um segundo ligante específico para Loricrina.

[0065] Em alguns exemplos de realização, o kit compreende ainda instruções para uso do kit para predizer o risco de metástases em um sujeito que sofre de melanoma.

[0066] Em alguns exemplos de realização, o kit compreende ainda, pelo menos, um agente de captura. Adequadamente, um agente de captura pode compreender uma porção de detecção e uma porção de ligação específica para o primeiro e/ou segundo ligante.

[0067] Em alguns exemplos de realização, o primeiro e/ou segundo ligante e/ou o agente de captura compreende(m) uma enzima como porção de detecção, e o kit compreende ainda um substrato da enzima.

[0068] Apropriadamente, o kit pode compreender ainda um ou mais componentes adicionais, tais como reagentes e/ou dispositivos necessários para a realização de um ensaio in vitro, por exemplo, tampões, fixadores, soluções de lavagem, reagentes de bloqueio, diluentes, cromógenos, enzimas, substratos, tubos de ensaio, placas, pipetas, etc.

[0069] O kit de alguns exemplos de realização da invenção pode ser vantajosamente utilizado para a realização de um método de alguns exemplos de realização da invenção e pode ser empregado em uma variedade de aplicações, por exemplo, no campo diagnóstico ou como uma ferramenta de pesquisa. Será compreendido que partes do kit podem ser embaladas individualmente em frascos ou em combinação em recipientes ou unidades multi- recipientes. De modo adequado, a fabricação do kit segue procedimentos- padrão que são conhecidos pelos técnicos do assunto.

[0070] Em alguns exemplos de realização, um agente terapêutico é administrado ao sujeito por não mais do que 12 semanas, não mais do que 10 semanas, não mais do que 6 semanas, não mais do que 4 semanas, não mais do que 2 semanas ou não mais do que uma após o sujeito ser identificado como tendo uma diminuição ou perda de expressão de Ambra-1 e Loricrina na amostra de tecido.

[0071] Em alguns exemplos de realização, o agente terapêutico é um agente quimioterápico. Qualquer agente quimioterápico adequado disponível pode ser administrado ao sujeito. Conforme utilizado na presente invenção, um “agente quimioterápico” é qualquer agente terapêutico útil para o tratamento do câncer, e abrange quimioterápicos do tipo moléculas pequenas, bem como agentes biológicos, tais como anticorpos. Em alguns exemplos de realização, o agente quimioterápico é selecionado a partir dacarbazina (DTIC), Temozolomida, Nab-paclitaxel, paclitaxel, carmustina (BCNU), cisplatina, carboplatina, vinblastina, interleucina 2, interferon alfa, anticorpos (por exemplo, ipilimumab, anticorpo anti-PD1) e inibidores de B-Raf (por exemplo vemurafenib, dabrafenib).

[0072] Exemplos não limitantes das vias de administração do agente terapêutico incluem a administração subcutânea, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, tópica, intradérmica, intranasal ou intrabronquial (por exemplo, realizada por inalação). Em alguns exemplos de realização, o agente terapêutico é administrado por via parenteral, por exemplo, por via intravenosa. Os modos comuns de administração pela qual o agente terapêutico pode ser administrado incluem, por exemplo, administração em bolus ou na forma de uma infusão, durante um período de tempo definido.

[0073] Um agente terapêutico pode ser administrado em uma quantidade eficaz para prevenir, inibir ou retardar o desenvolvimento de metástases.

[0074] As doses adequadas e regimes de dosagem para um determinado agente terapêutico e sujeito podem ser determinadas utilizando uma variedade de diferentes métodos, tais como área da superfície corporal ou peso corporal, ou de acordo com a literatura especializada e/ou protocolos hospitalares individuais. As doses podem ser ajustadas após a consideração da contagem de neutrófilos, função renal e hepática, e histórico de quaisquer efeitos adversos anteriores do sujeito para o agente terapêutico. As doses também podem ser diferentes dependendo se o agente terapêutico é utilizado sozinho ou em combinação.

[0075] O técnico hábil no assunto reconhecerá que outros modos de administração, dosagens dos agentes terapêuticos e regimes de tratamento podem ser determinados pelo médico de acordo com os métodos conhecidos no estado da técnica.

[0076] Determinados exemplos de realização da presente invenção proveem um método de determinação de um regime de tratamento para um sujeito que sofre de melanoma, em que o referido método compreende: a) obtenção de uma amostra de tecido do sujeito, em que a amostra de tecido compreende o tecido suprajacente de um melanoma primário; b) determinação da expressão de Ambra-1 e Loricrina na amostra de tecido; c) comparação da expressão obtida em (b) com um tecido de referência ou níveis de referência obtidos do tecido, e d) (i) se a expressão de Ambra-1 e Loricrina é normal ou aumentada, um protocolo de atendimento reconhecido normal é seguido, ou (11) se a expressão de Ambra-1 e Loricrina está diminuída ou foi perdida, o sujeito é tratado com um regime de tratamento anticâncer sistêmico.

[0077] Um “protocolo de atendimento reconhecido normal”, tal como será conhecido pelos técnicos hábeis no assunto, significa uma excisão mais ampla da cicatriz deixada pela excisão do melanoma primário realizada no sujeito. O tamanho da excisão mais larga será determinado por um médico ou cirurgião, com base na profundidade de Breslow do melanoma primário. Um protocolo de atendimento reconhecido normal pode compreender ainda avaliações clínicas regulares (por exemplo, a cada 3-12 meses) do sujeito por até 5 anos. Em alguns exemplos de realização, quando o melanoma primário está em estádio 2b ou 2c, o protocolo de atendimento reconhecido normal pode compreender ainda a realização de um estadiamento utilizando CT scan da cabeça à pélvis do sujeito no momento do diagnóstico. Alguns centros de tratamento oferecem o estadiamento com biópsia do linfonodo sentinela de todos os tumores em estádio 2a, 2b e 2c. Assim, em alguns exemplos de realização, o protocolo de atendimento reconhecido normal pode compreender ainda a realização de uma biópsia de linfonodo sentinela.

[0078] Em alguns exemplos de realização, um regime de tratamento anticâncer sistêmico compreende a administração de um agente terapêutico para o sujeito.

[0079] Em determinados exemplos de realização a presente invenção provê um método para o tratamento de um sujeito que sofre de melanoma.

[0080] De modo ideal, um sujeito identificado como tendo risco aumentado de metástases é tratado o mais rapidamente possível para minimizar as possibilidades de desenvolvimento das metástases. Assim, em alguns exemplos de realização, o método ou regime de tratamento é para prevenir, inibir ou retardar as metástases ou para diminuir o risco de metástases no sujeito.

[0081] Em alguns exemplos de realização, o sujeito é tratado imediatamente ou pouco depois de ter sido identificado como tendo um risco aumentado de metástases.

[0082] Em alguns exemplos de realização, o tratamento com o agente terapêutico é realizado após a cirurgia para excisar o melanoma primário.

[0083] Em alguns exemplos de realização, um método de tratamento ou regime de tratamento pode incluir ainda um ou mais dos seguintes: imagiologia intensificada (por exemplo, tomografia computadorizada, PET, MRI, raios-X) do sujeito; discussão e/ou oferecimento ou realização de uma biópsia de linfonodo sentinela; linfadenectomia total ou parcial; inclusão do sujeito em ensaios clínicos; e radioterapia.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0084] Os exemplos de realização da invenção serão agora descritos por meio apenas de exemplos, e com referência às figuras anexas. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS - Figuras 1A-1D: são imagens de microscopia de luz mostrando a expressão de Ambra-1 na epiderme normal (Figura 1A) e epiderme peritumoral suprajacente (Figuras 1B-1D) de melanomas com estadiamento AJCC I. Barras de escala = 50 μm; - Figuras 2A-2C: são imagens de microscopia de imunofluorescência mostrando a expressão de Loricrina na epiderme normal (Figura 2A) e epiderme peritumoral suprajacente (Figuras 2B-1D) de melanomas com estadiamento AJCC I. Barras de escala = 50 μm; - Figura 3A: mostra a análise univariada da expressão epidérmica de Ambra-1 em melanomas de todos os estádios AJCC. Curva de Kaplan-Meier exibindo a Sobrevida livre de doença em 7 anos (meses até a primeira metástase detectada) em melanoma primário, sem alteração da expressão de Ambra-1 (linha superior), expressão de Ambra-1 diminuída ou ausente (linha tracejada) ou tumores ulcerados (linha inferior). teste de Log-Rank (Mantel-Cox) P < 0,0001. DFS = 100% sem perda de Ambra-1, 72,1% Ambra-1 diminuída ou ausente, 35,7% ulcerada. Análise direta do grupo sem perda de Ambra-1 e Ambra-1 diminuída ou ausente pelo teste de Log-Rank (Mantel-Cox) Teste P = 0,0270, HR 3,56 (CI 95% 1,16 - 10,93); - Figura 3B: mostra a análise multivariada da expressão de Ambra-1 em uma coorte piloto de melanomas estádio AJCC 1. Curva de Kaplan-Meier exibindo a Sobrevida livre de doença em 7 anos (meses até a primeira metástase detectada) em melanoma primário estádio AJCC 1 que não revelaram alteração na expressão de Ambra-1 (linha superior), comparada com tumores estádio 1 com ausência de Ambra-1 na epiderme (linha inferior). DFS = 100% sem perda de Ambra-1, 83,3% Ambra-1 diminuída ou ausente. Teste de Log-Rank (Mantel-Cox) P = 0,0575, HR 4,29 (95% CI 0,95 - 19,25); - Figura 4A: é uma curva de Kaplan-Meier mostrando a Sobrevida livre de doença em 7 anos (meses até primeira metástase detectada) em epidermes em que a expressão de Ambra-1 foi mantida (linha superior) em comparação com aquelas epidermes em que a expressão de Ambra-1 foi perdida (linha inferior), em todos os tipos de tumores. P = 0,0007, HR 10,1 (95% CI 2,6538,5); - Figura 4B: é uma curva de Kaplan-Meier mostrando a Sobrevida livre de doença em 7 anos (meses até primeira metástase detectada) em epidermes em que a expressão de Loricrina foi mantida (linha superior) em comparação com aquelas epidermes em que a expressão de Loricrina foi perdida (linha inferior), em todos os tipos de tumores. P = 0,0006, HR 18,4 (95% CI 3,596,2); - Figura 4C: é uma curva de Kaplan-Meier mostrando a Sobrevida livre de doença em 7 anos (meses até primeira metástase detectada) em epidermes nas quais a expressão de Ambra-1 e Loricrina foi mantida (linha superior) em comparação com aquelas epidermes em que a expressão de Ambra-1 e Loricrina foi perdida (linha inferior), em todos os tipos de tumores. P =< 0,0001, HR 39,6 (95% CI 6,4-243,9); - Figura 5A: é uma curva de Kaplan-Meier mostrando a Sobrevida livre de doença em 7 anos (meses até primeira metástase detectada) em epidermes de melanoma primário estádio 1 segundo os critérios da AJCC nas quais a expressão de Ambra-1 foi mantida (linha superior) em comparação com aquelas epidermes em que a expressão de Ambra-1 foi perdida (linha inferior). P = 0,001, HR 24,12 (95% CI 3,6-161); - Figura 5B: é uma curva de Kaplan-Meier mostrando a Sobrevida livre de doença em 7 anos (meses até primeira metástase detectada) em epidermes de melanoma primário estádio 1 segundo os critérios da AJCC nas quais a expressão de Loricrina foi mantida (linha superior) em comparação com aquelas epidermes em que a expressão de Loricrina foi perdida (linha inferior). P < 0,0001, HR 210 (95% CI 16,86-2624); - Figura 5C: é uma curva de Kaplan-Meier mostrando a Sobrevida livre de doença em 7 anos (meses até primeira metástase detectada) em epidermes de melanoma primário estádio 1 segundo os critérios da AJCC nas quais a expressão de Ambra-1 e Loricrina foi mantida (linha superior) em comparação com aquelas epidermes em que a expressão de Ambra-1 e Loricrina foi perdida (linha inferior). P = 0,0002, HR 93,5 (95% CI 8,67-1008); - Figura 6: mostra a sequência de aminoácidos de Ambra-1 de Homo sapiens a partir da UniProtKB (número de acesso principal Q9C0C7-1, isoforma 1) (SEQ ID NO: 1); - Figura 7: mostra a sequência de aminoácidos de Loricrina de Homo sapiens a partir da UniProtKB (número de acesso principal P23490) (SEQ ID NO: 2); - Figura 8: mostra uma série de imagens de microscopia da expressão de Ambra-1 (anticorpo anti-Ambra-1 (Abcam Biochemicals, Cambridge, Reino Unido; 69501; 1:200)) na epiderme normal (A), epiderme suprajacente de melanomas estádio 1 (b). Ambra-1 mantida, (c). Ambra-1 diminuída e (d) expressão de Ambra-1 completamente perdida); - Figura 9: mostra uma série de imagens de microscopia da expressão de Loricrina (anticorpo anti-Loricrina (Abcam Biochemicals, Cambridge, Reino Unido; 24722; 1:500)) na epiderme normal (a), epiderme suprajacente de melanomas estádio 1 (b) Loricrina mantida, (c) Loricrina completamente perdida; - Figura 10: exibe a associação entre a pontuação visual dada para a mudança peritumoral de Ambra-1 (nenhuma perda, alguma perda ou perda completa) em comparação com os resultados da análise quantitativa da redução no percentual de positividade da coloração da epiderme normal comparada com a epiderme peritumoral. As linhas horizontais representam a percentagem da pontuação média ± erro padrão da média (0 = 12,05, 1=25,16, 3=46,92). ANOVA com um fator P < 0,0001 ****; - Figura 11: mostra a associação entre a pontuação visual transmitida para a mudança peritumoral de Ambra-1 sem ou com alguma perda da coloração comparada com a completa perda de coloração. As linhas horizontais representam a percentagem de pontuação média ± desvio padrão (média da sem/alguma perda = 18,12 DP = 12,97, média da perda total = 46,92 DP = 15,34). Mann-Whitney, P < 0,0001 ****; - Figura 12: mostra a análise univariada da expressão epidérmica de Ambra-1 em melanomas de todos os estádios pelo critério AJCC. Curva de Kaplan-Meier exibindo a Sobrevida livre de doença em 7 anos (meses até a primeira metástase detectada) nas epidermes de melanomas primários sem perda ou redução da expressão de Ambra-1 (linha negra) versus ausência da expressão de Ambra-1 (linha vermelha). DFS = 97,7% sem perda/ diminuição de Ambra-1 (n=44), 94,3% ausência de Ambra-1 (n=35). Teste de Log-Rank (Mantel-Cox) P = 0,411, HR 2,59 (95% CI 0,26 - 25,05); - Figura 13: mostra a análise univariada da expressão epidérmica combinada de Ambra-1 e Loricrina em melanomas de todos os estádios pelo critério AJCC. Curva de Kaplan-Meier mostrando a Sobrevida livre de doença em 7 anos (meses até primeira metástase detectada) em epidermes com melanoma primário que mantêm alguma expressão epidérmica de Ambra-1 ou Loricrina (“baixo risco” linha preta), contra a perda da expressão epidérmica de Ambra-1 e Loricrina (“alto risco” linha vermelha). DFS = 98,46% Baixo risco (n=65), 86,67% Alto risco (n=15). Teste de Log-Rank (Mantel-Cox) P = 0,025, HR 9,29 (95% CI 1,49 - 558,0).

[0085] Mais detalhes de alguns exemplos de realização da invenção são fornecidos abaixo.

DEFINIÇÕES

[0086] O termo “anticorpo” conforme utilizado na presente invenção, pretende incluir anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos biespecíficos, conjugados anticorpo-droga, domínios e fragmentos de anticorpos, incluindo fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, dímeros, minicorpos, diacorpos (diabodies), e multímeros dos mesmos. Os anticorpos podem ser fragmentados utilizando técnicas convencionais. Os anticorpos podem ser de qualquer origem, incluindo aves e mamíferos (por exemplo, de humano, murino, burro, ovelha, coelho, cabra, cobaia, camelo, cavalo ou galinha), de animais transgênicos, ou a partir de fontes recombinantes. Os anticorpos podem ser preparados utilizando métodos conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto.

[0087] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “melanoma primário” refere-se a um tumor maligno sobre a pele no local de origem, independentemente da espessura, em pacientes sem evidência clínica ou histológica de doença metastática regional ou distante.

[0088] Conforme utilizado na presente invenção, o “tecido suprajacente um melanoma primário” refere-se a tecido epidérmico situado entre um melanoma primário e a superfície da pele.

[0089] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “tecido normal” inclui, por exemplo, a “epiderme normal”, que é a epiderme saudável (ou seja, livre de doença). Em alguns exemplos de realização, o tecido normal é a epiderme, que se situa ao lado do melanoma primário, por exemplo, dentro de um cuff de pele normal feita com a amostra do melanoma primário.

[0090] Conforme utilizado na presente invenção, “epiderme peritumoral” refere-se ao tecido epidérmico suprajacente ou situado em torno de um tumor.

[0091] Conforme utilizado na presente invenção, “metástase” é definida como a progressão ou recorrência da doença que pode ocorrer localmente (tal como a recorrência local e na doença de trânsito), regionalmente (tal como micrometástases ou macrometástase linfonodais), ou distalmente (tais como cérebro, pulmão e outros tecidos). Em alguns exemplos de realização, o termo “metástase” é utilizado para se referir a doença metastática após um melanoma primário. Normalmente, a metástase proveniente de um melanoma primário pode se espalhar para os pulmões e/ou cérebro do sujeito, bem como para outros locais.

[0092] Deve ser compreendido que os termos “comparação” e “comparar”, utilizados no presente, referem-se geralmente a uma comparação dos parâmetros ou níveis correspondentes, por exemplo, um valor absoluto é comparado com um valor de referência absoluto, enquanto uma concentração é comparada com uma concentração de referência ou um sinal de intensidade obtido a partir da amostra de tecido é comparado com o mesmo tipo de sinal de intensidade obtido a partir da referência. A comparação pode ser realizada manualmente, por exemplo, pela avaliação visual, ou pode ser automatizada (por exemplo, usando um scanner automatizado ou comparação assistida por computador). Assim, a comparação pode ser realizada por um dispositivo de computação.

[0093] O estádio de um melanoma é uma descrição do quão difundido ele está. Isto inclui a sua espessura na pele, se ele se espalhou para os linfonodos próximos ou quaisquer outros órgãos, e alguns outros fatores. O estadiamento é baseado nos resultados do exame físico, biópsias, e quaisquer exames de imagem (tomografia computadorizada ou ressonância magnética etc.) ou outros testes que foram feitos. Tais ensaios são bem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto. O sistema mais frequentemente utilizado para o estadiamento do melanoma é o sistema TNM segundo os critérios do AJCC (Comitê Conjunto Americano sobre o Câncer). A Tabela 1 descreve as características de identificação de cada estádio. TABELA 1

EXEMPLOS MATERIAIS E MÉTODOS EXEMPLO 1 IMUNO-HISTOQUÍMICA PARA AMBRA-1 E LORICRINA

[0094]A análise de tecido de melanoma primário a partir do grupo de pacientes mostrado na Tabela 2 foi realizada pela coloração imuno- histoquímica de cortes de tecido embebidos em parafina e fixados em formalina. Os cortes de tecido de 5-6 μm de espessura foram colocados em lâminas de microscópio X-tra (Leica Microsystems, Milton Keynes, Reino Unido) a 56 °C durante a noite. Em seguida, as lâminas foram incubadas em Histoclear (AGTC Bioproducts, Hessle, Reino Unido) durante 20 minutos antes de reidratação em etanol 100%, 75%, 50% e, em seguida, água destilada por 5 segundos cada. A recuperação antigênica foi realizada pelo aquecimento em micro-ondas em tampões de recuperação antigênica pré- aquecidos (Ambra-1 (10 mM de Tris-HCl (pH 7,6)), Loricrina (10 mM de Na- citrato (pH 6,0)) durante 12 minutos antes de ser deixada resfriar durante 20 minutos. Cada corte foi deixado secar e o tecido isolado com uma caneta hidrofóbica ImmEdge (Vector Laboratories Inc., Burlingame, EUA). Os cortes de tecido foram então incubados com PBS/Tween a 0,05% (PBS/T) durante 3 minutos para permitir a reidratação antes da incubação com 0,2% de Triton X-100 (Sigma, St. Louis, EUA) em PBS/T durante 10 minutos. Após a lavagem com PBS/T os cortes foram incubados em H2O 3% em água durante 10 minutos para bloquear a peroxidase endógena. A avidina endógena foi bloqueada com a solução de Avidina de um kit de Bloqueio avidina/biotina (Vector Laboratories Inc., Burlingame, EUA) durante 15 minutos, antes da nova lavagem com PBS/T e a incubação com a porção de biotina do kit durante 15 minutos, com uma sequência de lavagem PBS/T. O bloqueio proteico foi realizado pela incubação dos cortes em soro de bloqueio a 2% a partir do kit Vectastain Elite kit (Vector Laboratories Inc., Burlingame, EUA).

[0095]Após uma nova lavagem com PBS/T, os cortes foram incubados com anticorpo primário durante 1 hora em temperatura ambiente com anticorpo anti-Ambra-1 (Abcam Biochemicals, Cambridge, Reino Unido; 69501; 1:200) ou anticorpo anti-Loricrina (Abcam Biochemicals, Cambridge, UK; 24722; 1:500). Após 3 lavagens com PBS/T o anticorpo primário foi detectado com anticorpo secundário animal-específico biotinilado durante 30 minutos em temperatura ambiente antes de mais 3 lavagens com PBS/T. A coloração foi realizada pela incubação durante 30 minutos com os reagentes ABC a partir do kit Vectastain Elite (pré-misturados 30 minutos antes da utilização), seguido por 3 lavagens com PBS/T e por uma incubação de 10 minutos com uma solução VIP (Vector Laboratories Inc., Burlingame, EUA). As lâminas foram enxaguadas em água corrente durante 5 minutos antes da contracoloração com hematoxilina (Sigma Diagnostics, St. Louis, EUA) durante 2 minutos, seguido de uma lavagem final em 10 minutos em água com trocas frequentes. Após a desidratação utilizando etanol a 75% e 100% durante 5 segundos os cortes foram limpos durante 2 minutos em histoclear, deixados secar, e em seguida as lâminas foram montadas com lamínulas e DPX (VWR International Ltd., Poole, Reino Unido).

DETERMINAÇÃO DA EXPRESSÃO

[0096] A diferença nos níveis de expressão de Ambra-1 e/ou Loricrina entre a epiderme normal e epiderme peritumoral foi inicialmente determinada por acordo consensual de 3 dermatologistas e um histopatologista. A expressão foi quantificada por estimativa da percentagem de células positivamente coradas na região peritumoral, como uma percentagem da expressão Ambra-1/Loricrina determinada no controle interno de referência da epiderme normal adjacente utilizando o software de análise de imagens Leica QWin (Leica Microsystems). Estas observações foram categorizadas como expressão “mantida” (> 75% da expressão normal), “diminuída” (25-75% da expressão normal) ou “perdida” (< 25% da expressão normal). A avaliação de cada corte foi realizada sem conhecimento prévio do eventual resultado da doença. TABELA 2 COORTE DE PACIENTES

ESTATÍSTICA

[0097] Todas as análises estatísticas e gerações de imagens foram realizadas utilizando o programa GraphPad Prism 5 (GraphPad Software; San Diego, EUA) de análise estatística.

[0098] Todas as análises univariadas e multivariadas das variáveis de estudo para a Sobrevida livre de doença foram realizadas usando construções de curvas de Kaplan-Meier contra 8 anos de seguimento, bem como pela análise de log-rank (Mantel-Cox) dos dados comparativos.

EXEMPLO 1 RESULTADOS E DISCUSSÕES

[0100] Os presentes inventores identificaram que uma diminuição na expressão de Ambra-1 na epiderme peritumoral suprajacente aos melanomas, particularmente nos melanomas com estádio I pelos critérios AJCC, se correlaciona de maneira significante com a diminuição da sobrevida livre de doença ao longo de 7 anos. Conforme mostrado na Figura 1A, a expressão de Ambra-1 é aumentada a partir da camada basal para a camada superficial da epiderme (estrato córneo) na epiderme normal situada adjacente a um melanoma em estádio 1 AJCC, consistente com diferenciação mantida. No entanto, a expressão de Ambra-1 é mantida (Figura 1B), diminuída (Figura 1C) ou mesmo perdida (Figura 1D) na epiderme suprajacente de uma gama de tumores em estádio 1 (AJCC).

[0101] Com relação à Figura 3, a perda ou diminuição da expressão de Ambra-1 na epiderme se correlaciona com um maior risco de metástase. Em todos os melanomas AJCC (Figura 3A), 100% dos pacientes que não apresentam perda da expressão de Ambra-1 ficaram livres da doença após 7 anos. Isto diminuiu para 72,1% nos pacientes com expressão de Ambra-1 diminuída ou ausente. Apenas 35,7% dos pacientes com melanomas ulcerados ficaram livres da doença após 7 anos. Isso destaca um aumento gradual no risco da doença com perda de Ambra-1 e eventual ulceração franca associado ao tumor.

[0102] Tomando apenas os melanomas em estádios AJCC 1 (Figura 3B), a percentagem de pacientes que ficaram livres da doença depois de 7 anos foi de 100% para aqueles que não exibiam nenhum tipo de perda na expressão de Ambra-1, 83,3% para aqueles que exibiram diminuição ou ausência da expressão de Ambra-1.

[0103] As Figuras 4A e 5A exibem a correlação entre a expressão de Ambra-1 e a sobrevida livre de doença dos sujeitos em uma coorte menor, nos quais foram avaliadas as expressões de Ambra-1 e Loricrina, durante 7 anos para todos os tipos de tumor (Figura 4A) ou apenas tumores em estádio 1 (Figura 5A). Em todos os tipos de tumor (Figura 4A), todos os pacientes cuja expressão de Ambra-1 foi mantida ficaram livres da doença após 7 anos. Para aqueles em que a expressão de Ambra-1 foi perdida, apenas 18% estavam livres da doença após 7 anos. Para a coorte de pacientes apenas com tumores em estádio 1, novamente 100% dos pacientes com expressão mantida de Ambra-1 não desenvolveram metástases, enquanto que a taxa de sobrevida livre da doença foi de 17% para aqueles com perda da expressão de Ambra-1.

[0104] Contrariamente às atuais publicações no estado da técnica que implicam Ambra-1 no controle da autofagia, acredita-se que o papel da Ambra-1 neste contexto possa ser a regulação negativa da diferenciação com a epiderme normal, resultando em uma perda da integridade. Foi demonstrado pelos inventores que a regulação negativa de outras proteínas envolvidas na autofagia, tal como a ATG1, não afeta o processo de diferenciação, suportando a hipótese de que este processo não está relacionado com a autofagia.

[0105] De modo inesperado, verificou-se que a perda da expressão de Loricrina também se correlaciona com um maior risco de metástase. As Figuras 2A-C mostram imagens representativas da expressão normal de Loricrina no estrato córneo (Figura 2A), bem como nas epidermes peritumorais nas quais a expressão de Loricrina foi perdida (Figura 2B, ou mantida (Figura 2C).

[0106] Com relação às Figuras 4B e 5B, a perda ou diminuição da expressão epidérmica de Loricrina se correlaciona com a diminuição da sobrevida livre de doença ao longo de 7 anos. Nos melanomas em todos os estádios AJCC (Figura 4B), 64% dos pacientes nos quais a expressão de Loricrina foi mantida ficaram livres da doença após 7 anos. Entretanto, nenhum dos pacientes com perda de expressão de Loricrina estavam livres da doença após 5 anos. Para os melanomas em estádio AJCC 1 (Figura 5B), 100% dos pacientes nos quais a expressão de Loricrina foi mantida ficaram livres da doença após 7 anos. Nenhum paciente com perda de expressão de Loricrina ficou livre de doença após 5 anos. Isso demonstra uma correlação estatisticamente significativa entre a expressão Loricrina e as taxas de sobrevida livre de doença nos pacientes com melanoma. Entretanto, como com a Ambra- 1, a perda apenas da Loricrina não é preditiva da progressão da doença com uma precisão de 100%, tanto para melanomas estádio AJCC 1 quanto para melanomas em todos os estádios (veja a Tabela 3).

[0107] No entanto, os inventores estabeleceram que a determinação da expressão de Ambra-1 e Loricrina é fortemente representativa da progressão da doença para metástase. Os resultados destes experimentos são mostrados nas Figuras 4C e 5C, e resumidos na Tabela 3. TABELA 3

1 Valor preditivo positivo; 2 Valor preditivo negativo.

[0108] Assim, verificou-se que a combinação da perda de Ambra-1 e Loricrina identifica pacientes que passaram a desenvolver metástases com uma precisão 100%.

EXEMPLO 2

[0109] Uma análise mais aprofundada foi realizada em 80 amostras retrospectivas de pacientes com melanomas estádios AJCC 1 recrutados para uma coorte independente no Hospital Universitário James Cook (Tabela 4). A análise revela dados de acordo com as conclusões da coorte retrospectiva inicial detalhada acima. TABELA 4

[0110] A coloração por imuno-histoquímica foi realizada utilizando DAB contracorado como a coloração especialista mais amplamente utilizada no uso clínico. Todas as amostras foram digitalmente fotografadas usando digitalização automatizada de lâminas em um scanner de lâminas Leica SCN400 (Leica Biosystems) dentro do Biobanco da Universidade de Newcastle (Figuras 8 e 9).

[0111] A análise visual da perda da expressão epidérmica de Ambra-1 foi realizada por dois dermatologistas independentes e foram atribuídas pontuações (escores) para cada lâmina com base no grau de perda da expressão epidérmica de Ambra-1 na epiderme peritumoral em comparação com epiderme normal dentro do mesmo corte. Houve 95% de concordância nas pontuações atribuídas entre os dermatologistas e uma nova revisão destas lâminas resultou em uma pontuação acordada para cada lâmina.

[0112] Da mesma forma, os mesmos dois dermatologistas empreenderam a análise visual da perda de Loricrina na epiderme de forma independente. Qualquer interrupção na continuidade da coloração de Loricrina na epiderme peritumoral que não foi devido à invasão tumoral direta da epiderme superior foi pontuada como perda de Loricrina. Concordância foi de 97,5% com acordo alcançado para todas as amostras.

[0113] A análise quantitativa da Ambra-1 na epiderme foi realizada usando o software de análise previamente validado do sistema Leica Slidepath. Cinco áreas representativas da epiderme normal foram selecionadas em aumento de 200x e a porcentagem média de pixels - DAB positivos foi obtida. Este valor foi comparado com a percentagem média de pixels DAB-positivos em dez áreas representativas da epiderme peritumoral na ampliação de x200. A redução no percentual global da expressão de Ambra-1 entre a expressão peritumoral e a epiderme normal foi então calculada.

[0114] A comparação das pontuações visuais e quantitativas (Figura 10) revela um aumento gradual estatisticamente significativo (P <0,0001) na pontuação quantitativa com a diminuição peritumoral de Ambra-1, tal como analisado visualmente. Isso valida o sistema de pontuação (escore) visual como método robusto e confiável para analisar a coloração de Ambra-1 na epiderme.

[0115] Para determinar um ponto de corte para a análise de sobrevida, pontuações (escores) visuais e quantitativas foram reanalisados sem ou com alguma perda de Ambra- 1 peritumoral em comparação à perda completa (Figura 11). Está análise mostra um aumento estatisticamente significativo na pontuação qualitativa em amostras com escores determinados visualmente como tendo uma perda completa de Ambra-1 (P <0,0001). Isso valida ainda mais a adequação da avaliação visual para identificar amostras com perda completa da Ambra-1 peritumoral, e um desvio padrão abaixo da média para a perda completa de Ambra-1 (média 46,92 ; DP 15,34) fornece um corte apropriado de 30% a adicionalmente determina a análise qualitativa da perda de Ambra-1.

[0116] A análise univariada da perda de Ambra-1 peritumoral em todos os pacientes não revelou nenhuma diferença global na sobrevida livre de doença entre tumores de “alto risco” (tumores com perda completa de Ambra-1 peritumoral, determinado por uma diminuição qualitativa > 30% na expressão) e tumores de “baixo risco” (diminuição qualitativa < 30%) (Figura 5). DFS = 97,7% tumores de baixo risco (n=44), 94,3% tumores de alto risco (n=35). Teste de LogRank (Mantel-Cox) P = 0,411, HR 2,59 (95% CI 0,26 - 25,05). Esses resultados não suportam Ambra-1 como biomarcador prognóstico neste subconjunto de pacientes.

[0117] Para avaliar a validade da combinação da expressão de Ambra-1 e Loricrina na epiderme como um biomarcador prognóstico, a análise univariada foi realizada em todas as amostras. As amostras de “alto risco” foram determinadas como tendo completa perda de expressão peritumoral de Ambra- 1 (diminuição quantitativa > 30%) e uma perda de Loricrina. Todos os outros tumores, com perda de Ambra-1 ou Loricrina, eram considerados de “baixo risco”. Estes resultados mostraram um aumento estatisticamente significativo de metástases no grupo de tumor de alto risco, mesmo com o número total de eventos metastáticos sendo baixo; reforçando ainda mais a utilidade da combinação de Ambra-1 e Loricrina como um biomarcador prognóstico combinado na doença em estádio AJCC 1. DFS = 98,46% Baixo risco (n=65), 86,67% Alto risco (n=15). Teste de Log-Rank (Mantel-Cox) P = 0,025, HR 9,29 (95% CI 1,49 - 558,0). TABELA 5

[0118] A análise final dos biomarcadores combinados Ambra- 1/Loricrina destaca a maior especificidade (83%), e valores preditivos positivos e negativos (13% e 98,4%, respectivamente) da combinação Ambra-1/Loricrina que vai além da Ambra-1 ou Loricrina sozinhas como marcadores (Tabela 5). Isso indica que o biomarcador combinado pode acrescentar valor prognóstico na identificação de pacientes de alto risco para o aumento da vigilância, bem como na identificação de pacientes de baixo risco que poderiam ser tranquilizados quanto ao seu prognóstico com mais certeza.

[0119] Esta é uma importante descoberta, pois uma diminuição ou perda da expressão destas duas proteínas pode indicar uma deterioração da epiderme suprajacente e da vasculatura subjacente ao tumor, o que significa que as células cancerosas já podem ter migrado a partir do tumor primário no momento da excisão do tumor.

[0120] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção proporciona assim um meio para determinar se um sujeito que sofre de melanoma possui maior risco de desenvolver metástase. Isto permite que um regime de tratamento seja adaptado, reduzindo desse modo o risco do sujeito desenvolver metástases e melhorar seu prognóstico.

[0121] Ao longo da descrição e das reivindicações deste relatório descritivo, as palavras “compreende” e “contém” e variações das mesmas indicam “incluindo, mas não se limitando a” e não são utilizadas para excluir outros radicais, aditivos, componentes, números inteiros ou etapas. Ao longo da descrição e das reivindicações deste relatório descritivo, o singular inclui o plural a menos que o contexto exija o contrário. De modo específico, quando um artigo indefinido é utilizado, o relatório descritivo deve ser entendido como contemplando a pluralidade, bem como a singularidade, a menos que o contexto dite de outra forma.

[0122] Elementos, números inteiros, características ou grupos descritos em conjunto com um aspecto específico, exemplo de realização ou exemplo da invenção devem ser entendidos como sendo aplicáveis a qualquer outro aspecto, exemplo de realização ou exemplo da invenção descrito, a menos que sejam incompatíveis com esta. Todos os elementos e características descritos neste relatório descritivo (incluindo quaisquer reivindicações, resumo e desenhos), e/ou todas as etapas de qualquer método ou processo divulgado, podem ser combinados em qualquer combinação, exceto as combinações onde pelo menos algumas das características e/ou etapas são mutuamente exclusivas. A invenção não está restrita a quaisquer detalhes de quaisquer exemplos de realização descritos acima. A invenção estende-se a qualquer elemento novo ou combinação nova das características descritas no presente relatório descritivo (incluindo quaisquer reivindicações, resumo e desenhos), ou a qualquer elemento novo ou qualquer combinação nova das etapas de qualquer método ou processo divulgado.

[0123] A atenção do leitor é dirigida para todos os papéis e documentos que são depositados simultaneamente ou previamente a este relatório descritivo relacionados com o presente pedido e que estão abertos à inspeção pública com este relatório descritivo, e os teores de todos esses documentos são incorporados ao presente pela referência.

Claims (11)

1. MÉTODO IN VITRO PARA DETERMINAR SE UM SUJEITO COM MELANOMA TEM UM RISCO MAIOR DE DESENVOLVER METÁSTASE, caracterizado pelo referido método compreender: (i) a determinação da expressão de Ambra-1 e Loricrina em uma amostra de tecido obtida a partir do sujeito, em que a amostra de tecido compreende o tecido suprajacente de um melanoma primário; em que a determinação da expressão de Ambra-1 e Loricrina na amostra de tecido compreende: o contato da amostra de tecido com um primeiro anticorpo anti- Ambra-1, em que a presença de Ambra-1 cria um complexo Ambra-1-ligante; o contato da amostra de tecido com um segundo anticorpo anti- Loricrina, em que a presença de Loricrina cria um complexo Loricrina-ligante; e a detecção e/ou quantificação do complexo Ambra-1-ligante e do complexo Loricrina-ligante; e (ii) a comparação da expressão obtida em (i) com um tecido de referência ou níveis de referência obtidos de tal tecido; em que uma diminuição na expressão de Ambra-1 e Loricrina na amostra de tecido em comparação com o tecido de referência ou níveis de referência, ou a perda da expressão de Ambra-1 e Loricrina na amostra de tecido é indicativa de um maior risco de metástase.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos níveis de referência serem os níveis de expressão de Ambra-1 e Loricrina que são característicos do tecido normal, em que opcionalmente o tecido de referência compreende um tecido normal.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo tecido normal ser a epiderme a partir de um sítio que não inclui um melanoma primário.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo tecido de referência ser uma referência interna, em que opcionalmente o tecido normal é a partir de um sítio adjacente ao melanoma primário.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela amostra de tecido compreender o tecido suprajacente a um melanoma primário e uma porção da epiderme normal adjacente ao melanoma primário.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela expressão de Ambra-1 e Loricrina na amostra de tecido ser de 25 a 75% do respectivo nível de referência.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela expressão de Ambra-1 e Loricrina na amostra de tecido ser menor que 25% do respectivo nível de referência, em que opcionalmente as expressões de Ambra-1 e Loricrina na amostra de tecido são determinadas pela observação visual ou por um scanner de lâminas automático.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo método compreender o contato de um primeiro corte da amostra de tecido com o primeiro ligante, e o contato de um segundo corte da amostra de tecido com o segundo ligante.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela amostra de tecido compreender pelo menos uma porção de uma epiderme peritumoral suprajacente ao melanoma primário.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela amostra de tecido compreender queratinócitos suprajacentes ao melanoma primário e o método compreender a determinação da expressão de Ambra-1 e Loricrina nos queratinócitos, em que opcionalmente o sujeito é um ser humano ou animal.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo sujeito sofrer de melanoma estágio 1, estágio 2, estágio 3 ou estágio 4 segundo os critérios do AJCC (Comitê Conjunto Americano sobre o Câncer), em que opcionalmente o sujeito está sofrendo de melanoma classificado pelo estadiamento AJCC em estágio 1a, estágio 1b, estágio 2a, estágio 2b ou estágio 2c.