BR112016030326B1 - Poliepítopo quimérico, polinucleotídeo, vetor, vetores de genoma de vírus do sarampo (mv) recombinantes, partículas de mv recombinantes,composições imunogênicas, uso das partículas de mv recombinantes e método de produção de partículas de mv recombinantes - Google Patents

Poliepítopo quimérico, polinucleotídeo, vetor, vetores de genoma de vírus do sarampo (mv) recombinantes, partículas de mv recombinantes,composições imunogênicas, uso das partículas de mv recombinantes e método de produção de partículas de mv recombinantes Download PDF

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Abstract

poliepítopo quimérico, polinucleotídeo, vetor, vetores de genoma de vírus do sarampo (mv) recombinantes, célula hospedeira, partículas de mv recombinantes, composições imunogênicas, uso das partículas de mv recombinantes e método de produção de partículas de mv recombinantes. a presente invenção refere-se a um poliepítopo quimérico do vírus da dengue composto de fragmentos de proteínas não estruturais e seu uso em uma composição imunogênica contra infecção pelo vírus da dengue. a presente invenção fornece meios, particularmente polinucleotídeos, vetores, células e métodos de produção de vetores que expressam os mencionados poliepítopos quiméricos, particularmente vetores que consistem de partículas de vírus do sarampo (mv) recombinantes. a presente invenção também se refere ao uso das partículas de mv recombinantes, particularmente sob a forma de composição ou vacina, para prevenção e/ou tratamento de infecções por vírus da dengue.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a um poliepítopo quimérico do vírus da dengue composto de fragmentos de proteínas não estruturais e seu uso em composições imunogênicas contra infecções pelo vírus da dengue. A presente invenção fornece meios, particularmente polinucleotídeos, vetores, células e métodos de produção de vetores que expressam os mencionados poliepítopos quiméricos, particularmente vetores que consistem em partículas de vírus do sarampo (também denominado MV) recombinantes. A presente invenção também se refere ao uso das partículas de MV recombinantes, particularmente na forma de composição ou vacina, para prevenção e/ou tratamento de infecções pelo vírus da dengue.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] O vírus da dengue (DENV) pertence à família de flavivirídeos de vírus de RNA de fita positiva englobados e é transmitido por mosquitos Aedes. A infecção por DENV é a doença viral causada por artrópodes mais importante, com cerca de 390 milhões de infecções todos os anos, podendo resultar em febre da dengue (DF) e, em 1-5% dos casos, em febre da dengue hemorrágica (DHF) e síndrome de choque da dengue (DSS), caracterizada por vazamento vascular e gerando choque hipotensivo (World Health Organization (WHO) Press, 2009, WHO/HTM/NTD/DEN/2009, primeira edição; Bhatt, S. et al, Nature 2013, 496 (7446): 504-507). Estima-se que mais de dois milhões de casos de doença da dengue severa e mais de 20.000 mortes ocorram a cada ano (Gubler, D. J., The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 2012, 86 (5): 743-744).
[003] Existem quatro sorotipos de DENV principais (denominados DENV1-4) que são 67-75% idênticos em nível de aminoácido. O genoma de RNA viral é traduzido como proteína isolada que é dividida por proteases virais e de hospedeiro em três proteínas estruturais (capsídeo (C), pré-membrana (prM) e envelope (E)) e sete proteínas não estruturais (NS) (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5). Pode-se ter acesso às sequências de nucleotídeos completas dos genomas de referência dos quatro sorotipos de vírus da dengue por meio do banco de dados Genbank com os números de acesso NC_001477.1, NC_001474.2, NC_001475.2 e NC_002640.1, respectivamente. Durante a infecção, a proteína E interage com receptores celulares e absorção viral ocorre por meio de endocitose mediada por receptor (Heinz, F. X. et al, Archives of Virology Supplementum 1994, 9: 339-348; Mukhopadhyay, S. et al, Nat. Rev. Microbiol. 2005, 3 (1): 13-22). A proteína E é estruturalmente conservada entre flavivírus e consiste em três domínios (EDI, EDII e EDIII) (Rey, F. A. et al, Nature 1995, 375 (6529): 291-298). Notadamente, o domínio EDIII induz os anticorpos específicos de sorotipos e neutralizadores mais potentes (Beltramello, M. et al, Cell Host & Microbe 2010, 8 (3): 271-283; Shrestha, B. et al, PLoS Pathog. 2010, 6 (4): e1000823; Sukupolvi-Petty, S. et al, J. Virol. 2010, 84 (18): 9227-9239; Wahala, W. M. et al, PLoS Pathog. 2010, 6 (3): e1000821; de Alwis, R. et al, PLoS neglected tropical diseases 2011, 5 (6): e1188; Yauch, L. E. et al, Advances in virus research 2014, 88: 315-372).
[004] Foi descrito anteriormente um antígeno de DENV tetravalente mínimo isolado composto dos quatro domínios de envelope III (EDIII) dos quatro sorotipos de DENV fundidos ao ectodomínio da proteína de membrana (ectoM) (Brandler et al, PLoS 2007, 1 (3), e96; Brandler et al, Vaccine, 2010, 28, 6730-6739). Quando expresso por um vetor viral reprodutor derivado de vacina com MV atenuado vivo, este antígeno induziu a neutralização de anticorpos contra os quatro sorotipos de vírus da dengue (Brandler et al, Vaccine, 2010, 28, 6730-6739). Além disso, avaliado em um modelo de primata não humano de infecção por DENV, vetor de MV recombinante que expressa o antígeno EDIII-ectoM tetravalente forneceu proteção apenas parcial. Esta observação indicou que faltava um antígeno DENV adicional para fornecer proteção completa.
[005] As proteínas NS estão envolvidas na montagem e reprodução viral e normalmente não são incorporadas em proteínas virais maduras. Surpreendentemente, embora infecção primária por um sorotipo de DENV induza imunidade protetora duradoura contra reinfecção pelo mesmo sorotipo, não apenas ela protege contra infecções com outros sorotipos, mas também aumenta o risco de desenvolvimento de doença mais severa mediante infecção secundária, fenômeno atribuído a anticorpos não neutralizantes ou subneutralizantes denominado Aprimoramento Dependente de Anticorpos (ADE) (Halstead, S. B. et al, Nature 1977, 265 (5596): 739-741; Dejnirattisai, W. et al, Science 2010, 328 (5979): 745-748). Em apoio à hipótese de ADE, propôs-se que os baixos níveis de anticorpos com reação cruzada de sorotipos produzidos após infecção primária podem aprimorar as infecções secundárias por meio da formação de complexos de anticorpo e DENV que se ligam aos receptores FCY (FCYR) sobre células mieloides. Este processo gera carga viral mais alta e maior produção de mediadores inflamatórios responsáveis pela permeabilidade vascular (Halstead, S. B. et al, Nature 1977, 265 (5596): 739741; Morens, D. M. et al, Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America 1994, 19 (3): 500-512; Halstead, S. B. et al, Advances in virus research 2003, 60: 421-467).
[006] Mecanisticamente, demonstrou-se que ADE é criticamente dependente da ativação de receptor de FcYRIIa expresso por monócitos, macrófagos e células dendríticas (DCs) que produzem altas quantidades de citoquinas (TNF-α e IL-6) e quemoquinas (MIP-1α) mediante estímulo (Wong, K. L. et al, PLoS ONE 2012, 7 (5): e36435; Boonnak, K. et al, J. Immunol. 2013, 190 (11): 5659-5665; Guilliams, M. et al, Nat. Rev. Immunol. 2014, 14 (2): 94108). Também se demonstrou que as cargas virais mais altas em ADE resultam da ligação de complexos imunológicos (entre o vírus e anticorpos subneutralizantes) ao receptor similar a Ig de leucócito B1 (LILR-B1) sobre monócitos primários humanos, gerando a inibição das reações antivirais iniciais mediadas pelo FcYRIIa ativado (Chan, K. R. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2014, 111 (7): 2722-2727).
[007] Dependendo, portanto, da natureza da reação de anticorpos específicos de DENV, a imunidade adaptativa pode induzir a proteção contra infecções ou o aumento da infecção e progressão da doença.
[008] Como as células B, também foi sugerido o papel patogênico de células T específicas de vírus durante infecções secundárias. A hipótese, denominada “pecado antigênico original”, postulou que, após infecção primária, células T de memória em reação cruzada, com baixa avidez pelo sorotipo da infecção secundária, dominam e mascaram a reação de células T específica, gerando morte menos eficiente de células alvo infectadas (Mongkolsapaya, J. et al, Nat. Med. 2003, 9 (7): 921-927). Estas células T CD8+ com reação cruzada, estimuladas mediante infecção secundária com sorotipo diferente, também exibiram diferenças qualitativas e quantitativas na sua reação ao epítopo com reação cruzada ou o ligante de peptídeo alterado (Bashyam, H. S. et al, J. Immunol. 2006, 176 (5): 2817-2824).
[009] Apesar destes estudos, entretanto, a demonstração direta do papel patogênico de células T específicas de DENV ainda é ausente e relatórios recentes não sustentaram o papel causador para células T CD8+ com reação cruzada na patogênese de febre hemorrágica da dengue durante infecções secundárias. De fato, estudo em adultos que experimentam infecção secundária não revelou nenhuma correlação entre a magnitude e a especificidade de reações de células T e grau de doença clínica (Simmons, C. P. et al, J. Virol. 2005, 79 (9): 5665-5675) e importante papel protetor para células T CD8+ durante a infecção por DENV primária também foi identificado em modelo de camundongo (Yauch, L. E. et al, J. Immunol. 2009, 182 (8): 4865-4873). Mais surpreendentemente, análise detalhada de reações de células T restritas por HLA em doadores de área hiperendêmica chega a reforçar o papel protetor de células T CD8+ durante infecção por DENV (Weiskopf, D. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2013, 110 (22): E2046-2053). Aparentemente, embora as reações específicas de sorotipos sejam marco inicial de infecções primárias, ainda há alteração em direção a uma reação contra epítopos conservados após infecções secundárias, sem nenhuma diferença de avidez ou funcionalidade em células T CD8+ dentre reações conservadas ou específicas de sorotipos. Além disso, estabeleceu-se correlação significativa entre reação de células T fracas e susceptibilidade a doenças (Weiskopf, D. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2013, 110 (22): E2046-2053). Coletivamente, estes estudos salientam o efeito benéfico de células T CD8+ contra a progressão de doenças em infecções por vírus da dengue.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0010] Figura 1: imunogenicidade de proteínas não estruturais NS3, NS4a, NS4b e NS5 de DENV1 e conservação de sequências de aminoácidos intrassorotipos e intersorotipos de DENV. A. Weiskopf, D. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2013, 110 (22): E2046-2053; B. Rivino, L. et al, J. Virol. 2013, 87 (5): 2693-2706.
[0011] Figura 2: sequência de aminoácidos e estrutura secundária de antígeno poliepitópico combinado de DENV1 NS (SEQ ID NO: 3). A indicação a seguir de posições de aminoácidos na sequência indica o tipo de estrutura secundária no qual o(s) aminoácido(s) está(ão) envolvido(s) na proteína com comprimento total correspondente conforme previsto por NS4B ou descrito em estudos de cristalografia publicados para NS3 e NS5 (PDB ID 2VBC, J. Virol.; janeiro de 2008; 82 (1): 173-183 e 2J7W, J. Virol., maio de 2007; 81 (9): 4753-65, respectivamente). Particularmente, hélices alfa são observadas nos segmentos de aminoácidos a seguir: 35-45; 57-66; 94-103; 123-138; 181-185; 189-198; 232-241; 247-254; 307-318; 342-360; 371-372; 374-375; 396-398; 406-419; 455-460; 468-473; 480-489; 500-517. Fitas beta são observadas nos segmentos de aminoácidos a seguir: 20-23; 50-54; 72-74; 112-116; 142-146; 164-168; 276-277; 280-281; 283-285; 291-293; 366-370; 376-380; 436-442; 452-453. Dobras são observadas nos segmentos de aminoácidos a seguir: 16; 55-56; 70; 80; 86-87; 89-93; 105; 111; 117; 122; 140; 148-49; 156-157; 161-162; 173-174; 178-179; 221; 243; 260-261; 287-288; 297-298; 305-306; 433-35; 449-450; 479; 492; 519-520. Voltas são observadas nos segmentos de aminoácidos a seguir: 17-18; 27-29; 32-34; 46-47; 67-69; 77-78; 118-119; 139; 151-152; 186-187; 199-200; 204-205; 223-226; 230-231; 242; 255-257; 264-267; 278-279; 304; 319; 329-332; 420-423; 428-429; 474; 490-491; 518; 528-538. Além disso, hélices 3/10 são observadas nos segmentos de aminoácidos a seguir: 213-218; 271-273; 301-303; 462-466 e ponte β é observada nos aminoácidos 188 e 300. As posições com aminoácidos conservados (encontradas em mais de 99,9% de um quadro representativo de 2033 sequências que incluem os quatro sorotipos) são destacadas em cinza escuro.
[0012] Figura 3: sequências de consenso de aminoácidos de poliepítopos DENV2-NS, DENV3-NS e DENV4-NS (SEQ ID NO: 146, 147 e 148, respectivamente).
[0013] Figura 4: alinhamento que compara as sequências de aminoácidos de poliepítopos de consenso DENV1-NS, DENV2-NS, DENV3-NS e DENV4-NS (SEQ ID NO: 3, 146, 147 e 148, respectivamente).
[0014] Figura 5: sequência de nucleotídeos nativos do polinucleotídeo que codifica poliepítopo DENV1-NS (SEQ ID NO: 1).
[0015] Figura 6: sequência de nucleotídeos otimizados do polinucleotídeo que codifica poliepítopo DENV1-NS (otimizado por códons humanos, otimizado por sarampo) (SEQ ID NO: 2).
[0016] Figura 7: representação esquemática de vetores de MV recombinantes que expressam antígenos de DENV. A sequência sintética poliepitópica NS foi inserida na posição ATU 2 ou 3 de vetores MV em combinação ou não com antígeno tetramérico EDIII de DENV. Os genes de MV são indicados conforme segue: nucleoproteína (N), fosfoproteína e proteínas acessórias V/C (PVC), matriz (M), fusão (F), hemaglutinina (H) e polimerase (L). Promotor de RNA polimerase T7 (T7), término de RNA polimerase T7 (T7t), ribozima de vírus da hepatite delta (d), ribozima de cabeça de martelo (hh). Em MVDVax9, o antígeno combinado inserido na posição ATU 2 é composto de uma proteína tetramérica EDIII de DENV secretada fundida a uma sequência poliepitópica NS secretada com locais de furina (que contém a sequência de aminoácidos RRDKR conforme definido em SEQ ID NO: 152) inserida para separar os diferentes componentes. Por outro lado, em MVDVax11, a sequência sintética poliepitópica de NS não é secretada (sem sequência líder de peptídeo) e é fundida em 3’ à proteína tetramérica EDIII de DENV exportada (a partir de sequência líder de peptídeos).
[0017] Figura 8: detecção por meio de Western Blot da expressão de antígeno poliepitópico NS DENV (superior) e antígeno tetramérico EDIII DENV (fundo) em lisatos celulares de células Vero infectadas por vírus recombinantes de MV-DENV ou células HEK293 transfectadas com plasmídeo pcDNA3-NS. Proteínas DENV foram sondadas com Mabs específicos.
[0018] Figura 9: peptídeos de poliepítopos NS DENV utilizados para testes ELISPOT em camundongos CD46-IFNAR. As sequências 1-36 são sobreposições de peptídeos 165-mer de cinco aminoácidos que cobrem todo o antígeno poliepitópico NS de DENV. Peptídeos 37-41 foram identificados utilizando algoritmos de previsão pela sua capacidade de ligar receptores de células T H2-Db e H2-Kb expressos em camundongos CD46-IFNAR. Estes peptídeos possuem sequências de aminoácidos conforme definido em SEQ ID NO: 98-138.
[0019] Figura 10: quantificação por meio de ELISPOT de reações de células T em camundongos CD46-IFNAR imunizados por vetores MV- DENV. Grupos de seis camundongos foram imunizados com MVDVax10, MVDVax8 ou MV vazio. ELISPOTS foram quantificados em esplenócitos coletados sete dias após uma única imunização. São exibidas reações a peptídeos NS DENV, MV e concanavalina A como controle positivo.
[0020] Figura 11: quantificação por meio de ELISPOT de reações de células T em camundongos CD46-IFNAR imunizados por vetores MV- DENV. São exibidas as reações a diferentes conjuntos de peptídeos ou peptídeos individuais que cobrem o antígeno poliepitópico NS.
[0021] Figura 12: reações de ELISPOT em camundongos CD46- IFNAR imunizados por vetores MV-DEBNF acumulando as reações a conjuntos ou peptídeos individuais.
[0022] Figura 13: procedimento para oferecer reações de células T CD8+ em camundongos transgênicos classe I HLA/nulos classe I H-2 e quantificação da reação de IFN-Y por meio de teste ELISPOT.
[0023] Figura 14: identificação e restrição de HLA dos epítopos imunogênicos da construção poliepitópica DENV1-NS (SEQ ID NO: 3).
[0024] Figura 15: quantificação das reações de células T em camundongos transgênicos HLA-A2, A24, B7 e B35 por meio do teste ELISPOT. Foram realizados três experimentos independentes, em que, ao todo, dez e quatro camundongos transgênicos HLA-A*02:01 receberam a construção poliepitópica DENV1-NS (SEQ ID NO: 3) e o plasmídeo controle, respectivamente, oito e quatro camundongos transgênicos HLA-A*24:02 receberam a construção poliepitópica DENV1-NS e o plasmídeo controle, respectivamente, cinco e quatro HLA-B*07:02 receberam a construção poliepitópica DENV1-NS e o plasmídeo controle, respectivamente, e cinco e três camundongos transgênicos HLA-B*35:01 receberam a construção poliepitópica DENV1-NS e o plasmídeo controle, respectivamente. Todos os animais foram imunizados por meio de injeção intradérmica (100 μg de construção poliepitópica DENV1-NS ou 100 μg de plasmídeo controle pcDNA3.1) seguida por eletroporação in vivo. Foram realizadas duas imunizações em intervalo de três semanas e células do baço foram testadas para determinar a secreção de IFN-Y por meio de ELISPOT dez dias após a segunda injeção. Camundongos individuais foram testados em paralelo com diferentes peptídeos a 2 μg/ml e com concanavalina A (ConA) a 5 μg/ml, concentração final.
[0025] Figura 16: reações de ELISPOT de (A) IFN-Y e (B) Granzima B (GrB) que acumulam as reações a peptídeos individuais. Nestes testes, os peptídeos utilizados foram: para camundongos transgênicos HLA- A24, os peptídeos P17, P32 e P33 (que possuem as sequências de aminoácidos definidas em SEQ ID NO: 39, 33 e 47, respectivamente) foram utilizados como cognatos e o peptídeo HBSP A2-2 (que possui a sequência de aminoácidos TLCIPHVAV conforme definido em SEQ ID NO: 150) como controle. Para camundongos transgênicos HLA-A2, os peptídeos P30, P53 e P56 foram utilizados como cognatos (que possuem as sequências de aminoácidos definidas em SEQ ID NO: 18, 51 e 55, respectivamente) e o peptídeo HBSP A2-2 como controle. Para camundongos transgênicos HLA-B7, os peptídeos P15, P30 e P36 foram utilizados como cognatos (que possuem as sequências de aminoácidos definidas em SEQ ID NO: 68, 18 e 21, respectivamente) e o peptídeo Sv B7-3 (que contém a sequência de aminoácidos SPFLPLLPI conforme definido em SEQ ID NO: 151) como controle. Para camundongos transgênicos HLA-B35, os peptídeos P49, P50 e P51 foram utilizados como cognatos (que possuem as sequências de aminoácidos definidas em SEQ ID NO: 28, 32 e 45, respectivamente) e o peptídeo Sv B7-3 como controle.
[0026] Figura 17: atividade citotóxica in vivo de células T de animais imunizados com a construção poliepitópica DENV1-NS (SEQ ID NO: 3) ou o plasmídeo controle. Para camundongos HLA-A24, células alvo com altas manchas foram pulsadas com uma mistura de peptídeos cognatos P17, P32 e P33 (que contêm as sequências de aminoácidos conforme definido em SEQ ID NO: 39, 33 e 47, respectivamente), enquanto células controle com poucas manchas não foram pulsadas. Para camundongos HLA-A2, células alvo com altas manchas foram pulsadas com uma mistura de peptídeos cognatos P30, P53 e P56 (que contêm as sequências de aminoácidos conforme definido em SEQ ID NO: 18, 51 e 55, respectivamente), enquanto células controle com poucas manchas foram pulsadas com o peptídeo controle HBSP A2-2. Para camundongos HLA-B35, células alvo com altas manchas foram pulsadas com uma mistura de peptídeos cognatos P49, P50 e P51 (que contêm as sequências de aminoácidos conforme definido em SEQ ID NO: 28, 32 e 45, respectivamente), enquanto células controle com poucas manchas não foram pulsadas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0027] Os inventores analisaram transcritos expressos de forma diferencial em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de doadores infectados sintomáticos ou assintomáticos de uma coorte no Camboja e observaram quantidade significativa de genes correspondentes à ativação de células T CD8+ sobre-expressas em indivíduos assintomáticos, em comparação com doadores sintomáticos, com febre da dengue (DF) ou febre hemorrágica da dengue (DHF). Uma quantidade mais alta de transcritos associados a TH17 e ativação de neutrófilos também foram observadas em PBMC desses pacientes sintomáticos com DHF e síndrome de choque da dengue (DSS), de acordo com a forte reação inflamatória observada em casos de dengue severos. Tomadas em conjunto, estas observações apresentam forte suporte a um papel protetor ligado por HLA para células T CD8+ em imunidade anti-DENV.
[0028] Os inventores projetaram um antígeno capaz de induzir a imunidade de células T CD8+ para DENV. O mais importante é que este antígeno possui tamanho pequeno em comparação com o comprimento total do genoma DENV ou o comprimento total de proteínas NS DENV, de forma que ele possa ser inserido em qualquer vetor de vacinas, tal como um vetor viral reprodutor derivado de vacina de MV atenuado vivo. Além disso, este projeto destina-se a fornecer um antígeno DENV enriquecido em epítopos altamente antigênicos, com a ideia de limitar a exposição do sistema imunológico a epítopos fracamente imunogênicos e evitar a dispersão ou diluição da reação imunológica. Este antígeno é composto de regiões poliepitópicas de proteínas NS de DENV. Utilizando distribuição e resistência de epítopos de anti-células T de DENV compiladas (Simmons, C. P. et al, J. Virol. 2005, 79 (9): 5665-5675; Yauch, L. E. et al, J. Immunol. 2009, 182 (8): 4865-4873; Weiskopf, D. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2013, 110 (22): E2046-2053; Imrie, A. et al, J. Virol. 2007, 81 (18): 10081-10091; Lund, O. et al, PLoS ONE 2011, 6 (10): e26494; Weiskopf, D. et al, J. Immunol. 2011, 187 (8): 4268-4279; Boucherma, R. et al, J. Immunol. 2013, 191 (2): 583-593; Nascimento, E. J. et al, PLoS neglected tropical diseases 2013, 7 (10): e2497; Rivino, L. et al, J. Virol. 2013, 87 (5): 2693-2706; Rivino, L. et al, J. Immunol. 2013, 191 (8): 4010-4019; Immune Epitope Database (IEDB)), os inventores selecionaram quatro regiões que são enriquecidas em epítopos CD8, para um total de 539 aminoácidos: duas regiões em NS3 (185 e 134 aminoácidos, respectivamente), uma região em NS4b (86 aminoácidos) e uma em NS5 (135 aminoácidos) (Figura 1). As fronteiras dessas quatro regiões foram selecionadas com base na estrutura secundária e nas propriedades de sequências de aminoácidos das poliproteínas correspondentes, utilizando dados cristalográficos para NS3 e NS5 (ID PDB 2VBC e 2J7W, respectivamente), utilizando ferramentas de previsão tais como JPRED (Cole, C., Barber, J. D. e Barton, G. J., Nucleic Acids Res., 2008, 35 (Supl. 2) W197- W201) ou GOR IV (método de previsão de estruturas secundárias GOR versão IV, Methods in Enzymology, 1996, R. F. Doolittle Ed., vol. 266, 540-533, Garnier, J., Gibrat, J-F, Robson, B.) para NS4B (Figura 2). Notadamente, o projeto evitou cuidadosamente o rompimento de elementos de estrutura secundária tais como as hélices α ou fitas β (Figura 2). Ao todo, 2033 sequências de genoma da dengue com comprimento total (865 para o sorotipo 1, 678 para o sorotipo 2, 427 para o sorotipo 3 e 63 para o sorotipo 4) foram alinhadas utilizando MUSCLE 3.7 (Edgar, R. C., Nucleic Acids Res. 2004, 32 (5): 1792-1797), com ajustes manuais de acordo com a sequência de aminoácidos. A similaridade de sequências foi avaliada intra e intersorotipos em níveis de ácidos nucleicos e aminoácidos. Análise das regiões de interesse concatenadas revelou forte conservação intrassorotipos e geralmente grau mais alto de identidade de sequências em comparação com o genoma como um todo, incluindo para comparações entre subtipos (Figuras 1 e 2). Com base na diversidade genética dos quatro sorotipos de DENV e com a ideia de que epítopos de células T são conservados entre sorotipos diferentes ou são específicos de sorotipos, mas com a capacidade de induzir reações de células T CD8+ com reação cruzada, foi selecionada uma sequência de consenso de protótipos com base em linhagens epidêmicas de DENV1, o poliepítopo de células T NS DENV1.
[0029] Selecionou-se uma sequência de consenso de sorotipo 1, pois ela apresentou identidade genética média mais alta com os quatro sorotipos (em comparação com o sorotipo 1: 99,48%; sorotipo 2: 83,48%; sorotipo 3: 89,39%; sorotipo 4: 76,96%).
[0030] Estimou-se a identidade genética média para cada sorotipo como percentual de identidade de sequências (razão de posições idênticas ao longo do total de posições alinhadas que constituem o poliepítopo NS) em pares para cada sequência do sorotipo e foi relatada a média. Este percentual fornecido corresponde apenas à concatenação dos fragmentos selecionados de NS3, NS4B e NS5.
[0031] A presente invenção refere-se, portanto, a um poliepítopo quimérico que contém menos de 600 resíduos de aminoácidos que compreendem ou consistem nos fragmentos de (a), (b) e (c) a seguir montados em um polipeptídeo de fusão em que os fragmentos de (a), (b) e (c) são fundidos direta ou indiretamente nesta ordem: a. dois fragmentos da proteína não estrutural (NS) NS3 do sorotipo 1 do vírus da dengue (DENV) 1 (DENV1) que compreende ou consiste em duas regiões, em que a primeira região contém uma sequência de aminoácidos conforme definido em SEQ ID NO: 6 e a segunda região contém uma sequência de aminoácidos conforme definido em SEQ ID NO: 9; b. um fragmento da proteína NS4b de DENV1 que possui uma sequência de aminoácidos conforme definido em SEQ ID N° 12; c. um fragmento da proteína NS5 de DENV1 que possui uma sequência de aminoácidos conforme definido em SEQ ID N° 15; ou uma de suas variantes de poliepítopos, que (i) compreende ou consiste no conjunto em um polipeptídeo de fusão de fragmentos NS DENV, cujas sequências são obtidas por meio de alinhamento dos fragmentos NS3 DENV1, NS4b DENV1, NS5 DENV1 indicados em (a), (b) e (c) com as sequências NS3, NS4b e NS5 correspondentes das proteínas NS de um vírus do sorotipo DENV2, DENV3 ou DENV4 ou (ii) consiste em um poliepítopo quimérico que contém uma sequência de aminoácidos que possui mais de 75% de identidade, particularmente mais de 80%, mais de 85% ou mais de 90% de identidade com a sequência do polipeptídeos de fusão que consiste em fragmentos fundidos (a), (b) e (c) (dos quais é derivada por meio de mutação de resíduos de aminoácidos) ao longo de todo o seu comprimento.
[0032] Em uma realização específica, a presente invenção refere- se a um poliepítopo quimérico que possui tamanho de menos de 600 resíduos de aminoácidos, particularmente que consiste em uma fita de 539 resíduos de aminoácidos e compreende ou consiste na fusão de fragmentos denominados (a), (b) e (c) a seguir e obtidos ou representantes de diversas proteínas não estruturais (NS) de qualquer genoma DENV, nomeadamente fragmentos que consistem em : a. a proteína NS3 que consiste nos aminoácidos 1645 a 1829 e 1959 a 2092 na sequência de poliproteínas de DENV1 (acesso Genbank n° NP_059433.1) ou aminoácidos 1645 a 1828 e 1958 a 2091 na sequência de poliproteínas de DENV2 (número de acesso Genbank NP_056776.2) ou aminoácidos 1643 a 1827 e 1957 a 2090 na sequência de poliproteínas de DENV3 (acesso Genbank n° YP_001621843.1) ou aminoácidos 1644 a 1827 e 1957 a 2090 na sequência de poliproteínas de DENV4 (acesso Genbank n° NP_073286.1); b. a proteína NS4b que consiste em aminoácidos 2262 a 2347 na sequência de poliproteínas de DENV1 (acesso Genbank n° NP_059433.1) ou aminoácidos 2260 a 2345 na sequência de poliproteínas de DENV2 (número de acesso Genbank NP_056776.2) ou aminoácidos 2260 a 2344 na sequência de poliproteínas de DENV3 (acesso Genbank n° YP_001621843.1) ou aminoácidos 2259 a 2341 na sequência de poliproteínas de DENV4 (acesso Genbank n° NP_073286.1); e c. a proteína NS5 que consiste em aminoácidos 2766 a 2899 na sequência de poliproteínas de DENV1 (acesso Genbank n° NP_059433.1) ou aminoácidos 2765 a 2898 na sequência de poliproteínas de DENV2 (número de acesso Genbank NP_056776.2) ou aminoácidos 2763 a 2896 na sequência de poliproteínas de DENV3 (acesso Genbank n° YP_001621843.1) ou aminoácidos 2761 a 2894 na sequência de poliproteínas de DENV4 (acesso Genbank n° NP_073286.1); em que cada fragmento (a), (b) e (c) compreende uma série de epítopos apropriados para permitir reação imunológica, especialmente reação de células T imunes contra todos os sorotipos DENV, em que o mencionado poliepítopo resulta da fusão direta ou indireta da série dos mencionados fragmentos, particularmente em que os mencionados fragmentos originam-se de um único sorotipo do vírus da dengue.
[0033] Em uma realização específica, a presente invenção refere- se a um poliepítopo quimérico que possui tamanho de 539 aminoácidos e compreende ou consiste na fusão de fragmentos denominados (a), (b) e (c) a seguir e obtidos ou representantes de diversas proteínas não estruturais (NS) de qualquer genoma DENV, nomeadamente fragmentos que consistem em: a. a proteína NS3 codificada pelos nucleotídeos 5027 a 5581 e 5969 a 6370 na sequência de nucleotídeos de DENV1 (acesso Genbank n° NC_001477.1) ou nucleotídeos 5026 a 5580 e 5968 a 6369 na sequência de nucleotídeos de DENV2 (acesso Genbank n° NC_001474.2) ou nucleotídeos 5021 a 5575 e 5963 a 6364 na sequência de nucleotídeos de DENV 3 (acesso Genbank n° NC_001475.2) ou nucleotídeos 5028 a 5582 e 5970 a 6371 na sequência de nucleotídeos de DENV 4 (acesso Genbank n° NC_002640.1); b. a proteína NS4b codificada pelos nucleotídeos 6878 a 7135 na sequência de nucleotídeos de DENV1 (acesso Genbank n° NC_001477.1) ou nucleotídeos 6874 a 7131 na sequência de nucleotídeos de DENV2 (acesso Genbank n° NC_001474.2) ou nucleotídeos 6872 a 7126 na sequência de nucleotídeos de DENV 3 (acesso Genbank n° NC_001475.2) ou nucleotídeos 6876 a 7124 na sequência de nucleotídeos de DENV 4 (acesso Genbank n° NC_002640.1); e c. a proteína NS5 codificada pelos nucleotídeos 8390 a 8791 na sequência de nucleotídeos de DENV1 (acesso Genbank n° NC_001477.1) ou nucleotídeos 8389 a 8790 na sequência de nucleotídeos de DENV2 (acesso Genbank n° NC_001474.2) ou nucleotídeos 8381 a 8782 na sequência de nucleotídeos de DENV 3 (acesso Genbank n° NC_001475.2) ou nucleotídeos 8382 a 8783 na sequência de nucleotídeos de DENV 4 (acesso Genbank n° NC_002640.1); em que cada fragmento traduzido (a), (b) e (c) compreende uma série de epítopos apropriados para permitir reação imunológica, especialmente reação de células T imunes contra todos os sorotipos de DENV, em que o mencionado poliepítopo resulta da fusão direta ou indireta da série dos mencionados fragmentos, particularmente em que os mencionados fragmentos originam-se de um único sorotipo do vírus da dengue.
[0034] Conforme definido no presente, o termo “poliepítopo” designa um polipeptídeo convenientemente com pelo menos 3 e, particularmente, pelo menos 5 e, preferencialmente, mais de 10 ou mais de 13 epítopos identificados em proteínas NS3, NS4b e NS5 de DENV1, particularmente epítopos de células T de sequência de consenso de NS3, NS4b ou NS5 de DENV1 fornecida na Figura 1. Epítopos dentro da presente invenção são lineares ou de conformação, preferencialmente lineares, e são qualquer peptídeo ou polipeptídeo envolvido na indução de uma reação imunológica mediada por células, especialmente reação imunológica de células T contra DENV e, particularmente, contra qualquer um dentre os sorotipos DENV1, DENV2, DENV3, DENV4 ou contra diversos, particularmente todos os sorotipos de DENV. Consequentemente, os epítopos descritos no presente incluem aqueles que são processados por APC (células que apresentam antígenos) em um hospedeiro, especialmente epítopos T reconhecidos em associação com moléculas MHC (Complexo de Histocompatibilidade Principal) de classe I, tais como epítopos que dirigem as células, são epítopos T ou linfócitos T CD8+ reconhecidos em associação com moléculas MHC da classe II, tais como aqueles cujas células alvo são linfócitos T CD4+.
[0035] A expressão “poliepítopo quimérico” indica qualquer polipeptídeo poliepitópico que compreende subporções de diferentes proteínas NS DENV selecionadas a partir de proteínas NS3, NS4b e NS5, tal como um poliepítopo derivado de uma primeira proteína NS DENV e um polipeptídeo derivado de uma segunda proteína NS DENV conforme definido no presente. Polipeptídeos são também considerados poliepítopos quiméricos se incluírem subporções derivadas de diferentes poliepítopos da mesma proteína NS DENV ou até dos mesmos poliepítopos de diferentes proteínas NS DENV. O poliepítopo quimérico de acordo com a presente invenção inclui a variante de polipeptídeo. Consequentemente, cada definição ou realização descrita no presente aplica-se ao polipeptídeo variante, a menos que seja tecnicamente irrelevante.
[0036] Em uma realização específica da presente invenção, o poliepítopo quimérico compreende epítopos restritos por antígeno de leucócitos humanos (HLA). A expressão “restrito por HLA” designa a capacidade de um epítopo específico de ter afinidade por este tipo de molécula de HLA. As moléculas de HLA utilizadas no presente invenção englobam moléculas da classe I (denominadas HLA-A, B ou C) ou moléculas da classe II (denominadas DP, DQ ou DR).
[0037] Em outra realização específica da presente invenção, o poliepítopo quimérico permite reação de células T CD8+ e/ou CD4+ restrita por antígeno de leucócitos humanos (HLA) e/ou reação de células T CD4+ contra DENV1, DENV2, DENV3 e DENV4. Uma lista não exaustiva de epítopos de células T CD8 DENV é fornecida na Tabela 1.
TABELA 1
[0038] Epítopos de células T+ CD8 DENV que contêm sequências de aminoácidos conforme definido em SEQ ID NO: 16.68. aOs aminoácidos diferentes do epítopo descrito encontram-se sublinhados; bepítopos de células T CD8 com avaliação positiva no teste Elispot encontram-se sublinhados; cNT: não testado. As referências para restrição de HLA são as seguintes: (1) Rivino, L. et al, J. Virol. 2013, 87 (5): 2693-2706; (2) Simmons, C. P. et al, J. Virol. 2005, 79 (9): 5665-5675; (3) Imrie, A. et al, J. Virol. 2007, 81 (18): 1008110091; (4) Boucherma, R. et al, J. Immunol. 2013, 191 (2): 583-593; (5) Weiskopf, D. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2013, 110 (22): E2046-2053; (6) Lund, O. et al, PLoS ONE 2011, 6 (10): e26494; (7) Rivino, L. et al, J. Immunol. 2013, 191 (8): 4010-4019; (8) Nascimento, E. J. et al, PLoS neglected tropical diseases 2013, 7 (10): e2497; (9) Immune Epitope Database (IEDB); (10) Weiskopf, D. et al, J. Immunol. 2011, 187 (8): 4268-4279; (11) Yauch, L. E. et al, J. Immunol. 2009, 182 (8): 4865-4873.
[0039] Em outra realização específica da presente invenção, o poliepítopo quimérico permite reação de células T CD4+ restrita por antígeno de leucócitos humanos (HLA) contra DENV1, DENV2, DENV3 e DENV4. Uma lista não exaustiva de epítopos de células T CD4 DENV é fornecida na Tabela 2.
TABELA 2
[0040] Epítopos de células T+ CD4 DENV que contêm sequências de aminoácidos conforme definido em SEQ ID NO: 69-97:
[0041] Em uma realização específica, demonstrou-se que a sequência de poliepítopos quiméricos NS oferece reações antigênicas em camundongos com restrição de HLA tais como HLA-A*02:01, HLA-A*24:02, HLA-B*07:02 ou HLA-B*35:01.
[0042] Em uma realização específica, a presente invenção refere- se a um poliepítopo quimérico, cujo tamanho é de 539 aminoácidos, que compreende ou consiste em: a. dois fragmentos da proteína NS3 não estrutural (NS) do sorotipo 1 do vírus da dengue (DENV) (DENV1), que possui sequências de aminoácidos conforme definido em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, respectivamente; b. um fragmento da proteína NS4b de DENV1 que compreende sequências de aminoácidos conforme definido em SEQ ID NO: 12; c. um fragmento da proteína NS5 de DENV1 que compreende sequências de aminoácidos conforme definido em SEQ ID NO: 15; e em que cada fragmento de NS (a), (b) e (c) é fundida direta ou indiretamente com outro fragmento de NS (a), (b) e (c) no poliepítopo, preferencialmente nesta ordem.
[0043] Pode-se ter acesso às sequências de nucleotídeos da poliproteína de DENV1, DENV2, DENV3 e DENV4 por meio dos números de acesso Genbank NP_059433.1, NP_056776.2, YP_001621843.1 e NP_073286.1, respectivamente.
[0044] Sequências de aminoácidos de poliepítopos DENV2-NS, DENV3-NS e DENV4-NS de SEQ ID NO: 146, 147 e 148, respectivamente, que são poliepítopos variantes de acordo com a presente invenção, são descritas na Figura 3. Os inventores conduziram um alinhamento que exibe resíduos de aminoácidos conservados em sequências de polipeptídeos DENV1-NS, DENV2-NS, DENV3-NS e DENV4-NS (Figura 4).
[0045] Em uma realização preferida da presente invenção, o poliepítopo quimérico compreende pelo menos os epítopos P30, P451, P36, P453, P49, P50, P32, P17, P21, P51, P33, P56 e P15 descritos no presente. Particularmente, os epítopos P30, P451 e P56 são restritos por HLA-A*02:01, os epítopos P17, P32 e P33 são restritos por HLA-A*24:02, os epítopos P15, P30 e P36 são restritos por HLA-B*07:02 e os epítopos P21, P49, P50, P51 e P453 são restritos por HLA-B*35:01. Espera-se que o poliepítopo quimérico contenha uma série de epítopos adicionais pelo menos iguais ao número de HLA existente, com exemplos fornecidos nas Tabelas 1 e 2.
[0046] Os epítopos de acordo com a presente invenção podem conter sequências de aminoácidos que são distintas ou diferem em um ou mais aminoácidos na NS de consenso determinada para DENV1 dentro da estrutura da presente invenção. Alternativa ou adicionalmente, dois epítopos do polipeptídeo de acordo com a presente invenção podem ter sequências sobrepostas em um fragmento de NS e, consequentemente, compartilham alguns aminoácidos.
[0047] Os polipeptídeos quiméricos de acordo com a presente invenção podem ser quimicamente sintetizados ou produzidos in vitro (sistema livre de células) ou in vivo após a expressão da molécula de ácido nucleico que codifica o poliepítopo em um sistema celular.
[0048] Conforme definido no presente, o termo “fragmento” designa partes ou porções de proteínas NS (ou seja, proteína NS3, NS4b ou NS5), em porções específicas que contêm de 86 a 185 aminoácidos. Qualquer sequência ou combinação de sequências de qualquer isolado do vírus da dengue correspondente aos fragmentos de acordo com a presente invenção (conforme delimitado pelas posições nas proteínas NS conforme identificado utilizando numeração de aminoácidos ou nucleotídeos sobre sequência de referência de DENV1 depositada em Genbank (NP_059433.1) ou conforme descrito com relação ao seu SEQ ID NO: possui comprimento mais curto que a proteína NS da qual se origina.
[0049] Segundo uma realização específica da presente invenção, o fragmento NS é fundido “diretamente” a outro fragmento de NS, ou seja, a extremidade 3’ do fragmento NS é ligada diretamente à extremidade 5’ do segundo fragmento (e assim por diante), correspondente a um poliepítopo quimérico composto de fragmentos de NS consecutivos da mesma e/ou de proteínas NS diferentes selecionadas a partir de NS3, NS4b e NS5, particularmente originários de sequência de consenso de NS de DENV1. Segundo uma realização alternativa, a fusão dos fragmentos é “indireta” e envolve, consequentemente, a presença de segmento(s) de resíduos de aminoácidos não de NS, ou seja, segmentos de resíduos de aminoácidos que não são lidos sobre a proteína NS que fornece a sequência do fragmento considerado.
[0050] Conforme definido no presente, o termo “região” designa a fita de aminoácido contígua de uma proteína NS conforme definido no presente, que contém pelo menos 86 aminoácidos. Um fragmento de proteína NS pode compreender ou consistir em uma série de regiões com relação ao fragmento de NS3.
[0051] A expressão “percentual de identidade” entre duas sequências nucleotídicas comparadas ou, respectivamente, duas sequências de aminoácidos utilizadas na presente invenção indica um percentual de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos entre as duas sequências a serem comparadas, obtidas após melhor alinhamento, em que esse percentual é puramente estatístico e as diferenças entre as duas sequências são distribuídas aleatoriamente ao longo de todo o seu comprimento. A expressão “melhor alinhamento” ou “alinhamento ideal” indica o alinhamento para o qual o percentual de identidade é o mais alto. Comparações de sequências entre duas sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos são tradicionalmente conduzidas por meio de comparação dessas sequências após o seu alinhamento de forma ideal, em que a mencionada comparação é conduzida utilizando segmentos ou janelas de comparação para identificar e comparar regiões locais com similaridade de sequências. O alinhamento de sequências ideal para comparação pode ser conduzido manualmente ou utilizando um algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981), utilizando o algoritmo de homologia local de Needleman e Wunsch (1970), utilizando o método de pesquisa de similaridades de sequências de Pearson e Lipman (1988) ou utilizando software que emprega esses algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA e TFASTA no Pacote de Software Genético de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison WI). Para obter alinhamento ideal, pode-se utilizar o programa BLAST, com a matriz BLOSUM 62. Também é possível utilizar matrizes PAM ou PAM250. Ao todo, 2033 sequências de genomas da dengue com comprimento total (865 para sorotipo 1, 678 para sorotipo 2, 427 para sorotipo 3 e 63 para sorotipo 4) foram alinhadas utilizando MUSCLE 3.7 (Edgar, R. C., Nucleic Acids Res. 2004, 32 (5): 1792-1797, com ajustes manuais de acordo com a sequência de aminoácidos.
[0052] O percentual de identidade entre duas sequências de ácidos nucleicos ou duas de aminoácidos é determinado comparando-se essas duas sequências alinhadas de forma ideal. O percentual de identidade é calculado por meio de determinação da quantidade de posições idênticas para as quais o resíduo de aminoácido ou nucleotídeo é idêntico entre as duas sequências, divisão desse número de posições idênticas pelo número total de posições comparadas e multiplicação do resultado obtido por 100 para obter o percentual de identidade entre essas duas sequências.
[0053] Em uma realização específica da presente invenção, a primeira região de NS3 de DENV1 contém uma sequência de aminoácidos conforme definido em SEQ ID NO: 6, a segunda região de NS3 de DENV1 contém uma sequência de aminoácidos conforme definido em SEQ ID NO: 9, o fragmento de NS4b de DENV1 contém uma sequência de aminoácidos conforme definido em SEQ ID NO: 12 e o fragmento de NS5 de DENV1 contém uma sequência de aminoácidos conforme definido em SEQ ID NO: 15.
[0054] Em outra realização específica da presente invenção, as sequências nativas e otimizadas dos polinucleotídeos que codificam a primeira região de NS3 de DENV1 são conforme definido em SEQ ID NO: 4 e 5, respectivamente, as sequências nativas e otimizadas do polinucleotídeo que codifica a segunda região de NS3 de DENV1 são conforme definido em SEQ ID NO: 7 e 8, respectivamente, as sequências nativas e otimizadas do polinucleotídeo que codifica o fragmento de NS4b de DENV1 são conforme definido em SEQ ID NO: 10 e 11, respectivamente, e as sequências nativas e otimizadas do polinucleotídeo que codifica o fragmento de NS5 de DENV1 são conforme definido em SEQ ID NO: 13 e 14, respectivamente).
[0055] O termo “variantes” engloba o conjunto dos outros fragmentos das proteínas NS3, NS4b e NS5 de um vírus do sorotipo 2, 3 ou 4 de DENV, conforme descrito no presente.
[0056] Em uma realização preferida da presente invenção, o poliepítopo quimérico compreende ou consiste em um polipeptídeo que contém uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, 146, 147 e 148.
[0057] A presente invenção também se refere à associação do poliepítopo quimérico de acordo com a presente invenção, com um polipeptídeo imunogênico distinto denominado a seguir EDIII/ectoM tetravalente. Em uma realização específica da presente invenção, o mencionado polipeptídeo imunogênico distinto (EDIII/ectoM tetravalente) consiste em antígenos de DENV quiméricos compostos da fusão dos polipeptídeos EDIII representativos dos quatro sorotipos de DENV, fundidos a ectoM de DENV1, e contém uma sequência de aminoácidos conforme descrito em SEQ ID NO: 145 e é codificado pelo polinucleotídeo que contém SEQ ID NO: 144.
[0058] A mencionada associação de polipeptídeos pode ser atingida como resultado da expressão dos polinucleotídeos, codificando cada um dentre o mencionado poliepítopo quimérico e o polipeptídeo imunogênico distinto, de um vetor conforme descrito no presente. Alternativamente, a mencionada associação pode resultar de uma construção de aminoácido que engloba o mencionado poliepítopo quimérico e polipeptídeo imunogênico distinto.
[0059] A presente invenção também se refere a partículas virais, particularmente partículas de vírus do sarampo (MV) recombinantes que expressam um polipeptídeo quimérico de acordo com a presente invenção ou o mencionado polipeptídeo quimérico em associação com o polipeptídeo EDIII/ectoM tetravalente.
[0060] A presente invenção também se refere a um vetor que compreende ou consiste em partículas de vírus do sarampo (MV) recombinantes que expressam o poliepítopo quimérico de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, o polipeptídeo imunogênico EDIII/ectoM tetravalente.
[0061] As partículas virais recombinantes produzidas desta forma, particularmente partículas de vírus do sarampo, comprovaram o aumento da reação imunológica oferecida pelos antígenos de DENV quando utilizadas isoladamente, particularmente por meio de impacto da reação de células T imunogênicas oferecidas após a administração das partículas a um hospedeiro delas necessitado.
[0062] A fim de preparar as partículas virais, particularmente partículas de MV que expressam o polipeptídeo quimérico de acordo com a presente invenção em associação com o chamado polipeptídeo EDIII/ectoM tetravalente conforme descrito no presente, o(s) polinucleotídeo(s) que codifica(m) os mencionados poliepítopo e polipeptídeo é(são) recombinado(s) em um polinucleotídeo que engloba o genoma do vírus, especialmente o genoma do vírus do sarampo.
[0063] Segundo uma realização preferida da presente invenção, o genoma de MV recombinante é fornecido como cDNA que codifica o genoma de RNA com comprimento total de um vírus Schwarz ou Moraten atenuado vivo.
[0064] Uma linhagem de MV atenuado vivo designa uma linhagem que foi passada em série sobre células selecionadas e, preferencialmente, adaptada a outras células tais como células primárias com reação de IFN α/β, ou seja, células CEF, para produzir linhagens de sementes apropriadas para preparação de linhagens de vacinas, abrigando um genoma estável que não permitiria a reversão da patogenicidade nem a integração em cromossomos hospedeiros, particularmente cromossomos hospedeiros humanos. Em uma realização específica da presente invenção, MV atenuado vivo é aquele que foi selecionado sobre células primárias tais como células CEF.
[0065] Conforme definido no presente, a expressão “vírus Moraten ou Schwarz atenuado vivo” designa um vírus Schwarz ou Moraten originário de uma linhagem que é avirulenta ou menos virulenta que uma linhagem parental determinada no mesmo hospedeiro, especialmente em seres humanos, mantendo ao mesmo tempo propriedades infecciosas, imunogenicidade e, possivelmente, propriedades adjuvantes quando administrado em hospedeiros, especialmente seres humanos. Particularmente, a linhagem Schwarz ou a linhagem Moraten é da vacina Rouvax® (Aventis). Demonstrou-se que a linhagem Schwarz possui perfeita identidade de sequências com a linhagem Moraten (Parks, C. L. et al, 2001, J. Virol. 75 (2): 910-920; Schwarz, A. J., 1962, Am. J. Dis. Child, 103, 386-389). As linhagens de Schwarz/Moraten atualmente são amplamente utilizadas, pois elas induzem reações imunológicas humorais e celulares de longo prazo e apresentam importante estabilidade genética, pois nenhuma reversão a forma patogênica foi observada até hoje (Hilleman, M., 2002, Vaccine, 20: 651-665).
[0066] O genoma do vírus do sarampo é obtido como resultado da preparação de uma molécula de cDNA que codifica o genoma de MV com comprimento total conforme descrito na técnica, especialmente em WO 2004/001051 e WO 2004/000876. A mencionada molécula de cDNA foi incluída como inserto em um plasmídeo denominado pTM-MVSchw depositado em doze de junho de 2002 junto ao CNCM n° I-2889 (Instituto Pasteur, Paris, França). A sequência do cDNA de MV que codifica o genoma é fornecida nas figuras que ilustram as construções preparadas com o poliepítopo quimérico de acordo com a presente invenção e o chamado polipeptídeo EDIII/ectoM tetravalente. A posição das sequências de MV é descrita nas figuras mencionadas.
[0067] A fim de expressar o poliepítopo quimérico de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, o chamado polipeptídeo EDIII/ectoM tetravalente distinto, a mencionada molécula de cDNA que codifica o genoma de MV com comprimento total é recombinada com uma molécula de DNA que codifica o polipeptídeo quimérico de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, em uma molécula de DNA que codifica o chamado polipeptídeo EDIII/ectoM tetravalente conforme descrito no presente, utilizando métodos e protocolos bem conhecidos dos técnicos no assunto. As moléculas de DNA que codificam os mencionados polipeptídeos são produzidas de acordo com métodos conhecidos pelo técnico no assunto.
[0068] Em uma realização específica, uma molécula de DNA correspondente ao poliepítopo quimérico de acordo com a presente invenção pode ser gerada por meio de síntese química. Preferencialmente, esta sequência é otimizada por códons para expressão em células de mamíferos e, preferencialmente, seu comprimento atende à “regra de seis” que estipula que a quantidade total de nucleotídeos é um múltiplo de 6, em que essas regras são conhecidas pelo impacto à expressão adequada das proteínas de MV do genoma de MV (Calain, P. et al, J. Virol., 1993, 67: 4822-4830).
[0069] Em uma realização específica, todas as construções de ácidos nucleicos inseridas no cDNA que codifica o genoma de MV com comprimento total, particularmente sequências de codificação para o poliepítopo quimérico e para o chamado polipeptídeo de EDIII/ectoM tetravalente possuem uma quantidade de nucleotídeos que é múltiplo de seis.
[0070] A presente invenção refere-se, portanto, a um polinucleotídeo isolado ou purificado que codifica o poliepítopo quimérico de acordo com a presente invenção e possui preferencialmente quantidade total de nucleotídeos que atende à regra de seis. Este polinucleotídeo é particularmente DNA ou cDNA. Em uma realização específica, sequências similares à poliadenilação e edição de MV da sequência que codifica os fragmentos de NS do polinucleotídeo de acordo com a presente invenção sofrem mutação (Lamb, R. A. et al em Fields Virology, quarta edição, 13051340; Schneider, H. et al, Virology, 1997, 227: 314-322). Além disso, para permitir a sua futura clonagem em um plasmídeo tal como pUC em um plasmídeo de expressão de mamíferos tal como pcDNA3 ou em vetor de MV, o DNA que codifica o poliepítopo quimérico de acordo com a presente invenção foi ladeado por sequências de locais de restrição tais como BgIII, ApaI, BsiWI e BssHII.
[0071] A presente invenção refere-se particularmente, portanto, às sequências de nucleotídeos nativas e otimizadas por códons que codificam o poliepítopo quimérico de DENV1 que são as sequências descritas como SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente (Figuras 5 e 6). A sequência de aminoácidos do poliepítopo quimérico de DENV1 é a sequência descrita como SEQ ID NO: 3.
[0072] A presente invenção também se refere a um polinucleotídeo isolado ou purificado que codifica o poliepítopo quimérico de acordo com a presente invenção em uma construção de ácido nucleico que compreende adicionalmente um polinucleotídeo codificador de antígenos de DENV tetravalentes compostos da fusão dos polipeptídeos EDIII dos quatro sorotipos, fundidos a ectoM de DENV1, em que o polinucleotídeo obtido possui preferencialmente uma quantidade total de nucleotídeos que atende à regra de seis. Em uma realização específica, esse polinucleotídeo possui a sequência de SEQ ID NO: 144. Essa construção pode compreender especificamente o polinucleotídeo que codifica antígenos de DENV tetravalentes compostos da fusão dos polipeptídeos EDIII dos quatro sorotipos, fundidos a ectoM de DENV1 acima no fluxo do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo quimérico de acordo com a presente invenção.
[0073] A presente invenção também se refere a uma molécula de ácido nucleico que compreende o polinucleotídeo descrito no presente que codifica o polipeptídeo quimérico de acordo com a presente invenção e compreende opcionalmente o polinucleotídeo que codifica antígenos de DENV tetravalentes compostos da fusão dos polipeptídeos EDIII dos quatro sorotipos, fundidos a ectoM de DENV1 recombinado com a molécula de cDNA que codifica o genoma de MV com comprimento total.
[0074] Conforme definido no presente, a expressão “isolado ou purificado" indica moléculas que foram alteradas pelo homem a partir do seu estado nativo, ou seja, se as moléculas existirem na natureza, elas foram alteradas e/ou retiradas do seu ambiente inicial. Como exemplo, um polinucleotídeo naturalmente presente e encontrado no ambiente biológico de um organismo vivo que o expressa naturalmente não é “isolado” neste contexto. O mesmo polinucleotídeo, quando separado do seu ambiente natural e/ou obtido por meio de clonagem, amplificação e/ou síntese química, entretanto, é considerado na presente invenção como sendo “isolado”. Além disso, um polinucleotídeo que é introduzido em um organismo por meio de transformação, manipulação genética ou qualquer outro método de recombinação é "isolado" mesmo se estiver presente no mencionado organismo.
[0075] O termo “codfificação” utilizado no presente pedido define a capacidade das moléculas de ácido nucleico de serem transcritas e, quando apropriado, traduzidas para expressão de produto em células ou linhagens celulares selecionadas, quando a mencionada molécula é colocada sob sequências de controle de expressão que incluem promotor para transcrição. Consequentemente, um “polinucleotídeo codificador” de acordo com a presente invenção é limitado ao ácido nucleico que possui a sequência traduzida na sequência de aminoácidos ou, alternativamente, quando especificado, compreende também as sequências de controle de expressão.
[0076] A presente invenção também se refere a um vetor. Da forma utilizada no presente, o termo “vetor” designa uma construção de polinucleotídeo projetada para transdução/transfecção de um ou mais tipos celulares. Os vetores podem ser, por exemplo, “vetores de clonagem”, que são projetados para isolamento, propagação e reprodução de polinucloeotídeos inseridos (denominados insertos), "vetores de expressão" que são projetados para expressão de uma molécula de polinucleotídeo especialmente para expressão do inserto em uma célula hospedeira, “vetores virais”, que são projetados para resultar na produção de partículas de vírus ou partículas similares a vírus recombinantes, ou "vetores impulsionadores”, que compreendem os atributos de mais de um tipo de vetor.
[0077] Diversos vetores apropriados para a transdução ou transfecção de células, particularmente para transfecção estável de células e bactérias, são disponíveis ao público (por exemplo, plasmídeos e vírus), bem como métodos de construção dessas linhagens celulares. Compreender-se-á que a presente invenção engloba qualquer tipo de vetor que compreende qualquer um dos polinucleotídeos de acordo com a presente invenção.
[0078] A presente invenção refere-se, portanto, a um vetor, particularmente um vetor de expressão, que pode ser um plasmídeo que compreende, como inserto(s) de polinucleotídeo(s), uma ou mais dentre as moléculas de ácido nucleico definidas no presente. Em uma realização específica, o plasmídeo compreende, como inserto, um polinucleotídeo que codifica o poliepítopo quimérico de acordo com a presente invenção conforme definido no presente e compreende opcionalmente o polinucleotídeo que codifica antígenos de DENV tetravalentes compostos da fusão dos polipeptídeos EDIII dos quatro sorotipos, fundidos a ectoM de DENV1.
[0079] Em uma realização específica, a presente invenção refere- se a um plasmídeo (denominado vetor de genoma de sarampo) que compreende (i) um cDNA que codifica o genoma de RNA com comprimento total de um vírus do sarampo (MV), em que esse cDNA é recombinado com (ii) um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção que codifica o poliepítopo quimérico de acordo com a presente invenção conforme definido no presente e, opcionalmente, (iii) um polinucleotídeo que codifica antígenos de DENV tetravalentes compostos da fusão dos polipeptídeos EDIII dos quatro sorotipos, fundidos a ectoM de DENV1 conforme definido no presente. Em uma realização específica, quando as sequências de (i), (ii) e, opcionalmente (iii) estiverem presentes no vetor de genoma de MV, atendem em conjunto à regra de seis.
[0080] Em uma realização específica, o(s) mencionado(s) polinucleotídeo(s) está(ão) posicionado(s) como inserto(s) separado(s) entre os genes P e M do genoma MV ou entre os genes H e L do genoma MV. Opcionalmente, o(s) mencionado(s) inserto(s) está(ão) localizado(s) em uma Unidade de Transcrição Adicional (ATU) tal como a ATU que possui a sequência de ATU 2 ou ATU 3 ilustrada na construção MDVVax6. A localização da ATU no cDNA derivado do RNA antigenômico de MV pode variar ao longo do mencionado cDNA.
[0081] Em uma realização específica, a presente invenção refere- se a um vetor de genoma do vírus do sarampo (MV) recombinante, que é um plasmídeo que compreende (i) cDNA que codifica o genoma de RNA com comprimento total de um vírus MV e (ii) o polinucleotídeo que codifica o poliepítopo quimérico de acordo com a presente invenção, em que o mencionado polinucleotídeo está posicionado como inserto entre os genes P e M do genoma MV ou entre os genes H e L do genoma MV, opcionalmente em uma Unidade de Transcrição Adicional (ATU), em que as sequências de (i) e (ii), quando recombinadas no plasmídeo, atendem em conjunto à regra de seis.
[0082] A presente invenção também se refere a um vetor de genoma de MV recombinante, que é um plasmídeo que compreende (a) um cDNA que codifica o genoma de RNA com comprimento total de um vírus MV; (b) um polinucleotídeo que codifica antígenos de DENV tetravalentes compostos da fusão dos polpeptídeos com domínio de envelope III (EDIII) dos quatro sorotipos de DENV, fundidos ao ectodomínio da proteína de membrana (ectoM) de DENV1, particularmente antígenos de DENV que possuem a sequência de SEQ ID NO: 145 e (c) o polinucleotídeo de acordo com a presente invenção, em que: - o polinucleotídeo (b) está posicionado como inserto entre os genes P e M do genoma de MV e o polinucleotídeo (c) está posicionado como inserto entre os genes H e L do genoma de MV; ou - o polinucleotídeo (b) está posicionado como inserto entre os genes P e M do genoma de MV e o polinucleotídeo (c) está posicionado como inserto entre os genes P e M do genoma de MV; ou - o polinucleotídeo (b) está posicionado como inserto entre os genes H e L do genoma de MV e o polinucleotídeo (c) está posicionado como inserto entre os genes P e M do genoma de MV; e em que as sequências de (a), (b) e (c), quando recombinadas no plasmídeo, atendem em conjunto à regra de seis.
[0083] Em uma realização específica, quando as sequências de (a), (b) e (c) são recombinadas em um plasmídeo, elas atendem em conjunto à regra de seis.
[0084] As sequências de nucleotídeos de vetores específicos de acordo com a presente invenção que compreendem os dois polinucleotídeos são as sequências descritas como SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143 e SEQ ID NO: 149.
[0085] A presente invenção também se refere a uma célula hospedeira geneticamente transformada com o polinucleotídeo que codifica o poliepítopo quimérico de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, com o polinucleotídeo que codifica o EDIII/ectoM tetravalente de acordo com a presente invenção, particularmente um polinucleotídeo que codifica antígenos de DENV tetravalentes compostos da fusão dos polipeptídeos com domínio de envelope III (EDIII) dos quatro sorotipos de DENV, fundidos ao ectodomínio da proteína de membrana (ectoM) de DENV1. Uma célula hospedeira específica pode ser geneticamente transformada, portanto, com um vetor de acordo com a presente invenção, particularmente com um vetor de genoma de MV recombinante de acordo com a presente invenção.
[0086] A célula hospedeira de acordo com a presente invenção sofre transfecção com um vetor de genoma de acordo com a presente invenção, por meio de métodos bem conhecidos dos técnicos no assunto, ou seja, por meio de transfecção química (fosfato de cálcio, lipofectamina, métodos com base em lipídios (lipossomo), eletroporação, fotoporação, uso de vetores virais etc.
[0087] Em uma realização específica, a célula é transformada ou sofre transdução com um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção, de forma a permitir a integração do polinucleotídeo no genoma celular por meio de recombinação com a sequência celular homóloga ou de inserção no genoma celular. A transfecção, infecção ou transdução pode ocorrer ex vivo, ou seja, em um ambiente artificial fora do organismo vivo.
[0088] Da forma utilizada no presente, os termos “transfectado”, “transformado” ou “infectado” designam uma célula que compreende um vetor de acordo com a presente invenção (expressão transitória), enquanto a expressão “geneticamente transformado” designa uma célula cujo genoma foi definitivamente modificado por um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção (expressão permanente).
[0089] As mencionadas células transformadas de forma estável ou transitórias podem ser quaisquer células procarióticas (bactérias) ou eucarióticas (de leveduras, insetos ou animais, incluindo mamíferos, especialmente seres humanos). Em uma realização, as células são células não humanas. Em uma realização específica, as células de acordo com a presente invenção são células humanas isoladas, em que “isoladas” indica fora do seu ambiente natural.
[0090] Em uma realização específica da presente invenção, a célula é a linhagem celular HEK-293-T7-MV.
[0091] De maior preferência, um vetor de genoma de MV recombinante infeccioso apropriado para conduzir a presente invenção é produzido utilizando cDNA de linhagem de MV Schwarz clonado no plasmídeo pTM-MVSchw, depositado pelo Instituto Pasteur junto ao CNCM (Paris, França) sob número I-2889 em 12 de junho de 2002, cuja sequência é descrita por Combredet (Combredet, C. et al, 2003, J. Virol. 77 (21): 11546-11554), também descrito em WO 2004/000876. O plasmídeo pTM-MVSchw foi obtido de um plasmídeo Bluescript e compreende o polinucleotídeo que codifica a linhagem de RNA de MV (+) com comprimento total da linhagem de Schwarz colocada sob o controle do promotor da T7 RNA polimerase e possui 18967 nucleotídeos. cDNAs de outras linhagens de MV podem ser obtidos de forma similar a partir do ácido nucleico purificado de partículas virais de MV atenuado vivo. Consequentemente, um vetor de genoma de MV recombinante de acordo com a presente invenção é pTM-MVDVax6, conforme ilustrado por SEQ ID NO: 139, pTM-MVDVax7, conforme ilustrado por SEQ ID NO: 140, pTM-MVDVax8, conforme ilustrado por SEQ ID NO: 141, pTM-MVDVax9, conforme ilustrado por SEQ ID NO: 142, pTM-MVDVax10, conforme ilustrado por SEQ ID NO: 143 ou pTM-MVDVax11, conforme ilustrado por SEQ ID NO: 149.
[0092] O plasmídeo que compreende o genoma de MV recombinante definido desta forma (vetor de genoma) é apropriado para uso em um sistema de resgate para preparação de partículas de vírus do sarampo recombinantes.
[0093] O resgate de vírus de MV recombinantes pode ser realizado conforme descrito anteriormente (Combredet et al, J. Virol., 2003, 77 (21): 1154611554), particularmente utilizando células auxiliares HEK293-T7-MV estáveis (WO 2004/000876).
[0094] Para que o resgate de partículas de MV recombinantes seja atingido e permita a montagem de partículas de MV recombinantes de acordo com a presente invenção, são utilizadas células auxiliares (células hospedeiras) que expressam uma RNA polimerase tal como T7 RNA polimerase e as proteínas N, P e L de MV, que são geneticamente transformadas com um vetor de genoma de MV de acordo com a presente invenção. A expressão das proteínas de MV pela célula auxiliar pode ser obtida por meio de transformação genética da célula auxiliar com vetores adicionais, tais como plasmídeos de transcomplementação, que expressam uma RNA polimerase tal como a T7 RNA polimerase e as proteínas N, P e L de MV.
[0095] Em uma realização específica da presente invenção, a linhagem de células auxiliares é a linhagem celular 293-T7-NP depositada junto à Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) em 14 de junho de 2006, sob número I-3618, ou a linhagem de células de MV 293-nlsT7-NP, depositada junto à CNCM em quatro de agosto de 2006, sob número I-3662.
[0096] A presente invenção também se refere a partículas de MV recombinantes, que são resgatadas de uma linhagem de células auxiliares que expressam a T7 RNA polimerase e as proteínas N, P e L de MV e que expressam adicionalmente um ácido nucleico codificador de um vetor de acordo com a presente invenção ou um ácido nucleico codificador de um vetor de genoma de MV recombinante de acordo com a presente invenção.
[0097] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma composição imunogênica que compreende (a) antígenos de DENV compostos da fusão dos polipeptídeos EDIII dos quatro sorotipos de DENV, fundidos a ectoM de DENV1, particularmente antígenos de DENV que possuem a sequência de SEQ ID NO: 145 e (b) o poliepítopo quimérico de acordo com a presente invenção, que opcionalmente não compreende um adjuvante acessório.
[0098] A presente invenção também se refere a uma composição imunogênica que compreende partículas de MV recombinantes de acordo com a presente invenção, em que essa composição opcionalmente não compreende um adjuvante acessório. É interessante notar que as partículas de MV recombinantes de acordo com a presente invenção são capazes de oferecer reação(ões) imunológica(s) celular(es) e/ou humoral(is) contra infecções pelo vírus da dengue ou contra infecções pelo vírus da dengue e MV, em um hospedeiro mediante administração. Em uma realização específica, a composição imunogênica de acordo com a presente invenção oferece reação imunológica, particularmente reação imunológica de células T contra DENV1, DENV2, DENV3 e DENV4 e, consequentemente, pode oferecer reação protetora contra infecções por qualquer vírus desses sorotipos DENV 1 a 4.
[0099] Segundo uma realização específica da presente invenção, a composição imunogênica é formulada para administração por meio de via parenteral tal como injeção subcutânea (sc), intradérmica (id), intramuscular (im), intraperitoneal (ip) ou intravenosa (iv).
[00100] Segundo outra realização específica da presente invenção, a composição imunogênica é administrada em uma ou mais doses de administração, particularmente em regime de administração de amplificação de primer.
[00101] Em uma realização específica, a composição imunogênica não compreende um adjuvante acessório.
[00102] A quantidade a ser administrada (dosagem) depende do paciente a ser tratado, incluindo a condição do paciente, o estado do sistema imunológico do indivíduo, a via de administração e o tamanho do hospedeiro. Dosagens apropriadas variam de 103 TCID50 a 107 TCID50 e podem ser modificadas pelos técnicos no assunto, dependendo das circunstâncias.
[00103] A presente invenção também se refere a uma composição de vacina que compreende (a) antígenos de DENV compostos da fusão dos polipeptídeos EDIII dos quatro sorotipos de DENV, fundidos a ectoM de DENV1, e (b) o poliepítopo quimérico de acordo com a presente invenção, que opcionalmente não compreende um adjuvante acessório.
[00104] A presente invenção também se refere a uma composição de vacina que compreende partículas de MV recombinantes de acordo com a presente invenção, que opcionalmente não compreende um adjuvante acessório.
[00105] A presente invenção também se refere a um método para prevenir e/ou tratar infecções por vírus da dengue em pacientes humanos, que compreende a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de partículas de MV recombinantes de acordo com a presente invenção ou uma composição imunogênica de acordo com a presente invenção, em que as mencionadas partículas ou composição encontram-se em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável; e/ou um adjuvante.
[00106] Da forma utilizada no presente, o termo “evitar” designa um método por meio do qual uma infecção por vírus da dengue é obstruída ou retardada.
[00107] Da forma utilizada no presente, o termo “tratar” designa um método por meio do qual os sintomas de infecções por vírus da dengue são reduzidos, ou seja, redução da infecção por vírus da dengue no hospedeiro ou melhoria da condição clínica do paciente ou sua completa eliminação.
[00108] Da forma definida no presente, um veículo farmaceuticamente aceitável engloba qualquer substância que permita a formulação do poliepítopo quimérico, do polinucleotídeo do vetor, particularmente o vetor de genoma de MV recombinante de acordo com a presente invenção em uma composição. Um veículo é qualquer substância ou combinação de substâncias fisiologicamente aceitáveis, ou seja, apropriadas para seu uso em uma composição em contato com hospedeiro, especialmente ser humano e, portanto, não tóxica. Exemplos desses veículos são soluções salinas tamponadas com fosfato, água destilada, emulsões tais como emulsões de óleo em água, vários tipos de agentes umectantes, soluções estéreis e similares.
[00109] Conforme definido no presente, adjuvantes incluem, por exemplo, lipossomos, fases oleosas, tais como adjuvantes do tipo Freund, geralmente utilizados na forma de uma emulsão com fase aquosa ou pode compreender sais inorgânicos insolúveis em água, tais como hidróxido de alumínio, sulfato de zinco, hidróxido de ferro coloidal, fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio.
[00110] A presente invenção também se refere a um método de produção de partículas de MV recombinantes para a preparação de vacina contra o vírus da dengue, que compreende ou consiste em: a. transfecção de um vetor de genoma de MV recombinante de acordo com a presente invenção em uma linhagem de células auxiliares que expressa a T7 RNA polimerase e as proteínas N, P e L de MV; b. transferência da mencionada linhagem de células auxiliares para células competentes para sustentar a reprodução e a produção de partículas de MV recombinantes que expressam um poliepítopo quimérico de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um polipeptídeo que compreende um antígeno de DENV tetravalente composto da fusão dos polipeptídeos EPDII dos quatro sorotipos, fundidos a ectoM de DENV1, particularmente antígenos de DENV que possuem a sequência de SEQ ID NO: 145; e c. recuperação das partículas de MV recombinantes produzidas na etapa b.
[00111] Em uma realização preferida da presente invenção, as células competentes na etapa (b) são células de Vero (rim de macaco verde africano), células de CEF (fibroblasta de embrião de galinha) ou células MRC5.
EXEMPLOS CULTIVO CELULAR
[00112] Células de Vero foram mantidas em DMEM Glutamax (Gibco-BRL) suplementadas com soro de feto de bezerro desativado por calor a 5% (FCS, Invitrogen, Frederick, MD). Células auxiliares HEK293- T7-MV estáveis utilizadas para recuperação viral (WO 2004/000876) foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% FCS.
CONSTRUÇÃO E RECUPERAÇÃO DE VETORES DE MV RECOMBINANTES
[00113] O plasmídeo pTM-MVSchw, que contém um cDNA de MV infeccioso correspondente ao antigenoma da linhagem de vacina de MV de Schwarz, foi descrito anteriormente (Combredet et al, J. Virol., 2003, 77 (21): 11546-11554). O cDNA sintético que codifica a construção poliepitópica de proteínas não estruturais de DENV1 foi inserido em vetores pTM-MVSchw digeridos por BsiWI/BssHII em diferentes posições, em combinação ou não com antígeno EDIII tetramérico descrito anteriormente (Brandler et al, PLoS 2007, 1 (3), e96; Brandler et al, Vaccine 2010, 28, 6730-6739 (Figura 7). A recuperação de vírus recombinantes foi realizada conforme descrito anteriormente (Combredet et al, J. Virol., 2003, 77 (21): 11546-11554) utilizando células auxiliares HEK293-T7-MV estáveis (WO 2004/000876). Os vírus recombinantes foram cultivados sobre células Vero e títulos virais foram determinados por meio de teste de diluição final sobre células de Vero.
WESTERN BLOT
[00114] Para evidenciar a expressão de antígenos de DENV por vetores de MV ou plasmídeo de expressão de pcDNA3, lisatos de células de Vero infectadas com MV-DENV ou de células HEK293 transfectadas com plasmídeo pcDNA3-NS foram fracionados por meio de SDS-PAGE, transferidos para membranas de celulose (Amersham Pharmacia Biotech) e sondados com anticorpo anti-EDIII DENV1 mAb 4E11 ou anti-NS3. Utilizou-se um conjugado de peroxidase de rabanete silvestre de anti-IgG de camundongo de cabra (HRP) (Amersham) como anticorpo secundário. A atividade de peroxidase foi visualizada com um kit de detecção de quimioluminescência amplificado (Pierce). Esta análise demonstrou que vetores de MV expressaram antígeno tetramérico de EDIII e antígeno poliepitópico de NS. De forma similar, o plasmídeo pcDNA3-NS expressou alto nível de antígeno poliepitópico NS (Figura 8).
EXPERIMENTOS COM CAMUNDONGOS E REAÇÕES IMUNOLÓGICAS CELULARES
[00115] Camundongos com deficiência de receptores de IFNα/β e que expressam receptor de MV humano (hCD46+/-IFNα/β-/- ou CD46-IFNAR) foram produzidos conforme descrito anteriormente (Combredet et al, J. Virol. 2003, 77 (21): 11546-11554) e abrigados sob condições livres de patógenos nas instalações de animais do Instituto Pasteur. Foram conduzidos experimentos seguindo as orientações do Escritório de Cuidados com Animais de Laboratório do Instituto Pasteur. Grupos de camundongos CD46-IFNAR com seis semanas de idade foram inoculados por meio da via intraperitoneal (ip) com uma única administração de 105 TCID50 de vetores MV-DENV ou MV vazio. Os camundongos sofreram eutanásia sete dias após a imunização e os baços foram coletados. Esplenócitos recém-extraídos foram especificamente estimulados por dezoito horas com peptídeos de DENV (2 μg/ml) ou MV (MOI 1). As células foram também estimuladas por concanavalina A (5 μg/ml, Sigma) como controle positivo e por RPMI-IL-2 (10 U/ml) como controle negativo. A sua capacidade de secretar IFN-Y mediante estímulo foi testada por meio de teste ELISPOT conforme descrito anteriormente (Guerbois et al, Virology, 2009, 388 (1): 191-203).
PEPTÍDEOS
[00116] Foi sintetizada uma série de 36 peptídeos sobrepostos (nove a quinze aminoácidos sobrepostos de cinco aminoácidos) que cobrem toda a sequência poliepitópica de NS (Figura 9). Cinco peptídeos específicos foram também identificados com algoritmos de previsão capazes de ligar-se a receptores de células T H2-Db e H2-Kb expressos em camundongos CD46-IFNAR (Figura 9). Estes peptídeos foram utilizados em experimentos ELISPOT em conjuntos ou como peptídeos individuais para estimular novamente reações de células T em esplenócitos de camundongos CD46-IFNAR imunizados.
IMUNOGENICIDADE EM CAMUNDONGOS CD46-IFNAR
[00117] Reação imunológica mediada por células (CMI) permitida por meio de imunização com MV-DENV foi determinada utilizando teste ELISPOT IFN-Y sobre esplenócitos coletados sete dias após uma única imunização. Após estímulo ex vivo por peptídeos NS de DENV ou MV, detectou-se uma quantidade significativa de células secretoras de IFN-y específicas de DENV (400-800 células formadoras de manchas/106 esplenócitos) em camundongos imunizados contra MV-DENV (Figuras 10, 11 e 12), que representaram um terço de reação específica de MV em condições de estímulo similares (1500 células formadoras de manchas/106 esplenócitos). A maior parte dos camundongos imunizados com MV-DENV (5/6) apresentou reação de CMI significativa a DENV, o que demonstra que uma única imunização de MV-DENV neste modelo experimental foi capaz de realizar primer sobre a imunidade celular anti- DENV em até uma semana.
IMUNOGENICIDADE EM CAMUNDONGOS HUMANIZADOS
[00118] O plasmídeo pcDNA3 que expressa a sequência de polipeptídeos de NS DENV1 sob um promotor de CMV foi injetado por meio de eletroporação em camundongos nulos da classe I H-2/transgênicos de monocadeias HLA-A*02-01, HLA-A*24:02, HLA-B*07:02 e HLA-B*35:01 e as células do baço foram quantificadas por meio de teste ELISPOT contra peptídeos individuais (Figura 13).
[00119] Dentre 47 potenciais epítopos descritos para oferecer reação de células T restritas por HLA em doadores humanos previamente expostos a DENV, 13 epítopos foram identificados em camundongos imunizados: quatro no primeiro domínio de NS3 e restritos por HLA- A*02:01, HLA-B*07:02 e HLA-B*35.01, quatro no segundo domínio de NS3, restritos por HLA-A*24:02 e HLA-B*35:01, três em NS4b, restritos por HLA- A*24:02 e HLA-B*35:01 e dois em NS5 e restritos por HLA-A*02:01 e HLA- B*07:02 (Figura 14).
[00120] Comparação da reação de células T oferecida nos diferentes camundongos transgênicos revelou quantidade mais alta de peptídeos com magnitude mais alta nos camundongos HLA-B*35:01, de acordo com a alta frequência de reação e magnitude associada a esse alelo em doadores humanos de área hiperendêmica (Weiskopf, D. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2013, 110 (22): E2046-2053) (Figura 15).
[00121] É interessante observar, de acordo com as regiões antigênicas conservadas selecionadas a partir dos diferentes sorotipos (Figuras 1 e 14), que a sequência de aminoácidos dos epítopos antigênicos presentes na construção poliepitópica foi conservada entre os outros sorotipos da dengue, particularmente para os dois resíduos âncora envolvidos na ligação de HLA (Tabela 3). Isso sugeriu que as células T CD8+ induzidas pela construção com base em DENV1 poderão também reconhecer peptídeos derivados de DENV2, 3 e 4. Essa reatividade cruzada de células T pode ser verificada utilizando linhagem de células B transformadas por EBV humano (Zemmour, J. et al, J. Immunol. 1992, 148 (6): 1941-1948) que expressam um único alelo de HLA e pulsadas com o peptídeo cognato ou infectadas com DENV1, 2, 3 e 4.
TABELA 3
[00122] Conservação de sequências entre os quatro sorotipos de DENV de epítopos da sequência de poliepítopos NS identificada em camundongos com quatro restrições de HLA diferentes; os resíduos âncora previstos encontram-se sublinhados e destacados em cinza: A. Peptídeos HLA-A*02:01: B. Peptídeos HLA-A*24:02: C. Peptídeos HLA-B*07:02 D. Peptídeos HLA-B*35:01
[00123] Evidência de proteção imunológica in vitro e in vivo induzida após imunização de DNA com a construção poliepitópica DENV1-NS (SEQ ID NO: 3):
A. Indução de células T citotóxicas específicas de DENV em camundongos transgênicos HLA classe I:
[00124] Para investigar o papel de células T CD8 em uma reação imunológica protetora, quatro grupos de camundongos H-2 classe I nulo/HLA classe I transgênicos (HLA-A*02:01, HLA-A*24:02, HLA-B*07:02 e HLA- B*35:01) foram vacinados por meio de imunização de DNA. Em cada grupo composto de sete animais transgênicos, cinco e dois camundongos receberam a construção poliepitópica e o plasmídeo controle, respectivamente. Todos os animais foram imunizados por meio de injeção intradérmica (100 μg de plasmídeo controle ou poliepitópico DENV1-NS) seguida por eletroporação in vivo. Foram realizadas duas imunizações em intervalos de três semanas e células do baço foram testadas para determinar a atividade citotóxica in vitro e in vivo, bem como a secreção de IFN-Y por meio de teste ELISPOT dez dias após a segunda injeção.
1. Avaliação de reações de células T citotóxicas específicas de DENV in vitro:
[00125] Em cada grupo de animais transgênicos HLA classe I, três e um camundongo que receberam a construção poliepitópica DENV1-NS e o plasmídeo controle, respectivamente, foram testados para determinar as suas reações de células T específicas de antígenos. A quantificação da reação de células T foi obtida utilizando o teste ELISPOT de Granzima B (GrB), que mede, em nível de célula única, a liberação do mediador citotóxico Granzima B e que se demonstrou apresentar forte correlação com a capacidade de células T de lisar células alvo (Ewen, C. L. et al, 2006, J. Immunol. Methods, 308 (1-2): 156-166; Kalia, V. et al, 2010, Adv. Exp. Med. Biol., 684: 79-95; Zanetti, M. et al, 2010, Adv. Exp. Med. Biol., 684: 108-125) e inibir a produção viral (Marcet- Palacios, M. et al, 2011, PLoS Pathog. 7 (12): e1002447). Neste teste, a frequência de células de baço que liberam Granzima B mediante estímulo in vitro com peptídeos cognatos ou irrelevantes foi medida em paralelo com a frequência de células que secretam IFN-y. Resultados demonstraram reação significativa de INF-y e GrB em camundongos imunizados com a construção poliepitópica DENV1-NS, em comparação com os animais imunizados com o plasmídeo pcDNA3.1 controle (Figuras 16A e 16B). Houve também correlação entre a reação de IFN-y e a liberação de GrB, com a reação mais alta para IFN- y e GrB obtida para os peptídeos P32 em camundongos HLA-A24, P56 em camundongos HLA-A2, P15 em camundongos HLA-B7 e P49, P50 e P51 em camundongos HLA-B35.
2. Avaliação de células T citotóxicas específicas de DENV in vivo:
[00126] O teste citotóxico in vivo foi realizado conforme descrito anteriormente (Clemente, T. et al, 2013, Methods, 61 (2): 105-109). Resumidamente, camundongos imunizados com a construção poliepitópica DENV1-NS ou o plasmídeo controle foram transferidos de forma adotiva com células singeneicas carregadas com peptídeos e marcadas com tintura fluorescente (violeta com traço celular). Uma mistura de 107 células manchadas com alta fluorescência e 107 com baixa fluorescência, pulsada com peptídeos específicos e controle, respectivamente, foi injetada de forma intravenosa em pacientes animais. Dezoito horas após a injeção, foram determinadas células do baço de camundongos pacientes foram analisadas por meio de citometria de fluxo e a razão entre células doadoras com alto traço celular (células pulsadas com uma mistura de peptídeos específicos) e células doadoras com baixo traço celular (não pulsadas ou pulsadas com peptídeos controle). Como uma quantidade equivalente de células com manchas altas e baixas foi injetada nos camundongos receptores, atividade mortal específica em camundongos imunizados resultou em fração mais baixa de células com altas manchas carregadas com a mistura de peptídeos específicos (Figura 17). O percentual de lise específica foi determinado utilizando a fórmula: 1 - % celular de violeta de traço com alta imunização/% celular de violeta de traço com baixa imunização x 100 % celular de violeta de traço alto nativo/% celular de violeta de traço baixo nativo
B. Indução de reação imunológica protetora em camundongos humanizados:
[00127] Como camundongos com suficiente IFN do tipo I são resistentes a infecções por DENV, reação imunológica protetora induzida por vacina contra desafio com DENV pode apenas ser considerada em camundongos com deficiência de tipo I ou em camundongos alinfoides enxertados com células tronco hematopoiéticas humanas. De forma alinhada com o recente desenvolvimento de novas gerações de camundongos humanizados reconstituídos com compartimentos linfoides e mieloides humanos com reações com restrições de HLA (Legrand, N. et al, 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 108 (32): 13224-13229; Garcia, S. et al, 2012, Immunol. Lett., 146 (1-2): 1-7; Serra-Hassoun, M. et al, 2014, J. Immunol., 193 (3): 1504-1511, os inventores utilizarão camundongos RAG-/- yc-/- transgênicos para SIRPalfa humano, nos quais moléculas de classe I e classe II de MHC de camundongos foram substituídas por moléculas HLA-A2 e DR1 humanas, respectivamente (CH1-2hSa).
[00128] Em primeira configuração, moléculas HLA-A2 estarão na configuração HHD (com os domínios α1 e α2 humanos de HLA-A2 ligado ao domínio α3 murino de H-2Db) (Pascolo, S. et al, 1997, J. Exp. Med., 185 (12); 2043-2051). Os camundongos HHD CH1-2hSa são disponíveis atualmente. Três meses após o enxerto de progenitores do sangue com cordão hematopoiético humano, quando todos os subconjuntos humanos foram reconstituídos no hospedeiro, os camundongos serão infectados em primeiro lugar com vírus da dengue para verificar a reprodução viral in vivo no compartimento de células dendríticas humanas. Resumidamente, dois grupos de três camundongos cada serão injetados por via intravenosa com 105 ou 106 PFU da linhagem de DENV1 KDH0026A (derivada de um isolado clínico humano). Títulos de vírus serão monitorados por meio de PCR por transcrição reversa quantitativa (qRT).
[00129] Em segunda configuração, as moléculas de HLA-A2 consistirão na versão HHH humana completa da molécula de classe I. Estes novos hospedeiros HHH CH1-2hSa, que atualmente se encontram em desenvolvimento, deverão aprimorar a ligação das moléculas CD8/TCR humanas aos complexos de MHC e peptídeo, permitindo estímulo mais eficiente de células T CD8 específicas de DENV. Dois grupos de seis camundongos HHH CH1-2hSa humanizados cada um serão imunizados com as construções de plasmídeo controle e poliepitópica DENV1-NS, conforme descrito na Figura 13. Em cada grupo de seis camundongos reconstituídos, a proteção será determinada por meio de quantificação de mRNA viral por meio de PCR qRT no sangue de animais infectados no dia 2, 4 e 7 após a injeção intravenosa de 105 ou 106 PFU de linhagem de DENV1 KDH0026A em cada grupo de três camundongos.
C. Eficácia de proteção de MVDVax em camundongos CD46- IFNAR:
[00130] Os inventores avaliaram a eficácia protetora em camundongos CD46-IFNAR de vetores MVDVax recombinantes que expressam um antígeno DENV tetravalente composto da fusão do domínio de envelope III (EDIII) dos quatro sorotipos de DENV fundidos ao ectodomínio da proteína de membrana (ectoM) de DENV1 e que expressam simultaneamente o antígeno NS de DENV1 de acordo com a presente invenção (descrito na Figura 7). Camundongos CD46-IFNAR foram produzidos conforme descrito anteriormente (Combredet, C. et al, 2003, J. Virol., 77 (21): 11546-11554) e abrigados sob condições livres de patógenos na instalação de animais do Instituto Pasteur. Foram conduzidos experimentos seguindo as orientações do Escritório de Cuidados com Animais de Laboratório do Instituto Pasteur. Grupos de camundongos CD46-IFNAR com seis semanas de idade foram inoculados por via intraperitoneal (ip) com 105 TCID50 de vetores MV-DENV ou MV vazio. Realizou-se segunda administração da mesma dose um mês após o primer. Para analisar a presença de anticorpos anti-MV e anti-DENV, sangue foi coletado regularmente por via periorbital. Dois meses após a última imunização, todos os animais foram desafiados experimentalmente por meio de injeção intraperitoneal de 105 TCID50 de linhagem de DENV1 do Havaí neuroadaptada de camundongos cultivada sobre células Vero (Despres et al, J. Virol., 1998, 72 (1), 823-829). Após o desafio, o sangue foi coletado por via periorbital no dia 1, 2, 3, 5, 7 e os animais foram seguidos para determinar os sinais clínicos e o peso pelos quinze dias seguintes. A carga viral genômica de DENV1 foi determinada no soro de camundongos por meio de PCR qRT de uma etapa conforme descrito abaixo. O soro foi desativado por calor a 56 °C por trinta minutos e a presença de anticorpos anti-MV foi detectada utilizando ELISA (Trinity Biotech). Utilizou-se imunoglobulina anticamundongos conjugada a HRP (Jackson Immuno Research) como anticorpo secundário. Anticorpos anti-DENV foram detectados conforme descrito anteriormente (Brandler et al, Vaccine, 2010, 28, 6730-6739) por meio de ELISA utilizando placas com 96 cavidades revestidas com proteínas EDIII recombinantes de DENV1, DENV2, DENV3 e DENV4 produzidas em E. coli ou sintetizadas in vitro. Utilizou-se imunoglobulina anticamundongos conjugada a HRP como anticorpo secundário. Os títulos finais de soro reunido foram calculados como recíproco da última diluição, gerando duas vezes a absorção de soro de camundongos inoculados com MV que serviram como controles negativos.
D. Eficácia protetora de MVDVax em primatas não humanos:
[00131] Os inventores avaliarão, em primatas não humanos (NHP), a eficácia protetora de vetores MVDVax recombinantes.
[00132] Os experimentos serão conduzidos conforme segue:
[00133] Vírus: vírus de desafio: linhagem de DENV1 da Jamaica CVI 1636 3P, isolada em 1977, passagens 2/3 MP/3P C6/36HT 2P sobrenadante de cultivo de células Vero. Linhagem de DENV1 KDH0026A, sobrenadante de cultivo de células C6/36. Linhagem de DENV2 DJ.M.O.1.7.12, sobrenadante de cultivo de células C6/36. Linhagem de DENV4 de Dominica 814669, isolada em 1981, passagens 4P C6/36 HT 2P sobrenadante de cultivo de células Vero. Esses vírus são utilizados para testes de neutralização. O vírus de vacina MVDVax recombinante é preparado conforme descrito anteriormente (Brandler, et al, Vaccine, 2010, 28, 6730-6739) e o título viral é determinado por meio de teste de diluição de limite final sobre células Vero.
[00134] Animais: macacos cynomolgus derivados das Ilhas Maurício (Macaca fascicularis) são abrigados em uma instalação de cuidados animais BSL-3 em CEA. O comitê ético da região de Ile-de-France aprovará métodos experimentais que são conduzidos de acordo com a Norma Europeia 2010-63-UE. Os animais são adultos, machos e fêmeas, jovens (0,8-1 kg). Para avaliar a imunogenicidade da possível vacina, doze animais são inoculados por via subcutânea com duas doses de 200 μl contendo 105 TCID50 de vírus de vacina MVDvax com um mês de intervalo e são amplificadas seis meses depois com uma terceira dose de 106 TCID50 de MVDVax. De forma similar, oito animais controle recebem duas administrações da vacina MVSchw vazia (200 μl contendo 105 TCID50) e uma terceira dose de 106 TCID50 seis meses mais tarde. Cinco meses após a última imunização, os animais são divididos em dois grupos e desafiados por meio de inoculação intravenosa de 1,0 x 104 pfu de DENV1 do tipo selvagem ou DENV4 suspensas em 200 μl de PBS. Os macacos são monitorados para determinar viremia, sinais clínicos e reação celular e de anticorpos. Células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são isoladas por meio de centrifugação de gradiente de densidade Percoll (Sigma-Aldrich). Soro e plasma são coletados e armazenados a -20 °C para análise posterior.
[00135] Reações humorais: anticorpos anti-DENV e anti-MV são detectados em soro desativado por calor utilizando teste imunossorvente ligado por enzimas (ELISA) conforme descrito anteriormente (Brandler et al, Vaccine, 2010, 28, 6730-6739). Soros são considerados positivos quando a densidade óptica (OD) for duas vezes a OD de soro de animais controle.
[00136] Teste de neutralização de DENV: Anticorpos neutralizantes anti-DENV são detectados utilizando um teste de neutralização de redução de foco (PRNT) em células Vero conforme descrito anteriormente (Brandler et al, PLoS 2007, 1 (3), e96). Resumidamente, anticorpos neutralizantes anti-DENV são detectados sobre células Vero utilizando 50 FFU de linhagem de DENV1 do Havaí adaptada para Vero (linhagem de referência da OMS, acesso Genbank n° AF2266887), linhagem de DENV2 da Jamaica n° 1409, linhagem de DENV3 PaH881/88 da Tailândia ou linhagem de DENV4 63632/76 da Birmânia. O título final é calculado como a diluição em soro mais alta que reduz a quantidade de FFU em pelo menos 50%. O título de anticorpo neutralizante também é testado no Centro de Desenvolvimento de Vacinas (CVD, Universidade de Mahidol, Tailândia). Nos testes conduzidos no CVD, células LLC-MK2 derivadas de rim de macaco e foram utilizados os DENVs a seguir: DENV1 (16007), DENV2 (16681), DENV3 (16562) e DENV4 (1036) e o título PRNT é calculado com base em redução de 50% da contagem de plaquetas (PRNT50) conforme descrito anteriormente (Sirivichayakul et al, Virol. J. 2014: 11-48).
[00137] Reações imunes celulares: reações celulares são detectadas por meio de teste Elispot e por meio de citometria de fluxo polifuncional após o estímulo de linfócitos do sangue periférico com conjuntos de peptídeos sintéticos que cobrem o inserto DENV1-NS de MVDVax, conforme descrito anteriormente (Stebbings et al, PLoS-One, 2012, 7 (11), e50397). As células são estimuladas em triplicata com conjuntos de peptídeos 15-mer sintéticos (sobrepostos por 11aa) (BEI, http://www.beiresources.org) a 1 μg/ml/peptideo ou MV vazio atenuado vivo a 104 TCID50/106 células, na presença de 1 μg/ml dos anticorpos coestimulantes anti- CD28 e CD49d (Biolegend). Controles negativos são incubados com volume igual de DMSO (0,15% v/v) sem peptídeo e controles positivos com 1 μg/ml de enterotoxina de estafilococos B (Sigma-Aldrich).
[00138] Quantificação de titulação de DENV e RNA viral de DENV: soro (25 μl) é diluído em 0,5 ml de meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM)/5% soro de feto de bezerro (FCS). RNA viral é extraído (kit de extração de RNA viral QIAamp, Qiagen) e analisado por meio de PCR qRT DENV de uma etapa, utilizando enzimas de alta fidelidade (Roche, Mannheim, Alemanha). PCR qRT em tempo real de RNA de DENV é realizada com kit de PCR em tempo real RealArt® WNV LC (Qiagen). Para titulação de vírus, as amostras são diluídas em 250 μl de meio e a infectividade de diluições em série é testada em células Vero sobrepostas com DMEM Glutamax/2% FCS contendo 0,8% final (peso/volume) de carbóxi metilcelulose. Após quatro dias de incubação, as células são fixadas e as placas são visualizadas por meio de teste de imunofoco conforme descrito anteriormente (Brandler et al, PLoS 2007, 1 (3), e96).

Claims (15)

1. POLIEPÍTOPO QUIMÉRICO cujo tamanho é menor que 600 resíduos de aminoácidos, consistindo nos fragmentos a seguir de (a), (b) e (c) montados em um polipeptídeo de fusão, caracterizado pelos fragmentos de (a), (b) e (c) serem direta ou indiretamente fundidos, nesta ordem: a. dois fragmentos da proteína não estrutural (NS) NS3 do sorotipo 1 do vírus da dengue (DENV) (DENV1) consistindo em duas regiões, em que a primeira região consiste em uma sequência de aminoácidos conforme definida em SEQ ID NO: 6 e a segunda região consiste em uma sequência de aminoácidos conforme definida em SEQ ID NO: 9; b. um fragmento da proteína NS4b de DENV1 que consiste em uma sequência de aminoácidos conforme definida na SEQ ID N° 12; c. um fragmento da proteína NS5 de DENV1 que consiste em uma sequência de aminoácidos conforme definida na SEQ ID N° 15; em que um poliepítopo provoca uma resposta imune protetora de células T CD4+ e/ou CD8+ restrita por antígeno de leucócitos humano (HLA) contra DENV1, DENV2, DENV3 e DENV4.
2. POLIEPÍTOPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por consistir em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147 e SEQ ID NO: 148.
3. POLINUCLEOTÍDEO isolado ou purificado, caracterizado por consistir em uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID N° 2 e codificar o poliepítopo quimérico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2.
4. VETOR, caracterizado por ser um plasmídeo que compreende o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 3.
5. VETOR DE GENOMA DE VÍRUS DO SARAMPO (MV) RECOMBINANTE, caracterizado por ser selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 139-143 e 149 e ser um plasmídeo que compreende (i) um cDNA que codifica o genoma de RNA com comprimento total de um vírus de MV e (ii) o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 3, o mencionado polinucleotídeo estando localizado como um inserto entre os genes P e M do genoma de MV ou entre os genes H e L do genoma de MV, opcionalmente em uma Unidade de Transcrição Adicional (ATU), em que as sequências de (i) e (ii) quando recombinadas juntas no plasmídeo atendem à regra de seis.
6. VETOR DE GENOMA DE MV RECOMBINANTE, caracterizado por ser um plasmídeo que compreende (a) um cDNA que codifica o genoma de RNA com comprimento total de um vírus de MV e (b) um polinucleotídeo consistindo na SEQ ID NO: 144 que codifica antígenos de DENV compostos da fusão dos polipeptídeos de domínio de envelope III (EDIII) dos quatro sorotipos de DENV, fundidos ao ectodomínio da proteína de membrana (ectoM) de DENV1, particularmente antígenos de DENV consistindo na sequência de SEQ ID NO: 145 e (c) o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 3, em que: - o polinucleotídeo (b) está localizado na forma de um inserto entre os genes P e M do genoma de MV e o polinucleotídeo (c) está localizado como um inserto entre os genes H e L do genoma de MV; ou - o polinucleotídeo (b) está localizado na forma de um inserto entre os genes P e M do genoma de MV e o polinucleotídeo (c) está localizado como um inserto entre os genes P e M do genoma de MV; ou - o polinucleotídeo (b) está localizado na forma de um inserto entre os genes H e L do genoma de MV e o polinucleotídeo (c) está localizado como um inserto entre os genes P e M do genoma de MV; e em que as sequências de (a), (b) e (c), quando recombinadas juntas no plasmídeo atendem à regra de seis.
7. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 6, caracterizado por compreender o cDNA que codifica o genoma de RNA com comprimento total de um vírus Schwarz ou Moraten atenuado vivo.
8. PARTÍCULAS DE VÍRUS DO SARAMPO (MV) RECOMBINANTES, caracterizadas por consistirem na SEQ ID NO: 2 e serem resgatadas de uma linhagem de células auxiliares que expressam a T7 RNA polimerase e as proteínas N, P e L de MV, e expressam adicionalmente um ácido nucleico que codifica um vetor conforme definido na reivindicação 4 ou um ácido nucleico que codifica um vetor de genoma de MV recombinante conforme definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 7.
9. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, caracterizada por compreender (a) antígenos de DENV compostos da fusão dos polipeptídeos EDIII dos quatro sorotipos de DENV, fundidos a ectoM de DENV1, particularmente antígenos de DENV que consistem na sequência de SEQ ID NO: 145, (b) o poliepítopo quimérico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, e (c) veículo farmaceuticamente aceitável, que opcionalmente não compreende um adjuvante acessório.
10. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, caracterizada por compreender partículas de MV recombinantes conforme definidas na reivindicação 8 e um adjuvante acessório.
11. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, caracterizada por ser formulada para administração por via parenteral tal como injeção subcutânea (sc), intradérmica (id), intramuscular (im), intraperitoneal (ip) ou intravenosa (iv).
12. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizada por ser administrada em uma ou mais doses de administração, particularmente em regime de administração de amplificação de primer (prime-boost).
13. USO DAS PARTÍCULAS DE MV RECOMBINANTES, conforme definidas na reivindicação 8, ou da composição imunogênica, conforme definida na reivindicação 9, caracterizado por ser para fabricar um medicamento para prevenir e/ou tratar infecções por vírus da dengue em pacientes humanos, em que as referidas partículas ou composição encontram- se em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável; e/ou um adjuvante.
14. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PARTÍCULAS DE MV RECOMBINANTES para a preparação de vacina contra o vírus da dengue, caracterizado por compreender ou consistir em: a. transfecção de um vetor de genoma de MV recombinante conforme definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 7, em uma linhagem de células auxiliares que expressa a T7 RNA polimerase e as proteínas N, P e L de MV; b. transferência da mencionada linhagem de células auxiliares para células competentes para sustentar a replicação e a produção de partículas de MV recombinantes que expressam um poliepítopo quimérico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2 e, opcionalmente, um polipeptídeo que compreende um antígeno de DENV tetravalente composto da fusão dos polipeptídeos EDII dos quatro sorotipos, fundidos a ectoM de DENV1, particularmente antígenos de DENV específicos consistindo na sequência de SEQ ID NO: 145; e c. recuperação das partículas de MV recombinantes produzidas na etapa b.
15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelas mencionadas células competentes na etapa (b) serem células Vero (rim de macaco verde africano), células CEF (fibroblasto de embriões de galinhas) ou células MRC5.
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