BR112015007458B1 - Processo in vitro e kit para diagnóstico de uma infecção por leptospira, e uso in vitro células bacterianas inativadas da espécie leptospira fainei - Google Patents

Abstract

USO DE BACTÉRIAS LEPTOSPIRA FAINEI SOROVAR HURSTBRIDGE PARA DIAGNÓSTICO DE LEPTOSPIROSE. A presente invenção refere-se a um processo in vitro para diagnóstico de uma infecção de Leptospirose em uma amostra biológica de um indivíduo, compreendendo uma etapa de, contato de dita amostra com células bacterianas de um sorovar da espécie Leptospira fainei, preferivelmente células bacterianas de Leptospira fainei sorovar Hurstbridge, ou uma fração antigênica de ditas células bacterianas. Em uma modalidade preferida, a dita infecção com Leptospira não é devida a bactérias pertencendo ao sorovar da espécie Leptospira fainei usada no processo diagnóstico.

Description

Antecedentes da Invenção

[0001] Explosões de leptospirose são de significante e crescente conceito de saúde pública em muitos países tropicais e subtropicais. Leptospirose é uma doença zoonótica causada por espiroquetas do gênero Leptospira, que são classificadas em 9 espécies patogênicas e nais de 200 sorovares nas bases de heterogeneidade estrutural no componente carboidrato do lipopolissacarídeo. Infecções humanas são endêmicas na maioria de climas tropicais e moderados, Globalmente, um número estimado de > 500 000 casos severos ocorrem anualmente com taxas de fatalidade excedendo 10%.

[0002] Esta doença infecciosa negligenciada também é reportada ser uma doença emergente ou reemergente em países industrializados, com prováveis impactos crescentes devido a aquecimento global e crescentes casos relacionados a viagem [Lau C, Travel Med Infect Dis. 2010]. A incidência é subestimada devido a apresentação clínica altamente variável que é caracterizada por sinais e sintomas não específicos; leptospirose é frequentemente confundida com outras doenças tais como dengue, rickettsiose, febres entéricas e malária. A tríade completa de doença de Weil (insuficiência hepática, insuficiência renal e hemorragia) é reconhecida ser responsável por menos que um terço de casos humanos [Mac Bride A.] et al., Curr. Opin. Infect. Dis. 2005]. A maior parte dos sinais e sintomas iniciais aponta para a assim chamada "febre aguda de origem desconhecida" (FUO), um principal desafio diagnóstico em áreas tropicais e subtropicais. Devido aos sintomas não específicos em leptospirose humana, a confirmação biológica é necessária para verificar a doença. Em muitas regiões endêmicas, o diagnóstico de laboratório de leptospirose não é disponível devido à falta de ensaio diagnóstico confiável, rápido e simples para um ponto de diagnóstico de cuidados de leptospirose humana.

[0003] Ainda, um inicial e adequado tratamento com antibiótico é um determinante chave para o resultado em leptospirose [Suputtamongkol Y. et al., PLoSNegl. Trp. Dis. 2010], porque, em contraste a muitas doenças similares (por exemplo, dengue), leptospirose pode ser facilmente tratada com antibióticos em seus estágios iniciais. Entretanto, o diagnóstico tem de ser confirmado antes do 5o dia após início de doença, quando tratamento com antibióticos é mais efetivo.

[0004] Uma necessidade de Testes Diagnósticos Rápidos (RDTs) confiáveis para diagnóstico de leptospirose humana foi por isso grandemente reconhecida. Preferivelmente, estes RDTs devem ser portáteis, de modo que eles possam ser usados diretamente ao lado do leito, mesmo em centros de saúde remotos, de modo a aperfeiçoar gerenciamento clínico de pacientes de leptospirose em dispensários remotos de regiões tropicais e subtropicais.

[0005] Atualmente, o diagnóstico de laboratório para leptospirose baseia-se na detecção de anticorpos erguidos contra as bactérias Leptospira através de técnicas sorológicas tal como o teste de aglutinação microscópica (MAT), de ácidos nucleicos de espiroquetas através de PCR [Goarant C. Trop. Med. Int. Health, 2009). Entretanto, estas técnicas são impróprias para cuidados clínicos iniciais em centros de saúde periféricos que suportam a maior parte da carga de leptospirose, porque eles são consumidores de tempo e requerem materiais sofisticados que são mais frequentemente disponíveis somente em laboratórios referências centrais [HartskeerIRA, Clin. Microbiol. Infect. 2011]. Também, técnicas sorológicas como teste de aglutinação microscópica (MAT) são limitadas pelo fato de que elas usam um grupo pouco representativo de antígenos de sorovar, de modo que uma reação negativa sobre amostras seriais não elimina a possibilidade de que o paciente possa realmente estar infectado com um sorovar Leptospira não incluído na bateria dos antígenos testados. Técnicas baseadas em PCR, embora muito sensíveis e testes iniciais, são tecnicamente demandantes e as Leptospiras desaparecem dos vasos sanguíneos aproximadamente em7 dias após infecção.

[0006] Além disso, ensaios baseados em ELISA usando lisados de célula inteira brutos de linhagens de Leptospira (usualmente o saprófita l. biflexa sorovar Patoc linhagem Patoc 1) como antígenos podem não reconhecer a diversidade de linhagens circulantes e a sensitividade destes testes é genericamente pobre (McBride Aj. Et al., Curr. Opinion Infect Dis, 2005).

[0007] Assim, a confirmação biológica de leptospirose é atualmente insatisfatória, quando não é confiável, tediosa e raramente disponível em uma maneira oportuna.

[0008] De fato, um principal desafio é ainda descobrir antígenos que são conservados através de principais linhagens de Leptospira, uma vez que tais antígenos podem ser potencialmente reconhecidos pela maioria de anticorpos gerados em pacientes infectados com Leptospira.

[0009] Neste contexto, os presentes inventores identificaram um antígeno de Leptospira que permite a detecção de um amplo espectro de anticorpos direcionados contra a maior parte dos sorovares. Este antígeno de Leptospira é expresso pelas bactérias do sorovar Hurstbridge, que foi originalmente isolado de porcos na Austrália [Perolat P. et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 1998] e é agora classificado na espécie Leptospira fainei, conhecida também infectar humanos [Chappel RJ. Et al. Epidemiol. Infect. 1998]. Os presentes inventores realmente demonstraram que este antígeno apresenta uma alta reatividade na direção de anticorpos gerados por vários sorogrupos de leptospirose, mesmo distantemente sorologicamente relacionados, tais como sorogrupos Australis, Autumnalis, Ballum, Bataviae, Canicola, Cynpteri, Grippotyphoas, Hebdomadis, Icterohaemorrhagiae, Panama, Pomona, Pyrogenes, Sejroe e Tarassovi, em amostras de soro de um número de pacientes metropolitanos Franceses. De nota, resultados positivos falsos são excluídos uma vez que o sorovar Hurstbridge é pobremente representado fora da Austrália e Nova Zelândia. Os presentes inventores também identificaram um processo para inativar as bactérias do sorovar Hurstbridge de modo a aperfeiçoar a exposição de dito antígeno na superfície de célula bacteriana.

[00010] Usando um tal antígeno, é possível desenvolver diferentes Testes Diagnósticos Rápidos (RDTs) exibindo alta sensitividade e especificidade para numerosos sorovares de Leptospira.

[00011] Como mostrado abaixo em detalhes, os presentes inventores desenvolveram dois diferentes RDTs, que são i) um teste ELISA e ii) um ensaio de bastão de imersão de imuno cromatografia de fluxo vertical, estes dois RDTs usando bactérias Leptospira fainei termo inativadas como antígeno, para detecção de IgM humana antiLeptospira em amostras de soro humano. A robustez destes dois RDTs é muito satisfatória em termos de sensitividade, especificidade, reproduzibilidade, vida em prateleira.

[00012] É possível usar o ensaio ELISA e de bastão de imersão da invenção como ferramentas diagnósticas robustas, simples, e rápidas para diagnóstico de leptospirose em pacientes apresentando sinais iniciais e seus sintomas.

[00013] Além disso, na medida em que o ensaio de bastão de imersão da invenção não requer sistema de análise caro e complexo, ele pode por isso ser usado em centros de saúde remotos, ou em dispensários remotos de regiões tropicais e subtropicais.

[00014] Na medida em que bactérias Leptospira fainei apresentam uma alta reatividade na direção de anticorpos gerados por vários sorogrupos de leptospirose, os presentes inventores também propõem o uso de bactérias Leptospira fainei como antígeno em um Teste de Aglutinação Microscópica (MAT).

Legendas de Figuras

[00015] A Figura 1 mostra os Valores Preditivos Positivo e Negativo (PPV, NPV) para o diagnóstico de leptospirose usando o bastão de imersão de IgM da invenção, usando 187 espécimes de soro positivo e 221 negativos.

[00016] A Figura 2 mostra valores Preditivos Positivo e Negativo (PPV, NPV) para o diagnóstico de leptospirose usando o bastão de imersão IgM da invenção e um ensaio de IgM de fluxo lateral comercial. Esta comparação foi conduzida sobre 72 espécimes de soro positivos e 72 negativos selecionados randomicamente de espécimes de Nova Caledônia.

Descrição Detalhada da Invenção

[00017] Em um primeiro aspecto, a presente invenção mostra um processo in vitro para diagnóstico de uma infecção com Leptospira em uma amostra biológica de um indivíduo, compreendendo uma etapa de contato de dita amostra com células bacterianas de um sorovar da espécie Leptospira fainei, ou uma fração antigênica de ditas células bacterianas.

[00018] Neste aspecto, a dita infecção de Leptospira não é devida a bactérias pertencendo ao dito sorovar. Em outras palavras, quando o processo diagnóstico da invenção usa bactérias de um definido sorovar da espécie Leptospira fainei, então este processo não é pretendido para ser usado para diagnóstico de uma infecção mediada por este sorovar definido.

[00019] Como aqui usado, o termo "antígeno" significa qualquer molécula (por exemplo, proteína, lipoproteína, polissacarídeo, e/ou glicoproteína) que faz com que o sistema imune produza anticorpos contra a dita substância. Um antígeno "imunogênico" é um tipo específico de antígeno que é capaz de estimular uma resposta imune adaptativa se injetado por si próprio. No nível molecular, um antígeno é assim caracterizado por sua habilidade para ser reconhecido e "ligado" pelo sítio de ligação de antígeno de um anticorpo.

[00020] No contexto da presente invenção, o termo "fração antigênica de invenção" designa um antígeno que é expresso especificamente por células bacterianas da espécie Leptospira fainei. Este antígeno é acessível especialmente quando as bactérias foram inativadas com um aquecimento e opcionalmente com um tratamento químico. Importantemente, este antígeno é expresso por um número de bactérias de outros sorogrupos ou sorovares. Mais precisamente, a fração antigênica da invenção corresponde a um antígeno i) que é expresso pelas células bacterianas da espécie Leptospira fainei e ii) que é reconhecido por anticorpos que são encontrados no soro de indivíduos infectados com bactérias pertencendo ao seguintes sorogrupos: Australis, Autumnalis, Ballum, Bataviae, Canicola, Cynpteri, Grippotyphoas, Hebdomadis, Icterohaemorrhagiae, Panama, Pomona, Pyrogenes, Sejroe e Tarassovi.

[00021] L. fainei pertence ao grupo intermediário de Leptospira [Perolat P., Int. J. Syst. Bacteriol., 1998]. Sem ser preso por teoria, é feita a hipótese de que esta espécie pode compartilhar características antigênicas comuns com saprófitas e patógenos que constituem os dois outros grupos filogenéticosno gênero Leptospira. Isto pode explicar porque o antígeno da invenção é reconhecido por vários anticorpos anti- Lepdospira, e em particular anticorpos gerados em indivíduos que são infectados com bactérias que não pertencem à espécie L. fainei.

[00022] A fração antigênica da invenção pode ser uma proteína, uma lipoproteína, um polissacarídeo, e/ou uma glicoproteína. Ela é preferivelmente lipopolissacarídeo (LPS, que permanece intacto com aquecimento das células bacterianas), uma proteína secretada, uma proteína citoplásmica, ou uma proteína da membrana celular das bactérias de sorovar Hurstbridge de Leptospira fainei, por exemplo, uma proteína de membrana envelope. Mais preferivelmente, a dita fração antigênica é LPS.

[00023] No contexto da presente invenção, uma fração antigênica (ou um antígeno) é dito ser "reconhecida", "especificamente reconhecida" ou "ligada" por um anticorpo se o dito anticorpo tem uma constante de afinidade Ka (que é a constante de dissociação invertida, isto é, 1/Kd) maior que 10s M-1, preferivelmente maior que 106 M-1, mais preferivelmente maior que 107 M-1 para o dito antígeno (ou epítopo).

[00024] Em uma modalidade preferida, o processo diagnóstico da invenção requer o uso de células bacterianas (ou sua fração antigênica) da sorovar Hurstbridge de Leptospira fainei. Em uma modalidade preferida, as ditas bactérias são células da linhagem BUT 6, que foram originalmente isoladas de porcos na Austrália [Perolat P. et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 1998] e são agora classificadas na espécie Leptospira fainei [Chappel RJ. Et al., Epidemiol. Infect. 1998]. Estas bactérias foram referidas como L. fainei Hurstbridge 1 e são disponíveis em coleções internacionais [por exemplo, ATCC BAA-1109T ou CRBIP6.1209T]. A sequência parcial de rDNA 16S da linhagem protótipo de L. fainei é referida como número de acesso GeneBank U60594, AY631885, AY995712 e FJ154578. O processo diagnóstico da invenção preferivelmente usa células bacterianas da espécie Leptospira fainei que foram previamente inativadas ou mortas, preferivelmente através de um tratamento térmico. Alguns destes tratamentos são descritos em Terpstra WJ. Et al., Zentralbl Bakteriol A. 1980.

[00025] Estes particulares tratamentos são aqui referidos como "processos inativantes" de células bacterianas. Eles permitem inativação de células bacterianas da espécie Leptospira fainei de modo a induzir o aparecimento do antígeno da invenção, que então pode ser usado no processo diagnóstico da invenção.

[00026] Em uma modalidade, células bacterianas integrais da espécie Leptospira fainei são usadas. Estas células bacterianas integrais são preferivelmente obtidas através de inativação das mesmas (preferivelmente através de aquecimento, como descrito abaixo), e/ou através de tratamento das mesmas com agentes de conservação. Estes agentes de conservação são bem conhecidos na técnica.

[00027] Em uma modalidade, as células bacterianas da espécie Leptospira fainei são inativadas por meio do assim chamado "processo de inativação da invenção", que compreende pelo menos uma etapa de inativação de ditas células bacterianas com um tratamento mecânico (por exemplo, por meio de uma Prensa Francesa, sonificação, etc.) ou um tratamento térmico (por exemplo, em uma alta temperatura). Este processo de inativação da invenção é preferivelmente realizado sobre células bacterianas do sorovar Hurstbridge de Leptospira fainei.

[00028] O processo de inativação da invenção preferivelmente compreende pelo menos um tratamento térmico. Assim, as células bacterianas inativadas usadas na invenção são preferivelmente termo - inativadas. Neste processo de inativação baseado em aquecimento, a etapa de aquecimento é tipicamente realizada submetendo-se as células bacterianas vivas da espécie Leptospira fainei a alta temperatura por pelo menos cerca de 10 minutos, preferivelmente por pelo menos cerca de 20 minutos, e mais preferivelmente por pelo menos cerca de 30 minutos, e no máximo por cerca de 1 hora. De modo a inativar eficientemente (isto é, pelo menos 90% das células bacterianas e preferivelmente quase 100% das mesmas) a temperatura está preferivelmente compreendida entre cerca de 60oC e 150oC, mais preferivelmente entre cerca de 90oC e 110oC e mesmo mais preferivelmente ao redor de 100oC. Este tratamento de aquecimento pode ser realizado em qualquer sistema provendo uma alta temperatura durante o tempo requerido (por exemplo, em um forno, um aquecedor seco, ou um banho de ebulição). Preferivelmente, o tratamento de aquecimento é realizado em um banho de ebulição. Neste caso, é preferível que as células sejam mantidas isoladas da água em um recipiente seguro.

[00029] Em uma outra modalidade, as células bacterianas inativadas térmica ou mecanicamente da espécie Leptospira fainei são ainda quimicamente tratadas, por exemplo, com um agente químico de inativação.

[00030] Nesta modalidade, o dito agente químico inativante é definido como qualquer agente químico tendo propriedades de preservação e/ou antissépticas. Em particular, preservação da morfologia (forma e estrutura) das células bacterianas é importante no contexto da invenção, na medida em que o antígeno da invenção pode ser expresso na superfície das células bacterianas. Consequentemente, o dito agente químico inativante é preferivelmente um agente de fixação, por exemplo, escolhido no grupo consistindo em: aldeído (tal como formaldeído, glutaraldeído, e paraformaldeído), álcoois (tais como metanol, etanol), acetona, agentes oxidantes (como tetróxido de ósmio, dicromato de potássio, ácido crômico, e permanganato de potássio) e semelhantes. O dito agente químico inativante é mais preferivelmente escolhido no grupo consistindo em: formaldeído e paraformaldeído. O tratamento químico deve demorar suficientemente de modo que pelo menos 95% das células bacterianas (e preferivelmente quase 100% das mesmas) sejam inativadas (em outras palavras, nenhuma célula bacteriana viva deve restar na amostra bacteriana). O tratamento químico tipicamente demorará pelo menos cerca de uma hora, e mais preferivelmente pelo menos cerca de duas horas, e mesmo mais que 10 horas, no máximo cerca de 24 horas. A duração e a temperatura da reação obviamente dependerão da escolha do agente químico e de sua concentração. Uma vez que agentes químicos que podem ser usados para inativação de bactérias são conhecidos e comercializados por décadas, será fácil para aqueles versados determinar as condições (por exemplo, duração, temperatura, concentração, etc.) de uso para inativação de pelo menos 95% (e preferivelmente todas) das células bacterianas com qualquer agente químico dado. Por exemplo, como mostrado abaixo, o processo diagnóstico da invenção requer o uso de células bacterianas que foram tratadas com formaldeído (formalina) 0,2% v/v por duas a seis horas.

[00031] Importantemente, o tratamento de inativação mecânico, térmico ou químico pode ser realizado em qualquer ordem.

[00032] Entretanto, em uma modalidade preferida, as células bacterianas da espécie Leptospira fainei são primeiro tratadas quimicamente com um agente químico de inativação como definido acima, e são em segundo lugar tratadas em uma alta temperatura ou mecanicamente, por exemplo, nas condições definidas anteriormente. Em uma modalidade mais preferida, o processo diagnóstico da invenção requer o uso de células bacterianas da espécie Leptospira fainei que foram primeiramente tratadas com, como um tratamento químico de inativação, formaldeído (formalina) 0,2% v/v durante duas a seis horas, e então sendo aquecidas durante 45 minutos em um banho de ebulição.

[00033] Como aqui usado, o termo "amostra biológica" refere-se a qualquer amostra que possa conter anticorpos específicos de Leptospira, tal como qualquer fluido biológico, por exemplo, amostra de soro, amostra de sangue, amostra de plasma, amostra de linfa, amostra de urina, ou amostra de fluido cérebro-espinhal (CSF). Plasma de sangue é o componente líquido de sangue, no qual as células de sangue são suspensas. Ele é composto de principalmente água (90% em volume), e contém proteínas, glicose, fatores de coagulação, íons de minerais, hormônio e dióxido de carbono dissolvidos. Ele é facilmente recuperado quando corresponde ao fluido sobrenadante obtido quando sangue não coagulado foi centrifugado. Para obter amostras de plasma, o sangue é misturado com uma apropriada quantidade de anticoagulante como heparina, oxalato ou ácido etileno diamino tetra- acético (EDTA), então imediata e inteiramente misturado para evitar coagulação. Soro de sangue corresponde a plasma de sangue sem fibrinogênio ou outros fatores de coagulação. Estas proteínas são algumas vezes consideradas como substâncias interferentes em alguns testes uma vez que elas podem reagir com o reagente e pelo que renderem resultados imprecisos. Soro é por isso frequentemente preferido em testes clínicos. Amostras de soro podem ser facilmente obtidas por aqueles versados na técnica através de centrifugação de amostras de sangue em cerca de 2500 rpm por uns poucos minutos e então recuperando o sobrenadante.

[00034] Em uma modalidade preferida, o processo diagnóstico da invenção é realizado sobre uma amostra biológica que é uma amostra de soro. Uma tal amostra de soro é obtida através de uma coleta de sangue completamente inofensiva a partir do indivíduo e assim permite um diagnóstico não invasivo de leptospirose.

[00035] No contexto da presente invenção, o termo "indivíduo" aqui designa indivíduos humanos ou animais.

[00036] O processo da invenção é usualmente realizado sobre indivíduos que são suspeitos de uma leptospirose. Os ditos indivíduos usualmente apresentam pelo menos um sintoma conhecido ser associado com uma tal infecção. Este sintoma é, por exemplo, febre, calafrios, mialgia, e/ou dor de cabeça intensa.

[00037] O processo da invenção também pode ser aplicado a qualquer indivíduo tendo sofrido de leptospirose, de modo a detectar a predominância de sorotipo de anticorpos antileptospirose durante ou após evento epidêmico de leptospirose.

[00038] No contexto da invenção, a expressão "diagnosticando uma infecção de Leptospira" refere-se ao processo de identificação ou detecção de se um indivíduo ou um paciente está infectado ou não com bactérias patogênicas do gênero Leptospira. Ele também refere-se ao processo de monitoramento de progressão de uma infecção por ditas bactérias. Em outros termos, o processo da invenção permite diagnosticar uma infecção induzida por Leptospira em um indivíduo. Ele também permite discriminação de indivíduos infectados por bactérias Leptospirra de indivíduos infectados por bactérias de outros gêneros.

[00039] É aqui relembrado que, quando o antígeno usado no processo da invenção é de células bacterianas de um definido sorovar da espécie Leptospira fainei, a infecção de Leptospira que é diagnosticada de acordo com o processo da invenção não é necessariamente devida a (ou causada por) bactérias pertencendo ao dito sorovar. Em particular, quando o antígeno usado no processo da invenção são células bacterianas de sorovar Hurstbridge de Leptospira fainei, a infecção com Leptospira que é diagnosticada de acordo com o processo da invenção não é necessariamente devida a (ou causada por) bactérias pertencendo ao sorovar Hurstbridge de Leptospira fainei. Em uma modalidade preferida, a infecção de Leptospira que é diagnostica de acordo com o processo da invenção não é devida (ou causada por) quaisquer bactérias pertencendo à espécie Leptospira fainei, e, em particular, a bactérias pertencendo ao sorovar Hurstbridge de Leptospira fainei. Em uma modalidade mais preferida, a infecção de leptospirose que é diagnosticada de acordo com o processo da invenção é antes devida a (ou causada por) bactérias pertencendo a um ou mais sorogrupos escolhido de Hardjo, Louisiana, Shermani, Celledoni, Sarmin, Javanica, Grippotyphosa, Mini, Serjoe, Australis, Autumnalis, Ballum, Bataviae, Canicola, Cynpteri, Hebdomadis, Icterohaemorrhagiae, Panama, Pomona, Pyrogenes, Sejroe e Tarassovi. Em uma modalidade mesmo mais preferida, a infecção de leptospirose que é diagnosticada de acordo com o processo da invenção é devida a (ou causada por) bactérias pertencendo a um ou mais sorogrupos escolhidos de Australis, Autumnalis, Ballum, Bataviae, canicola, Cynopteri, Grippotyphosa, Hebdomadis, Icterohaemorrhagie, Panama, Pomona, Pyrogenes, Sejroe e Tarassovi.

[00040] Como aqui mostrado, o termo "in vitro" refere-se a estudos ou experimentos que são conduzidos usando amostras biológicas (por exemplo, amostras de sangue ou soro) que foram isoladas de seus organismos hospedeiros (por exemplo, animais ou humanos) que foram isolados de seus organismos hospedeiros (por exemplo, animais ou humanos). Estes experimentos podem ser, por exemplo, reduzidos para prática em materiais de laboratório tais como tubos, frascos, cavidades, microtubos, etc. Em contraste, quando aqui usado, o termo "in vivo" refere-se a estudos que são conduzidos sobre organismos vivos inteiros.

[00041] Um anticorpo (Ab) é uma proteína com forma de Y grande produzida por células-B que é usada pelo sistema imune para identificar e neutralizar objetos estranhos tais como bactérias e vírus. Anticorpos nativos são usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150 000 Dáltons, compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada compreende uma região (ou domínio) variável de cadeia pesada (aqui abreviado como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve compreende um domínio, CL. As regiões VH e VL ainda podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas "regiões determinantes de complementaridade" (CDR) ou "regiões hipervariáveis", que são primariamente responsáveis por ligação de um epítopo de um antígeno, e que são interespaçadas com regiões que são mais conservadas, chamadas de regiões de estrutura FR). Cada VH e VL são compostas por três CDRs e quatro FRs, arranjadas a partir de terminus amino para terminus carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio ligante que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos que medeiam a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores de hospedeiro, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (C1q) do sistema complemento clássico. Regiões constantes não são diretamente envolvidas em ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras. Dependendo da sequência de aminoácidos da região constante de suas cadeias pesadas, anticorpos ou imunoglobulinas podem ser designados para diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE,. IgG e IgM, e várias destas ainda podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3,, e IgG4; IgA1 e IgA2. Das várias classes de imunoglobulina humana, somente IgG1, IgG2, IgG3 e IgM humanas são conhecidas ativarem complemento; e IgG1 e IgG3 humanas mediam ADCC mais eficientemente que IgG2 e IgG4.

[00042] Anticorpos de isotipos IgM e IgG são compostos por duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas ligadas por ligações dissulfeto. Importantemente, anticorpos IgM formam polímeros onde imunoglobulinas múltiplas estão covalentemente ligadas através de ligações dissulfeto, principalmente como um pentâmero mas também como um hexâmetro. Em sua forma pentâmero, eles têm uma massa molecular de aproximadamente 900 kDa. Devido cada monômero ter dois sítios de ligação de antígeno, uma IgM pentamérica tem 10 sítios de ligação. Anticorpos IgM não podem ligar 10 antígenos ao mesmo tempo devido a restrições estéreas. Devido à sua natureza polimérica, IgM possui alta avidez.

[00043] De nota, anticorpos IgM são os primeiros a aparecerem em resposta a inicial exposição a antígeno, e a presença de específica IgG, em geral, corresponde a maturação da resposta de anticorpo.

[00044] Com os ensaios diagnósticos da técnica anterior, ambos anticorpos tipo IgG e IgM foram usualmente detectados na amostra biológica dos pacientes. Em contraste, entretanto, os ensaios de bastão de imersão e ELISA da invenção são específicos para anticorpos tipo IgM induzidos pela infecção de Leptospira, de modo que a leptospirose é diagnosticada em um estágio inicial e por isso pode ser mais eficientemente curada. Em adição, e devido a títulos de IgM serem conhecidos diminuírem mais rápido que IgG, alguns resultados MAT positivos podem revelar IgGs restantes de prévia exposição a Leptospiras, e por isso podem ser menos específicos que ensaios específicos-IgM para detecção de leptospirose aguda e recente.

[00045] A identificação dos anticorpos IgM é realizada através do uso de anticorpos policlonais, ou monoclonais, ou fragmentos funcionais de anticorpos, usados como "agente de revelação". Como aqui usado, "fragmentos funcionais de anticorpos" é pretendido incluir Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv, dsFv, ds-scFv, dímeros, minicorpos, diacorpos, e seus multímeros e fragmentos de anticorpos biespecíficos. Anticorpos podem ser fragmentados usando-se técnicas convencionais. Por exemplo, fragmentos F(ab’)2 podem ser gerados por tratamento de anticorpo com pepsina. O resultante fragmento F(ab’)2 pode ser tratado para reduzir pontes dissulfeto para produzir fragmentos Fab’. Digestão com papaína pode conduzir à formação de fragmentos Fab. Fab, Fab’, e F(ab’)2, scFv, dsFv, ds-scFv, dímeros, minicorpos, diacorpos, fragmentos de anticorpos biespecíficos e outros fragmentos também podem ser sintetizados através de técnicas recombinantes. Um "anticorpo monoclonal", como aqui usado, significa um anticorpo elevando-se de uma população de anticorpos aproximadamente homogênea. Mais particularmente, os anticorpos individuais de uma população são idênticos exceto para umas poucas possíveis mutações ocorrendo naturalmente que podem ser encontradas em proporções mínimas. Em outras palavras, um anticorpo monoclonal consiste em um anticorpo homogêneo surgindo do crescimento de um único clone de célula (por exemplo, um hibridoma, uma célula hospedeira eucariótica transfectada com uma molécula de DNA codificando o anticorpo homogêneo, uma célula hospedeira procariótica transfectada com uma molécula de DNA codificando o anticorpo homogêneo, etc.) me é genericamente caracterizado por cadeias pesadas de uma e somente uma classe e subclasse, e cadeias leves de somente um tipo. Anticorpos monoclonais são altamente específicos e são direcionados contra um único antígeno. Em adição, em contraste com preparações de anticorpos policlonais que tipicamente incluem vários anticorpos direcionados contra vários determinantes, ou epítopos, cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único epítopo do antígeno.

[00046] De nota, o processo de diagnóstico da invenção pode usar células bacterianas vivas ou células bacterianas inativadas.

[00047] Células bacterianas vivas da espécie Leptospira fainei podem ser usadas, por exemplo, em um ensaio MAT. Um tal ensaio MAT consiste em diluições seriais do soro de paciente mantido em contato com um igual volume de uma suspensão bem crescida de Leptospiras e lidas microscopicamente através de estimativa de 50% de aglutinação como o título de ponto final da mistura de reação. Este ensaio é amplamente usado na técnica. Em resumo, as células bacterianas são crescidas em um meio apropriado (tipicamente o meio Johnson & Harris modificado Mc Cullough e Ellinghausen dedicado [EMJH]] e colocadas em contato com diferentes diluições do soro testado. A aglutinação é então observada sob um microscópio de campo escuro.

[00048] Vantajosamente, embora ele seja realizado com bactérias de um sorovar definido (por exemplo, Hurtsbridge), o ensaio MAT da invenção permite diagnosticar uma infecção devida a bactérias pertencendo a outros sorogrupos e/ou sorovares como mencionado acima.

[00049] Em uma modalidade preferida, entretanto, o processo diagnóstico da invenção usa células bacterianas da espécie Leptospira fainei que foram inativadas de acordo com o "processo de inativação" da invenção (como definido acima) ou suas frações antigênicas.

[00050] Neste caso, o processo diagnóstico da invenção tanto pode ser um ensaio ELISA, como um ensaio de bastão de imersão. Nestes ensaios da invenção, as células bacterianas termo- e opcionalmente quimicamente inativadas da espécie Leptospira fainei são imobilizadas sobre um suporte sólido. O dito suporte é preferivelmente uma membrana de nitrocelulose para o ensaio de bastão de imersão, ou uma placa de microtitulação para o ensaio ELISA. Suportes alternativos que podem ser usados nestes ensaios são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00051] Como aqui usado, o "ensaio ELISA da invenção" designa um ensaio ELISA (Ensaio Imuno sorvente ligado - enzima) requerendo o uso de células bacterianas da espécie Leptospira fainei que foram inativadas de acordo com o processo de inativação da invenção, ou suas frações antigênicas, as ditas bactérias ou frações sendo imobilizadas sobre um suporte sólido, preferivelmente uma placa de microtitulação. Um ensaio ELISA de acordo com a invenção é mostrado na parte experimental do pedido de patente. Ensaios ELISA são amplamente usados e bem descritos na técnica.

[00052] Como aqui usado, o "ensaio de bastão de imersão da invenção" designa um ensaio de bastão de imersão requerendo o uso de células bacterianas da espécie Leptospira fainei que foram inativadas de acordo com o processo de inativação da invenção, ou suas frações antigênicas, as ditas bactérias ou frações estando imobilizadas sobre um suporte sólido, preferivelmente uma membrana de nitrocelulose. Um ensaio de bastão de imersão de acordo com a invenção é mostrado na parte experimental do pedido de patente. Ensaios de bastão de imersão são amplamente usados e bem descritos na técnica.

[00053] Interessantemente, no presente estudo, 11 de 17 pacientes confirmados de leptospirose podem ser diagnosticados mais cedo com o ensaio de Bastão de imersão da invenção do que com o MAT (ver Tabela 2 abaixo). Similarmente, em 16 de 99 soros iniciais de casos confirmados, o ensaio de Bastão de Imersão da invenção foi positivo antes de soro ascensão (10/37) ou soro conversão (6/62) poder ser evidenciada com o MAT. Por isso, o ensaio de bastão de imersão de IgM da invenção apresenta uma positividade mais inicial quando comparado a MAT em soros seriais. Devido a um diagnóstico inicial ser de importância principal no gerenciamento clínico de leptospirose, a possibilidade para avaliar a doença mais cedo no curso da infecção deve ser visto como uma real vantagem.

[00054] Imobilização das bactérias (ou sua fração) s obre o suporte sólido é realizada através de meios convencionais que são bem conhecidos na técnica. No caso de um ensaio de bastão de imersão, as bactérias ou suas frações podem ser, por exemplo, espargidas sobre o suporte sólido e deixadas secar até evaporação total das bactérias ou suas frações espargidas. No caso de um ensaio ELISA, as bactérias ou suas frações antigênicas podem ser colocadas em contato com a superfície do suporte sólido e deixadas secar até evaporação total, por exemplo, durante pelo menos 6 horas a cerca de 4oC, então as bactérias (ou frações) não ligadas são lavadas através de sucessivas lavagens.

[00055] O suporte sólido sobre o qual as bactérias (ou frações antigênicas) são imobilizadas é então colocado em contato com a amostra biológica do indivíduo, em condições apropriadas de modo que as imunoglobulinas humanas que estão presentes na dita amostra biológica podem se ligar às bactérias imobilizadas (ou suas frações). As ditas condições apropriadas (temperatura, duração, etc.) dependem de cada tipo de suporte, e é questão de rotina identificar as mesmas para as bactérias (ou frações) da invenção. Por exemplo, poucos segundos (no máximo 1 hora) são suficientes para a tira de bastão de imersão da invenção, enquanto uns poucos minutos (no máximo doze horas) sejam requeridos para o ensaio ELISA da invenção.

[00056] O processo diagnóstico da invenção, e em particular os ensaios ELISA e bastão de imersão da invenção, ainda compreendem uma etapa de detecção de imunoglobulinas humanas ligadas ao antígeno imobilizado. Esta detecção é tipicamente realizada com um agente de revelação. Este "agente de revelação" pode ser um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, tanto na forma de um conjugado imuno, ou um anticorpo marcado de modo a obter um sinal detectável e/ou quantificável.

[00057] Em uma modalidade preferida, o dito agente de revelação é preferivelmente um anticorpo IgM anti-humana, mais preferivelmente um anticorpo IgM anti-humana que está conjugado com um rótulo detectável. Exemplos de rótulos detectáveis incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, e materiais radioativos. Exemplos de apropriadas enzimas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, beta galactosidase, ou acetil colinesterase; exemplos de apropriados complexos de grupos protéticos incluem estreptavidina / biotina e avidina / bitoina; exemplos de apropriados materiais fluorescentes incluem umbeliferona, fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; exemplo de materiais luminescentes incluem luminol, e exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aequorim; exemplos de apropriado material radioativo incluem 125I, 131I, 35S ou 3H.

[00058] Também é possível usar o antígeno da invenção acoplado com pérolas ou nanopartículas. Pérolas revestidas ou nanopartículas carreando o antígeno da invenção podem agregar ou ser imunocapturadas na presença de um soro de indivíduo contendo anticorpos reconhecendo este antígeno. Esta agregação é facilmente detectável por meios convencionais, tal como através de microscopia, por citometria de fluxo, ou olho nu, etc.

[00059] Os ensaios diagnósticos da invenção vantajosamente contêm um controle positivo ao qual o agente de revelação se liga sem requerer a presença dos complexos de antígeno - imunoglobulina humana. Por exemplo, se o agente de revelação é um anticorpo IgM anti-humana, o controle positivo pode consistir em IgM humana ou pelo menos a sua parte constante.

[00060] Quando a etapa de detecção revela que a amostra biológica contém imunoglobulinas humanas que são específicas para o antígeno da invenção, o dito indivíduo é diagnostico ter uma infecção de Leptospira. Então é possível administrar um apropriado tratamento antibiótico.

[00061] Tratamentos antibióticos que são atualmente usados para prevenção ou combate contra leptospirose são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais antibióticos incluem doxiciclina, ceftriaxona, penicilina G e penicilina A. Eles são revistos em Levett P. N. et al., Mandell, Douglas, and Bennett’s Principales and Practice of Infectious Diseases, 2010.

[00062] Da mesma maneira, em um segundo aspecto, a presente invenção provê um processo para identificação in vitro se um indivíduo será beneficiado do tratamento com uma composição contendo antibiótico, o processo compreendendo: a) condução de processo diagnóstico da invenção sobre uma amostra biológica do dito indivíduo, como definido acima, usando células bacterianas de um sorovar da espécie Leptospira fainei ou uma fração antigênica das ditas células bacterianas, e b) identificação se o indivíduo se beneficiará do tratamento com uma composição contendo antibiótico se a dita amostra biológica contem imunoglobulinas humanas que são específicas para as ditas células bacterianas da espécie de Leptospira fainei, ou para dita fração antigênica de ditas células bacterianas.

[00063] Preferivelmente, as células bacterianas usadas neste processo são células bacterianas da espécie Leptospira fainei que foram inativadas de acordo com o processo de inativação da invenção descrito acima.

[00064] Preferivelmente, as células bacterianas usadas neste processo pertencem ao sorovar Hurstbridge de Leptospira fainei.

[00065] Mais preferivelmente, as células bacterianas usadas neste processo são células bacterianas de sorovar Hurstbridge de Leptospira fainei que foram inativadas de acordo com o processo de inativação da invenção.

[00066] Como aqui pretendido, um indivíduo é "previsto beneficiar-se do tratamento com uma composição contendo antibiótico" se ele é diagnosticado sofrer de leptospirose pelo processo diagnóstico da invenção. Este processo é uma ferramenta muito útil para evitar exposição de antibióticos para indivíduos que não sofrem de leptospirose, pelo que prevenindo a emergência de resistência bacteriana.

[00067] Em um outro aspecto, a presente invenção e puxada para uma composição contendo antibiótico para uso no tratamento de um indivíduo que foi diagnosticado com leptospirose usando o processo da invenção.

[00068] A presente invenção também refere-se ao uso de um antibiótico para preparação de uma composição pretendida para tratar um indivíduo que foi diagnosticado com leptospirose usando o processo de diagnóstico da invenção.

[00069] Além disso, a presente invenção refere-se a um processo de tratamento de um indivíduo em sua necessidade, o processo compreendendo administração de uma composição contendo antibiótico em indivíduos cuja leptospirose foi diagnosticada usando o processo diagnóstico da invenção.

[00070] Em um segundo aspecto, a presente exposição também provê kits úteis para modalidade de processo diagnóstico descrito acima.

[00071] Os kits da invenção genericamente compreendem um suporte sólido revestido com células bacterianas inativadas da espécie Leptospira fainei, as frações antigênicas de ditas células bacterianas, e um agente de revelação.

[00072] Em uma modalidade preferida, o dito agente de revelação é um anticorpo marcado, mais preferivelmente um anticorpo IgM antihumana marcado. Exemplos de marcadores detectáveis incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais bioluminescentes, e materiais radioativos. Exemplos de apropriadas enzimas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, beta galactosidase, ou acetil colinesterase; exemplos de apropriados complexos de grupo protético incl uem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, dichlorot[pi]azinylamine fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; exemplo de material luminescente inclui luminol, e exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aequorim; exemplos de apropriados materiais radioativos incluem 125I, 131I, 35S ou 3H.

[00073] Em uma modalidade preferida, as células bacterianas revestidas sobre o dito suporte sólido pertencem a sorovar Hurstbridge de Leptospira fainei. Em uma modalidade mais preferida, as ditas células bacterianas são células bacterianas de sorovar Hurstbridge de Leptospira fainei que foram inativadas com o processo de inativação da invenção.

[00074] Em uma modalidade preferida, o suporte sólido do dito kit é uma placa de microtitulação ou uma membrana de celulose.

[00075] Em uma modalidade preferida, o kit da invenção ainda compreende uma amostra controle que também é reco nhecida pelo dito agente de revelação. Por exemplo, se o agente de revelação é um anticorpo IgM anti-humana, o controle positivo pode consistir em IgM humana ou pelo menos a sua parte constante.

[00076] Os kits da invenção também podem incluir instruções para interpretação de resultados obtidos usando o kit.

[00077] Os kits também podem compreender, por exemplo, um agente tamponante, um preservativo, ou um agente de estabilização de proteína. Os kits ainda podem compreender componentes necessários para detecção de marcador detectável (por exemplo, uma enzima ou um substrato). Cada componente de um kit pode ser encerrado em um recipiente individual e todos os vários recipientes podem estar dentro de uma embalagem única, junto com instruções para interpretação de resultados dos ensaios realizados usando o kit.

[00078] Em um outro aspecto, a presente invenção alveja células bacterianas da espécie Leptospira fainei, que foram inativadas com o processo de inativação da invenção, ou frações antigênicas de ditas células bacterianas. Como mencionado anteriormente, estas células bacterianas ou suas frações antigênicas compreendem pelo menos um antígeno universal que é reconhecido por um número de anticorpos específicos para bactérias Leptospira pertencendo a diferentes sorovares e/ou grupos de soros.

[00079] Preferivelmente, estas células bacterianas pertencem ao sorovar Hurstbridge de Leptospira fainei.

[00080] Em uma modalidade preferida, a dita fração antigênica é escolhida de: lipossacarídeo, proteínas citoplásmicas, proteínas secretadas, e proteínas de membrana envelope. Ela é mais preferivelmente lipossacarídeo (LPS).

[00081] Em um outro aspecto, a presente invenção é direcionada ao uso de: i) células bacterianas da espécie Leptospira fainei que foram inativadas com o processo de inativação da invenção, ou frações antigênicas de ditas células bacterianas, ou ii) o kit da invenção, contendo as ditas células bacterianas e um agente de revelação, em um processo diagnóstico para detecção de infecção de leptospirose em um indivíduo em sua necessidade.

[00082] Em uma modalidade preferida, as ditas células bacterianas são células bacterianas de sorovar Hurstbridge de Leptospira fainei, que foram preferivelmente inativadas com o processo de inativação da invenção.

[00083] Outras características e vantagens da presente invenção tornar-se-ão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada. Deve ser entendido, entretanto, que a descrição detalhada e os específicos exemplos enquanto indicando realizações preferidas da invenção são dados somente a título de ilustração, uma vez que várias mudanças e modificações dentro do espírito e escopo da invenção tornar-se-ão aparentes para aqueles versados na técnica a partir desta descrição detalhada.

Exemplos 1. Material e Processos 2. Preparação de Antígeno

[00084] O antígeno foi preparado no Institut Pasteur, Unite de Biologie des Spirochetes, Paris, France. 10 mL de pré-cultura EMJH de Leptospira fainei Hurstbridge BUT 6T foi usado foram usados para inocular um litro de EMJH. Esta cultura de um litro foi incubada a 30oC por 4-7 dias com agitação constante até atingir uma densidade ótica maior que ou igual a 0,5 em 420 nm. A cultura foi então deixada em repouso em temperatura ambiente por 2-6 horas após adição de 2 mL de formaldeído (ou formalina) 37% (isto é, 0,2% v/v). A cultura morta com formalina foi aquecida por 45 minutos em um banho de água em ebulição. Por último, o pH foi ajustado para 9,6 e esta preparação foi estocada a 4oC. Esta preparação bruta foi usada diretamente como um antígeno fixo nos RTDs (ELISA e bastões de imersão). 3. Desenvolvimento e produção do ensaio ELISA 3.1. Amostras de soro

[00085] Amostras de sangue de voluntários saudáveis sem história de leptospirose e soro negativos por MAT foram coletadas de biobanque (Patform ICAReB/Investigation Clinique et Accès aux Ressources Biologiques, Institut Pasteur).

[00086] Amostras de soros negativos e positivos para leptospirose foram endereçadas para o National Reference center of Leptospirosis (Institut Pasteur) para propósito diagnóstico entre 2010 e 2011 e originadas de pacientes de França continental e a French West Indies (Guadalupe e Martinica).

[00087] Os seguintes grupos foram estabelecidos baseados no MAT (Teste de Aglutinação Microscópica) que é o teste referência para o soro diagnóstico de leptospirose (padrão ouro): - Grupo A (controles negativos): Duas sorologias para o mesmo paciente e cujos resultados permaneceram negativos em MAT - Grupo B (casos positivos): Duas sorologias para o mesmo paciente com um soro conversão ou soro conversão demonstrada (>=4 vezes de elevação) em MAT com pelo menos um soro grupo de Leptospira patogênico e foi por isso considerado um caso de Leptospirose confirmado em laboratório. 3.2. protocolo ELISA

[00088] Placas de microtitulação de fundo plano (Immulon 1B Thermo, Dutscher) foram revestidas com 75 microlitros da solução antigênica bem homogeneizada, por toda noite a 4oC. Alternativamente, a solução antigênica foi deixada evaporar a 37oC por 1-3 dias. As placas revestidas foram então estocadas em um local seco em temperatura ambiente por até dois anos.

[00089] Placas foram lavadas três vezes com PBS-Tween 20 0,2% (PBST), então incubadas por 1 hora a 37oC ( ou por toda noite a 4oC) com solução de bloqueio, 75 microlitros de PBS - Leite 5% (PBSM) (pulverizados:Dutscher) pH 7,2. Placas foram novamente lavadas três vezes com PBST. Duplicatas de diluição de 75 microlitros dos soros dos pacientes em PBSM (1:400) foram incubadas por 1 hora a 37oC. Uma faixa de diluição de uma reunião de amostras de soro positivas (1:400 a 1:204 800) e um controle negativo foram incluídos sobre cada placa como padrões internos. Esta reunião foi constituída por 50 amostras de soro positivas exibindo títulos recíprocos de MAT > 800 com pelo menos um soro grupo de Leptospira patogênico.

[00090] As placas foram lavadas três vezes com PBST. 75 microlitros de conjugado de IgM-peroxidase anti-humana coelho (Biorad) diluído em 1:500 em PBSM foram adicionados a cada cavidade e placas foram incubadas por 1 hora a 37oC.

[00091] Placas foram lavadas cinco vezes com PBST. 75 microlitros de tampão substrato ácido 2-2’-azino dietil benz-tiazolino-6-sulfônico (ABTS) 0,5 mM (Roche), foram adicionados a cada cavidade. Placas foram lidas em 415 nm com leitor ELISA (Biorad) após 30 minutos de incubação no escuro a 37oC.

[00092] O corte de ponto final foi estabelecido por titulação como o valor de OD405 médio das 20 amostras de soro negativas para leptospirose plus 3 desvios padrões. 3.3. Resultados do protocolo ELISA Um total de 449 soros foram analisados:

TN = negativo verdadeiro = 308 TP = positivo verdadeiro = 141 FP = positivo falso = 4 FN = negativo falso = 6 Sensitividade TP/(TP+FN)x100 = 141/(141+6)x100 = 96% Especificidade: TN/(TN+FP)x100 = 308/(308+4) = 99% Valor preditivo positivo (VPP): TP/(TP+FP)x100 = 141/(141+4)x100 = 97% Valor preditivo negativo (VPN): TN/(TN+FN)x100 = 308/(308+6)x100 = 98% Precocidade do teste:

[00093] Em mais que metade dos casos (57%), o ensaio ELISA da invenção foi positivo sobre o primeiro soro, enquanto o MAT foi negativo.

3. Desenvolvimento e produção do ensaio de bastão de imersão 3.1. Amostras de soro

[00094] Casos de leptospirose foram definidos como confirmados quando uma suspeita clínica e epidemiológica foi complementada através de tanto uma PCR específica positiva evidenciando genomas de Leptospira sp. Patogênica no sangue ou urina do paciente ou quando duas análises sorológicas usando o MAT referência sobre soros agudos e convalescentes mostraram uma soro conversão (de nil para um título recíproco > 400) ou uma significante soro ascensão (pelo menos uma elevação de quatro vezes em títulos recíprocos), de acordo com padrões recomendados WHO. Casos prováveis foram definidos como suspeita clínica e epidemiológica junto com um soro único com um título recíproco MAT maior que 400 [Berlioz-arthaud A. et al., Trans R. Soc. Trop. Med. Hyg. 2007]. O painel de linhagens usadas para MAT foi adaptado para a epidemiologia local.

[00095] Todos os soros usados neste estudo foram endereçados para Institut Pasteur para propósitos diagnósticos e originados de pacientes de Nova Caledonia, França continental e a French West Indies (Martinica e Guadalupe). Eles foram estocados a -20oC, selecionados de acordo com definições de casos, então testados de modo cego. Para avaliar a sensitividade do ensaio de bastão de imersão, somente soros positivos MAT de casos confirmados foram usados. A especificidade foi avaliada usando soros patológicos ou saudáveis negativos MAT dos laboratórios referências do Institut Pasteur em Nouméa (IPNC) ou Paris.

[00096] O IPNC e o NRC são laboratórios DIAGNÓSTICOS DE REFERÊNCIA PARA LEPTOSPIROSE. Em Nova caledonia, leptospirose é uma doença notificável. As amostras de soro usadas neste estudo foram selecionadas das coleções de IPONC e NRC de soros expedidas de atividades diagnósticas de rotina e como parte de vigilância de saúde pública. Este biobanco de soros foi declarado para o French Ministry of Research (DC-2010-1222, Collections number 1 e 2). Este estudo foi parte de um protocolo aprovado pelo Institut Pasteur (protocol # RBM2008-16) e o French Minister for Education & Research (protocol # AC-2007-44). Todos os soros foram testados como amostras anônimas. 3.2. Protocolo de bastão de imersão

[00097] A linha controle positiva foi fabricada de IgM humana purificada (MP Biomedicals) em 2 mg/mL. Ambas, linhas controle e teste foram aspergidas como linhas sobre membranas de nitrocelulose. A preparação de bactérias tratada com formalina bruta foi diretamente usada como um antígeno fixado para a linha de teste. Partículas de ouro marcadas com IgM anti-humana cabra (BBI International BA.GAHM40/X) foi usada como a fase móvel de captura para construir bastões de imersão de imuno cromatografia de fluxo vertical de uma etapa, como descrito antes [Chanteau S. et al., PLoS Med., 2006].

[00098] Experimentos preliminares determinaram uma diluição 1/400 de soros em Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS, pH 7,4) como apropriado. Em resumo, tiras foram introduzidas em 200 uL, diluídas em soro em tubos de poliestireno de 5 mL, por 15 minutos. As tiras foram então removidas e colocadas sobre papel de cozinha absorvente e lidas dentro de 5 minutos. Todos os resultados foram anotados usando uma escala de graduação de 0 (nenhum traço visível sobre banda de teste) a 3+ (intensidade da banda de teste igual à intensidade da banda controle). A graduação incluiu um valor "fraco" para traços baixos, mas visíveis sobre a banda teste. Fracos, 1+, 2+ e 3+ foram então considerados positivos para ainda análises e 0 foi considerado como negativo. Todas as tiras foram arquivadas para ainda verificação.

[00099] Todas as análises foram corridas de modo cego: qualquer pessoa envolvida em uma análise particular não teve acesso aos resultados dos outros resultados de testes a partir do mesmo soro. A sensitividade foi avaliada usando 187 soros de casos de leptospirose confirmados com um título recíproco MAT > 400. A especificidade foi avaliada usando 221 soros negativos (142 de Nova caledônia, 79 de França continental): 12 soros positivos IgM de vírus anti-Chikungunya, 58 soros positivos IgM de vírus antidengue de todos os 4 sorotipos, 6 soros positivos Ig total de vírus anti-hepatite A, 7 soros positivos de fator reumatoide, 25 soros positivos de sífilis (TPHA e VDRL), um soro de malária aguda, e 112 soros de doadores de sangue saudáveis. Todos estes 221 soros controles negativos foram testados usando MAT E foram todos negativos (título <100).

[000100] Possível resultado negativo falso devido a alto nível de IgM anti-Leptospira (fenômeno zona) foi controlado usando dois soros positivos com títulos MAT de 25.600 e 51.200, respectivamente. 3.3. Ensaios de Estabilidade

[000101] As tiras foram estocadas a 4oC em folhas de alumínio seladas, e o teste foi realizado em temperatura ambiente de laboratório (20-23oC).

[000102] A vida de prateleira prevista das tiras revestidas foi avaliada através de testes de diluições seriais de um soro positivo MAT (título recíproco de MAT = 800, apontando para soro grupo Icterohaemorrhagiae) duas vezes por semana sobre um período de 3 semanas de exposição das tiras a 60oC. Durante este período, o soro controle positivo foi mantido a 4oC para evitar repetidos ciclos de congelamento - descongelamento. Este processo de estabilidade acelerada é equivalente a dois anos de real tempo de estocagem a 25oC [Banoo et al., Nat. Ver. Microbiol. 2010]. 3.4. Capacidade de reprodução e repetição

[000103] Vários experimentos foram realizados para avaliar a robustez do ensaio de bastão de imersão (capacidade de reprodução e repetição): - simulação de condições de campos tropicais através de modalidade dos testes em paralelo em temperatura ambiente de laboratório e a 37oC em uma incubadora; - teste cegos de um painel de quatro soros (3 positivos e um negativo) através de três operadores diferentes em três dias diferente; - testes cegos de um mesmo soro 14 vezes usando duas diferentes bateladas de tiras pelo mesmo operador. - leitura cega de resultados de tira por dois técnicos sobre 117 soros (28 negativos e 89 amostras positivas), e por três técnicos sobre 97 soros (16 negativas e 81 amostras positivas). 3.5. Cinéticas comparativas de MAT e o ensaio de bastão de imersão da invenção

[000104] A prematuridade de soro conversão de IgM usando MAT ou o ensaio de bastão de imersão da invenção foi avaliada sobre soros seriais (dia 2 a dia 18 após o início de sintomas) a partir de 17 casos confirmados, baseado nos dados de início como declarado pelos pacientes.

[000105] O ensaio de bastão de imersão também foi usado sobre soros iniciais a partir de 99 pacientes confirmados positivos por PCR, mas ainda negativos por MAT (títulos recíprocos = 0,100 ou 200).

[000106] 150 soros positivos MAT de casos prováveis, incluindo 124 soros da coleção IPNC, e 26 do French National Reference Centre, foram testados usando o ensaio de bastão de imersão. 3.6. Comparação com 3 ensaios diagnósticos comerciais

[000107] Para comparar RDT recentemente desenvolvido com técnicas atualmente disponíveis, o desempenho destes dois ensaios foi comparado sobre soros idênticos de Nova Caledônia. Para avaliar a sensitividade, 72 soros positivos MAT de casos confirmados foram selecionados randomicamente dos 118 soros controles de Nova Caledônia. Para a especificidade, 72 controles negativos foram randomicamente selecionados, correspondendo a 10 soros positivos IgM de vírus anti-Chikungunya, 30 doadores de sangue saudáveis, 11 soros positivos IgM de vírus antidengue de todos os 4 sorotipos, 6 soros positivos Ig total de vírus anti-hepatite A, 7 soros positivos para fator reumatoide, 7 soros positivos para sífilis (TPHA e VDRL), um soro de malária aguda. Os resultados usando o ensaio de bastão de imersão da invenção foram comparados com aqueles obtidos usando dois ensaios Elisa (Leptospira IgM ELISA, Panbio, Inverness Medical, QLD Australia, e SERION ELISA classic Lewptospira IgG/IgM, Institut Virion/Serion GmbH, Germany) e um ensaio de mino cromatografia IgM de fluxo lateral (Leptocheck, Zephyr Biomedicals, India). O teste Serion ELISA foi usado junto com o Absorvente de Fator Reumatóide como recomendado pelo fabricante. Todos os testes foram feitos dentro de um período de 5 dias. Para cálculos, os resultados "incertos" de ELISA foram considerados como positivos. 3.7. Análise estatística

[000108] A avaliação do ensaio de bastão de imersão da invenção para o soro diagnóstico de petospirose foi realizada de acordo com o WHO Tropical Diseases Research Diagnostics Evaluation Expert Panel para a avaliação de testes diagnósticos para doenças infecciosas [Banoo et al., Nat. Rev. Microbiol. 2010].

[000109] Sensitividade (Se), especificidade (Sp), valores preditivos positivos e negativos (PPV e NPV, respectivamente) do ensaio de bastão de imersão foram calculados, usando a sorologia MAT referência como o padrão ouro. Ambos os testes foram conduzidos em IPNC. Os intervalos de confiança de 95% (CI 95%) foram calculados usando o processo Wilson.

[000110] As razões de probabilidade (LR) também foram calculadas. A LR positiva (LR+ = Se/[1-Sp]) indica quantas vezes um resultado positivo é mais provável de ser observado em espécimes com a doença alvo do que aqueles sem a doença alvo. A LR negativa (FR- = [1-S]/Sp) indica quantas vezes um resultado negativo é mais provável de ser observado em espécimes com o distúrbio alvo do que naqueles sem o distúrbio-alvo. O teste é mais preciso quanto mais LR difere de 1. LR+ acima de 10 e LR- abaixo de 0,1 foram consideradas evidência diagnóstica convincente [Jaeschke R et al., JAMA 1994]. CIs 95% foram calculados para LR+ e LR- [Simel DL. J. Clin. Epidemiol. 1991].

[000111] A razão de desigualdade de diagnóstico (DOR) mede desempenho de teste através de combinação de resistências de sensitividade e especificidade, com a vantagem de precisão como um indicador único. Estas características conduzem DOR ser particularmente útil para testes de comparação onde quer que o balanço entre taxas de negativo falso e positivo falso não seja de imediata importância [Glas AS. et al., J. Clin. Epidemiol. 2003]. A DOR é definida como a razão das desigualdades de resultados de testes positivos em espécimes com o distúrbio-alvo em relação às desigualdades de resultados de testes positivos em espécimes sem o distúrbio alvo. Ela foi calcu lada como se segue: DOR = (Se / [1 - Se]) / ([1-Sp] / Sp)

[000112] A DOR não depende de predominância e seu valor varia de 0 a infinito, com maiores valores indicando melhor desempenho de teste discriminatório, CIs 95% para valores de DOR foram calculados [Armitage P. et al., Statistical methods in medical research, 1994]. 3.8. Resultados do ensaio de bastão de imersão da invenção a) Especificidade e sensitividade

[000113] Dos 187 soros positivos padrão ouro testados, 168 tiveramum resultado de bastão de imersão positivo. Os sorogrupos putativos dos 19 soros negativos de bastão de imersão foram: Icterohaemorrhagiae (n = 12), Pyrogenes (n = 3), Australis (n = 2), Panama (n = 1) e um não pode ser determinado devido a coaglutinação de múltiplos sorogrupos.

[000114] Dos 221 soros negativos MAT testados, 207 tiveram um resultado negativo de bastão de imersão. Todos os 14 soros positivos com bastão de imersão foram graduados "fraco" e originados de 9 doadores de sangue saudáveis e cinco pacientes positivos para IgM de vírus antidengue.

[000115] A sensitividade e especificidade do ensaio de bastão de imersão da invenção foram por isso, respectivamente, Se = 89,8% [95% CI, 84,7-93,4] e Sp = 93,7% [95% CI, 89,65-96,2]. As razões de probabilidade (LR) foram por isso LR+ = 14,18 [95% CI, 8,52-23,56] e LR- = 0,11 [95%; 0,01-0,17]; e a razão de desigualdade de diagnóstico DOR de 130,74 [95% CI, 63,65-268,52].

[000116] Os valores preditivos positivos e negativos de acordo com predominância são apresentados na Figura 1.

[000117] A ausência de negativo falso devido a fenômeno de zona foi demonstrada usando dois soros positivos com títulos recíprocos de MAT muito altos (25600 e 51200) diluídos serialmente duas vezes (1/400 a 1/6400). b) Estabilidade em temperatura e processo de envelhecimento acelerado para vida em prateleira

[000118] Os resultados com bastão de imersão de 10 soros positivos com MAT corridos a 37oC foram idênticos àqueles corridos a 25oC.

[000119] Diluições seriais de duas vezes (de 1/400 a 1/12800) de um soro positivo com MAT (título 800) foram testadas duas vezes por semana por três semanas com bastão de imersão exposto a 60oC. No dia 1, o título recíproco de bastão de imersão diminuiu para 3200 (uma diluição do soro). c) Capacidade de reprodução

[000120] Um soro testado 14 vezes com tiras das duas diferentes bateladas renderam 14 resultados similares, incluindo o grau.

[000121] Variabilidade interleitores foi avaliada por dois operadores independentes sobre 177 soros (28 negativos e 149 positivos) dos quais 157 soros foram lidos por três operadores independentes. Estas leituras proporcionaram uma excelente concordância interoperador em todos os casos (> 99%), mas um bastão de imersão fracamente positivo a partir de um provável caso foi classificado "fraco" por dois operadores, mas negativo pelo terceiro.

[000122] Variabilidade interoperador também foi avaliada usando 4 soros (bastão de imersão graduado de negativo a +3) testados cega e independentemente em três dias diferentes por três operadores diferentes. Dois operadores proveram resultados de graduação perfeitamente concordantes sobre todos os três testes, o terceiro graduou "fraco" um soro negativo uma vez dos três testes. d) cinéticas comparativas de MAT e RDT Tabela 2

[000123] De 17 casos confirmados analisados (ver T Fabela 2): - um paciente (número 1) soroconvertido para MAT no dia 6 (apontando para Icterohaemorrhagiae), mas permaneceu negativo para o ensaio de bastão de imersão. - opostamente, 5 pacientes confirmados com PCR (números 2-6) foram negativos com MAT enquanto eles foram positivos para o ensaio de bastão de imersão. Para um destes pacientes (número 6), ensaios de PCR e bastão de imersão foram ambos positivos no dia 4 após o início de sintomas. - cinco pacientes (números 7-11) foram positivos pra MAT e o ensaio de bastão de imersão no mesmo dia (dias 5-11 após o início de sintomas).; - por último, para 6 pacientes (números 12-17), o ensaio de bastão de imersão foi positivo antes que o MAT (dia 3 para dia 7). Destes 6, quatro (números 12, 15, 16 e 17) tiveram resultados de PCR de sangue de bastão de imersão positivos no mesmo dia (nos dias 5, 4, 7 e 3, respectivamente).

[000124] Similarmente, em 16 de 99 soros iniciais de pacientes confirmados de Nova Caledônia, o ensaio de bastão de imersão foi positivo enquanto o MAT ainda foi negativo (6 de 62) ou mostrou baixos títulos (título 100para 4 de 21; título 200 para 6 de 16).

[000125] De 150 soros de prováveis casos de leptospirose (soros únicos com um MAT > 400), 109 renderam um resultado positivo usando o ensaio de bastão de imersão da invenção, correspondendo a uma concordância de 72,7% [65-79,1].

[000126] Destes, 108 tiveram um MAT > 400, dos quais 81 (75% [66,1-82,2]) foram positivos para o ensaio de bastão de imersão da invenção, enquanto 63 tiveram um título MAT > 800, dos quais 53 (84,1% [73,291,1]) foram positivos para o ensaio de bastão de imersão da invenção.

[000127] O uso de 72 espécimes de soro positivos padrão ouro (MAT > 400 de casos confirmados) e 72 negativos (MAT < 100) selecionados randomicamente permitiu uma comparação do ensaio de bastão de imersão da invenção com três testes comercialmente disponíveis: dois testes ELISA e um ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral de IgM.

[000128] Os resultados destes testes são detalhados na Tabela 3. Tabela 3

NA: não aplicável *LR+: razão de probabilidade positiva - [CI 95%] tLR: razão de probabilidade negativa - [CI 95%] tDOR: razão de desigualdade de diagnóstico- [CI 95%]

[000129] Sensitividade (%), número de testes diagnósticos rápidos positivos entre pacientes com evidência sorológica (MAT) de leptospirose (n = 72) - [CI 95%].

[000130] Especificidade (%), teste diagnóstico rápido negativo entre amostras de soro de pacientes sem evidência sorológica (MAT) de leptospirose (n = 72) - [CI 95%].

[000131] O ELISA IgM de Panbio teve 100% de especificidade sobre estes espécimes junto com a mais baixa sensitividade (75%). Esta especificidade de 100% não permite o cálculo de uma Razão de Desigualdade de Diagnóstico (DOR) que pode, entretanto, ser muito alta. O teste ELISA de Serion teve ambas, uma boa sensitividade (91,7%) e uma boa especificidade (81,9%), por isso mostrando uma boa DOR de 49,9. Um outro teste de diagnóstico rápido, por exemplo Leptocheck (de Zephyr) teve uma sensitividade muito boa (91,2%) mas uma especificidade bem baixa (52,8%), rendendo uma DOR de 39,1. O ensaio de bastão de imersão da invenção mostrou uma especificidade muito boa (95,8%) e uma boa sensitividade (81,9%) e por isso teve uma DOR muito boa de 104,4. As correspondentes curvas de valores preditivos de acordo com predominância dos dois testes rápidos de IgM sobre estes espécimes são comparadas na figura 2.

[000132] Quando considerando a necessidade de RDT para diagnóstico ao lado do leito, a comparação do ensaio de bastão de imersão da invenção com ensaios que são comercialmente disponíveis mostra que o ensaio de bastão de imersão da invenção tem uma menor sensitividade (81,9% versus 97,2%), porém uma muito maior especificidade (95,8% versus 52,8%) e por isso uma melhor Razão de Desigualdade de Diagnóstico (104,4 versus 39,1). Esta melhor performance também é mostrada através de comparação das curvas de seus valores preditivos de acordo com predominância (Figura 2).

[000133] Importantemente, somente soros de casos confirmados de leptospirose foram usados para esta avaliação. Por isso, as amostras positivas para a avaliação de sensitividade foram ambas, positivo Padrão Ouro (um título recíproco MAT de pelo menos 400) e de casos confirmados de leptospirose (tanto uma PCR positiva ou uma soroconversão a partir de nil para > 400 ou uma elevação de > 4-vezes em títulos recíprocos de MAT em soros emparelhados). Adicionalmente, todos os soros negativos para avaliação de especificidade foram testados cegamente usando o MAT referência e somente foram considerados como negativos verdadeiros se o título recíproco MAT estava abaixo de 100. Estes últimos originados de ambos, voluntários saudáveis e uma seleção de pacientes com condições patológicas de relevância em países endêmicos. Uso disto definiu claramente definição de caso, a sensitividade e especificidade do ensaio de bastão de imersão da invenção foram 89,8% e 93,7% respectivamente. Estes resultados comparam e são levemente melhores que aqueles reportados por Smits et al. que reportaram uma sensitividade de 85,8% e uma especificidade de 93,6% com um outro ensaio de bastão de imersão (Smits HI, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2001). Para aumentar a energia estatística desta avaliação, foram incluídos amostras de soro tão velhas como 3 anos e 3 meses de Nova Caledônia, estocadas congeladas a -20oC. É bem reconhecido que a estocagem de longo termo de espécimes de soro a -20oC e seu congelamento / descongelamento podem resultar em uma queda de títulos IgM. Realmente, a sensitividade foi maior em soros estocados por menos que dois anos que em soros estocados por mais que dois anos (90,6% versus 81,5%). Isto pode ter resultado em uma leve subestimativa da sensitividade do ensaio de bastão de imersão da invenção.

[000134] Importantemente, o ensaio de bastão de imersão da invenção reage com anticorpos para pelo menos sorogrupos Australis, Autumnalis, Ballum, Bataviae, Canicola, Cynopteri, Grippotyphosa, Hebdomadis, Ictterohaemorrhagiae, Panama, Pomona, Pyrogenes, Sejroe e Tarassovi, indicando que o ensaio reage amplamente com anticorpos montados contra linhagens Leptospira circulando em todo mundo.

[000135] Os resultados demonstram que o teste diagnóstico da invenção é útil em contextos endêmicos, especialmente em países de baixa e média renda. Realmente, a maior parte da carga de leptospirose ocorre em país atrasado com retardado acesso ao laboratório de referência. Em situações epidêmicas, especialmente durante períodos após desastre como nas Filipinas em 2009, testes diagnósticos de referência são raramente, se alguma vez, disponíveis. Por isso, um teste diagnóstico com bons desempenhos diagnósticos também pode ser particularmente útil. o uso do ensaio de bastão de imersão da invenção como uma seleção inicial para infecções de leptospirose pode permitir facilitação de dificuldade de diagnóstico diferencial de leptospirose.

Claims (18)

1. Processo in vitro para diagnóstico de uma infecção por Leptospira em uma amostra biológica de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de contato da referida amostra com células bacterianas de sorovar Hurstbridge de Leptospira fainei, ou uma fração antigênica das referidas células bacterianas, em que a referida infecção não é devida a bactérias pertencendo ao referido sorovar, e em que as referidas células bacterianas foram inativadas com um tratamento térmico.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas células bacterianas também foram tratadas com um agente de inativação químico.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida infecção de leptospirose é devido a bactérias pertencendo a um ou mais de sorogrupo Australis, Autumnalis, Ballum, Bataviae, Canicola, Cynopteri, Grippotyphosa, Hebdomadis, Icterohaemorrhagiae, Panama, Pomona, Pyrogenes, Sejroe ou Tarassovi.

4. Processo de acordo com qualquer uma de reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é um ensaio ELISA ou um ensaio de bastão de imersão.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a referida fração antigênica é selecionada dentre o grupo consistindo em: LPS, proteínas citoplásmicas, proteínas secretadas, e proteínas de membrana de envelope, e é preferivelmente LPS.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido tratamento térmico é realizado pela submissão de bactérias vivas por 10 minutos a uma temperatura compreendida entre 60oC e 150oC, preferencialmente entre 90°C e 110°C.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de detectar imunoglobulinas humanas ligadas às bactérias inativadas imobilizadas ou frações das mesmas com um agente de revelação sendo um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, na forma de um imunoconjugado ou marcado.

8. Kit para diagnóstico de uma infecção de leptospirose em uma amostra biológica de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende um suporte sólido revestido com células bacterianas inativadas da espécie Leptospira fainei, ou frações antigênicas das referidas células bacterianas, e um agente de revelação.

9. Kit de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma amostra controle que também é reconhecida pelo referido agente de revelação.

10. Kit de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o referido suporte é uma placa de microtitulação ou uma membrana de nitrocelulose.

11. Uso in vitro de células bacterianas inativadas do sorovar Hurstbridge de Leptospira fainei que foram inativadas com um tratamento térmico ou de frações antigênicas das referidas células bacterianas, caracterizado pelo fato de que é para diagnosticar leptospirose em um indivíduo em necessidade do mesmo, em que a referida infecção por leptospirose não é devida a bactérias pertencentes ao referido sorovar.

12. Uso diagnóstico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que usa ainda, como agente revelador, um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, na forma de um imunoconjugado ou marcado.

13. Uso diagnóstico da reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que usa ainda uma amostra controle que pode ser reconhecida pelo referido agente revelador.

14. Uso diagnóstico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que as referidas células bacterianas ou as referidas frações antigênicas são revestidas em um suporte sólido.

15. Uso diagnóstico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o referido suporte é uma placa de microtitulação ou uma membrana de nitrocelulose.

16. Uso diagnóstico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizado pelo fato de que o referido tratamento térmico foi realizado submetendo bactérias vivas por 10 minutos a uma temperatura compreendida entre 60°C e 150°C.

17. Uso diagnóstico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 16, caracterizado pelo fato de que o referido tratamento térmico foi realizado submetendo bactérias vivas por 10 minutos a uma temperatura compreendida entre 90°C e 110°C.

18. Uso diagnóstico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17, caracterizado pelo fato de que as referidas bactérias inativadas também foram tratadas com um agente químico.

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