BR112014031261B1

BR112014031261B1 - Composição de caldo de fermentação, método para o controle de contaminação bacteriana, método para a produção de etanol e método para o aprimoramento do crescimento de células de zymomonas

Info

Publication number: BR112014031261B1
Application number: BR112014031261-3A
Authority: BR
Inventors: Maria C. Leana; Brian G. Lefebvre
Original assignee: E.I. Du Pont De Nemours And Company
Priority date: 2012-06-15
Filing date: 2013-06-10
Publication date: 2021-11-23
Also published as: AU2013274537B2; US20140099689A1; WO2013188262A1; ES2610402T3; AU2013274537A1; CN104364383A; US8697426B2; CA2875991A1; BR112014031261A2; PL2861747T3; HUE031193T2; US8722373B2; US20130337522A1; EP2861747B1; JP2015519078A; EP2861747A1

Abstract

composição de caldo de fermentação, método para o controle de contaminação bacteriana, método para a produção de etanol e método para o aprimoramento do crescimento de células de zymomonas. a presente invenção se refere à contaminação que foi controlada nas fermentações que utilizam a zymomonas mobilis como o biocatalisador, sem o impacto negativo na produção de fermentação, através da adição de virginiamicina. descobriu-se que a concentração eficaz de virginiamicina é dependente do tipo do meio de fermentação utilizado.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001]A presente invenção se refere aos campos de microbiologia e de fermentação. Mais especificamente, os métodos foram desenvolvidos para o controle dos contaminantes de fermentações em que a Zymomonas é utilizada como o biocatalisador.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O etanol combustível produzido a partir de recursos renováveis é uma das soluções a longo prazo para a escassez mundial de combustíveis fósseis, o aumento dos custos de energia, e os efeitos do aquecimento global relacionados ao aumento de dióxido de carbono atmosférico. O etanol combustível, a partir de recursos renováveis, é produzido através da fermentação de açúcares utilizando um biocatalisador. A levedura atual é o biocatalisador mais amplamente utilizado para a produção do etanol. Os açúcares fermentáveis normalmente são obtidos a partir de biomateriais processados, incluindo os grãos de milho, beterraba de açúcar e cana de açúcar. Uma fonte de açúcar de biomaterial abundante alternativa é a biomassa celulósica ou lignocelulósica. Estão sendo desenvolvidos métodos para o processamento da biomassa celulósica ou lignocelulósica para a produção dos açúcares fermentáveis utilizando os tratamentos físicos, químicos e/ou enzimáticos.

[003] É difícil manter a esterilidade em um processo de fermentação em larga escala, particularmente quando o biomaterial é utilizado como como uma fonte de carboidratos. Os processos de fermentação em larga escala, normalmente são contaminadas com bactérias que podem ser provenientes do biomaterial processado, equipamentos, água de processamento ou de outras fontes. As bactérias contaminantes típicas são as bactérias do ácido lático (LAB), tais como as espécies de Lactobacillus. As bactérias contaminantes reduzem o rendimento do produto de fermentação, através da utilização dos açúcares, e reduzem a eficácia do biocatalisador do produto primário. As bactérias contaminantes produzem os produtos indesejados, tais como o ácido acético e lático que aumentam as condições de tensão na cultura ocasionando um crescimento inferior do biocatalisador e/ou menor produção do produto biocatalisador.

[004]As bactérias contaminantes, predominantemente as bactérias do ácido lático, são um problema nas fermentações que utilizam a levedura como o biocatalisador, normalmente com o mosto ou melaço que serviu como fonte de carboidratos para a produção do etanol para o combustível ou cervejeiro. Devido às diferenças de sensibilidades de levedura e bactérias contaminantes para alguns antimicrobianos, uma série de agentes antimicrobianos pode ser utilizada para o controle das bactérias nas fermentações de levedura. Os antimicrobianos utilizados com sucesso nas fermentações de leveduras para o controle da contaminação LAB incluem a penicilina (Day et al., (1954) Agricultural and Food Chemistry. 2: 252258)., virginiamicina (Hynes et al., (1997) J. of Industrial Microbiology & Biotechnology 18: 284-291; Bischoff et al., (2009) Biotechnology and Bioengineering 103: 117-122; publicação WO 2007/145857), ácidos de lúpulo (patente US 2009/0.042.276), FermaSureTM, bem como a eritromicina, a tilosina, e a tetraciclina.

[005]A Zymomonas está sendo desenvolvida como um biocatalisador eficaz para a produção do etanol através da manipulação dos aprimoramentos da cepa, incluindo a utilização de xilose e arabinose em adição à glicose, e inativação das vias metabólicas competidoras. Além disso, a Zymomonas foi adaptada para a utilização no hidrolisado por meio de fermentação através do aumento da tolerância aos inibidores presentes no hidrolisado da biomassa celulósica. No entanto, a utilização da Zymomonas como um biocatalisador para a fermentação de etanol apresenta desafios adicionais no controle de contaminação uma vez que este biocatalisador é uma bactéria, assim como são os contaminantes mais predominantes.

[006]As concentrações de muitos antibióticos que são seguras para a utilização com a levedura são inibidoras do crescimento da cepa Zymomonas mobilis ZM4, incluindo a tetraciclina, canamicina, polimixina e estreptomicina (Agrawan and Basappa, Biotechnology Letters (1996) 18: 673-678). Apenas a penicilina G mostrou ser segura para a utilização com a Zymomonas. A penicilina de benzila foi utilizada com sucesso para o controle da contaminação bacteriana na fermentação em batelada da Zymomonas mobilis para a produção do etanol (Grote e Rogers, Journal of Fermentation Technology (1985) 63: 287-290). Em outra revisão a Zymomonas foi descrita como um contaminante de cidra e cerveja, e foram descobertas as cepas de Zymomonas com resistência aos níveis normalmente utilizados de alguns antibióticos, incluindo a canamicina, polimixina, e estreptomicina (Swings and De Ley, Bacteriological Reviews (1977) 41: 1-46). As diferenças entre as cepas podem estar relacionadas com a codificação da resistência nos plasmídeos, como foi descoberto para a estreptomicina, canamicina, gentamicina e na cepa Z. mobilis CP4 (Walia et al., 1984) Applied and Environmental Microbiology 47: 198-200).

[007] Continua a existir uma necessidade de métodos para o controle dos contaminantes bacterianos nas fermentações que utilizam um biocatalisador bacteriano de Zymomonas que foi desenvolvido para a produção do etanol.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[008] A presente invenção se refere às composições e métodos de caldo de fermentação para o controle da contaminação bacteriana nos meios em que a Zymomonas é o biocatalisador.

[009] Consequentemente, a presente invenção se refere a uma composição de caldo de fermentação que compreende: (a) o meio de fermentação; (b) a virginiamicina; e (d) uma população crescente de células de Zymomonas.

[010] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para o controle da contaminação bacteriana em uma fermentação utilizando um biocatalisador Zymomonas que compreende: (a) o fornecimento de um meio de fermentação; (b) a adição de virginiamicina ao meio de fermentação; (c) a adição de um inóculo de células de Zymomonas ao meio de fermentação, por conseguinte, produzindo um caldo de fermentação; e (d) a manutenção do caldo de fermentação, sob condições adequadas para o crescimento das células de Zymomonas; em que as etapas (b) e (c) podem ser realizadas em qualquer ordem ou simultaneamente, e em que a contaminação bacteriana é controlada.

[011] Em uma realização, o etanol é produzido no caldo de fermentação do presente método.

[012] Em ainda outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para a produção do etanol que compreende: (a) o fornecimento de um meio de fermentação; (b) a adição de um inóculo de células de Zymomonas ao meio de fermentação cultivado na presença de virginiamicina para a produção de um caldo de fermentação; e (c) a manutenção do caldo de fermentação, sob condições adequadas para o crescimento das células de Zymomonas e a produção do etanol através das células de Zymomonas; em que o etanol é produzido.

[013] Em ainda outro aspecto, a presente invenção se refere um método para o aprimoramento do crescimento de células de Zymomonas que compreende cultivar células de Zymomonas em meio de fermentação que compreende a virginiamicina.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[014] A Figura 1 mostra um diagrama da via de fermentação do etanol da Zymomonas manipulada para a utilização da xilose.

[015]A Figura 2 é um gráfico que mostra o crescimento da cepa Z. mobilis ZW705 no hidrolisado# 3 MD07 clarificado suplementado com 2 g/L de extrato de levedura e Lactrol®, Lactoside VTM, ou Lactoside 247TM em diferentes concentrações, e um controle.

[016]A Figura 3 mostra os gráficos da concentração de ácido lático (A) ou etanol (B) nas culturas inicialmente inoculadas com uma proporção de 1:100 de Lactobacillus plantarum: cepa Z. mobilis ZW705, em um meio definido com (F1068) ou sem (F1067) 2 ppm de Lactrol®.

[017]A Figura 4 mostra um gráfico da utilização de glicose nas culturas inicialmente inoculadas com uma proporção de 1:100 de Lactobacillus plantarum: cepa Z. mobilis ZW705, em um meio definido com (F1068) ou sem (F1067) 2 ppm de Lactrol®.

[018]A Figura 5 mostra os gráficos da concentração de ácido lático (A) ou etanol (B), em um meio hidrolisado inoculado com uma cultura de sementes inicialmente contaminadas com uma proporção de 1:100 de L. plantarum: cepa Z. mobilis ZW705 e cultivadas em meio sem a virginiamicina (F1069) ou cultivadas em meio que contém 2 ppm de Lactrol® (F1070).

[019]A Figura 6 mostra os gráficos de utilização da glicose (A) e xilose (B) no meio hidrolisado inoculado com uma cultura de sementes inicialmente contaminadas com uma proporção de 1:100 de L. plantarum: cepa Z. mobilis ZW705 e cultivadas em meio sem a virginiamicina (F1069) ou cultivadas em meio que contém 2 ppm de Lactrol® (F1070).

[020]A Figura 7 mostra os gráficos da concentração de ácido lático (A) ou etanol (B), nas culturas cultivadas em meio hidrolisado que contém diferentes concentrações de Lactrol®, que foram inoculadas com uma cultura de sementes inicialmente contaminadas com uma proporção de 1:100 de L. plantarum: cepa Z. mobilis ZW705 e cultivados sem a virginiamicina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[021] A presente invenção se refere à utilização de um agente antimicrobiano para o controle das bactérias contaminantes nas fermentações que utilizam a Zymomonas como o biocatalisador, tal como para a produção do etanol. A constatação de que a virginiamicina é segura para as células de Zymomonas enquanto efetivamente controla as bactérias contaminantes permite a sua utilização nas fermentações em que Zymomonas é o biocatalisador. Em particular, descobriu-se que os elevados níveis de virginiamicina, que são mais elevados que os níveis normalmente utilizados nas fermentações para a produção do etanol através da levedura são necessários para o controle eficaz das bactérias contaminantes nos meios de fermentação que contêm o hidrolisado de biomassa celulósica. Os níveis elevados podem ser utilizados nas fermentações de Zymomonas sem nenhuma redução na produção do etanol. A produção eficiente de etanol a partir dos recursos renováveis, tal como o hidrolisado da biomassa celulósica, para a utilização como aditivo de combustível irá abordar a escassez dos combustíveis fósseis, redução dos custos de energia e o impacto do aquecimento global.

[022]As seguintes definições e abreviações devem ser utilizadas para a interpretação das reivindicações e da especificação.

[023] Conforme utilizados no presente, os termos “compreende”, “que compreendem”, “inclui”, “incluindo”, “possui”, “possuindo”, “contém” ou “que contém”, ou qualquer outra variação do mesmo, pretendem abrangem uma inclusão não exclusiva. Por exemplo, uma composição, mistura, processo, método, artigo ou equipamento que compreende uma lista de elementos não está necessariamente limitado a apenas esses elementos, mas pode incluir outros elementos que não estejam expressamente listados ou sejam inerentes a essa composição, mistura, processo, método, artigo ou equipamento. Além disso, salvo expressamente indicado em contrário, “ou” se refere a uma inclusão e não a uma exclusão. Por exemplo, uma condição A ou B é satisfeita por qualquer uma das seguintes opções: A é verdadeiro (ou presente) e B é falso (ou não presente), A é falso (ou não presente) e B é verdadeiro (ou presente), e ambos A e B são verdadeiros (ou presentes).

[024]Além disso, os artigos indefinidos “um” e “uma” que precedem um elemento ou componente da presente invenção pretendem ser não restritivos em relação ao número de casos (isto é, as ocorrências) do elemento ou componente. Por conseguinte, “um” ou “uma” deve ser lido incluindo um ou pelo menos um, e a forma da palavra singular do elemento ou componente também inclui o plural, a menos que o número obviamente signifique o singular.

[025] O termo “invenção” ou “presente invenção”, conforme utilizado no presente é um termo não limitante e não pretende se referir a qualquer realização singular da invenção especificada, mas engloba todas as possíveis realizações conforme descritas na presente invenção e nas reivindicações.

[026] Conforme utilizado no presente, o termo “cerca de”, que modifica a quantidade de um ingrediente ou reagente da presente invenção, se refere à variação na quantidade numérica que pode ocorrer, por exemplo, através da medição típica e dos procedimentos para a manipulação de líquidos utilizada na fabricação de concentrados ou da utilização de soluções na prática, através do erro involuntário nestes procedimentos; através de diferenças de fabricação, fonte ou grau de pureza dos ingredientes utilizados para a produção das composições ou realização dos métodos; e similares. O termo “cerca de” também engloba as quantidades que diferem devido a diferentes condições de equilíbrio para uma composição resultante de uma determinada mistura inicial. Sejam ou não alteradas pelo termo “cerca de”, as reivindicações incluem equivalentes para as quantidades. Em uma realização, o termo “cerca de” significa dentro de 10% do valor numérico relatado, de preferência, dentro de 5% do valor numérico relatado.

[027] O termo “produção do etanol” se refere a um organismo que produz o etanol através do metabolismo de fontes de carboidratos.

[028] O termo “açúcar(es) fermentável(is)” se refere aos oligossacarídeos e monossacarídeos que podem ser utilizados como uma fonte de carbono através de um microrganismo em um processo de fermentação.

[029] O termo “sacarificação e fermentação simultâneas (SSF)” se refere a um processo em que a biomassa é sacarificada e os açúcares fermentáveis produzidos a partir de sacarificação são utilizados através de um biocatalisador para a produção de um produto, ao mesmo tempo, normalmente no mesmo recipiente de reação.

[030] O termo “celulose” se refere a uma composição que compreende a celulose e os componentes adicionais, que podem incluir a hemicelulose e lignina.

[031] O termo “lignocelulósico” se refere a uma composição que compreende a lignina e a celulose. O material lignocelulósico também pode compreender a hemicelulose.

[032] O termo “sacarificação” se refere à produção de açúcares fermentáveis a partir de polissacarídeos.

[033] O termo “biomaterial” se refere a qualquer material derivado biológico que é uma fonte de carboidratos que pode ser utilizado na fermentação através de um biocatalisador. O biomaterial inclui a biomassa celulósica, bem como outros materiais de vegetais e materiais derivados de vegetais utilizados como fontes de carboidratos tais como os grãos, mosto, melaço, e sumo bruto (tal como a partir da beterraba de açúcar e da cana de açúcar).

[034] O termo “biomassa pré-tratada” significa uma biomassa que foi submetida ao pré-tratamento antes da sacarificação.

[035] O termo “biomassa celulósica” se refere a qualquer material celulósico ou lignocelulósico e inclui os materiais que compreendem a celulose e, opcionalmente, que ainda compreende a celulose, hemicelulose, lignina, amido, oligossacarídeos e/ou monossacarídeos. A biomassa celulósica também pode compreender os componentes adicionais, tais como a proteína e/ou lipídio. A biomassa celulósica pode ser derivada a partir de uma única fonte, ou a biomassa pode compreender uma mistura derivada de mais de uma fonte; por exemplo, a biomassa poderia compreender uma mistura dos sabugos de milho e forragem de milho ou uma mistura de grama e folhas. A biomassa celulósica inclui, mas não está limitada às culturas bioenergéticas, resíduos agrícolas, resíduos sólidos municipais, resíduos sólidos industriais, lodo da fabricação de papel, resíduos de jardim, resíduos de madeira e de silvicultura. Os exemplos de biomassa incluem, mas não estão limitados aos sabugos de milho, resíduos de plantação, tais como as cascas de milho, forragem de milho, gramíneas, trigo, palha de trigo, palha de cevada, feno, palha de arroz, gramíneas do gênero Panicum (switchgrass), fronda da palma, cachos de fruto de palma vazio, resíduos de papel, bagaço da cana de açúcar, material de celulose vegetal do sorgo ou soja e, componentes celulósicos obtidos a partir processamento de grãos, árvores, galhos, raízes, folhas, aparas de madeira, serragem, arbusto e moitas, vegetais, frutas, flores e esterco animal.

[036] O termo “hidrolisado de biomassa celulósica” se refere ao produto resultante a partir da sacarificação da biomassa celulósica ou lignocelulósica. A biomassa também pode ser pré-tratada antes da sacarificação. O hidrolisado de biomassa celulósica é um produto que contém os sólidos de biomassa.

[037] O termo “hidrolisado clarificado de biomassa celulósica” ou “hidrolisado claro de biomassa celulósica” se refere a um hidrolisado de biomassa celulósica, que foi processado para remover os sólidos e não é considerado para ser um hidrolisado de biomassa celulósica. Além disso, qualquer preparação que contenha os açúcares derivados da biomassa celulósica.

[038] O termo “enzima de sacarificação” se refere a uma enzima que pode catalisar a conversão de um componente de biomassa em açúcares fermentáveis. Normalmente, a enzima é mais eficaz quando a biomassa é pré- tratada.

[039] O termo “contaminação substancial” se refere a um nível de contaminação por bactérias do ácido lático em um caldo de fermentação, que iria produzir uma quantidade superior que cerca do meio definido de ácido lático se o caldo de fermentação fosse incubado, sem um agente antimicrobiano durante cerca de 40 horas.

[040] O termo “bactéria do ácido lático” se refere às bactérias que produzem o ácido lático como o produto final metabólico principal da fermentação de carboidratos. As bactérias do ácido lático (LAB) são as bactérias gram positivas que pertencentes à ordem Lactobacillales, e incluem, por exemplo, os genêros Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus, Pediococcus, Streptococcus, e Enterococcus.

[041] O termo “meio de fermentação” se refere a uma composição que compreende os componentes, tais como os nutrientes, que suportam o crescimento de um microrganismo utilizado como um biocatalisador. O meio de fermentação pode ser utilizado em qualquer tamanho, incluindo as fermentações de produção de culturas de pequena escala e larga escala.

[042] O termo “caldo de fermentação” se refere a uma composição que compreende o meio de fermentação e as células do biocatalisador em que a fermentação está ocorrendo ou ocorreu. Dependendo do tempo que o biocatalisador está sendo cultivado no caldo de fermentação, este caldo também pode incluir o produto produzido através do biocatalisador, tal como o etanol.

[043] O termo “cultura de semente” é uma cultura de células do biocatalisador que é utilizada para inocular um volume maior do meio de fermentação para a produção de um caldo de fermentação. Normalmente, uma cultura de inóculo de sementes é de cerca de 0,01% a 20% v/v do volume final do caldo de fermentação.

[044] O termo “contaminação” se refere à presença de microrganismos que não são intencionalmente introduzidos. Normalmente um biocatalisador desejado, é introduzido em um meio de crescimento para a produção de um caldo de fermentação. Os microrganismos presentes no caldo de fermentação diferentes do biocatalisador introduzido são considerados contaminação.

[045] O presente método fornece um controle de bactérias indesejadas nas culturas em que uma bactéria Zymomonas é o biocatalisador, tal como na fermentação para a produção do etanol. As bactérias contaminantes indesejadas normalmente estão presentes nos processos em larga escala, particularmente quando os meios contêm o biomaterial processado. O biomaterial processado utilizado nos meios podem incluir as fontes de carboidratos, tal como o milho ou mosto de trigo, melaço de beterraba de açúcar ou de cana de açúcar, e hidrolisado de biomassa celulósica ou lignocelulósica. As bactérias contaminantes podem ser introduzidas em um processo de fermentação a partir dos biomateriais, equipamento do processo, culturas de inoculação, água de processamento, ar, ou outras fontes. O controle da contaminação em uma fermentação de produção normalmente permite que o biocatalisador cresça e produza o produto para um nível mais elevado que o obtido na presença de contaminação de bactérias, fornecendo um processo de fermentação mais eficiente e econômico.

AGENTE ANTIMICROBIANO PARA AS FERMENTAÇÕES DE ZYMOMONAS

[046] Uma vez que a Zymomonas é uma bactéria, para um agente antimicrobiano ser utilizado nas fermentações Zymomonas, ele deve seletivamente visar as bactérias contaminantes, não afetando as bactérias Zymomonas. As bactérias contaminantes predominantes nas fermentações em larga escala, utilizando as fontes de carboidratos derivados do biomaterial são as bactérias do ácido lático (LAB), tais como as cepas de Lactobacillus. As LAB são as bactérias gram positivas, enquanto que a Zymomonas é gram negativa. O desafio, por conseguinte, foi identificar um agente antimicrobiano que controla a LAB nos meios de fermentação, sem o impacto negativo sobre o crescimento e produção do etanol das células de Zymomonas. Outras bactérias contaminantes, além de LAB, podem ser controladas por este tipo de agente antimicrobiano.

[047] O presente método utiliza a virginiamicina como o agente antimicrobiano seletivo nas fermentações Zymomonas. Descobriu-se no presente que a virginiamicina é segura para a utilização para o controle da contaminação nas culturas de Zymomonas. A virginiamicina é produzida por Streptomyces virginiae e está comercialmente disponível em diferentes preparações, tais como Lactrol® (Phibro; Ridgefield Park, NJ) e Lactosido VTM (Lallemand Ethanol Tecnologia; Milwaukee, WI). O Lactrol® é recomendado para a utilização nas fermentações de etanol, em que a levedura é o biocatalisador em de 0,25 partes por milhão (ppm) a 2,0 ppm, com 0,5 ppm sendo mais utilizado. As instruções do fabricante indicam que a dosagem não deverá exceder 6,0 ppm durante a fermentação. As especificações de Lactrol® indicam que a preparação é de 100% de atividade, indicando que 2 ppm de Lactrol® é equivalente a 2 ppm de virginiamicina. O Lactosido VTM é recomendado para a utilização nas fermentações alcoólicas, em que a levedura é o biocatalisador em de 0,1 ppm para 3,0 ppm. Além disso, Lactosido 247TM (Lallemand Tecnologia Etanol; Milwaukee, WI) contém a virginiamicina que é combinada com a penicilina G. As instruções do fabricante recomenda a utilização do etanol nas fermentações em que a levedura é o biocatalisador em de 1 a 2 ppm, com taxas mais elevadas potencialmente necessárias para as infecções graves.

[048] Em um aspecto, no presente método, a virginiamicina e um inóculo de células de Zymomonas são adicionados a um meio de fermentação de produção de um caldo de fermentação, que é mantido sob condições adequadas para o crescimento das células de Zymomonas. A virginiamicina e o inóculo podem ser adicionados ao meio em qualquer ordem, ou simultaneamente. As presentes composições de caldo de fermentação compreendem o meio de fermentação, a virginiamicina, e uma população crescente de células de Zymomonas conforme descrito abaixo. Uma vez que o meio de fermentação é inoculado com as células de Zymomonas tais como as células de um estoque de congelador, células recuperadas a partir de um estoque de congelador, ou células de uma cultura de sementes, as células de Zymomonas crescem formando uma população crescente de células de Zymomonas.

[049] O meio de fermentação pode ser de qualquer tipo que suporta o crescimento e produção das células de Zymomonas. Um técnico do assunto saberá como preparar qualquer um dos tipos dos meios descritos, tendo em conta as informações abaixo. Em uma realização, o meio de fermentação é um meio definido. Este meio contém os componentes adquiridos típicos incluindo uma fonte de carboidratos, tal como a glicose, uma fonte de aminoácidos e outros nutrientes, tal como o extrato de levedura, e outros componentes que podem incluir os elementos de vestígio, nitrogênio e fósforo, tais como o KH2PO4 e MgSO4. O meio definido muitas vezes é utilizado para o cultivo de culturas em escala laboratorial, bem como as culturas de sementes que são utilizadas como o inóculo para as fermentações em larga escala.

[050] Em uma outra realização, o meio de fermentação contém os açúcares obtidos a partir dos materiais não celulósicos, tais como o mosto, sumos bruto, ou melaço. Estes açúcares são preparados a partir dos biomateriais, tais como os grãos de cereais (tais como o milho, trigo, cevada, e centeio), e as culturas de açúcar, tais como a beterraba do açúcar e a cana de açúcar. O mosto hidrolisado utilizado para a fermentação é produzido a partir dos grãos de cereais, normalmente através do aquecimento a uma temperatura acima da temperatura de gelatinação, tratando com a alfa-amilase para a liquefação e sacarificação, utilizando as enzimas tal como a glucoamilase. O melaço ou sumo bruto a partir de beterraba de açúcar e da cana de açúcar pode ser utilizado como fonte de açúcar no meio de fermentação. Este tipo de fonte de açúcar é uma fonte de açúcar do biomaterial não celulósico (celulósico inclui o lignocelulósico), uma vez que a fonte de açúcar principalmente é o amido ou sumo de açúcar. Este tipo de fonte de açúcar normalmente é utilizado nas culturas de sementes e na produção do etanol a partir de levedura como um biocatalisador, e outras fermentações não celulósicos em grandes escala.

[051] Os meios definidos e meios que possuem um açúcar a partir de uma fonte não celulósica não possuem o hidrolisado de biomassa celulósico (incluindo o lignocelulósico). Além disso, os meios que contêm uma fonte de açúcar, que é obtida a partir da biomassa celulósica, e é altamente purificada para remover outros componentes celulósicos, tais como os sólidos, são considerados como sendo o meio que não contém o hidrolisado de biomassa celulósica. Este tipo de meio contém um hidrolisado clarificado de biomassa celulósica.

[052] Em ainda outra realização, o meio de fermentação contém o hidrolisado de biomassa celulósica preparado a partir dos biomateriais da celulose (incluindo a lignocelulósica). O hidrolisado de biomassa celulósica contém os sólidos de biomassa. O hidrolisado de biomassa celulósica é produzido através da sacarificação da biomassa celulósica (incluindo a lignocelulósica). Normalmente, a biomassa é pré-tratada antes da sacarificação. A biomassa pode ser tratada através de qualquer método conhecido por um técnico do assunto para a produção dos açúcares fermentáveis em um hidrolisado. Normalmente, a biomassa é pré-tratada utilizando os tratamentos físicos e/ou químicos, e sacarificada enzimaticamente. Os tratamentos físicos e químicos incluem, mas não estão limitados à trituração, moagem, corte, tratamento base tal como com a amônia ou com o NaOH, e/ou tratamento com o ácido. Particularmente útil, é um pré-tratamento com baixo teor de amônia em que a biomassa é colocada em contato com uma solução aquosa que compreende a amônia para a formação de uma mistura de biomassa - amônia aquosa em que a concentração de amônia é suficiente para manter o pH alcalino da mistura de biomassa - amônia aquosa, mas é inferior a cerca de 12% em peso em relação ao peso seco da biomassa, e em que o peso seco da biomassa é, pelo menos, cerca de 15% em peso dos sólidos em relação ao peso da mistura de biomassa - amônia aquosa, conforme descrito na patente de propriedade comum US 2007/0.031.918 A1, que é incorporado no presente como referência.

[053]A sacarificação enzimática normalmente utiliza um consórcio de enzimas para romper a celulose e/ou hemicelulose e para a produção de um hidrolisado que contém os açúcares incluindo a glicose, xilose e arabinose. As enzimas sacarificadas são revistas em Lynd, L.R., et al., (Microbiol. Mol. Biol. Rev., 66:506-577, 2002). Pelo menos, uma enzima é utilizada e, normalmente, uma mistura de enzimas de sacarificação é utilizada que inclui uma ou mais glicosidases. As glicosidases hidrolisam as ligações de éter de di-, oligo- e polissacarídeos e são encontradas na classificação da enzima EC 3.2.1.x (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego, Califórnia, com Suplemento 1 (1993), Suplemento 2 (1994), Suplemento 3 (1995, Suplemento 4 (1997) e Suplemento 5 [na Eur J. Biochem, 223: 1-5, 1994; Eur J. Biochem, 232:1-6, 1995; Eur J. Biochem., 237: 1-5., 1996; Eur J. Biochem, 250: 1-6., 1997; e Eur J. Biochem, 264: 610-650 1999, respectivamente]) das “hidrolases” do grupo geral (EC 3). As glicosidases úteis no presente método podem ser categorizadas pelos componentes da biomassa que hidrolisam. As glicosidases úteis para o presente método incluem as glicosidases que hidrolisam a celulose (por exemplo, as celulases, endoglucanases, exoglucanases, celobioidrolases, β-glucosidases), as glicosidases que hidrolisam a celulose (por exemplo, as xilanases, endoxilanases, exoxilanases, β-xilosidases, arabino-xilanases, mannases, galactases, pectinases, glucuronidases), e as glicosidases que hidrolisam o amido (por exemplo, as amilases, α-amilases, β-amilases, glucoamilases, α-glucosidases, isoamilases). Além disso, pode ser útil para acrescentar outras atividades ao consórcio de enzima de sacarificação, tais como as peptidases (EC 3.4.xy, lipases (EC 3.1.1.X e 3.1.4.x), ligninases (EC 1.11.1.x), ou esterases de feruloil (EC 3.1.1.73) para promover a liberação dos polissacarídeos de outros componentes da biomassa. É conhecido no estado da técnica que os microrganismos que produzem as enzimas que hidrolisam os polissacarídeos frequentemente exibem uma atividade, tal como uma capacidade para degradar a celulose, que é catalisada por diversas enzimas ou um grupo de enzimas que possuem diferentes especificidades de substrato. Por conseguinte, um “celulase” a partir de um microrganismo pode compreender um grupo de enzimas, uma ou mais ou todas que podem contribuir para a atividade da degradação da celulose. As preparações de enzimas comerciais ou não comerciais, tal como a celulase, pode compreender inúmeras enzimas, dependendo do esquema de purificação utilizado para obter a enzima. Muitas enzimas da hidrolase de glicosila e suas composições que são úteis para a sacarificação estão descritas na publicação WO 2011/038019.

[054]As enzimas de sacarificação podem ser obtidas comercialmente. Tais enzimas incluem, por exemplo, celulase Spezyme® CP, xilanase Multifect®, Accelerase® 1500, e Accellerase® DUETO (Danisco US Inc., Genencor International, Rochester, NY), e Novosyme-188 (Novozymes, 2880 Bagsvaerd, Dinamarca). Além disso, as enzimas de sacarificação podem ser não purificadas e fornecidas como uma preparação do extrato de células ou de células inteiras. As enzimas podem ser produzidas utilizando os microrganismos recombinantes que foram manipulados para expressar uma ou mais enzimas de sacarificação. Por exemplo, a preparação da proteína H3A utilizada no presente para a sacarificação da biomassa celulósica pré-tratada é uma preparação de enzimas não purificadas produzidas por uma cepa geneticamente manipulada de Trichoderma reesei, que inclui uma combinação de celulases e hemicelulases e está descrita na publicação WO 2011/038019, que está incorporada no presente como referência.

[055]As enzimas adicionais para a sacarificação incluem, por exemplo, as hidrolases de glicosila, tais como os membros das famílias GH3, GH39, GH43, GH55, GH10, e GH11. As GHs são um grupo de enzimas que hidrolisam a ligação glicosídica entre dois ou mais carboidratos, ou entre um carboidrato e uma porção de não carboidratos. As famílias de GHs foram classificadas com base na similaridade de sequência e a classificação está disponível no banco de dados da enzima ativa de carboidratos (CAZy) (Cantarel et al., (2009) Nucleic Acids Res 37 (edição de banco de dados): D233-238). Algumas destas enzimas são capazes de atuar em diversos substratos e demonstraram a eficácia como enzimas de sacarificação. As enzimas da família 3 das hidrolases do glicosídeo (“GH3”) possuem um determinado número de atividades conhecidas, incluindo, por exemplo, as atividades da β-glicosidase (EC: 3.2.1.21); β-xilosidase (EC: 3.2.1.37); β-glucosaminidase de N-acetia (EC: 3.2.1.52); β-1,3-glicosidase de glucano (EC: 3.2.1.58); cellodextrinase (EC: 3.2.1.74); exo-1,3-1,4-glucanase (EC: 3.2.1); e/ou β-galactosidase (EC 3.2.1.23). As enzimas família das hidrolases do glicosídeo 39 (“GH39”) também possuem um determinado número de atividades conhecidas, incluindo, por exemplo, as atividades da α-L-iduronidase (EC: 3.2.1.76) e/ou β-xilosidase (EC: 3.2.1.37). As enzimas família das hidrolases do glicosídeo 43 (“GH43”) possuem um determinado número de atividades conhecidas, incluindo, por exemplo, as atividades de L-α-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55); β-xilosidase (EC 3.2.1.37); endoarabinanase (CE 3.2.1.99); e/ ou 1,3-β-galactosidase de galactano (EC 3.2.1.145). As enzimas família das hidrolases do glicosídeo 51 (“GH51”) são conhecidas por possuírem, por exemplo, as atividades de L-α- arabinofuranosidase (CE 3.2.1.55) e/ou endoglucanase (EC 3.2.1.4). As enzimas família das hidrolases do glicosídeo 10 (“GH10”) foram descritas em detalhe em Schmidt et al., 1999, Biochemistry 38: 2.403-2.412 e Leggio Lo et al., 2001, FEBS Lett 509: 303-308) e a família da hidrolase do glicosídeo 11 (“GH11”) foram descritas em Hakouvainen et al., 1996, Biochemistry 35: 9.617-24.

[056] Os meios de fermentação que contêm o hidrolisado de biomassa podem conter uma porcentagem do hidrolisado com um ou mais açúcares e/ou outros componentes adicionados, ou os meios podem conter 90% ou mais do hidrolisado com adições inferiores, tal como o sorbitol, conforme descrito abaixo. Em diversas realizações, o hidrolisado de biomassa celulósica é de, pelo menos, cerca de 50%, 60%, 79%, 80%, 90% ou 95% do volume final do caldo de fermentação. Normalmente, cerca de 10% do volume final do caldo de fermentação é o inóculo da semente.

[057] O teor dos sólidos do hidrolisado de biomassa normalmente está entre cerca de 10% e 40%, dependendo dos métodos de pré-tratamento e de sacarificação empregados. Mais normalmente, o teor de sólidos é de cerca de 25%, com um meio que contém 90% do hidrolisado de biomassa celulósica que possui cerca de 23% de sólidos.

CONCENTRAÇÕES DE VIRGINIAMICINA UTILIZADAS NOS CALDOS DE FERMENTAÇÃO

[058] Descobriu-se no presente que a concentração de virginiamicina que é necessária para o controle da contaminação em um caldo de fermentação de Zymomonas varia, dependendo se o meio de fermentação contém o hidrolisado de biomassa celulósica. Descobriu-se no presente que no caldo de fermentação que contém o meio que não contém o hidrolisado de biomassa celulósica (descrito acima), uma concentração de cerca de 2 ppm de virginiamicina controla as bactérias contaminantes sem afetar a utilização de glicose e a produção do etanol das células de Zymomonas. A concentração de virginiamicina no presente caldo de fermentação que não contém o hidrolisado de biomassa celulósica pode ser de, pelo menos, cerca de 0,25 ppm, 0,5 ppm, 0,75 ppm, 1 ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4 ppm, 5 ppm, 10 ppm, ou 20 ppm, incluindo qualquer número inteiro ou fração entre os mesmos. As realizações típicas utilizam a virginiamicina em concentrações que estão entre cerca de 0,25 ppm e 20 ppm. As realizações mais típicas utilizam a virginiamicina em concentrações que estão entre cerca de 1,0 ppm e 10 ppm. A quantidade de virginiamicina necessária para o controle da contaminação depende de fatores tais como a quantidade de contaminação, o tipo do meio, a concentração de células de Zymomonas após a inoculação, e as condições de fermentação, e pode ser determinada por um especialista na técnica para uma situação específica.

[059] O controle das bactérias contaminantes pode ser avaliado através da determinação do nível de ácido lático no caldo de fermentação, em que a presença de uma quantidade inferior a cerca de 5 g/L de ácido lático após cerca de 40 horas de fermentação indica que a contaminação está controlada. A contaminação pode ser controlada em uma quantidade inferior a cerca de 5 g/L de ácido lático no caldo de fermentação, ou inferior a 4 g/L ou 3 g/L ou 2 g/L ou 1 g/L de ácido lático. A quantidade do ácido lático no caldo de fermentação normalmente é analisada através de HPLC, conforme é conhecido por um técnico do assunto.

[060] No meio que não contém o hidrolisado de biomassa celulósica e que contém 2,5 ppm ou 5 ppm de virginiamicina, descobriu-se no presente que o crescimento das células de Zymomonas é melhor que o crescimento das células na ausência de virginiamicina conforme medido por OD600. Em uma realização, o crescimento das células de Zymomonas é aprimorado através do crescimento das células em um meio que compreende a virginiamicina. O crescimento aprimorado pode contribuir para a redução do nível de contaminação por meio da competição, e/ou para o aumento da produção do etanol. A concentração de virginiamicina utilizada para o aprimoramento do crescimento depende de fatores tais como o tipo de meio utilizado, a concentração de células de Zymomonas após a inoculação, e as condições de fermentação. Um técnico do assunto pode facilmente avaliar a concentração de virginiamicina que estimula o crescimento da célula de Zymomonas quando se utiliza um meio específico e um conjunto de condições para a fermentação. Por exemplo, em um meio hidrolisado clarificado de biomassa celulósica nas condições descritas no Exemplo 1 no presente, as concentrações de virginiamicina de 2,5 ppm e 5 ppm aprimoram o crescimento de células de Zymomonas. Em outras fermentações, o crescimento de células de Zymomonas pode ser aprimorado pela presença de virginiamicina em concentração no intervalo de cerca de 1 ppm a cerca de 50 ppm, ou superior.

[061] Descobriu-se no presente que quando a contaminação presente em uma cultura de sementes é controlada através da utilização de virginiamicina (conforme descrito acima), e a cultura de sementes é utilizada para inocular uma fermentação em escala superior, a contaminação permanece controlada na fermentação em larga escala sem a adição de virginiamicina ou outros agentes antimicrobianos para o meio de fermentação separadamente a partir do inóculo. Por conseguinte, em uma realização, a contaminação é controlada em uma fermentação através da inclusão de virginiamicina em uma cultura de semente que é utilizada para inocular o meio de fermentação. O meio de fermentação pode conter o hidrolisado de biomassa celulósica, ou não conter o hidrolisado de biomassa celulósica. Em uma cultura de sementes cresceram em meio que não contém o hidrolisado de biomassa celulósica, a concentração de virginiamicina pode ser conforme descrita acima: pelo menos, cerca de 0,25 ppm, 0,5 ppm, 0,75 ppm, 1 ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4 ppm, 5 ppm, 10 ppm, ou 20 ppm, incluindo um número inteiro ou fração entre os mesmos. As realizações típicas utilizam a virginiamicina em concentrações que estão entre cerca de 0,25 ppm e 20 ppm. As realizações mais típicas utilizam a virginiamicina em concentrações que estão entre cerca de 1 ppm e cerca de 5 ppm.

[062] No entanto, quando a contaminação não é controlada em uma cultura de semente, a contaminação é um fator em uma fermentação em larga escala que é inoculada com a cultura de sementes contaminadas. Em uma realização, a contaminação na fermentação nas sementes inoculadas contaminadas é controlada conforme descrito acima, quando utilizando o meio que não contém o hidrolisado de biomassa celulósica.

[063] Descobriu-se no presente que no caldo de fermentação que contém os meios que contêm o hidrolisado de biomassa celulósica, uma concentração de virginiamicina que é de, pelo menos, cerca de 10 ppm pode ser utilizada para o controle das bactérias contaminantes, mantendo a produção típica de etanol através das células de Zymomonas (cerca de 70 a 80 g/L para a cepa de Zymomonas utilizada no presente). Em diversas realizações do presente caldo de fermentação que contém o hidrolisado de biomassa celulósica, a concentração de virginiamicina no caldo de fermentação é de, pelo menos, cerca de 10 ppm, 20 ppm, 30 pm, 40 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm, ou 250 ppm, incluindo um número inteiro ou fração entre os mesmos. Descobriu-se no presente que a boa produção do etanol é alcançada pelas células de Zymomonas no caldo de fermentação nas sementes inoculadas contaminadas que compreende o meio que contém o hidrolisado de biomassa celulósica e as concentrações de virginiamicina de 10 ppm a 250 ppm. A presença de sólidos relativamente elevados no hidrolisado de biomassa celulósica que contém o meio pode contribuir para o requisito para os níveis mais elevados de virginiamicina necessários para o controle da contaminação, em comparação com os níveis que são eficazes no meio que não contém o hidrolisado de biomassa celulósica. A presença de diversos produtos de degradação da biomassa no hidrolisado também pode contribuir. Os níveis elevados de virginiamicina são superiores que aqueles recomendados para a utilização na produção do etanol de levedura pelos fabricantes dos produtos de virginiamicina.

[064] Em qualquer tipo de meio utilizado para a fermentação, os resultados específicos do controle de contaminação irão depender de fatores, incluindo as características do crescimento e da produção da cepa de Zymomonas utilizada, os microrganismos contaminantes presentes, o nível de contaminação inicial, o tipo e a quantidade de material do hidrolisado de biomassa celulósica no meio (que inclui a porcentagem de sólidos e toxicidade do hidrolisado dos subprodutos para a contaminação e células contaminantes Zymomonas), se presente, e as condições de cultura incluindo a mistura. Um técnico do assunto pode facilmente determinar a concentração de virginiamicina em relação às quantidades descritas no presente que é eficaz no controle da contaminação de um caldo de fermentação específico de Zymomonas utilizando as condições específicas de fermentação, mantendo a produtividade da célula Zymomonas.

INÓCULO DE CÉLULAS DE ZYMOMONAS

[065] No presente método, o inóculo de células de Zymomonas pode ser qualquer fonte de células de Zymomonas que seja eficaz em iniciar uma cultura em crescimento. Normalmente, as células de Zymomonas são armazenadas como estoques congelados, e as células são recuperadas através do crescimento em uma pequena cultura em meio definido. A pequena cultura é utilizada como um inóculo que é adicionado ao meio de fermentação para a produção de um caldo de fermentação ou cultura. Uma pequena cultura também pode ser utilizada para inocular uma cultura de semente. As células Zymomonas são cultivadas na cultura de semente que, em seguida, são adicionadas como um inóculo para uma fermentação em escala superior. Uma cultura de sementes utilizada como o inóculo pode conter o meio definido estéril sem a virginiamicina necessária para o controle da contaminação. De maneira alternativa, uma cultura de sementes utilizada como o inóculo pode conter o meio definido ou outro meio que não contém o hidrolisado de biomassa celulósica, tal como o meio preparado a partir de mosto ou melaço, que pode ser contaminado, tal como através do equipamento de processo, em que a virginiamicina é adicionada para o controle da contaminação conforme descrito acima. Além disso, uma cultura de sementes utilizada como o inóculo pode conter o hidrolisado de biomassa celulósica e a virginiamicina para o controle da contaminação conforme descrito acima.

CÉLULAS DE ZYMOMONAS

[066]Qualquer cepa das células de Zymomonas pode ser utilizada nas presentes composições e métodos, e é selecionada com base em fatores incluindo o tipo do meio a ser utilizado e o resultado desejado do processo de fermentação. Qualquer cepa de Zymomonas que é um biocatalisador eficaz para o processo de produção desejada pode ser utilizada. Por exemplo, as células de Zymomonas que naturalmente produzem o etanol utilizando a glicose, frutose e/ou sacarose como substratos de fermentação, mas a xilose não é metabolizada. Em uma realização, as células de Zymomonas utilizados nos presentes métodos e composições foram manipuladas para a utilização de xilose, que é particularmente desejada quando utilizando o hidrolisado de biomassa celulósica, que contém a xilose.

[067]As cepas de Zymomonas produtoras de etanol, tal como Z. mobilis foram manipuladas para a fermentação de xilose para o etanol. Normalmente quatro genes foram introduzidos na Z. mobilis para a expressão de quatro enzimas envolvidas no metabolismo de xilose para criar uma via metabólica de utilização de xilose (Figura 1), conforme descrito na patente US 5.514.583, patente US 5.712.133, patente US 6.566.107, publicação WO 1995/28476, Feldmann et al., ((1992) Appl Microbiol Biotechnol 38: 354-361), e Zhang et al., ((1995) Science 267: 240-243). Estes incluem os genes que codificam a xilose isomerase que catalisa a conversão de xilose em xilulose, e a xiluloquinase que fosforila a xilulose para formar a xilulose 5-fosfato. Além disso, são expressas a transaldolase e transcetolase, duas enzimas da via das pentoses de fosfato, que convertem a xilulose 5-fosfato em intermediários que acoplam o metabolismo das pentoses para a via glicolítica Entner-Douderoff permitindo o metabolismo de xilose em etanol (vide Figura 1). As sequências de DNA que codificam estas enzimas podem ser obtidas a partir de qualquer um dos numerosos microrganismos que são capazes de metabolizar a xilose, tais como as bactérias entéricas, e algumas leveduras e fungos. As fontes para as regiões codificantes podem incluir a Xanthomonas, Klebsiella, Escherichia, Rhodobacter, Flavobacterium, Acetobacter, Gluconobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Salmonella, Pseudomonas, e Zymomonas. Normalmente são utilizadas as regiões de codificação de E. coli.

[068]As sequências de DNA de codificação são operativamente ligadas aos promotores que são expressos em células de Zymomonas, tais como o promotor de desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato de Z. mobilis (promotor GAP), e Z. mobilis enolase (promotor ENO). Um promotor GAP mutante com aumento da expressão conforme descrito na patente US 7.989.206, que está incorporada no presente como referência, também é útil para a expressão em Zymomonas. As regiões de codificação individualmente podem ser expressas a partir dos promotores, ou duas ou mais regiões de codificação podem ser unidas em um operon com a expressão a partir do mesmo promotor. Os genes quiméricos resultantes podem ser introduzidos nas células de Zymomonas e mantidos em um plasmídeo, ou integrados no genoma, utilizando, por exemplo, a recombinação homóloga, a integração direcionada ao local, ou a integração aleatória. Os exemplos de cepas manipuladas para expressar uma via de utilização de xilose metabólica incluem CP4(pZB5) (patente US 5.514.583), ATCC31821 / pZB5 (patente US 6.566.107), 8b (patente US 2003/0.162.271; Mohagheghi et al., (2004) Biotechnol Lett 25; 321- 325), e ZW658 (ATTCC # PTA-7858). As células de Zymomonas que são manipuladas para a expressão da via de utilização de xilose metabólica, em geral, necessitam de um período de adaptação em um meio que contém xilose a antes de ser capaz de crescer no meio que contém xilose como o único açúcar.

[069] Em realizações adicionais, as células de Zymomonas possuem uma ou mais modificações genéticas adicionais que aprimoram a cepa tal como uma que aumenta a taxa de crescimento e/ou a massa de células, aumenta a utilização de xilose e/ou permite a utilização de outros açúcares tal como a arabinose, aumenta a tolerância aos compostos de inibição tal como o acetato ou aumenta a produção do etanol.

[070] Em uma realização, as células de Zymomonas podem ser adicionalmente modificadas para a utilização de arabinose, que está descrita na patente US 5.843.760, que está incorporada no presente como referência. Para permitir a utilização de arabinose, os genes expressos, além dos genes da via de utilização de xilose incluem: (1) a L-arabinose isomerase para converter a L- arabinose em L-ribulose, (2) a L-ribulocinase para converter a L-ribulose em L- ribulose-5-fosfato, e (3) a L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase para converter a L- ribulose-5-fosfato em D-xilulose (patente US 5.843.760). Conforme descrito na patente US 2011/0.143.408, que está incorporada no presente como referência, uma utilização aprimorada da arabinose pode ser alcançada através de adicionalmente expressar um simportador de arabinose de prótons, tal como através de expressar uma região codificadora a partir de um gene araE.

[071] Em uma outra realização, o gene endógeno himA, que codifica a subunidade alfa do fator hospedeiro de integração, é geneticamente modificado para reduzir a sua expressão que aprimora o crescimento em um meio que contém a etila, conforme descrito na patente US 7.897.396, que está incorporada no presente como referência. O acetato está presente no hidrolisado de biomassa, por conseguinte, quando se utiliza o meio que contém o hidrolisado de biomassa, é desejada uma maior tolerância para este componente.

[072] Em uma outra realização, é produzida uma modificação genética que reduz a atividade da glicose-frutose oxido redutase (GFOR), conforme descrito na patente US 7.741.119, que está incorporada no presente como referência. A redução da expressão GFOR, bem como do gene himA, pode ser através de qualquer método, tal como os descritos acima para reduzir a atividade da aldose redutase.

[073] Em uma outra realização, é produzido uma modificação genética que aumenta a atividade da ribose-5-fosfato isomerase (RPI), conforme descrito no Pedido de Patente de propriedade comum e copendente US 2013/161.734, que está incorporado no presente como referência. A expressão RPI aumentada pode ser alcançada através do aumento da expressão do gene que codifica o RPI endógeno, tal como com um promotor que é mais altamente ativo que o promotor nativo, ou através da expressão de um gene heterólogo que codifica qualquer proteína ou polipeptídeo com a atividade da ribose-5- fosfato isomerase em Zymomonas. Existem dois grupos de enzimas isomerase de ribose-5-fosfato, que são denominados RPI-A e B-RPI, conforme descrito na patente 2013/161.734, qualquer um pode ser expresso.

[074] Em uma outra realização, a xilose isomerase que é expressa como parte da via de utilização de xilose metabólica é expressa utilizando um promotor altamente ativo mutante, que está descrito nas patentes US 7.989.206 e US 7.998.722, que estão incorporadas no presente como referência. Os promotores mutantes descritos no presente são os promotores do gene da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Zymomonas mobilis.

[075] Em uma outra realização, uma xilose isomerase que é expressa como parte da via de xilose utilização metabólica é uma xilose isomerase do Grupo I incluída na classe de enzimas identificadas por EC 5.3.1.5, conforme descrito no Pedido de Patente de propriedade comum e copendente US 2011/0.318.801. Está descrito no presente que as xilose isomerases do Grupo I, conforme expressa a partir de uma região codificadora de isolada a partir de Actinoplanes missouriensis possui uma atividade mais elevada que na xilose isomerase do Grupo 2 de Zymomonas. As xilose isomerases do Grupo I estão definidas no presente através da análise de bioinformática molecular filogenética (utilizando o algoritmo PHYLIP vizinho de ligação implementado em PHYLIP (Phylogeny Inference Package versão 3.5c; Felsenstein (1989) Cladistics 5: 164-166), a análise GroupSim (Capra e Singh (2008) Bioinformatics 24: 1473-1480), e um modelo Profile Hidden Markov (utilizando o algoritmo hmmsearch do pacote de software HMMER; Janelia Farm Research Campus, Ashburn, VA).

[076] Em uma outra realização, as células de Zymomonas foram adaptadas para o crescimento em uma cultura de tensão que contém o etanol e o acetato de amônio, conforme descrito na Publicação do Pedido de Patente US 2011/0.014.670-A1, que está incorporada no presente como referência. Estas cepas Zymomonas com tolerância aprimorada de acetato são particularmente úteis quando se utiliza o hidrolisado de biomassa celulósica que contém o meio de fermentação, que contém o acetato.

[077]As cepas descritas nas referências acima fornecem os exemplos de cepas que podem ser utilizadas nos presentes métodos e incluem ATCC31821 e / pZB5, ZW658 (ATCC # PTA-7858), ZW800, ZW801-4, ZW801- 4 :: ΔhimA, AcR # 3, e ZW705.

FERMENTAÇÃO DE ZYMOMONAS

[078] No presente método, o meio de cultura inoculado, ou caldo de fermentação, é incubado sob condições adequadas para o crescimento das células de Zymomonas. Em uma realização, as células de Zymomonas são de uma cepa de Zymomonas que é um biocatalisador eficaz para a produção do etanol sob condições utilizadas na fermentação, e o etanol é produzido no caldo de fermentação. Quando a concentração de açúcares no meio de fermentação é elevada de maneira que o crescimento é inibido, o meio inclui o sorbitol, o manitol, ou uma mistura destes conforme descrito no Pedido de Patente de propriedade comum US 7.629.156, que está incorporada no presente como referência. Normalmente uma concentração final de cerca de 5 mM de sorbitol ou manitol está presente no meio.

[079]As condições típicas são utilizados com temperatura que está entre cerca de 30° C a cerca de 37° C, e com pH de cerca de 4,5 a cerca de 7,5. As culturas típicas são incubadas sem ar, oxigênio ou outros gases suplementados (que podem incluir as condições tais como a fermentação anaeróbia, microaeróbia, ou microaerofílica), durante, pelo menos, cerca de 20 horas, e podem ser executadas por cerca de 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 horas ou superior. As culturas de sementes típicas são incubadas durante cerca de 20 horas, enquanto que as culturas de produção de fermentação são incubadas durante cerca de 40 horas ou superior. Para minimizar a formação de espuma, os agentes antiespumantes de silicone (qualquer classe à base de silicone, base orgânica e similares) pode ser adicionado ao meio, conforme necessário.

[080] Para culturas de fermentação de produção comercial, pode ser aplicada uma variedade de metodologias de cultura. Por exemplo, a produção em larga escala pode utilizar as metodologias de cultura contínua e em batelada. Um método de cultura clássica em batelada é um sistema fechado em que a composição do meio é definida no início da cultura e não é submetida às alterações artificiais durante o processo de cultivo. Por conseguinte, no início do processo de cultivo, o meio é inoculado com o organismo desejado, e o crescimento ou a atividade metabólica pode ocorra sem nenhuma adição ao sistema. Normalmente, no entanto, uma cultura “em batelada” é a batelada em relação à adição da fonte de carbono e as tentativas são muitas vezes realizadas nos fatores de controle tais como o pH e concentração de oxigênio. Nos sistemas em batelada, as composições do metabólito e da biomassa do sistema mudam constantemente até o momento em que a fermentação é interrompida. Dentro da batelada, as células da cultura moderam de uma fase lag estática para uma fase log de crescimento elevado e, finalmente, uma fase estacionária, em que a taxa de crescimento é reduzida ou interrompida. Se não tratadas, as células na fase estacionária acabarão por morrer. As células da fase log, em geral, são responsáveis pela maior parte da produção do produto final ou intermediário.

[081] Uma variação no sistema em batelada padrão é o sistema de batelada alimentada. Os processos de fermentação em batelada alimentada, também são adequados para os presentes métodos e composições, e compreendem um sistema em batelada típico, com a ressalva de que o substrato é adicionado em incrementos à medida que a fermentação progride. A medida da concentração do substrato real em sistemas de batelada alimentada é difícil e, por conseguinte, é estimado com base nas alterações dos fatores mensuráveis, tais como o pH e a pressão parcial de gases residuais, tal como o CO2. Os métodos de cultura em batelada e batelada alimentada são comuns e bem conhecidos no estado da técnica e os exemplos podem ser encontrados em Biotechnology: A Textbook of Microbiology industrial, Crueger, Crueger, e Brock, 2a edição (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, ou Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36, 227, (1992).

[082] Os presentes métodos e composições também podem ser utilizados em um processo de cultura contínua. As culturas contínuas são sistemas abertos, em que o meio de cultura é continuamente adicionado a um biorreator e uma quantidade igual de meios condicionados é removida simultaneamente para o processamento. Em geral, as culturas contínuas mantêm as células a uma densidade elevada e constante na fase líquida, em que as células essencialmente estão no crescimento da fase log. De maneira alternativa, a cultura contínua pode ser praticada com as células imobilizadas em que o carbono e os nutrientes são continuamente adicionados, e os produtos valiosos, subprodutos ou produtos residuais são continuamente removidos da massa de células. A imobilização celular pode ser realizada utilizando um amplo intervalo de suportes sólidos compostos por fibras naturais e/ou materiais sintéticos, conforme é conhecido para um técnico do assunto.

[083] Em um processo de produção, as culturas de fermentação de produção normalmente são executadas uma em seguida da outra, até uma limpeza do sistema ser necessária.

[084] Os presentes métodos e composições também podem ser utilizados em uma sacarificação e processo de fermentação (SSF) simultâneo. Por exemplo, o processo descrito na Publicação de Pedido de Patente US 2011/0.318.803, que está incorporado no presente como referência, pode ser utilizado. Neste processo SSF, as células Zymomonas são cultivadas nas condições de agitação baixa do impulsor com concentração elevada dos sólidos insolúveis em uma mistura de sacarificação-fermentação durante a reação de fermentação e sacarificação simultânea para a produção de concentrações elevadas de etanol. Além disso, pode ser utilizado um processo de fermentação e sacarificação híbrido (HSF), em que a sacarificação parcial é realizada antes da adição das células de Zymomonas, em seguida, a sacarificação e a fermentação adicionais ocorrem simultaneamente.

EXEMPLOS

[085] A presente descrição é ainda definida nos exemplos a seguir. Deve ser entendido que esses exemplos, embora indiquem as realizações preferidas, são apenas dados a título de ilustração. A partir da discussão acima e destes exemplos, um técnico no assunto pode verificar as características preferenciais, e sem se desviar de seu espírito e escopo, pode realizar diversas alterações e modificações para adaptá-las às diversas utilizações e condições.

[086] O significado das abreviações é o seguinte: “h” significa hora(s), “min” significa minuto(s), “sec” significa segundo(s), “d” significa dia(s), “L” significa litro(s), “mL” significa mililitro(s), “μL” significa microlitro(s), “g” significa gramas, “μg” significa micrograma(s), “ng” significa nanograma(s), “g/L “significa gramas por litro,” mM “significa milimolar,” μM “significa micromolar,” nm “significa nanômetro(s),” μmol “significa micromol(s),” pmol “significa picomol(s),” DO600 “significa a densidade óptica medida a 600 nm, “ETF” significa o tempo decorrido de fermentação, “ppm” significa partes por milhão.

MÉTODOS GERAIS DESCRIÇÃO DA CEPA ZW705

[087]A cepa Zymomonas mobilis ZW705 foi produzida a partir da cepa ZW804-1. A ZW801-4 é uma cepa recombinante que utiliza a xilose da Z. mobilis, que foi descrita na Patente de propriedade comum US 7.741.119, que está incorporada no presente como referência. A cepa ZW801-4 foi derivada a partir da cepa ZW800, que foi derivada a partir da cepa ZW658, todas conforme descritas na patente US 7.741.119. A ZW658 foi construída através da integração de dois operons, PgapxylAB e Pgaptaltkt, que contêm quatro genes que utilizam a xilose que codificam a xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transcetolase, no genoma de ZW1 (ATCC # 31821) através dos eventos de transposição sequencial, e seguido pela adaptação em meios seletivos que contêm a xilose (patente US 7629156). O ZW658 foi depositado como ATCC PTA-7858. No ZW658, o gene que codifica a glicose-frutose oxidorredutase foi inativado por inserção utilizando uma recombinação homóloga mediada por hospedeiro, duplo-cruzada, e a resistência à espectinomicina como um marcador selecionável para criar o ZW800 (patente US 7.741.119). O marcador de resistência à espectinomicina, que foi delimitado por sítios loxP, foi removido através da recombinação do sítio específico utilizando utilizando a Cre recombinase para criar o ZW801-4.

[088]As culturas da cepa Z. mobilis ZW801-4 foram adaptadas para o crescimento em condições de tensão do meio que contém o acetato de amônio para a produção do ZW705, conforme descrito no Pedido de Patente US 2011/0.014.670, que está incorporado no presente como referência. Uma cultura contínua de ZW801-4 foi executada em fermentadores de 250 mL agitados, de pH e temperatura controlados (Sixfors; Bottmingen, Suíça). O meio basal para a fermentação foi de 5 g/L de extrato de levedura, 15 mM de fosfato de amônio, 1 g/L de sulfato de magnésio, 10 mM de sorbitol, 50 g/L de xilose e 50 g/L de glicose. A adaptação ao crescimento na presença de concentrações elevadas do acetato e da amônia foi efetuada através do aumento gradual da concentração do acetato de amônio adicionado ao meio de cultura contínuo acima, mantendo uma taxa de crescimento estabelecida conforme medida através da taxa de diluição específica durante um período de 97 dias. O acetato de amônio foi aumentado para uma concentração de 160 mM. Os aumentos adicionais na concentração de íons do amônio foram obtidos através da adição do fosfato de amônio para uma concentração total final do íon de amônio de 210 mM ao final de 139 dias de cultura contínua. A cepa ZW705 foi isolada a partir da população adaptada através do plaqueamento de colônias únicas e amplificação de uma colônia selecionada.

COMPOSIÇÃO DO SABUGO DE MILHO

[089]A quantidade de celulose e xilana no sabugo de milho inicial foi determinada utilizando o método ASTM E1758-01 “Standard method for the determination of carbohydrates by HPLC”, conforme detalhado no National Renewable Energy Lagoratory (Golden, CO) Relatório Técnico NREL / TP-510 - 42.618 (revisado em abril de 2008). A composição foi determinada como sendo 34,8% de celulose, 29,2% de xilana, 12,8% de lenhina com base no peso seco.

ENZIMAS DE SACARIFICAÇÃO

[090]A celulase Spezyme® CP e Multifect®-CX12L foi de Danisco US Inc., Genencor International, Rochester, NY

[091]A Novozyme-188 foi de Novozymes (2880 Bagsvaerd, Dinamarca).

PROTEÍNA H3A

[092]A proteína H3A foi preparada a partir da cepa H3A geneticamente modificada de Trichoderma reesei. A cepa H3A foi preparada conforme descrito na patente US 7.666.648. Resumidamente, uma cepa mutante de Trichoderma reesei, derivada a partir de RL-P37 (Sheir-Neiss, G et al., Appl Microbiol Biotechnol 1984, 20: 46-53) e selecionada para a produção de celulase elevada foi cotransformada com um cassete de expressão β-glicosidase e um cassete de expressão da endoxilanase utilizando a eletroporação. Um transformante foi denominado cepa # 229. A cepa # 229 foi cotransformada com um cassete de expressão de β-xilosidase Fv3A, um cassete de expressão β-xilosidase Fv43D, e um cassete de expressão Fv51A α- arabinofuranosidase utilizando a eletroporação. A cepa H3A foi isolada a partir desta etapa de transformação.

[093]As proteínas extracelulares produzidas durante a fermentação da cepa H3A foram separados a partir da massa de células através da centrifugação, concentradas através da membrana de ultrafiltração por meio de uma membrana Millipore de peso de corte molecular de 10 kD e o pH ajustado para 4,8. A proteína total foi determinada utilizando um método Biuret modificado conforme modificado por Weichselbaum e Gornall utilizando a albumina de soro bovino como um calibrador (Weichselbaum, 1960, Amer J. Clin Path 16:40;.Gornall et al., 1949 J. Biol Chem. 177:752). Esta preparação de proteína extracelular de H3A, também denominada no presente como proteína H3A, foi utilizada como uma combinação da preparação da celulase e hemicelulase efetuando a hidrólise dos complexos de carboidratos durante a SSF.

HIDROLISADO DO SABUGO FRF13 PRÉ-TRATAMENTO

[094]O sabugo de milho hidrolisado foi preparado pela primeira vez através do pré-tratamento de amônia diluído do sabugo de milho triturado, utilizando os métodos de baixo teor de amônia descritos na patente US 7.932.063. Um recipiente de reator horizontal Littleford Day de 130 L que contém um revestimento para a passagem de vapor em torno do corpo do recipiente (Littleford Day, Inc., Florence, KY) foi utilizado para o pré- tratamento para gerar o sabugo pré-tratado denominado SSL34. O recipiente foi carregado com o sabugo a partir do processamento das sementes de milho para alcançar 46% do preenchimento do reator em uma base de sabugo molhado (51 libras). O sabugo foi reduzido para um tamanho inferior a 1 mm utilizando um grande micropulverizador (Model # 1SH, Série # 10019; Pulverizing Machinery Co., Summit, NJ) com uma tela de 1,0 mm. Uma colherada de gelo seco foi adicionada conforme necessário para o sabugo antes da moagem para evitar que o equipamento se aqueça. A unidade principal do micropulverizador é um motor de 5 h.p., com uma velocidade máxima do rotor de 9.600 RPM. Ele possui seis martelos rotativos, uma concha, e está alinhado com as bordas opostas de impacto.

[095]O sabugo possuía uma densidade a granel solta molhada de 0,385 g/cm3 e 7,4% em peso de umidade. O vácuo foi aplicado ao recipiente para alcançar 0,1 atm antes da introdução de uma solução de hidróxido de amônio a 28,9% em peso (44 kilos (9,8 libras)) e água (81 kilos (17,9 libras)) próximo da parte superior do recipiente para fornecer 6% em peso de NH3 em relação ao peso seco da biomassa e 60% em peso de sólidos na parte interna do recipiente. Um segundo e terceiro pré-tratamento em batelada, denominados SSL35 e SSL36, foram realizados da mesma maneira para gerar material suficiente para a sacarificação posterior. Em todas as bateladas, o agitador do reator foi ajustado para 70 rpm e a vapor foi passado através do revestimento do recipiente. Quando o recipiente alcançou uma temperatura interna de 80° C, o vapor foi introduzido próximo da parte superior do recipiente para aumentar a temperatura interna do recipiente para 145° C. Esta temperatura foi mantida durante 20 minutos. Aos 15 minutos deste tempo de retenção, o fluxo de vapor através do revestimento foi interrompido. No final do pré-tratamento, o reator foi despressurizado através de um condensador de ventilação para alcançar a pressão atmosférica. O vácuo (de cerca de inferior a 1 atm) foi posteriormente aplicado durante 15 minutos, para baixar a temperatura para inferior a 60° C e remover a amônia e água adicional a partir do sabugo pré- tratado antes de abrir a válvula de fundo do recipiente e recuperar a biomassa pré-tratada. A porcentagem (%) do peso final dos sólidos para as bateladas do sabugo pré-tratado SSL34, SSL35, e SSL36 foi de 67,4%, 66,2%, e 68,0%, respectivamente.

SACARIFICAÇÃO

[096] Um hidrolisado (FRF13) foi gerado em um fermentador de 200 L utilizando uma mistura de sabugos de milho pré-tratados a partir das preparações de SSL34, SSL 35 e SSL36 através da sacarificação com a proteína H3A descrita acima. Um resto de água (120,0 kg) foi adicionado ao fermentador e esterilizado com o revestimento de calor a 121° C, mantido durante 20 minutos. A água foi resfriada até 47° C e a mistura do sabugo pré-tratado foi adicionada através de um orifício na parte superior do tanque; foram adicionados 20,0 kg neste momento. O pH foi ajustado para 5,3 com 1N de H2SO4 e a preparação de enzima foi adicionada. A dosagem de enzima foi de 4,53 kg, o que era equivalente a 14 mg de proteína por g de glucano + xilano no sabugo total a ser adicionado ao reator. Ao longo das 12 horas seguintes, quatro adições de 15,0 kg do sabugo foram realizadas para o reator, de três em três horas, com o pH ajustado para 5,3 com 1N de H2SO4 após cada adição. A carga dos sólidos alvos para esta execução foi de 25% em peso. O fermentador foi controlado a 47° C e pH 5,3 durante cerca de 72 horas. No final deste período de tempo, 20 litros foram retirados para a utilização nestas experiências, e os teores restantes do recipiente foram fermentados. Uma amostra do hidrolisado foi analisada e o restante foi armazenado sob refrigeração até a sua utilização. Os resultados da análise da amostra estão apresentados na Tabela 1. TABELA 1 TÉRMINO DAS PROPRIEDADES DO HIDROLISADO DE SACARIFICAÇÃO PARA A FRF13

HIDROLISADO DO SABUGO MD07 # 3 PRÉ-TRATAMENTO

[097]As bateladas do sabugo de milho foram processadas com um moinho de martelos (Glen Mills Inc., Clifton, NH), passadas através de uma tela de 0,95 cm (3/8 de polegada) ou uma tela de 0,48 cm (3/16 de polegada) e tratadas com 6%, 8%, ou 10% de amônia em relação ao peso seco da biomassa em um reator de 170 L Jaygo (Jaygo Manufacturing, Inc., Mahwah, NJ) mantidas a 145° C durante 20 min. Antes da injeção da amônia aquosa, o reator foi evacuado até cerca de 0,1 bar, e após o período de 20 min, o reator foi expandido em dois estágios para cerca de 0,1 bar. A concentração final dos sólidos para a mistura do sabugo pré-tratado foi de cerca de 60%.

SACARIFICAÇÃO

[098] O hidrolisado MD07 # 3 foi gerado em um fermentador de 1.000 L, equipado com um circuito de recirculação. Um resto de água (542,3 kg) foi adicionado ao fermentador e esterilizado a 121° C durante 20 minutos. A água foi resfriada até 47° C e a mistura do sabugo pré-tratado foi adicionada através de um alimentador, localizado na parte superior do tanque; 112,1 kg foram adicionados neste momento. O pH foi ajustado para 5,3 com 9,8% em peso de H2SO4 e uma primeira dose de enzimas foi adicionada. Vide Tabela 2 para a massa das enzimas utilizadas e as dosagens correspondentes. Ao longo das nove horas seguintes, um adicional de 317,6 kg dos sabugos de milho pré- tratados foram adicionados, com o pH controlado a 5,3 com 9,8% em peso de H2SO4 ao longo das adições. A carga dos sólidos alvos para esta execução foi de 25% em peso. Ao término das 12 horas após a primeira adição de enzima, uma segunda dose foi adicionada (vide Tabela 2). O fermentador foi controlado a 47° C e pH 5,3 durante cerca de 96 horas e a suspensão foi circulada através do circuito de recirculação. Iniciando três horas após a primeira adição de enzima, um moinho de rotor-estator no circuito fechado de recirculação foi utilizado de maneira intermitente para a redução do tamanho das partículas dos sabugos pré-tratados na suspensão. O moinho foi utilizado nove vezes a partir de 30 a 110 minutos de cada vez. No final da execução de 96 horas, algum material hidrolisado foi retirado para a utilização nestas experiências. Uma amostra do hidrolisado foi analisada e o restante foi armazenado sob refrigeração até à sua utilização. Os resultados da análise da amostra estão contidos na Tabela 3. TABELA 2 ENZIMAS UTILIZADAS NA SACARIFICAÇÃO MD07 # 3

TABELA 3 TÉRMINO DAS PROPRIEDADES DE SACARIFICAÇÃO DO HIDROLISADO PARA MD07 # 3

[099] O MD07 # 3 clarificado foi produzido a partir do hidrolisado de MD07 # 3 através da centrifugação e filtração com o estágio final sendo a filtração por meio de um filtro de 0,2 μm.

FONTES DE VIRGINIAMICINA

[0100] O Lactrol® foi adquirido de Phibro (Ridgefield Park, NJ) e é 100% de virginiamicina.

[0101] O Lactoside VTM e Lactoside 247TM foram adquiridos de Lallemand Etanol Tecnologia (Milwaukee, WI).

MEIO

[0102] MRS = 10 g/L de peptona, 8 g/L de extrato de carne, 4 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de glicose, 5 g/L de acetato de sódio triidratado, 1 g/L de Tween 80, 2 g/L de K2HPO4, 2 g/L citrato de triamônio, 0,2 g/L de MgSO4*7H2O, 0,05 g/L de MnSO4*4H2O, pH 6,2.

ANÁLISE DE HPLC

[0103]As amostras de fermentação foram tomadas em intervalos de tempo e analisadas para EtOH, açúcares residuais, e outros produtos metabólicos tais como o ácido acético, ácido lático, e glicerol utilizando um sistema de HPLC Waters (sistema Alliance, Waters Corp., Milford, MA) ou um Agilent 1100 Series LC; condições = 0,6 mL/min de 0,01 N de H2SO4, volume de injeção = 5 mL, temperatura autoamostragem = 10°C, temperatura da coluna = 55°C, tempo de execução = 25 min, detecção através do índice de refração (mantida a 40°C). A coluna HPLC foi adquirida de BioRad (Aminex HPX-87H, BioRad Inc., Hercules, CA). Os analitos foram quantificados através da detecção do índice de refração e comparados com os padrões conhecidos.

EXEMPLO 1 TOLERÂNCIA DE Z. MOBILIS PARA A VIRGINIAMICINA

[0104] O inóculo da cepa Z. mobilis ZW705 (descrita em Métodos Gerais) foi preparado através da recuperação de 2 mL de OD de cerca de 10 estoques congelados em meio MRM3G6 (10 g/L de extrato de levedura BBL, 2 g/L de KH2PO4, 1 g/L de MgSO4*7H2O, 60 g/L de glicose, pH 5,5) a 33° C durante cerca de 8 horas. Esta cultura foi utilizada para inocular os tubos que contêm o hidrolisado clarificado MD07 # 3 (vide Métodos Gerais) suplementado com extrato de 2 g/L de levedura e diversas preparações de virginiamicina a uma taxa de inoculação de 20% (volume final), produzindo um OD inicial de cerca de 0,5. Os estoques dos agentes Lactrol®, Lactoside VTM ou Lactoside 247TM que contém a virginiamicina foram preparados em 1.000 ppm em etanol. Estes agentes foram adicionados ao meio a 2,5 ppm, 5 ppm, 10 ppm, ou 20 ppm. As especificações de Lactrol® indicam que a preparação é de 100% de atividade, indicando que 2,5 ppm de Lactrol® é equivalente a 2,5 ppm de virginiamicina A concentração de etanol inicial em cada tubo foi trazida para 1,94% em vol (200 μL em 10,3 mL) por meio da adição dos estoques que contêm a virginiamicina e etanol puro. Os tubos foram mantidos a 33° C com agitação durante 32 horas, com o crescimento monitorado através da medição OD600. Conforme mostrado na Figura 2, o ZW705 mostrou um melhor crescimento na presença dos agentes que contêm a virginiamicina do que para a cultura de controle que não contém a virginiamicina, exceto no meio Lactrol® de 10 ppm.

EXEMPLO 2 EFEITO DA VIRGINIAMICINA NO CONTROLE DA CONTAMINAÇÃO DO MEIO DA SEMENTE Z. MOBILIS

[0105] O inóculo da cepa Z. mobilis ZW705 (descrito em Métodos Gerais) foi preparado através da recuperação de 2 mL de OD de cerca de 10 estoque congelados em meio MRM3G6 (10 g/L de extrato de levedura BBL, 2 g/L de KH2PO4, 1 g/L de MgSO4*7H2O, 60 g/L de glicose, pH 5,5) a 33° C durante cerca de 8 horas, neste momento o OD foi de cerca de 2. O inóculo da cepa Lactobacillus plantarum ATCC 8014 foi preparado através da inoculação de meio MRS com uma colônia individual e permitindo o crescimento a 33° C durante 8 horas, neste momento o OD foi de cerca de 0,4.

[0106] O meio da semente (10 g/L de extrato de levedura Amberex695, 2 g/L de KH2PO4, 5 g/L de MgSO4*7H2O, 10 mM de sorbitol, 150 g/L de glicose, pH 5,5) foi preparado e esterilizado em autoclave (121° C, 30 min). Uma amostra de 500 mL de meio foi inoculada com uma mistura de Z. mobilis ZW705 (para OD de 0,05) e L. plantarum ATCC 8014 (para OD de 0,0005) produzindo um nível de contaminação de 1:100, e fermentado a 33° C e pH 5,5 (4 N de NH4OH adicionados quando necessário para o controle do pH). Em uma segunda amostra, foram adicionados 2 ppm de Lactrol®. Isto é equivalente a 2 ppm de virginiamicina uma vez que o Lactrol® é 100% de ingrediente ativo. As quantidades de ácido lático e de etanol produzidas no meio foram analisadas em diferentes pontos de tempo através de HPLC (coluna Aminex 87H, 0,01N de H2SO4, 0,6 mL/min) e os resultados são mostrados na Figura 3A (ácido lático) e 3B (etanol).

[0107] Na ausência de qualquer antimicrobiano (amostra F1067), após 19,3 horas de fermentação, 2,4 g/L de ácido lático e 60,3 g/L de etanol foram formados. Na cultura paralela de 2 ppm de Lactrol® adicionados ao meio (amostra F1068), 0,3 g/L de ácido lático foi produzido em 19,3 h, que ilustra a eficácia de uma dose de2 ppm de Lactrol® na redução do crescimento de L. plantarum, conforme evidenciado através de uma concentração reduzida de ácido lático. A quantidade de etanol produzida na presença de Lactrol® permaneceu equivalente à quantidade produzida na cultura de controle.

[0108] A glicose também foi medida através de HPLC, conforme descrito acima, e os resultados mostraram que o consumo de glicose foi similar para as culturas com e sem o Lactrol® (Figura 4).

EXEMPLO 3 EFEITO DA UTILIZAÇÃO DA SEMENTE Z. MOBILIS TRATADA COM A VIRGINIAMICINA COMO O INÓCULO DO MEIO HIDROLISADO

[0109] Uma amostra da cultura F1067 (sem Lactrol®) em EFT = 19,3 horas a partir do Exemplo 1 foi utilizada como uma cultura de semente para inocular 450 mL de meio de hidrolisado do sabugo (FRF13; vide Métodos Gerais) (ajustado para pH 5,8, 10 mM + sorbitol) a 10% em volume (volume final), que foi fermentado a 33° C (reduzido a 30° C em EFT = 21 h) e pH 5,8 (ajustado com 4 N de NaOH). Após 48 horas de fermentação (amostra F1069), 27,6 g/L de ácido lático (Figura 5A) e 32,6 g/L de etanol (Figura 5B) foram formados. Em uma experiência paralela, uma amostra da cultura F1068 (com 2 ppm de Lactrol®) em 19,3 h (a partir do Exemplo 1) foi utilizada como a cultura de semente para inocular o mesmo meio ao mesmo de 10% em vol. Após 48 horas de fermentação (amostra F1070), 73,5 g/L de etanol foram formados (Figura 5B), com nenhum ácido lático detectável produzido (Figura 5A). Os resultados mostraram que uma pequena dose de Lactrol® utilizada nas sementes contaminadas foi suficiente para evitar a contaminação do hidrolisado de fermentação.

[0110]A xilose e glicose também foram analisadas durante as duas fermentações do hidrolisado através de HPLC, conforme descrito acima, e os resultados são mostrados na Figura 6. As duas fermentações mostraram o consumo completo da glicose, no entanto, a fermentação inoculada com as sementes que contêm o Lactrol® consumiu a glicose mais rapidamente. A fermentação inoculada com a semente que contém o Lactrol® também apresentou um consumo quase completo de xilose, enquanto que uma quantidade superior a 50% da xilose não foi consumida na fermentação inoculada com as sementes que não contêm o Lactrol® (Figura 6).

EXEMPLO 4 EFEITO DA VIRGINIAMICINA NA FERMENTAÇÃO DO HIDROLISADO CONTAMINADO DE Z. MOBILIS

[0111] Para determinar a dose de Lactrol® necessária para evitar a formação do ácido lático durante a fermentação do hidrolisado, uma porção de sementes de cultura intencionalmente contaminadas F1067 em EFT = 19,3 h (a partir do Exemplo 1) foi utilizada como uma cultura de semente para inocular o meio de hidrolisado do sabugo (FRF13; vide Métodos Gerais) (ajustada para pH 5,8, + 10 mM de sorbitol) a 10% em volume (volume final) que contém 0 ppm (amostra F1069) ou 2 ppm (amostra F1071) de Lactrol® que, em seguida, foi fermentado a 33° C (reduzido para 30° C em EFT = 21 h) e pH 5,8 (ajustado com 4 N de NaOH).

[0112] Para explorar as concentrações mais elevadas de Lactrol®, uma cultura de sementes similar ao F1067 foi produzida e utilizada como o inóculo para a fermentação do hidrolisado do sabugo de uma maneira similar à descrita acima, na presença de 10, 50, ou 250 ppm de Lactrol® (amostras F1081 e 1083, respectivamente). Os resultados na Figura 7A mostram que, após 45 horas, grandes quantidades (superiores a 20 g/L) de ácido lático foram produzidas em meio que contém 0 e 2 ppm de Lactrol®. Incluir 10 ppm de Lactrol® reduziu a formação de ácido lático para cerca de 5 g/L em 45 horas. Incluir de 50 e 250 ppm de Lactrol® manteve a concentração de ácido lático em inferior a 1 g/L, que ilustra a necessidade de concentrações mais elevadas de virginiamicina para o controle de microrganismos contaminantes durante a fermentação do hidrolisado.

[0113]A produção do etanol foi superior nas fermentações que contêm 10 ppm, 50 ppm, ou 250 ppm de Lactrol® do que nas fermentações que contêm 0 ppm ou 2 ppm, conforme mostrado na Figura 7B.

Claims

1. COMPOSIÇÃO DE CALDO DE FERMENTAÇÃO, caracterizada por compreender: (a) meio de fermentação; (b) virginiamicina, em que a concentração de virginiamicina é pelo menos 10 ppm; e (d) uma população crescente de células de Zymomonas.

2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela concentração de ácido lático ser inferior a 5 g/L.

3. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo meio de fermentação não conter hidrolisado de biomassa celulósica.

4. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo meio de fermentação compreender hidrolisado de biomassa celulósica.

5. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela concentração de virginiamicina ser pelo menos 20 ppm.

6. MÉTODO PARA O CONTROLE DE CONTAMINAÇÃO BACTERIANA em uma fermentação, utilizando um biocatalisador de célula de Zymomonas, caracterizado por compreender: (a) fornecimento de um meio de fermentação; (b) b) adição de virginiamicina ao meio de fermentação, em que a virginiamicina é adicionada em uma concentração de pelo menos 10 ppm; (c) adição de um inóculo de células de Zymomonas ao meio de fermentação, por conseguinte, produzindo um caldo de fermentação; e (d) manutenção do caldo de fermentação sob condições adequadas para crescimento das células de Zymomonas; em que as etapas (b) e (c) podem ser realizadas em qualquer ordem ou simultaneamente, e em que a contaminação bacteriana é controlada.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelas células de Zymomonas produzirem etanol no caldo de fermentação.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 7, caracterizado pelo meio de fermentação não conter hidrolisado de biomassa celulósica.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 7, caracterizado pelo meio de fermentação compreender hidrolisado de biomassa celulósica.

10. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ETANOL, caracterizado por compreender: (a) fornecimento de um meio de fermentação; (b) adição ao meio de fermentação de um inóculo de células de Zymomonas cultivadas na presença de virginiamicina, produzindo um caldo de fermentação; e (c) manutenção do caldo de fermentação sob condições adequadas para crescimento das células de Zymomonas e produção de etanol pelas células de Zymomonas; em que nenhuma virginiamicina é adicionada ao meio de fermentação de modo separado do inóculo de (b), e em que etanol é produzido.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo meio de fermentação compreender hidrolisado de biomassa celulósica ou não conter hidrolisado de biomassa celulósica.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo inóculo de células de Zymomonas de (b) ser cultivado em meio que não contém hidrolisado de biomassa celulósica, e a concentração de virginiamicina ser pelo menos 0,25 ppm.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela concentração de virginiamicina estar entre 1 ppm e 10 ppm.

14. MÉTODO PARA O APRIMORAMENTO DO CRESCIMENTO DE CÉLULAS DE ZYMOMONAS, caracterizado por compreender cultivar células de Zymomonas em meio de fermentação que compreende virginiamicina.