BR112014015242B1 - Polipeptídeo híbrido isolado, polinucleotídeo isolado,célula hospedeira, método de produção de um polipeptídeo híbrido, processos para degradação ou conversão de um material celulósico, para produção de um produto de fermentação, de fermentação de um material celulósico, formulação ou composição de cultura de células microbianas de caldo completo, e,célula hospedeira microbiana transgênica - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEO HÍBRIDO ISOLADO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO HÍBRIDO, PLANTA, PARTE DE PLANTA OU CÉLULA DE PLANTA TRANSGÊNICA, PROCESSOS PARA DEGRADAÇÃO OU CONVERSÃO DE UM MATERIAL CELULÓSICO, PARA PRODUÇÃO DE UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO, DE FERMENTAÇÃO DE UM MATERIAL CELULÓSICO, FORMULAÇÃO OU COMPOSIÇÃO DE CULTURA DE CÉLULAS DE CALDO COMPLETO, E, CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA TRANSGÊNICA. A presente invenção se relaciona a polipeptídeos híbridos tendo atividade de celobiohidrolase. A presente invenção também se relaciona com polinucleotídeos codificando os polipeptídeos híbridos; construtos de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos; e processos de uso de polipeptíde os híbridos.

Description

Declaração quanto a Direitos a Invenções Feitas Sob Pesquisa e Desenvolvimento Federalmente Financiados

[0001] Esta invenção foi feita com apoio do Governo sob o Acordo Cooperativo DE-FC36-08GO18080 concedido pelo Departamento da Energia. O governo detém certos direitos nessa invenção.

Referência a uma Listagem de Sequências

[0002] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador, que é incorporada neste documento por referência.

Antecedentes da Invenção Área da Invenção

[0003] A presente invenção se relaciona com polipeptídeos híbridos tendo atividade de celobiohidrolase, polinucleotídeos codificando os polipeptídeos híbridos, métodos de produção dos polipeptídeos híbridos, e métodos de uso dos polipeptídeos híbridos.

Descrição da Técnica Relacionada

[0004] A celulose é um polímero de glucose de açúcar simples covalentemente ligado por ligações beta-1,4. Muitos microrganismos produzem enzimas que hidrolisam glucanas ligadas em beta. Estas enzimas incluem endoglucanases, celobiohidrolases, e beta-glucosidases. As endoglucanases digerem o polímero de celulose em posições aleatórias, o abrindo ao ataque por celobiohidrolases. As celobiohidrolases liberam sequencialmente moléculas de celobiose a partir das extremidades do polímero de celulose. A celobiose é um dímero de glucose ligado em beta-1,4 solúvel em água. As beta-glucosidases hidrolisam celobiose em glucose.

[0005] A conversão de matérias-primas lignocelulósicas em etanol tem as vantagens da disponibilidade pronta de grandes quantidades de matéria-prima, a desejabilidade de evitar queima ou descarga dos materiais em aterros, e a limpeza do combustível de etanol. Madeira, resíduos agrícolas, culturas herbáceas, e resíduos sólidos urbanos têm sido considerados matérias-primas para a produção de etanol. Estes materiais consistem principalmente em celulose, hemicelulose, e lignina. Logo que a lignocelulose é convertida em açúcares fermentáveis, p.ex., glucose, os açúcares fermentáveis podem ser facilmente fermentados através de leveduras em etanol.

[0006] Existe uma necessidade na técnica para novos enzimas para aumentar a eficiência e conferir soluções de enzima eficazes em termos de custos para a sacarificação do material celulósico.

[0007] O documento WO 2010/060056 divulga um polipeptídeo híbrido composto por um domínio de ligação de carboidrato de uma celobiohidrolase I de Talaromyces emersonii e uma celobiohidrolase I de Trichoderma reesei.

[0008] A presente invenção confere polipeptídeos híbridos tendo atividade de celobiohidrolase.

Sumário da Invenção

[0009] A presente invenção se relaciona a polipeptídeos híbridos isolados tendo atividade de celobiohidrolase, compreendendo: (a) um primeiro fragmento de polipeptídeo compreendendo um domínio de celobiohidrolase catalítico na extremidade N-terminal do polipeptídeo híbrido selecionado a partir do grupo consistindo em (i) um fragmento de polipeptídeo tendo pelo menos 96% de identidade de sequência com os aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2; (ii) um fragmento de polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo possuindo pelo menos 96% de identidade de sequência com os nucleotídeos 55 a 1485 de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA; e (iii) um fragmento de polipeptídeo compreendendo ou consistindo nos aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2; e (b) um segundo fragmento de polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação de carboidrato na extremidade C-terminal do segundo fragmento de polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em (i) um fragmento de polipeptídeo tendo pelo menos 96% de identidade de sequência com os aminoácidos 468 a 532 de SEQ ID NO: 4; (ii) um fragmento de polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo possuindo pelo menos 96% de identidade de sequência com os nucleotídeos 1453 a 1587 de SEQ ID NO: 3; e (iv) um fragmento de polipeptídeo compreendendo ou consistindo nos aminoácidos 485 a 529 de SEQ ID NO: 4.

[00010] A presente invenção também se relaciona com polinucleotídeos isolados codificando os polípeptídeos híbridos; construtos de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos; e métodos de produção de polípeptídeos híbridos.

[00011] A presente invenção também se relaciona com processos para degradação ou conversão de um material celulósico, compreendendo: tratamento do material celulósico com uma composição de enzimas na presença de tal polipeptídeo híbrido tendo atividade de celobiohidrolase.

[00012] A presente invenção também se relaciona com processos para produção de um produto de fermentação, compreendendo: (a) sacarificação de um material celulósico com uma composição de enzimas na presença de tal polipeptídeo híbrido tendo atividade de celobiohidrolase; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais (por ex., vários) microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

[00013] A presente invenção também se relaciona com processos de fermentação de um material celulósico, compreendendo: fermentação do material celulósico com um ou mais (p. ex., vários) microrganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzimas na presença de tal polipeptídeo híbrido tendo atividade de celobiohidrolase.

Breve Descrição das Figuras

[00014] A Figura 1 mostra um mapa de restrição do plasmídeo pF5.

[00015] A Figura 2 mostra o efeito do domínio de celobiohidrolase I catalítico de Penicillium sp. (emersonií) GH7 e proteína híbrida CBM de celobiohidrolase I Aspergillus fumigatus GH7 na hidrólise do PCS não lavado moído a 50-65°C por uma composição de enzimas.

Definições

[00016] Acetilxilana esterase: O termo “acetilxílana esterase” significa uma carboxilesterase (EC 3.1.1.72) que catalisa a hidrólise de grupos acetila a partir de xilana polimérica, xilose acetilada, glucose acetilada, acetato de alfa-naftila, e acetato de p-nitrofenila. Para propósitos da presente invenção, a atividade de acetilxilana esterase é determinada usando acetato de p-nitrofenila a 0,5 mM como substrato em acetato de sódio a 50 mM pH 5,0 contendo TWEEN™ 20 a 0,01 % (monolaurato de polioxietileno sorbitana). Uma unidade de acetilxilana esterase é definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 μmole de âníonp-nitrofenolato por minuto a pH 5, 25°C.

[00017] Variante alélica: O termo “variante alélica” significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações genéticas podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[00018] Alfa-L-arabinofuranosidase: O termo “alfa-L- arabinofuranosidase” significa uma alfa-L-arabinofuranosídeo arabino furanohidrol ase (EC 3.2.1.55) que catalisa a hidrólise de resíduos terminais não redutores de alfa-L-arabinofuranosídeo em alfa-L- arabinosídeos. A enzima atua em alfa-L-arabinofuranosídeos, alfa-L- arabinanas contendo ligações (1,3) e/ou (1,5), arabinoxilanas, e arabinogalactanas. A alfa-L-arabinofuranosidase é também conhecida como arabinosidase, alfa-arabinosidase, alfa-L-arabinosidase, alfa- arabinofuranosidase, polissacarídeo alfa-L-arabinofuranosidase, alfa-L- arabinofuranosídeo hidrolase, L-arabinosidase, ou alfa-L-arabinanase. Para finalidades da presente invenção, a atividade de alfa-L-arabinofuranosidase é determinada usando 5 mg de arabinoxilana de trigo de viscosidade média (Megazyme International Ireland, Ltd., Bray, Co. Wicklow, Irlanda) por mL de acetato de sódio a 100 mM a pH 5 em um volume total de 200 μL durante 30 minutos a 40°C, seguido de análise de arabinose por meio de cromatografia em coluna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA).

[00019] Alfa-glucuronidase: O termo “alfa-glucuronidase” significa uma alfa-D-glucosiduronato glucuronohidrolase (EC 3.2.1.139) que catalisa a hidrólise de um alfa-D-glucuronosideo em D-glucuronato e um álcool. Para propósitos da presente invenção, a atividade da alfa-glucuronidase é determinada de acordo com de Vries, 1998, J. Bacterial. 180: 243-249. Uma unidade de alfa-glucuronidase iguala a quantidade de enzima capaz de liberar 1 μmole de ácido glucurônico ou 4-O-metilglucurônico por minuto a pH 5, 40°C.

[00020] Beta-glucosidase: O termo “beta-glucosidase” significa uma beta-D-glucosídeo glucohidrolase (E.C. 3.2.1.21) que catalisa a hidrólise de resíduos de beta-D-glucose não redutores terminais com a liberação de betaD-glucose. Para propósitos da presente invenção, a atividade da betaglucosidase é determinada usando p-nitrofenil-beta-D-glucopiranosídeo como substrato de acordo com o procedimento de Venturi et al., 2002, Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophillum var. coprophilum: production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Uma unidade de beta-glucosidase é definida como 1,0 μmole de ânion /?-nitrofenolato produzida por minuto a 25°C, pH 4,8 a partir de p- nitrofenil-beta-D-glucopiranosideo a 1 mM como substrato em citrato de sódio a 50 mM contendo 0,01 % de TWEEN® 20.

[00021] Beta-xilosidase: O termo “beta-xilosidase” significa uma beta-D-xilosídeo xilohidrolase (E.C. 3.2.1.37) que catalisa a exo-hidrólise de beta (1—>4)-xilo-oligossacarídeos pequenos para remover resíduos de D- xilose sucessivos de terminais não redutores. Para finalidades da presente invenção, uma unidade de beta-xilosidase é definida como 1,0 μmole de ânion p-nitrofenolato produzida por minuto a 40°C, pH 5 a partir de p-nitrofenil- beta-D-xilosídeo a 1 mM como substrato em citrato de sódio a 100 mM contendo 0,01 % de TWEEN® 20.

[00022] Domínio de ligação de carboidratos: O termo “domínio de ligação de carboidratos (DLC)” significa a região de uma enzima que medeia a ligação da enzima a um substrato de carboidrato. O domínio de ligação de carboidratos encontra-se tipicamente na extremidade N-terminal ou C- terminal de uma enzima. Um módulo de ligação de carboidratos (MLC) é classificado como um domínio de ligação de carboidratos.

[00023] Domínio catalítico: O termo “domínio catalítico” significa a região de uma enzima contendo a maquinaria catalítica da enzima.

[00024] cDNA: O termo “cDNA” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA madura, processada, obtida de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de intron que podem estar presentes no correspondente DNA genômico. O transcrito de RNA primário, inicial, é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de passos, incluindo processamento, antes de aparecer como mRNA maduro processado.

[00025] Celobiohidrolase: O termo “celobiohidrolase” significa uma 1,4-beta-D-glucana celobiohidrolase (E.C. 3.2.1.91 e E.C. 3.2.1.176) que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glucosídicas em celulose, celo- oligossacarídeos, ou qualquer polímero contendo glucose ligado em beta-1,4, liberando celobiose da extremidade redutora (celobiohidrolase I) ou extremidade não redutora (celobiohidrolase II) da cadeia (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of cellobiohidrolases, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficient on crystalline cellulose?, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178). A atividade de celobiohidrolase é determinada de acordo com os procedimentos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBSLetters, 149: 152-156; van Tilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283-288; e Tomme et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575-581. Na presente invenção, o método de Tomme et al. pode ser usado para determinar a atividade de celobiohidrolase.

[00026] Enzima celulolítica ou celulase: O termo “enzima celulolítica” ou “celulase” significa uma ou mais (p.ex., várias) enzimas que hidrolisam um material celulósico. Taís enzimas incluem endoglucanase(s), celobiohidrolase(s), beta-glucosidase(s), ou suas combinações. As duas abordagens básicas para medir a atividade celulolítica incluem: (1) medir a atividade celulolítica total, e (2) medir as atividades celulolíticas individuais (endoglucanases, celobiohidrolases, e beta-glucosidases) como revisto em Zhang et al., Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. A atividade celulolitica total é usualmente medida usando substratos insolúveis, incluindo papel de filtro Whatman N°l, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose de algas, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc. O ensaio mais comum de atividade celulolitica total é o ensaio de papel de filtro usando papel de filtro Whatman N°1 como o substrato. O ensaio foi estabelecido pela International Union of Pure e Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).

[00027] Para propósitos da presente invenção, a atividade de enzimas celulolíticas é determinada por medição do aumento na hidrólise de um material celulósico por enzima(s) celulolítica(s) sob as seguintes condições: 1-50 mg de proteína de enzima celulolítica/g de celulose em PMP (ou outro material celulósico pré-tratado) por 3-7 dias a uma temperatura adequada, por exemplo, 50°C, 55°C, ou 60°C, em comparação com uma hidrólise de controle sem adição de proteína de enzima celulolitica. Condições típicas são reações de 1 mL, PMP lavado ou não lavado, 5 % sólidos insolúveis, acetato de sódio a 50 mM pH 5, 1 mM MnSO4, 50°C, 55°C, ou 60°C, 72 horas, análise de açúcares por coluna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA).

[00028] Material celulósico: O termo “material celulósico” significa qualquer material contendo celulose. O polissacarídeo predominante na parede celular primária da biomassa é celulose, o segundo mais abundante é hemicelulose, e o terceiro é pectina. A parede celular secundária, produzida após a célula ter parado de crescer, contém também polissacarídeos e é reforçada por lignina polimérica covalentemente reticulada à hemicelulose. A celulose é um homopolímero de anhidrocelobiose e logo uma beta-( 1 -4)-D- glucana linear, enquanto hemiceluloses incluem uma variedade de compostos, tais como xilanas, xiloglucanas, arabinoxilanas, e mananas em complexas estruturas ramificadas com um espetro de substituintes. Embora geralmente polimorfa, a celulose é encontrada em tecido de plantas principalmente como uma matriz cristalina insolúvel de cadeias paralelas de glucana. As hemiceluloses estão usualmente ligadas por hidrogênio a celulose, bem como a outras hemiceluloses, que ajudam a estabilizar a matriz da parede celular.

[00029] A celulose é geralmente encontrada, por exemplo, nos caules, folhas, peles, cascas, e sabugos de plantas ou folhas, ramos, e madeira de árvores. O material celulósico pode ser, mas não está limitado a, resíduos agrícolas, material herbáceo (incluindo culturas energéticas), resíduos sólidos urbanos, resíduos de fábrica de pasta celulósica e papel, resíduos de papel, e madeira (incluindo resíduos de silvicultura) (ver, por exemplo, Wiselogel et al., 1995, em Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp. 105118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, editor executivo, Volume 65, páginas 23-40, Springer-Verlag, Nova Iorque). E entendido aqui que a celulose pode estar na forma de lignocelulose, um material das paredes celulares de plantas contendo lignina, celulose, e hemicelulose em uma matriz mista. Em um aspeto preferencial, o material celulósico é qualquer material de biomassa. Em outro aspeto preferencial, o material celulósico é lignocelulose, que compreende celulose, hemiceluloses, e lignina.

[00030] Em um aspeto, o material celulósico é resíduos agrícolas. Em outro aspeto, o material celulósico é material herbáceo (incluindo culturas energéticas). Em outro aspeto, o material celulósico é resíduo sólido urbano. Em outro aspeto, o material celulósico é resíduo de fábricas de pasta celulósica e papel. Em outro aspeto, o material celulósico é resíduo de papel. Em outro aspeto, o material celulósico é madeira (incluindo resíduos de silvicultura).

[00031] Em outro aspeto, o material celulósico é cana-do-reino. Em outro aspeto, o material celulósico é bagaço. Em outro aspeto, o material celulósico é bambu. Em outro aspeto, o material celulósico é sabugo de milho. Em outro aspeto, o material celulósico é fibra de milho. Em outro aspeto, o material celulósico é palha de milho. Em outro aspeto, o material celulósico é miscanto. Em outro aspeto, o material celulósico é casca de laranja. Em outro aspeto, o material celulósico é palha de arroz. Em outro aspeto, o material celulósico é capim-elefante. Em outro aspeto, o material celulósico é palha de trigo.

[00032] Em outro aspeto, o material celulósico é álamo. Em outro aspeto, o material celulósico é eucalipto. Em outro aspeto, o material celulósico é abeto. Em outro aspeto, o material celulósico é pinheiro. Em outro aspeto, o material celulósico é álamo. Em outro aspeto, o material celulósico é espruce. Em outro aspeto, o material celulósico é salgueiro.

[00033] Em outro aspeto, o material celulósico é celulose de algas. Em outro aspeto, o material celulósico é celulose bacteriana. Em outro aspeto, o material celulósico é linter de algodão. Em outro aspeto, o material celulósico é papel de filtro. Em outro aspeto, o material celulósico é celulose microcristalina. Em outro aspeto, o material celulósico é celulose tratada com ácido fosfórico.

[00034] Em outro aspeto, o material celulósico é uma biomassa aquática. Como usado aqui, o termo “biomassa aquática” significa biomassa produzida em um ambiente aquático por um processo de fotossíntese. A biomassa aquática pode ser algas, plantas emergentes, plantas de folhas flutuantes, ou plantas submersas.

[00035] O material celulósico pode ser usado como tal ou pode ser sujeito a pré-tratamento, usando métodos convencionais conhecidos na técnica, como descrito aqui. Em um aspeto preferencial, o material celulósico é pré-tratado.

[00036] Polipeptídeo híbrido: O termo “polipeptídeo híbrido” significa um polipeptídeo no qual uma região de um polipeptídeo está fundida no terminal N ou terminal C de uma região de outro polipeptídeo.

[00037] Os polipeptídeos híbridos da presente invenção têm pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, e pelo menos 100% da atividade de celobiohidrolase do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 6.

[00038] Sequência codificante: O termo “sequência codificante” significa um polinucleotídeo, que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. As fronteiras da sequência codificante são geralmente determinadas por uma grelha de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG, ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG, ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético, ou uma sua combinação.

[00039] Sequências de controle: O termo “sequências de controle” significa sequências de ácidos nucleicos necessárias para expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo híbrido da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (z.e., do mesmo gene) ou estranha (i.e., de um gene diferente) ao polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de propeptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal, e terminador da transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sinais de terminação transcricionais e translacionais. As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes para o propósito de de introdução de locais de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle à região codificante do polinucleotídeo codificando um polipeptídeo.

[00040] Endoglucanase: O termo “endoglucanase” significa uma endo-l,4-(l,3;l,4)-beta-D-glucana 4-glucanahidrolase (E.C. 3.2.1.4) que catalisa a endohidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (tais como celulose de carboximetila e celulose de hidroxietila), liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glucanas mistas tais como beta-D-glucanas ou xiloglucanas de cereais, e outro material de plantas contendo componentes celulósicos. A atividade de endoglucanase pode ser determinada por medição da redução na viscosidade do substrato ou aumento nas extremidades redutoras determinados por um ensaio de açúcares redutores (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). Para propósitos da presente invenção, a atividade de endoglucanase é determinada usando celulose de carboximetila (CMC) como substrato de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268, a pH 5, 40°C.

[00041] Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer passo envolvido na produção de um polipeptídeo incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricíonal, tradução, modificação pós- translacional, e secreção.

[00042] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo e está operacionalmente ligado a sequências de controle que proporcionam a sua expressão.

[00043] Glicosídeo hidrolase da Família 61: O termo “glicosídeo hidrolase da Família 61” ou “Família GH61” ou “GH61” significa um polipeptídeo da Família 61 de glicosídeo hidrolases de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, e Henrissat B., e Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696. As enzimas desta família foram originalmente classificadas como uma família de glicosídeo hidrolases com base na medição de atividade muito fraca de endo-1,4-beta-D-glucanase em um membro da família. A estrutura e modo de ação destas enzimas não são canônicas e não podem ser consideradas glicosidases bona fide. No entanto, são mantidas na classificação CAZy com base na sua capacidade de intensificar a degradação de lignocelulose quando usadas em conjunto com uma celulase ou uma mistura de celulases.

[00044] Feruloil esterase: O termo “feruloil esterase” significa uma 4- hidroxi-3-metoxicinamoil-açúcar hidrolase (EC 3.1.1.73) que catalisa a hidrólise de grupos 4-hidroxi-3-metoxicinamoíla (feruloíla) de açúcar esterificado, que é usualmente arabinose em substratos de biomassa natural, para produzir ferulato (4-hidroxi-3-metoxicinamato). A feruloil esterase é também conhecida como ácido ferúlico esterase, hidroxicinamoíl esterase, FAE-III, éster de cinamoíla hidrolase, FAEA, cinAE, FAE-I, ou FAE-II. Para propósitos da presente invenção, a atividade de feruloil esterase é determinada usando p-nitrofenilferulato a 0,5 mM como substrato em acetato de sódio a 50 mM pH 5,0. Uma unidade de feruloil esterase iguala a quantidade de enzima capaz de liberar 1 μmole de ânion/7-nitrofenolato por minuto a pH 5, 25°C.

[00045] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo com um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos eliminados do terminal amina e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento tem atividade alfa-amilase. Em um aspeto, um fragmento contém pelo menos 80% dos resíduos de aminoácidos, p.ex., pelo menos 85 % dos resíduos de aminoácidos, pelo menos 90 % dos resíduos de aminoácidos, ou pelo menos 95 % dos resíduos de aminoácidos de um polipeptídeo ou do polipeptídeo maduro de uma enzima de interesse.

[00046] Enzima hemicelulolítica ou hemicelulase: O termo “enzima hemicelulolítica” ou “hemicelulase” significa uma ou mais (p.ex., várias) enzimas que hidrolisam um material hemicelulósico. Ver, por exemplo, Shallom, D. e Shoham, Y. Microbial hemicellulases. Current Opinion In Microbiology, 2003, 6(3): 219-228). As hemicelulases são componentes chave na degradação de biomassa de plantas. Exemplos de hemicelulases incluem, mas não estão limitados a, uma acetilmanana esterase, uma acetilxilana esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido cumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glucuronoíl esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase, e uma xilosidase. Os substratos destas enzimas, as hemiceluloses, são um grupo heterogêneo de polissacarídeos ramificados e lineares que estão ligados através de ligações de hidrogênio às microfibrilas de celulose na parede celular de plantas, as reticulando em uma rede robusta. As hemiceluloses estão também covalentemente ligadas a lignina, formando em conjunto com celulose uma estrutura altamente complexa. A estrutura e organização variáveis de hemiceluloses requerem a ação concertada de muitas enzimas para a sua degradação completa. Os módulos catalíticos das hemicelulases são ou glicosídeo hidrolases (GHs) que hidrolisam ligações glicosídicas, ou carboidrato ésterases (CEs), que hidrolisam ligações éster de grupos secundários de acetato ou ácido ferúlico. Estes módulos catalíticos, com base na homologia da sua sequência primária, podem ser atribuídos a famílias GH e CE. Algumas famílias, com uma dobragem global similar, podem ser adicionalmente agrupadas em clãs, marcados alfabeticamente (p.ex., GH-A). Uma classificação muito informativa e atualizada destas e outras enzimas ativas em carboidratos está disponível na base de dados Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy). As atividades de enzimas hemicelulolíticas podem ser medidas de acordo com Ghose e Bisaria, 1987, Pure & AppL Chem. 59: 1739-1752, a uma temperatura, p.ex., 50°C, 55°C, ou 60°C, e pH adequados, p.ex., 5,0 ou 5,5.

[00047] Condições de elevada estringência: O termo “condições de alta estringência” significa, para sondas com um comprimento de pelo menos 100 nucleotídeos, pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 0,3 % SDS, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e 50 % formamida, seguindo procedimentos comuns de “Southern blotting” por 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma por 15 minutos, usando 2X SSC, 0,2 % SDS a 65°C.

[00048] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, transdução, ou similares com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não é idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[00049] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância que não ocorre naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais ou todos os constituintes que ocorrem naturalmente aos quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (p.ex., produção recombinante em uma célula hospedeira; múltiplas cópias de um gene codificando a substância; e uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância).

[00050] Condições de baixa estringência: O termo “condições de baixa estringência” significa, para sondas com um comprimento de pelo menos 100 nucleotídeos, pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 0,3 % SDS, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e 25% formamida, seguindo procedimentos comuns de “Southern blotting” por 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma por 15 minutos, usando 2X SSC, 0,2 % SDS a 50°C.

[00051] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo na sua forma final de seguida à tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como o processamento do N- terminal, o truncamento do C-terminal, glicosilaçao, fosforilação, etc. E conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois dos mais polipeptídeos maduros diferentes (isto é, com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente), expresso através do mesmo polinucleotídeo. Em um aspeto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 19 a 520 de SEQ ID NO: 6.

[00052] Sequência codificante do polipeptídeo maduro: O termo “sequência codificante do polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade biológica. Em um aspeto, a sequência codificante do polipeptídeo maduro é os nucleotídeos 55 a 1485 de SEQ ID NO: 5.

[00053] Condições de estringência média: O termo “condições de estringência média” significa, para sondas com um comprimento de pelo menos 100 nucleotídeos, pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 0,3 % SDS, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e 35% formamida, seguindo procedimentos comuns de “Southern blotting” por 12 a 24 horas. O material transportador é final mente lavado três vezes, cada uma por 15 minutos, usando 2X SSC, 0,2 % SDS a 55°C.

[00054] Condições de estríngência média-elevada: O termo “condições de estríngência média-alta” significa, para sondas com um comprimento de pelo menos 100 nucleotídeos, pré-hibridização e hibridizaçâo a 42°C em 5X SSPE, 0,3 % SDS, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e 35% formamida, seguindo procedimentos comuns de “Southern blotting” por 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma por 15 minutos, usando 2X SSC, 0,2 % SDS a 60°C.

[00055] Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene que ocorre naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de um modo que de outro modo não existiria na natureza ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências de controle.

[00056] Operacionalmente ligado: O termo “operacionalmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo tal que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificante.

[00057] Genitor ou polipeptídeo genitor: O termo “genitor” ou “polipeptídeo genitor” significa um de dois ou mais (por exemplo, vários), polipeptídeos em que os seus fragmentos são combinados de forma a produzirem um polipeptídeo híbrido da presente invenção. O genitor pode ser um polipeptídeo (tipo selvagem) ocorrendo naturalmente e/ou uma sua variante. O termo “genitor” ou “polipeptídeo genitor” também pode ser usado na forma plural.

[00058] Polipeptídeo tendo atividade celulolítica intensificadora: O termo “polipeptídeo tendo atividade celulolítica intensificadora” significa um polipeptídeo GH61 que catalisa a intensificação da hidrólise de um material celulósico por enzima tendo atividade celulolítica. Para propósitos da presente invenção, a atividade celulolítica intensificadora é determinada por medição do aumento em açúcares redutores ou o aumento do total de celobiose e glucose da hidrólise de um material celulósico por enzima celulolítica sob as seguintes condições: 1-50 mg de proteína total/g de celulose em palha de milho pré-tratada (PMP), em que a proteína total é compreendida de 50-99,5 % p/p de proteína de enzima celulolítica e 0,5-50 % p/p de proteína de um polipeptídeo GH61 com atividade celulolítica aumentada por 1 -7 dias a uma temperatura adequada, como 40°C-80°C, por exemplo, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, ou 70°C, e um pH adequado, como 4-9, por exemplo, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, ou 7,0, em comparação com uma hidrólise de controle com igual carga de proteína total sem atividade celulolítica aumentada (1-50 mg de proteína celulolítica/g de celulose em PMP). Em um aspeto preferencial, uma mistura de CELLUCLAST® 1.5L (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) na presença de 2-3 % de peso de proteína total de beta-glucosidase de Aspergillus oryzae (recombinantemente produzida em Aspergillus oryzae de acordo com WO 02/095014) ou 2-3 % de peso de proteína total de betaglucosidase de Aspergillus fumigatus (recombinantemente produzida em Aspergillus oryzae como descrito em WO 2002/095014) de carga de proteína celulase é usada como a fonte da atividade celulolítica.

[00059] Os polípeptídeos GH61 com atividade celulolítica aumentada intensificam a hidrólise de um material celulósico catalisada por enzima com atividade celulolítica ao reduzirem a quantidade de enzima celulolítica requerida para alcançar o mesmo grau de hidrólise, preferencialmente pelo menos 1,01 vezes, por exemplo, pelo menos 1,05 vezes, pelo menos 1,10 vezes, pelo menos 1,25 vezes, pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes.

[00060] Palha de milho pré-tratada: O termo “PCS” ou “Palha de Milho Pré-tratada” significa um material celulósico derivado de palha de milho por tratamento com calor e ácido sulfurico diluído, pré-tratamento alcalino, ou pré-tratamento neutro.

[00061] Identidade de sequência: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequência”.

[00062] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente versão 5.0.0 ou superior. Os parâmetros usados são uma penalidade de intervalo aberto de 10, uma penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a identidade percentual e é calculado como se segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)

[00063] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente versão 5.0.0 ou superior. Os parâmetros usados são uma penalidade de intervalo aberto de 10, uma penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle marcado “identidade mais longa” (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a identidade percentual e é calculado como se segue: (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)

[00064] Subsequência: O termo “subsequência” significa um polinucleotídeo tendo um ou mais (p.ex., vários) nucleotídeos ausentes da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência codificante do polipeptídeo maduro; em que a subsequência codifica um fragmento tendo atividade biológica. . Em um aspeto, a subsequência contém pelo menos 80% dos nucleotídeos, p.ex., pelo menos 85%, pelo menos 90% dos nucleotídeos ou pelo menos 95% dos nucleotídeos da sequência codificante do polipeptídeo ou da sequência codificante do polipeptídeo maduro de uma enzima de interesse.

[00065] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo tendo atividade biológica compreendendo uma alteração, i.e., uma substituição, inserção, e/ou deleção, em uma ou mais (p.ex., várias) posições. Uma substituição significa substituição do aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de um aminoácido adjacente ao e imediatamente a seguir ao aminoácido ocupando uma posição.

[00066] Condições de estríngência muito elevada: O termo “condições de muito alta estríngência” significa, para sondas com um comprimento de pelo menos 100 nucleotídeos, pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 0,3 % SDS, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e 50 % formamida, seguindo procedimentos comuns de “Southern blotting” por 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma por 15 minutos, usando 2X SSC, 0,2 % SDS a 70°C.

[00067] Condições de estríngência muito baixa: O termo “condições de muito baixa estríngência” significa, para sondas com um comprimento de pelo menos 100 nucleotídeos, pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 0,3 % SDS, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e 25% formamida, seguindo procedimentos comuns de “Southern blotting” por 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma por 15 minutos, usando 2X SSC, 0,2% SDS a 45°C.

[00068] Material contendo xilana: O termo “material contendo xilana” significa qualquer material compreendendo um polissacarídeo da parede celular de plantas contendo uma estrutura principal de resíduos xilose ligados em beta-(l-4). Xilanas de plantas terrestres são heteropolímeros possuindo uma cadeia principal beta-(l-4)-D-xilopiranose, que é ramificada por cadeias curtas de carboidratos. Eles compreendem ácido D-glucurônico ou seu éter de 4-O-metila, L-arabinose, e/ou vários oligossacarídeos, compostos por D-xilose, L-arabinose, D- ou L-galactose, e D-glucose. Os polissacarídeos do tipo xilana podem ser divididos em homoxilanas e heteroxilanas, que incluem glucuronoxilanas, (arabino)glucuronoxilanas, (glucurono)arabinoxilanas, arabinoxilanas, e heteroxilanas complexas. Ver, por exemplo, Ebringerova et al., 2005, Adv. Polym. Sei. 186: 1-67.

[00069] Nos processos da presente invenção pode ser usado qualquer material contendo xilana. Em um aspeto preferencial, o material contendo xilana é lignocelulose.

[00070] Atividade de degradação de xilana ou atividade xilanolítica: O termo “atividade de degradação de xilana” ou “atividade xilanolítica” significa uma atividade biológica que hidrolisa material contendo xilana. As duas abordagens básicas para medir a atividade xilanalítica incluem: (1) medir a atividade xilanalítica total, e (2) medir as atividades xilanalíticas individuais (p.ex., endoxilanases, beta-xilosidases, arabinofuranosidases, alfa-glucuronidases, acetilxilana esterases, feruloil esterases, e alfa-glucuronil esterases). Os progressos recentes em ensaios de enzimas xilanolíticas foram resumidos em várias publicações, incluindo Biely e Puchard, 2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11): 1636-1647; Spanikova e Biely, 2006, Glucuronoyl esterase - Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune, FEBS Letters 580(19): 4597-4601; Herrmann, Vrsanska, Jurickova, Hirsch, Biely, e Kubicek, 1997, The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase, Biochemical Journal 321: 375381.

[00071] A atividade de degradação total de xilana pode ser medida por determinação dos açúcares redutores formados a partir de vários tipos de xilana, incluindo, por exemplo, xilanas de espelta de aveia, madeira de faia, e madeira de lariço, ou por determinação fotométrica de fragmentos de xilana corada liberados de várias xilanas covalentemente coradas. O ensaio mais comum de atividade xilanolítica total é baseado na produção de açúcares redutores a partir de 4-O-metil glucuronoxilana polimérica como descrito em Bailey, Biely, Poutanen, 1992, Interlab oratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23(3): 257-270. A atividade de xilanase também pode ser determinada com 0,2 % AZCL-arabinoxilana como substrato em 0,01 % TRITON® X-100 (4-(l,l,3,3-tetrametilbutil)fenil- polietileno glicol) e 200 mM tampão de fosfato de sódio pH 6 a 37°C. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 μmole de azurina produzida por minuto a 37°C, pH 6 a partir de 0,2 % AZCL-arabinoxilana como substrato em tampão 200 mM fosfato de sódio pH 6.

[00072] Para propósitos da presente invenção, atividade de degradação de xilana é determinada por medição do aumento na hidrólise de xilana de madeira de bétula (Sigma Chemical Co., Inc., St. Louis, MO, EUA) por enzima(s) de degradação de xilana sob as seguintes condições típicas: reações de 1 mL, 5 mg/mL de substrato (sólidos totais), 5 mg de proteína xilanolítica/g de substrato, 50 mM acetato de sódio pH 5, 50°C, 24 horas, análise de açúcares usando o ensaio de hidrazida do ácido /j-hidroxibenzoico (PHBAH) como descrito por Lever, 1972, “A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates”, Anal. Biochem 47: 273-279.

[00073] Xilanase: O termo “xilanase” significa uma 1,4-beta-D-xilan- xilohidrolase (E.C. 3.2.1.8) que catalisa a endohidrólise de ligações 1,4-beta- D-xilosidicas em xilanas. Para propósitos da presente invenção, a atividade de xilanase pode ser determinada com AZCL-arabinoxilana a 0,2 % como substrato em TRITON® X-100 a 0,01 % e tampão fosfato de sódio a 200 mM pH 6 a 37°C. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 μmole de azurina produzida por minuto a 37°C, pH 6 a partir de AZCL- arabinoxilana a 0,2 % como substrato em fosfato de sódio a 200 mM pH 6.

Descrição Detalhada da Invenção

[00074] A presente invenção se relaciona a polipeptídeos híbridos isolados tendo atividade de celobiohidrolase, compreendendo: (a) um primeiro fragmento de polipeptídeo compreendendo um domínio de celobiohidrolase catalítico na extremidade N-terminal do polipeptídeo híbrido selecionado a partir do grupo consistindo em (i) um fragmento de polipeptídeo tendo pelo menos 96% de identidade de sequência com os aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2; (ii) um fragmento de polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo possuindo pelo menos 96% de identidade de sequência com os nucleotídeos 55 a 1485 de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA; e (iii) um fragmento de polipeptídeo compreendendo ou consistindo nos aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2; e (b) um segundo fragmento de polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação de carboidrato na extremidade C-terminal do segundo fragmento de polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em (i) um fragmento de polipeptídeo tendo pelo menos 96% de identidade de sequência com os aminoácidos 485 a 529 de SEQ ID NO: 4; (ii) um fragmento de polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo possuindo pelo menos 96% de identidade de sequência com os nucleotídeos 1453 a 1587 de SEQ ID NO: 3; e (iii) um fragmento de polipeptídeo compreendendo ou consistindo nos aminoácidos 485 a 529 de SEQ ID NO: 4.

[00075] Em um primeiro aspeto, o primeiro fragmento de polipeptídeo na extremidade N-terminal do polipeptídeo híbrido tem uma identidade de sequência com os aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 96%, por ex., pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, Em uma modalidade, o primeiro fragmento de polipeptídeo difere em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, dos aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2.

[00076] Em uma outra modalidade, o primeiro fragmento de polipeptídeo é de pelo menos 370 aminoácidos, por exemplo, pelo menos 380, pelo menos 390, pelo menos 400, pelo menos 410, pelo menos 420, ou pelo menos 430 aminoácidos. Numa outra modalidade, o primeiro fragmento de polipeptídeo é de 437 aminoácidos.

[00077] Em outra modalidade, o primeiro fragmento de polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento. Em outro aspeto, o primeiro fragmento de polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2.

[00078] Em um outro primeiro aspeto, o segundo fragmento de polipeptídeo na extremidade C-termínal do primeiro fragmento de polipeptídeo tem uma identidade de sequência com os aminoácidos 485 a 529 de SEQ ID NO: 4 de pelo menos 96%, por ex., pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, Em uma modalidade, o segundo fragmento de polipeptídeo difere em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, dos aminoácidos 485 a 529 de SEQ ID NO: 4.

[00079] Em uma outra modalidade, o segundo fragmento de polipeptídeo é de pelo menos 34 aminoácidos, por exemplo, pelo menos 36, pelo menos 38, pelo menos 40, pelo menos 42, ou pelo menos 44 aminoácidos. Numa outra modalidade, o segundo fragmento de polipeptídeo é de 45 aminoácidos.

[00080] Em outra modalidade, o segundo fragmento de polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 485 a 529 de SEQ ID NO: 4 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento. Em outra modalidade, o segundo fragmento de polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 485 a 529 de SEQ ID NO: 4.

[00081] Em um segundo aspeto, o primeiro fragmento de polipeptídeo é codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de muito baixa estringência, condições de baixa estringência, condições de média estringência, condições de média-elevada estringência, condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência com (i) os nucleotídeos 55 a 1485 de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência cDNA dos nucleotídeos 55 a 1485 de SEQ ID NO: 1 ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[00082] Em um outro segundo aspeto, o segundo fragmento de polipeptídeo é codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de muito baixa estringência, condições de baixa estringência, condições de média estringência, condições de média-elevada estringência, condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência com os nucleotídeos 1453 a 1587 de SEQ ID NO: 3 ou o seu complemento completo (Sambrook et al., 1989, supra}.

[00083] Os nucleotídeos 55 a 1485 de SEQ ID NO: 1 ou os nucleotídeos 1453 a 1587 de SEQ ID NO: 3, ou suas subsequências, bem como os aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos 485 a 529 de SEQ ID NO: 4 ou os seus fragmentos, podem ser usados para desenhar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA codificando polipeptídeos tendo atividade de celobiohidrolase ou polipeptídeos tendo atividade de ligação de carboidratos a partir de estirpes de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridiação com DNA genômico ou cDNA de uma célula de interesse, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão, de modo a identificar e isolar o gene correspondente aí presente. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 15, p.ex., pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos em comprimento. Preferencialmente, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, p.ex., pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos em comprimento. Podem ser usadas sondas DNA e RNA. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com P, H, S, biotina, ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.

[00084] Uma biblioteca de DNA genômicos ou cDNA preparada a partir de tais outras estirpes pode ser rastreada quanto a DNA que hibrida com as sondas descritas acima e codifica um polipeptídeo tendo atividade celulolítica intensificadora. DNA genômico ou outro de tais outras estirpes pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, ou outras técnicas de separação. DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido e imobilizado em nitrocelulose ou outro material transportador adequado. De forma a identificar um clone de DNA que hibrida com essa sonda, o material de suporte é utilizado em uma transferência de Southern.

[00085] Para propósitos da presente invenção, híbridação indica que os polinucleotídeos hibridam com uma sonda de ácido nucleico marcada correspondendo os nucleotídeos 55 a 1485 de SEQ ID NO: 1 ou os nucleotídeos 1453 a 1587 de SEQ ID NO: 3; ou subsequências desses, sob condições de estringência muito baixas a muito elevadas. Moléculas com as quais a sonda de ácido nucleico hibrida sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[00086] Em uma modalidade, a sonda de ácido nucleico é os nucleotídeos 55 a 1485 de SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, a sonda de ácido nucleico é os nucleotídeos 1453 a 1587 de SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica os aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento. Em outra modalidade, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica os aminoácidos 485 a 529 de SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento.

[00087] Para sondas curtas de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, as condições de estringência são definidas como pré-hibridização e hibridização a cerca de 5°C a 10°C abaixo da Tm calculada usando o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 48:1390) em 0,9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl pH 7,6, 6 mM EDTA, 0,5% NP-40, IX solução de Denhardt, 1 mM pirofosfato de sódio, 1 mM fosfato de sódio monobásico, 0,1 mM ATP, e 0,2 mg de RNA de fermento por ml seguindo procedimentos de transferência Southern padrão por 12 a 24 horas, de modo ótimo. O material portador é finalmente lavado uma vez em 6X SCC mais 0,1% SDS por 15 minutos e duas vezes cada durante 15 minutos usando 6X SSC entre 5°C a 10°C abaixo do Tm calculado.

[00088] Em um terceiro aspeto, o primeiro fragmento de polipeptídeo é codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequência com os nucleotídeos 55 a 1485 de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de cDNA do mesmo de pelo menos 96%, por ex., pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%,

[00089] Em outro terceiro aspeto, o segundo fragmento de polipeptídeo é codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequência com os nucleotídeos 1453 a 1587 de SEQ ID NO: 3 de pelo menos 96%, por ex., pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%.

[00090] Em uma modalidade, o polipeptídeo híbrido com atividade de celobiohidrolase compreende ou consiste em SEQ ID NO: 6 ou o seu polipeptídeo maduro, ou um seu fragmento tendo atividade de celobiohidrolase e atividade de ligação de carboidrato. Em outra modalidade, o polipeptídeo híbrido com atividade de celobiohidrolase compreende ou consiste em SEQ ID NO: 6 ou o seu polipeptídeo maduro. Em outra modalidade, o polipeptídeo híbrido tendo atividade de celobiohidrolase compreende os ou consiste nos aminoácidos 19 a 520 de SEQ ID NO: 6, ou um seu fragmento tendo atividade de celobiohidrolase e atividade de ligação de carboidrato. Em outra modalidade, o polipeptídeo híbrido tendo atividade de celobiohidrolase compreende os ou consiste nos aminoácidos 19 a 520 de SEQ ID NO: 6.

[00091] Em cada uma das modalidades acima, o polipeptídeo híbrido maduro pode ainda compreender um peptídeo sinal. Em uma modalidade, o peptídeo sinal é o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 6. Em uma outra modalidade, o peptídeo sinal consiste nos aminoácidos 1 a 18 de SEQ ID NO: 6.

Polinucleotídeos

[00092] A presente invenção também se relaciona a polipeptídeos isolados codificando polinucleotídeos híbridos tendo atividade de celobiohidrolase, compreendendo: (a) um primeiro polinucleotídeo codificando um primeiro fragmento de polipeptídeo na extremidade N-terminal do polipeptídeo híbrido selecionado a partir do grupo consistindo em (i) um polinucleotídeo codificando um fragmento de polipeptídeo tendo pelo menos 96% de identidade de sequência com os aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2; (ii) um polinucleotídeo codificando um fragmento de polipeptídeo possuindo pelo menos 96% de identidade de sequência com os nucleotídeos 55 a 1485 de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA; e (iii) um polinucleotídeo codificando um fragmento de polipeptídeo compreendendo ou consistindo nos aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2; e (b) um segundo polinucleotídeo codificando um segundo fragmento de polipeptídeo na extremidade C-terminal do primeiro fragmento de polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em (i) um polinucleotídeo codificando um fragmento de polipeptídeo tendo pelo menos 96% de identidade de sequência com os aminoácidos 485 a 529 de SEQ ID NO: 4; (ii) um polinucleotídeo codificando um fragmento de polipeptídeo possuindo pelo menos 96% de identidade de sequência com os nucleotídeos 1453 a 1587 de SEQ ID NO: 3; e (iii) um polinucleotídeo codificando um fragmento de polipeptídeo compreendendo ou consistindo nos aminoácidos 485 a 529 de SEQ ID NO: 4.

[00093] Em um primeiro aspeto, o primeiro polinucleotídeo codifica o primeiro fragmento de polipeptídeo tendo uma identidade de sequência com os aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 96%, por ex., pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%.

[00094] Em um outro primeiro aspeto, o segundo polinucleotídeo codifica o segundo fragmento de polipeptídeo na extremidade C-terminal do primeiro fragmento de polipeptídeo tendo uma identidade de sequência com os aminoácidos 485 a 529 de SEQ ID NO: 4 de pelo menos 96%, por ex., pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%.

[00095] Em um segundo aspeto, o primeiro polinucleotídeo codificando o primeiro fragmento de polipeptídeo hibrida sob condições de muito baixa estringência, condições de baixa estringência, condições de média estringência, condições de média-elevada estringência, condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência com (i) os nucleotídeos 55 a 1485 de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência cDNA dos nucleotídeos 55 a 1485 de SEQ ID NO: 1 ou (iii) o seu complemento completo de (i) ou (ii) (Sambrook et al., 1989, supra).

[00096] Em outro segundo aspeto, o segundo polinucleotídeo codificando o segundo fragmento de polipeptídeo hibrida sob condições de muito baixa estringência, condições de baixa estringência, condições de média estringência, condições de média-elevada estringência, condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência com os nucleotídeos 1453 a 1587 de SEQ ID NO: 3 ou o seu complemento completo (Sambrook et al., 1989, supra).

[00097] Em um terceiro aspeto, o primeiro polinucleotídeo codificando o primeiro fragmento de polipeptídeo tem uma identidade de sequência com os aminoácidos 55 a 1485 de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de cDNA do mesmo de pelo menos 96%, por ex., pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, Em uma modalidade, o primeiro polinucleotídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 55 a 1485 de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA.

[00098] Em outro terceiro aspeto, o segundo polinucleotídeo codificando o segundo fragmento de polipeptídeo tem uma identidade de sequência com os aminoácidos 1453 a 1587 de SEQ ID NO: 3 de pelo menos 96%, por ex., pelo menos 97%>, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%. Em uma modalidade, o segundo polinucleotídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1453 a 1587 de SEQ ID NO: 3.

[00099] Em outra modalidade, o polipeptídeo híbrido com atividade de celobiohidrolase é codificado por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 5 ou o polipeptídeo maduro codificando a sua sequência, ou uma sua subsequência codificando um fragmento tendo atividade de celobiohidrolase e atividade de ligação a carboidratos; ou o seu cDNA. Em outra modalidade, o polipeptídeo híbrido com atividade de celobiohidrolase é codificado por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo nos nucleotídeos 55 a 1680 de SEQ ID NO: 5 ou uma sua subsequência codificando um fragmento tendo atividade de celobiohidrolase e atividade de ligação de carboidrato. Em outra modalidade, o polipeptídeo híbrido tendo atividade de celobiohidrolase compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6 um seu fragmento tendo atividade de celobiohidrolase e atividade de ligação de carboidrato. Em outra modalidade, o polipeptídeo híbrido tendo atividade de celobiohidrolase compreende os ou consiste nos aminoácidos 19 a 520 de SEQ ID NO: 6 um seu fragmento tendo atividade de celobiohidrolase e atividade de ligação de carboidrato.

[000100] Em cada uma das modalidades acima, o polipeptídeo híbrido maduro codificando sequência pode ainda compreender um peptídeo sinal codificando sequência. Em uma modalidade, o peptídeo sinal é o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 2. Em uma outra modalidade, o peptídeo sinal consiste nos aminoácidos 1 a 18 de SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, o peptídeo sinal codificando sequência é o peptídeo sinal codificando sequência de SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, o peptídeo sinal codificando sequência consiste nos nucleotídeos 1 a 54 de SEQ ID NO: 1.

Construtos de Ácidos Nucleicos

[000101] A presente invenção se relaciona também com construtos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo híbrido da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[000102] O polinucleotídeo pode ser manipulado de uma variedade de modos para proporcionar expressão do polipeptídeo híbrido. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.

[000103] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo híbrido da presente invenção. O promotor contém sequências de controle transcricionais que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados, e híbridos, e pode ser obtido de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

[000104] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição dos construtos de ácidos nucleicos da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos do gene da alfa- amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, gene da alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, gene da penicilinase (penP) de Bacillus licheniformis, gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gene da levansucrase (sacB) de Bacillus subtilis , genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene crylllA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gene da agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor, e gene da beta-lactamase procariótico (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 21-25). Promotores adicionais são descritos em Useful proteins from recombinant bacteria em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra. Exemplos de promotores tandem são divulgados em WO 99/43835.

[000105] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição dos constructos de ácidos nucleicos da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são os promotores obtidos dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase ácida estável de Aspergillus niger, glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum ÇWQ 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidase de Trichoderma reesei, celobiohidrolase I de Trichoderma reesei, celobiohidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, xilanase III de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, e fator de alongamento da tradução de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus', exemplos não limitantes incluem promotores modificados de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus niger nos quais o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e seus promotores mutantes, truncados, e híbridos. Outros promotores são descritos na Patente dos E.U.A. No. 6,011,147.

[000106] Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinase (GALl) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae, e 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[000107] A sequência de controle pode ser também um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. O terminador está operacionalmente ligado ao terminal 3' do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo híbrido. Na presente invenção pode ser usado qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira.

[000108] Terminadores preferenciais para células hospedeiras bacterianas são obtidos dos genes da fosfatase alcalina (aprlí) de Bacillus clausii , alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, e RNA ribossômico (rrnB) de Escherichia coli.

[000109] Terminadores preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum, beta-glucosidase de Trichoderma reesei, celobiohidrolase I de Trichoderma reesei, celobiohidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, xilanase III de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, e fator de alongamento da tradução de Trichoderma reesei.

[000110] Terminadores preferenciais para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes dq enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

[000111] A sequência de controle pode ser também uma região estabilizadora de mRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.

[000112] Exemplos de regiões estabilizadoras de mRNA adequadas são obtidos de um gene crylIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e de um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

[000113] A sequência de controle pode ser também um líder, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para tradução pela célula hospedeira. O líder está operacionalmente ligado ao terminal 5' do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo híbrido. Pode ser usado qualquer líder que seja funcional na célula hospedeira.

[000114] Líderes preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da amilase TAKA de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[000115] Líderes adequados para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3- fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

[000116] A sequência de controle pode ser também uma sequência de poliadenilação, uma sequência operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina a mRNA transcrito. Pode ser usada qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira.

[000117] Sequências de poliadenilação preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas a partir dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa- glucosidase de Aspergillus niger, TARA amilase de Aspergillus oryzae e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[000118] Sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

[000119] A sequência de controle pode ser também uma região codificante do peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado ao terminal N de um polipeptídeo da presente invenção e que dirige o polipeptídeo para a via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência codificante do peptídeo sinal naturalmente ligada em grelha de leitura de tradução ao segmento da sequência codificante que codifica o polipeptídeo. Altemativamente, a extremidade 5' da sequência codificante pode conter uma sequência codificante do peptídeo sinal que é estranha à sequência codificante. Uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode ser requerida onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência codificante do peptídeo sinal. Altemativamente, uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência codificante do peptídeo sinal natural de modo a intensificar a secreção do polipeptídeo. No entanto, pode ser usada qualquer sequência codificante do peptídeo sinal que dirija o polipeptídeo expresso para a via secretora de uma célula hospedeira.

[000120] Sequências codificantes do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências codificantes do peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus, e prsA de Bacillus subtilis. Peptídeos sinal adicionais são descritos por Simonen e Paiva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[000121] Sequências codificantes do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências codificantes do peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa, e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

[000122] Peptídeos sinal úteis para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes dp fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências codificantes do peptídeo sinal úteis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

[000123] A sequência de controle pode ser também uma sequência codificantes do pró-peptídeo que codifica um pró-peptídeo posicionado no terminal N de um polipeptídeo híbrido da presente invenção. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró-polipeptídeo está geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência codificante do pró-peptídeo pode ser obtida dos genes da protease alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[000124] Quando estiverem presentes ambas as sequências de peptídeo sinal e pró-peptídeo, a sequência de pró-peptídeo é posicionada próximo do terminal N de um polipeptídeo e a sequência do peptídeo sinal é posicionada próximo do terminal N da sequência do pró-peptídeo.

[000125] Pode ser também desejável adicionar sequências reguladoras que regulam a expressão do polipeptídeo híbrido em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sequências reguladoras são aquelas que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Sequências reguladoras em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac, e trp. Em levedura, pode ser usado o sistema ADH2 ou sistema GAL1. Em fungos filamentosos, podem ser usados o promotor de glucomilase de Aspergillus niger, o promotor de alfa-amilase TAKA de Aspergillus oryzae, e o promotor de glucoamilase de Aspergillus oryzae, promotor de celobiohidrolase I de Trichoderma reesei, e promotor de celobiohidrolase II de Trichoderma reesei. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que permitem amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, estas sequências reguladoras incluem o gene da düdrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes da metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Nesses casos, o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo híbrido será operavelmente ligado à sequência reguladora.

Vetores de Expressão

[000126] A presente invenção se relaciona também com vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo híbrido da presente invenção, um promotor, e sinais de terminação transcricionais e translacionais. As várias sequências de nucleotídeos e de controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que possa incluir um ou mais locais de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo em tais locais. Altemativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Ao criar o vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor tal que a sequência codificante esteja operacionalmente ligadas às sequências de controle apropriadas para expressão.

[000127] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (p.ex., um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e possa provocar expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[000128] O vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, i.e., um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação da qual é independente da replicação cromossômica, p.ex., um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Altemativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) nos(s) qual(ais) foi integrado. Além disso, pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon.

[000129] O vetor contém preferencialmente um ou mais marcadores selecionáveis que permitem seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas, ou similares. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou virai, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos, e similares.

[000130] Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos tal como resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina, ou tetraciclina. Marcadores adequados para células hospedeiras levedura incluem, mas não estão limitados a, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Marcadores selecionáveis para utilização em uma célula hospedeira fúngica filamentosa incluem mas não estão limitados a adeA (fosforribosilaminoimidazol-succinocarboxamida sintase), adeB (fosforribosil-aminoimidazol sintase), amdS (acetamidase), argB (omitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5’-fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), bem como seus equivalentes. Preferenciais para uso em uma célula de Aspergillus são genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e um gene bar de Streptomyces hygroscopicus. Preferenciais para uso em uma célula de Trichoderma são genes adeA, adeB, amdS, hph, epyrG.

[000131] O marcador selecionável pode ser um sistema de marcador selecionável dual como descrito em WO 2010/039889. Em um aspecto, o marcador selecionável dual é um sistema de marcador selecionável dual hph-tk.

[000132] O vetor contém preferencialmente um elemento(s) que permite a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

[000133] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo híbrido ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Altemativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionamento da integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local(ais) preciso(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização precisa, os elementos de integração devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10000 pares de bases, 400 a 10000 pares de bases, e 800 a 10000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequência com a sequência alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codifícante ou codifícantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[000134] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem da replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediando a replicação autônoma que funcione em uma célula. O termo “origem da replicação” ou “replicador de plasmídeo” significa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[000135] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184 permitindo replicação em E. coli, e pUBHO, pE194, pTAlOóO e pAMBl permitindo replicação em Bacillus.

[000136] Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são origem de replicação de 2 microns, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

[000137] Exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMAI e ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMAI e a construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser alcançados de acordo com os métodos divulgados em WO 00/24883.

[000138] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo híbrido da presente invenção. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou por inclusão de um gene marcador selecionável amplifícável com o polinucleotídeo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e desse modo cópias adicionais do polinucleotídeo podem ser selecionadas por cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.

[000139] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos de um perito na técnica (ver, p.ex,, Sambrook et al., 1989, supra).

Células Hospedeiras

[000140] A presente invenção se relaciona também com células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polipeptídeo híbrido da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo. Um construto ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira tal que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossômíco ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não é idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[000141] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de um polipeptídeo híbrido da presente invenção, p.ex., um procariota ou um eucariota.

[000142] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. Bactérias Gram-positivas incluem, mas não estão limitadas a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. Bactérias Gram-negativas incluem, mas não estão limitadas a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.

[000143] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas não se limitando a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.

[000144] A célula hospedeira bacteriana pode também ser qualquer célula Streptococcus incluindo, mas não se limitando a, células Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[000145] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas não limitada a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, e Streptomyces lividans.

[000146] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser efetuada por transformação com protoplastos (ver, p.ex., Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformação com células competentes (ver, p.ex., Young e Spizizen, 1961, J. Bacterial. 81: 823-829, ou Dubnau e Davídoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), eletroporação (ver, p.ex., Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742751), ou conjugação (ver, p.ex., Koehler e Thorne, 1987, J. Bacterial. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser efetuada por transformação com protoplastos (ver, p.ex., Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, p.ex., Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser efetuada por transformação com protoplastos, eletroporação (ver, p.ex., Gong et al., 2004, Folia Microbiol. {Praha) 49: 399-405), conjugação (ver, p.ex., Mazodier et al., 1989, J. Bacterial. 171: 3583-3585), ou transdução (ver, p.ex., Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser efetuada por eletroporação (ver, p.ex., Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) ou conjugação (ver, p.ex., Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser efetuada por competência natural (ver, p.ex., Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformação com protoplastos (ver, p.ex., Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), eletroporação (ver, p.ex., Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804), ou conjugação (ver, p.ex., Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). No entanto, pode ser usado qualquer método conhecido na técnica para introdução de DNA em uma célula hospedeira.

[000147] A célula hospedeira pode ser também um eucariota, tal como uma célula de mamífero, de inseto, de planta, ou fúngica.

[000148] A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. “Fungos” como usado aqui inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota bem como os Oomycota e todos os fungos mitospóricos (como definido por Hawksworth et al., Em, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU).

[000149] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. “Levedura” como usado aqui inclui levedura ascosporógena (Endomycetales), levedura basidiosporógena, e levedura pertencendo aos Fungi Imperfecti (Biastomyceies). Uma vez que a classificação de leveduras pode mudar no futuro, para os propósitos desta invenção, a levedura deve ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, e Davenport, editores, Soc. App. Bacterial. Symposium Series No. 9, 1980).

[000150] A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia lipolytic a.

[000151] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parede miceüal composta por quitina, celulose, glucana, quitosana, manana, e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o crescimento vegetativo por leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae é por floração de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

[000152] A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

[000153] Por exemplo, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

[000154] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplastos, transformações dos protoplastos, e regeneração da parede celular de uma forma conhecida per se. Procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 1470-1474, e Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Métodos adequados para transformação de espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacterial. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de Produção

[000155] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo tendo atividade de celobiohidrolase da presente invenção compreendendo: (a) cultivo de uma célula hospedeira da presente invenção sob condições adequadas para a expressão do polipeptídeo híbrido; e opcionalmente (b) recuperação do polipeptídeo híbrido.

[000156] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção do polipeptídeo híbrido usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as células podem ser cultivadas por cultivo em balão agitado, ou fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, descontínuas, descontínuas alimentadas, ou em estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais, em um meio adequado e sob condições permitindo que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo tem lugar em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (p.ex., em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado para o meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado, pode ser recuperado de lisatos de células.

[000157] O polipeptídeo híbrido pode ser detectado usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polípeptídeos. Esses métodos de detecção podem incluir a utilização de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima ou desaparecimento de um substrato de enzimas. Por exemplo, pode ser usado um ensaio de enzimas para determinar a atividade do polipeptídeo híbrido.

[000158] O polipeptídeo híbrido pode ser recuperado através de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitando a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação, ou precipitação. Em um aspecto, é recuperado um caldo de fermentação completo compreendendo um polipeptídeo híbrido tendo atividade de celobiohidrolase da presente invenção.

[000159] O polipeptídeo híbrido pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (p.ex., permuta iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem, e de exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (p.ex., focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (p.ex., precipitação com sulfato de amónio), SDS-PAGE, ou extração (ver, p.ex., Protein Purification, J.-C. Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter polipeptídeos híbridos substancialmente puros.

[000160] Em um aspeto alternativo, o polipeptídeo híbrido não é recuperado, mas ao invés uma célula hospedeira da presente invenção expressando o polipeptídeo é usada como uma fonte do polipeptídeo.

Formulações ou Composições Celulares de Caldo de Fermentação

[000161] A presente invenção também se refere a uma formulação ou composição celular de caldo de fermentação compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. O produto de caldo de fermentação compreende adicionalmente ingredientes adicionais usados no processo de fermentação, tais como, por exemplo, células (incluindo as células hospedeiras contendo o gene codificando o polipeptídeo da presente invenção que são usadas para produzir o polipeptídeo de interesse), detritos celulares, biomassa, meios de fermentação e/ou produtos de fermentação. Em algumas formas de realização, a composição é um caldo inteiro de células mortas contendo ácido(s) orgânico(s), células mortas e/ou detritos celulares, e meio de cultura.

[000162] O termo “caldo de fermentação” como usado aqui se refere a uma preparação produzida por fermentação celular que sofre recuperação e/ou purificação nulas ou mínimas. Por exemplo, são produzidos caldos de fermentação quando culturas microbianas são cultivadas até à saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir a síntese (p.ex., expressão de enzimas por células hospedeiras) e secreção de proteínas para o meio de cultura de células. O caldo de fermentação pode compreender conteúdos não fracionados ou fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo de fermentação não é fracionado e compreende o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após as células microbianas (p.ex., células fúngicas filamentosas) serem removidas, p.ex., por centrifugação. Em algumas formas de realização, o caldo de fermentação contém meio de cultura celular gasto, enzimas extracelulares, e células microbianas viáveis e/ou não viáveis.

[000163] Em uma forma de realização, a formulação e composições celulares de caldo de fermentação compreendem um primeiro componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico com 1-5 carbonos e/ou um seu sal e um segundo componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico com 6 ou mais carbonos e/ou um seu sal. Em uma forma de realização específica, o primeiro componente de ácido orgânico é ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um seu sal, ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores e o segundo componente de ácido orgânico é ácido benzoico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido 4- metilvalérico, ácido fenilacético, um seu sal, ou uma mistura de dois ou mais dos anteriores.

[000164] Em um aspeto, a composição contém um ácido(s) orgânico(s), e opcionalmente contém adicionalmente células mortas e/ou detritos celulares. Em uma forma de realização, as células mortas e/ou detritos celulares são removidos de um caldo inteiro de células mortas para proporcionar uma composição que está isenta destes componentes.

[000165] As formulações ou composições celulares de caldo de fermentação podem compreender adicionalmente um conservante e/ou agente antimicrobiano (p.ex., bacteriostático), incluindo, mas não se limitando a, sorbitol, cloreto de sódio, sorbato de potássio, e outros conhecidos na técnica.

[000166] As formulações ou composições celulares de caldo de fermentação podem compreender adicionalmente múltiplas atividades enzimáticas, tais como uma ou mais (p.ex., várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma celulase, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma lacase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma swolenina. As formulações ou composições celulares de caldo de fermentação podem também compreender uma ou mais (p.ex., várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma hidrolase, uma isomerase, uma ligase, uma liase, uma oxidorredutase, ou uma transferase, p.ex., uma alfa-galactosidase, alfa-glucosidase, aminopeptidase, amilase, beta-galactosidase, beta-glucosidase, beta-xilosidase, carbohidrase, carboxipeptidase, catalase, celobiohidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, endoglucanase, esterase, glucoamilase, invertase, lacase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, ou xilanase.

[000167] O caldo inteiro ou composição de células mortas pode conter os conteúdos não fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo inteiro ou composição de células mortas contém o meio de cultura gasto e detritos celulares presentes após as células microbianas (p.ex., células fúngicas filamentosas) crescerem até à saturação, incubadas sob condições limitantes de carbono para permitir a síntese de proteínas (p.ex., expressão de enzima(s) celulase e/ou glucosidase). Em algumas formas de realização, o caldo inteiro ou composição de células mortas contém o meio de cultura celular gasto, enzimas extracelulares, e células fúngicas filamentosas mortas. Em algumas formas de realização, as células microbianas presentes no caldo inteiro ou composição de células mortas podem ser permeabilizadas e/ou lísadas usando métodos conhecidos na técnica.

[000168] Um caldo inteiro ou composição celular como descrito aqui é tipicamente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, tais como células mortas, detritos celulares, componentes de meios de cultura, e/ou enzima(s) insolúvel(insolúveis). Em algumas formas de realização, os componentes insolúveis podem ser removidos para proporcionar uma composição líquida clarificada.

[000169] As formulações e composições celulares de caldo inteiro da presente invenção podem ser produzidas por um método descrito em WO 90/15861 ou WO 2010/096673.

[000170] São dados em baixo exemplos de usos preferenciais das composições da presente invenção. A dosagem da composição e outras condições sob as quais a composição é usada podem ser determinadas com base em métodos conhecidos na técnica.

Composições de Enzimas

[000171] A presente invenção também se refere a composições compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. Preferencialmente, as composições são enriquecidas em tal polipeptídeo. O termo “enriquecido” indica que a atividade de celobiohidrolase da composição foí aumentada, p.ex., com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1.

[000172] As composições podem compreender um polipeptídeo da presente invenção como principal componente enzimático, por exemplo, uma composição monocomponente. Altemativamente, as composições podem compreender múltiplas atividades enzimáticas, tais como uma ou mais (p.ex., várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma celulase, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma lacase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma swolenina. As composições podem também compreender uma ou mais (p.ex., várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma hidrolase, uma isomerase, uma ligase, uma liase, uma oxidorredutase, ou uma transferase, p.ex., uma alfa-galactosidase, alfa-glucosidase, aminopeptidase, amilase, beta-galactosidase, beta-glucosidase, beta-xilosidase, carbohidrase, carboxipeptidase, catalase, celobiohidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, endoglucanase, esterase, glucoamilase, invertase, lacase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, ou xilanase. As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. As composições podem ser estabilizadas de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[000173] São dados em baixo exemplos de usos preferenciais das composições da presente invenção. A dosagem da composição e outras condições sob as quais a composição é usada podem ser determinadas com base em métodos conhecidos na técnica.

Usos

[000174] A presente invenção está também dirigida aos seguintes processos para uso de popipeptídeos híbridos, ou suas composições.

[000175] A presente invenção se relaciona também com processos para degradação de um material celulósico, compreendendo: tratamento do material celulósico com uma composição de enzimas na presença de um polipeptídeo híbrido tendo atividade de celobiohidrolase da presente invenção. Em um aspeto, os processos compreendem adicionalmente recuperação do material celulósico degradado ou convertido. Produtos solúveis da degradação ou conversão do material celulósico podem ser separados de material celulósico insolúvel usando um método conhecido na técnica, tal como, por exemplo, centrifugação, filtração, ou sedimentação por gravidade.

[000176] A presente invenção também se relaciona com processos de produção de um produto de fermentação, compreendendo: (a) sacarificação de um material celulósico com uma composição de enzimas na presença de um polipeptídeo híbrido tendo atividade de celobiohidrolase da presente invenção; (b) fermentação do material celulósico sacarificado com um ou mais (p.ex., vários) microrganismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperação do produto de fermentação da fermentação.

[000177] A presente invenção se relaciona também com processos de fermentação de um material celulósico, compreendendo: fermentação do material celulósico com um ou mais (p.ex., vários) microrganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzimas na presença de um polipeptídeo híbrido tendo atividade de celobiohidrolase da presente invenção. Em um aspeto, a fermentação do material celulósico produz um produto de fermentação. Em outro aspeto, os processos compreendem adicionalmente recuperação do produto de fermentação da fermentação.

[000178] Os processos da presente invenção podem ser usados para sacarificar o material celulósico em açúcares fermentáveis e para converter os açúcares fermentáveis em muitos produtos de fermentação úteis, p.ex., combustível, etanol potável, e/ou químicos de plataformas (p.ex., ácidos, álcoois, cetonas, gases, e similares). A produção de um produto de fermentação desejado a partir do material celulósico envolve tipicamente pré- tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação), e fermentação.

[000179] O processamento do material celulósico de acordo com a presente invenção pode ser alcançado usando métodos convencionais na técnica. Além disso, os processos da presente invenção podem ser implementados usando qualquer dispositivo convencional de processamento de biomassa configurado para operar de acordo com a invenção.

[000180] Hidrólise (sacarificação) e fermentação, separadas ou simultâneas, incluem, mas não estão limitadas a, hidrólise e fermentação separadas (SHF); sacarificação e fermentação simultâneas (SSF); sacarificação e cofermentação simultâneas (SSCF); hidrólise e fermentação híbridas (HHF); hidrólise e cofermentação separadas (SHCF); hidrólise e cofermentação híbridas (HHCF); e conversão microbiana direta (DMC), também por vezes chamado bioprocessamento consolidado (CBP). SHF usa passos de processo separados para primeiramente hidrolisar enzimaticamente o material celulósico em açúcares fermentáveis, p.ex., monômeros de glucose, celobiose, e pentose, e depois fermentar os açúcares fermentáveis em etanol. Em SSF, a hidrólise enzimática do material celulósico e a fermentação de açúcares em etanol são combinadas em um passo (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., editor, Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212). SSCF envolve a cofermentação de múltiplos açúcares (Sheehan, J., e Himmel, M., 1999, Enzymes, energy and the environment: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy’s research and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817-827). HHF envolve um passo de hidrólise separado, e adicionalmente um passo de sacarificação e hidrólise simultâneas, que podem ser levadas a cabo no mesmo reator. Os passos em um processo HHF podem ser levadas a cabo a diferentes temperaturas, i.e., sacarificação enzimática a elevada temperatura seguida por SSF a uma temperatura mais baixa que a estirpe da fermentação pode tolerar. DMC combina os três processos (produção de enzimas, hidrólise, e fermentação) em um ou mais (p.ex., vários) passos onde o mesmo organismo é usado para produzir as enzimas para a conversão do material celulósico em açúcares fermentáveis e para converter os açúcares fermentáveis em um produto final (Lynd, L. R., Weimer, P. J., van Zyl, W. H., e Pretorius, I. S., 2002, Microbial cellulose utilization: Fundamentals and biotechnology, Microbiol. Mol. Biol. Reviews 66: 506-577). É entendido aqui que qualquer método conhecido na técnica compreendendo pré-tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação), fermentação, ou uma sua combinação, pode ser usado na prática dos processos da presente invenção.

[000181] Um dispositivo convencional pode incluir um reator descontínuo alimentado agitado, um reator descontínuo agitado, um reator de fluxo contínuo agitado com ultrafiltração, e/ou um reator de coluna de fluxo de pistão contínuo (Fernanda de Castilhos Corazza, Flávio Faria de Moraes, Gisella Maria Zanin e Ivo Neitzel, 2003, Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov, A. V., e Sinitsyn, A. P., 1985, Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose: 1. A mathematical model for a batch reactor process, Enz. Microb. Technol. 7: 346-352), um reator de atrito (Ryu, S. K., e Lee, J. M., 1983, Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor, Biotechnol. Bioeng. 25: 53-65), ou um reator com agitação intensiva induzida por um campo eletromagnético (Gusakov, A. V., Sinitsyn, A. P., Davydkin, I. Y., Davydkin, V. Y., Protas, O. V., 1996, Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl. Biochem. Biotechnol. 56: 141-153). Tipos adicionais de reatores incluem reatores de leito fluidizado, de manta de lodo, imobilizados, e do tipo extrusora para hidrólise e/ou fermentação.

[000182] Pré-tratamento. Na prática dos processos da presente invenção, qualquer processo de pré-tratamento conhecido na técnica pode ser usado para desagregar os componentes de paredes celulares de plantas do material celulósico (Chandra et al., 2007, Substrate pretreatment: The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics?, Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 67-93; Galbe e Zacchi, 2007, Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production, Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 41-65; Hendriks e Zeeman, 2009, Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 100: 10-18; Mosier et al., 2005, Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 96: 673-686; Taherzadeh e Karimi, 2008, Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: A review, Int. J. of Mol. Sci. 9: 1621-1651; Yang e Wyman, 2008, Pretreatment: the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol, Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr. 2: 26-40).

[000183] O material celulósico pode ser também sujeito a redução do tamanho das partículas, crivagem, pré-embebição, molhagem, lavagem, e/ou condicionamento antes do pré-tratamento usando métodos conhecidos na técnica.

[000184] Pré-tratamentos convencionais incluem, mas não estão limitados a, pré-tratamento com vapor (com ou sem explosão), pré-tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com água quente, pré-tratamento alcalino, pré-tratamento com cal, oxidação úmida, explosão úmida, explosão de fibras com amónia, pré-tratamento com solvente orgânico, e pré-tratamento biológico. Pré-tratamentos adicionais incluem pré-tratamentos de percolação com amónia, ultrassons, eletroporação, micro-ondas, CO2 supercrítico, H2O supercrítica, ozônio, líquido iônico, e irradiação gama.

[000185] O material celulósico pode ser pré-tratado antes da hidrólise e/ou fermentação. O pré-tratamento é preferencialmente realizado antes da hidrólise. Altemativamente, o pré-tratamento pode ser levado a cabo simultaneamente com hidrólise de enzimas para liberar açúcares fermentáveis, tais como glucose, xilose, e/ou celobiose. Na maioria dos casos, o próprio passo de pré-tratamento resulta em alguma conversão da biomassa em açúcares fermentáveis (mesmo na ausência de enzimas).

[000186] Pré-tratamento com Vapor. No pré-tratamento com vapor, o material celulósico é aquecido para desagregar os componentes de paredes celulares de plantas, incluindo lignina, hemicelulose, e celulose para tomar a celulose e outras frações, p.ex., hemicelulose, acessíveis a enzimas. O material celulósico é passado por ou através de um vaso de reação onde é injetado vapor para aumentar a temperatura até à temperatura e pressão requeridas e é retido no mesmo durante o tempo de reação desejado. O pré- tratamento com vapor é preferencialmente realizado a 140-250°C, por exemplo, 160-200°C ou 170-190°C, em que o intervalo de temperaturas ótimas depende da adição de um catalisador químico. O tempo de residência para o pré-tratamento com vapor é preferencialmente 1-60 minutos, p.ex., 130 minutos, 1-20 minutos, 3-12 minutos, ou 4-10 minutos, onde o tempo de residência ótimo depende da gama de temperaturas e da adição de um catalisador químico. O pré-tratamento com vapor permite cargas de sólidos relativamente altas, tal que o material celulósico seja geralmente apenas umedecido durante o pré-tratamento. O pré-tratamento com vapor é frequentemente combinado com uma descarga explosiva do material após o pré-tratamento, que é conhecida como explosão a vapor, isto é, expansão rápida até à pressão atmosférica e fluxo turbulento do material para aumentar a área superficial acessível por fragmentação (Duff e Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe e Zacchi, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 618-628; Pedido de Patente dos E.U.A. No. 20020164730). Durante o pré-tratamento com vapor, os grupos acetila de hemicelulose são clivados e o ácido resultante autocatalisa a hidrólise parcial da hemicelulose em monossacarídeos e oligossacarídeos. A lignina é removida somente em extensão limitada.

[000187] Pré-tratamento Químico: O termo “tratamento químico” se refere a qualquer pré-tratamento químico que promova a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose, e/ou lignina. Um tal pré-tratamento pode converter celulose cristalina em celulose amorfa. Exemplos de processos de pré-tratamento químico adequados incluem, por exemplo, pré-tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com cal, oxidação úmida, explosão de fibras/por congelamento com amónia (AFEX), percolação com amónia (APR), líquido iônico, e pré-tratamentos com organosolv.

[000188] Um catalisador tal como H2SO4 ou SO2 (tipicamente 0,3 a 5 % p/p) é frequentemente adicionado antes do pré-tratamento com vapor, o que diminui o tempo e temperatura, aumenta a recuperação, e melhora a hidrólise enzimática (Ballesteros et al., 2006, Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132: 496-508; Varga et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme Microb. Technol. 39: 756-762). No pré- tratamento com ácido diluído, o material celulósico é misturado com ácido diluído, tipicamente H2SO4, e água para formar uma pasta, aquecido por vapor até à temperatura desejada, e após um tempo de residência expandido até à pressão atmosférica. O pré-tratamento com ácido diluído pode ser implementado com alguns tipos de reatores, por exemplo, reatores de fluxo de pistão, reatores contracorrente, ou reatores contracorrente contínuos com encolhimento do leito (Duff e Murray, 1996, supra', Schell et al., 2004, Bioresource Technol. 91: 179-188; Lee et al., 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 93-115).

[000189] Também podem ser usados vários métodos de pré-tratamento sob condições alcalinas. Estes pré-tratamentos alcalinos incluem, mas não estão limitados, a hidróxido de sódio, cal, oxidação úmida, percolação com amónia (APR), e explosão de fibras/por congelamento com amónia (AFEX).

[000190] O pré-tratamento com cal é realizado com óxido de cálcio ou hidróxido de cálcio a temperaturas de 85-150°C e tempos de residência de 1 hora a vários días (Wyman et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 1959-1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 673-686). WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900, e WO 2006/110901 divulgam métodos de pré-tratamento usando amónia.

[000191] A oxidação úmida é um pré-tratamento térmico realizado tipicamente a 180-200°C durante 5-15 minutos com adição de um agente oxidante tal como peróxido de hidrogênio ou sobrepressão de oxigênio (Schmidt e Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64: 139-151; Palonen et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 88: 567-574; Martin et al., 2006, J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1669-1677). O pré-tratamento é realizado preferencialmente a 1-40 % de matéria seca, p.ex., 2-30 % de matéria seca ou 5-20 % de matéria seca, e frequentemente o pH inicial é aumentado por adição de alcalino tal como carbonato de sódio.

[000192] Uma modificação do método de pré-tratamento por oxidação úmida, conhecida como explosão úmida (combinação de oxidação úmida e explosão a vapor) pode manipular matéria seca até 30 %. Na explosão úmida, o agente oxidante é introduzido durante o pré-tratamento após um certo tempo de residência. O pré-tratamento é depois finalizado por expansão até à pressão atmosférica (WO 2006/032282).

[000193] A explosão de fibras com amónia (AFEX) envolve tratamento do material celulósico com amónia líquida ou gasosa a temperaturas moderadas tais como 90-150°C e elevada pressão tal como 17-20 bar durante 5-10 minutos, onde o conteúdo de matéria seca pode ser tão elevado quanto 60 % (Gollapalli et al., 2002, Appl. Biochem. Biotechnol. 98: 23-35; Chundawat et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96: 219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 1133-1141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 2014-2018). Durante o pré-tratamento por AFEX, a celulose e as hemiceluloses permanecem relativamente intatas. Os complexos de lignina-carboidrato são clivados.

[000194] O pré-tratamento com organosolv deslignifica o material celulósico por extração usando etanol aquoso (etanol a 40-60 %) a 160-200°C durante 30-60 minutos (Pan et al., 2005, Biotechnol. Bioeng. 90: 473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94: 851-861; Kurabi et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 219-230). Ácido sulfurico é usualmente adicionado como um catalisador. No pré-tratamento com organosolv, a maioria da hemicelulose e lignina é removida.

[000195] Outros exemplos de métodos de pré-tratamento adequados são descritos por Schell et al., 2003, Appl. Biochem. and Biotechnol. Vol. 105108, p. 69-85, e Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686, e Pedido Publicado dos E.U.A. 2002/0164730.

[000196] Em um aspeto, o pré-tratamento químico é preferencialmente levado a cabo na forma de um tratamento com ácido diluído, e mais preferencialmente na forma de um tratamento contínuo com ácido diluído. O ácido é tipicamente ácido sulfurico, mas também podem ser usados outros ácidos, tais como ácido acético, ácido cítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido succínico, cloreto de hidrogênio, ou suas misturas. O tratamento com ácido fraco é conduzido na gama de pH de preferencialmente 1-5, p.ex., 1-4 ou 1-2,5. Em um aspeto, a concentração do ácido está na gama de preferencialmente 0,01 a 10 % por peso de ácido, p.ex., 0,05 a 5 % por peso de ácido ou 0,1 a 2 % por peso de ácido. O ácido é contatado com o material celulósico e mantido a uma temperatura na gama de preferencialmente 140-200°C, p.ex., 165-190°C, durante períodos variando de 1 a 60 minutos.

[000197] Em outro aspeto, o pré-tratamento tem lugar em uma pasta aquosa. Em aspetos preferenciais, o material celulósico está presente durante o pré-tratamento em quantidades preferencialmente entre 10-80 % por peso, p.ex., 20-70 % por peso ou 30-60 % por peso, tal como em torno de 40 % por peso. O material celulósico pré-tratado pode não ser lavado ou ser lavado usando qualquer método conhecido na técnica, p.ex., lavado com água.

[000198] Pré-tratamento Mecânico ou Pré-tratamento Físico: O termo “pré-tratamento mecânico” ou “pré-tratamento físico” se refere a qualquer pré-tratamento que promova a redução do tamanho das partículas. Por exemplo, tal pré-tratamento pode envolver vários tipos de trituração ou moagem (p.ex., moagem a seco, moagem úmida, ou moagem com esferas vibratórias).

[000199] O material celulósico pode ser pré-tratado fisicamente (mecanicamente) e quimicamente. O pré-tratamento mecânico ou físico pode ser acoplado com tratamento com vapor/explosão a vapor, hidrotermólise, tratamento com ácido diluído ou fraco, tratamento a elevada temperatura, elevada pressão, irradiação (p.ex., irradiação de micro-ondas), ou suas combinações. Em um aspeto, elevada pressão significa pressão na gama de preferencialmente cerca de 100 a cerca de 400 psi, p.ex., cerca de 150 a cerca de 250 psi. Em outro aspeto, elevada temperatura significa temperaturas na gama de cerca de 100 a cerca de 300°C, p.ex., cerca de 140 a cerca de 200°C. Em um aspeto preferencial, o pré-tratamento mecânico ou físico é realizado em um processo descontínuo usando um sistema hidrolisador de pistola a vapor que usa elevada pressão e elevada temperatura como definido acima, p.ex., um Hidrolisador Sunds disponível da Sunds Defibrator AB, Suécia. Os pré-tratamentos físico e químico podem ser levados a cabo sequencialmente ou simultaneamente, como desejado.

[000200] Conformemente, em um aspeto preferencial, o material celulósico é sujeito a pré-tratamento físico (mecânico) ou químico, ou qualquer sua combinação, para promover a separação e/ou liberação de celulose, hemícelulose, e/ou lignina.

[000201] Pré-tratamento Biológico: O termo “pré-tratamento biológico” se refere a qualquer pré-tratamento biológico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemícelulose, e/ou lignina a partir do material celulósico. Técnicas de pré-tratamento biológico podem envolver aplicação de microrganismos e/ou enzimas solubilizadores de lignina (ver, por exemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh e Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, em Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. O., e Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, capítulo 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alemanha, 65: 207-241; Olsson e Hahn-Hagerdal, 1996, “Fermentation of lignocellulosic hidrolysates for ethanol production”, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; e Vallander e Eriksson, 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials'. State of the art, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95).

[000202] Sacarificação. No passo de hidrólise, também conhecida como sacarificação, o material celulósico, p.ex., pré-tratado, é hidrolisado para degradar a celulose e/ou a hemicelulose em açúcares fermentáveis, tais como glucose, celobiose, xilose, xilulose, arabinose, manose, galactose, e/ou oligossacarídeos solúveis. A hidrólise é realizada enzimaticamente por uma composição enzimática como descrito aqui na presença de um polipeptídeo híbrido da presente invenção. As enzimas das composições podem ser adicionadas simultaneamente ou sequencialmente.

[000203] A hidrólise enzimática é preferencialmente levada a cabo em um ambiente aquoso adequado sob condições que podem ser prontamente determinadas por um perito na técnica. Em um aspeto, a hidrólise é realizada sob condições adequadas para a atividade da(s) enzima(s), i.e., ótimas para a(s) enzima(s). A hidrólise pode ser levada a cabo como um processo descontínuo alimentado ou contínuo onde o material celulósico é gradualmente alimentado a, por exemplo, uma solução de hidrólise contendo enzimas.

[000204] A sacarificação é geralmente realizada em reatores ou fermentadores de tanque agitado sob condições controladas de pH, temperatura, e mistura. Condições adequadas de tempo de processo, temperatura e pH podem ser prontamente determinadas por um perito na técnica. Por exemplo, a sacarificação pode durar até 200 horas, mas tipicamente é realizada durante preferencialmente cerca de 12 a cerca de 120 horas, p.ex., cerca de 16 a cerca de 72 horas ou cerca de 24 a cerca de 48 horas. A temperatura está preferencialmente situada no intervalo de cerca de 25°C até cerca de 70°C, por exemplo, cerca de 30°C até cerca de 65°C, cerca de 40°C até cerca de 60°C, ou cerca de 50°C até cerca de 55°C. O pH está preferencialmente situado no intervalo de cerca de 3 até cerca de 8, por exemplo, cerca de 3,5 até cerca de 7, cerca de 4 até cerca de 6, ou cerca de 5,0 até cerca de 5,5. O conteúdo de sólidos secos está na gama de preferencialmente cerca de 5 a cerca de 50 % por peso, p.ex., cerca de 10 a cerca de 40 % por peso ou cerca de 20 a cerca de 30 % por peso.

[000205] As composições de enzimas podem compreender qualquer proteína útil na degradação do material celulósico.

[000206] Em um aspeto, a composição de enzimas compreende ou compreende adicionalmente uma ou mais (p.ex., várias) proteínas selecionadas do grupo consistindo em uma celulase, um polipeptídeo com atividade celulolitica aumentada, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma lacase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma swolenina. Em outro aspeto, a celulase é preferencialmente uma ou mais (p.ex., várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma endoglucanase, uma celobiohidrolase, e uma beta-glucosidase. Em outro aspeto, a hemicelulase é preferencialmente uma ou mais (p.ex., várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma acetilmanana esterase, uma acetilxilana esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido cumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glucuronoíl esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase, e uma xilosidase.

[000207] Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma ou mais (p.ex., várias) enzimas celulolíticas. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende ou compreende adicionalmente uma ou mais (p.ex., várias) enzimas hemicelulolíticas. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma ou mais (p.ex., várias) enzimas celulolíticas e uma ou mais (p.ex., várias) enzimas hemicelulolíticas. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma ou mais (p.ex., várias) enzimas selecionadas do grupo de enzimas celulolíticas e enzimas hemicelulolíticas. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma endoglucanase. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma celobiohidrolase. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma beta-glucosidase. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende um polipeptídeo tendo atividade celulolítica intensificadora. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma endoglucanase e um polipeptídeo tendo atividade celulolítica intensificadora. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma celobiohidrolase e um polipeptídeo tendo atividade celulolítica intensific adora. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma beta-glucosidase e um polipeptídeo tendo atividade celulolítica intensificadora. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma endoglucanase e uma celobiohidrolase. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma endoglucanase e uma beta-glucosidase. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma celobiohidrolase e uma beta-glucosidase. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma endoglucanase, uma celobiohidrolase, e um polipeptídeo tendo atividade celulolítica intensificadora. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma endoglucanase, uma beta-glucosidase, e um polipeptídeo tendo atividade celulolítica intensificadora. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma celobiohidrolase, uma beta-glucosidase, e um polipeptídeo tendo atividade celulolítica intensificadora. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma endoglucanase, uma celobiohidrolase, e uma beta-glucosidase. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma endoglucanase, uma celobiohidrolase, uma beta-glucosidase, e um polipeptídeo tendo atividade celulolítica intensificadora.

[000208] Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma acetilmanana esterase. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma acetilxilana esterase. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma arabinanase (p.ex., alfa-L-arabinanase). Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma arabinofuranosidase (p.ex., alfa-L-arabinofuranosidase). Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma ácido cumárico esterase. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma feruloil esterase. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma galactosidase (p.ex., alfa- galactosidase e/ou beta-galactosidase). Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma glucuronidase (p.ex., alfa-D-glucuronidase). Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma glucuronoil esterase. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma mananase. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma manosidase (p.ex., beta-manosidase). Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma xilanase. Em um aspeto preferencial, a xilanase é uma xilanase da Família 10. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma xilosidase (p.ex., beta-xilosidase).

[000209] Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma esterase. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma expansina. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma lacase. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma enzima ligninolítica. Em um aspeto preferencial, a enzima ligninolítica é uma manganês peroxidase. Em outro aspeto preferencial, a enzima ligninolítica é uma lignina peroxidase. Em outro aspeto preferencial, a enzima ligninolítica é uma enzima produtora de H2O2. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma pectinase. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma peroxidase. Em outro aspeto, a composição de enzimas compreende uma protease. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma swolenina.

[000210] Nos processos da presente invenção, a(s) enzima(s) pode(m) ser adicionada(s) antes da ou durante a sacarificação, sacarificação e fermentação, ou fermentação.

[000211] Um ou mais (p.ex., vários) componentes da composição de enzimas podem ser proteínas de tipo selvagem, proteínas recombinantes, ou uma combinação de proteínas de tipo selvagem e proteínas recombinantes. Por exemplo, um ou mais (p.ex., vários) componentes podem ser proteínas nativas de uma célula, que é usada como célula hospedeira para expressar recombinantemente um ou mais (p.ex., vários) outros componentes da composição de enzimas. Um ou mais (p.ex., vários) componentes da composição de enzimas podem ser produzidos como monocomponentes, que são depois combinados para formar a composição de enzimas. A composição de enzimas pode ser uma combinação de preparações de proteína multicomponentes e monocomponentes.

[000212] As enzimas usadas nos processos da presente invenção podem estar em qualquer forma adequada para uso, tal como, por exemplo, uma formulação ou uma composição celular de caldo de fermentação, um lisato celular com ou sem detritos celulares, uma preparação de enzimas semipurificada ou purificada, ou uma célula hospedeira como uma fonte das enzimas. A composição de enzimas pode ser um pó ou granulado seco, um granulado não polvilhável, um líquido, um líquido estabilizado, ou uma enzima protegida estabilizada. Preparações de enzimas líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas por adição de estabilizantes tais como um açúcar, um álcool de açúcar ou outro poliol, e/ou ácido láctico ou outro ácido orgânico de acordo com processos estabelecidos.

[000213] As quantidades ótimas das enzimas e polípeptídeos híbridos dependem de vários fatores, incluindo a, mas não se limitando à, mistura de componentes celulolíticos e/ou hemicelulolíticos, o material celulósico, a concentração do material celulósico, o(s) pré-tratamento(s) do material celulósico, temperatura, tempo, pH, e inclusão de organismos fermentadores (p.ex., levedura para Sacarificação e Fermentação Simultâneas).

[000214] Em um aspeto, uma quantidade eficaz de enzima celulolítica ou hemicelulolítica para o material celulósico é cerca de 0,5 a cerca de 50 mg, p.ex., cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, cerca de 0,5 a cerca de 25 mg, cerca de 0,75 a cerca de 20 mg, cerca de 0,75 a cerca de 15 mg, cerca de 0,5 a cerca de 10 mg, ou cerca de 2,5 a cerca de 10 mg por g do material celulósico.

[000215] Em outro aspeto, uma quantidade eficaz de um polipeptídeo híbrido tendo atividade celobiohidrolase em relação ao material celulósico é cerca de 0,01 a cerca de 50,0 mg, p.ex., cerca de 0,01 a cerca de 40 mg, cerca de 0,01 a cerca de 30 mg, cerca de 0,01 a cerca de 20 mg, cerca de 0,01 a cerca de 10 mg, cerca de 0,01 a cerca de 5 mg, cerca de 0,025 a cerca de 1,5 mg, cerca de 0,05 a cerca de 1,25 mg, cerca de 0,075 a cerca de 1,25 mg, cerca de 0,1 a cerca de 1,25 mg, cerca de 0,15 a cerca de 1,25 mg, ou cerca de 0,25 to cerca de 1,0 mg por g do material celulósico.

[000216] Em outro aspeto, uma quantidade eficaz de um polipeptídeo híbrido tendo atividade de celobiohidrolase para a enzima celulolítica ou hemicelulolítica é cerca de 0,005 até cerca de 1,0 g, por exemplo, cerca de 0,01 até cerca de 1,0 g, cerca de 0,15 até cerca de 0,75 g, cerca de 0,15 até cerca de 0,5 g, cerca de 0,1 até cerca de 0,5 g, cerca de 0,1 até cerca de 0,25 g, ou cerca de 0,05 até cerca de 0,2 g por g de enzima celulolítica ou hemicelulolítica.

[000217] Os polipeptídeos tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de enzima hemicelulolítica bem como outras proteínas/polipeptídeos úteis na degradação do material celulósico, p.ex., polipeptídeos GH61 tendo atividade celulolítica intensificadora (coletivamente doravante “polipeptídeos tendo atividade de enzima”), podem ser derivados ou obtidos de qualquer origem adequada, incluindo origem bacteriana, fúngica, de levedura, de planta, ou de mamífero. O termo “obtido” significa também aqui que a enzima pode ter sido produzida recombinantemente em um organismo hospedeiro empregando métodos descritos aqui, em que a enzima produzida recombinantemente é nativa do ou estranha ao organismo hospedeiro ou tem uma sequência de aminoácidos modificada, p.ex., tendo um ou mais (p.ex., vários) aminoácidos que estão eliminados, inseridos e/ou substituídos, i.e., uma enzima produzida recombinantemente que é um mutante e/ou um fragmento de uma sequência de aminoácidos nativa ou uma enzima produzida por processos de embaralhamento de ácidos nucleicos conhecidos na técnica. Englobados dentro do significado de uma enzima nativa estão variantes naturais e dentro do significado de uma enzima estranha estão variantes obtidas recombinantemente, tal como por mutagênese sítio-dirigida ou embaralhamento.

[000218] Um polipeptídeo com atividade de enzima pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano Gram-positivo tal como um polipeptídeo tendo atividade de enzima de Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus, Caldicellulosiruptor, Acidothermus, Thermobifidia, ou Oceanobacillus, ou um polipeptídeo bacteriano Gram-negativo tal como um polipeptídeo tendo atividade de enzima de E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria, ou Ureaplasma.

[000219] Em um aspeto, o polipeptídeo é um polipeptídeo tendo atividade de enzima de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis.

[000220] Em outro aspeto, o polipeptídeo é um polipeptídeo tendo atividade de enzima de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[000221] Em outro aspeto, o polipeptídeo é um polipeptídeo tendo atividade de enzima de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, ou Streptomyces lividans.

[000222] O polipeptídeo tendo atividade de enzima pode ser também um polipeptídeo fúngico, e mais preferencialmente um polipeptídeo de levedura tal como um polipeptídeo tendo atividade de enzima de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrow ia', ou mais preferencialmente um polipeptídeo fúngico filamentoso tal como um polipeptídeo tendo atividade de enzima de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, ou Xylaria.

[000223] Em um aspeto, o polipeptídeo é um polipeptídeo tendo atividade de enzima de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis.

[000224] Em outro aspeto, o polipeptídeo é um polipeptídeo tendo atividade de enzima de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, ou Trichophaea saccata.

[000225] Podem ser usados mutantes quimicamente modificados ou com manipulação proteica de polipeptídeos tendo atividade de enzima.

[000226] Um ou mais (p.ex., vários) componentes da composição de enzimas podem ser um componente recombinante, i.e., produzido por clonagem de uma sequência de DNA codificando o componente único e subsequentemente transformado na célula com a sequência de DNA e expresso em um hospedeiro (ver, por exemplo, WO 91/17243 e WO 91/17244). O hospedeiro é preferencialmente um hospedeiro heterólogo (a enzima é estranha ao hospedeiro), mas o hospedeiro pode sob certas condições ser também um hospedeiro homólogo (a enzima é nativa do hospedeiro). Proteínas celulolíticas monocomponentes podem ser também preparadas por purificação de uma tal proteína a partir de um caldo de fermentação.

[000227] Em um aspeto, a uma ou mais (p.ex., várias) enzimas celulolíticas compreendem uma preparação comercial de enzimas celulolíticas. Exemplos de preparações comerciais de enzimas celulolíticas adequadas para uso na presente invenção incluem, por exemplo, CELLIC® CTec (Novozymes A/S), CELLIC® CTec2 (Novozymes A/S), CELLIC® CTec3 (Novozymes A/S), CELLUCLAST™ (Novozymes A/S), NOVOZYM™ 188 (Novozymes A/S), CELLUZYME™ (Novozymes A/S), CEREFLO™ (Novozymes A/S), e ULTRAFLO™ (Novozymes A/S), ACCELERASE™ (Genencor Int.), LAMINEX™ (Genencor Int.), SPEZYME™ CP (Genencor Int.), FILTRASE® NL (DSM); METHAPLUS® S/L 100 (DSM), ROHAMENT™ 7069 W (Rohm GmbH), FIBREZYME® LDI (Dyadic International, Inc.), FIBREZYME® LBR (Dyadic International, Inc.), ou VISCOSTAR® 150L (Dyadic International, Inc.). As enzimas celulase são adicionadas em quantidades eficazes de cerca de 0,001 a cerca de 5,0 % por peso de sólidos, p.ex., cerca de 0,025 a cerca de 4,0 % por peso de sólidos ou cerca de 0,005 a cerca de 2,0 % por peso de sólidos.

[000228] Exemplos de endoglucanases bacterianas que podem ser usadas nos processos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, uma endoglucanase de Acidothermus cellulolyticus (WO 91/05039; WO 93/15186; Patente dos E.U.A. No. 5,275,944; WO 96/02551; Patente dos E.U.A. No. 5,536,655, WO 00/70031, WO 05/093050); endoglucanase III de Thermobifida fusca (WO 05/093050); e endoglucanase V de Thermobifida fusca (WO 05/093050).

[000229] Exemplos de endoglucanases fúngicas que podem ser usadas na presente invenção incluem, mas não estão limitados, a endoglucanase I de Trichoderma reesei (Penttila et al., 1986, Gene 45: 253-263, endoglucanase 1 de Trichoderma reesei Cel7B (no. de acesso do GENBANK™ M15665), endoglucanase II de Trichoderma reesei (Saloheimo, et al., 1988, Gene 63:11-22), endoglucanase II de Trichoderma reesei Cel5A (no. de acesso do GENBANK™ M19373), endoglucanase III de Trichoderma reesei (Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64: 555-563, no. de acesso do GENBANK™ AB003694), endoglucanase V de Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228, no. de acesso do GENBANK™ Z33381), endoglucanase de Aspergillus aculeatus (Ooi et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 5884), endoglucanase de Aspergillus kawachii (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 27: 435-439), endoglucanase de Erwinia carotovara (Saarilahti et al., 1990, Gene 90: 9-14), endoglucanase de Fusarium oxysporum (no. de acesso do GENBANK™ L29381), endoglucanase de Humicola grisea var. thermoidea (no. de acesso do GENBANK™ AB003107), endoglucanase de Melanocarpus albomyces (no. de acesso do GENBANK™ MAL515703), endoglucanase de Neurospora crassa (no. de acesso do GENBANK™ XM_324477), endoglucanase V de Humicola insolens, endoglucanase de Myceliophthora thermophila CBS 117.65, endoglucanase de basidiomiceto CBS 495.95, endoglucanase de basidiomiceto CBS 494.95, endoglucanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6B, endoglucanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6C, endoglucanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7C, endoglucanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7E, endoglucanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7F, endoglucanase de Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A, e endoglucanase de Trichoderma reesei estirpe No. VTT-D-80133 (no. de acesso do GENBANK™ M15665).

[000230] Exemplos de celobiohidrolases úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, celobiohidrolase II de Aspergillus aculeatus (WO 2011/059740), celobiohidrolase I de Chaetomium thermophilum, celobiohidrolase II de Chaetomium thermophilum, celobiohidrolase I de Humicola insolens, celobiohidrolase II de Myceliophthora thermophila (WO 2009/042871), celobiohidrolase II de Thielavia hyrcanie (WO 2010/141325), celobiohidrolase II de Thielavia terrestris (CEL6A, WO 2006/074435), celobiohidrolase I de Trichoderma reesei, celobiohidrolase II de Trichoderma reesei, e celobiohidrolase II de Trichophaea saccata (WO 2010/057086).

[000231] Exemplos de beta-glucosidases úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, beta-glucosidases de Aspergillus aculeatus (Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288), Aspergillus fumigatus (WO 2005/047499), Aspergillus niger (Dan et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 4973-4980), Aspergillus oryzae (WO 2002/095014), Penicillium brasilianum IBT 20888 (WO 2007/019442 e WO 2010/088387), Thielavia terrestris (WO 2011/035029), e Trichophaea saccata (WO 2007/019442).

[000232] A beta-glucosidase pode ser uma proteína de fusão. Em um aspecto, a beta-glucosidase é uma proteína de fusão BG variante de beta-glucosidase de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637) ou uma proteína de fusão de beta-glucosidase de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637.

[000233] Outras endoglucanases, celobiohidrolases, e beta-glucosidases úteis são divulgadas em numerosas famílias de Glicosil Hidrolases usando a classificação de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, e Henrissat B., e Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

[000234] Outras enzimas celulolíticas que podem ser usadas na presente invenção são descritas em WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, Patente dos E.U.A. No. 5,457,046, Patente dos E.U.A. No. 5,648,263, e Patente dos E.U.A. No. 5,686,593.

[000235] Nos processos da presente invenção, qualquer polipeptídeo GH61 tendo atividade celulolítica intensificadora pode ser usado como um componente da composição de enzimas.

[000236] Exemplos de polipeptídeos GH61 com atividade celulolítica aumentada úteis nos processos da presente invenção incluem mas não estão limitados a polipeptídeos GH61 de Thielavia terrestris (WO 2005/074647, WO 2008/148131, e WO 2011/035027), Thermoascus aurantiacus (WO 2005/074656 e WO 2010/065830), Trichoderma reesei (WO 2007/089290), Myceliophthora thermophila (WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, e WO 2009/085868), Aspergillus fumigatus (WO 2010/138754), polipeptídeos GH61 de Penicillium pinophilum (WO 2011/005867), Thermoascus sp. (WO 2011/039319), Penicillium sp. (WO 2011/041397), e Thermoascus crustaceous (WO 2011/041504).

[000237] Em um aspeto, o polipeptídeo GH61 com atividade celulolitica aumentada é usado na presença de um cátion metálico divalente ativador solúvel de acordo com WO 2008/151043, por exemplo, manganês ou cobre.

[000238] Em outro aspeto, o polipeptídeo GH61 tendo atividade celulolitica intensificadora é usado na presença de um composto dioxi, um composto bicíclico, um composto heterocíclico, um composto contendo nitrogênio, um composto de quinona, um composto contendo enxofre, ou um licor obtido de um material celulósico pré-tratado tal como palha de milho pré-tratada (PCS).

[000239] O composto dioxi pode incluir qualquer composto adequado contendo dois ou mais átomos de oxigênio. Em alguns aspetos, os compostos dioxi contêm uma fração arila substituída como descrito aqui. Os compostos dioxi podem compreender uma ou mais (p.ex., várias) hidroxilas e/ou derivados de hidroxila, mas incluem também frações arila substituídas sem hidroxilas e derivados de hidroxila. Exemplos não limitantes dos compostos dioxi incluem pirocatecol ou catecol, ácido cafeico; ácido 3,4- diidroxibenzoico, 4-rerí-butil-5-metoxi-l,2-benzenodiol; pirogalol; ácido gálico; 3,4,5-triidroxibenzoato de metila; 2,3,4-triidroxibenzofenona; 2,6- dimetoxifenol; ácido sinapínico; ácido 3,5-diidroxibenzoico; 4-cloro-l,2- benzenodiol; 4-nitro-l,2-benzenodiol; ácido tânico; gaiato de etila; glicolato de metila; ácido diidroxifúmárico; 2-butino~l,4-diol; (ácido crocônico; 1,3- propanodiol; ácido tartárico; 2,4-pentanodiol, 3-etioxi-l,2-propanodiol; 2,4,4'- triidroxibenzofenona; cis-2-buteno-l,4-diol; 3,4-diidroxi-3-ciclobuteno-l,2- diona; diidroxiacetona; acetal de acroleína; 4-hidroxibenzoato de metila; ácido 4-hidroxibenzoico; e 3,5-dimetoxi-4-hidroxibenzoato de metila; ou um seu sal ou solvato.

[000240] Ó composto bicíclico pode incluir qualquer sistema de anel fundido substituído adequado como descrito aqui. Os compostos podem compreender um ou mais (p.ex., vários) anéis adicionais, e não estão limitados a um número específico de anéis a não ser que de outro modo definido. Em um aspeto, o composto bicíclico é um flavonoide. Em outro aspeto, o composto bicíclico é um isoflavonoide opcionalmente substituído. Em um outro aspeto, o composto bicíclico é um íon flavílio opcionalmente substituído, tal como uma antocianidina opcionalmente substituída ou antocianina opcionalmente substituída, ou um seu derivado. Exemplos não limitantes dos compostos bicíclicos incluem epicatequina; quercetina; miricetina; taxifolina; campferol; morina; acacetina; naringenina; isorramnetina; apigenina; cianidina; cianina; curomanina; queracianina; ou um seu sal ou solvato.

[000241] O composto heterocíclico pode ser qualquer composto adequado, tal como um anel aromático ou não aromático opcionalmente substituído contendo um heteroátomo, como aqui descrito. Em um aspeto, o heterocíclico é um composto compreendendo uma fração heterocicloalquila opcionalmente substituída ou uma fração heteroarila opcionalmente substituída. Em outro aspeto, a fração heterocicloalquila opcionalmente substituída ou a fração heteroarila opcionalmente substituída é heterocicloalquila com 5 membros opcionalmente substituída ou heteroarila com 5 membros opcionalmente substituída. Em um outro aspeto, heterocicloalquila opcionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída é uma fração opcionalmente substituída selecionada de pirazolila, furanila, imidazolila, isoxazolila, oxadiazolila, oxazolila, pirrolila, piridila, pirimidila, piridazinila, tiazolila, triazolila, tienila, diidrotieno-pirazolila, tianaftenila, carbazolila, benzimidazolila, benzotienila, benzofuranila, indolila, quinolinila, benzotriazolila, benzotiazolila, benzooxazolila, benzimidazolila, isoquinolinila, isoindolila, acridinila, benzoisazolila, dimetilidantoína, pirazinila, tetraidrofuranila, pirrolinila, pirrolidiníla, morfolinila, indolila, diazepinila, azepinila, tiepinila, piperidinila, e oxepinila. Em outro aspeto, a fração heterocicloalquila opcionalmente substituída ou a fração heteroarila opcionalmente substituída é uma furanila opcionalmente substituída. Exemplos não limitantes dos compostos heterocíclicos incluem (l,2-diidroxietil)-3,4-diidroxifuran-2(5H)-ona; 4-hidroxi-5-metil-3-furanona; 5-hidroxi-2(5H)-furanona; [ l,2-diidroxietil]-furan-2,3,4(5H)-triona; a- hidroxi-y-butirolactona; y-lactona ribônica; y-lactona do ácido aldohexuronicaldohexurônico; δ-lactona do ácido glucônico, 4- hidroxicumarina; diidrobenzofurano; 5-(hidroximetil)furfural; furoína; 2(5H)- furanona; 5,6-diidro-2H-piran-2-ona; e 5,6-diidro-4-hidroxi-6-metil-2H-piran- 2-ona; ou um seu sal ou solvato.

[000242] O composto contendo nitrogênio pode ser qualquer composto adequado com um ou mais átomos de nitrogênio. Em um aspeto, o composto contendo nitrogênio compreende uma amina, imina, hidroxílamina, ou fração nitróxido. Exemplos não limitantes dos compostos contendo nitrogênio incluem acetona oxima; ácido violúrico; piridino-2-aldoxima; 2-aminofenol; 1,2-benzenodiamina; 2,2,6,6-tetrametil-l-piperidiniloxi; 5,6, 7,8- tetraidrobiopterina; 6,7-dimetil-5,6,7,8-tetraidropterina; e ácido maleâmico; ou um seu sal ou solvato.

[000243] O composto de quinona pode ser qualquer composto adequado compreendendo uma fração quinona como descrito aqui. Exemplos não limitantes dos compostos de quinona incluem 1,4-benzoquinona; 1,4- naftoquinona; 2-hidroxi-1,4-naftoquinona; 2,3-dimetoxi-5-metil-1,4- benzoquinona ou coenzima Qo; 2,3,5,6-tetrametil-l,4-benzoquinona ou duroquinona; 1,4-diidroxiantraquinona; 3-hidroxi-1 -metil-5,6-indolinodiona ou adrenocromo; 4-fôrí-butil-5-metoxi-l,2-benzoquÍnona; pirroloquinolina quinona; ou um seu sal ou solvato.

[000244] O composto contendo enxofre pode ser qualquer composto adequado contendo um ou mais átomos de enxofre. Em um aspeto, o composto contendo enxofre compreende uma fração selecionada de tionila, tioéter, sulfinila, sulfonila, sulfamida, sulfonamida, ácido sulfônico, e éster sul fônico. Exemplos não limitantes dos compostos contendo enxofre incluem etanotiol; 2-propanotiol; 2-propeno-l-tiol; ácido 2-mercaptoetanossulfônico; benzenotiol; benzeno-1,2-ditiol; cisteína; metionina; glutationa; cistina; ou um seu sal ou solvato.

[000245] Em um aspeto, uma quantidade eficaz de um tal composto descrito acima para material celulósico como uma razão molar para unidades glucosila de celulose é cerca de 10'6 a cerca de 10, p.ex., cerca de 10'6 a cerca de 7,5, cerca de 10'6 a cerca de 5, cerca de 10'6 a cerca de 2,5, cerca de 10’6 a cerca de 1, cerca de 10'5 a cerca de 1, cerca de IO'5 a cerca de 10'1, cerca de 10’4 a cerca de 10"1, cerca de 10'3 a cerca de 10’1, ou cerca de 10'3 a cerca de 10’ . Em outro aspeto, uma quantidade eficaz de um tal composto descrito acima é cerca de 0,1 μM a cerca de 1 M, p.ex., cerca de 0,5 μM a cerca de 0,75 M, cerca de 0,75 μM a cerca de 0,5 M, cerca de 1 μM a cerca de 0,25 M, cerca de 1 μM a cerca de 0,1 M, cerca de 5 μM a cerca de 50 mM, cerca de 10 μM a cerca de 25 mM, cerca de 50 μM a cerca de 25 mM, cerca de 10 μM a cerca de 10 mM, cerca de 5 μM a cerca de 5 mM, ou cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM.

[000246] O termo “licor” significa a fase de solução, aquosa, orgânica, ou uma sua combinação, tendo origem no tratamento de um material de lignocelulose e/ou hemícelulose em uma pasta, ou seus monossacarídeos, p.ex., xilose, arabinose, manose, etc., sob condições como descrito aqui, e os seus conteúdos solúveis. Um licor para enriquecimento celulolítico de um polipeptídeo GH61 pode ser produzido por tratamento de um material (ou matéria-prima) de lignocelulose ou hemícelulose por aplicação de calor e/ou pressão, opcionalmente na presença de um catalisador, p.ex., ácido, opcionalmente na presença de um solvente orgânico, e opcionalmente em combinação com desagregação física do material, e depois separação da solução dos sólidos residuais. Tais condições determinam o grau de enriquecimento celulolítico obtenível através da combinação de licor e um polipeptídeo GH61 durante a hidrólise de um substrato celulósico por uma preparação de celulases. O licor pode ser separado do material tratado usando um método padrão na técnica, tal como filtração, sedimentação, ou centrifugação.

[000247] Em um aspecto, uma quantidade eficaz do licor para celulose é cerca de 10'6 até cerca de 10 g por g de celulose, por exemplo, cerca de 10'6 até cerca de 7,5 g, cerca de 10'6 até cerca de 5 g, cerca de 10'6 até cerca de 2,5 g, cerca de 10'6 até cerca de 1 g, cerca de 10’5 até cerca de 1 g, cerca de 10’5 até cerca de 10’1 g, cerca de IO 4 até cerca de 10'! g, cerca de 1O'J até cerca de 10' g, ou cerca de 10' até cerca de 10'“ g por g de celulose.

[000248] Em um aspeto, a uma ou mais (p.ex., várias) enzimas hemicelulolíticas compreendem uma preparação comercial de enzimas hemicelulolíticas. Exemplos de preparações comerciais de enzimas hemicelulolíticas adequadas para uso na presente invenção incluem, por exemplo, SHEARZYME™ (Novozymes A/S), CELLIC® HTec (Novozymes A/S), CELLIC® HTec2 (Novozymes A/S), CELLIC® HTec3 (Novozymes A/S), VISCOZYME® (Novozymes A/S), ULTRAFLO® (Novozymes A/S), PULPZYME® HC (Novozymes A/S), MULTIFECT® Xilanase (Genencor), ACCELLERASE® XY (Genencor), ACCELLERASE® XC (Genencor), ECOPULP® TX-200A (AB Enzymes), HSP 6000 Xilanase (DSM), DEPOL™ 333P (Biocatalysts Limit, País de Gales, RU), DEPOL™ 740L. (Biocatalysts Limit, País de Gales, RU), e DEPOL™ 762P (Biocatalysts Limit, País de Gales, RU).

[000249] Exemplos de xilanases úteis nos processos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, xilanases de Aspergillus aculeatus (GeneSeqP:AAR63790; WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (WO 2006/078256), Penicillium pinophilum (WO 2011/041405), Penicillium sp. (WO 2010/126772), Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/079210), e GH10 de Trichophaea saccata (WO 2011/057083).

[000250] Exemplos de beta-xilosidases úteis nos processos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, beta-xilosidases de Neurospora crassa (número de acesso do SwissProt Q7SOW4), Trichoderma reesei (número de acesso do UniProtKB/TrEMBL Q92458), e Talaromyces emersonii (número de acesso do SwissProt Q8X212).

[000251] Exemplos de acetilxilana esterases úteis nos processos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, acetilxilana esterases de Aspergillus aculeatus (WO 2010/108918), Chaetomium globosum (número de acesso do Uniprot Q2GWX4), Chaetomium gracile (número de acesso do GeneSeqP AAB82124), Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/073709), Hypocrea jecorina (WO 2005/001036), Myceliophtera thermophila (WO 2010/014880), Neurospora crassa (número de acesso do UniProt q7s259), Phaeosphaeria nodorum (número de acesso do Uniprot Q0UHJ1), e Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/042846).

[000252] Exemplos de feruloil esterases (ácido ferúlico esterases) úteis nos processos da presente invenção incluem, mas não estão limitados, a feruloil esterases de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/076122), Neosartorya fischeri (número de acesso do UniProt A1D9T4), Neurospora crassa (número de acesso do UniProt Q9HGR3), Penicillium aurantiogriseum 2009/127729), e Thielavia terrestris (WO 2010/053838 e WO 2010/065448).

[000253] Exemplos de arabinofuranosidases úteis nos processos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, arabinofuranosidases de Aspergillus niger (número de acesso do GeneSeqP AAR94170), Humicola insolens DSM 1800 (WO 2006/114094 e WO 2009/073383), e M. giganteus (WO 2006/114094).

[000254] Exemplos de alfa-glucuronidases úteis nos processos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, alfa-glucuronidases de Aspergillus clavatus (número de acesso do UniProt alccl 2), Aspergillus fumigatus (número de acesso do SwissProt Q4WW45), Aspergillus niger (número de acesso do Uniprot Q96WX9), Aspergillus terreus (número de acesso do SwissProt Q0CJP9), Humicola insolens (WO 2010/014706), Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/068565), Talaromyces emersonii (número de acesso do UniProt Q8X211), e Trichoderma reesei (número de acesso do Uniprot Q99024).

[000255] Os polipeptídeos tendo atividade de enzima usados nos processos da presente invenção podem ser produzidos por fermentação das estirpes microbianas acima notadas em um meio nutriente contendo fontes adequadas de carbono e hidrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica (ver, p.ex., Bennett, J.W. e LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Meios adequados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (p.ex., em catálogos da American Type Culture Collection). Gamas de temperaturas e outras condições adequadas para crescimento e produção de enzimas são conhecidos na técnica (ver, p.ex., Bailey, J.E., e Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw- Hill Book Company, NI, 1986).

[000256] A fermentação pode ser qualquer método de cultivo de uma célula resultando na expressão ou isolamento de uma enzima ou proteína. A fermentação pode, portanto, ser entendida como compreendendo cultivo em balão agitado, ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínua, descontínua, descontínua alimentada, ou em estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais, realizada em um meio adequado e sob condições permitindo que a enzima seja expressa ou isolada. As enzimas resultantes produzidas pelos métodos descritos acima podem ser recuperadas do meio de fermentação e purificadas por procedimentos convencionais.

[000257] Fermentação. Os açúcares fermentáveis obtidos a partir do material celulósico hidrolisado podem ser fermentados por um ou mais (p.ex., vários) microrganismos fermentadores capazes de fermentar os açúcares diretamente ou indiretamente em um produto de fermentação desejado. “Fermentação” ou “processo de fermentação” se refere a qualquer processo de fermentação ou qualquer processo compreendendo um passo de fermentação. Processos de fermentação incluem também processos de fermentação usados na indústria do álcool consumível (p.ex., cerveja e vinho), indústria de lacticínios (p.ex., produtos lácteos fermentados), indústria do couro, e indústria do tabaco. As condições de fermentação dependem do produto de fermentação desejado e organismo fermentador e podem ser facilmente determinadas por um perito na técnica.

[000258] No passo de fermentação, açúcares, liberados do material celulósico como resultado dos passos de pré-tratamento e hidrólise enzimática, são fermentados em um produto, p.ex., etanol, por um organismo fermentador, tal como uma levedura. A hidrólise (sacarificação) e fermentação podem ser separadas ou simultâneas, como descrito aqui.

[000259] Qualquer material celulósico hidrolisado adequado pode ser usado no passo de fermentação na prática da presente invenção. O material é geralmente selecionado com base no produto de fermentação desejado, i.e., a substância a ser obtida da fermentação, e no processo empregue, como é bem conhecido na técnica.

[000260] O termo “meio de fermentação” é entendido aqui como se referindo a um meio antes de o(s) microrganismo(s) fermentador(es) ser(em) adicionado(s), tal como um meio resultante de um processo de sacarificação, bem como um meio usado em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

[000261] “Microrganismo fermentador” se refere a qualquer microrganismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, adequado para uso em um processo de fermentação desejado para produzir um produto de fermentação. O organismo fermentador pode ser organismos fermentadores de hexose e/ou pentose, ou uma sua combinação. Organismos fermentadores de hexose e pentose são bem conhecidos na técnica. Microrganismos fermentadores adequados são capazes de fermentar, i.e., converter, açúcares, tais como glucose, xilose, xilulose, arabinose, maltose, manose, galactose, e/ou oligossacarídeos, diretamente ou indiretamente, no produto de fermentação desejado. Exemplos de organismos fermentadores bacterianos e fúngicos produtores de etanol são descritos por Lin et al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol. 69: 627-642.

[000262] Exemplos de microrganismos fermentadores que conseguem fermentar açúcares de hexose incluem organismos bacterianos e fúngicos, tais como levedura. Leveduras preferenciais incluem estirpes de Candida, Kluyveromyces, e Saccharomyces, p.ex., Candida sonorensis, Kluyveromyces marxianus, e Saccharomyces cerevisiae.

[000263] Exemplos de organismos fermentadores que conseguem fermentar açúcares de pentose em seu estado nativo incluem organismos bacterianos e fúngicos, tais como algumas leveduras. Leveduras preferenciais fermentadoras de xilose incluem estirpes de Candida, preferencialmente C. sheatae ou C. sonorensis', e estirpes de Pichia, preferencialmente P. stipitis, tal como P. stipitis CBS 5773. Leveduras preferenciais fermentadoras de pentose incluem estirpes de Pachysolen, preferencialmente P. tannophilus. Organismos não são capazes de fermentar açúcares de pentose, tais como xilose e arabinose, podem ser geneticamente modificados para o fazer por métodos conhecidos na técnica.

[000264] Exemplos de bactérias que podem fermentar eficazmente hexose e pentose em etanol incluem, por exemplo, Bacillus coagulans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermocellum, Clostridium phytofermentans, Geobacillus sp., Thermoanaerobacter saccharolyticum, e Zymomonas mobilis (Philippidis, 1996, supra}.

[000265] Outros organismos fermentadores incluem estirpes de Bacillus, tais como Bacillus coagulans', Candida, tais como C. sonorensis, C. methanosorbosa, C. diddensiae, C. parapsilosis, C. naedodendra, C. blankii, C. entomophilia, C. brassicae, C. pseudotropicalis, C. boidinii, C. utilis, e C. scehatae; Clostridium, tais como C. acetobutylicum, C. thermocellum, e C. phytofermentans', E. coli, especialmente estirpes de E. coli que foram geneticamente modificadas para melhorar o rendimento do etanol; Geobacillus sp.; Hansenula, tais como Hansenula anômala', Klebsiella, tais como K. oxytoca; Kluyveromyces, tais como K. marxianus, K. lactis, K. thermotolerans, e K. fragilis; Schizosaccharomyces, tais como S. pombe; Thermoanaerobacter, tais como Thermoanaerobacter saccharolyticum', e Zymomonas, tais como Zymomonas mobilis.

[000266] Em um aspeto preferencial, a levedura é uma Bretannomyces. Em um aspeto mais preferencial, a levedura é Bretannomyces clausenii. Em outro aspeto preferencial, a levedura é uma Candida. Em outro aspeto mais preferencial, a levedura é Candida sonorensis. Em outro aspeto mais preferencial, a levedura é Candida boidinii. Em outro aspeto mais preferencial, a levedura é Candida blankii. Em outro aspeto mais preferencial, a levedura é Candida brassicae. Em outro aspeto mais preferencial, a levedura é Candida diddensii. Em outro aspeto mais preferencial, a levedura é Candida entomophiliia. Em outro aspeto mais preferencial, a levedura é Candida pseudotropicalis. Em outro aspeto mais preferencial, a levedura é Candida scehatae. Em outro aspeto mais preferencial, a levedura é Candida utilis. Em outro aspeto preferencial, a levedura é uma Clavispora. Em outro aspeto mais preferencial, a levedura é Clavispora lusitaniae. Em outro aspeto mais preferencial, a levedura é Clavispora opuntiae. Em outro aspeto preferencial, a levedura é uma Kluyveromyces. Em outro aspeto mais preferencial, a levedura é Kluyveromyces fragilis. Em outro aspeto mais preferencial, a levedura é Kluyveromyces marxianus. Em outro aspeto mais preferencial, a levedura é Kluyveromyces thermotolerans. Em outro aspeto preferencial, a levedura é uma Pachysolen. Em outro aspeto mais preferencial, a levedura é Pachysolen tannophilus. Em outro aspeto preferencial, a levedura é uma Pichia. Em outro aspeto mais preferencial, a levedura é a Pichia stipitis. Em outro aspeto preferencial, a levedura é uma Saccharomyces spp. Em outro aspeto mais preferencial, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em outro aspeto mais preferencial, a levedura é Saccharomyces distaticus. Em outro aspeto mais preferencial, a levedura é Saccharomyces uvarum.

[000267] Em um aspeto preferencial, a bactéria é uma Bacillus. Em um aspeto mais preferencial, a bactéria é Bacillus coagulans. Em outro aspeto preferencial, a bactéria é uma Clostridium. Em outro aspeto mais preferencial, a bactéria é Clostridium acetobutylicum. Em outro aspeto mais preferencial, a bactéria é Clostridium phytofermentans. Em outro aspeto mais preferencial, a bactéria é Clostridium thermocellum. Em outro aspeto mais preferencial, a bactéria é Geobacilus sp. Em outro aspeto mais preferencial, a bactéria é uma Thermoanaerobacter. Em outro aspeto mais preferencial, a bactéria é Thermoanaerobacter saccharolyticum. Em outro aspeto preferencial, a bactéria é uma Zymomonas. Em outro aspeto mais preferencial, a bactéria é Zymomonas mobilis.

[000268] Leveduras comercialmente disponíveis adequadas para a produção de etanol incluem, p.ex., BIOFERM™ AFT e XR (NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, EUA), levedura ETHANOL RED™ (Fermentis/Lesaffre, EUA), FALI™ (Levedura de Fleischmann, EUA), FERMIOL™ (DSM Specialties), GERT STRAND™ (Gert Strand AB, Suécia), e levedura fresca SUPERSTART™ e THERMOSACC™ (Ethanol Technology, WI, EUA).

[000269] Em um aspeto preferencial, o microrganismo fermentador foi geneticamente modificado para proporcionar a capacidade de fermentar açúcares de pentose, tais como microrganismos utilizando xilose, utilizando arabinose, e coutilizando xilose e arabinose.

[000270] A clonagem de genes heterólogos em vários microrganismos fermentadores levou à construção de organismos capazes de converter hexoses e pentoses em etanol (cofermentação) (Chen e Elo, 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho et al., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859; Kotter e Ciriacy, 1993, Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783; Walfridsson et al., 1995, Xylose- metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TALI genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase, Appl. Environ. Microbiol. 61: 4184-4190; Kuyper et al., 2004, Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principle, FEMS Yeast Research 4: 655-664; Beall et al., 1991, Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303; Ingram et al., 1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214; Zhang et al., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda et al., 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465-4470; WO 2003/062430, xilose isomerase).

[000271] Em um aspeto preferencial, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Candida sonorensis. Em outro aspeto preferencial, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Escherichia coli. Em outro aspeto preferencial, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Klebsiella oxytoca. Em outro aspeto preferencial, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Kluyveromyces marxianus. Em outro aspeto preferencial, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Saccharomyces cerevisiae. Em outro aspeto preferencial, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Zymomonas mobilis.

[000272] E bem conhecido na técnica que os organismos descritos acima podem ser também usados para produzir outras substâncias, como descrito aqui.

[000273] O microrganismo fermentador é tipicamente adicionado ao material ou hidrolisado celulósico degradado e a fermentação é realizada durante cerca de 8 a cerca de 96 horas, p.ex., cerca de 24 a cerca de 60 horas. A temperatura está tipicamente situada entre cerca de 26°C e cerca de 60°C, por exemplo, cerca de 32°C ou 50°C, e cerca de pH 3 até cerca de pH 8, por exemplo, pH 4-5, 6, ou 7.

[000274] Em um aspeto, a levedura e/ou outro microrganismo são aplicados no material celulósico degradado e a fermentação é realizada durante cerca de 12 a cerca de 96 horas, tal como tipicamente 24-60 horas. Em outro aspeto, a temperatura é preferencialmente entre cerca de 20°C e cerca de 60°C, p.ex., cerca de 25°C a cerca de 50°C, cerca de 32°C a cerca de 50°C, ou cerca de 32°C a cerca de 50°C, e o pH é geralmente de cerca de pH 3 a cerca de pH 7, p.ex., cerca de pH 4 a cerca de pH 7. No entanto, alguns organismos fermentadores, p.ex., bactérias, têm temperaturas ótimas de fermentação mais altas. A levedura ou outro microrganismo é preferencialmente aplicada em quantidades de aproximadamente 10 a 10 , preferencialmente de aproximadamente 10 a 10 , especialmente aproximadamente 2x10 contagens de células viáveis por mL de caldo de fermentação. Guia adicional respeitantes ao uso de levedura para fermentação pode ser encontrado em, p.ex., “The Alcohol Textbook” (Editores K. Jacques, T.P. Lyons e D.R. Kelsall, Nottingham University Press, Reino Unido 1999), que é aqui incorporado por referência.

[000275] Pode ser usado um estimulador da fermentação em combinação com qualquer um dos processos descritos aqui para melhorar adicionalmente o processo de fermentação, e em particular, o desempenho do microrganismo fermentador, tal como intensificação da taxa e rendimento de etanol. Um “estimulador da fermentação” se refere a estimuladores do crescimento dos microrganismos fermentadores, em particular, levedura. Estimuladores da fermentação preferenciais para o crescimento incluem vitaminas e minerais. Exemplos de vitaminas incluem multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para- aminobenzoico, ácido fólico, riboflavina, e Vitaminas A, B, C, D, e E. Ver, por exemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002), que é aqui incorporado por referência. Exemplos de minerais incluem minerais e sais minerais que podem fornecer nutrientes compreendendo P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn, e Cu.

[000276] Produtos de fermentação: Um produto de fermentação pode ser qualquer substância derivada da fermentação. O produto de fermentação pode ser, sem limitação, um álcool (p.ex., arabinitol, «-butanol, zsobutanol, etanol, glicerol, metanol, etileno glicol, 1,3-propanodiol [propileno glicol], butanodiol, glicerina, sorbitol, e xilitol); um alcano (p.ex., pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano, e dodecano), um cicloalcano (p.ex., ciclopentano, ciclohexano, cicloheptano, e ciclooctano), um alqueno (p.ex., penteno, hexeno, hepteno, e octeno); um aminoácido (p.ex., ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina, e treonina); um gás (p.ex., metano, hidrogênio (H2), dióxido de carbono (CO2), e monóxido de carbono (CO)); isopreno; uma cetona (p.ex., acetona); um ácido orgânico (p.ex., ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucônÍco, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido láctico, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiônico, ácido succínico, e ácido xilônico); e policetídeo. O produto de fermentação pode ser também proteína como um produto de elevado valor.

[000277] Em um aspeto preferencial, o produto da fermentação é um álcool. Será entendido que o termo “álcool” engloba uma substância que contém uma ou mais frações hidroxila. Em um aspeto mais preferencial, o álcool é w-butanol. Em outro aspeto mais preferencial, o álcool é zsobutanol. Em outro aspeto mais preferencial, o álcool é etanol. Em outro aspeto mais preferencial, o álcool é metanol. Em outro aspeto mais preferencial, o álcool é arabinitol. Em outro aspeto mais preferencial, o álcool é butanodiol. Em outro aspeto mais preferencial, o álcool é etileno glicol. Em outro aspeto mais preferencial, o álcool é glicerina. Em outro aspeto mais preferencial, o álcool é glicerol. Em outro aspeto mais preferencial, o álcool é 1,3-propanodiol. Em outro aspeto mais preferencial, o álcool é sorbitol. Em outro aspeto mais preferencial, o álcool é xilitol. Ver, por exemplo, Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alemanha, 65: 207-241; Silveira, M. M., e Jonas, R., 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 400-408; Nigam, P., e Singh, D., 1995, Processes for fermentative production of xylitol - a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji, T. C., Qureshi, N. e Blaschek, H. P., 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium berijerinckií BA 101 and in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603.

[000278] Em outro aspeto preferencial, o produto da fermentação é um alcano. O alcano pode ser um alcano não ramificado ou ramificado. Em outro aspeto mais preferencial, o alcano é pentano. Em outro aspeto mais preferencial, o alcano é hexano. Em outro aspeto mais preferencial, o alcano é heptano. Em outro aspeto mais preferencial, o alcano é octano. Em outro aspeto mais preferencial, o alcano é nonano. Em outro aspeto mais preferencial, o alcano é decano. Em outro aspeto mais preferencial, o alcano é undecano. Em outro aspeto mais preferencial, o alcano é dodecano.

[000279] Em outro aspeto preferencial, o produto da fermentação é um cicloalcano. Em outro aspeto mais preferencial, o cicloalcano é ciclopentano. Em outro aspeto mais preferencial, o cicloalcano é ciclohexano. Em outro aspeto mais preferencial, o cicloalcano é cicloheptano. Em outro aspeto mais preferencial, o cicloalcano é ciclooctano.

[000280] Em outro aspeto preferencial, o produto da fermentação é um alqueno. O alqueno pode ser um alqueno não ramificado ou ramificado. Em outro aspeto mais preferencial, o alqueno é penteno. Em outro aspeto mais preferencial, o alqueno é hexeno. Em outro aspeto mais preferencial, o alqueno é hepteno. Em outro aspeto mais preferencial, o alqueno é octeno.

[000281] Em outro aspeto preferencial, o produto da fermentação é um aminoácido. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido aspártico. Em outro aspeto mais preferencial, o aminoácido é ácido glutâmico. Em outro aspeto mais preferencial, o aminoácido é glicina. Em outro aspeto mais preferencial, o aminoácido é lisina. Em outro aspeto mais preferencial, o aminoácido é serina. Em outro aspeto mais preferencial, o aminoácido é treonina. Ver, por exemplo, Richard, A., e Margaritis, A., 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid) production and other microbial biopolymers, Biotechnology and Bioengineering 87 (4): 501-515.

[000282] Em outro aspeto preferencial, o produto da fermentação é um gás. Em outro aspeto mais preferencial, o gás é metano. Em outro aspeto mais preferencial, o gás é H2. Em outro aspeto mais preferencial, o gás é CO2. Em outro aspeto mais preferencial, o gás é CO. Ver, por exemplo, Kataoka, N., A. Miya, e K. Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria, Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47; e Gunaseelan V.N. em Biomass and Bioenergy, Vol. 13 (1-2), pp. 83-114, 1997, Anaerobic digestion of biomass for methane production'. A review.

[000283] Em outro aspeto preferencial, o produto da fermentação é isopreno.

[000284] Em outro aspeto preferencial, o produto da fermentação é uma cetona. Será entendido que o termo “cetona” engloba uma substância que contém uma ou mais frações cetona. Em outro aspeto mais preferencial, a cetona é acetona. Ver, por exemplo, Qureshi e Blaschek, 2003, supra.

[000285] Em outro aspeto preferencial, o produto da fermentação é um ácido orgânico. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido acético. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido acetônico. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido adípico. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido ascórbico. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido cítrico. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido 2,5-dÍceto-D- glucônico. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido fórmico. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido fumárico. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido glucárico. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido glucônico. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido glucurônico. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido glutárico. Em outro aspeto preferencial, o ácido orgânico é ácido 3- hidroxipropiônico. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido itacônico. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido láctico. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido málico. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido malônico. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido oxálico. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido propiônico. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido succínico. Em outro aspeto mais preferencial, o ácido orgânico é ácido xilônico. Ver, por exemplo, Chen, R., e Lee, Y. Y., 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl, Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448.

[000286] Em outro aspeto preferencial, o produto da fermentação é policetídeo.

[000287] Recuperação. O(s) produto(s) de fermentação pode(m) ser opcionalmente recuperado(s) do meio de fermentação usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia, procedimentos eletroforéticos, solubilidade diferencial, destilação, ou extração. Por exemplo, o álcool é separado do material celulósico fermentado e purificado por métodos convencionais de destilação. Pode ser obtido etanol com uma pureza até cerca de 96 % por volume, que pode ser usado como, por exemplo, etanol para combustível, etanol potável, i.e., bebidas alcoólicas neutras potáveis, ou etanol industrial.

Plantas

[000288] A presente invenção se relaciona também com plantas, p.ex., uma planta, parte de planta, ou célula de planta transgênica, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção de modo a expressarem e produzirem um polipeptídeo híbrido tendo atividade celobiohidrolase em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo híbrido pode ser recuperado da planta ou parte de planta. Altemativamente, a planta ou parte de planta contendo o polipeptídeo híbrido pode ser usada como tal para melhoria da qualidade de um alimento ou ração, p.ex., melhoria do valor nutricional, palatabilidade, e propriedades reológicas, ou para destruir um fator antinutritivo.

[000289] A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou monocotiledônea (uma monocot). Exemplos de plantas monocot são gramíneas, tais como gramíneas dos prados (poácea, Poa), gramíneas forrageiras tais como Festuca, Lolium, gramíneas temperadas, tais como Agrostis, e cereais, p.ex., trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo, e milho.

[000290] Exemplos de plantas dicot são tabaco, legumes, tais como tremoços, batata, beterraba-sacarina, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tais como couve-flor, colza, e o organismo modelo relacionado de perto Arabidopsis thaliana.

[000291] Exemplos de partes de plantas são caule, calo, folhas, raiz, frutos, sementes, e tubérculos, bem como os tecidos individuais compreendendo estas partes, p.ex., epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Compartimentos específicos de células de plantas, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocôndrias, vacúolos, peroxissomos e citoplasma, são também considerados uma parte de planta. Além do mais, qualquer célula de planta, independentemente da origem do tecido, é considerada como sendo uma parte de planta. De igual modo, partes de plantas tais como tecidos e células específicos isolados para facilitar a utilização da invenção são também consideradas partes de plantas, p.ex., embriões, endospérmios, aleurona e sedimentos de sementes.

[000292] Também incluída dentro do escopo da presente invenção é a descendência de tais plantas, partes de plantas, e células de plantas.

[000293] A planta ou célula de planta transgênica expressando o polipeptídeo híbrido pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em resumo, a planta ou célula de planta é construída por incorporação de um ou mais construtos de expressão codificando o polipeptídeo híbrido no genoma da planta hospedeira ou genoma do cloroplasto e propagação da planta ou célula de planta modificada resultante em uma planta ou célula de planta transgênica.

[000294] O construto de expressão é convenientemente um construto de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo híbrido operacionalmente ligado a sequências reguladoras apropriadas requeridas para expressão do polinucleotídeo na planta ou parte de planta de escolha. Além do mais, o construto de expressão pode compreender um marcador selecionável útil para identificação de células de plantas nas quais foi integrada o construto de expressão e sequências de DNA necessárias para introdução do construto na planta em questão (estas últimas dependem do método de introdução de DNA a ser usado).

[000295] A escolha de sequências reguladoras, tais como sequências promotoras e terminadoras e opcionalmente sequências sinal ou de trânsito, é determinada, por exemplo, com base em quando, onde, e como é desejado que o polipeptídeo híbrido seja expresso. Por exemplo, a expressão do gene que codifica um polipeptídeo pode ser constitutiva ou induzível, ou pode ser específica para o desenvolvimento, estágio ou tecido, e o produto genético pode ser direcionado para um tecido ou parte de planta específico, como sementes ou folhas. Sequências reguladoras são, por exemplo, descritas por Tague etal., 1988, Plant Physiology 86: 506.

[000296] Para expressão constitutiva, pode ser usado o promotor de 35S-CaMV, ubiquitina 1 do milho, ou actina 1 do arroz (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Promotores específicos quanto a órgãos podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos de dreno de armazenamento tais como sementes, tubérculos de batata, e frutos (Edwards e Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos de dreno metabólico tais como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor específico quanto a sementes tal como o promotor de glutelina, prolamina, globulina, ou albumina do arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885-889), um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene de proteína de sementes desconhecida de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), um promotor de uma proteína do corpo oleaginoso de sementes (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), o promotor da proteína de reserva napA de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico para sementes conhecido na técnica, p.ex., como descrito em WO 91/14772. Além do mais, o promotor pode ser um promotor específico quanto a folhas tal como o promotor rbcs do arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000), o promotor do gene de adenina metiltransferase do vírus Chlorella (Mitra e Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), o promotor do gene aldP doe arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674), ou um promotor induzível por ferida tai como o promotorpin2 da batata (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). De igual modo, o promotor pode ser induzido por tratamentos abióticos tais como temperatura, seca, ou alterações na salinidade ou induzido por substâncias exogenamente aplicadas que ativam o promotor, p.ex,, etanol, estrogênios, hormônios de plantas tais como etileno, ácido abscísico, e ácido giberélico, e metais pesados.

[000297] Um elemento intensificador de promotores pode ser também usado para alcançar expressão mais elevada de um polipeptídeo híbrido na planta. Por exemplo, o elemento intensificador de promotores pode ser um íntron que é colocado entre o promotor e o polinucleotídeo codificando um polipeptídeo híbrido. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra, divulgam o uso do primeiro íntron do gene da actina 1 do arroz para intensificar a expressão.

[000298] O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes do construto de expressão podem ser escolhidos daqueles disponíveis na técnica.

[000299] O construto de ácido nucleico é incorporada no genoma da planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas na área, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeamento de partículas, transformação biolística, e eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

[000300] A transferência genética mediada por Agrobacterium tumefaciens é um método para geração de dicots transgênicas (para uma revisão, ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38) e para transformação de monocots, embora outros métodos de transformação possam ser usados para estas plantas. Um método para geração de monocots transgênicas é bombardeamento com partículas (partículas microscópicas de outro ou tungsténio revestidas com o DNA transformente) de calos embrionários ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para transformação de monocots é baseado em transformação com protoplastos como descrito por Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Métodos adicionais de transformação incluem aqueles descritos nas Patentes dos E.U.A. Nos. 6,395,966 e 7,151,204 (ambas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade).

[000301] Após transformação, os transformantes tendo incorporado o construto de expressão são selecionados e regenerados em plantas inteiras de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Frequentemente, o procedimento de transformação é desenhado para a eliminação seletiva de genes de seleção durante a regeneração ou nas gerações seguintes por uso, por exemplo, de cotransformação com dois construtos separados de T-DNA ou excisão sítio-específica do gene de seleção por uma recombinase específica.

[000302] Adicionalmente à transformação direta de um genótipo particular de planta com um construto da presente invenção, podem ser feitas plantas transgênicas por cruzemento de uma planta tendo o construto com uma segunda planta à qual falta do construto. Por exemplo, um construto codificando um polipeptídeo híbrido pode ser introduzido em uma variedade de planta particular por cruzamento, sem necessidade de transformação direta de uma planta dessa dada variedade. Portanto, a presente invenção engloba não só uma planta diretamente regenerada a partir de células que foram transformadas de acordo com a presente invenção, mas também a descendência de tais plantas. Como usado aqui, descendência pode se referir à descendência de qualquer geração de uma planta genitora preparada de acordo com a presente invenção. Tal descendência pode incluir um construto de DNA preparado de acordo com a presente invenção. O cruzamento resulta em introdução de um transgene em uma linhagem de planta por polinização cruzada de uma linhagem de partida com uma linhagem de planta dadora. Exemplos não limitantes de tais passos são descritos na Patente dos E.U.A. No. 7,151,204.

[000303] Podem ser geradas plantas através de um processo de retroconversão. Por exemplo, plantas incluem plantas referidas como genótipo, linhagem, planta endogâmica, ou híbrido retroconvertido.

[000304] Podem ser usados marcadores genéticos para auxiliar a ingressão de um ou mais transgenes da invenção de um fundo genético para outro. A seleção auxiliada por marcadores oferece vantagens em relação ao melhoramento convencional na medida em que pode ser usada para evitar erros causados por variações fenotípicas. Adicionalmente, marcadores genéticos podem proporcionar dados dizendo respeito ao grau relativo de plasma germinativo de elite na descendência individual de um cruzamento particular. Por exemplo, quando uma planta com um traço desejado que de outro modo tem um fundo genético agronomicamente não desejável é cruzada com uma genitora de elite, podem ser usados marcadores genéticos para selecionar descendência que não só possui o traço de interesse, mas têm também uma proporção relativamente grande do plasma germinativo desejado. Deste modo, o número de gerações requerido para ingressar um ou mais traços em um fundo genético particular é minimizado.

[000305] A presente invenção também se refere a métodos de produção de um polipeptídeo híbrido da presente invenção, compreendendo (a) cultivar uma planta ou uma célula de planta transgênica compreendendo um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo híbrido em condições conducentes à produção do polipeptídeo híbrido; e, opcionalmente, (b) recuperar o polipeptídeo híbrido.

[000306] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser considerados como limitantes do escopo da invenção.

Exemplos Estirpes

[000307] A estirpe fúngica NN051602 foi isolada a partir de uma amostra composta recolhida na Província de Yunnan, China, por diluição em placas de PDA, a 45°C e, de seguida, purificada por meio de transferência de um único conídio sobre uma placa de YG. A estirpe NN051602 foi identificada como Penicillium emersonii, com base tanto em características morfológicas como na sequência ITS rDNA.

[000308] A estirpe fúngica NN051303 foi isolada a partir de uma amostra ambiental recolhida na China, por diluição em placas de PDA, a 45°C e, de seguida, purificada por meio de transferência de um único conídio sobre uma placa de agar YG. A estirpe NN051303 foi identificada como Aspergillus fumigatus, com base tanto em características morfológicas como na sequência ITS rDNA.

Meio

[000309] As placas PDA eram compostas por 39 gramas de ágar de dextrose de batata e água desionizada até 1 litro.

[000310] As placas YG eram compostas por 5 g de extrato de levedura, 10 g de glucose, 20 g de ágar, e água desionizada até 1 litro.

[000311] Placas de meio mínimo foram compostas de 342 g de sacarose, 20 ml de solução salina (2,6% de KC1, 2,6% de MgSO4-7H2O, 7,6% de KH2PO4, 2 ppm de Na2B4O7- 10H2O, 20 ppm de CuSO4'5H2O, 40 ppm de FeSO4 7H2O, 40 ppm de MnSO4-2H2O, 40 ppm de Na2MoO4-2H2O, 400 ppm de ZnSO4-7H2O), 20 g de ágar, e água desionizada até 1 litro.

[000312] Meio YPM era composto de 1 % extrato de levedura, 2 % peptona, e 2 % maltose em água desionizada.

Exemplo 1: Preparação de DNA Genômico

[000313] Penicillium emersonii NN051602 foi cultivada em uma placa PDA, a 45 0 C durante 3 dias. Os micélios foram coletados diretamente da placa de PDA em um almofariz esterilizado e congelados em nitrogênio líquido. Os micélios congelados foram moídos, com almofariz e pilão, a um pó fino, e o DNA genômico foi isolado utilizando um Estojo DNEASY® Plant Mini (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha).

[000314] A estirpe Aspergillus fumigatus NN051303 foi cultivada em uma placa PDA durante 3 dias a 45 0 C. Os micélios foram coletados diretamente da placa de PDA em um almofariz esterilizado e congelados em nitrogênio líquido. Os micélios congelados foram moídos, com almofariz e pilão, a um pó fino, e o DNA genômico foi isolado utilizando um Estojo DNEASY® Plant Mini.

Exemplo 2: PeCBHI-AfCBM híbrido construído através de clonagem de PCR

[000315] Os iniciadores de oligonucleotídeos mostrados abaixo, foram concebidos de modo a amplificarem separadamente o gene de celobiohidrolase I GH7 de comprimento completo a partir do DNA genômico de Penicillium emersonii NN051602 e o domínio CBM a partir do DNA genômico de Aspergillus fumigatus NN051303. Os iniciadores foram sintetizados pela Invitrogen, Beijing, China. Iniciador direto 1: 5’-ACACAACTGGGGATCCACCatgcttcgacgggctcttc-3’ (SEQ ID NO: 7) Iniciador reverso 1: 5’-ttccgccaccggggttcgacgaagcggtgaaggtcgagttgatc-3’ (SEQ ID NO: 8) Iniciador direto 2: 5’-gatcaactcgaccttcaccgcttcgtcgaaccccggtggcggaa-3’ (SEQ ID NO: 9) Iniciador reverso 2: 5’-GTCACCCTCTAGATCTctacaggcactgagagtaataatcattcagcttctg-3 ’ (SEQ ID NO: 10)

[000316] Os caracteres em letras maiúsculas são uma região homóloga aos locais de inserção do plasmídeo pPFJO355 (WO2011005867). As caracteres em letras minúsculas representam a região codificadora do gene celobiohidrolase I GH7 de Penicillium emersonii, e os caracteres em negrito representam a região codificadora do domínio CBM de celobiohidrolase I GH7 de Aspergillus fumigatus.

[000317] O iniciador direto 1 e o iniciador reverso 1 foram usados para amplificar o gene celobiohidrolase I GH7 de Penicillium emersonii em uma reação de PCR composta por 2 μl de DNA genômico de Penicillium emersonii, 10 μl de tampão 5X PHUSION™ HF (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia), 1,5 μl de DMSO, 2,5 mM de cada um de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 20 pmol de iniciador direto 1, 20 pmol de iniciador reverso 1, e 0,6 unidades de DNA polimerase de Alta Fidelidade PHUSION™ (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia) num volume final de 50 μl. A amplificação foi realizada utilizando um Peltier Thermal Cycler (MJ Research Inc., São Francisco do Sul, Califórnia, EUA) programado para a desnaturação a 98°C durante 1 minuto; 5 ciclos de desnaturação a 98°C durante 15 segundos, emparelhamento a 65°C durante 30 segundos, com uma diminuição de 1°C por ciclo, e uma elongação de 72°C durante 1 minuto; 23 ciclos cada um a 98°C durante 15 segundos, 63°C durante 30 segundos, e 72°C durante 1 minuto; e uma extensão final a 72°C durante 5 minutos. O bloco de calor foi depois para um ciclo de embebição a 4°C.

[000318] O produto da reação foi isolado por eletroforese em gel de 1,0 % agarose usando 90 mM de Tris- acetato de borato, 1 mM tampão de EDTA (TBE), em que uma banda de produto de aproximadamente 1,5 pb foi excisada do gel, e purificada usando um Estojo de Purificação de DNA PCR e Banda de Gel ILLUSTRA® GFX® (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante. A banda de produto de PCR foi designada produto F1 PCR.

[000319] O iniciador direto 2 e o iniciador reverso 2 foram usados para amplificar o gene celobiohidrolase I GH7 de Aspergillus fumigatus em uma reação de PCR composta por 2 μl de DNA genômico de Aspergillus fumigatus, 10 μl de tampão 5X PHUSION™ HF, 1,5 μl de DMSO, 2,5 mM de cada um de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 20 pmol de iniciador direto 2, 20 pmol de iniciador reverso 2, e 0,6 unidades de PHUSION™ High-Fidelity DNA Polymerase num volume final de 50 μl. A amplificação foi realizada utilizando um Peltier Thermal Cycler programado para a desnaturação a 98°C durante 1 minuto; 5 ciclos de desnaturação a 98°C durante 15 segundos, emparelhamento a 65°C durante 30 segundos, com uma diminuição de 1°C por ciclo, e uma elongação de 72°C durante 30 segundos; 23 ciclos cada um a 98°C durante 15 segundos, 63°C durante 30 segundos, e 72°C durante 30 segundos; e uma extensão final a 72°C durante 5 minutos. O bloco de calor foi depois para um ciclo de embebição a 4°C.

[000320] O produto da reação foi isolado por eletroforese em gel de 1,0 % agarose usando tampão TBE, em que uma banda de produto de 200 pb foi excisada do gel, e purificada usando um Estojo de Purificação de DNA PCR e Banda de Gel ILLUSTRA® GFX® de acordo com as instruções do fabricante. A banda de produto de PCR foi designada produto F3 PCR.

[000321] Os produtos Fl e F3 de PCR foram utilizados em uma extensão de sobreposição de processamento PCR (SOE, PCR) de acordo com Horton et al., 1989, Gene 77: 61-68. Brevemente, a reação de PCR foi composta por 10 μl de tampão 5X PHUSION™ HF, 1,5 μl de DMSO, 10 ng do produto de Fl PCR, 5 ng do produto de F3 PCR, 2,5 mM de cada um de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, e 0,6 unidades de PHUSION™ High-Fidelity DNA Polymerase num volume final de 46 μl. Nos seguintes ciclos térmicos, os produtos Fl e F3 PCR atuaram como iniciadores para o outro de forma a fazer alongamentos. O SOE PCR foi realizado em um Peltier Thermal Cycler programado para 1 ciclo a 98°C durante 1 minuto; 5 ciclos de desnaturação a 98°C durante 15 segundos, emparelhamento a 42°C durante 30 segundos, com uma diminuição de 1°C por ciclo, e uma elongação de 72°C durante 80 segundos; 4 ciclos cada um a 98°C durante 15 segundos, 37°C durante 30 segundos, e 72°C durante 80 segundos; e uma extensão final a 72°C durante 5 minutos. O bloco de calor foi depois para um ciclo de embebição a 4°C. O par de iniciadores, 2 μl de 10 μM de iniciador direto 1 e 2 μl de 10 μM de iniciador inverso 2, foram adicionados à solução de reação de PCR seguidos por PCR a 98°C durante 1 minuto; 5 ciclos de desnaturação a 98°C durante 15 segundos, emparelhamento a 65°C durante 30 segundos, com uma diminuição de 1°C por ciclo, e uma elongação de 72°C durante 80 segundos; 23 ciclos cada um a 98°C durante 15 segundos, 63°C durante 30 segundos, e 72°C durante 80 segundos; e uma extensão final a 72°C durante 5 minutos. O bloco de calor foi depois para um ciclo de embebição a 4°C.

[000322] Os produtos da reação foram isolados por eletroforese em gel de 1,0 % agarose usando tampão TBE, em que uma banda de produto de 1,7 kb foi excisada do gel, e purificada usando um Estojo de Purificação de DNA PCR e Banda de Gel ILLUSTRA® GFX® de acordo com as instruções do fabricante. O produto de PCR foi designado produto F5 PCR.

[000323] O plasmídeo pPFJO355 foi digerido com Bam I e Bgl II, isolado por electroforese em gel de 1,0% agarose usando tampão TBE, e purificado utilizando um Estojo de Purificação de DNA PCR e Banda de Gel ILLUSTRA® GFX® de acordo com as instruções do fabricante.

[000324] O produto F5 PCR e o vector digerido foram ligados em conjunto, utilizando um Estojo de Clonagem de Secagem (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, EUA), resultando em PF5 (Figura 1), em que a transcrição do híbrido de celobiohidrolase I GH7 de Penicillium emersonii fundido com o CBM de celobiohidrolase I GH7 de Aspergillus fumigatus estava sob o controle de um promotor a partir de um gene alfaamilase Aspergillus oryzae. Resumidamente, 30 ng de pPFJO355 digerido com Bam 1 e Bgl II, e 60 ng do produto PCR F5 foram adicionados a um frasco de reação e novamente suspensos num volume final de 10 μl, por adição de água desionizada. A reação foi incubada a 37°C durante 15 minutos e depois 50°C durante 15 minutos. Cinco μl da reação foram utilizados para transformar as células competentes E. coli TOP10 (TIANGEN Biotech (Beijing) Co. Ltd., Beijing, China). Uma transformante de E. coli contendo PF5 foi detectada pela PCR de colônias. PCR colônia é um método para a triagem rápida das inserções de plasmídeo diretamente nas colônias de E. coli. Resumidamente, em uma alíquota da solução de PCR pré-misturada em um tubo de PCR, incluindo o tampão de PCR, MgCL, dNTPs, e os pares de iniciadores a partir dos quais foi gerado o fragmento de PCR, foi adicionada uma colônia única por escolha com uma ponta estéril e girando a ponta na solução de reação. Normalmente foram rastreadas 7-10 colônias. Após o programa de PCR, as reações foram analisadas por electroforese em gel de agarose para identificar as colônias com um produto de amplificação de um tamanho esperado. O DNA de plasmídeo foi preparado utilizando um Estojo Miniprep de Rotação QIAPREP® (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha). O gene híbrido inserido no pF5 foi confirmado por sequenciação de DNA usando um Analisador 3730XL DNA (Applied Biosystems Inc., Foster City, Califórnia, EUA).

[000325] A sequência de DNA e a sequência de aminoácidos deduzida da sequência de codificação do polipeptídeo híbrido são mostradas na SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente. A sequência de codificação é 1683 bp incluindo o codão de paragem, que é interrompido por 2 intrões de 60 bp (nucleotídeos 604 a 663) e 60 bp (nucleotídeos 1229 a 1288). A proteína codificada é 520 aminoácidos com um peptídeo de sinal de 18 resíduos. A proteína madura contém 502 aminoácidos com uma massa molecular prevista de 53,32 kDa e um ponto isoeléctrico previsto de 4,16.

Exemplo 3: Expressão do gene híbrido PeCBHI-AfCBM em Aspergillus oryzae

[000326] Protoplastos de Aspergillus oryzae HowBlOl (WO 95/35385 Exemplo 1) preparados de acordo com o método de Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422, foram transformados com 3 μg de plasmídeo pF5. A transformação rendeu cerca de 50 transformantes. Doze transformantes foram isolados em placas de meio mínimo individuais.

[000327] Quatro transformantes foram inoculados separadamente em 3 ml de meio YPM em uma placa de 24 poços e incubadas a 30°C com agitação a 150 rpm. Após 3 dias de incubação, foram analisados 20 μl de sobrenadante de cada cultura através de SDS-PAGE utilizando um gel Bis-Tris NUPAGE® NOVEX® 4-12% com 50 mM de 2-(N-morfolino) ácido etanossulfônico (MES) (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califórnia, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O gel resultante foi corado com INSTANTBLUE® (Expedeon Ltd., Babraham Cambridge, Reino Unido). Os perfis de SDS- PAGE das culturas mostraram que a maioria dos transformantes tinham uma banda maior a aproximadamente 62 kDa. Um dos transformantes foi escolhido como uma estirpe de expressão, designada Aspergillus oryzae O5KRR.

Exemplo 4: Fermentação de Aspergillus oryzae O5KRR

[000328] Uma planta de Aspergillus oryzae O5KRR foi lavada com 10 ml de meio YPM e inoculada em 6 frascos de 2 litros contendo cada um 400 ml de meio YPM de forma a gerar um caldo para caracterização do polipeptídeo híbrido tendo atividade de celobiohidrolase. A cultura foi colhida no dia 3 e filtrada utilizando uma Membrana DURAPORE® de 0,45 μm (Millipore, Bedford, MA, EUA).

Exemplo 5: Purificação do recombinante híbrido PeCBHI-AfCBM de Aspergillus oryzae O5KRR

[000329] Um volume de 2400 ml de caldo filtrado de Aspergillus oryzae O5KRR (Exemplo 4) foi precipitado com sulfato de amónio (80% de saturação), re-dissolvido em 50 ml de 20 mM de acetato de sódio, pH 5,5, dialisado contra o mesmo tampão, e filtrado através um filtro de 0,45 μm. O volume final foi de 80 ml. A solução foi aplicada a uma coluna Fast Flow Q- SEPHAROSE ® de 40 ml (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido), equilibrada em 20 mM de acetato de sódio, pH 5,5 e as proteínas foram eluídas com um gradiente linear de 0-0,2 M de NaCl. As fracções foram recolhidas e analisadas por SDS-PAGE utilizando um gel Bis-Tris NUPAGE® NOVEX® 4-12% com 50 mM de MES. Foram reunidas fracções contendo uma banda a aproximadamente 62 kDa. De seguida, a solução reunida foi concentrada por ultrafiltração.

Exemplo 6: Ensaio de hidrólise de palha de milho pré-tratada

[000330] A palha de milho foi pré-tratada no Department of Energy National Renewable Energy Laboratory (NREL) dos E.U.A. usando ácido sulfúrico a 1,4 % por peso a 165°C a 107 psi durante 8 minutos. Os sólidos insolúveis em água na palha de milho pré-tratada (PCS) continham 56,5% de celulose, 4,6% de hemicelulose, e 28,4% de lignina. A celulose e a hemicelulose foram determinadas por uma hidrólise de duas fases com ácido sulfúrico com subsequente análise de açúcares através de cromatografía líquida de alto desempenho usando o Procedimento Analítico Padrão # 002 do NREL. A lignina foi determinada gravimetricamente após hidrólise das frações de celulose e hemicelulose com ácido sulfúrico usando o Procedimento Analítico Padrão #003 do NREL.

[000331] PCS não lavados moídos (peso seco 32,35%) foram preparados por moagem da totalidade da polpa de PCS em um moinho úmido de várias utilidades Cosmos ICMG 40 (EssEmm Corporation, Tamil Nadu, índia).

[000332] A hidrólise do PCS não lavado moídos foi efetuada usando placas de poços profundos de 2,2 ml (Axygen, Union City, Califórnia, EUA) em um volume de reação total de 1,0 ml. A hidrólise foi realizada com 50 mg de sólidos de PCS insolúveis por ml de 50 mM de acetato de sódio de pH 5,0 de tampão contendo 1 mM de sulfato de manganês e várias cargas de proteínas de várias composições de enzimas (expressas como mg de proteína por grama de celulose). As composições enzimáticas foram preparadas e então foram adicionadas simultaneamente a todos os poços em um volume variando desde 50 μL até 200 μL, para um volume final de 1 mL em cada reação. As placas foram então seladas utilizando um selador de calor de placa ALPS-300™ (Abgene, Epsom, Reino Unido), completamente misturadas, e incubadas a uma temperatura específica durante 72 horas. Todos os experimentos relatados foram realizados em triplicado.

[000333] Depois da hidrólise, as amostras foram filtradas usando uma placa de filtro de 96 poços de 0,45 μm MULTISCREEN® (Millipore, Bedford, MA, EUA) e os filtrados analisados quanto ao teor de açúcar, conforme descrito abaixo. Quando não foram usadas imediatamente, alíquotas filtradas foram congeladas a -20°C. As concentrações de açúcares de amostras diluídas em 0,005 M H2SO4 foram mensuradas usando uma coluna de 4,6 x 250 mm AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA) por eluíção com 0,05 % p/p ácido benzoico-0,005 M H2SO4 a 65°C a uma taxa de fluxo de 0,6 mL por minuto, e quantificação por integração dos sinais de glucose, celobiose, e xilose a partir da detecção do índice de refração (CHEMSTATION®, AGILENT® 1100 HPLC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) com calibração por amostras de açúcares puros. A glucose e celobiohidrolasese equivalentes resultantes foram utilizadas para calcular a percentagem de conversão de celulose para cada reação.

[000334] Glucose, celobiose, e xilose foram mensurados individualmente. As concentrações de açúcares medidas foram ajustadas para o fator de diluição apropriado. Em caso de PCS não lavados moídos, as concentrações líquidas dos açúcares enzimaticamente produzidos foram determinadas ajustando as concentrações de açúcar medidas para as correspondente concentrações de açúcar base nos PCS não lavados moídos a ponto de tempo zero. A totalidade do processamento de dados HPLC foi realizada utilizando o software Microsoft Excel™ (Microsoft, Richland, WA, EUA).

[000335] O grau de conversão de celulose em glucose foí calculado usando a equação seguinte: % conversão = (concentração de glucose/ concentração glucose em uma digestão limitada) x 100. De forma a calcular a % de conversão, foi definido um ponto de conversão de 100% com base no controle de celulase (100 mg de celulase de Trichoderma reesei por grama de celulose), e todos os valores foram divididos por este número e depois multiplicado por 100. A média dos pontos de dados em triplicado foi calculada e o desvio padrão foi calculado.

Exemplo 7: Preparação de uma composição enzimática

[000336] Preparação de celobiohidrolase II GH6A de Aspergillus fumigatus. A celobiohidrolase II GH6A de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 11 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 12 [sequência de aminoácidos deduzida]) foi preparada de modo recombinante em Aspergillus oryzae como descrito em WO 2011/057140. O caldo da celobiohidrolase II GH6A de Aspergillus fumigatus foi filtrado e trocado por tampão para Tris 20 mM pH 8,0 utilizando uma coluna G-25 de 400 ml SEPHADEX™ (GE Healthcare, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante. As frações foram reunidas e ajustadas para 1,2 M sulfato de amônio-20 mM Tris pH 8,0. As fracções reunidas foram aplicadas em uma coluna Fast Flow PHENYL SEPHAROSE™ 6 (elevada sub) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) equilibrada em 20 mM Tris pH 8,0 com 1,2 M de sulfato de amónio, e a celobiohidrolase II ligada foi eluida com 20 mM Tris pH 8,0 sem sulfato de amónio. As frações foram reunidas.

[000337] Preparação de polipeptídeo de Penicillium sp. (emersonii) GH61A tendo atividade celulolitica melhorada. O polipeptídeo de Penicillium sp. (emersonií) GH61A (SEQ ID NO: 13 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 14 [sequência de aminoácidos deduzida]) foi preparado de modo recombinante de acordo com WO 2011/041397. O polipeptídeo de Penicillium sp. (emersonií) GH61A foi purificado de acordo com WO 2011/041397.

[000338] Preparação de endoglucanase II de Trichoderma reesei GH5A. A endoglucanase II de Trichoderma reesei GH5A (SEQ ID NO: 15 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 16 [sequência de aminoácidos deduzida]) foi preparada de modo recombinante de acordo com WO 2011/057140. O caldo da endoglucanase II de Trichoderma reesei GH5A foi filtrado, dessalinizado, e mudado com tampão em 20 mM Tris, pH 8,0 utilizando um concentrador de fluxo tangencial (Pall Filtron, Northborough, MA, EUA), equipado com uma membrana de polietersulfona de 10 kDa de acordo com as instruções do fabricante.

[000339] Preparação de beta-glucosidase GH3A de Aspergillus fumigatus. (U569) (SEQ ID NO: 17 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 18 [sequência de aminoácidos deduzida]) foi recombinantemente preparada de acordo com WO 2005/047499 usando Aspergillus oryzae como um hospedeiro. O caldo foi filtrado e ajustado para pH 8,0 com 20 % acetato de sódio, o que tomou a solução turva. Para remover a turbidez, a solução foi centrifugada a 20000 x g durante 20 minutos, e o sobrenadante foi filtrado através de uma unidade de filtração de 0,2 μm (Nalgene, Rochester, NI, EUA). O filtrado foi diluído com água desionizada para alcançar a mesma condutividade de 50 mM Tris/HCl, pH 8,0. A solução enzimática ajustada foi aplicada em uma coluna Q SEPHAROSE® Fast Flow (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) equilibrada em 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 e eluiu com um gradiente linear desde 0 até 500 mM cloreto de sódio. As frações foram agrupadas e tratadas com carvão vegetal ativado a 1 % (p/v) para remover a cor do agrupamento de beta-glucosidase. O carvão vegetal foi removido por filtração do sobrenadante através de uma unidade de filtração de 0,2 μm (Nalgene, Rochester, NI, EUA). O filtrado foi ajustado para pH 5,0 com ácido acético a 20 % e diluído 10 vezes com água desionizada. O filtrado ajustado foi aplicado em uma coluna SP SEPHAROSE® Fast Flow (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) equilibrada em 10 mM ácido succínico pH 5,0 e a beta-glucosidase eluiu com um gradiente linear desde 0 até 500 mM cloreto de sódio.

[000340] Preparação de xilanase GH10 de Aspergillus fumigatus. A xilanase GH10 (xyn3) de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 19 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 20 [sequência de aminoácidos deduzida]) foi preparada recombinantemente de acordo com WO 2006/078256 usando BECh2 Aspergillus oryzae (WO 2000/39322) como um hospedeiro. O caldo da xilanase GH10 (xyn3) de Aspergillus fumigatus NN055679 foi filtrado, dessalinizado, e trocado por tampão em 50 mM de acetato de sódio pH 5,0 utilizando uma Coluna de Dessalinização HIPREP® 26/10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

[000341] Preparação de beta-xilosidase GH3 de Talaromyces emersonii. A beta-xilosidase GH3 de Talaromyces emersonii (SEQ ID NO: 21 [sequência de DNA] e SEQ ID NO: 22 [sequência de aminoácidos deduzida]) foi preparada de modo recombinante em Aspergillus oryzae como descrito em WO 2011/057140. A beta-xilosidase GH3 de Talaromyces emersonii foi dessalinizada e o tampão foi mudado para 50 mM acetato de sódio pH 5,0 usando um concentrador de fluxo tangencial equipado com uma membrana de poliétersulfona de 10 kDa.

[000342] A concentração de proteína para cada um dos monocomponentes acima descrito foi determinada utilizando um Kit de Ensaio de Proteína de Microplacas BCA™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) em quefoi utilizada albumina de soro bovino como padrão de proteína. Cada monocomponente, preparado conforme descrito acima, foi combinado de modo a produzir uma composição de enzima composta por 25% de celobiohidrolase II CelóA de Aspergillus fumigatus, 15% de polipeptídeo GH61A de Penicillium emersonii tendo atividade de melhoramento da celulase, de 10% de endoglucanase II GH5 de Trichoderma reesei, 5% de xilanase GH10 (xyn3) de Aspergillus fumigatus, 5% de mutante beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus, e 3% de beta-xilosidase de Talaromyces emersonii. A composição de enzima é designada neste documento por “composição de enzima sem celobiohidrolase I”.

Exemplo 8: Efeito do domínio de celobiohidrolase I catalítico de Penicillium sp. {emersonii) GH7 e proteína híbrida CBM de celobiohidrolase I Aspergillus fumigatus GH7 na hidrólise do PCS não lavado moído a 50-65°C por uma composição de enzimas

[000343] O efeito do domínio de celobiohidrolase I catalítico de Penicillium sp. {emersonii) GH7 e da proteína híbrida CBM (P244YG) de celobiohidrolase I de Aspergillus fumigatus GH7 na hidrólise do PCS não lavado moído foi avaliado a 50°C, 55°C, 60°C, e 65°C, utilizando a composição de enzima sem celobiohidrolase I (Exemplo 7 ).

[000344] A composição de enzima sem celobiohidrolase I e de celobiohidrolase I GH7 de Penicillium sp. ( emersonii ) de tipo selvagem foram efetuadas como controles. A composição da enzima com a celobiohidrolase I híbrida ou a celobiohidrolase 1 GH7 de Penicillium sp. ( emersonii ) foi adicionada às reações de hidrólise PCS de 1,1 mg de proteína total por g de celulose, enquanto que a composição de enzima sem celobiohidrolase I foi adicionada às reações de hidrólise PCS a 1,9 e 3,0 mg de proteína total por g de celulose.

[000345] O ensaio foi realizado como descrito no Exemplo 6. As reações de 1 ml com o PCS não lavado moído (5% de sólidos insolúveis) foram efetuadas durante 72 horas em 50 mM de acetato de sódio, pH 5,0 de tampão contendo 1 mM de sulfato de manganês. Todas as reações foram realizadas em triplicado e envolveram mistura única no início da hidrólise.

[000346] Conforme mostrado na Figura 2, a composição de enzima que incluía o polipeptídeo híbrido superou a composição enzimática contendo a celobiohidrolase I (P82PH) de Penicillium sp. ( emersonii) nativa. O grau de conversão de celulose em glucose para o polipeptídeo híbrido foi maior do que a composição de enzima contendo a celobiohidrolase I GH7 de Penicillium sp. (Emersonii) nativa a 50°C, 55°C, 60°C e 65°C.

[000347] A presente invenção é ainda descrita nos parágrafos numerados que se seguem: [1] Um polipeptídeo híbrido isolado tendo atividade de celobiohidrolase, compreendendo: (a) um primeiro fragmento de polipeptídeo compreendendo um domínio de celobiohidrolase catalítico na extremidade N- terminal do polipeptídeo híbrido selecionado a partir do grupo consistindo em (i) um fragmento de polipeptídeo tendo pelo menos 96% de identidade de sequência com os aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2; (ii) um fragmento de polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo possuindo pelo menos 96% de identidade de sequência com os nucleotídeos 55 a 1485 de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA; e (iii) um fragmento de polipeptídeo compreendendo ou consistindo nos aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento tendo atividade de celobiohidrolase; e (b) um segundo fragmento de polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação de carboidrato na extremidade C-terminal do primeiro fragmento de polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em (i) um fragmento de polipeptídeo tendo pelo menos 96% de identidade de sequência com os aminoácidos 485 a 529 de SEQ ID NO: 4; (ii) um fragmento de polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo possuindo pelo menos 96% de identidade de sequência com os nucleotídeos 1453 a 1587 de SEQ ID NO: 3; e (iii) um fragmento de polipeptídeo compreendendo ou consistindo nos aminoácidos 485 a 529 de SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento tendo atividade de ligação de carboidrato. [2] O polipeptídeo híbrido do parágrafo 1, em que o primeiro fragmento de polipeptídeo tem pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com os aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2. [3] O polipeptídeo híbrido do parágrafo 1, em que o primeiro fragmento de polipeptídeo é codificado através de um polipeptídeo tendo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com os nucleotídeos 55 a 1485 de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA. [4] O polipeptídeo híbrido do parágrafo 1, em que o primeiro fragmento de polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento tendo atividade de celobiohidrolase. [5] O polipeptídeo híbrido do parágrafo 1, em que o primeiro fragmento de polipeptídeo é codificado através dos nucleotídeos 55 a 1485 de SEQ ID NO: 1 ou da sequência de cDNA dos mesmos, ou uma subsequência dos mesmos que codifica um fragmento dos mesmos possuindo atividade de celobiohidrolase. [6] O polipeptídeo híbrido do parágrafo 1, em que o segundo fragmento de polipeptídeo tem pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com os aminoácidos 485 a 529 de SEQ ID NO: 4. [7] O polipeptídeo híbrido do parágrafo 1, em que o segundo fragmento de polipeptídeo é codificado através de um polipeptídeo tendo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com os nucleotídeos 1453 a 1587 de SEQ ID NO: 3. [8] O polipeptídeo híbrido do parágrafo 1, em que o segundo fragmento de polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 485 a 529 de SEQ ID NO: 4 ou um seu fragmento tendo atividade de ligação de carboidrato. [9] O polipeptídeo híbrido do parágrafo 1, em que o segundo fragmento de polipeptídeo é codificado através dos nucleotídeos 1453 a 1587 de SEQ ID NO: 3 ou uma sua subsequência codificando um fragmento tendo atividade de ligação de carboidrato. [10] O polipeptídeo híbrido do parágrafo 1, o qual compreende ou consiste nos aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2 como o primeiro fragmento de polipeptídeo na extremidade N-terminal do polipeptídeo híbrido e aminoácidos 485 a 529 de SEQ ID NO: 4 como o segundo fragmento de polipeptídeo na extremidade C-terminal do primeiro fragmento de polipeptídeo. [11] O polipeptídeo híbrido do parágrafo 1, o qual compreende ou consiste em polípeptídeos maduros de SEQ ID NO: 6 ou um seu fragmento tendo atividade de celobiohidrolase e atividade de ligação de carboidrato. [12] O polipeptídeo híbrido de qualquer um dos parágrafos 1- 11, que também compreende um peptídeo sinal na extremidade N-terminal do primeiro fragmento de polipeptídeo. [13] O polipeptídeo híbrido do parágrafo 12, em que o peptídeo sinal é o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 2. [14] O polipeptídeo híbrido do parágrafo 13, em que o peptídeo sinal consiste nos aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO: 2. [15] Um polinucleotídeo isolado codificando o polipeptídeo híbrido de qualquer um dos parágrafos 1-14. [16] Um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 15. [17] Um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 15. [18] Uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo do parágrafo 15. [19] Um método de produção de um polipeptídeo híbrido tendo atividade de celobiohidrolase, compreendendo: (a) cultivo da célula hospedeira do parágrafo 18 sob condições adequadas para a expressão do polipeptídeo híbrido; e opcionalmente (b) recuperação do polipeptídeo híbrido. [20] Uma planta, parte de planta ou célula de planta transgênica transformada com o polinucleotídeo do parágrafo 15 codificando um polipeptídeo híbrido. [21] Um método de produção de um polipeptídeo híbrido de qualquer um dos parágrafos 1-14 compreendendo: (a) cultivo de uma planta ou célula de planta transgênica compreendendo um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo híbrido sob condições conducentes à produção do polipeptídeo híbrido; e opcionalmente (b) recuperação do polipeptídeo híbrido. [22] Um processo para degradação ou conversão de um material celulósico, compreendendo: tratamento do material celulósico com uma composição de enzimas na presença do polipeptídeo híbrido de qualquer um dos parágrafos 1-14. [23] O processo do parágrafo 22, em que o material celulósico é pré-tratado. [24] O processo do parágrafo 22 ou 23, compreendendo adicionalmente recuperação do material celulósico degradado. [25] O processo de qualquer um dos parágrafos 1-14 em que a composição de enzima compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma celulase, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma lacase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma swolenina. [26] O processo do parágrafo 25, em que a celulase consiste de uma ou maís enzimas selecionadas do grupo consistindo de uma endoglucanase, uma celobiohidrolase, e uma beta-glucosidase. [27] O processo do parágrafo 25, em que a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma xilanase, uma acetilxilana esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase, e uma glucuronidase. [28] O processo de qualquer um dos parágrafos 22-27, em que o material celulósico degradado é um açúcar. [29] O processo do parágrafo 28, em que o açúcar é selecionado do grupo consistindo em glucose, xilose, manose, galactose, e arabinose. [30] Um processo para produção de um produto de fermentação, compreendendo: (a) sacarificação de um material celulósico com uma composição de enzimas na presença do polipeptídeo híbrido de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-14; (b) fermentação do material celulósico sacarificado com um ou mais microrganismos fermentadores de forma a produzir o produto de fermentação; e (c) recuperação do produto de fermentação a partir da fermentação. [31] O processo do parágrafo 30, em que o material celulósico é pré-tratado. [32] O processo do parágrafo 30 ou 31 em que a composição de enzima compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma celulase, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma lacase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma swolenina. [33] O processo do parágrafo 32, em que a celulase consiste de uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo de uma endoglucanase, uma celobiohidrolase, e uma beta-glucosidase. [34] O processo do parágrafo 32, em que a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma xilanase, uma acetilxilana esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase, e uma glucuronidase. [35] O processo de qualquer um dos parágrafos 30-34, em que os passos (a) e (b) são realizados simultaneamente em uma sacarificação e fermentação simultâneas. [36] O processo de qualquer um dos parágrafos 30-35, em que o produto da fermentação é um álcool, um alcano, um cicloalcano, um alqueno, um aminoácido, um gás, isopreno, uma cetona, um ácido orgânico, ou policetídeo. [37] Um processo de fermentação de um material celulósico, compreendendo: fermentação do material celulósico com um ou mais microrganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzimas na presença do polipeptídeo híbrido de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-14. [38] O processo do parágrafo 37, em que o material celulósico é pré-tratado antes da sacarificação. [39] O processo do parágrafo 37 ou 38 em que a composição de enzima compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma celulase, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma lacase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma swolenina. [40] O processo do parágrafo 39, em que a celulase consiste de uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo de uma endoglucanase, uma celobiohidrolase, e uma beta-glucosidase. [41] O processo do parágrafo 39, em que a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma xilanase, uma acetilxilana esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase, e uma glucuronidase. [42] O processo de qualquer um dos parágrafos 37-41, em que a fermentação do material celulósico produz um produto de fermentação. [43] O processo do parágrafo 42, compreendendo adicionalmente recuperação do produto de fermentação da fermentação. [44] O processo de qualquer um dos parágrafos 42 ou 43, em que o produto da fermentação é um álcool, um alcano, um cicloalcano, um alqueno, um aminoácido, um gás, isopreno, uma cetona, um ácido orgânico, ou policetídeo. [45] Formulação ou composição de cultura de células de caldo completo compreendendo o polipeptídeo híbrido de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-14.

[000348] A invenção descrita e reivindicada aqui não é para ser limitada no escopo pelos aspetos específicos aqui divulgados, uma vez que estes aspetos se pretendem como ilustrações de vários aspetos da invenção. Quaisquer aspetos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção adicionalmente àquelas apresentadas e descritas aqui se tomarão aparentes àqueles peritos na técnica a partir da descrição acima mencionada. Tais modificações se destinam também a estar dentro do escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente divulgação incluindo definições imperará.

Claims (20)

1. Polipeptídeo híbrido isolado, caracterizado pelo fato de ter atividade de celobiohidrolase, compreendendo: (a) um primeiro fragmento de polipeptídeo consistindo em um domínio de celobiohidrolase catalítico na extremidade N-terminal do polipeptídeo híbrido selecionado a partir do grupo consistindo em (i) um fragmento de polipeptídeo consistindo nos aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2 com 0 a 10 substituições conservativas; e (ii) um fragmento de polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo consistindo nos nucleotídeos 55 a 1485 de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA ou suas sequências degeneradas que codificam o mesmo polipeptídeo; (b) um segundo fragmento de polipeptídeo consistindo em um domínio de ligação de carboidrato na extremidade C-terminal do primeiro fragmento de polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em (i) um fragmento de polipeptídeo consistindo nos aminoácidos 485 a 529 de SEQ ID NO: 4 com 0 a 10 substituições conservativas; e (ii) um fragmento de polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo consistindo nos nucleotídeos 1453 a 1587 de SEQ ID NO: 3, ou suas sequências degeneradas que codificam o mesmo polipeptídeo.

2. Polipeptídeo híbrido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro fragmento de polipeptídeo consiste nos aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2 com 0 a 10 substituições conservativas.

3. Polipeptídeo híbrido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo fragmento de polipeptídeo consiste nos aminoácidos 485 a 529 de SEQ ID NO: 4 com 0 a 10 substituições conservativas.

4. Polipeptídeo híbrido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que consiste nos aminoácidos 19 a 455 de SEQ ID NO: 2 com 0 a 10 substituições conservativas como o primeiro fragmento de polipeptídeo na extremidade N-terminal do polipeptídeo híbrido e aminoácidos 485 a 529 de SEQ ID NO: 4 com 0 a 10 substituições conservativas como o segundo fragmento de polipeptídeo na extremidade C- terminal do primeiro fragmento de polipeptídeo.

5. Polipeptídeo híbrido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que consiste em polípeptídeos maduros de SEQ ID NO: 6 com 0 a 10 substituições conservativas.

6. Polipeptídeo híbrido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que também compreende um peptídeo sinal na extremidade N-terminal do primeiro fragmento de polipeptídeo.

7. Polipeptídeo híbrido de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal é o peptídeo sinal de SEQ ID NO: 2.

8. Polipeptídeo híbrido de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal consiste nos aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO: 2.

9. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo híbrido como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o polinucleotídeo consiste nos nucleotídeos 55 a 1680 da SEQ ID NO: 5.

10. Célula hospedeira microbiana, caracterizada pelo fato de que expressa o polinucleotídeo híbrido como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

11. Método de produção de um polipeptídeo híbrido tendo atividade de celobiohidrolase, caracterizado pelo fato de compreender: (a) cultivo da célula hospedeira de acordo com a reivindicação 10 sob condições adequadas para a expressão do polipeptídeo híbrido; e opcionalmente (b) recuperação do polipeptídeo híbrido.

12. Método de produção de um polipeptídeo híbrido como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de compreender: (a) cultivo de uma planta ou célula de planta transgênica compreendendo um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo híbrido sob condições conducentes à produção do polipeptídeo híbrido; e opcionalmente (b) recuperação do polipeptídeo híbrido.

13. Processo para degradação ou conversão de um material celulósico, caracterizado pelo fato de compreender: tratamento do material celulósico com uma composição de enzimas na presença do polipeptídeo híbrido como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a recuperação do material celulósico degradado.

15. Processo para produção de um produto de fermentação, caracterizado pelo fato de compreender: (a) sacarificação de um material celulósico com uma composição de enzimas na presença do polipeptídeo híbrido como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8; (b) fermentação do material celulósico sacarificado com um ou mais microrganismos fermentadores de forma a produzir o produto de fermentação; e (c) recuperação do produto de fermentação a partir da fermentação.

16. Processo de fermentação de um material celulósico, caracterizado pelo fato de compreender: fermentação do material celulósico com um ou mais microrganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzimas na presença do polipeptídeo híbrido como definido qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

17. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a fermentação do material celulósico produz um produto de fermentação.

18. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente recuperação do produto de fermentação a partir da fermentação.

19. Formulação ou composição de cultura de células microbianas de caldo completo, caracterizado pelo fato de compreender o polipeptídeo híbrido como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

20. Célula hospedeira microbiana transgênica, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 9.

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