BR112014010562B1

BR112014010562B1 - Método de fermentação de sementes de cacau empregando pichia kluyveri

Info

Publication number: BR112014010562B1
Application number: BR112014010562-6A
Authority: BR
Inventors: Sofie Saerens; Jan Hendrik Swiegers
Original assignee: Chr. Hansen A/S
Priority date: 2011-11-03
Filing date: 2012-11-05
Publication date: 2020-12-15
Also published as: AP2014007684A0; DK2773218T4; DK2773218T3; EP2773218B1; EP2773218A1; AP3494A; BR112014010562A2; US20170311620A1; US20140271989A1; EP2773218B2; US11134700B2; WO2013064678A1

Abstract

produto à base de cacau com um perfil de sabor melhorado, métodos de fermentação de sementes de cacau e de preparar um produto à base de cacau, uso de uma cepa da levedura pichia kluyveri, bem como de sementes de cacau fermentadas. a presente invenção refere-se às cepas da levedura pichia kluyveri que têm propriedades vantajosas úteis em processos para fermentação do cacau. especialmente, cepas da levedura pichia kluyveri podem ser usadas como uma cultura de partida de processos para fermentação do cacau para produzir sabores relativos a fruta, a produção de ésteres e álcoois superiores no farelo de cacau. mais especificamente, a levedura pode ser usada para adaptar os níveis de acetato de isoamila e acetato de isobutila no farelo de cacau. além disso, a pichia kluyveri tem capacidade de liquefazer a polpa de cacau completamente, que é uma indicação de uma alta atividade pectinolítica. como a eficiência de liquefazer a polpa é correlacionada com a eficiência de fermentação e qualidade total das sementes de cacau, as cepas de pichia kluyveri podem ser usadas para melhorar a qualidade de semente de cacau. considerando a importância primordial da fermentação atingir sementes comerciais de alta qualidade, o uso de cepa de pichia kluyveri como uma cultura de partida da fermentação de cacau pode melhorar a qualidade e o sabor das sementes.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se ao campo da fermentação decacau. Especificamente, a invenção se refere a um método de fermentação de material de cacau, tal como sementes e polpa de cacau, com uma cepa da levedura Pichia kluyveri.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A qualidade de sementes comerciais de cacau, matéria-prima principal da produção de chocolate, depende na combinação de fatores que incluem o tipo do material vegetal, as práticas agrícolas, e o processamento pós-colheita. Entre estes, a fermentação das sementes de cacau é o mais relevante já que é o processo pelo qual surgem os precursores do sabor do cacau. A formação destes precursores depende da atividade de espécies microbianas diferentes na polpa que envolve as sementes.

[003] Das 22 espécies que constituem o gênero Theobroma(família Sterculiaceae), Theobroma cacao L., é comercialmente a mais importante, devido ao valor das suas sementes (Lima et al. 2011). Há três variedades botânicas principais Theobroma cacao: Forastero, Criollo e Trinitario. As populações de Forastero, provavelmente natural da bacia do Amazonas, fornecem a mais de 95 % do cacau do mundo (ICCO, 2007). As sementes desta variedade são lisas, adstringentes, e de cores purpúreas devido à presença de antonianinas. As árvores de cacau Forastero são muito produtivas e são consideradas como sendo moderadamente resistentes à peste (Lima et al. 2011). Criollo é a variedade cultivada original, indígena à América Central e do Norte, do Sul. As sementes são brancas ao marfim ou têm a cor purpúrea muito pálida. Os rendimentos baixos e a sua suscetibilidade de muitas doenças fazem-nos raros para cultivar. O tipo de Trinitario originou no Trinidad e coberturas todos os produtos da hibridização natural e a recombinação de variedades de Forastero e o Criollo. As sementes são variáveis em cores, embora raramente branco, e as árvores mostrem uma suscetibilidade do intermediário de doenças e peste a variedades de Criollo e Forastero. Tanto o Trinitario como as populações de Criollo produzem as sementes de cacau 'perfeitas' ou sementes de cacau 'de sabor', cuja ação na produção mundial total é em baixo de 5 % (ICCO, 2007). Estas sementes de cacau são usadas para fazer o chocolate escuro de alta qualidade.

[004] As sementes de cacau são a matéria-prima principal daprodução de chocolate. Não só não é possível fazer o chocolate sem sementes de cacau, mas também o sabor distintivo de chocolate é devido à presença destas sementes. Outro derivado de produtos de sementes de cacau é cacau em pó, amplamente usado na indústria alimentícia, e manteiga de cacau que além do seu uso de confeitaria também tem aplicações cosméticas e farmacêuticas.

[005] Entretanto, antes que as sementes de cacau podem servendidas e processadas em produtos industriais finais eles sofreram o processamento pós-colheita em fazendas e plantações compreendendo as etapas de abertura de vagem e remoção de sementes da vagem, fermentação de semente, e secagem. Nesta sequência, a fermentação constitui uma etapa crítica essencial do desenvolvimento de atributos de qualidade de sabor das sementes comerciais de cacau. Isto é devido a que durante a fermentação, as transformações bioquímicas são induzidas dentro das sementes que levam à formação de precursores importantes do sabor do cacau, alguns do qual são compostos altamente voláteis. A fermentação das sementes adicionalmente causa o escurecimento, redução de amargor e adstringência das sementes. O sabor total do cacau é desenvolvidodepois depois de torrefação, através de reações complexas,principalmente do tipo de Maillard (Afoakwa et al. 2008).

[006] O fruto da árvore de cacau é botanicamente uma drupaindeiscente, normalmente chamada vagem. Estes são ovais em forma, medida entre 12 e 30 cm, e contêm 30 para 40 sementes incorporadas em uma polpa mucilaginosa, que compreende aproximadamente 40 % da semente peso fresco (Schwan e Wheals, 2004). A polpa é caracterizada por um teor de açúcar de aproximadamente 9 para 13 % (p/p), alta acidez, conferida pela presença de ácidos orgânicos diversos, mas ácido principalmente cítrico, e um teor de proteína na faixa de de 0,4 a 0,6 % (p/p). O processamento de pós-ceifa das sementes de cacau começa rompendo as vagens e retirando as sementes do fruto da fermentação. O método da fermentação de semente de cacau consiste de empilhar certa quantidade de sementes frescas em montões, caixas de madeira, bandejas ou cestos e permitir naturalmente ocorrer microrganismos para desenvolver-se (Schwan e Wheals, 2004). Durante esta fermentação espontânea, as sementes são libertadas de aderir a polpa e no fim da fermentação a polpa decomposta é geralmente tirada ao lavar pela água e as sementes secas para produzir as sementes de cacau fermentadas do comércio.

[007] A atividade microbiana na polpa de semente de cacauconsidera-se como uma sucessão microbiana bem definida conduzida por leveduras que dominarão a população microbiana total durante as dez primeiras horas da fermentação, depois da qual o seu nível é sobrepujado por aquele de bactérias do ácido lático (LAB), isto à sua vez diminui depois 48h de fermentação em detrimento do desenvolvimento vigoroso de bactérias de ácido acético (AAB).

[008] A atividade metabólica de leveduras na polpa de sementede cacau leva à produção de etanol, gás carbônico, ácidos e compostos voláteis, com um aumento acompanhado da temperatura. Acredita-se que algumas leveduras metabolizem o ácido cítrico (Jespersen 2003), que contribui para um aumento no valor de pH da polpa.Além disso, as leveduras têm a capacidade de degradar a polpa produzindo enzimas pectinolíticas. Os produtos do metabolismo de LAB incluem ácido láctico, etanol, ácido acético, e outros ácidos orgânicos, bem como glicerol, manitol, gás carbônico e voláteis. A produção dos ácidos causa uma redução de pH da polpa, mas o fato que as leveduras podem assimilar o ácido láctico, em conjunto com a capacidade fermentativa de LAB de usar o ácido cítrico, em parte explica porque o efeito total da produção de ácidos pode não produzir uma redução tão pronunciada de pH durante os dois primeiros dias da fermentação (Lima et al. 2011). O acesso a aumento de ar na massa de semente de cacau que resulta do colapso enzimático da polpa estimula o desenvolvimento de AAB, que convertem o etanol no ácido acético. O etanol e o ácido acético difuso nas sementes e em conjunto com o calor produziram isto causa a morte do embrião de semente. Isto à sua vez inicia reações bioquímicas nas sementes que conduzem finalmente ao desenvolvimento de um sabor característico e a cor das sementes. Estas propriedades são adicionalmente desenvolvidas durante a secagem, assando-se e o processamento final das sementes. Deste modo, a atividade de leveduras, LAB e AAB é essencial para a produção de cacau de alta qualidade.

[009] Entretanto, a fermentação espontânea é muito nãohomogênea e as variações grandes ocorrem em ambas as contagens microbianas e composição de espécies, até em fermentações que ocorrem no mesmo sítio. As variações parecem depender de muitos fatores incluem o país, fazenda, madureza de vagem, pós-colhem o manejo de vagem, o tipo de cacau, método de fermentação, tamanho do lote, alteração ou nenhuma alteração, tempo de fermentação etc. que faz extremamente difícil controlar as fermentações de cacau e como resultado a reprodutibilidade das fermentações é quase impossível. O problema principal aqui parece estar a falta do controle sob o crescimento e o desenvolvimento de microrganismos e metabólitos produzidos durante o processo de fermentação, que resulta em uma qualidade variável das sementes de cacau acabadas.

[0010] As tentativas foram feitas na técnica anterior controlar ascondições de fermentação de fermentações de semente de cacau.

[0011] Na literatura, alguns papéis referem ao uso de culturas departida da fermentação de semente de cacau. Schwann (1998) e Schwan e Wheals (2004) divulgam o uso de culturas de partida na fermentação de semente de cacau com um inóculo consistindo nas cepas Saccharomyces cerevisiae var. chevalieri, Lactobacillus lactis, Lactobacillus plantarum, Acetobacter aceti e Gluconobacter oxydans. Leal et al., (2008) divulgam o uso único de um Kluyveromyces marxianus híbrido com a atividade pectinolítica melhorada como uma cultura de partida da fermentação de semente de cacau. Finalmente, Lefeber et al., (2010 e 2011) divulgam o uso de bactérias ácidas lácticas e acéticas específicas culturas de partida como ideais da fermentação de semente de cacau. Entretanto, Lefeber et al., só testaram bactérias em meio de simulação de cacau.

[0012] O pedido de patentes internacional WO 2007/031186divulga um método para regular a fermentação do material vegetal consistindo em sementes e/ou polpa de cacau de cacau acrescentando ao material vegetal de dita culturas bacterianas específicas contendo pelo menos uma bactéria ácida láctica e/ou pelo menos uma bactéria ácida acética em pontos de tempo diferentes durante o processo de fermentação.

[0013] O pedido de patentes internacional WO 2011/012680divulga um método para usar uma composição microbiana para regular a fermentação de cacau sementes de cacau materiais, tal como e/ou polpa de cacau, particularmente usando composições compreendendo as combinações específicas dos microrganismos incluindo pelo menos um Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum e um Acetobacter pasteurianus.

[0014] Entretanto, os parâmetros de fermentação permanecemdifíceis de controlar em métodos de técnica anterior e melhor compreensão dos processos biológicos que controlam a presença e a quantidade de compostos na fermentação de sementes de cacau é altamente desejável. Os problemas de gosto ainda podem ocorrer tal como a presença de (demasiado) ácidos, uma falta do gosto de cacau e demasiado sabor ruim. Especialmente, ser capaz de regular a quantidade e o tipo de compostos de sabor em sementes de cacau seria muito benéfico para produtores de cacau. A regulação da quantidade de ésteres e álcoois superiores, e particularmente acetato de isoamila, em combinação com sementes de alta qualidade levaria em conta o desenvolvimento de novas tecnologias que permitem os produtores de cacau obter sementes de cacau de alta qualidade com um perfil de sabor diferente. Tal tecnologia seria, desse modo, do valor comercial significante.

[0015] Assim, lá existe uma necessidade de processosmelhorados do aumento de sabores desejáveis na fermentação de cacau e para a melhora da qualidade das sementes de cacau fermentadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0016] O problema a ser resolvido pela presente invenção serefere ao fornecimento de um método da fermentação de sementes de cacau e polpa em que a presença de compostos de sabor desejáveis, ésteres acéticos tal como, é melhorada e a qualidade total da fermentação é melhorada.

[0017] A solução é baseada nos achados surpreendentes pelos inventores que pela inoculação das sementes de cacau e polpa com uma cepa da levedura Pichia kluyveri cada um é capaz de produzir sementes de cacau fermentadas com um perfil melhorado de sabor.

[0018] Consequentemente, um primeiro aspecto da presenteinvenção se refere a sementes de cacau fermentadas com um melhorou perfis de sabor, sementes de cacau fermentadas tal como possuindo uma razão acetato de isobutila / isobutanol maior que 1, tal como maior que 1,2, e/ou uma razão acetato de isoamila / álcool isoamílico maior que 0,005, tal como maior que 0,006.

[0019] Um segundo aspecto da presente invenção se refere a umproduto à base de cacau que tem um perfil de sabor melhorado, em que o produto à base de cacau é preparado das sementes de cacau fermentadas do primeiro aspecto da presente invenção.

[0020] Um terceiro aspecto da invenção se refere a um método dafermentação de sementes de cacau compreendendo as etapas de: acrescentar a um material vegetal essencialmente consistindo em sementes e/ou derivado de polpa de vagens de fruto das espécies Theobroma cacao pelo menos uma cepa da levedura Pichia kluyveri; efermentação do material vegetal.

[0021] Preferivelmente, o método da fermentação de sementes decacau compreende as etapas de: acrescentar a um material vegetal essencialmente consistindo em sementes e/ou derivado de polpa de vagens de fruto das espécies Theobroma cacao pelo menos uma cepa da levedura Pichia kluyveri;fermentar o material vegetal; esecar as sementes de cacau fermentadas.

[0022] Um quarto aspecto da presente invenção se refere ao uso de pelo menos uma cepa da levedura Pichia kluyveri da fermentação de sementes de cacau para melhorar o sabor e/ou a qualidade das sementes fermentadas.

[0023] Um quinto aspecto se refere a uma cepa da levedura Pichia kluyveri para uso na fermentação de sementes de cacau para melhorar o sabor e/ou a qualidade das sementes fermentadas.

[0024] Um sexto aspecto da presente invenção relaciona-se a sementes de cacau fermentadas conseguíveis pelo método de acordo com o primeiro aspecto da invenção.

[0025] Um sétimo aspecto da presente invenção se refere a um método para produzir produtos à base de cacau compreendendo as etapas de: fornecimento de sementes de cacau que foram fermentadas com um método de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção; e produzir um produto à base de cacau das sementes de cacau de etapa a).

[0026] Um oitavo aspecto relaciona-se a produtos à base de cacauconseguíveis pelo método de acordo com o quarto aspecto da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0027] A Figura 1 ilustra concentrações de acetaldeído (em ppm/g)no farelo de cacau, obtido pela fermentação de sementes de cacau com 7 diferentes cepas de levedura.

[0028] A Figura 2 ilustra concentrações de acetato de etila (emppm/g) no farelo de cacau, obtido pela fermentação de sementes de cacau com 7 diferentes cepas de levedura.

[0029] A Figura 3 ilustra concentrações de acetato de isobutila (emppm/g) no farelo de cacau, obtido pela fermentação de sementes de cacau com 7 diferentes cepas de levedura.

[0030] A Figura 4 ilustra concentrações de acetato de isoamila (em ppm/g) no farelo de cacau, obtido pela fermentação de sementes de cacau com 7 diferentes cepas de levedura.

[0031] A Figura 5 ilustra concentrações de hexanoato de etila (emppm/g) no farelo de cacau, obtido pela fermentação de sementes de cacau com 7 diferentes cepas de levedura.

[0032] A Figura 6 ilustra concentrações de octanoato de etila (emppm/g) no farelo de cacau, obtido pela fermentação de sementes de cacau com 7 diferentes cepas de levedura.

[0033] A Figura 7 ilustra concentrações de decanoato de etila (emppm/g) no farelo de cacau, obtido pela fermentação de sementes de cacau com 7 diferentes cepas de levedura.

[0034] A Figura 8 ilustra concentrações de isobutanol (em ppm/g)no farelo de cacau, obtido pela fermentação de sementes de cacau com 7 diferentes cepas de levedura.

[0035] A Figura 9 ilustra concentrações de álcool isoamílico (emppm/g) no farelo de cacau, obtido pela fermentação de sementes de cacau com 7 diferentes cepas de levedura.

[0036] A Figura 10 ilustra a razão acetato de isobutila / isobutanolno farelo de cacau, obtido pela fermentação de sementes de cacau com 7 diferentes cepas de levedura.

[0037] A Figura 11 ilustra a razão acetato de isoamila / álcoolisoamílico no farelo de cacau, obtido pela fermentação de sementesde cacau com 7 diferentes cepas de levedura.

[0038] A Figura 12 ilustra levedura (YGC) e bactérias do ácidolático (GJ5) números de célula durante a fermentação de cacau espontânea (SP_A).

[0039] A Figura 13 ilustra levedura (YGC) e bactérias do ácidolático (GJ5) números de célula durante a fermentação de cacau espontânea (SP_B).

[0040] A Figura 14 ilustra levedura (YGC) e bactérias do ácido lático (GJ5) números de célula durante a fermentação de cacau inoculada (PK_A).

[0041] A Figura 15 ilustra levedura (YGC) e bactérias do ácidolático (GJ5) números de célula durante a fermentação de cacau inoculada (PK_B).

[0042] A Figura 16 ilustra o sabor resultados de degustaçãodescritivos do liquor de cacau de inoculado (PK) e fermentações de semente de cacau espontâneas (SP).

[0043] A Figura 17 ilustra a marcação e a preferência de liquor decacau de inoculado (P. kluyveri) e fermentação de semente de cacau espontânea.A pontuação máxima é 5.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

[0044] O termo "material vegetal" inclui algo que é ou foi avegetação viva, particularmente plantas e partes quaisquer do mesmo.

[0045] O termo "fermentação" se refere geralmente a atividadequalquer ou processo que envolve decomposição enzimática(digestão) de materiais orgânicos por microrganismos. O termo "fermentação" abrange tanto processos anaeróbicos como aeróbicos, bem como processos que envolvem uma combinação ou a sucessão de estágios 1 ou mais anaeróbicos e/ou aeróbicos. Na presente invenção, a fermentação preferivelmente envolve a decomposição (digestão) de materiais vegetal como definidos acima. "A fermentação" como usada aqui inclui a oxidação de compostos orgânicos tal como a polpa.

[0046] Uma "fermentação espontânea" como usada aqui é aqueleque emprega microrganismos naturalmente apresentam em e/ou inconscientemente introduzido no material orgânico fermentado na partida ou durante a fermentação. Consequentemente, em acima métodos uma fermentação espontânea de outra maneira pode ser regulada pela adição de pelo menos uma cepa microbiana como definida aqui.

[0047] A "polpa" é a parte úmida suave do fruto de uma planta. Apolpa de sementes de cacau é às vezes referido como "mucilagem".

[0048] O termo "semente de cacau" se refere à semente davariedade de árvore de cacau qualquer.

[0049] Observa-se que os termos "cacau" e "cocoa" como usadosaqui se consideram como sinônimos.

[0050] O termo "vagem" se refere a um fruto de cacau maduro oumaduro ou caso de semente. Como usado na presente invenção, a vagem cerca as sementes de cacau e a polpa.

[0051] O termo "produtos à base de cacau" aqui refere a produtosque são preparados usando sementes de cacau fermentadas. Os produtos pretendem referir aos produtos preparados começando de sementes de cacau que foram submetidas à fermentação tal como descrito aqui. Os produtos à base de cacau podem estar em uma forma líquida ou em uma forma seca ou liofilizada tal como na forma de grânulos, granulados ou um pó.

[0052] Como usado aqui "farelo de cacau" se refere à semente decacau fermentada, seca sem a casca.

[0053] O termo "liquor de cacau" aqui se refere a farelo de cacaumoído. O liquor de cacau é preparado moendo farelo de cacau torrado em uma pasta escura. No resfriamento, o liquor de cacau produz a massa de cacau. Quando o farelo é moído em uma pasta uniforme grossa, ele forma o que é conhecido como "flocos de cacau". O termo "flocos de cacau" assim refere ao liquor de cacau na forma de flocos sólidos.

[0054] O liquor de cacau pode ser processado em doiscomponentes diferentes: cacau em pó e manteiga de cacau. O liquor de cacau é prensado no torta de cacau pela remoção a maior parte da manteiga de cacau. O termo "torta de cacau" assim refere aos sólidos de cacau ou restante de massa de cacau depois da extração de gordura (manteiga de cacau) por pressão. Os tortas de cacau podem ser partidas e moídas em um pó fino de cacau. O "cacau em pó" se refere a sólidos de cacau.

[0055] A "manteiga de cacau" é o componente graxo da massa dechocolate, ao passo que a parte restante da massa de chocolate são os sólidos de cacau ou a massa de cacau. Por exemplo produzir o chocolate escuro, o farelo de cacau ou a massa de cacau são- misturada com a manteiga de cacau de açúcar e suficiente para permitir ao chocolate ser moldado. Para produzir o chocolate ao leite, a massa de cacau e a manteiga de cacau são misturadas com açúcar e leite em pó, enquanto para o chocolate branco a manteiga de cacau é misturada com açúcar e leite em pó.

[0056] No contexto presente, o termo "mutante" deve ser entendido como um derivado de cepa de uma cepa da invenção por meio de engenharia, por exemplo, genética, radiação e/ou tratamento químico. É preferido que o mutante seja um mutante funcionalmente equivalente, por exemplo um mutante que tem substancialmente o mesmo, ou melhorado, propriedades (por exemplo quanto ao aumento de compostos de sabor do cacau desejáveis) como a cepa mãe. Tal mutante é uma parte da presente invenção. Especialmente, o termo "mutante" se refere a uma cepa obtida submetendo-se uma cepa da invenção ao tratamento de mutagenização qualquer convencionalmente usado incluindo tratamento com uma mutagene química com sulfonato de metano e etano tal como (EMS) ou N-metil- N'-nitro-N-nitroguanidina (NTG), luz UV ou a um mutante que ocorre espontaneamente. Um mutante pode ter sido submetido a vários tratamentos de mutagenização (um tratamento único deve ser entendido uma etapa de mutagenização seguida de uma etapa de avaliação/seleção), mas é atualmente preferido que não mais do que 20, ou não mais do que 10, ou não mais do que 5, tratamentos (ou etapas de avaliação/seleção) sejam executados. Em um mutante atualmente preferido, menor do que 5 %, ou menor do que 1% ou até menor do que 0. 1% dos nucleotídios no genoma de levedura foram deslocados com outro nucleotídio, ou eliminados, em comparação com a cepa mãe.

[0057] No contexto presente, o termo "variante" deve ser entendido como uma cepa que é funcionalmente equivalente a uma cepa da invenção, por exemplo tendo substancialmente o mesmo, ou melhorado, propriedades (por exemplo quanto ao aumento de compostos de sabor do cacau desejáveis). Tais variantes, que podem ser identificadas usando técnicas de avaliação adequadas, são uma parte da presente invenção.

[0058] O uso dos termos "a" e 'um" e "o" são referents semelhantes no contexto de descrever a invenção (especialmente no contexto das seguintes reivindicações) deve ser interpretado para cobrir tanto o singular como o plural, a menos que de outra maneira seja indicado aqui ou claramente contradito pelo contexto. Os termos "compreendendo", "tem", "incluem" e "contendo" devem ser interpretados como termos de extremidade aberta (isto é, significando "incluindo, mas não limitados a,") salvo indicação em contrário. A recitação de faixas de variação de valores aqui simplesmente é destinada a servir como um método abreviado da referência individualmente a cada valor separado que está incluído na faixa de variação, a menos que de outra maneira seja indicado aqui, e cada valor separado é incorporado na especificação como se fosse individualmente recitado aqui. Todos os métodos descritos aqui podem ser executados na qualquer ordem adequada a menos que de outra maneira seja indicado aqui ou de outra maneira claramente contraditos pelo contexto. O uso dos quaisquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, "tal como") fornecido aqui, é destinado simplesmente para iluminar melhor a invenção e não põe uma limitação do alcance da invenção a menos que de outra maneira não reivindicado. Nenhuma linguagem na especificação deve ser interpretada como indicando elemento não-reivindicado qualquer como essencial para a prática da invenção. Implementação e aspectos da invenção.

[0059] A presente invenção é dirigida a pelo menos uma cepa da levedura Pichia kluyveri, e usos e métodos da fermentação de material vegetal de cacau, sementes de cacau de incluindo e polpa de cacau, com a dita pelo menos uma cepa da levedura Pichia kluyveri.

[0060] Os presentes métodos levam em conta o controle ou a manipulação do desenvolvimento de características desejáveis, compostos de sabor tal como e outros ativos de qualidade, ponto tal como da fermentação e características do material fermentado, das sementes de cacau fermentadas e os produtos à base de cacau preparados.

[0061] Em um primeiro aspecto a presente invenção se refere a sementes de cacau fermentadas possuindo uma razão acetato de isobutila / isobutanol maior que 1, tal como maior que 1,2, e/ou uma razão acetato de isoamila / álcool isoamílico maior que 0,005, tal como maior que 0,006. Preferivelmente, as sementes de cacau fermentadas são da variedade Forastero.

[0062] Os níveis de acetato de isobutila, isobutanol, acetato de isoamila e álcool isoamílico podem ser determinados pelo par de cromatografia de gás da fase superior com a detecção de ionização de chama como estabelecida no Exemplo 1 aqui ou por outro método qualquer conhecido ao versado na técnica.

[0063] Em um segundo aspecto a presente invenção é relacionada a um produto à base de cacau que tem um perfil de sabor melhorado, em que o produto à base de cacau é preparado usando sementes de cacau fermentadas de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção.

[0064] Em um terceiro aspecto a presente invenção é relacionada a um método da fermentação de sementes de cacau compreendendo as etapas: acrescentar a um material vegetal essencialmente consistindo em sementes e/ou derivado de polpa de vagens de fruto das espécies Theobroma cacao pelo menos uma cepa da levedura Pichia kluyveri; fermentar o material vegetal; e secar as sementes de cacau fermentadas.

[0065] A espécie Theobroma cacao como usada aqui compreende todas as variedades, particularmente todas as variedades comercialmente úteis, inclusive mas não limitada a Forastero, Criollo, Trinitario, Arriba e atravessa e híbridos do mesmo. O derivado de sementes de cacau das vagens de fruto de Theobroma cacao é a matéria-prima principal da produção de chocolate. As sementes de cacau são incorporadas em uma polpa mucilaginosa dentro das vagens.Depois que as vagens são colhidas, as sementes de cacau (normalmente incluindo pelo menos uma porção da polpa circundante) são recuperadas das vagens.Consequentemente, o material vegetal usado no método da invenção pode compreender preferivelmente o derivado de sementes de cacau das vagens de fruto de Theobroma cacao, e pode compreender adicionalmente o derivado de polpa das ditas vagens de fruto.

[0066] O pelo menos uma cepa de Pichia kluyveri pode estar na forma congelada, líquida ou seca, incluindo por exemplo congelam a forma secada e o leito de borrifo/fluido que a forma secada, ou congelado ou congelado a vácuo concentra.

[0067] Em uma modalidade preferida a cepa Pichia kluyveri é selecionada do grupo consistindo em Pichia kluyveri cepas PK-KR1 e Pichia os kluyveri cepas PK-KR2 depositado no National Measurement Institute, 541-65 Clarke Street, South Melbourne, Victoria 3205, Austrália, por University of Auckland, School of Biological Sciences, Auckland 1142, Nova Zelândia, e dado os números de acesso V06/022711 e V06/022712, respectivamente, e mutante e cepas de variantes do mesmo, em que o mutante e as cepas de variantes do mesmo conservaram ou adicionalmente melhoraram as propriedades de sabor de V06/022711 e V06/022712, respectivamente.

[0068] Preferivelmente, a etapa a) é realizada no início da fermentação.

[0069] Em uma modalidade preferida o material vegetal é fermentado com o pelo menos uma cepa de Pichia kluyveri durante pelo menos 12 horas, tal como durante pelo menos 24 horas, tal como durante pelo menos 2 dias, tal como durante pelo menos 3 dias, tal como durante pelo menos 4 dias, tal como durante pelo menos 5 dias, tal como durante pelo menos 6 dias, tal como durante pelo menos 7 dias.

[0070] A fermentação em modalidades preferidas é realizada em montões, caixas de madeira, bandejas ou cestos para levar em conta a fermentação espontânea para ocorrer.

[0071] Em uma modalidade preferida o método da fermentação de sementes de cacau adicionalmente compreende a adição ao material vegetal pelo menos uma cepa bacteriana do ácido lático. Em uma modalidade mais preferida, a pelo menos uma cepa bacteriana do ácido lático é uma cepa bacteriana de Lactobacillus plantarum. Em outra modalidade mais preferida a pelo menos uma cepa bacteriana do ácido lático é uma cepa bacteriana de Lactobacillus paracasei.

[0072] Preferivelmente, a pelo menos uma cepa bacteriana do ácido lático é acrescentada pelo menos 12 horas, tal como pelo menos 24 horas, tal como pelo menos 36 horas, tal como pelo menos 48 horas, depois da adição da primeira composição compreendendo pelo menos uma cepa de Pichia kluyveri .

[0073] Em uma modalidade da presente invenção o pelo menos uma cepa de Pichia kluyveri é acrescentado ao material vegetal como uma primeira cultura de partida. O termo "cultura de partida" se refere a uma composição compreendendo microrganismos vivos que são capazes do iniciar ou realizar a fermentação do material orgânico, opcionalmente depois de ser cultivados em um meio de partida separado para obter uma cultura de alta densidade. Consequentemente, em uma modalidade, uma cultura de partida da invenção pode ser uma cultura de alta densidade obtida propagando uma cultura de partida em um meio adequado.

[0074] Uma cultura de partida de acordo com a presente invençã também pode conter além de microrganismos, agentes tamponadores e nutrientes estimulantes de crescimento ou preservativos ou outros transportadores, leite em pó tal como ou açúcar.

[0075] Em uma modalidade preferida a primeira cultura de partida contém pelo menos 102 unidades de formação de colônia (CFU)/g da cepa da levedura Pichia kluyveri, tal como pelo menos 103 CFU/g, tal como pelo menos 104 CFU/g, tal como pelo menos 105 CFU/g, tal como pelo menos 106 CFU/g, tal como pelo menos 107 CFU/g, tal como pelo menos 108 CFU/g, tal como pelo menos 109 CFU/g, tal como pelo menos 1010 CFU/g, tal como pelo menos 1011 CFU/g, tal como pelo menos 1012 CFU/g, tal como pelo menos 1013 CFU/g.

[0076] Em outra modalidade preferida a primeira cultura de partida contém entre 102 e 1010 CFU/g da cepa da levedura Pichia kluyveri do material vegetal, tal como entre 103 e 109 CFU/g, tal como entre 104 e 108 CFU/g, tal como entre 105 e 107 CFU/g.

[0077] Em ainda outra modalidade da presente invenção a pelo menos uma cepa bacteriana do ácido lático é acrescentada ao material vegetal como uma segunda cultura de partida.

[0078] Uma cultura de partida de acordo com a presente invenção também pode conter além de microrganismos, agentes tamponadores e nutrientes estimulantes de crescimento ou preservativos ou outros transportadores, leite em pó tal como ou açúcar.

[0079] Em uma modalidade preferida a segunda cultura de partida contém pelo menos 102 unidades de formação de colônia (CFU)/g da cepa bacteriana do ácido lático, tal como pelo menos 103 CFU/g, tal como pelo menos 104 CFU/g, tal como pelo menos 105 CFU/g, tal como pelo menos 106 CFU/g, tal como pelo menos 107 CFU/g, tal como pelo menos 108 CFU/g, tal como pelo menos 109 CFU/g, tal como pelo menos 1010 CFU/g, tal como pelo menos 1011 CFU/g, tal como pelo menos 1012 CFU/g, tal como pelo menos 1013 CFU/g.

[0080] Em outra modalidade preferida a segunda cultura de partida contém entre 102 e 1012 CFU/g da cepa bacteriana do ácido lático do material vegetal, tal como entre 103 e 1011 CFU/g, tal como entre 104 e 1010 CFU/g, tal como entre 105 e 109 CFU/g.

[0081] Um quarto aspecto da invenção se refere ao uso de pelo menos uma cepa da levedura Pichia kluyveri da fermentação de sementes de cacau para melhorar o sabor e/ou a qualidade das sementes fermentadas.

[0082] Em uma modalidade preferida o uso de pelo menos uma cepa da levedura Pichia kluyveri da fermentação de sementes e/ou polpa de cacau deve melhorar o sabor aumentando a razão acetato de isobutila / isobutanol a maior que 1, tal como maior que 1,2, e/ou a razão acetato de isoamila / álcool isoamílico a maior que 0,005, tal como maior que 0,006, depois da fermentação de sementes e/ou polpa de cacau durante 7 dias em 30°C seguido secando em 40°C durante 7 dias e/ou a qualidade das sementes fermentadas aumentando a quantidade de polpa liquefeita a maior que 95 % depois da fermentação de sementes e/ou polpa de cacau durante 7 dias em 30°C.

[0083] Em uma modalidade muito preferida a cepa Pichia kluyveri é selecionado do grupo consistindo em cepa de Pichia kluyveri PK- KR1 e Pichia os kluyveri cepas PK-KR2 depositado no National Measurement Institute, 541-65 Clarke Street, South Melbourne, Victoria 3205, Austrália, por University of Auckland, School of Biological Sciences, Auckland 1142, Nova Zelândia, e dado os números de acesso V06/022711 e V06/022712, respectivamente, e mutantes e variantes do mesmo, em que o mutante e as cepas de variantes do mesmo conservaram ou adicionalmente melhoraram as propriedades de sabor de V06/022711 e V06/022712, respectivamente.

[0084] Um quinto aspecto da invenção se refere a uma cepa da levedura Pichia kluyveri para uso na fermentação de sementes de cacau para melhorar o sabor e/ou a qualidade das sementes fermentadas.

[0085] Em uma modalidade preferida a cepa da levedura Pichia kluyveri para uso na fermentação de sementes e/ou polpa de cacau melhora o sabor aumentando a razão acetato de isobutila / isobutanol a maior que 1, tal como maior que 1,2, e/ou a razão acetato de isoamila / álcool isoamílico a maior que 0,005, tal como maior que 0,006, depois da fermentação de sementes e/ou polpa de cacau durante 7 dias em 30°C seguido secando em 40°C durante 7 dias e/ou a qualidade das sementes fermentadas aumentando a quantidade de polpa liquefeita a maior que 95 % depois da fermentação de sementes e/ou polpa de cacau durante 7 dias em 30°C.

[0086] Em uma modalidade muito preferida a cepa Pichia kluyveri é selecionado do grupo consistindo em cepa de Pichia kluyveri PK- KR1 e Pichia kluyveri cepa PK-KR2 depositadas no National Measurement Institute, 541-65 Clarke Street, South Melbourne, Victoria 3205, Austrália, por University of Auckland, School of Biological Sciences, Auckland 1142, Nova Zelândia, e dado os números de acesso V06/022711 e V06/022712, respectivamente, e mutantes e variantes do mesmo, em que o mutante e as cepas de variantes do mesmo conservaram ou adicionalmente melhoraram as propriedades de sabor de V06/022711 e V06/022712, respectivamente.

[0087] Um sexto aspecto da presente invenção se refere a sementes de cacau fermentadas conseguíveis executando o método de acordo com o primeiro aspecto da invenção.

[0088] Em um sétimo aspecto a presente invenção fornece um método para produzir produtos à base de cacau compreendendo as etapas de: c) fornecer sementes de cacau que foram fermentadas com um método de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção; e d) produzir um produto à base de cacau das sementes de cacau de etapa a).

[0089] Em uma modalidade preferida os produtos à base de cacau incluem o farelo de cacau, os flocos de cacau, o torta de cacau, o cacau em pó, o liquor de cacau e o chocolate incluem o chocolate escuro, o leite chocolate de chocolate ou branco.

[0090] Em um oitavo aspecto a presente invenção se refere a um produto à base de cacau conseguível executando o método do quarto aspecto da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1. Materiais e métodos. Ajustes da fermentação.

[0091] As provas para fermentação do cacau de escala do laboratório foram realizadas com 250g de sementes de cacau frescas (variedade de Forastero). As sementes de cacau foram recuperadas da Ghana.As sementes de cacau foram coletadas em garrafas de vidro de 500 ml, que foram livremente fechadas com uma chapeleta. A fermentação foi realizada em 30°C durante 7 dias. 7 cepas de levedura diferentes foram inoculadas nas sementes de cacau em 5 milhões de CFU/g nas sementes de cacau: Saccharomyces cerevisiae, Pichia kluyveri PK-KR1, Torulaspora delbrueckii, Kluyveromyces thermotolerans, Candida krusei, Hanseniapora guillermondii e Pichia membranifaciens. Depois da fermentação, as sementes de cacau fermentadas foram artificialmente secas em um forno em 40 °C durante até 7 dias. Análise por GC-FID da fase superior.

[0092] A cromatografia de gás da fase superior ligada com a detecção de ionização de chama (GC-FID) foi usada para a medição de acetaldeído, ésteres acéticos, ésteres e álcoois superiores nos produtos de fermentação.

[0093] Por fermentação de levedura 6 sementes de cacau fermentadas e secas foram analisadas para o seu perfil de sabor. As sementes foram arrombadas e a camada exterior foi retirada. O interior da semente (bicos) foi esmagado a pequenas partes e coletou em frascos. As amostras foram depois analisadas com um Sistema de Perkin Elmer GC calibrado com um amostrador da fase superior. O GC foi equipado de uma coluna DB-WAXETR (comprimento, 30 m; diâmetro interno, 0,25 mm; espessura de camada, 0.5 μm; Agilent Technologies, Alemanha). O injetor de divisão-splitless foi usado e manteve-se em 180°C. As amostras foram aquecidas para 30 min em 70°C no autoamostrador da fase superior antes da injeção (temperatura de agulha: 110°C). O hélio foi usado como o gás de transportador. Depois de começar em 60°C, a temperatura de forno foi levantada depois de 2 min de 60°C a 230°C em 45°C/min e foi finalmente mantida em 230°C para 5 min. Durante o programa GC com uma taxa de fluxo constante (10 mL/min) do gás de transportador (Ele) foi mantido. A temperatura FID foi mantida constante em 220°C respectivamente.Os resultados foram analisados com o software Turbochrom.

Resultados.

[0094] As fermentações de escala do laboratório foram realizadas com sementes de cacau frescas, inoculadas com 7 diferentes cepas de levedura. As fermentações foram realizadas durante 7 dias (ver Materiais e Métodos), que permitiu à polpa em volta das sementes fermentadas com Pichia kluyveri PK-KR1 liquefazer-se completamente. Depois da fermentação, as sementes foram coletadas e secas artificialmente em um forno em 40°C.

[0095] A análise de sabor das sementes de cacau fermentadas e secas foi realizada com o espaço superior GC-FID tal como descrito em Materiais e Métodos. Os resultados são representados na Fig. 1 (aldeídos), Fig. 2-4 (ésteres acéticos), Fig. 5-7 (ésteres de etila), e Fig. 8-9 (álcoois superiores).

[0096] Como os ésteres acéticos são formados de álcoois superiores, a razão do éster acético em relação ao precursor de álcool superior respectivo, dá uma ideia da eficiência da cepa da levedura para produzir certo éster (ver Fig. 10-11). Isto é específico para uma condição específica usada.Neste caso, isso é específico para a fermentação de semente de cacau.

Discussão.

[0097] As concentrações de acetaldeído não foram estatisticamente diferentes entre o farelo de cacau de sementes fermentadas com diferentes cepas de levedura (vide a Fig.1).

[0098] As mais elevadas diferenças de sabor foram encontradas para ésteres. Parece que as concentrações de ésteres acéticos, especialmente a concentração de acetato de isoamila, que é um composto de sabor frutoso desejável, foi altamente aumentada no farelo de cacau de sementes de cacau fermentadas com Pichia kluyveri, em comparação com outras cepas da levedura.Também a concentração de acetato de isobutila foi aumentada no farelo de cacau de sementes de cacau fermentadas com Pichia kluyveri, em comparação com outras cepas da levedura. O acetato de etila, que é um composto negativo em altas concentrações por causa do prego pule o sabor, mas facilmente mascarado por outros ésteres acéticos, foi aumentado no farelo de cacau de sementes de cacau fermentadas com Hanseniapora guillermondii e diminuiu com Pichia membranifaciens.

[0099] Os ésteres de etila medidos foram o hexanoato de etila, octanoato e o decanoato (Figs. 5-7). As altas concentrações do hexanoato de etila foram atingidas em bicos de coqueiro fermentados com Saccharomyces cerevisiae e Hanseniapora guillermondii, enquanto as concentrações baixas foram atingidas nas fermentações com Pichia kluyveri e Candida krusei. O octanoato de etila foi encontrado na mais elevado concentração, em comparação com hexanoato de etila e decanoato. Aqui, o mais alto nível foi obtido nas fermentações com Hanseniapora guillermondii e o nível mais baixo foi encontrado na fermentação com Candida krusei. Para o decanoato de etila, nenhuma diferença foi encontrada entre todas as diferentes cepas de levedura.

[00100] As concentrações do isobutanol atingiram o mais alto nível na fermentação com Hanseniapora guillermondii e o nível mais baixo foi atingido na fermentação com Pichia kluyveri (Fig. 8). O nível de álcool isoamílico foi mais elevado na fermentação com Candida krusei e o mais baixo na fermentação com Pichia membranifaciens (Fig. 9).

[00101] Como os ésteres acéticos são formados de álcoois superiores como substrato, a razão do éster acético em relação ao precursor de álcool superior respectivo é um modo de medir a eficiência catalítica de uma cepa da levedura para produzir ésteres acéticos e isto em uma condição específica (Fig. 10 e 11).

[00102] Da análise de sabor completa de todas as fermentações, é claro que Pichia kluyveri produz as mais elevadas quantidades de sabores desejáveis, isto é acetatos de isobutila e isoamila. Isto significa que a cepa Pichia kluyveri tem um enorme efeito sobre o perfil de sabor do farelo de cacau. Os aumentos notáveis foram encontrados para a razão ésteres acéticos em relação aos álcoois respectivos da isoamila de compostos de sabor desejável e acetato de isobutila, isto mostra um potencial enorme para usar a Pichia kluyveri como cultura de partida de fermentações de cacau.

[00103] Além disso, a cepa Pichia kluyveri foi a única cepa capaz de liquefazer a polpa de cacau completamente depois de 7 dias da fermentação em 30°C, que é uma indicação da alta atividade pectinolítica. Sobre disto, a liquefação foi muito mais rápida, em comparação com outras cepas. Isto indica que a Pichia kluyveri é muito eficiente na fermentação de cacau, já que a redução do volume de polpa de cacau final melhora a qualidade final (menor o teor de cascas nas sementes secas de cacau finais).

Exemplo 2.

[00104] As fermentações de cacau de escala da produção foram realizadas para apoiar o achado que usar uma cultura de Pichia kluyveri para partida de fermentações de cacau melhora a qualidade e o sabor do cacau.

Materiais e métodos. Ajustes da fermentação.

[00105] Um total de 4 fermentações em 'o volume de cacau' foi executado: a fermentação de cacau inoculadas com a cepa da levedura Pichia kluyveri PK-KR1 em duplicata. uma fermentação espontânea não-inoculada de cacau de controle em duplicata.

[00106] Os ajustes da fermentação foram executados em montões de aproximadamente 100 kg de sementes de cacau cruas, cobertas com plástico. As sementes de cacau são referidas como 'volume de cacau', significando uma mistura de Variedades Trinitario, Forastero e Criollo.

1) Protocolo de fermentação.

[00107] Inoculação com cepa da levedura Pichia kluyveri PK-KR1 (PK).

[00108] Só a Pichia kluyveri é inoculada.

Protocolo.

[00109] A inoculação da levedura foi realizada depois que as vagens de cacau foram abertas e um monte foi formado: As vagens de cacau foram abertas e as sementes de cacau foram retiradas e postas em um cesto. A placenta dentro da vagem de cacau foi retirada.As sementes de cacau foram vazadas sobre as folhas de bananeira para começar a formar o monte.Um monte de aproximadamente 100 kg foi formado.

[00110] A levedura foi acrescentada diretamente sobre o monte de sementes de cacau:

[00111] Um saco da levedura congelada foi descongelado em água. Uma vez descongelado, a pasta fluida de levedura do saco foi suspensa na água em uma diluição 1/1. A levedura foi inoculada em 5 milhões de células/g semente de cacau, que foi equivalente à 500 ml de pasta fluida de levedura /100 kg de sementes. A suspensão de levedura foi vazada em uma panela aguada.A suspensão de levedura foi espalhada em relação aos montões de sementes de cacau e bem misturada com as sementes.

[00112] As fermentações foram cobertas de folhas de bananeira e posteriormente um filme plástico para proteger as sementes de cacau contra a chuva. Um termômetro e um medidor de pH foram postos em um monte selecionado para seguir a temperatura e o pH constantemente.

Amostragem.

[00113] Cada dia (incluindo um ponto de tempo nulo), as amostras foram tomadas para contagem de leveduras e bactérias (Plaqueamento de YGC e GJ5)

[00114] Para a contagem de leveduras e bactérias, 10 g de sementes de cacau foram misturados com 90 ml da água peptonada em um saco Stomacher. As sementes de cacau foram lavadas bem na água peptonada e 1 ml da amostra foi tomado deste saco para fazer diluições seriais. A amostra de 1 ml foi diluída em 9ml de água peptonada. As diluições decimais foram feitas desse frasco e plaqueadas nos meios respectivos. O plaqueamento foi feito em GJ5 de bactérias do ácido lático e YGC da levedura.

2) Controle espontâneo (SP).

[00115] Nenhuma inoculação da levedura foi realizada.

Protocolo.

[00116] As vagens de cacau foram abertas e um monte foi formado:

[00117] As vagens de cacau foram abertas e as sementes de cacau foram retiradas e postas em um cesto. A placenta dentro da vagem de cacau foi retirada.As sementes de cacau foram vazadas sobre as folhas de bananeira para começar a formar o monte.Um monte de aproximadamente 100 kg foi formado.As fermentações foram cobertas de folhas de bananeira e posteriormente um filme plástico para proteger as sementes de cacau contra a chuva.

[00118] Um termômetro e um medidor de pH foram postos em um monte selecionado para seguir a temperatura e o pH constantemente.Amostragem.

[00119] Cada dia (incluindo um ponto de tempo nulo), as amostras foram tomadas para contagem de leveduras e bactérias (Plaqueamento de YGC e GJ5)

[00120] Para a contagem de leveduras e bactérias, 10 g de sementes de cacau foram misturados com 90 ml da água peptonada em um saco Stomacher. As sementes de cacau foram lavadas bem na água peptonada e 1 ml da amostra foi tomado deste saco para fazer diluições seriais. A amostra de 1 ml foi diluída em 9ml de água peptonada. As diluições decimais foram feitas desse frasco e plaqueadas nos meios respectivos. O plaqueamento foi feito em GJ5 de bactérias do ácido lático e YGC da levedura.

[00121] GJ5 é feito do suco de uva concentram-se (77.5 g/L, K V Saft Vall0), extrato de levedura (22.4 g/L; Springer Bio), Tween ® 80 (0.6 g/L; Sigma-Aldrich), MnSO4, H2O (0,1 g/L; Merck), e ágar-ágar (15 g/L; SO-BI-GEL) em água de torneira. YGC é feito do extrato de levedura (5,0 g/L; Oxoid L21), D-glucose-monohydrat (20,0 g/L; Merck), chloramphenicol (0,1 g/L; Fluka) e ágar-ágar (15 g/L; SO-BI- GEL) em água Milli-Q (Millipore).

[00122] Informação sobre a fermentação no monte.

[00123] Todas as fermentações foram realizadas durante 5 dias (ver a Tabela 1). O peso de cada fermentação foi aproximadamente 100 kg (ver a Tabela 1). As fermentações foram viradas (variadas) depois de 48 e 96 horas para ter uma fermentação homogênea e deixar o ar na fermentação. Tabela 1. Informação sobre peso no monte.

Processos de pós - fermentação.

[00124] Depois que as fermentações foram feitas, as sementes foram coletadas e secas sob um abrigo em esteiras de bambu. As sementes de cacau foram secas durante 8 dias, até que o teor de umidade fosse aproximadamente 8 % (ver a Tabela 2). Depois da secagem, as sementes de cacau foram coletadas e as amostras foram tomadas para a torrefação. As condições de torrefação são mencionadas na Tabela 3. As amostras torradas foram usadas para fazer o liquor de cacau da degustação. O liquor de cacau é feito pela remoção as conchas das sementes de cacau e moedura dos 'bicos' (dentro de sementes de cacau) para atingir uma pasta de cacau = liquor de cacau. Tabela 2. Condições de secagem (secagem ao sol).

Tabela 3. Condições de torrefação.

RESULTADOS. Crescimento de leveduras e bactérias.

[00125] Depois de terminadas todas as fermentações de cacau, todas as placas de YGC e GJ5 foram contadas para analisar o crescimento de bactérias do ácido lático e da levedura. Os resultados são traçados por fermentação (ver Fig. 12, 13, 14 e 15).

[00126] Para a fermentação espontânea (SP_A e B): - a levedura cresceu a 50 milhões de células por g, em ambas as duplicatas. Entretanto, em SP_B, as células de levedura caíram para a concentração de 1 milhão de células por ml depois da primeira alteração (48o), enquanto o crescimento de levedura foi mais constante em SP_A. - as bactérias do ácido lático em GJ5 cresceram a 100 milhões de células por g em ambas as fermentações duplicadas, com uma partida mais lenta na fermentação B. As bactérias do ácido lático ficaram em uma alta concentração até o final da fermentação.

[00127] Para a fermentação com inoculação de Pichia kluyveri (PK_A e B): - a levedura cresceu a 10 milhões de células por g, em ambas as duplicatas, e atingiu o máximo somente depois da virada (48a). Depois de três dias, as contagens das células caíram 0, 1 milhão de células por g. A Pichia kluyveri células de levedura formou a maioria de células de levedura nas placas de três primeiros dias. - as bactérias do ácido lático em GJ5 seguiram mais ou menos a mesma tendência como nas fermentações espontâneas.

[00128] Degustação de sementes de cacau.

[00129] O liquor de cacau foi feito para as 4 fermentações. O licor foi provado por uma equipe de provadores profissionais de 9 pessoas e avaliado para os seguintes itens: - gosto de cacau - amargor - adstringente - floral - frutoso - cru/verde - agradával - sabor ruim

[00130] Os resultados são dados na Fig. 16. Os resultados mostrados são a média de amostras A e B de cada fermentação.

[00131] Em geral, o gosto das sementes de cacau inoculadas com Pichia kluyveri foi peercebido na sua maioria como gosto de cacau, floral, agradával e frutoso em comparação com sementes de cacau da fermentação espontânea. A fermentação espontânea deu sementes de cacau com o sabor mais amargo e adstringente.Esta fermentação também produziu a maior parte de sementes de cacau com sabor ruim. Isto poderia ser relacionado para moldar o crescimento na fermentação espontânea.

[00132] Depois da seção descritiva de sabor, também se pediu que o grupo de degustadores desse uma pontuação e preferência total às sementes de cacau. Os resultados são representados na Fig. 17. Da preferência total e pontuação média, foi muito claro que a fermentação inoculada com Pichia kluyveri com a mais elevado pontuação foi a mais preferida. A fermentação espontânea foi a menos preferida.

DEPÓSITOS

[00133] A Pichia kluyveri PK-KR1 e as cepas de PK-KR2 foram depositados no dia 24 de agosto de 2006 no National Measurement Institute, 541-65 Clarke Street, South Melbourne, Victoria 3205, Austrália, por University of Auckland, School of Biological Sciences, Auckland 1142, Nova Zelândia, e dados os números de acesso V06/022711 e V06/022712, respectivamente, tal como descrito em WO 2009/110807 na página 14. REFERÊNCIAS Schwan, R.F. (1998). Appl. Environ. Microbiol. 64:1477- 1483 Schwan, R.F e Wheals, A.E. (2004) Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 44:205-221. Lima, L.J.R., Almeida, M.H., Nout, M.J.R. e Zwietering, M.H. (2011). Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 51:731-761. Afoakwa, E.O., Paterson, A., Fowler, M. e Ryan, A. (2008). Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 48; 840-857. Jespersen, L. (2003) FEMS Yeast Res. 3:191-200. Leal, G.A., Gomes, L.H., Efraim, P., Tavares, F.C.d. A. e Figueira, A. (2008). FEMS Yeast Res. 8:788-798. Lefeber, T, Janssens, M., Camu, N. e Vuyst, L.D. (2010). Appl. Environ. Microbiol. 76:7708-7716. Lefeber, T., Janssens, M, Moens, F., Gobert, W. e De Vuyst, L. (2011). Appl. Environ. Microbiol.publicado online à frente de impressão no dia 29 de julho de 2011. WO 2007/031186 WO 2011/012680

Claims

1. Método de fermentação de sementes de cacau, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) adicionar um material vegetal essencialmente constituído por sementes e/ou derivado de polpa de vagens de fruto da espécie Theobroma cacao, a cepa Pichia kluyveri PK-KR1 depositada em 24 de agosto de 2006 no National Measurement Institute, 541-65 Clarke Street, South Melbourne, Victoria 3205, Austrália, pela Universidade de Auckland, Escola de Ciências Biológicas, Auckland 1142, Nova Zelândia, sob o número de acesso V06/022711; (b) fermentar o material vegetal por pelo menos 12 horas para obter sementes de cacau fermentadas, e (c) secar as sementes de cacau fermentadas.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é realizada no início da fermentação.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda adicionar ao material vegetal pelo menos uma cepa bacteriana de ácido lático.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma cepa bacteriana de ácido lático é uma cepa bacteriana de Lactobacillus plantarum.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma cepa bacteriana de ácido lático é uma cepa bacteriana de Lactobacillus paracasei.