BR112014005398B1

BR112014005398B1 - Agente de preenchimento cutâneo que inibe a atividade de metaloproteinases de matriz

Info

Publication number: BR112014005398B1
Application number: BR112014005398-7A
Authority: BR
Inventors: Young Ji Chung; Eun Mi Kim
Original assignee: Caregen Co., Ltd.
Priority date: 2011-09-09
Filing date: 2011-11-02
Publication date: 2021-08-31
Also published as: CN104024271A; WO2013035931A1; KR101363455B1; US20140328782A1; US9303064B2; CN104024271B; EP2754665A4; EP2754665A1; JP2014526459A; ES2637290T3; JP5908589B2; BR112014005398A2; EP2754665B1; KR20130028403A

Abstract

peptídeo que inibe a atividade de metaloproteinases de matriz e uso do mesmo. a presente invenção refere-se a um peptídeo que inibe a atividade de metaloproteinases de matriz e uso do mesmo. o peptídeo que inibe a atividade de metaloproteinases de matriz exibe excelente eficácia em melhorar a condição da pele inibindo diretamente a atividade das metaloproteinases de matriz. em adição, uma composição contendo o peptídeo da invenção tem excelentes bioatividades de inibir a atividade de enzimas que degradam o ácido hialurônico, a adipogênese em células de gordura, angiogênese, e similares, sendo assim útil para o tratamento de várias doenças tais como obesidade, câncer, inflamação, e similares, e para a permeabilidade da pele é excelente devido ao pequeno tamanho do peptídeo, sendo assim útil em vários campos. o peptídeo da invenção com excelente atividade e segurança pode ser vantajosamente aplicado a fármacos, pseudofármacos, e cosméticos.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente descrição refere-se a um peptídeo que inibe a atividade de metaloproteinases de matriz e uso do mesmo.

Descrição da Técnica Relacionada

[002] A metaloproteinase de matriz (MMP) é um grupo de endopeptidase capaz de degradar macro-biomoléculas tais como colágeno, proteoglicano e gelatina. A MMP é classificada como colagenase, gelatinase, estromelisina e MMP tipo membrana. Toda a MMP é expressa na forma de pró-enzima, e ativada cortando-se sua porção (Bond, J.S., e outros, Int. J. Biochem., 75, 565 a 574 (1985); Chen, J.M., Chen, W.T., Cell, 48, 193 a 203 (1987); Harris, E.D. e outros, Coll Rel Res, 4, 493 a 512 (1984)).

[003] A colagenase age em colágeno epilético com forma de hélice tripla, gelatina, e similares, e é conhecida como três tipos de colagenase, tal como colagenase de fibroblasto, colagenase de leucócitos neutrofílicos e colagenase-3. Em adição, relatou-se que a colagenase corta o tipo I, II e III de fibrilas de colágeno (Goldberg, G.I., e outros, J.Biol.Chem., 261, 6600 a 6605 (1986); Fini, M.E., e outros, Biochemistry, 26, 6155 a 6165 (1987)). Ademais, relatou-se que essas três colagenases têm ao menos aproximadamente 50% de identidade de sequência (Borkakoti, e outros, Nature Struct. Biol., 1, 106 a 110 (1994); EMBO, J., 13, 1263 a 1269 (1994)).

[004] MMP cai em um domínio de pró-peptídeo, um domínio catalítico e um domínio C-terminal. MMP é feita de forma criptoplásmica e secretada, e ativada cortando-se 80 aminoácidos do domínio de pró- peptídeo N-terminal e removendo-se o resíduo de cisteína do domínio tendo sequências PRCGVPD (Van Wart, H.E. e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5578 a 5582 (1990)). Relatou-se que a atividade da MMP ativada é inibida por acoplamento com o inibidor de tecido da metaloproteinase de matriz (TIMP), o acoplamento é regulado pelo domínio catalítico (Murphy, e outros, J. Niol. Chem., 267, 9612 a 9618 (1992)). Várias formas de MMP têm especificidade de substrato, e são expressas em processo metabólico quando necessário para degradar a matriz extracelular ou a estrutura de colágeno em tecidos normais. O distúrbio associado à MMP é aterosclerose, doença inflamatória do sistema nervoso central, doença de Alzheimer, envelhecimento da pele, artrite reumatoide, osteoartrite, úlcera de córnea, doença óssea, albuminúria, doença de aneurisma abdominal, perda de cartilagem degenerativa devido a lesões traumáticas de articulação, doença desmielinizante do sistema nervoso central, cirrose, doença glomerular, ruptura prematura de membranas fetais, doença inflamatória do intestino, doença periodontal, degeneração macular relacionada à idade, retinopatia diabética, cardiomiopatia, vitreoretinopatia proliferativa, retinopatia imatura, ceratocone, síndrome de Sjogren, miopia, tumores nos olhos, rejeição ao transplante de córnea, angiogênese, invasão de câncer e metástase, e similares. À medida que a doença progrediu, a matriz extracelular de cartilagem articular é destruída, embora o distúrbio autoimune seja a causa de artrite reumatoide e osteoartrite. A estromelisina é reconhecida como a principal enzima nessa artrite e trauma de articulação e desempenha uma função importante na conversão de pró-colagenase em colagenase ativada. Então, a inibição da atividade de MMP bloqueia a progressão de artrite, e relatou-se que a MMP é derivada de leucócitos penetrantes, fibroblastos ou micro-organismos externos.

[005] Também, a colagenase secretada pelo estímulo de mediador inflamatório e bactérias gera retração gengival ao degradar o colágeno que é o substrato de tecido periodontal, e causa doença periodontal através da progressão dessa. A atividade de colagenase de fibroblasto e estromelisina, separados a partir de gengiva inflamada, é mostrada, e revela-se que um nível de enzima e gengivite observado é corrigido (Overall, C.M. e outros, J. Periodontal Res. 22, 81 a 88 (1987)).

[006] MMP está relacionada à patogênese de um sistema nervoso central. Assume-se que MMP destrói a mielina e a barreira hemato- encefálica inserindo a célula mononuclear inflamatória no nervo central, e está envolvida no acúmulo de proteína beta-amiloide na doença de Alzheimer (Yong, VW, e outros, Trends Neurosci 21(2),75 a 80 (1998)). Também, relatou-se que a concentração de MMP é mais alta no cérebro com doença de Alzheimer do que no cérebro normal (Leake A, Morris CM, & Whateley J. Neurosci Lett 291(3),201-3(2000), e relatou-se que o nível de gelatinase no fluido cérebro-espinhal está relacionado à esclerose múltipla e outras doenças nervosas e contribui para o acúmulo de proteína beta-amiloide após degradá-la (Backstrom JR, e outros, J neurosci 16(24),7910-9 (1996)).

[007] Em adição, como MMP induz o envelhecimento da pele, a inibição de MMP antecipa o tratamento e a prevenção de rugas; ademais, a MMP facilita a angiogênese e a invasão de câncer e metástase através de degradação de membrana basilar. Então, há uma necessidade de desenvolvimento de fármacos que sejam capazes de inibir MMP, porque a MMP não somente desempenha uma função importante na invasão do câncer e metástase através de degradação de membrana basilar, mas também media várias doenças. Entretanto, há uma necessidade do desenvolvimento de agentes não tóxicos como inibidores da atividade de MMP, porque o inibidor pode ser usado somente na medicina ideal somente se ele puder ser seguro com uso a longo prazo.

[008] Ademais, foi conduzido ativamente um estudo sobre inibidores de MMP para tratamento eficaz de várias doenças mediadas por MMP, e o desenvolvimento de inibidores de MMP é usado eficazmente no tratamento de várias doenças.

[009] Por todo este pedido, várias patentes e publicações são referenciadas, e citações são fornecidas em parênteses. As descrições dessas patentes e publicações são aqui incorporadas por referência neste pedido de modo a descrever mais completamente esta invenção e o estado da técnica a qual esta invenção pertence.

Descrição Detalhada Desta Invenção

[0010] Os presentes inventores realizaram pesquisas intensivas para desenvolver peptídeos excelentes inibindo a atividade de metaloproteinases de matriz e triaram peptídeos após sintetizar vários tipos de peptídeos. Como um resultado, os presentes inventores selecionaram peptídeos que são superiores não somente em atividade biológica tal como efeitos da inibição da degradação de colágeno, inibição da morte celular por estresse oxidativo, inibição da atividade da metaloproteinase de matriz 2 e a inibição da degradação de ácido hialurônico, mas também na relação de penetração na pele.

[0011] Consequentemente, é um objetivo desta invenção fornecer um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácido representada pela seguinte fórmula 1:

[0012] É outro objetivo desta invenção fornecer uma composição cosmética para melhorar as condições da pele, compreendendo o peptídeo como um ingrediente ativo.

[0013] É ainda outro objetivo desta invenção fornecer uma composição farmacêutica para melhorar as condições da pele, compreendendo o peptídeo como um ingrediente ativo.

[0014] É ainda outro objetivo desta invenção fornecer um agente de preenchimento cutâneo, compreendendo o peptídeo e ácido hialurônico.

[0015] É ainda outro objetivo desta invenção fornecer uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar obesidade, compreendendo o peptídeo como um ingrediente ativo.

[0016] É ainda outro objetivo desta invenção fornecer uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar inflamação, compreendendo o peptídeo como um ingrediente ativo.

[0017] É ainda outro objetivo desta invenção fornecer uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar câncer, compreendendo o peptídeo como um ingrediente ativo.

[0018] É ainda outro objetivo desta invenção fornecer uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar um distúrbio relacionado à atividade de MMP, compreendendo o peptídeo como um ingrediente ativo.

[0019] Outros objetivos e vantagens da presente invenção se tornarão mais claros a partir da seguinte descrição detalhada junto com as reivindicações e desenhos em anexo.

[0020] Em um aspecto desta invenção, é fornecido um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácido representada pela seguinte fórmula 1:

[0021] em que Xaa1 representa Ser, Met, Tyr, Gly, Ala, Val, Leu ou Ile, Xaa2 representa Ile, Leu, Val, Ser, Met, Tyr, Gly ou Ala, Xaa3 representa Lys, Tyr ou Phe, Xaa4 representa Leu, Ile, Val, Ser, Met, Tyr, Gly ou Ala, Xaa5 representa Gln, Ser ou Thr, Xaa6 representa Gly, Pro ou Lys.

[0022] Os presentes inventores realizaram pesquisas intensivas para desenvolver excelentes peptídeos inibindo a atividade de metaloproteinases de matriz e triaram peptídeos após sintetizar vários tipos de peptídeos. Como um resultado, selecionou-se peptídeos que são superiores não somente em atividade biológica, tal como efeitos de inibição de degradação de colágeno, inibição de morte celular por estresse oxidativo, inibição da atividade de metaloproteinase de matriz 2 a inibição da degradação de ácido hialurônico, mas também na relação de penetração na pele.

[0023] Mais especificamente, os presentes inventores sintetizaram peptídeos candidatos selecionando uma porção virtual capaz de se ligar a uma metaloproteinase de matriz que já é conhecida através de Busca de Homologia usando um computador e métodos de ancoragem, e então otimizando-se uma sequência de aminoácido da porção predita. Em seguida, os peptídeos candidatos foram sintetizados executando-se síntese de fase sólida usando resina de cloreto de tritila e aminoácidos protegidos por Fmoc, os presentes inventores isolaram os peptídeos desejados removendo o grupo de proteção Fmoc da resina usando ácido trifluoracético. Após passar por purificação, análise e verificação de conteúdos e pureza nos peptídeos sintetizados, os peptídeos da presente invenção são selecionados triando-se os peptídeos tendo a bioatividade mais excelente através de vários testes biológicos.

[0024] O peptídeo de acordo com a presente invenção, Xaa1 representa Ser, Met ou Tyr, Xaa2 representa Ile ou Leu, Xaa3 representa Lys, Tyr ou Phe, Xaa4 representa Leu, Ile ou Val, Xaa5 representa Gln, Ser ou Thr, Xaa6 representa Gly, Pro ou Lys. De acordo com uma certa modalidade, o peptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em sequências de aminoácido de SEQ ID NO: 1-3.

[0025] O termo usado aqui “peptídeo” refere-se a uma molécula linear formada pela ligação entre os resíduos de aminoácido através de ligações peptídicas. Os peptídeos da presente invenção podem ser preparados por processos de síntese química convencionais conhecidos pelos versados na técnica, em particular, técnicas de síntese de fase sólida (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54 (1963); Stewart, e outros, Solid Phase Peptide Synthesis,2aed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111 (1984)).

[0026] O termo usado aqui “peptídeo” refere-se a uma molécula linear formada pela ligação de resíduos de aminoácido através de ligações peptídicas. Os peptídeos da presente invenção podem ser preparados por processos de síntese química convencionais conhecidos pelos versados na técnica, em particular, técnicas de síntese de fase sólida (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54 (1963); Stewart, e outros, Solid Phase Peptide Synthesis,2aed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111 (1984)).

[0027] O peptídeo da presente invenção seleciona uma porção de sequências de aminoácido e induz modificações no N-terminal ou C- terminal para melhorar sua atividade. Sua modificação possibilita que tenha vida útil muito maior quando o peptídeo é administrado em um sistema vivo.

[0028] Em adição, os peptídeos desta invenção têm em seu C- terminal, um grupo de proteção selecionado a partir do grupo que consiste em grupo hidroxila (-OH), grupo amino (-NH2) e grupo azida (- NHNH2), em seu N-terminal um grupo de proteção selecionado a partir do grupo que consiste em grupo acetila, grupo fluorenil metóxi carbonila, grupo formila, grupo palmitoila, grupo miristila, grupo estearila e polietileno glicol (PEG).

[0029] As modificações de peptídeos descritos acima aumentam muito a estabilidade dos peptídeos desta invenção. O termo usado aqui “estabilidade” refere-se à estabilidade in vivo e estabilidade em armazenamento (por exemplo, estabilidade em armazenamento em temperatura ambiente) também. O grupo de proteção descrito acima projeta os peptídeos a partir do ataque de protease de um sistema vivo.

[0030] De acordo com uma certa modalidade, o peptídeo da presente invenção facilita o crescimento celular em fibroblastos dérmicos primários humanos e fibroblastos, e inibe a morte celular por estresse oxidativo. Também, após induzir a morte celular através da irradiação de UV diretamente na célula, o tratamento do peptídeo da presente invenção inibe a morte celular. Em adição, o peptídeo da presente invenção não somente inibe diretamente a atividade de metaloproteinase de matriz, mas também inibe a degradação de colágeno por metaloproteinases de matriz. Ademais, o peptídeo da presente invenção exibe uma excelente eficácia em inibir transferência de melanossomas que é importante para o branqueamento da pele. Esses resultados significam que o peptídeo da presente invenção tem uma excelente eficácia em melhorar a condição.

[0031] Em outro aspecto desta invenção, é fornecida uma composição cosmética para melhorar as condições da pele, compreendendo o peptídeo da presente invenção como um ingrediente ativo.

[0032] Em ainda outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para melhorar as condições da pele, compreendendo administrar a um sujeito uma composição contendo o peptídeo da presente invenção como um ingrediente ativo.

[0033] De acordo com uma certa modalidade, a melhora das condições da pele da presente invenção é a melhora das rugas ou elasticidade da pele, prevenção de envelhecimento da pele, melhora na umidade da pele, remoção de feridas, regeneração da pele ou branqueamento da pele.

[0034] Em ainda outro aspecto desta invenção, é fornecida uma composição farmacêutica para melhorar as condições da pele, compreendendo o peptídeo da presente invenção como um ingrediente ativo.

[0035] De acordo com uma certa modalidade, a melhora das condições da pele da presente invenção é a remoção de feridas ou regeneração.

[0036] Em ainda outro aspecto desta invenção, é fornecido um agente de preenchimento de pele compreendendo o peptídeo da presente invenção e ácido hialurônico.

[0037] Em ainda outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para preencher uma pele, compreendendo administrar a um sujeito o peptídeo da presente invenção e ácido hialurônico.

[0038] O peptídeo da presente invenção exibe excelente eficácia em melhorar a segurança a longo prazo em inibir a atividade de hialuronato liase no caso de aplicação do peptídeo a produtos agentes de preenchimento.

[0039] Em ainda outro aspecto desta invenção, é fornecida uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar obesidade, compreendendo o peptídeo da presente invenção como um ingrediente ativo.

[0040] Em ainda outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para prevenir ou tratar obesidade, compreendendo administrar a um sujeito uma composição contendo o peptídeo da presente invenção como um ingrediente ativo.

[0041] O peptídeo da invenção tem excelentes atividades de inibir adipogênese quando o peptídeo trata adipócitos, sendo assim úteis para a prevenção ou tratamento de obesidade.

[0042] Em ainda outro aspecto desta invenção, é fornecida uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar inflamação, compreendendo o peptídeo da presente invenção como um ingrediente ativo.

[0043] Em ainda outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para prevenir ou tratar inflamação, compreendendo administrar a um sujeito uma composição contendo o peptídeo da presente invenção como um ingrediente ativo.

[0044] O peptídeo da presente invenção exibe excelente eficácia de anti-inflamatórios inibindo a expressão de proteínas relacionadas à inflamação no caso do tratamento do peptídeo da presente invenção para células periodontais.

[0045] Em ainda outro aspecto desta invenção, é fornecida uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar câncer, compreendendo o peptídeo da presente invenção como um ingrediente ativo.

[0046] Em ainda outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para prevenir ou tratar câncer, compreendendo administrar a um sujeito uma composição contendo o peptídeo da presente invenção como um ingrediente ativo.

[0047] O peptídeo da presente invenção inibe a angiogênese através da supressão de formação de tubo em células endoteliais vasculares, sendo assim aplicável ao tratamento de vários cânceres.

[0048] Em ainda outro aspecto desta invenção, é fornecida uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar um distúrbio relacionado à atividade de MMP, compreendendo o peptídeo da presente invenção como um ingrediente ativo, em que o distúrbio relacionado à atividade de MMP compreende artrite, retinopatia diabética, cicatriz hipertrófica, psoríase, úlcera de membrana mucosa e tecido epitelial, inflamação por resposta autoimune; lúpus, neuropatia autoimune, destruição de miócitos como distúrbio relacionado à degradação da membrana basilar; glaucoma ou angiogênese excessiva.

[0049] Em ainda outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para prevenir ou tratar um distúrbio relacionado à atividade de MMP, compreendendo administrar a um sujeito uma composição contendo o peptídeo da presente invenção como um ingrediente ativo, em que o distúrbio relacionado à atividade de MMP compreende artrite, retinopatia diabética, cicatriz hipertrófica, psoríase, úlcera de membrana mucosa e tecido epitelial, inflamação por resposta autoimune; lúpus, neuropatia autoimune, destruição de miócitos como distúrbio relacionado à degradação da membrana basilar; glaucoma ou angiogênese excessiva.

[0050] O peptídeo da presente invenção tem várias bioatividades de inibir a atividade de metaloproteinases de matriz (MMP), degradação de colágeno, degradação de ácido hialurônico, formação de lipídeo em células adipócitos e angiogênese, sendo assim útil para o tratamento de doenças relacionadas.

[0051] Em adição, a permeabilidade na pele do peptídeo da presente invenção é excelente devido ao peso molecular do peptídeo é menor do que a de outras proteínas. Então, as composições compreendendo o peptídeo da presente invenção melhora eficazmente as condições da pele no caso de aplicação do peptídeo à pele topicamente.

[0052] Então, o peptídeo da invenção pode ser vantajosamente aplicado a fármacos e cosméticos e a presente composição pode ser preparada como uma composição farmacêutica ou cosmética.

[0053] De acordo com uma modalidade preferencial, a composição é uma composição farmacêutica compreendendo (a) uma quantidade farmaceuticamente eficaz dos peptídeos da presente invenção; e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0054] O termo usado aqui “quantidade farmaceuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade suficiente para mostrar e alcançar eficácias e atividades do peptídeo desta invenção.

[0055] O veículo farmaceuticamente aceitável contido na composição farmacêutica da presente invenção, que é geralmente usado em formulações farmacêuticas, mas não está limitado, inclui lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, borracha, fosfato de potássio, arginato, gelatina, silicato de potássio, celulose microcristalina, polivinil pirrolidona, celulose, água, xaropes, metil celulose, metil-hidróxi benzoato, propil-hidróxi benzoato, talco, estearato de magnésio, e óleos minerais. A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode incluir ainda um lubrificante, um umectante, um adoçante, um agente flavorizante, um emulsificante, um agente de suspensão, e um conservante. Os detalhes de veículos e formulações farmaceuticamente aceitáveis podem ser encontrados em Remington's Pharmaceutical Sciences(19aed., 1995), que é incorporado aqui por referência.

[0056] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada oral e parenteralmente, e preferencialmente, administrada parenteralmente, por exemplo, por administração intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, local ou transdérmica.

[0057] A quantidade de dosagem adequada da composição farmacêutica da presente invenção pode variar dependendo dos métodos de formulação farmacêutica, dos métodos de administração, da idade do paciente, do peso corporal, sexo, estado patogênico, dieta, tempo de administração, via de administração, uma taxa de excreção e sensibilidade para uma composição farmacêutica usada. Preferencialmente, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada com uma dosagem diária de 0,0001 a 100 μg.

[0058] De acordo com as técnicas convencionais conhecidas pelos versados na técnica, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser formulada com carreador e/ou veículo farmaceuticamente aceitável, como descrito acima, finalmente fornecendo várias formas, tal como uma forma de dose unitária e uma forma de múltiplas doses. Exemplos não limitantes das formulações incluem, mas não estão limitados a uma solução, uma suspensão, ou uma emulsão em meio oleoso ou aquoso, um extrato, um elixir, um pó, um grânulo, um comprimido e uma cápsula, e podem compreender ainda um agente de dispersão ou um estabilizante.

[0059] De acordo com uma modalidade preferencial, a composição é uma composição cosmética compreendendo (a) uma quantidade cosmeticamente eficaz do peptídeo da presente invenção; e (b) um veículo cosmeticamente aceitável.

[0060] O termo usado aqui “quantidade cosmeticamente eficaz” refere-se a uma quantidade suficiente para alcançar as eficácias em melhorar as condições da pele descritas acima.

[0061] As composições cosméticas desta invenção podem ser formuladas em uma ampla variedade de formas, por exemplo, incluindo uma solução, uma suspensão, uma emulsão, uma pasta, uma pomada, um gel, um creme, uma loção, um pó, um sabonete, um limpador contendo tensoativo, um óleo, uma base em pó, uma base em emulsão, uma base em certa e uma aspersão. Especificamente, as composições cosméticas desta invenção podem ser formuladas na forma de suavizante de pele, líquido nutriente, creme nutriente, creme de massagem, essência, creme para os olhos, creme de limpeza, espuma de limpeza, água de limpeza, pacote, aspersão ou pó.

[0062] Quando a composição cosmética está na forma de pasta, creme ou gel, ela pode compreender gorduras animais e vegetais, ceras, parafinas, amido, tragacanto, derivados de celulose, polietileno glicóis, silicones, bentonitas, sílica, talco, ou óxido de zinco.

[0063] Na formulação de pó ou aspersão, ela pode compreender lactose, talco, sílica, hidróxido de alumínio, silicato de cálcio, ou pó de poliamida. A aspersão pode adicionalmente compreender os propelentes usuais, por exemplo, cloro-flúor-hidrocarbonetos, propano/butano ou dimetil éter.

[0064] A formulação de solução e emulsão pode compreender solvente, solubilizante e emulsificante, por exemplo, água, etanol, isopropanol, etil carbonato, etil acetato, álcool benzílico, benzoato de benzila, propileno glicol, 1,3-butilglicol, óleos, ésteres de glicerol graxo, polietileno glicol e ésteres de ácido graxo de sorbitano.

[0065] A formulação de suspensão pode compreender diluentes líquidos, por exemplo, água, etanol ou propileno glicol, agentes de suspensão tal como isoestearil álcool etoxilado, ésteres de polioxietileno sorbitol e ésteres de polioxietileno sorbitano, celulose microcristalina, meta-hidróxido de alumínio, bentonita, ágar ou tragacanto.

[0066] A formulação de composições de limpeza com tensoativo pode compreender sulfato de álcool alifático, sulfato de éter de álcool alifático, monoéster de sulfosucinato, isotinato, derivados de imidazólio, metil laurato, sarcocinato, sulfato de éter de amida de ácido graxo, betaína de alquil amido, álcool alifático, glicerídeo de ácido graxo, dietanolamida de ácido graxo, óleo vegetal, derivados de lanolina ou éster de glicerol ácido graxo etoxilado.

[0067] Ademais, as composições cosméticas desta invenção podem conter auxiliares, bem como peptídeos como ingredientes ativos e veículos. Os exemplos não limitantes de auxiliares incluem antioxidantes, estabilizantes, solubilizantes, vitaminas, corantes e melhoradores de odor.

[0068] As características e vantagens da presente invenção serão resumidas como segue:

[0069] O peptídeo da presente invenção inibindo a atividade de metaloproteinase de matriz exibe uma excelente eficácia em melhorar a condição da pele inibindo diretamente a atividade de metaloproteinases de matriz;

[0070] A composição contendo o peptídeo da presente invenção tem excelentes bioatividades de inibir a atividade de enzimas de degradação de ácido hialurônico, adipogênese em células de gordura, angiogênese, e similares, sendo assim útil para o tratamento de várias doenças tais como antiobesidade, anticâncer, anti-inflamação;

[0071] o peptídeo da presente invenção tem excelente permeabilidade na pele devido ao pequeno tamanho do peptídeo;

[0072] as excelentes atividade e estabilidade do presente peptídeo descrito acima podem ser amplamente vantajosas na aplicação a fármacos, pseudofármacos, e cosméticos.

Breve Descrição dos Desenhos

[0073] A FIG. 1a é um gráfico que demonstra os efeitos no crescimento de células de fibroblastos dérmicos primários humanos após tratar os peptídeos da presente invenção por concentração.

[0074] A FIG. 1b é um gráfico que demonstra os efeitos no crescimento de células de fibroblastos após tratar os peptídeos da presente invenção por concentração.

[0075] A FIG. 2 é uma imagem de microscópio que demonstra os efeitos no crescimento de células de fibroblastos após tratar os peptídeos da presente invenção.

[0076] A FIG. 3a é um gráfico que demonstra os efeitos inibidores dos peptídeos da presente invenção na morte celular por estresse oxidativo.

[0077] A FIG. 3b é uma imagem de microscópio que demonstra os efeitos inibidores na morte celular de fibroblastos dérmicos primários humanos por irradiação UV após tratar os peptídeos da presente invenção.

[0078] A FIG. 3c mostra dados de fosforilação ERK que demonstram os efeitos idênticos com os efeitos da FIG. 3b.

[0079] A FIG. 4a mostra dados zimografia com gelatina que demonstram os efeitos inibidores na atividade de metaloproteinase de matriz 2 no caso do tratamento dos peptídeos da presente invenção por concentração.

[0080] A FIG. 4b mostra dados de zimografia com gelatina que demonstram efeitos inibidores na atividade de metaloproteinase de matriz 2 em fibroblastos no caso do tratamento dos peptídeos da presente invenção por concentração.

[0081] A FIG. 4c mostra dados de zimografia com gelatina que demonstram os efeitos inibidores diretos na atividade de metaloproteinase de matriz 2 no caso do tratamento dos peptídeos da presente invenção por concentração.

[0082] A FIG. 5a mostra dados demonstrando efeitos inibidores na degradação de colágeno no caso do tratamento dos peptídeos da presente invenção por concentração após induzir a degradação de colágeno pela metaloproteinase de matriz 2 (MMP2).

[0083] A FIG. 5b mostra dados que demonstram a inibição da degradação de colágeno no caso do tratamento dos peptídeos da presente invenção por concentração após induzir a síntese de colágeno por IGF-1 e facilitando a degradação de colágeno pela metaloproteinase de matriz 2 (MMP2).

[0084] A FIG. 6a mostra dados de zimografia com gelatina demonstrando efeitos inibidores na degradação de ácido hialurônico no caso do tratamento dos peptídeos da presente invenção.

[0085] As FIGs. 6b, c e d representam a inibição da degradação de ácido hialurônico em produtos agentes de preenchimento no caso do tratamento dos peptídeos da presente invenção por concentração após induzir artificialmente a degradação de ácido hialurônico através da adição de hialuronato liase nos produtos agentes de preenchimento.

[0086] A FIG. 6e representa os efeitos nos tempos de permanência de produtos agentes de preenchimento quando o produto agente de preenchimento contendo hialuronato liase e o peptídeo (SEQ ID NO: 2) é injetado na pele dorsal de ratos. Os efeitos foram determinados em intervalos de 1 a 7 dias. Como um resultado, o efeito de degradação de ácido hialurônico é excelente e os produtos agentes de preenchimento ficaram por um tempo mais longo no caso de uma amostra que é injetada com produtos agentes de preenchimento contendo o peptídeo (SEQ ID NO: 2) do que no caso de uma amostra que é injetada com somente produtos agentes de preenchimento.

[0087] A FIG. 7a mostra dados demonstrando efeitos superiores no branqueamento da pele por efeitos de inibição de transferência de melanossoma dos peptídeos da presente invenção.

[0088] A FIG. 7b mostra dados de forma de célula demonstrando efeitos de inibição dos peptídeos da presente invenção em transferência de melanossomas.

[0089] A FIG. 8 mostra dados RT-PCT demonstrando efeitos anti- inflamatórios dos peptídeos da presente invenção pela inibição da expressão de proteínas relacionadas à inflamação.

[0090] A FIG. 9 mostra dados demonstrando a inibição de adipogênese no caso do tratamento dos peptídeos da presente invenção.

[0091] A FIG. 10 mostra dados demonstrando a inibição de angiogênese de células HUVEC no caso do tratamento dos peptídeos da presente invenção.

[0092] A presente invenção será agora descrita em mais detalhes por meio de exemplos. Está óbvio para os versados na técnica que esses exemplos são destinados a serem mais concretamente ilustrativos e o escopo da presente invenção como apresentado nas reivindicações em anexo não está limitado a esses exemplos ou por esses exemplos.

Exemplos Exemplo de Preparação 1: Síntese de SIPCKLQSG (SEQ ID NO: 1)

[0093] A 700 mg de resina de cloreto de tritila (resina CTL, Nova Biochem Cat No. 01-64-0021) introduzidos em um reator foram adicionados 10 ml de cloreto de metileno (MC) e agitados por 3 min. Após remover a solução, 10 ml de dimetilformamida (DMF) foram adicionados ao resultante e então a agitação foi executada por 3 min, após o que o solvente foi removido. 10 ml de solução de diclorometano (DCM) foram adicionados ao reator e 200 mmol de Fmoc-Gly-OH (Bachem, Suíça) e 400 mmol de diisopropil etilamina (DIEA) foram então adicionados ao reator, após o que a mistura foi dissolvida por agitação, e a reação passou então por agitação por 1 hora. Após a reação, o resultante foi lavado e reagido por 10 min em metanol e DIEA (2:1) dissolvido em DCM, seguido por lavagem com excesso de DCM/DMF (1:1). Após a remoção do solvente, 10 ml de DMF foram adicionados ao reator e agitados por 3 min, seguido pela remoção do solvente. 10 ml de uma solução de desproteção (20% piperidina/DMF) foram adicionados ao reator e agitados por 10 min em temperatura ambiente, e a remoção da solução foi executada. Após adicionar o mesmo volume da solução de desproteção, a reação foi realizada por 10 min e a solução foi removida, seguida por lavar sequencialmente com DMF (duas vezes), MC (uma vez) e DMF (uma vez) por 3 min respectivamente para produzir resinas Gly-CTL. 10 ml de solução de DMF foram adicionados a um novo reator e então 200 mmol de Fmoc-Ser(tBu)-OH (Bachem, Suíça), 200 mmol de HoBt e 200 mmol de Bop foram adicionados, seguidos pela agitação por solubilização. 400 mmol de DIEA foram adicionados ao reator duas vezes como uma fração e a agitação foi executada por ao menos 5 min para dissolver todos os conteúdos sólidos. A solução de aminoácido dissolvida foi introduzida no reator contendo a resina desprotegida e a reação foi realizada com agitação por 1 hora em temperatura ambiente. Após a remoção da solução de reação, o resultante foi agitado três vezes com solução de DMF por 5 min para remover resíduos não reagidos. Uma pequena quantidade da resina reagida foi tomada para avaliar a extensão de reações por teste de Ninhidrina. Usando a solução de desproteção, a desproteção foi executada duas vezes da mesma maneira que descrito acima para produzir resinas Ser(tBu)-Gly-CTL. Após lavar suficientemente com DMF e MC, o teste de ninhidrina foi executado novamente e então os acoplamentos de aminoácidos foram executados como descrito abaixo. Com base na sequência de aminoácido selecionada, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Leu, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Pro, Fmoc-Ile e Fmoc-Ser(tBu) foram sequencialmente acoplados às resinas. Após incubar duas vezes com a solução de desproteção por 10 min, o grupo de proteção Fmoc foi removido por lavagem. Após executar a acetilação por 1 hora com anidrido acético, DIEA e HoBt, as resinas de peptidila preparadas foram lavadas três vezes sequencialmente com DMF, MC e metanol, secas sob o fluxo de gás nitrogênio, secas completamente por secagem a vácuo sob P2O5 e então reagidas com 30 ml da solução de saída [contendo 95% TFA (ácido trifluoracético), 2,5% de água destilada, 2,5% tioanisol] por 2 horas em temperatura ambiente mediante agitação intermitente. A resina foi filtrada e lavada com um pequeno volume de solução de TFA (ácido trifluoracético), após o que o filtrado foi combinado com licor mãe. Após destilação sob pressão reduzida para reduzir o volume total em dois, a precipitação foi induzida usando 50 ml de éter frio e os precipitados formados foram coletados por centrifugação, seguidos por lavagem duas vezes com éter frio. Após remover o licor mãe, o resultante foi completamente seco sob atmosfera de nitrogênio para fornecer 0,7 g de peptídeo não purificado 1 (rendimento: 93%), NH2-Ser-Ile-Pro-Cys-Lys-Leu-Gln-Ser-Gly-COOH. O peso molecular do produto final foi determinado como 932 (MW teórico 932,12) usando um analisador de massas. Os outros peptídeos de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 foram também sintetizados pelo processo descrito acima. Tabela 1

[0094] Exemplo Experimental 1: Efeitos de peptídeos sintéticos no crescimento de fibroblastos dérmicos primários humanos

[0095] De modo a avaliar os peptídeos preparados no Exemplo de Preparação 1 se eles têm atividades similares e atividades de inibição de fator de crescimento, o ensaio colorimétrico SRB (Sulforhodamina B; Sigma-Aldrich) foi executado usando fibroblastos dérmicos primários humanos de acordo com o método de Rizzino e outros (Rizzino, e outros Cancer Res., 48: 4266 (1988)).

[0096] Os fibroblastos dérmicos primários humanos foram cultivados em frascos de 250 ml contendo MSCM (meio de células- tronco mesenquimais, Gibco, USA) suplementado com 5% FBS (soro bovino fetal) e 1% MSCGS (Suplemento de Crescimento de Células- Tronco Mesenquimais, Science, USA). As células cultivadas foram tratadas com solução de tripsina a 1% para desacoplar as células do fundo do frasco de cultura e centrifugadas para coletar os peletes celulares. Após as células serem ressuspensas em MSCM não contendo FBS, sua alíquota (3 x 103células) foi adicionada a cada cavidade de placas com 96 cavidades e cultivadas sob CO2 a 5% por 24 horas a 37° C. Após 24 horas de cultura, o meio foi alterado com um meio fresco não contendo soro e as células foram incubadas com pedaço experimental padrão ou peptídeos sintetizados (10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 μg/ml e 10 μg/ml) dissolvidos em água destilada por 72 horas sob as mesmas condições descritas acima. Após remover os sobrenadantes, as células foram fixadas usando etanol e lavadas três vezes com PBS (solução salina tamponada com fosfato). Após remover a solução de lavagem, as células foram tratadas com solução SRB e suficientemente lavadas com ácido acético a 1%. Em adição, as células foram observadas em um microscópio para encontrar a viabilidade celular e a absorbância em 590 nm foi medida para analisar o estado de sobrevida das células.

[0097] Como mostrado nas FIGs. 1a e 1b, os peptídeos desta invenção (SEQ ID NO: 1-3) facilitam drasticamente o crescimento de fibroblastos dérmicos primários humanos e fibroblastos. Em adição, como mostrado na FIG. 2, observou-se que a forma das células foi significativamente alterada devido à indução de crescimento de fibroblastos pelo tratamento dos peptídeos (SEQ ID NO: 1-3) desta invenção.

Exemplo Experimental 2: Efeitos Inibidores de Peptídeos Sintéticos na Morte Celular por Estresse Oxidativo

[0098] De modo a avaliar os peptídeos preparados no Exemplo de Preparação 1 se eles têm atividades de inibição de morte celular, NIH3T3 que é um fibroblasto e fibroblastos dérmicos primários humanos são testados. As células foram cultivadas pelos mesmos métodos descritos acima, e sua alíquota (3 x 103células) foi adicionada a cada cavidade de placas com 96 cavidades e cultivada sob CO2 a 5% por 24 horas a 37° C. Após 24 horas de cultura, o meio foi alterado com o mesmo meio não contendo soro e as células foram tratadas com 15 μM de menadiona (Sigma) para aplicar estresse oxidativo. Após incubação por 48 horas com os peptídeos sintetizados (1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml e 1000 ng/ml), a morte celular foi observada. As células foram secas com solução SRB e a absorbância a 590 nm foi medida para analisar a morte celular sob as mesmas condições descritas no Exemplo Experimental 1.

[0099] A FIG. 3a representa os dados para a influência dos peptídeos (1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml e 1000 ng/ml) da presente invenção na inibição da morte celular após aplicar estresse oxidativo pelo tratamento de 15 μM de menadiona e mostra que o tratamento dos peptídeos inibe a morte celular por estresse oxidativo.

[00100] A FIG. 3b representa os dados para a influência dos peptídeos da presente invenção na inibição de morte celular usando fibroblastos dérmicos primários humanos. Após tratar os peptídeos por concentração e irradiar com 20 mJ/cm2 UV ou 30 mJ/cm2 UV, o estado das células foi observado. Como mostrado na FIG. 3b, revela que a morte celular é induzida no caso de irradiação de 20 mJ/cm2 UV ou 30 mJ/cm2 UV, e o tratamento dos peptídeos inibe a morte celular por irradiação UV por concentração.

[00101] A FIG. 3c representa os resultados da análise de Western Blotting para observar o sinal de influência dos peptídeos na inibição da morte celular por estresse oxidativo. Como um resultado, a fosforilação de ERK (quinases reguladas por sinal extracelular) facilita no caso do tratamento dos peptídeos da presente invenção por tempo (15 min, 30 min ou 60 min).

[00102] Consequentemente, as FIGs. 3a e 3b mostram que os peptídeos da presente invenção (SEQ ID NO: 1-3) inibem a morte celular induzida por estresse oxidativo em fibroblastos dérmicos primários humanos e fibroblastos, e isso ocorre devido à facilitação de fosforilação de ERK pelos peptídeos (FIG. 3c).

Exemplo Experimental 3: Efeitos Inibidores de Peptídeos Sintéticos na Atividade de Metaloproteinase de Matriz 2

[00103] A inibição da atividade de metaloproteinase de matriz 2 foi testada usando zimografia com gelatina para os peptídeos sintetizados no Exemplo de Preparação 1. Para testar a influência na inibição da atividade de metaloproteinase de matriz 2, observou-se que a inibição da atividade da metaloproteinase de matriz 2 pelos peptídeos no caso de presença de metaloproteinase de matriz 2 e usando fibroblastos, respectivamente.

[00104] Para observar a influência na inibição direta da atividade da metaloproteinase de matriz 2 pelos peptídeos, após misturar os peptídeos e a metaloproteinase de matriz 2 e incubar por 1 hora em temperatura ambiente, a atividade da metaloproteinase de matriz 2 foi medida por zimografia com gelatina.

[00105] Após executar SDS-PAGE com substrato de gelatina (2 mg/ml), 2,5% de Triton X-100 foi tratado por 30 min e tampão (50 mM Tris-HCl, 0,2 M NaCl, 5 mM CaCl2, Triton X-100 a 1%) foi tratado por 24 horas a 37° C. O gel tratado foi colorido com azul de Coomassie brilhante R250 (Sigma) e tampão descolorante (metanol a 5%, ácido acético a 7,5%, água destilada) foi tratado. A atividade da metaloproteinase de matriz 2 foi mostrada como banda representada por hidrólise de gelatina.

[00106] De modo a avaliar os peptídeos se eles têm atividades de inibição da atividade de metaloproteinase de matriz 2 usando fibroblastos, a alíquota (3 x 104 células) de fibroblastos foi adicionada a cada cavidade de placas com 24 cavidades e cultivada por 24 horas. Após a cultura por 24 horas com o meio não contendo soro, as células cultivadas foram coletadas do fundo das placas e centrifugadas, seguida pela coleta de sobrenadantes. Em seguida, a atividade da metaloproteinase de matriz 2 foi observada.

[00107] Consequentemente, observa-se que a atividade da metaloproteinase de matriz 2 é inibida pelo tratamento dos peptídeos da presente invenção por concentração usando zimografia com gelatina (FIGs. 4a e 4c). Em adição, o mesmo resultado é observado no caso de uso dos fibroblastos NIH3T3 (Fig. 4b).

Exemplo Experimental 4: Efeitos Inibidores de Peptídeos Sintéticos na Degradação de Colágeno

[00108] Os fibroblastos dérmicos primários humanos foram cultivados em placas com 24 cavidades em uma densidade de 3 x 104 células/cavidade por 24 h. Após incubação com meio contendo soro a 5% por 42 h, a metaloproteinase de matriz 2 e os peptídeos foram tratados por 6 horas. Após coletar os sobrenadantes por centrifugação, a quantidade de colágeno foi determinada usando o kit de colágeno. Em adição, após induzir a síntese de colágeno artificialmente com IGF-1 (fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1) sob as mesmas condições de cultura descritas acima e incubar com a metaloproteinase de matriz 2 e os peptídeos por 4 horas, avaliou-se se os peptídeos têm atividades de inibição de degradação de colágeno usando o kit de colágeno.

[00109] A FIG. 5a representa o resultado que é executado para avaliar se os peptídeos da presente invenção têm função inibidora de degradação de colágeno induzida pela metaloproteinase de matriz 2 (MMP2). Ela revela que a degradação de colágeno foi induzida no caso do tratamento da metaloproteinase de matriz 2 in vivo e inibida no caso do tratamento de cada peptídeo simultaneamente. Em adição, após induzir a síntese de colágeno por tratamento com IGF-1, ela mostra que todos os três peptídeos inibem a degradação de colágeno no caso do tratamento da metaloproteinase de matriz 2 e dos peptídeos (FIG. 5b).

Exemplo Experimental 5: Efeitos Inibidores de Peptídeos Sintéticos na Degradação de Ácido Hialurônico em Produtos Agentes de preenchimento

[00110] O hialuronato liase foi artificialmente colocado em um produto agente de preenchimento comercial em uma concentração de 100 ug para induzir a degradação de ácido hialurônico, e então 200 ug de peptídeos foram tratados. Em seguida, a degradação de ácido hialurônico dentro do produto agente de preenchimento foi observada por 7 dias (FIGs. 6a e 6b, c, d). Um ensaio usando coluna GPC e um experimento in vivo usando ratos foram executados. O grupo de controle foi tratado com hialuronato liase, e o grupo de tratamento foi cotratado com hialuronato liase e cada peptídeo. Quando o produto agente de preenchimento foi injetado na pele de ratos, a degradação de ácido hialurônico dentro do agente de preenchimento foi inibida pelo tratamento de peptídeos (FIG. 6e).

Exemplo Experimental 6: Efeitos Inibidores de Peptídeos Sintéticos na Transferência de Melanossoma

[00111] O ensaio de fagocitose foi executado usando queratinócito HaCaT para investigar os efeitos inibidores dos peptídeos sintéticos na transferência de melanossoma. As biopartículas de ligação de fluorescência são usadas como materiais para fagocitose. Após cultivar em placas com 96 cavidades em uma densidade de 3 x 103 células/cavidade por 24 h, o queratinócito HaCaT foi cultivado em meio isento de soro por 6 h. Após tratar 1 μg/ml de tripsina para indução de fagocitose, 1 μg/ml de peptídeos foram tratados por 48 h. Como um resultado, a fagocitose de biopartículas no queratinócito foi observada com um microscópio de fluorescência.

[00112] Como mostrado nas FIGs. 7a e 7b, os peptídeos da presente invenção inibem a transferência de melanossomas.

Exemplo Experimental 7: Efeitos Anti-inflamatórios de Peptídeos Sintéticos em Células Periodontais.

[00113] Um experimento foi conduzido usando células de fibroblasto de ligamento periodontal humano (ATCC, USA) para investigar os efeitos anti-inflamatórios dos peptídeos sintéticos em células periodontais tendo periodontite.

[00114] As células de fibroblastos de ligamento periodontal humanas foram adicionadas em uma placa de cultura de tecido com 6 cavidades (5 x 101 células/cavidade), e cultivadas por 24 horas. Para induzir a inflamação em células periodontais, as mesmas foram tratadas com LPS (10 μg/ml, Lipopolisacarídeo/ Sigma, USA), e então foram tratadas com os peptídeos da presente invenção (1 μg/ml). Após as células periodontais serem cultivadas por 4 horas, mRNA foi extraído das células cultivadas (grupo de controle, grupo tratado com LPS, e grupo tratado com LPS e peptídeo), e então a reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa foi conduzida usando iniciadores IL-6, IL-1 beta e COX-2. As sequências de nucleotídeo dos iniciadores usados foram como segue: IL-6 (direto 5’-agaggagacttcacagagga-3', reverso 5’- atctctctgaaggactctgg-3'), IL-1 beta (direto 5’-ccgtggaccttccaggatca-3', reverso 5’-gatccacactctccagctgc-3'), COX-2 (direto 5’- cccccacagtcaaagacact-3', reverso 5’-ccccaaagatagcatctgga-3'), Actina (direto 5’-gatctcaaagacaaccaactagtg-3', reverso 5’- ctccagctgaagactcctcccag-3').

[00115] Como mostrado na FIG. 8, quando a inflamação foi induzida em células de fibroblasto de ligamento periodontal humanas, a expressão de IL-6, IL-1 beta e COX-2, que estão em citocina inflamatória, foi aumentada, se a expressão das três citocinas inflamatórias foi consideravelmente diminuída quando os peptídeos da presente invenção foram co-tratados (FIG. 8).

Exemplo Experimental 8: Efeitos Inibidores de Peptídeos Sintéticos na Formação de Lipídeos em Adipócitos

[00116] Um experimento foi conduzido usando pré-adipócito, células 3T3-L1 (ATCC, USA) para investigar os efeitos inibidores dos peptídeos sintéticos na adipogênese. Os pré-adipócitos (células 3T3-L1) na passagem 8 foram adicionados em uma placa de cultura de tecido com 24 cavidades (3 x 104 células/cavidade), e cultivados por 24 horas. No grupo de controle, os pré-adipócitos foram cultivados em meio DMI (0,5 mM IBMX, 0,25 μM dexametasona e 1 μg/ml de insulina) para diferenciar os pré-adipócitos em adipócitos. No grupo de tratamento, cada peptídeo na concentração de 1 μg/ml foi adicionado ao meio DMI. Em seguida, as células foram cultivadas por 10 dias para induzir a diferenciação.

[00117] Como mostrado na FIG. 9, como um resultado da observação em microscópio, os pré-adipócitos no grupo de controle foram diferenciados em adipócitos, e o lipídeo foi formado nas células. Por outro lado, a formação de lipídeo em cada grupo tratado com peptídeo foi consideravelmente diminuída, se comparado com o grupo de controle.

Exemplo Experimental 9: Efeitos Inibidores de Peptídeos Sintéticos na Angiogênese

[00118] Usando HUVEC (Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana, ATCC, USA), a formação de tubo foi observada para investigar os efeitos inibidores dos peptídeos sintéticos na angiogênese.

[00119] Após matrigel ser adicionado em uma placa de cultura de tecido com 96 cavidades para solidificação do matrigel (50 μl/cavidade) e mantido a 37° C por 30 min, HUVECs foram cultivadas em meio de suplemento de não crescimento contendo soro a 0,2% que foi adicionado no matrigel solidificado. Nesse momento, HUVECs foram tratadas com cada peptídeo (1 μg/ml) e cultivadas a 37° C. Após 5 horas, a formação de tubo foi observada com um microscópio óptico.

[00120] Como mostrado na FIG. 10, a formação de tubo foi inibida pelo tratamento de cada peptídeo, se comparado com o grupo de controle. Esse resultado mostra que cada peptídeo sintético tem um efeito inibidor na angiogênese.

Exemplo 1: Preparação de Nanopeptídeos

[00121] 50 mg do peptídeo sintetizado no Exemplo 1 acima foram dissolvidos em 500 ml de água destilada por agitação vigorosa. A solução de peptídeo foi misturada com 5 g de lecitina, 0,3 ml de oleato de sódio, 50 ml de etanol e uma pequena quantidade de óleos, e seu volume foi ajustado com água destilada para 1 L. A solução resultante foi submetida a um microfluidizador sob alta pressão para emulsificação, fornecendo assim nanossomas tendo tamanho de 100 nm. Os nanossomas foram preparados para ter uma concentração final de aproximadamente 50 ppm e usados como ingredientes para cosméticos sozinhos ou em combinação com outros.

Exemplo de Formulação 1: Preparação de Suavizante de Pele

[00122] Um suavizante de pele contendo um ou mais nanossomas de peptídeo preparados no Exemplo 1 foi formulado de acordo com a seguinte composição: Tabela 2

Exemplo de Formulação 2: Preparação de Creme Nutriente

[00123] Um creme nutriente contendo um ou mais nanossomas de peptídeo preparados no Exemplo 1 foi formulado de acordo com a seguinte composição: Tabela 3

Exemplo de Formulação 3: Líquido Nutriente

[00124] Um líquido nutriente contendo um ou mais nanossomas preparados no Exemplo 1 foi formulado de acordo com a seguinte composição: Tabela 4

Exemplo de Formulação 4: Preparação de Essência

[00125] Uma essência contendo um ou mais nanossomas de peptídeo preparados no Exemplo 1 foi formulada de acordo com a seguinte composição: Tabela 5

[00126] Tendo descrito uma modalidade preferencial da presente invenção, entende-se que variantes e modificações dessa que estão dentro do espírito da invenção podem se tornar claras aos versados na técnica, e o escopo dessa invenção é determinado pelas reivindicações em anexo e seus equivalentes.

Claims

1. Agente de preenchimento cutâneo, caracterizado pelo fato de que compreende (a) o peptídeo consistindo na sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-3; e (b) ácido hialurônico.

2. Agente de preenchimento cutâneo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta capacidade de facilitar o crescimento celular.

3. Agente de preenchimento cutâneo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que inibe a morte celular por estresse oxidativo.

4. Agente de preenchimento cutâneo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que inibe a atividade de metaloproteinase de matriz (MMP) 2.

5. Agente de preenchimento cutâneo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que inibe a degradação de colágeno.

6. Agente de preenchimento cutâneo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que inibe a degradação de ácido hialurônico.

7. Agente de preenchimento cutâneo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que inibe a transferência de melanossomas.

8. Agente de preenchimento cutâneo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que inibe a formação de lipídeo em células adipócitos.

9. Agente de preenchimento cutâneo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo inibe a angiogênese.

10. Agente de preenchimento cutâneo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de ser para melhorar as condições da pele.

11. Agente de preenchimento cutâneo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a melhora das condições da pele é a melhora nas rugas ou elasticidade da pele, prevenção de envelhecimento da pele, melhora na umidade da pele, remoção de feridas, regeneração da pele ou branqueamento da pele.

12. Agente de preenchimento cutâneo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento de condições da pele.

13. Agente de preenchimento cutâneo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a melhora das condições da pele é a remoção de feridas ou regeneração da pele.

14. Agente de preenchimento cutâneo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento da obesidade.

15. Agente de preenchimento cutâneo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento de inflamação.

16. Agente de preenchimento cutâneo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento de câncer.

17. Agente de preenchimento cutâneo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento de um distúrbio relacionado à atividade de MMP, em que o distúrbio relacionado à atividade de MMP compreende artrite, retinopatia diabética, cicatriz hipertrófica, psoríase, úlcera de membrana mucosa e tecido epitelial, inflamação por resposta autoimune, lúpus, neuropatia autoimune, destruição de miócitos como distúrbio relacionado à degradação a membrana basilar, glaucoma ou angiogênese excessiva.