BR112013033494B1 - Método para aumentar a resistência a ferrugem de soja phacosporacea em plantas de soja, método para a produção de uma planta de soja que tem resistência aumentada contra ferrugem de soja phacosporacea e vetor de transformação - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA AUMENTAR A RESISTÊNCIA A PHACOSPORACEA EM PLANTAS E/OU CÉLULAS VEGETAIS, CONSTRUCTO DE VETOR RECOMBINANTE, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA QUE TEM RESISTÊNCIA AUMENTADA CONTRA PHACOSPORACEA E USO DO CONSTRUCTO DE VETOR RECOMBINANTE. É fornecido um método para aumentar a resistência contra fungos patogênicos da família Phacosporaceae em plantas e/ou células vegetais transgênicas. Nessas plantas, a via de sinalização de etileno e/ou atividade dos compostos de sinalização de etileno é alterada. Isto é alcançado pelo priming da via de sinalização de etileno nestas plantas, em comparação com as plantas tipo selvagem e/ou células vegetais tipo selvagem. Dependendo da ativação ou função inibidora de um composto de sinalização específico, a superexpressão ou knockdown do gene cognato pode ser usada.

Description

[001] A presente invenção refere-se a um método para aumentar a resistência contra fungos patogênicos da família Phacosporaceae em plantas e/ou células vegetais transgênicas. Nessas plantas, a via de sinalização de etileno e/ou atividade dos compostos de sinalização de etileno é alterada. Isto é alcançado pelo priming da via de sinalização de etileno nestas plantas, em comparação com as plantas tipo selvagem e/ou células vegetais tipo selvagem. Dependendo da ativação ou função inibidora de um composto de sinalização específico, a superexpressão ou knockdown do gene cognato pode ser usada.

[002] Além disso, a invenção refere-se a plantas e/ou células vegetais transgênicas que têm uma resistência aumentada contra fungos patogênicos da família Phacosporaceae, por exemplo, ferrugem da soja e a vetores de expressão recombinantes que compreendem uma sequência que é idêntica ou homóloga a uma sequência que codifica um composto de sinalização de etileno funcional ou fragmentos do mesmo.

[003] O cultivo de plantas agrícolas de cultura serve principalmente para a produção de gêneros alimentícios para humanos e animais. Monoculturas, em particular, que são a regra hoje em dia, são altamente suscetíveis a uma dispersão de doenças similar à epidemia. O resultado é produções notamente reduzidas. Até hoje, os organismos patogênicos foram controlados principalmente pelo uso de pesticidas. Hoje em dia, a possibilidade de modificar diretamente a disposição genética de uma planta ou patógeno também está aberta ao homem.

[004] Resistência geralmente significa a capacidade de uma planta prevenir, ou pelo menos reduzir a infestação e colonização por um patógeno nocivo. Mecanismos diferentes podem ser discernidos na resistência que ocorre naturalmente, nos quais as plantas defendem-se de colonização por organismos fitopatogênicos. Estas interações específicas entre o patógeno e o hospedeiro determinam o curso de infecção (Schopfer e Brennicke (1999) Pflanzenphysiologie, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg, Germany, Alemanha).

[005] Com referência à corrida à resistência específica, também chamada resistência de hospedeiro, uma diferenciação é feita entre interações compatíveis e incompatíveis. Na interação compatível, uma interação ocorre entre um patógeno virulento e uma planta suscetível. O patógeno sobrevive, e pode acumular estruturas de reprodução, enquanto o hospedeiro na maioria das vezes morre. Uma interação incompatível ocorre, por outro lado, quando o patógeno infecta a planta mas é inibido em seu crescimento antes ou depois do fraco desenvolvimento de sintomas. No último caso, a planta é resistente ao respectivo patógeno (Schopfer e Brennicke, vide acima). No entanto, este tipo de resistência é específica para uma certa linhagem ou patógeno.

[006] Em interações tanto compatíveis como incompatíveis ocorre uma reação defensiva e específica do hospedeiro ao patógeno. Na natureza, no entanto, esta resistência é frequentemente superada por causa do rápido desenvolvimento evolutivo de novas raças virulentas de patógenos (Neu et al. (2003) American Cytopathol. Society, MPMI 16 no 7: 626-633).

[007] A maioria dos patógenos é específica para espécies de plantas. Isto significa que o patógeno pode induzir uma doença em certas espécies de planta, mas não em outras espécies de planta (Heath (2002) Can. J. Plant Pathol. 24: 259-264). A resistência contra um patógeno em certas espécies de planta é chamada de resistência de não hospedeiro. A resistência de não hospedeiro oferece proteção forte, ampla e permanente de fitopatógenos. Os genes que fornecem resistência de não hospedeiro fornecem a oportunidade de uma proteção forte, ampla e permanente contra certas doenças em plantas não hospedeiras. Em particular, essa resistência trabalha para diferentes linhagens do patógeno.

[008] Imediatamente após o reconhecimento de um patógeno potencial, a planta começa a produzir reações de defesa. Na maioria das vezes, a presença do patógeno é percebida através dos chamados receptores PAMP, uma classe de receptor transmembrana similar a quinase que reconhecem moléculas conservadas associadas ao patógeno (por exemplo, flagelina ou quitina). A jusante dos receptores PAMP, os fito-hormônios de ácido salicílico (SA), jasmonato (JA) e etileno (ET) desempenham um papel importante na regulação das diferentes reações de defesa. Dependendo da razão dos diferentes fito-hormônios, reações diferentes de defesa são produzidas pela célula hospedeira. Geralmente, a defesa dependente de SA está ligada à resistência contra patógenos biotróficos, enquanto que reações de defesa dependentes de JA/ET estão ativas contra patógenos necrotróficos (e insetos). Na maioria dos patógenos de planta, as interações ET mostraram agir de forma sinérgica com JA e antagônica à defesa biotrófica de SA. Por exemplo, a bem conhecida proteína PDF1.2, marcador de JA, necessita da ativação de ET e JA para ser suprarregulada durante a defesa contra patógenos necrotróficos. O envolvimento crucial da via JA/ET na resistência contra patógenos necrotróficos é corroborada pelo fato de que a superexpressão de ERF1, uma proteína central envolvida na sinalização de ET (consulte Figura 1) leva a uma resistência melhorada contra os fungos necrotróficos (Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum e Plectosphaerella cucumerina (Berrocal-Lobo et al. 2002, Plant Journal 29:23-32, Berrocal-Lobo e Molina 2004, MPMI 17:763ff). Por outro lado, o priming da via de sinalização de ET pela superexpressão de ERF1 aumenta a susceptibilidade de Arabidopsis contra o patógeno biotrófico Pseudomonas syringae (Berrocal-Lobo et al. 2002, Plant Journal 29:23-32), fornecendo o modelo proposto de que o JA/ET interage negativamente com a via de SA para equilibrar a natureza das reações de defesa de acordo com o patógeno de ataque, permitindo que a planta ajuste sua resposta de defesa. Então, geralmente acredita-se que o priming da via de sinalização de ET leva à resistência aumentada a fungos necrotróficos, mas ao mesmo tempo, a uma suscetibilidade aumentada a patógenos biotrópicos.

[009] Os fungos são distribuídos mundialmente. Aproximadamente 100.000 espécies de fungos diferentes são conhecidos até hoje. As ferrugens são de grande importância. Eles podem ter um ciclo complicado de desenvolvimento com até cinco etapas diferentes de esporo (espermatium, aecidiósporo, uredósporo, teleutósporo e basidiósporo).

[010] Durante a infecção de plantas por fungos patogênicos, fases diferentes são usualmente observadas. As primeiras fases da interação entre fungos fitopatogênicos e suas plantas hospedeiras potenciais são decisivas para a colonização da planta pelo fungo. Durante a primeira etapa da infecção, os esporos tornam-se anexos à superfície das plantas, germinam, e o fungo penetra na planta. Os fungos podem penetrar na planta através de portas existentes, como estômatos, lenticelas, hidátodos e feridas, ou então eles penetram na epiderme da planta diretamente como o resultado da força mecânica e com a ajuda de enzimas que digerem a parede celular. Estruturas específicas de infecção são desenvolvidas para penetração na planta. A ferrugem da soja, Phakopsora pachyrhizi, penetra diretamente na epiderme da planta. Depois de cruzar a célula da epiderme, o fungo alcança o espaço intercelular do mesófilo, onde o fungo inicia a dispersão através das folhas. Para adquirir nutrientes, o fungo penetra nas células do mesófilo e desenvolve haustórios dentro da célula do mesófilo. Durante o processo de penetração, a membrana plasmática da célula de mesófilo penetrada permanece intacta. Portanto, o fungo de ferrugem da soja estabelece uma interação biotrópica com a soja.

[011] A ferrugem da soja tornou-se cada vez mais importante nos tempos recentes. A doença pode ser causada pelas ferrugens biotrópicas Phakopsora pachyrhizi (Sydow) e Phakopsora meibomiae (Arthur). Eles pertencem à classe Basidiomycota, ordem Uredinales, família Phakopsoraceae. Ambas as ferrugem infectam um espectro amplo de plantas hospedeiras. P. pachyrhizi, também citado como fungo asiático, é o patógeno mais agressivo na soja (Glycine max), e é portanto, pelo menos atualmente, de grande importância para agricultura. P. pachyrhizi pode ser encontrado próximo de todas as regiões tropicais e subtropicais de cultivo de soja do mundo. P. pachyrhizi é capaz de infectar 31 espécies de 17 famílias das Leguminosas mediante condições naturais e é capaz de crescer em mais de 60 espécies mediante condições controladas (Sinclair et al. (eds.), Proceedings of the rust workshop (1995), National SoyaResearch Laboratory, Publicação no 1 (1996); Rytter J.L. et al., Plant Dis. 87, 818 (1984)). P. meibomiae foi descoberto na Bacia do Caribe e em Porto Rico, e não causou nenhum dano substancial até agora.

[012] P. pachyrhizi atualmente pode ser controlado no campo apenas por meios de fungicidas. As plantas de soja com resistência ao espectro inteiro dos isolados não são disponíveis. Ao procurar plantas resistentes, foram descobertos quatro genes dominantes Rpp1-4, que medeiam resistência da soja a P. pachyrhizi. A resistência foi perdida rapidamente, visto que P. pychyrhizi desenvolve novas raças virulentas.

[013] Nos anos recentes, doenças fúngicas, por exemplo, ferrugem da soja, ganharam importância como peste na produção agrícola. Havia, portanto, uma exigência na técnica anterior para desenvolver métodos para controlar fungos e fornecer plantas resistentes a fungos.

[014] Muita pesquisa foi realizada no campo de bolor poeirento e plumoso que infecta a camada de epiderme de plantas. No entanto, o problema para enfrentar a ferrugem da soja que infeta os restos de mesófilo não foi resolvido.

[015] Surpreendentemente, nós descobrimos que os fungos patogênicos biotrópicos da família Phacosporaceae, por exemplo, fungo de ferrugem da soja, podem ser controlados pelo uso de defesa mediada por etileno, embora a técnica anterior ensine, que o priming da defesa mediada por etileno leva à suscetibilidade aumentada a fungos biotrópicos (Berrocal-Lobo et al. 2002, Plant Journal 29:23-32). Nós realizamos o priming da via de ET tanto pela superexpressão de diversas proteínas envolvidas na sinalização do etileno como pela infrarregulação de diversas proteínas envolvidas na supressão da via de sinalização de ET. Geralmente, espera-se que o priming da via de sinalização de ET deveria levar à suscetibilidade melhorada contra Ferrugem Asiática da Soja (ASR), visto que a via de sinalização de ET interage negativamente com a defesa biotrópica associada à via de SA. Por outro lado, espera-se resistência melhorada a ASR pela inibição da via de sinalização de ET e, portanto, descongestionamento da via de SA. Surpreendentemente, nós descobrimos que a própria via de sinalização de ET aumenta a resistência contra ferrugem da soja. A superexpressão de diversas proteínas envolvidas na via de sinalização de ET (ERF1, ERF2, Pti4, Pti5) aumenta a resistência da soja contra fungos patogênicos da família Phacosporaceae, por exemplo, ferrugem da soja. A infrarregulação de proteínas antagonistas da via de sinalização de ET como CTR1 e EBF1 também aumenta a resistência da soja a fungos patogênicos da família Phacosporaceae, por exemplo, ferrugem da soja. Vice-versa, a superexpressão de proteínas da via antagonista de sinalização de ET, como CTR1 e EBF1, aumenta a suscetibilidade da soja a fungos patogênicos da família Phacosporaceae, por exemplo, ferrugem da soja. Isto claramente demonstra a influência positiva das vias de defesa mediadas por ET para resistência da soja contra fungos patogênicos da família Phacosporaceae, por exemplo, ferrugem da soja.

[016] O objeto da presente invenção é fornecer um método de aumento de resistência contra fungos patogênicos da família Phacosporaceae, preferencialmente contra fungos patogênicos do gênero Phacospora, mais preferencialmente contra Phakopsora pachyrhizi (Sydow) e Phakopsora meibomiae (Arthur), também conhecidos como ferrugem da soja em plantas transgênicas e/ou células vegetais transgênicas pelo uso da via de sinalização de etileno, especialmente pelo priming da via de sinalização de etileno. Isso pode ser alcançado pela superexpressão de um ou mais ácidos nucleicos da invenção para realizar o priming da via de sinalização de etileno ou infrarregulação de um ou mais ácidos nucleicos da invenção que também levariam à resistência aumentada a fungos patogênicos da família Phacosporaceae, por exemplo, ferrugem da soja.

[017] Os ácidos nucleicos da invenção para realizar o priming da via de sinalização de etileno e para alcançar resistência aumentada a fungos patogênicos da família Phacosporaceae, por exemplo, ferrugem da soja, são Pti4, Pti5, ERF1 e/ou ERF2, por exemplo, conforme definido por qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7 ou qualquer homólogo, derivado, ortólogo ou parálogo dos mesmos. O priming da via de sinalização de etileno também pode ser alcançado pela infrarregulação de repressores de qualquer um dentre Pti4, Pti5, ERF1 e/ou ERF2 como microRNAs ou ta-siRNAs que direcionam esses genes.

[018] Os ácidos nucleicos da invenção a serem infrarregulados para realizar o priming da via de sinalização de etileno e para alcançar resistência aumentada a fungos patogênicos da família Phacosporaceae, por exemplo, ferrugem da soja, são CTR1, EBF1 e/ou EBF2, por exemplo, conforme definido por qualquer uma das SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 ou 23 ou qualquer fragmento, homólogo, derivado, ortólogo ou parálogo dos mesmos. O priming da via de sinalização de etileno também pode ser alcançado pela superexpressão de repressors de qualquer um dentre CTR1, EBF1 e/ou EBF2 como microRNAs ou ta-siRNAs que direcionam esses genes.

[019] Um objeto adicional é fornecer plantas transgênicas resistentes contra fungos patogênicos da família Phacosporaceae, preferencialmente contra fungos patogênicos do gênero Phacospora, com a máxima preferência contra Phakopsora pachyrhizi (Sydow) e Phakopsora meibomiae (Arthur), também conhecidos como ferrugem da soja, um método para produzior essas plantas, bem como um constructo de vetor útil para os métodos acima. Este objeto é alcançado pela matéria objeto das principais reivindicações. Realizações preferenciais da invenção são definidas pelas características das sub-reivindicações.

DEFINIÇÕES

[020] A presente invenção pode ser compreendida mais facilmente por referência à seguinte descrição detalhada das realizações preferenciais da invenção e aos Exemplos incluídos no presente pedido. A menos que apontado de outro modo, os termos usados no presente pedido devem ser entendidos de acordo com o uso convencional por esses técnicos no assunto na técnica relevante. Além das definições de termos fornecidos no presente pedido, definições de termos comuns em biologia molecular também podem ser encontrados em Rieger et al., 1991 Glossary of genetics: classical and molecular, 5a Ed., Berlin: Springer-Verlag; e em Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento 1998). Entende-se que como usado no relatório descritivo e nas reivindicações, “um” ou “uma” pode significar um ou mais, dependendo do contexto no qual é usado. Assim, por exemplo, referência a “uma célula” pode significar que pelo menos uma célula pode ser utilizada. Entende-se que a terminologia usada no presente pedido tem a intenção de descrever somente realizações específicas descritas, e não tem a intenção de ser limitante.

[021] Ao longo deste pedido, várias publicações são referidas. As divulações de todas estas publicações e essas referências citadas dentro dessas publicações em suas totalidades são incorporadas como referência neste pedido para mais completamente descrever o estado da técnica ao qual esta invenção faz parte. Técnicas padrão para clonagem, isolamento de DNA, amplificação e purificação, reações enzimáticas envolvendo DNA ligase, DNA polimerase, endonucleases de restrição e similares, e várias técnicas de separação são essas conhecidas e geralmente empregadas por esses técnicos no assunto. Várias técnicas padrão são descritas em Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y.; Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y.; Wu (Ed.) 1993 Meth. Enzymol. 218, Parte I; Wu (Ed.) 1979 Meth Enzymol. 68; Wu et al., (Eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 e 101; Grossman e Moldave (Eds). 1980 Meth. Enzymol. 65; Miller (Ed.) 1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Old e Primrose, 1981 Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif e Wensink, 1982 Practical Methods in Molecular Biology; Glover (Ed.) 1985 DNA Cloning Vol. I e II, IRL Press, Oxford, UK; Hames e Higgins (Eds.) 1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK; e Setlow e Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principles and Methods, Vols. 1-4, Pleem um Press, Nova York. As abreviaturas e a nomenclatura, onde empregadas, são considerados padrão no campo e geralmente usadas em publicações profissionais como essas citadas no presente pedido.

[022] O termo “priming” deve ser entendido como a sensibilização de uma planta ou parte da mesma para o futuro ataque por pestes ou patógenos, a fim de induzir uma resistência contra essas pestes ou patógenos. A resistência induzida pelo priming não é baseada em uma ativação direta de um mecanismo de defesa, mas em uma sensibilização da planta ou tecido da planta que resulta em uma expressão mais rápida e mais forte do mecanismos de defesa, em comparação com uma planta não primada, uma vez que a planta é exposta a ataque de patógeno. “Priming” refere-se no presente pedido à sensibilização de uma planta ou parte de uma planta, de modo que seja capaz de ativar mecanismos de defesa mais rápido e/ou mais forte quando exposta a um ou mais estresses bióticos, em comparação com uma planta não primada de controle ou parte da mesma que deve contar com uma resposta direta de defesa. Sem se limitar ao escopo da invenção, acredita- se que o priming resulte em um nível aumentado de fatores de sinalização como proteínas de fator de transcrição (TF) ou quinases MAP e similares na planta ou tecido vegetal primado, em comparação com plantas ou tecidos vegetais não primados. Mediante subsequente exposição da planta ou tecido vegetal ao estresse como peste ou ataque de patógeno, essas proteínas TF inativas tornam-se ativas e regulam a expressão gênica de genes de defesa, de modo que uma resposta de defesa mais rápida e/ou mais forte é montada por plantas ou tecidos primados, em comparação a plantas ou tecidos não primados. O priming pode, para o presente pedido, adicionalmente ser entendido como uma ativação constitutiva do respectivo mecanismo de defesa.

[023] O termo “priming da via de sinalização de etileno” significa que o efeito do priming é realizado por sensibilização da via de sinalização de etileno, conforme mostrado na Figura 1, que leva a uma resposta de defesa mais rápida e mais forte dos mecanismos de defesa dependentes de etileno da planta ou tecido vegetal. A sensibilização da via de sinalização de etileno pode ser alcançada melhorando a expressão de proteína Pti4, Pti5, ERF1 e/ou ERF2 e/ou pela supressão da expressão de proteína CTR1, EBF1 e/ou EBF2.

[024] “Homólogos” de uma proteína englobam peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e/ou enzimas que têm substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos em relação à proteína não modificada em questão, e que têm atividade biológica e funcional similar à da proteína não modificada a partir da qual eles são derivados.

[025] “Homólogos” de um ácido nucleico englobam nucleotídeos e/ou polinucleotides que têm substituições, deleções e/ou inserções de ácido nucleico em relação ao ácido nucleico não modificado em questão, em que a proteína codificada por esse ácido nucleico tem atividade funcional similar ou maior que a proteína não modificada codificada pelo ácido nucleico não modificado a partir do qual eles são derivados. Em particular, homólogos de um ácido nucleico englobam substituições no código degenerativo de aminoácido.

[026] Uma “deleção” refere-se à remoção de um ou mais aminoácidos a partir de uma proteína ou à remoção de um ou mais ácidos nucleicos a partir do DNA, ssRNA e/ou dsRNA.

[027] Uma “inserção” refere-se a um ou mais resíduos de aminoácidos ou resíduos de ácido nucleico a serem introduzidos em um sítio predeterminado em uma proteína ou ácido nucleico.

[028] Uma “substituição” refere-se à substituição de aminoácidos da proteína por outros aminoácidos que têm propriedades similares (como hidrofobicidade similar, hidrofilicidade, antigenicidade, propensão para formar ou quebrar estruturas α-helicoidais ou estruturas folha beta).

[029] No nível de ácido nucleico, uma substituição refere-se a uma substituição de ácido nucleico por outros ácidos nucleicos, em que a proteína codificada pelo ácido nucleico modificado tem uma função similar. Em particular, homólogos de um ácido nucleico abrangem substituições no código degenerativo de aminoácido.

[030] As substituições de aminoácidos são tipicamente de resíduos únicos, mas podem ser agrupadas dependendo das restrições funcionais colocadas no polipeptídeo e podem variar de 1 a 10 aminoácidos; inserções ou deleções serão usualmente na ordem de cerca de 1 a 10 resíduos de aminoácidos. As substituições de aminoácidos são preferencialmente substituições de aminoácidos conservativas. Tabelas de substituição conservativa são bem conhecidas na técnica (consulte, por exemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company (Eds) e Tabela 1 abaixo).

[031] As substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos podem facilmente ser feitas com o uso de técnicas de síntese peptídica bem conhecidas, como síntese peptídica em fase sólida e similares, ou por manipulação de DNA recombinante.

[032] Os métodos para a manipulação de sequências de DNA para produzir substituição, inserção ou deleção de variantes de uma proteína são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, técnicas para produzir mutações de substituição em sítios predeterminados no DNA são bem conhecidas pelos técnicos no assunto e incluem a mutagênese M13, mutagênese T7-Gene in vitro (USB, Cleveland, OH), mutagênese sítio-dirigida QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), PCR mediada por mutagênese sítio-dirigida ou outros protocolos de mutagênese sítio-dirigida.

[033] Ortólogos e parálogos englobam conceitos evolutivos usados para descrever as relações ancestrais dos genes. Parálogos são genes da mesma espécie que foram originadas através de duplicação de um gene ancestral, ortólogos são genes de organismos diferentes que foram originados através de especiação, e também são derivados a partir de um gene ancestral comum.

[034] O termo “dominio” refere-se a um conjunto de aminoácidos conservados nas posições específicas ao longo de um alinhamento de sequências de proteínas relacionadas evolutivamente. Embora aminoácidos em outras posições possam variar entre homólogos, aminoácidos que são altamente conservados nas posições específicas indicam aminoácidos que provavelmente são essenciais na estrutura, estabilidade ou função de uma proteína.

[035] Existem bases de dados especializadas para a identificação de dominios, por exemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher e Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., páginas 53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32:D134- D137, (2004)), ou Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276280 (2002)). Está disponível um conjunto de ferramentas para análise de sequências de proteínas in silico no servidor proteômico ExPASy (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31:3784- 3788(2003)). Domínios ou motivos também podem ser identificados com o uso de técnicas de rotina, como por alinhamento de sequência.

[036] Métodos para o alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica, esses métodos incluem GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA. GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para encontrar o alinhamento global (isto é, que abrange as sequências completas) de duas sequências, que maximiza o número de correspondências e minimiza o número de gaps. O algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10) calcula o percentual de identidade de sequência e realiza uma análise estatística da similaridade entre as duas sequências. O programa de computação para realização da análise BLAST está disponível publicamente junto ao National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Homólogos podem ser facilmente identificados com o uso, por exemplo, do algoritmo de alinhamento de múltiplas sequências ClustalW (versão 1.83), com os parâmetros padrão de alinhamento em pares, e um método de escore em porcentagem. As porcentagens globais de similaridade e de identidade também podem ser determinadas com o uso de um dos métodos disponíveis no pacote do programa de computação MatGAT (Campanella et al., BMC 2003 Jul 10;4:29. MatGAT: um aplicativo que gera matrizes de similaridade/identidade com o uso de sequências de proteínas ou de DNA). A edição manual secundária pode ser realizada para otimizar o alinhamento entre motivos conservados, como seria aparente para um técnico no assunto. Além disso, ao invés de usar as sequências inteiras para a identificação de homólogos, os dominios específicos podem também ser usados. Os valores de identidade de sequência podem ser determinados ao longo do ácido nucleico completo, da sequência de aminoácidos ou ao longo dos dominios selecionados ou motivo(s) conservado(s), com o uso dos programas acima mencionados acima com o uso dos parâmetros padrão. Para alinhamentos locais, o algoritmo de Smith-Waterman é particularmente útil (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1);195-7).

[037] Como usado no presente pedido, os termos “resistência à ferrugem da soja”, “resistente a uma ferrugem da soja”, “resistente à ferrugem da soja”, “resistente a uma ferrugem”, “resistente à ferrugem”, “resistência a fungo”, “resistente a um fungo” e/ou “resistente a fungo” significa reduzir ou prevenir uma infecção por Phacosporacea, em particular Phakopsora pachyrhizi (Sydow) e Phakopsora meibomiae (Arthur) também conhecido como ferrugem da soja ou Ferrugem Asiática da Soja (ASR). O termo “resistência” refere-se à resistência da soja. Resistência não implica que a planta necessariamente tem 100% resistência à infecção. Em realizações preferenciais, a resistência à infecção por ferrugem da soja em uma planta resistente é maior que 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% em comparação a uma planta tipo selvagem que não é resistente à ferrugem da soja. Preferencialmente a planta tipo selvagem é uma planta de genótipo similar, mais preferencialmente idêntico que a planta que tem resistência aumentada à ferrugem da soja, mas não compreende um ácido nucleico recombinante da invenção, fragmentos funcionais do mesmo e/ou um ácido nucleico capaz de hibridizar com um ácido nucleico da invenção.

[038] Os termos “resistência à ferrugem da soja”, “resistente a uma ferrugem de soja”, “resistente à ferrugem da soja”, “resistência à ferrugem”, “resistente a uma ferrugem”, “resistente à ferrugem”, “resistente fúngica”, “resistência a um fungo” e/ou “fúngica-resistente”, como usados no presente pedido, referem-se à capacidade de uma planta, em comparação a uma planta tipo selvagem, evitar infecção por fungos patogênicos da família Phacosporaceae, por exemplo, do gênero Phakopsora pachyrhizi (Sydow) e Phakopsora meibomiae (Arthur), também conhecidos como ferrugem da soja, para destruir, dificultar, reduzir, atrasar a ferrugem, parar o desenvolvimento, crescimento e/ou multiplicação de ferrugem da soja. O nível de resistência fúngica de uma planta pode ser determinado de várias maneiras, por exemplo, por pontuação/medição da área de folha infectada em relação à área de folha total. Outra possibilidade para determinar o nível de resistência é contar o número de colônias de ferrugem da soja sobre a planta ou medir a quantia de esporos produzidos por essas colônias. Outra maneira de resolver o grau de infestação fúngica é medir especificamente a quantidade de DNA de ferrugem por PCR quantitativo (q). Sondas específicas e sequências de primer para a maioria dos fungos patogênicos estão disponíveis na literatura (Frederick RD, Snyder CL, Peterson GL, et al. 2002 Polymerase chain reaction assays for the detection and discrimination of the rust pathogens Phakopsora pachyrhizi and P. meibomiae PHYTOPATHOLOGY 92(2) 217-227). Preferencialmente, a resistência à ferrugem da soja é resistência de não hospedeiro. A resistência de não hospedeiros significa que as plantas são resistentes a pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% e preferencialmente 100% das linhagens do patógeno de ferrugem da soja, preferencialmente as linhagens de Phakopsora pachyrhizi.

[039] O termo “hibridização” como usado no presente pedido inclui “qualquer processo pelo qual uma fita de molécula de ácido nucleico se une a uma fita complementar através de pareamento de base”. (J. Coombs (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, Nova York). A hibridização e a força de hibridização (isto é, a força da associação entre as moléculas de ácido nucleico) é afetada por esses fatores como o grau de complementaridade entre as moléculas de ácido nucleico, estringência das condições envolvidas, a Tm do híbrido formado, e a razão G:C dentro das moléculas de ácido nucleico. Como usado no presente pedido, o termo “Tm” é usado em referência à “temperatura de fusão”. A temperatura de fusão é a temperatura em que uma população de moléculas de ácido nucleico de fita dupla torna-se metade dissociada em fitas simples. A equação para calcular a Tm de moléculas de ácido nucleico é bem conhecida na técnica. Conforme indicado por referências padrão, uma estimativa simples do valor de Tm pode ser calculada pela equação: Tm=81,5+0,41(% G+C), quando uma molécula de ácido nucleico está em solução aquosa em NaCl 1 M [consulte, por exemplo, Anderson e Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)]. Outras referências incluem cálculos mais sofisticados, que levam em conta características estruturais bem como de sequência para o cálculo de Tm. Condições estringentes, são conhecidas pelos técnicos no assunto e podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.

[040] Em particular, o termo condições de estringência refere- se a condições, em que 100 nucleotídeos contíguos ou mais, 150 nucleotídeos contíguos ou mais, 200 nucleotídeos contíguos ou mais ou 250 nucleotídeos contíguos ou mais que são um fragmento ou idêntico à molécula de ácido nucleico complementar (DNA, RNA, ssDNA ou ssRNA) hibridiza sob condições equivalentes a hibridação em dodecil sulfato de sódio (SDS) 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C com lavagem em SSC 2X, SDS 0,1% a 50°C ou 65°C, preferencialmente a 65°C, com uma molécula de ácido nucleico específica (DNA; RNA, ssDNA ou ssRNA). Preferencialmente, as condições de hibridização são equivalentes a hibridização em dodecil sulfato de sódio (SDS) 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C com lavagem em SSC 1X, SDS 0,1% a 50°C ou 65°C, preferencialmente 65°C, mais preferencialmente as condições de hibridização são equivalentes a hibridização em dodecil sulfato de sódio (SDS) 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C com lavagem em SSC 0,1X, SDS 0,1% a 50°C ou 65°C, preferencialmente 65°C. Preferencialmente, os nucleotídeos complementares hibridizam com um fragmento ou com os ácidos nucleicos inteiros da invenção. Preferencialmente, o polinucleotídeo complementar hibridiza com partes dos ácidos nucleicos da invenção capazes de fornecer resistência à ferrugem da soja por superexpressão ou infrarregulação, respectivamente.

[041] Como usado no presente pedido, o termo “ácido nucleico da invenção” ou “aminoácido da invenção” refere-se a um gene que tem pelo menos 60% de identidade com qualquer uma das SEQ-ID-No. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 ou 23 ou com uma codificação de sequência para uma proteína que tem pelo menos 60% de identidade com as SEQ-ID-No. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ou 24 e/ou fragmentos funcionais da mesma. Em uma realização, homólogos dos ácidos nucleicos da invenção têm no nível de de DNA e/ou nível de proteína, pelo menos 70%, preferencialmente de pelo menos 80%, especialmente preferencialmente de pelo menos 90%, bem especialmente preferencialmente de pelo menos 95%, muito especialmente preferencialmente de pelo menos 98%, 99% ou 100% de identidade sobre a região inteira de DNA ou região de proteína fornecida em uma sequência especificamente divulgada no presente pedido e/ou um fragmento funcional da mesma.

[042] Como usado no presente pedido, o termo “aminoácido da invenção” refere-se a uma proteína que tem pelo menos 60% de identidade a uma codificação de sequência para uma proteína que tem SEQ-ID-No. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ou 24 e/ou um fragmento da mesma. Em uma realização, homólogos dos aminoácidos da invenção têm pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, especialmente preferencialmente pelo menos 90%, bem especialmente preferencialmente pelo menos 95%, muito especialmente preferencialmente pelo menos 98%, 99% ou 100% de identidade sobre a região de proteína inteira fornecida em uma sequência especificamente divulgada no presente pedido e/ou um fragmento funcional da mesma.

[043] A “identidade” ou “homologia” entre dois ácidos nucleicos e/ou refere-se em cada caso sobre o comprimento inteiro do ácido nucleico da invenção.

[044] Por exemplo, a identidade pode ser calculada por meios do programa Vector NTI Suite 7.1 da companhia Informax (EUA) que emprega o Método Clustal (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. abril de 1989; 5(2):151-1) com as seguintes configurações:

[045] De maneira alternativa a identidade pode ser determinada de acordo com Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike, Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids

[046] Todas as sequências de ácido nucleico mencionadas no presente pedido (sequências de DNA e RNA de fita simples e fita dupla, por exemplo, cDNA e mRNA) podem ser produzidas de uma maneira conhecida por síntese química a partir dos blocos de construção de nucleotídeos, por exemplo, por condensação de fragmento de sobreposição individual, blocos de construção de ácido nucleico complementar da dupla hélice. A síntese química de oligonucleotídeos pode, por exemplo, ser realizada de uma maneira conhecida, pelo método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2a edição, Wiley Press, Nova York, páginas 896-897). O acúmulo de oligonucleotídeos sintéticos e preenchimento de gaps por meio do fragmento de Klenow da DNA polimerase e reações de ligação bem como técnicas de clonagem geral são descritas em Sambrook et al. (1989), consulte abaixo.

[047] A identidade de sequência entre o ácido nucleico útil de acordo com a presente invenção e os ácidos nucleicos da invenção podem ser otimizados por comparação de sequência e algoritmos de alinhamento conhecidos na técnica (consulte Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991, e referências citadas a esse respeito) e calculando a diferença de percentual entre as sequências de nucleotídeos, por exemplo, o algoritmo de Smith-Waterman conforme implementado no programa de computação BESTFIT com o uso de parâmetros padrão (por exemplo, University of Wisconsin Genetic Computing Group). Pelo menos 60% identidade de sequência, preferencialmente pelo menos 70% de identidade de sequência, 80% 90%, 95%, 98%, 99% de identidade de sequência, ou até 100% de identidade de sequência, com os ácidos nucleicos que têm qualquer SEQ-ID-No. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 ou 23 são preferenciais.

[048] O termo “planta” tem a intenção de englobar plantas em qualquer estágio de maturidade ou desenvolvimento, bem como quaisquer tecidos ou órgãos (partes de planta) pegos ou derivados de qualquer uma dessas plantas a menos que claramente indicado de outra forma por contexto. As partes de planta incluem, mas não se limitam a, células vegetais, caules, raízes, flores, óvulos, estames, sementes, folhas, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, culturas de antera, gametófitos, esporófitos, pólen, microesporos, protoplastos, culturas de raízes cabeludas e/ou similares. A presente invenção também inclui sementes produzidas pelas plantas da presente invenção. Preferencialmente, as sementes compreendem os ácidos nucleicos recombinantes da invenção. Em uma realização, as sementes são de reprodução verdadeira para uma resistência aumentada à infecção fúngica em comparação a uma variedade tipo selvagem da semente da planta. Como usado no presente pedido, uma “célula vegetal” inclui, mas não se limita a, um protoplasto, gameta produzindo célula e uma célula que regenera em uma planta inteira. A cultura de tecido de vários tecidos de plantas e regeneração de plantas deste ponto em diante é bem conhecida na técnica e largamente é publicada.

[049] Em uma realização da presente invenção a planta é selecionada a partir do grupo que consiste em feijões, soja, ervilha, trevo, kudzu, luzerna, lentilhas, tremoços, ervilhacas e/ou amendoim. Preferencialmente, a plant é um legume, que compreende plantas do gênero Phaseolus (que compreende feijão francês, feijão anão, feijão de corda (Phaseolus vulgaris), feijão de Lima (Phaseolus lunatus L.), feijão Tepari (Phaseolus acutifolius A. Gray), feijão runner (Phaseolus coccineus)); o gênero Glycine (que compreende Glycine soja, sojas (Glycine max (L.) Merill)); ervilha (Pisum) (que compreende shelling peas (Pisum sativum L. convar. sativum), também chamada de ervilhas lisas ou sementes redondas; ervilha marrowfat (Pisum sativum L. convar. medullare Alef. emend. C.O. Lehm), ervilha açúcar (Pisum sativum L. convar. axiphium Alef emend. C.O. Lehm), também chamada de ervilha fresca, ervilha comestível ou mangetout, (Pisum granda sneida L. convar. sneidulo p. shneiderium)); amendoim (Arachis hypogaea), trevo (Trifolium spec.), medick (Medicago), videira kudzu (Pueraria lobata), common lucerne, alfalfa (M. sativa L.), grão de bico (Cicer), lentilha (Lens) (Lens culinaris Medik.), tremoço (Lupinus); ervilhacas (Vicia), feijão de campo, fava (Vicia faba), vetchling (Lathyrus) (que compreende chickling pea (Lathyrus sativus), ervilha do mato (Lathyrus tuberosus)); gênero Vigna (que compreende feijão moth (Vigna aconitifolia (Jacq.) Maréchal), feijão adzuki (Vigna angularis (Willd.) Ohwi & H. Ohashi), feijão urd (Vigna mungo (L.) Hepper), feijão mung (Vigna radiata (L.) R. Wilczek), amendoim bambara (Vigna subterrane (L.) Verdc.), rice bean (Vigna umbellata (Thunb.) Ohwi & H. Ohashi), Vigna vexillata (L.) A. Rich., Vigna unguiculata (L.) Walp., nas três subespécies feijão aspargo, feijão fradinho, feijão de vaca)); guandu (Cajanus cajan (L.) Millsp.), o gênero Macrotyloma (que compreende amendoim geocarpa (Macrotyloma geocarpum (Harms) Maréchal & Baudet), feijão cavalo (Macrotyloma uniflorum (Lam.) Verdc.)); feijão goa (Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC.), feijão inhame africano (Sphenostylis stenocarpa (Hochst. ex A. Rich.) Harms), feijão preto egípicio, feijão dolichos, feijão lablab (Lablab purpureus (L.) Sweet), feijão inhame (Pachyrhizus), feijão guar (Cyamopsis tetragonolobus (L.) Taub.); e/ou o gênero Canavalia (que compreende feijão de porco (Canavalia ensiformis (L.) DC.), feijão espada (Canavalia gladiata (Jacq.) DC.)).

[050] A referência no presente pedido a um ácido nucleico “endógeno” da invenção refere-se ao gene em questão conforme encontrado em uma planta em sua forma natural (isto é, sem que haja qualquer intervenção humana). O ácido nucleico recombinante da invenção refere-se ao mesmo gene (ou um ácido nucleico/gene substancialmente homólogo) em uma forma isolada subsequentemente (re)introduzida em uma planta (um transgene). Por exemplo, uma planta transgênica que contém esse transgene pode, quando comparada à expressão do gene endógeno, encontrar um aumento substancial da expressão do transgene ou infrarregulação do endógeno correspondente, respectivamente. O gene isolado pode ser isolado a partir de um organismo, ou pode ser fabricado artificialmente, por exemplo, por síntese química. Uma planta transgênica, de acordo com a presente invenção, inclui um ácido nucleico recombinante da invenção integrado em qualquer loci genético e opcionalmente a planta também pode incluir o gene endógeno dentro do antecedente genético natural.

[051] Para os propósitos da invenção, meios “recombinantes” em relação a, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico, uma molécula de ácido nucleico, um cassete de expressão ou um constructo de vetor que compreende qualquer um ou mais dos ácidos nucleicos da invenção, todas essas construções produzidas pelo homem por métodos de tecnologia genética em que tanto (a) as sequências dos ácidos nucleicos da invenção ou uma parte das mesmas, ou (b) sequência(s) de controle genético que são ligadas de maneira funcional à sequência de ácido nucleico da invenção de acordo com a invenção, por exemplo, um promotor, ou (c) a) e b) não são localizadas em seu ambiente genético natural nem foram modificadas pelo homem por métodos de tecnologia genética. A modificação pode assumir a forma de, por exemplo, uma substituição, adição, deleção, inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeo. O ambiente genético natural é entendido como significando o genômico natural ou locus cromossômico na planta original, a presença em uma biblioteca genômica ou a combinação com o promotor natural.

[052] No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da sequência de ácido nucleico é preferencialmente mantido, pelo menos em parte. O ambiente flanqueia a sequência de ácido nucleico pelo menos em um lado e tem um comprimento de sequência de pelo menos 50 bp, preferencialmente pelo menos 500 bp, especialmente preferencialmente pelo menos 1000 bp, com a máxima preferência pelo menos 5000 bp.

[053] Um cassete de expressão que ocorre naturalmente, por exemplo, a combinação de ocorrência natural do promotor natural das sequências de ácido nucleico com a sequência de ácido nucleico correspondente que codifica uma proteína útil nos métodos da presente invenção, conforme definido acima, torna-se um cassete de expressão recombinante quando esse cassete de expressão é modificado pelo homem por métodos não naturais, sintéticos (“artificiais”) como, por exemplo, tratamento mutagênico. Métodos adequados são descritos, por exemplo, na patente US 5.565.350, documento WO 00/15815 na patente US 200405323. Além disso, um cassete de expressão que ocorre naturalmente, por exemplo, a combinação de ocorrência natural do promotor natural das sequências de ácido nucleico com a sequência de ácido nucleico correspondente que codifica uma proteína útil nos métodos da presente invenção, conforme definido acima, torna-se um cassete de expressão recombinante quando esse cassete de expressão não está integrado no meio genético natural, mas em um meio genético diferente. Deve-se notar ainda que, no contexto da presente invenção, o termo “ácido nucleico isolado” ou “proteína isolada” pode, em alguns casos, ser considerado como um sinônimo de um “ácido nucleico recombinante” ou uma “proteína recombinante”, respectivamente e refere-se a um ácido nucleico ou uma proteína que não está localizada em seu ambiente genético natural e/ou que foi modificada por métodos de tecnologia genética.

[054] Como usado no presente pedido, o termo “transgênico” preferencialmente refere-se a qualquer planta, célula vegetal, calo, tecido vegetal ou parte da planta que contém o constructo recombinante, vetor ou cassete de expressão da invenção ou uma parte dos mesmos que preferencialmente é introduzido por processos não essencialmente biológicos, preferencialmente por transformação de Agrobacteria. O constructo recombinante ou uma parte do mesmo é integrado de maneira estável em um cromossomo, de modo que é passado para gerações sucessivas por propagação clonal, propagação vegetativa ou propagação sexual. As ditas gerações sucessivas também são transgênicas. Processos essencialmente biológicos podem ser cruzamento de plantas e/ou recombinação natural.

[055] Uma planta transgênica, célula ou tecido vegetal para os propósitos da invenção é dessa forma entendido como significando que o constructo recombinante, vetor ou cassete de expressão da invenção está integrado no genoma.

[056] Preferencialmente, constructos, vetores ou cassetes de expressão da invenção não estão presentes no genoma da planta original ou estão presentes no genoma da planta transgênica sem seu locus natural do genoma da planta original.

[057] Locus natural significa a localização em um cromossomo específico, preferencialmente a localização entre certos genes, mais preferencialmente a mesma sequência antecedente como na planta original que é transformada.

[058] Preferencialmente, a planta transgênica, célula ou tecido vegetal da mesma expressa os constructos ou cassetes de expressão da invenção.

[059] O termo “expressão” ou “expressão gênica” significa a transcrição de um gene específico, genes específicos ou constructo de vetor genético específico. O termo “expressão” ou “expressão gênica”, em particular, significa a transcrição de um gene, genes ou constructo de vetor genético dentro do RNA estrutural (rRNA, tRNA), um RNA regulador (por exemplo, microRNA, siRNA, ta-siRNA) ou mRNA, com ou sem subsequente tradução deste último em uma proteína. O processo inclui a transcrição de DNA e processamento do produto de RNA resultante.

[060] O termo “expressão aumentada”, “expressão melhorada”, “superexpressão” ou “aumento de conteúdo” como usado no presente pedido, significa qualquer forma de expressão que é adicional ao nível de expressão tipo selvagem original. Para os propósitos desta invenção, o nível de expressão tipo selvagem original também pode ser zero (ausência de expressão).

[061] Métodos para aumentar a expressão de genes ou produtos de genes são bem documentados na técnica e incluem, por exemplo, a superexpressão direcionada pelos promotores apropriados, o uso de enhancers de transcrição ou enhancers de tradução. Ácidos nucleicos isolados que servem como promotores ou elementos enhancer podem ser introduzidos na posição apropriada (tipicamente a montante) de uma forma não heteróloga de um polinucleotídeo de modo a suprarregular a expressão de um ácido nucleico que codifica a proteína de interesse. Por exemplo, os promotores endógenos podem ser alterados in vivo por mutação, deleção e/ou substituição (consulte, Kmiec, patente US 5.565.350,. Zarling et al, documento WO 9322443), ou promotores isoladas podem ser introduzidos em uma célula vegetal na orientação apropriada e distância a partir de um gene da presente invenção, de modo a controlar a expressão do gene.

[062] Se a expressão da proteína é desejada, é geralmente desejável incluir uma região de poliadenilação na extremidade 3’ de uma região codificadora de polinucleotídeo. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, a partir de uma variedade de genes de outras plantas, ou a partir do T-DNA. A sequência da extremidade 3’ a ser adicionada pode ser derivada, por exemplo, dos genes da nopalina sintase ou octopina sintase, ou alternativamente de outro gene de planta, ou menos preferencialmente de qualquer outro gene de eucarionte.

[063] Uma sequência de íntron pode ser adicionada à região 5’ não traduzida (UTR) e/ou à sequência codificadora da sequência codificadora parcial para aumentar a quantidade de mensagem madura que se acumula no citosol. A inclusão de um íntron de junção na unidade de transcrição tanto nos constructos para expressão em vegetais como em animais mostraram aumentar a expressão gênica em ambos, mRNA e proteínas, em níveis de até 1000 vezes (Buchman e Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1:1183-1200). Esse aumento de íntron da expressão gênica é tipicamente maior quando colocado perto da extremidade 5’ da unidade de transcrição. O uso de íntrons do milho Adh1-S íntron 1, 2 e 6, e do íntron Bronze-1 são conhecidos na técnica. Para informações gerais consulte: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling e Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

[064] O termo “fragmento funcional” refere-se a qualquer ácido nucleico e/ou proteína que meramente compreende uma parte do ácido nucleico inteiro e/ou proteína inteira, mas fornece ainda a mesma função, isto é, resistência à ferrugem da soja, quando expresso ou reprimido em uma planta, respectivamente. Preferencialmente, o fragmento compreende pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% da sequência original. Preferencialmente, o fragmento funcional compreende ácidos nucleicos contíguos ou aminoácidos como no ácido nucleico original e/ou proteína original.

[065] Em uma realização, o fragmento de qualquer um dos ácidos nucleicos da invenção tem uma identidade conforme definido acima ao longo de um comprimento de pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 90% dos nucleotídeos do respectivo ácido nucleico da invenção ao respectivo ácido nucleico da invenção.

[066] Nos casos onde é desejado superexpressão de ácido nucleico da invenção, o termo “atividade funcional similar” ou “função similar” significa que qualquer homólogo e/ou fragmento fornece resistência à ferrugem da soja quando expresso em uma planta. Atividade funcional preferencialmente similar quer dizer pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% ou mais de resistência à ferrugem da soja em comparação com atividade funcional fornecida pela expressão recombinante de qualquer uma das sequências de nucleotídeo da invenção, conforme definido pela SEQ ID No. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 ou 23 e/ou proteína recombinante da invenção, conforme definido pela SEQ ID No. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ou 24.

[067] O termo “atividade aumentada”, como usado no presente pedido, significa qualquer proteína que tem atividade aumentada e fornece resistência aumentada à ferrugem da soja em comparação com a planta tipo selvagem, meramente expressando o respectivo ácido nucleico endógeno da invenção. Na medida em que a superexpressão está relacionada, para os propósitos desta invenção, a expressão tipo selvagem original talvez também possa ser zero (ausência de expressão).

[068] “Reprimir”, “infrarregular” ou “suprimir” a expressão de uma molécula de ácido nucleico em uma célula vegetal são usados equivalentemente no presente pedido e significam que o nível de expressão da molécula de ácido nucleico ou o nível de atividade de proteína da proteína codificada pela molécula de ácido nucleico em uma planta, parte de uma planta ou célula vegatal, depois da aplicação de um método da presente invenção, está mais baixo que sua expressão na planta, parte da planta ou célula vegetal antes da aplicação do método, ou em comparação com uma planta de referência desprovida de uma molécula de ácida nucleico recombinante da invenção. O termo “reprimida”, “infrarregulada” ou “suprimida”, como usado no presente pedido, são sinônimos e significam no presente pedido, mais baixa, preferencialmente significativamente expressão mais baixa da molécula de ácido nucleico a ser expressa ou atividade da proteína a ser expressa. Como usado no presente pedido, uma “repressão”, “infrarregulação” ou “supressão” do nível de um agente como uma proteína, mRNA ou RNA significa que o nível é reduzido em relação a uma planta substancialmente idêntica, parte de uma planta ou célula vegetal cultivada mediante condições substancialmente idênticas, sendo desprovida de uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção, por exemplo, sendo desprovida de região complementar a pelo menos uma parte da molécula precursora do srRNA, do constructo recombinante ou do vetor recombinante da invenção. Como usado no presente pedido, “repressão”, “infrarregulação” ou “supressão” do nível de um agente como, por exemplo, um pré-RNA, mRNA, rRNA, tRNA, snoRNA, snRNA expressos pelo gene alvo e/ou do produto proteína codificado por este, significa que a quantidade é reduzida em 10% ou mais, por exemplo, 20% ou mais, preferencialmente 30% ou mais, mais preferencialmente 50% ou mais, até mesmo mais preferencialmente 70% ou mais, com a máxima preferência 80% ou mais, por exemplo, 90% em relação a uma célula ou organismo desprovido de uma molécula de ácida nucleico recombinante da invenção. A repressão ou infrarregulação pode ser determinada por métodos com os quais o técnico no assunto está familiarizado. Dessa forma, a infrarregulação, repressão ou supressão do ácido nucleico ou proteína ou quantidade de atividade de proteína podem ser determinados, por exemplo, por uma detecção imunológica da proteína. Além disso, técnicas como ensaio de proteína, fluorescência, hibridização Northern, ensaio de proteção de nuclease, transcrição reversa (RT-PCR quantitativo) ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado à enzima), Western blotting, radioimunoensaio (RIA) ou outro imunoensaio e análise celular ativada por fluorescência (FACS) podem ser empregadas para medir uma proteína específica ou RNA em uma planta ou célula vegetal. Dependendo do tipo do produto proteína alvo, sua atividade ou o efeito no fenótipo do organismo ou na célula também podem ser determinados. Métodos para determinar a quantidade de proteína são conhecidos pelos técnicos no assunto. Exemplos que podem ser mencionados são: o método de micro-Biuret (Goa J (1953) Scand J Clin Lab Invest 5:218-222), o método de Folin- Ciocalteau (Lowry OH et al. (1951) J Biol Chem 193:265-275) ou medição da absorção de CBB G-250 (Bradford MM (1976) Analyt Biochem 72:248-254).

[069] Um método para aumentar a resistência a Phacosporacea, por exemplo, ferrugem da soja em que a via de sinalização de etileno é primada, em comparação a plantas tipo selvagem ou células vegetais tipo selvagem, pelo aumento da expressão de uma proteína Pti4, Pti5, ERF2 e/ou ERF1 ou um fragmento funcional, ortólogo, parálogo ou homólogo da mesma é uma realização da invenção.

[070] Um método para aumentar resistência a Phacosporacea, por exemplo, ferrugem da soja em que o priming da via de sinalização de etileno pode ser alcançada pelo aumento da expressão de uma proteína Pti4, Pti5, ERF1 e/ou ERF2 ou um fragmento funcional, ortólogo, parálogo ou homólogo da mesma em que a proteína Pti4, Pti5, ERF1 e/ou ERF2 é codificada por: (i) um ácido nucleico recombinante que tem pelo menos 60% de identidade, 70% de identidade de sequência, 80% 90%, 95%, 98%, 99% de identidade de sequência, ou até mesmo 100% de identidade de sequência com SEQ ID No. 1, 3, 5 ou 7, um fragmento funcional do mesmo e/ou um ácido nucleico recombinante capaz de hibridizar mediante condições estringentes com esses ácidos nucleicos do mesmo e/ou por (ii) um ácido nucleico recombinante que codifica uma proteína que tem pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 70% de identidade de sequência, 80% 90%, 95%, 98%, 99% de identidade de sequência, ou até mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No. 2, 4, 6 ou 8, um fragmento funcional do memso, um ortólogo e/ou um patálogo do mesmo é uma realização adicional da invenção.

[071] Em um método adicional da invenção, o priming da via de sinalização de etileno é alcançada por um método que compreende as etapas de: (a) transformar estavelmente uma célula vegetal com um cassete de expressão, que compreende: (i) um ácido nucleico recombinante que tem pelo menos 60% de identidade, preferencialmente pelo menos 70% de identidade de sequência, 80% 90%, 95%, 98%, 99% de identidade de sequência, ou até mesmo 100% de identidade de sequência com SEQ ID No. 1, 3, 5 ou 7, e/ou um fragmento funcional do mesmo e/ou um ácido nucleico recombinante capaz de hibridizar mediante condições estringentes com esses ácidos nucleicos do mesmo e/ou (ii) um ácido nucleico recombinante que codifica uma proteína que tem pelo menos 60% de identidade, preferencialmente pelo menos 70% de identidade de sequência, 80% 90%, 95%, 98%, 99% de identidade de sequência, ou até mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No. 2, 4, 6 ou 8, um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo e/ou um patálogo do mesmo em conexão funcional com um promotor; (b) regenerar a planta a partir da célula vegetal; e (c) expressar o dito ácido nucleico recombinante que codifica uma proteína Pti4, Pti5, ERF1 e/ou ERF2 em uma quantidade e por um período suficiente para gerar ou para aumentar a resistência à ferrugem da soja na dita planta.

[072] CONSTRUCTO, com vetor recombinante, caracterizado pelo fato de compreender: (a) (i) um ácido nucleico recombinante que tem pelo menos 60% de identidade, 70% de identidade de sequência, 80% 90%, 95%, 98%, 99% de identidade de sequência, ou até mesmo 100% de identidade de sequência com SEQ ID No. 1, 3, 5 ou 7, um fragmento funcional do mesmo e/ou um ácido nucleico capaz de hibridizar mediante condições estringentes com esses ácidos nucleicos e/ou (ii) um ácido nucleico recombinante que codifica uma proteína que tem pelo menos 60% de identidade, preferencialmente pelo menos 70% de identidade de sequência, 80% 90%, 95%, 98%, 99% de identidade de sequência, ou até mesmo 100% de identidade de sequência com a SEQ ID No. 2, 4, 6 ou 8, um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo e/ou um patálogo do mesmo ligado de maneira funcional com (b) um promotor e (c) uma sequência de terminação da transcrição é uma realização adicional da invenção.

[073] Como usado no presente pedido, o termo “ácido nucleico alvo” preferencialmente refere-se a uma molécula de DNA capaz de prevenir a expressão, reduzir a quantidade e/ou função do gene CTR1, EBF1 e/ou EBF2 da planta conforme definido, por exemplo, pela SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 ou 23 na planta ou parte da planta.

[074] O termo “gene alvo”, como usado no presente pedido, refere-se a um gene cuja expressão do mesmo é infrarregulada ou suprimida. Na estrutura deste pedido, genes alvo são preferencialmente genes CTR1, EBF1 e/ou EBF2 de planta conforme, por exemplo, definido pela SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 ou 23 ou homólogos, parálogos ou equivalentes funcionais do mesmo.

[075] A presente invenção fornece um método para aumentar a resistência a fungos patogênicos da família Phacosporaceae, preferencialmente contra fungos patogênicos do gênero Phacospora, mais preferencialmente contra Phakopsora pachyrhizi (Sydow) e Phakopsora meibomiae (Arthur), também conhecido como ferrugem da soja em plantas e/ou células vegetais, em que a via de sinalização de etileno é primada em comparação a plantas tipo selvagem e/ou células vegetais tipo selvagem por infrarregulação ou supressão da expressão de uma proteína CTR1, EBF1 e/ou EBF2.

[076] Em uma realização da invenção, a proteína CTR1, EBF1 e/ou EBF2 é codificada por: (i) um ácido nucleico recombinante que tem pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 70%, por exemplo pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, até mesmo mais preferencialmente pelo menos 90%, por exemplo pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, com a máxima preferência 99% de com SEQ ID No. 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 ou 23, um fragmento funcional do mesmo e/ou um ácido nucleico recombinante capaz de hibridizar mediante condições estringentes com esses ácidos nucleicos do mesmo e/ou por (ii) um ácido nucleico recombinante que codifica uma proteína que tem pelo menos 60% de identidade, preferencialmente pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, até mesmo mais preferencialmente pelo menos 90%, por exemplo pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, com a máxima preferência pelo menos 99% de homologia com SEQ ID No. 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ou 24, um fragmento funcional do mesmo, um ortólogo e/ou um parálogo do mesmo.

[077] Um método para aumentar a resistência a fungos patogênicos da família Phacosporaceae, preferencialmente contra fungos patogênicos do gênero Phacospora, mais preferencialmente contra Phakopsora pachyrhizi (Sydow) e Phakopsora meibomiae (Arthur), também conhecido como ferrugem da soja em plantas e/ou células vegetais, em que a via de sinalização de etileno é primada em comparação a plantas tipo selvagem e/ou células vegetais tipo selvagem por infrarregulação ou supressão da expressão de uma proteína CTR1, EBF1 e/ou EBF2 compreende as etapas de: a) fornecer um ácido nucleico recombinante que compreende um ácido nucleico alvo que é substancialmente idêntico e/ou substancialmente complementar a pelo menos 19 nucleotídeos contíguos do gene alvo de CTR1, EBF1 e/ou EBF2 ou um homólogo, parálogo ou ortólogo do mesmo, conforme definido acima. b) introduzir o dito ácido nucleico recombinante na planta e/ou na parte da mesma é uma reivindicação adicional da invenção.

[078] É uma realização adicional da invenção, que no método conforme definido acima, o ácido nucleico recombinante é capaz de fornecer dsRNA, si-RNA e/ou miRNA na planta, uma parte da mesma, uma vez que o ácido nucleico recombinante é expresso, em que pelo menos 19, preferencialmente pelo menos 20, mais preferencialmente pelo menos 21, por exemplo 22 ou 23 nucleotídeos contíguos do dsRNA e/ou siRNA e/ou dsRNA são substancialmente complementares ao gene alvo de CTR1, EBF1 e/ou EBF2.

[079] Em uma realização específica do método da invenção conforme definido acima, o dito ácido nucleico recombinante compreende um promotor que é funcional na célula vegetal, ligado de maneira funcional a um ácido nucleico alvo que é substancialmente idêntico e/ou substancialmente complementar a pelo menos 19, preferencialmente pelo menos 20, mais preferencialmente pelo menos 21, por exemplo, 22 ou 23 nucleotídeos contíguos do gene alvo de CTR1, EBF1 e/ou EBF2 e que, quando é transcrito, gera RNA que compreende uma primeira fita que tem uma sequência substancialmente complementar a pelo menos 19, preferencialmente pelo menos 20, mais preferencialmente pelo menos 21, por exemplo, 22 ou 23 nucleotídeos contíguos do gene alvo de CTR1, EBF1 e/ou EBF2 e uma segunda fita que tem uma sequência substancialmente complementar à primeira fita ou partes da mesma, e uma sequência reguladora terminadora.

[080] Em outra realização específica do método da invenção, conforme definido acima, o dito ácido nucleico recombinante compreende um promotor que é funcional na célula vegetal, ligado de maneira funcional a um ácido nucleico alvo que, quando é transcrito, gera RNA que compreende uma primeira fita que tem uma sequência substancialmente idêntica ou substancialmente complementar a pelo menos 19, preferencialmente pelo menos 20, mais preferencialmente pelo menos 21, por exemplo, 22 ou 23 nucleotídeos contíguos do gene alvo de CTR1, EBF1 e/ou EBF2, e uma sequência reguladora terminadora.

[081] Realizações adicionais da invenção são constructos de vetores recombinantes que compreendem um ácido nucleico recombinante que compreende um promotor que é funcional na célula vegetal, ligado de maneira funcional a um ácido nucleico alvo que é substancialmente idêntico e/ou substancialmente complementar a pelo menos 19, preferencialmente pelo menos 20, mais preferencialmente pelo menos 21, por exemplo, 22 ou 23 nucleotídeos contíguos do gene alvo de CTR1, EBF1 e/ou EBF2, e uma sequência reguladora terminadora.

[082] Os constructos de vetor recombinante da invenção, conforme definido acima, podem ainda compreender um promotor que é funcional na célula vegetal, ligado de maneira funcional a um ácido nucleico alvo que é substancialmente idêntico e/ou substancialmente complementar a pelo menos 19, preferencialmente pelo menos 20, mais preferencialmente pelo menos 21, por exemplo, 22 ou 23 nucleotídeos contíguos do gene alvo de CTR1, EBF1 e/ou EBF2 e que, quando é transcrito, gera RNA que compreende uma primeira fita que tem uma sequência substancialmente complementar a pelo menos 19, preferencialmente pelo menos 20, mais preferencialmente pelo menos 21, por exemplo, 22 ou 23 nucleotídeos contíguos do gene alvo de CTR1, EBF1 e/ou EBF2 e opcionalmente uma segunda fita que tem uma sequência substancialmente complementar à primeira fita ou partes da mesma, e uma sequência reguladora terminadora.

[083] A presente invenção fornece um método para produzir uma palnta e/ou uma parte da mesma resistente a fungos patogênicos da família Phacosporaceae, por exemplo, ferrugem da soja, que compreende: a) fornecer um ácido nucleico recombinante que compreende um ácido nucleico alvo que é substancialmente idêntico e/ou substancialmente complementar a pelo menos 19, preferencialmente pelo menos 20, mais preferencialmente pelo menos 21, por exemplo 22 ou 23 nucleotídeos contíguos da sequência alvo da invenção, b) introduzir o dito ácido nucleico recombinante na planta e/ou partes da mesma, em que a introdução do dito ácido nucleico recombinante resulta na infrarregulação ou repressão da expressão do gene respectivo alvo. Esses genes alvo são preferencialmente CTR1, EBF1 e EBF2 e homólogos, parálogos ou equivalentes funcionais do mesmo conforme definido, por exemplo, pela SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 ou 23.

[084] A presente invenção fornece ainda um constructo de vetor que compreende um ácido nucleico recombinante que compreende um promotor que é funcional na célula vegetal, ligado de maneira funcional a um ácido nucleico alvo que é substancialmente idêntico e/ou substancialmente complementar, preferencialmente idêntico ou complementar a pelo menos 19, preferencialmente pelo menos 20, mais preferencialmente pelo menos 21, por exemplo, 22 ou 23 nucleotídeos contíguos do gene alvo da invenção e uma sequência reguladora terminadora, bem como o uso do constructo de vetor, para a transformação de plantas ou partes da mesma para forncere plantas resistentes a fungos patogênicos da família Phacosporaceae, por exemplo, ferrugem da soja.

[085] A presente invenção também fornece uma célula vegetal transgênica, plantas ou partes da mesma, que compreende um ácido nucleico recombinante que compreende um ácido nucleico alvo que é substancialmente idêntico e/ou substancialmente complementar, preferencialmente idêntico ou complementar a pelo menos 19, preferencialmente pelo menos 20, mais preferencialmente pelo menos 21, por exemplo, 22 ou 23 nucleotídeos contíguos do gene alvo da invenção. As partes de plantas podem ser células vegetais, raízes, talos, folhas, flores e/ou sementes.

[086] Há um acordo geral que em muitos organismos, inclusive fungos e plantas, pedaços grandes de dsRNA complementares a um gene específico são clivados em 19 a 24 fragmentos de nucleotídeos (siRNA) dentro das células, e que esses siRNAs são os reais mediadores para silenciar o gene alvo específico. Como usado no presente pedido, siRNA refere-se a 19 a 24 fragmentos de nucleotídeos complementares ao respectivo gene alvo.

[087] Há várias possibilidades para fornecer o siRNA: RNA de interferência (RNAi), micro-RNAi (miRNA), RNA sense e/ou RNA antisense para infrarregulação ou supressão da expressão do gene alvo da invenção.

[088] Como usado no presente pedido, “RNAi” ou “RNA de interferência” refere-se ao processo de silenciamento do gene pós-transcrição específico de sequência, mediado por RNA dupla fita (dsRNA). No processo de RNAi, tem que ser fornecido dsRNA que compreende uma primeira fita que é substancialmente complementar a pelo menos 19 nucleotídeos contíguos do gene alvo da invenção e uma segunda fita que é complementar à primeira fita, pelo menos parcialmente. Para este propósito, um ácido nucleico recombinante é introduzido na planta, que é capaz de produzir esse dsRNA. O dsRNA específico do gene alvo é produzido e é processado em fragmentos relativamente pequenos (siRNAs). miRNA refere-se a um processo similar, exceto que o dsRNA produzido compreende apenas parcialmente regiões substancialmente idênticas ao gene alvo (pelo menos 19 nucleotídeos contíguos).

[089] Como usado no presente pedido, “interferência antisense” refere-se ao processo de silenciamento do gene pós-transcrição específico de sequência, provavelmente também mediada por RNA dupla fita (dsRNA). No processo de RNA antisense, tem que ser fornecido ssRNA que compreende uma primeira fita que é substancialmente complementar a pelo menos 19 nucleotídeos contíguos do gene alvo. Com este propósito, o ácido nucleico recombinante é introduzido na planta, que é capaz produzir esse ssRNA. Sem se limitar à teoria, é suposto que este pares de RNA com ssRNA complementar são transcritos a partir do gene alvo original.

[090] Conforme divulgado no presente pedido, não é necessário 100% da identidade de sequência entre o ácido nucleico alvo e o gene alvo para praticar a presente invenção. Preferencialmente, o ácido nucleico compreende uma porção de 19 nucleotídeos que é substancialmente idêntica e/ou substancialmente complementar a pelo menos 19 nucleotídeos contíguos do gene alvo. Embora um ácido nucleico alvo que compreende uma sequência idêntica de nucleotídeo e/ou idêntica a uma porção do gene alvo e/ou complementar à sequência inteira e/ou uma porção do gene alvo é preferencial para inibição, a invenção pode tolerar variações de sequência que talvez sejam esperadas devido à manipulação ou síntese gênica, mutação genética, polimorfismo de linhagem ou divergência evolutiva. Dessa forma, o ácido nucleico alvo também pode englobar uma incompatibilidade com o gene alvo de pelo menos 1, 2 ou mais nucleotídeos. Por exemplo, é contemplado na presente invenção que dentro de 21 nucleotídeos contíguos o ácido nucleico alvo pode conter uma adição, deleção ou substituição de 1, 2 ou mais nucleotídeos, contanto que a sequência de RNA resultante ainda interfira na respectiva função do gene alvo.

[091] A identidade de sequência entre o ácido nucleico recombinante útil de acordo com a presente invenção e o gene de alvo pode ser otimizada por comparação de sequência e algoritmos de alinhamento conhecidos na técnica (consulte Gribskov e Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991, e referências citadas nesse) e cálculo da diferença de porcentagem entre as sequências de nucleotídeo, por exemplo, pelo algoritmo de Smith-Waterman, conforme implementado no programa de software, com o uso de parâmetros padrão (por exemplo, University of Wisconsin Genetic Computing Group). É preferencial mais que 80% de identidade de sequência, 90% de identidade de sequência, ou até mesmo 100% de identidade de sequência, entre o ácido nucleico alvo e pelo menos 19 nucleotídeos contíguos do gene alvo. O mesmo preferencialmente se aplica para complementaridade de sequência.

[092] Quando o ácido nucleico alvo da invenção tem um comprimento maior que aproximadamente 19 nucleotídeos, por exemplo, de cerca de 50 nucleotídeos a cerca de 500 nucleotídeos, o dsRNA correspondente fornecido a partir deste será clivado aleatoriamente ao dsRNAs de cerca de 21 nucleotídeos dentro da célula vegetal: os siRNAs. Os múltiplos especializados Dicers em plantas podem gerar siRNAs tipicamente variando em tamanho de 19nt a 24nt (Consulte Henderson et al., 2006. Nature Genetics 38:721-725.). A clivagem de um dsRNA mais longo da invenção pode produzir um agrupamento de 21mer de dsRNAs, derivados do dsRNA mais longo. Os siRNAs podem ter sequências correspondentes a fragmentos de 19 a 24 nucleotídeos contíguos ao longo da sequência inteira do gene alvo. Um técnico no assunto reconheceria que o siRNA pode ter uma incompatibilidade com o gene alvo de pelo menos 1, 2 ou mais nucleotídeos. Ainda, essas incompatibilidades são destinadas a serem incluídas na presente invenção.

[093] Em uma realização, o ácido nucleico é substancialmemte idêntico e/ou substancialmente complementar, preferencialmente idêntico ou complementar ao longo de um comprimento de pelo menos 19, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400 ou pelo menos 500 nucleotídeos ao respectivo gene alvo. Em particular, o ácido nucleico pode compreender 19 a 500, preferencialmente 50 a 500, mais preferencialmente 250 a 350 nucleotídeos, em que preferencialmente pelo menos cerca de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 100, 200, 300, 400 bases consecutivas ou até o comprimento inteiro do ácido nucleico alvo são idênticas e/ou complementares e/ou idênticas ao gene alvo.

[094] Preferencialmente, o ácido nucleico recombinante é capaz de fornecer dsRNA e/ou siRNA e/ou miRNA na planta, uma parte da mesma uma vez que o ácido nucleico recombinante é expresso na planta, em que preferencialmente pelo menos 19 nucleotídeos contíguos do dsRNA e/ou siRNA e/ou miRNA são substancialmente complementares ao respectivo gene alvo.

[095] Geralmente, o termo “substancialmente idêntico” ou “substancialmente complementar” preferencialmente refere-se ao DNA e/ou RNA que é pelo menos 80% idêntico ou complementar a 19 ou mais nucleotídeos contíguos de uma sequência específica de DNA ou RNA do respectivo gene alvo, mais preferencialmente, pelo menos 90% idêntico a 19 ou mais nucleotídeos contíguos, e mais preferencialmente pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% Idêntico ou complementar ou absolutamente idêntico ou absolutamente complementar a 19 ou mais nucleotídeos contíguos de uma sequência específica de DNA ou RNA do respectivo gene alvo. Em particular, o RNA idêntico corresponde à fita codificadora de DNA do respectivo gene alvo.

[096] Como usado no presente pedido, o termo “substancialmente idêntico” ou “substancialmente complementar”, como aplicado ao DNA do ácido nucleico recombinante, o ácido nucleico alvo e/ou o gene alvo significa que a sequência de nucleotídeo é pelo menos 80% idêntica ou complementar a 19 ou mais nucleotídeos contíguos do gene alvo, mais preferencialmente, pelo menos 90% idêntica ou complementar a 19 ou mais nucleotídeos contíguos do gene alvo, e com a máxima preferência pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica ou complementar ou absolutamente idêntica ou absolutamente complementar a 19 ou mais nucleotídeos contíguos do gene alvo. O termo “19 ou mais nucleotídeos contíguos do gene alvo” corresponde ao gene alvo, tendo pelo menos cerca de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500 bases consecutivas ou até o comprimento inteiro do gene alvo.

[097] Uma realização de acordo com a presente invenção fornece um método para a produção de uma planta e/ou parte da mesma resistente a um fungo patogênico da família Phacosporaceae, por exemplo, ferrugem da soja, em que o ácido nucleico recombinante compreende um promotor que é funcional na célula vegetal, ligado de maneira funcional a um ácido nucleico alvo, que é substancialmente idêntico e/ou substancialmente complementar, ou preferencialmente idêntico ou complementar a pelo menos 19, preferencialmente pelo menos 20, mais preferencialmente pelo menos 21, por exemplo, 22 ou 23 nucleotídeos contíguos do respectivo gene alvo e que, quando é transcrito, gera RNA que compreende uma primeira fita que tem uma sequência substancialmente complementar a pelo menos 19, de preferência pelo menos 20, mais preferencialmente pelo menos 21, por exemplo, 22 ou 23 nucleotídeos contíguos do gene alvo e uma segunda cadeia que tem uma sequência substancialmente complementar à primeira fita e/ou partes da mesma, e uma sequência reguladora terminadora.

[098] A primeira fita e a segunda fita podem, pelo menos, formar parcialmente o dsRNA. Esta técnica também é referida como RNAi.

[099] Em outra realização, o ácido nucleico alvo compreende 19 a 24 nucleotídeos contíguos da sequência alvo que são substancialmente idênticos e/ou substancialmente complementares ao gene alvo, e os nucleotídeos restantes do ácido nucleico alvo não são idênticos e/ou complementares ao gene alvo. Não idêntico significa identidade que é menor que 95%, menor que 90%, menor que 80%, menor que 70%, menor que 60% sobre a sequência inteira do ácido nucleico alvo. Não complementar significa uma complementaridade que é menor que 95%, menor que 90%, menor que 80%, menor que 70%, menor que 60% sobre a sequência inteira do ácido nucleico alvo. Esta técnica também é referida como miRNA.

[0100] Uma realização, de acordo com a presente invenção, fornece um método para produção de uma planta ou parte da mesma resistente a um fungo patogênico da família Phacosporaceae, por exemplo, ferrugem da soja, em que o ácido nucleico recombinante compreende um promotor que é funcional na célula vegetal, ligado de maneira funcional a um ácido nucleico alvo que, quando é transcrito, gera RNA que compreende uma primeira fita que tem uma sequência substancialmente complementar, preferencialmente complementar a pelo menos 19, preferencialmente pelo menos 20, mais preferencialmente pelo menos 21, por exemplo, 22 ou 23 nucleotídeos contíguos do gene alvo, e uma sequência reguladora terminadora.

[0101] Preferencialmente, a primeira fita gerada na planta forma dsRNA junto com uma segunda fita de RNA gerada na planta que é complementar à primeira fita. Esta técnica também é referida como RNA antisense.

[0102] O dsRNA da invenção opcionalmente pode compreender uma única fita presa em ambas as extremidades. Preferencialmente, a única fita presa compreende pelo menos dois nucleotídeos nas extremidades 3’ de cada fita da molécula de dsRNA. A estrutura dupla fita pode ser formada por uma única fita de RNA complementar a si mesma (isto é, formando uma alça de grampo) ou duas fitas de RNA complementares. Quando o dsRNA da invenção forma uma alça de grampo, este pode opcionalmente compreender um íntron, como apresentado pela patente US 2003/0180945A1 ou um espaçador de nucleotídeo, que é uma extensão de sequência entre fitas complementares de RNA para estabilizar o transgene de grampo nas células. Os métodos para produzir várias moléculas de dsRNA são apresentados, por exemplo, no documento WO 99/53050 e na patente US 6.506.559.

[0103] Em uma realização, o constructo de vetor compreender um promotor que é funcional na célula vegetal, ligado de maneira funcional a um ácido nucleico alvo que é substancialmente idêntico e/ou substancialmente complementar a pelo menos 19, preferencialmente pelo menos 20, mais preferencialmente pelo menos 21, por exemplo, 22 ou 23 nucleotídeos contíguos do gene alvo e que, quando é transcrito, gera RNA que compreende uma primeira fita que tem uma sequência substancialmente complementar a pelo menos 19, preferencialmente pelo menos 20, mais preferencialmente pelo menos 21, por exemplo, 22 ou 23 nucleotídeos contíguos do gene alvo, e uma segunda fita que tem uma sequência substancialmente complementar à primeira fita ou partes da mesma, e uma sequência reguladora terminadora.

[0104] É preferencial que a primeira fita e a segunda fita sejam capazes de hibridizar para formar dsRNA pelo menos parcialmente.

[0105] Em outra realização, o constructo de vetor compreende um promotor que é funcional na célula vegetal, ligado de maneira funcional a um ácido nucleico alvo que, quando é transcrito, gera RNA que compreende uma primeira fita que tem uma sequência substancialmente complementar ou idêntica a pelo menos 19, preferencialmente pelo menos 20, mais preferencialmente pelo menos 21, por exemplo, 22 ou 23 nucleotídeos contíguos do gene alvo, e uma sequência reguladora terminadora.

[0106] É preferencial que o transcrito da primeira fita e pelo menos uma parte do transcrito do gene alvo sejam capazes de hibridizar para formar dsRNA pelo menos em parte.

[0107] Em uma realização, o constructo de vetor compreende um ácido nucleico alvo que compreende 19 a 500 nucleotídeos. Variantes adicionais do ácido nucleico alvo são definidos na seção referindo-se ao método para produzir uma planta.

[0108] Com relação a um constructo de vetor e/ou ácido nucleico recombinante, o termo “ligado de maneira funcional” significa que o ácido nucleico alvo está ligado à sequência reguladora, incluindo promotores, terminadores, enhancers e/ou outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação), de uma maneira que permita a expressão do ácido nucleico alvo (por exemplo, em uma célula vegetal hospedeira quando o vetor é introduzido na célula vegetal hospedeira). Essas sequências reguladoras estão descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) e Gruber e Crosby, em: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Eds. Glick e Thompson, Capítulos 7, 89-108, CRC Press: Boca Raton, Flórida, incluindo as referências nesse. Sequências reguladoras incluem aquelas que direcionam a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeo em muitos tipos de células hospedeiras e aquelas que dirigem a expressão direta da sequência de nucleotídeo só em certas células hospedeiras ou mediante certas condições. Será considerado por esses técnicos no assunto que o projeto do vetor pode depender desses fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de dsRNA desejado, e similares. Os constructos de vetor da invenção podem ser introduzidos em células hospedeiras de planta para assim produzir ssRNA, dsRNA e/ou siRNA e/ou miRNA para prevenir e/ou reduzir expressão do respectivo gene alvo e assim aumentar a resistência a fungos patogênicos da família Phacosporaceae, por exemplo, ferrugem da soja.

[0109] Em uma realização, o constructo de vetor compreende um promotor ligado de maneira funcional a um nucleotídeo alvo que é um molde para uma ou ambas as fitas das moléculas de ssRNA ou dsRNA pelo menos substancialmente complementar a 19 nucleotídeos contíguos do gene alvo.

[0110] Em uma realização, a molécula de ácido nucleico compreende adicionalmente dois promotores ladeando ambas as extremidade da molécula de ácido nucleico, em que os promotores dirigem a expressão de cada fita de DNA individual, gerando assim dois RNA complementares que hibridizam e formam o dsRNA.

[0111] Em realizações alternativas, a sequência de nucleotídeo é transcrita em ambas as fitas do dsRNA em uma unidade de transcrição, em que a fita sense é transcrita a partir da extremidade 5’ da unidade de transcrição e a fita antisense é transcrita a partir da extremidade 3’, em que as duas fitas são separadas por cerca de 3 a cerca de 500 pares de bases, e em que depois de transcrição, o transcrito de RNA se dobra para formar um grampo.

[0112] Em outra realização, o vetor contém um promotor bidirecional, dirigindo a expressão de duas moléculas de ácido nucleico, através do qual uma molécula de ácido nucleico codifica uma sequência substancialmente idêntica a uma porção de um gene de alvo da invenção e a outra molécula de ácido nucleico codifica uma segunda sequência substancialmente complementar á primeira fita e capaz de formar um dsRNA, quando ambas as sequências são transcritas. Um promotor bidirecional é um promotor capaz de mediar expressão em duas direções.

[0113] Em outra realização, o vetor contém dois promotores, um mediando a transcrição da sequência substancialmente idêntica a uma porção de um gene alvo da invenção e o outro promotor mediando a transcrição de uma segunda sequência sendo substancialmente complementar à primeira fita e capaz de formar um dsRNA, quando ambas as sequências são transcritas. O segundo promotor talvez seja um promotor diferente.

[0114] Um promotor diferente significa um promotor que tem uma atividade diferente em relação à célula ou especificidade de tecido, ou que exibe expressão em diferentes indutores, por exemplo, patógenos, estresse abiótico ou produtos químicos.

[0115] Promotores de acordo com a presente invenção podem ser constitutivos, induzíveis, em particular, induzíveis por patógeno, preferenciais para estágios de desenvolvimento, preferenciais para tipo celular, preferenciais para tecido, preferenciais para órgão. Os promotores constitutivos são ativos sob a maioria das condições. Exemplos não limitantes de promotores constitutivos incluem os promotores CaMV 19S w 35S (Odell et al., 1985, Nature 313:810-812), o promotor sX CaMV 35S (Kay et al., 1987, Science 236:1299-1302), o promotor Sep1, o promotor actina do arroz (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2:163-171), o promotor actina de Arabidopsis, o promotor ubiquitina (Christensen et al., 1989, Plant Molec. Biol. 18:675-689); pEmu (Last et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81:581-588), o promotor 35S do vírus de mosaico de figwort, o promotor Smas (Velten et al., 1984, EMBO J. 3:27232730), o promotor GRP1-8, o promotor cinnamil álccol desidrogenase (patente US 5.683.439), promotores do T-DNA de Agrobacterium, como mannopina sintase, nopalina sintase, e octopina sintase, a subunidade pequena do promotor ribulose bifosfato carboxilase (ssuRUBISCO), e/ou similares. Os promotores que expressam o dsRNA em uma célula que é contatada pelo fungo são preferenciais. Alternativamente, o promotor pode dirigir a expressão do dsRNA em um tecido vegetal remoto do local de contato com o fungo, e o dsRNA pode então ser transportado pela planta para uma célula que é contatada pelo fungo, em particular, células de locais infectados por fungos ou próximas a estes.

[0116] Preferencialmente, o vetor de expressão da invenção compreende um promotor constitutivo, promotor raiz-específico, um promotor induzível por patógeno, ou um promotor induzível por fungos. Um promotor é induzível, se sua atividade, medida na quantidade de RNA produzido sob controle do promotor, é pelo menos 30%, 40%, 50%, preferencialmente pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% mais preferencialmente pelo menos 100%, 200%, 300% maior em seu estado induzido, que em seu estado não induzido. Um promotor é célula-, tecido- ou órgão-específico, se sua atividade, medida na quantidade de RNA produzido sob controle do promotor, é pelo menos 30%, 40%, 50%, preferencialmente pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% mais preferencialmente pelo menos 100%, 200%, 300% maior em um tipo celular, tecido ou órgão específico, do que em outros tipos celulares ou tecidos da mesma planta, preferencialmente os outros tipos celulares ou tecidos do mesmo órgão da planta, por exemplo, uma raiz. No caso de promotores órgão- específico, a atividade do promotor tem que ser comparada à atividade do promotor em outros órgãos da planta, por exemplo, folhas, talos, flores ou sementes.

[0117] Promotores preferenciais para estágio de desenvolvimento são preferencialmente expressos em certos estágios de desenvolvimento. Os promotores preferenciais para tecido e órgão incluem aqueles que são preferencialmente expressos em certos tecidos ou órgãos, como folhas, raízes, sementes ou xilema. Exemplos de promotores preferenciais para tecido e preferenciais para órgão incluem, mas não se limitam a fruta-preferencial, óvulo-preferencial, tecido masculino-preferencial, semente-preferencial, integumento-preferencial, tubérculo-preferencial, caule-preferencial, pericarpo- preferencial, folha-preferencial, estigma-preferencial, pólen-preferencial, antera- preferencial, pétala-preferencial, sépala-preferencial, pedicelo-preferencial, síliqua-preferencial, tronco-preferencial, raiz-preferencial e/ou similares. Promotores preferenciais de sementes são preferencialmente expressos durante o desenvolvimento de semente e/ou germinação. Por exemplo, promotores preferenciais de sementes podem ser embrião-preferenciais, endosperma-preferenciais e revestimento de semente-preferenciais. Consulte Thompson et al., 1989, BioEssays 10:108. Exemplos de promotores preferenciais de semente incluem, mas não se limitam a celulose sintase (celA), Cim1, gama-zeína, globulina-1, zeína 19 kD de milho (cZ19B1) e/ou similares.

[0118] Outros promotores tecido-preferenciais ou órgão- preferenciais incluem, mas não se limitam a, promotor do gene da napina de semente de colza (patente US 5.608.152), o promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al., 1991, Mol Gen Genet. 225(3):459-67), o promotor de oleosina de Arabidopsis (pedido PCT documento WO 98/45461), o promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (patente US 5.504.200), o promotor de Bce4 de Brassica (pedido PCT documento WO 91/13980), ou o promotor de B4 (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2(2):233-9), bem como os promotores que conferem expressão específica em sementes em plantas monocotiledôneas como milho, cevada, trigo, centeio, arroz, etc. Promotores adequados a serem apontados são o promotor do gene lpt2 ou lpt1 da cevada (pedido PCT documento WO 95/15389 e pedido PCT documento WO 95/23230) ou aqueles descritos no pedido PCT documento 99/16890 (promotores do gene hordeína da cevada, gene glutelina do arroz, gene orizina do arroz, gene prolamina do arroz, gene gliadina do trigo, gene glutelina do trigo, gene glutelina do trigo, gene casirina do sorgo, gene secalina do centeio)

[0119] Promotores uteis de acordo com a invenção incluem, mas não se limitam a, promotor principal de proteína de ligação a clorofila a/b, promotores de histona, promotor Ap3, promotor de β-conglicina, promotor napina, o promotor de lecitina de soja, promotor de zeína de milho com 15kD, promotor de zeína de milho com 22kD, promotor de zeína de milho com 27kD, promotor de g-zeína, ceroso, shrunken 1, shrunken 2, promotores de bronze, promotor Zm13 (patente US 5.086.169), os promotores de poligalacturonase de milho (PG) (patente US 5.412.085 e 5.545.546), promotor SGB6 (patente US 5.470.359), bem como os promotores sintéticos ou outros naturais.

[0120] Os promotores específicos de epiderme podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em: WIR5 (=GstA1); acc. X56012; Dudler & Schweizer, GLP4, acc. AJ310534; Wei Y., Zhang Z., Andersen C.H., Schmelzer E., Gregersen P.L., Collinge D.B., Smedegaard-Petersen V. e Thordal-Christensen H., Plant Molecular Biology 36, 101 (1998), GLP2a, acc. AJ237942, Schweizer P., Christoffel A. e Dudler R., Plant J. 20, 541 (1999); Prx7, acc. AJ003141, Kristensen B.K., Ammitzboll H., Rasmussen S.K. e Nielsen K.A., Molecular Plant Pathology, 2(6), 311 (2001); GerA, acc. AF250933; Wu S., Druka A., Horvath H., Kleinhofs A., Kannangara G. e von Wettstein D., Plant Phys Biochem 38, 685 (2000); OsROC1, acc. AP004656 RTBV, acc. AAV62708, AAV62707; Kloti A., Henrich C., Bieri S., He X., Chen G., Burkhardt P.K., Wünn J., Lucca P., Hohn T., Potrykus I. e Fütterer J., PMB 40, 249 (1999); Promotor da quitinase de batata (Ancillo et al., Planta. 217(4), 566, (2003)); Promotor AtProT3 (Grallath et al., Plant Physiology. 137(1), 117 (2005)); Promotores SHN de Arabidopsis (fatores de transcrição AP2/EREBP envolvidos na produção de cutiona e cera) (Aarón et al., Plant Cell. 16(9), 2463 (2004)); e/ou GSTA1 de trigo (Dudler et al., WP2005306368 and Altpeter et al., Plant Molecular Biology. 57(2), 271 (2005)).

[0121] Os promotores específicos de mesófilo podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em: PPCZm1 (=PEPC); Kausch A.P., Owen T.P., Zachwieja S.J., Flynn A.R. e Sheen J., Plant Mol. Biol. 45, 1 (2001); OsrbcS, Kyozuka et al., PlaNT Phys 102, 991 (1993); Kyozuka J., McElroy D., Hayakawa T., Xie Y., Wu R. e Shimamoto K., Plant Phys. 102, 991 (1993); OsPPDK, acc. AC099041; TaGF-2.8, acc. M63223; Schweizer P., Christoffel A. e Dudler R., Plantam J. 20, 541 (1999); TaFBPase, acc. X53957; TaWIS1, acc. AF467542; patente US 200220115849; HvBIS1, acc. AF467539; patente US 200220115849; ZmMIS1, acc. AF467514; patente US 200220115849; HvPR1a, acc. X74939; Bryngelsson et al., Mol. Plant Microbe Interacti. 7 (2), 267 (1994); HvPR1b, acc. X74940; Bryngelsson et al., Mol. Plant Microbe Interact. 7(2), 267 (1994); HvB1,3gluc; acc. AF479647; HvPrx8, acc. AJ276227; Kristensen et al., Molecular Plant Pathology, 2(6), 311 (2001); e/ou HvPAL, acc. X97313; Wei Y., Zhang Z., Andersen C.H., Schmelzer E., Gregersen P.L., Collinge D.B., Smedegaard-Petersen V. e Thordal-Christensen H. Plant Molecular Biology 36, 101 (1998).

[0122] Os promotores constitutivos podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em: - promotor PcUbi da salsa (documento WO 03/102198) - promotor 35S de CaMV: promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (Benfey et al. 1989 EMBO J. 8(8): 2195-2202), - promotor STPT: promotor translocador de fosfato de triose curta de Arabidopsis thaliana (Acesso NM_123979) - promotor Act1: - promotor do gene actina 1 de Oryza sativa (McElroy et al. 1990 PLANT CELL 2(2) 163-171 a) e/ou - promotor EF1A2: fator alfa de alongamento de tradução de Glycine max (patente US 20090133159).

[0123] O técnico no assunto está consciente que os métodos da invenção para suprarregulação de Pti4, Pti5, ERF1 e/ou ERF2, conforme definido acima, e infrarregulação de CTR1, EBF1 e/ou EBF2, conforme definido acima, para aumentar resistência à ferrugem da soja, por exemplo, Phacosporacea, em uma planta por priming da via de sinalização de etileno, podem ser combinados e podem ser aplicados em uma planta por vez. Isto significa que o vetor ou planta ou parte de planta da invenção pode compreender um ou mais constructos para superexpressão de pelo menos um de Pti4, Pti5, ERF1 e/ou ERF2 e ao mesmo tempo, um ou mais constructos para infrarregulação de pelo menos um de CTR1, EBF1 e/ou EBF2.

[0124] Um tipo de constructo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Certos constructos de vetor são capazes de realizar replicação autônoma em uma célula vegetal hospedeira na qual eles são introduzidos. Outros constructos de vetores são integrados no genoma de uma célula vegetal hospedeira pela introdução em uma célula hospedeira, e através disso serem replicados junto com o genoma hospedeiro. Em particular, o constructo de vetor é capaz de dirigir a expressão de gene ao qual o vetor é ligado de maneira funcional. No entanto, a invenção é destinada a incluir essas outras formas de constructos de vetor de expressão, como vetores virais (por exemplo, vírus X da batata, vírus do “rattle” do tabaco e/ou vírus gêmeos), que servem para funções equivalentes.

[0125] De acordo com a presente invenção o ácido nucleico alvo é capaz de reduzir a quantidade ou função da proteína de qualquer umas das proteínas da invenção em células vegetais. Em realizações preferenciais, a redução na quantidade de proteína ou função da proteína alvo acontece de modo constitutivo ou tecido-específico. Em realizações especialmente preferenciais, uma redução induzida essencialmente por patógeno na quantidade de proteína ou função de proteína acontece, por exemplo, por expressão recombinante do ácido nucleico alvo sob o controle de um promotor induzível por fungos. Em particular, a expressão do ácido nucleico alvo acontece em locais infectados por fungo onde, no entanto, preferencialmente a expressão da sequência de ácido nucleico alvo permanece essencialmente inalterada em tecidos não infectados por fungo. Em realizações preferenciais, a quantidade de proteína de uma proteína alvo na planta é reduzida por pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% ou mais, em comparação a uma planta tipo selvagem que não é transformada com o ácido nucleico alvo. Preferencialmente, a planta tipo selvagem é uma planta com um genótipo similar, mais preferencialmente idêntico ao da planta transformada com o ácido nucleico alvo.

[0126] O termo “introdução” ou “transformação”, conforme mencionado no presente pedido, engloba a transferência de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, independentemente do método usado para a transferência. O tecido de planta capaz de realizar propagação clonal subsequente, por meio de organogênese ou embriogênese, pode ser transformado por um constructo de vetor da presente invenção e regenerar uma planta inteira a partir dele. O tecido específico escolhido varia de acordo com os sistemas de propagação clonal disponíveis e mais adequados à espécie particular sendo transformada. Tecido exemplares alvos incluem discos foliais, pólen, embriões, cotilédones, hipocótilos, megagametófitos, tecido caloso, tecido merismático existente (por exemplo, meristema apical, gemas axilares e meristemas de raiz), e tecido de meristema induzido (por exemplo, meristema de cotilédone e meristema de hipocótilo). O polinucleotídeo pode ser introduzido transitória ou estavelmente em uma célula hospedeira e pode ser mantido não integrado, por exemplo, como um plasmídeo. Alternativamente, ele pode ser integrado no genoma hospedeiro. A célula vegetal transformada resultante pode então ser usada para regenerar uma planta transformada de uma maneira conhecida por técnicos no assunto.

[0127] O termo “terminador” engloba uma sequência de controle que é uma sequência de DNA no final de uma unidade de transcrição que sinaliza o processamento 3’ e poliadenilação de um transcrito primário e terminação da transcrição. O terminador pode ser derivado do gene natural, a partir e uma variedade de outros genes de plantas, ou a partir do T-DNA. O terminador a ser adicionado pode ser derivado, por exemplo, dos genes da nopalina sintase ou octopina sintase, ou alternativamente de outro gene de planta, ou menos preferencialmente de qualquer outro gene de eucarionte.

[0128] As células vegetais transgênicas podem ser transformadas com um dos constructos de vetor descritos acima. Métodos adequados para transformação ou células hospedeiras de transfecção incluindo células vegetais são bem conhecidos na técnica de biotecnologia vegetal. Qualquer método pode ser usado para transformar o vetor de expressão recombinante em células vegetais para produzir plantas transgênicas da invenção. Métodos gerais para transformar plantas dicotiledôneas são divulgados, por exemplo, nas patentes US 4.940.838, 5.464.763, e similares. Métodos para transformar plantas dicotiledôneas específicas, por exemplo, algodão, são apresentados nas patentes 5.004.863, 5.159.135 e 5.846.797. Métodos de transformação de soja que são apresentados nas patentes US 4.992.375, 5.416.011, 5.569.834, 5.824.877, 6.384.301 e na patente EP 0301749B1 podem ser usados. Métodos de transformação podem incluir métodos diretos e indiretos de transformação. Métodos diretos adequados incluem absorção de DNA induzida por glicol, transformação mediada por lipossomo (patente US 4.536.475), métodos biolísticos com o uso de arma genética (Fromm ME et al., Bio/Technology. 8(9):833-9, 1990; Gordon-Kamm et al. Plant Cell 2:603, 1990), eletroporação, incubação de embriões secos em solução que compreende DNA, e microinjeção. No caso destes métodos diretos de transformação, os plasmídeos usados não necessitam satisfazer nenhuma exigência específica. Plasmídeos simples, como aqueles das séries pUC, pBR322, M13mp, pACYC184 e similares podem ser usados. Se plantas intactas serão regeneradas a partir das células transformadas, um gene marcador selecionável está preferencialmente localizado no plasmídeo. Técnicas de transformação direta são igualmente adequadas para plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas.

[0129] A transformação também pode ser realizada por infecção bacteriana por meio de Agrobacterium (por exemplo, patente EP 0 116 718), infecção viral por meio de vetores virais (patente EP 0 067 553, patente US 4.407.956, documento WO 95/34668, documento WO 93/03161) ou por meio de pólen (patente EP 0 270 356, documento WO 85/01856, patente US 4.684.611). Técnicas de transformação baseadas em Agrobacterium (especialmente para plantas dicotiledôneas) são bem conhecidas na técnica. A linhagem de Agrobacterium (por exemplo, Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes) compreende um plasmídeo (plasmídeo Ti ou Ri) e um elemento T-DNA que é transferido para a planta após infecção com Agrobacterium. O T-DNA (DNA transferido) é integrado no genoma da célula vegetal. O T-DNA pode estar localizado no plasmídeo Ri ou Ti ou está compreendido separadamente em um, assim chamado, vetor binário. Métodos para a transformação mediada por Agrobacterium são descritos, por exemplo, em Horsch RB et al. (1985) Science, 225:1229. A transformação mediada por Agrobacterium é mais adequada para plantas dicotiledôneas, mas foi adaptada para plantas monocotiledôneas. A transformação de plantas por Agrobacteria é descrita, por exemplo, em White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15 - 38; Jenes B et al. Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205- 225. A transformação pode resultar em transformação temporária ou estável e expressão. Embora uma sequência de nucleotídeo da presente invenção possa ser inserida em qualquer planta e célula vegetal incluída dentro destas classes amplas, esta é particularmente útil em células de planta de cultura.

[0130] As células vegetais modificadas geneticamente podem ser regeneradas através de todos os métodos com os quais um técnico no assunto está familiarizado. Métodos adequados podem ser encontrados nas publicações acima mencionadas por S.D. Kung e R. Wu, Potrykus ou Hofgen e Willmitzer.

[0131] Geralmente após a transformação, as células ou agrupamentos de células vegetais são selecionados para a presença de um ou mais marcadores que são codificados pelos genes expressíveis na planta cotransfectada com o gene de interesse, após o qual o material transformado é regenerado em uma planta inteira. Para selecionar as plantas transformadas, o material vegetal obtido na transformação é, em regra, submetido a condições seletivas de modo que as plantas transformadas podem ser distinguidas das plantas não transformadas. Por exemplo, as sementes obtidas da maneira acima descrita podem ser plantadas e, após período de crescimento inicial, submetidas a uma seleção adequada por spray. Uma possibilidade adicional consiste no cultivo das sementes, se apropriado após esterilização, em placas de ágar com o uso de um agente de seleção adequado, de modo que somente as sementes transformadas podem desenvolver-se em plantas. Alternativamente, as plantas transformadas são triadas para a presença de um marcador selecionável como aqueles descritos acima.

[0132] Após transferência de DNA e regeneração, plantas transformadas putativamente podem também ser avaliadas, por exemplo, com o uso de análise de Southern para a presença do gene de interesse, número de cópias e/ou organização genômica. Alternativa ou adicionalmente, os níveis de expressão do DNA recém-introduzido podem ser monitorados com o uso de análise de Northern e/ou Western, ambas as técnicas sendo bem conhecidas por técnicos no assunto.

[0133] As plantas transformadas regeneradas podem ser propagadas por uma variedade de formas, como as técnicas de propagação clonal ou de reprodução clássica. Por exemplo, uma planta transformada de primeira geração (ou T1) pode ser autofecundada e os transformantes homozigóticos de segunda geração (ou T2) selecionados, e as plantas T2 podem então ser ainda propagadas através de técnicas clássicas de reprodução. Os organismos transformados gerados podem apresentar uma variedade de formas. Por exemplo, eles podem ser quimeras de células transformadas e células não transformadas; transformantes clonais (por exemplo, todas as células transformadas para conter o cassete de expressão); enxertos de tecidos transformados e não transformados (por exemplo, em plantas, um porta-enxerto transformado enxertado em uma muda não transformada).

[0134] As partes coletáveis da planta transgênica de acordo com a presente invenção são parte da invenção. As partes coletáveis podem ser sementes, raízes, folhas e/ou flores que compreendem o gene SMT1, o gene SMT1 complementar e/ou parte do mesmo. Partes preferenciais de plantas de soja são feijão de soja que compreendem o gene transgênico SMT1.

[0135] Os produtos derivados de plantas transgênicas de acordo com a presente invenção, partes das mesmas ou partes coletáveis das mesmas são parte da invenção. Um produto preferencial é refeição de soja ou óleo de soja.

[0136] A presente invenção também inclui métodos para a produção de um produto que compreende a) o crescimento das plantas da invenção e b) produzir o dito produto a partir de, ou pelas plantas da invenção e/ou ou partes da mesma, por exemplo, sementes dessas plantas. Em uma realização adicional, o método compreende as etapas de a) crescimento das plantas da invenção, b) remoção das partes coletáveis, conforme definido acima, a partir das plantas e c) produção do dito produto a partir de, ou pelas partes coletáveis de acordo com a invenção.

[0137] Em uma realização, o método para a produção de um produto compreende: a) cultivar as plantas da invenção ou que são obtidas pelos métodos de invenção e, b) produzir o dito produto a partir de ou pelas plantas da invenção e/ou partes, por exemplo, sementes, destas plantas.

[0138] O produto pode ser produzido no local onde a planta foi cultivada, ou as plantas e/ou partes da mesma podem ser removidas do local onde as plantas foram cultivadas para produzir o produto. Tipicamente, a planta é cultivada, as partes coletáveis desejadas são removidas da planta, se possível, em ciclos repetidos, e o produto produzido a partir das partes coletáveis da planta. A etapa de crescimento da planta pode ser realizada apenas uma vez a cada vez que os métodos da invenção são realizados, embora permitindo repetidas vezes, as etapas de produção do produto, por exemplo, por remoção repetida de partes coletáveis das plantas da invenção e, se necessário, posterior processamento dessas partes para se chegar ao produto. Também é possível que a etapa de cultivo das plantas da invenção seja repetida e as plantas ou partes coletáveis sejam armazenadas até que a produção do produto seja então realizada uma vez para as plantas ou partes das plantas acumuladas. Também, as etapas de crescimento das plantas e produção do produto podem ser realizadas com uma sobreposição de tempo, mesmo que simultaneamente a uma grande extensão, ou sequencialmente. Geralmente as plantas são cultivadas por algum tempo antes do produto ser produzido.

[0139] Em uma realização, os produtos produzidos pelos ditos métodos da invenção são produtos de plantas como, mas não limitados a, um gênero alimentício, ração para animais, um suplemento alimentar, suplemento de ração, fibra, cosmético ou produto farmacêutico. Gêneros alimentícios são considerados como composições usadas para nutrição e/ou para nutrição suplementar. Rações para animais e suplementos de alimentação animal, em particular, são considerados como gênero alimentício.

[0140] Em outra realização, os métodos inventivos para produção são usados para produzir produtos agrícolas como, mas não se limitando a, extratos vegetais, proteínas, aminoácidos, carboidratos, gorduras, óleos, polímeros, vitaminas e similares.

[0141] É possível que um produto vegetal consista de um ou mais produtos agrícolas em grande parte. FIGURAS

[0142] A Figura 1 mostra ilustração esquemática da via de sinalização de ET (tomado de Adie et al. J Plant Growth Regul 2007 26:160ff, DOI 10.1007/s00344-007-0012-6). A ligação de ET leva à inativação de seu receptor e sucessivamente à desativação da quinase CTR1 similar a Raf. Isto permite que EIN2 ative a família Ein3 de fatores de transcrição. Por outro lado, Ein3 é regulado por EBF1 e EBF2, levando à degradação de EIN3. Ein3 ativado suprarregula a expressão de ERF1 (e o seu homólogo/genes ortólogos). ERF1 (e outros fatores de transcrição similar a ERF) ativam a expressão de genes de defesa regulados por etileno (por exemplo, proteínas PR etc.).

[0143] A Figura 2 mostra o sistema de escore usado para determinar o nível de área de folha doente de tipo selvagem e plantas transgênicas de soja contra o fungo de ferrugem P. pachyrhizi.

[0144] A Figura 3 mostra a sequência inteira do gene ERF-1 de Arabidopsis thaliana que tem SEQ-ID-No.1.

[0145] A Figura 4 mostra a sequência da proteína ERF-1 (SEQ-ID- 2).

[0146] A Figura 5 mostra o resultado do escore de 31 plantas de soja transgênica que expressam o constructo de vetor de superexpressão de ERF-1. Plantas de soja T0 que expressam proteína ERF-1 foram inoculadas com esporos de Phakopsora pachyrhizi. A avaliação da área de folha doente em todas as folhas foi realizada 14 dias após a inoculação. A média da porcentagem da área de folha mostrando colônias de fungos ou amarelado/acastanhado forte em todas as folhas foi considerada como área de folha doente. Todas as 31 plantas T0 de soja que expressam ERF-1 (expressão verificada por RT-PCR) foram avaliadas em paralelo a plantas de controle não transgênicas. A mediana da área de folha doente é mostrada na Figura 5. A superexpressão de ERF-1 reduz significativamente (p<0,001) a área de folha doente em comparação a plantas de controle não transgênicas.

[0147] A Figura 6 mostra a sequência inteira do gene Pti-4 de Solaem um lycopersicum que tem SEQ-ID-No.3.

[0148] A Figura 7 mostra a sequência da proteína Pti-4 (SEQ-ID- 4).

[0149] A Figura 8 mostra o resultado do escore de 33 plantas de soja transgênica que expressam o constructo de vetor de superexpressão de Pti-4. As plantas de soja T0 que expressam proteína Pti-4 foram inoculadas com esporos de Phakopsora pachyrhizi. A avaliação da área de folha doente em todas as folhas foi realizada 14 dias após a inoculação. A média da porcentagem da área de folha mostrando colônias de fungos ou amarelado/acastanhado forte em todas as folhas foi considerada como área de folha doente. Todas as 33 plantas T0 de soja que expressam Pti-4 (expressão verificada por RT-PCR) foram avaliadas em paralelo a plantas de controle não transgênicas. A mediana da área de folha doente é mostrada na Figura 8. A superexpressão de Pti-4 reduz a área de folha doente em comparação a plantas de controle não transgênicas.

[0150] A Figura 9 mostra a sequência inteira do gene Pti-5 de Solaem um lycopersicum que tem SEQ-ID-No.5.

[0151] A Figura 10 mostra a sequência da proteína Pti-5 (SEQ-ID- 6).

[0152] A Figura 11 mostra o resultado do escore de 34 plantas de soja transgênica que expressam o constructo de vetor de superexpressão de Pti-5. As plantas de soja T0 que expressam proteína Pti-5 foram inoculadas com esporos de Phakopsora pachyrhizi. A avaliação da área de folha doente em todas as folhas foi realizada 14 dias após a inoculação. A média da porcentagem da área de folha mostrando colônias de fungos ou amarelado/acastanhado forte em todas as folhas foi considerada como área de folha doente. Todas as 34 plantas T0 de soja que expressam Pti-4 (expressão verificada por RT-PCR) foram avaliadas em paralelo a plantas de controle não transgênicas. A mediana da área de folha doente é mostrada na Figura 11. A superexpressão de Pti-4 reduz significativamente (p<0,05) a área de folha doente em comparação a plantas de controle não transgênicas.

[0153] A Figura 12 mostra a sequência inteira do gene ERF-2 de Arabidopsis thaliana que tem SEQ-ID-No.7.

[0154] A Figura 13 mostra a sequência da proteína ERF-2 (SEQ-ID-8).

[0155] A Figura 14 mostra o resultado do escore de 29 plantas de soja transgênica que expressam o constructo de vetor de superexpressão de ERF-2. Plantas de soja T0 que expressam proteína ERF-2 foram inoculadas com esporos de Phakopsora pachyrhizi. A avaliação da área de folha doente em todas as folhas foi realizada 14 dias após a inoculação. A média da porcentagem da área de folha mostrando colônias de fungos ou amarelado/acastanhado forte em todas as folhas foi considerada como área de folha doente. Todas as 29 plantas T0 de soja que expressam ERF-2 (expressão verificada por RT-PCR) foram avaliadas em paralelo a plantas de controle não transgênicas. A mediana da área de folha doente é mostrada na Figura 14. A superexpressão de ERF-2 reduz significativamente (p<0,01) a área de folha doente em comparação a plantas de controle não transgênicas.

[0156] A Figura 15 mostra a sequência inteira do gene CTR-1 de Arabidopsis thaliana que tem SEQ-ID-No.9.

[0157] A Figura 16 mostra a sequência da proteína CTR-1 (SEQ-ID-10).

[0158] A Figura 17 mostra a sequência inteira do gene EBF-1 de Arabidopsis thaliana que tem SEQ-ID-No.11.

[0159] A Figura 18 mostra a sequência da proteína EBF-1 (SEQ- ID-12). EXEMPLOS

[0160] Os exemplos a seguir não se destinam a limitar o escopo das reivindicações da invenção, mas são especialmente destinados a serem exemplares de certas realizações. Quaisquer variações nos métodos exemplificados que ocorrem ao técnico no assunto são destinadas a serem incluídas no escopo da presente invenção. EXEMPLO 1 MÉTODOS GERAIS

[0161] A síntese química de oligonucleotídeos pode ser afetuada, por exemplo, de modo conhecido pelo uso do método de fosfoamidito (Voet, Voet, 2a Edição, Wiley Press Nova York, páginas 896-897). As etapas de clonagem realizadas para os propósitos da presente invenção como, por exemplo, clivagens de restrição, eletroforese em gel de agarose, purificação de fragmentos de DNA, transferência de ácidos nucleicos para membranas de nitrocelulose e de nylon, fragmentos ligantes de DNA, transformação de células E. coli, culturas de bactérias, fagos multiplicadores e análise de sequências de DNA recombinante, são realizadas conforme descrito por Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), ISBN 0-87969-309-6. O sequenciamento de moléculas de DNA recombinante é realizado com um sequenciador de DNA com fluorescência a laser seguindo o método de Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)). EXEMPLO 2 CLONAGEM DE CONSTRUCTOS DE VETOR DE SUPEREXPRESSÃO

[0162] Os cDNAs de todos os genes mencionados neste pedido foram gerados por síntese de DNA (Geneart, Regensburg, Alemanha).

[0163] O cDNA de ERF1 foi sintetizado de modo que um sítio de restrição de EcoRV esteja localizado na frente do ATG inicial e um sítio de restrição de SpeI a jusante do códon de parada. Os cDNAs sintetizados foram digeridos com o uso de enzimas de restrição EcoRV e SpeI (NEB Biolabs) e ligados em um vetor Gateway pENTRY digerido por EcoRV/SpeI (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA) de modo que o fragmento inteiro estivesse localizado na direção sense entre o promotor de ubiquitina de salsa (PcUbi) e um terminador tOCS de Agrobacterium.

[0164] Para obter o vetor binário de transformação de planta, uma sistema de reação tripla de LR (Gateway system, (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA) foi realizado de acordo com o protocolo de fabricantes pelo uso de um vetor pENTRY-A contendo um promotor de ubiquitina de salsa, o vetor pENTRY-B descrito acima contendo o cDNA e um vetor pENTRY-C contendo um terminador t-StCatpA. Como alvo, foi usado um vetor binário pDEST que é composto de: (1) uma cassete de resistência à canamicina para seleção bacteriana (2) uma origem pVS1 para replicação em Agrobacteria (3) uma origem pBR322 de replicação para manutenção estável em E.coli e (4) entre o limite direito e esquerdo uma seleção AH sob controle de um promotor PcUbi (Figura 4). A reação de recombinação foi transformada em E. coli (DH5alfa), mini preparado e selecionado por digestões de restrição específicas. Um clone positivo do constructo de vetor foi sequenciado e foi submetido à transformação de soja.

[0165] Os cDNAs de Pti4, Pti5, CTR1 foram sintetizados de modo que um sítio de recombinação de attB1 (Gateway system, (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA) estivesse localizado na frente do ATG inicial e um sítio de recombinação attB2 estivesse localizado diretamente a jusante do códon de parada. Os cDNAs sintetizados foram transferidos a um vetor pENTRY-B pelo uso do sistema de reação (Gateway system, (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA) de acordo com o protocolo fornecido pelo fornecedor. Para obter o vetor binário de transformação de planta, uma sistema de reação tripla de LR (Gateway system, (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA) foi realizado de acordo com o protocolo de fabricantes pelo uso de um vetor pENTRY-A contendo um promotor de ubiquitina de salsa, os cDNAs em um vetor pENTRY-C e um vetor pENTRY-C contendo um terminador t-Nos. Como alvo, foi usado um vetor binário pDEST que é composto de: (1) uma cassete de resistência à canamicina para seleção bacteriana (2) uma origem pVS1 para replicação em Agrobacteria (3) uma origem pBR322 de replicação para manutenção estável em E.coli e (4) entre o limite direito e esquerdo uma seleção AH sob controle de um promotor pcUbi (Figura 4). A reação de recombinação foi transformada em E. coli (DH5alfa), mini preparado e selecionado por digestões de restrição específicas. Um clone positivo de cada constructo de vetor foi sequenciado e foi submetido à transformação de soja.

[0166] Os cDNAs de EFB1 e ERF2 foram sintetizado de modo que um sítio de restrição de EcoRV estivesse localizado na frente do ATG inicial e um sítio de restrição de SpeI a jusante do códon de parada. Os cDNAs sintetizados foram digeridos com o uso de enzimas de restrição EcoRV e SpeI (NEB Biolabs) e ligados em um vetor Gateway pENTRY digerido por EcoRV/SpeI (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA) de modo que o fragmento inteiro esteja localizado na direção sense entre o promotor ubiquitina de salsa (PcUbi) e um terminador tOCS de Agrobacterium. Para obter o vetor binário de transformação de planta, uma sistema de reação tripla de LR (Gateway system, (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA) foi realizado de acordo com o protocolo de fabricantes pelo uso de um vetor pENTRY-A vazio não contendo nenhuma sequência entre os sítios de recombinação, o vetor pENTRY-B descrito acima contendo os cDNAs e um vetor pENTRY-C vazio. Como alvo, foi usado um vetor binário pDEST que é composto de: (1) uma cassete de resistência à canamicina para seleção bacteriana (2) uma origem pVS1 para replicação em Agrobacteria (3) uma origem pBR322 de replicação para manutenção estável em E.coli e (4) entre o limite direito e esquerdo uma seleção AH sob controle de um promotor pcUbi (Figura 4). A reação de recombinação foi transformada em E. coli (DH5alfa), mini preparado e selecionado por digestões de restrição específicas. Um clone positivo de cada constructo de vetor foi sequenciado e foi submetido à transformação de soja. EXEMPLO 3 TRANSFORMAÇÃO DE SOJA

[0167] Os constructos contendo o vetor de expressão (consulte exemplo 2) foram transformados na soja. 3.1 ESTERILIZAÇÃO E GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE SOJA

[0168] Praticamente qualquer semente de qualquer variedade de soja pode ser empregada no método da invenção. Uma variedade de cultivar de soja (incluindo Jack, Williams 82 e Resnik) é apropriada para transformação de soja. As sementes de soja foram esterilizadas em uma câmara com um gás de cloro por adição de 3,5 ml de HCl 12N gota a gota em 100 ml de alvejante (hipoclorito de sódio 5,25%) em um dessecador com uma tampa bem apropriada. Depois de 24 a 48 horas na câmara, sementes foram removidas e aproximadamente 18 a 20 sementes foram plaqueadas em meio sólido GM com ou sem 6-benzil-aminopurina 5 μM (BAP) em placas de Petri de 100 mm. As mudas sem BAP são mais alongadas e as raízes desenvolvidas, especialmente a formação de raiz lateral e secundária. BAP fortalece a muda por formação de uma muda mais curta e mais troncuda.

[0169] Plantas com sete a dez dias cultivadas na luz (> 100 μEinstein/m2s) a 25°C foram usadas para material de explante para os três tipos explante. Desta vez, o revestimento da semente foi partido, e o epicótilo com as folhas unifoliadas cresceram no mínimo até o comprimento dos cotilédones. O epicótilo deveria ter pelo menos 0,5 cm para evitar nós no tecido cotiledonar (visto que cultivares de soja e lotes de sementes podem variar no tempo de desenvolvimento, uma descrição do estágio de germinação é mais exata que um tempo específico de germinação).

[0170] Para inoculação de mudas inteiras (Método A, consulte exemplo 3.3. e 3.3.2) ou explantes de folha (Método B, consulte exemplo 3.3.3), as mudas estavam então prontas para transformação.

[0171] Para o método C (consulte exemplo 3.3.4), o hipocótilo e um, metade ou parte de ambos os cotilédones foram removidos de cada muda. As mudas foram então colocadas em meios de propagação por 2 a 4 semanas. As mudas produzem vários brotos ramificados para se obter explantes das mesmas. A maioria dos explantes se originou a partir do crescimento da plântula da gema apical. Estes explantes foram preferencialmente usados como tecido alvo. 3.2 - CRESCIMENTO E PREPARAÇÃO DE CULTURA DE AGROBACTERIUM

[0172] As culturas de Agrobacterium foram preparadas por raspagem de Agrobacterium (por exemplo, A. tumefaciens ou A. rhizogenes) carregando o vetor binário desejado (por exemplo, H. Klee. R. Horsch e S. Rogers 1987 Agrobacterium-Mediated Plant Transformation and its further Applications to Plant Biology; Annual Review of Plant Physiology Vol. 38: 467-486) sobre meios YEP de meio de crescimento YEP sólido: 10 g de extrato de levedura. 10 g de Bacto Peptona. 5 g de NaCl. Ajustar pH para 7,0, e trazer volume final para 1 litro com H2O, para placas de ágar YEP adicionar 20g de ágar, autoclave) e incubar a 25°C até que as colônias apareceram (aproximadamente 2 dias). Dependendo dos genes de marcador selecionável no plasmideo Ti ou Ri, o vetor binário e os cromossomos bacterianos, compostos diferentes de seleção foram usados para A. tumefaciens e seleção de rizogenes no meio sólido e meio líquido YEP. Várias linhagens de Agrobacterium podem ser usadas para o método de transformação.

[0173] Depois de aproximadamente dois dias, uma única colônia (com um palito estéril) foi selecionada e 50 ml de líquido YEP foi inoculado com antibióticos e agitados a 175 rpm (25° C) até que uma OD.sub.600 entre 0,8-1,0 fosse alcançada (aproximadamente 2 d). Estoques de glicerol de trabalho (15%) para transformação são preparados e 1 ml de estoque de Agrobacterium aliquotado em tubos Eppendorf de 1,5 ml então armazenados a -80°C.

[0174] O dia anterior à inoculação de explante, 200 ml de YEP foram inoculados com 5. mu.l a 3 ml de estoque de Agrobacterium de trabalho em um frasco Erlenmeyer de 500 ml. O frasco foi agitado durante a noite em 25°C. até que a OD.sub.600 estivesse entre 0,8 e 1,0. Antes de preparar os explantes de soja, Agrobacteria foram peletizados por centrifugação por 10 min a 5,500.vezes.g a 20° C. O pélete foi ressupenso em líquido CCM até a densidade desejada (OD.sub.600 0,5-0,8) e colocado à temperatura ambiente por pelo menos 30 min antes do uso. 3.3 - PREPARAÇÃO DE EXPLANTE E CO-CULTIVO (INOCULAÇÃO) 3.3.1 MÉTODO A: PREPARAÇÃO DE EXPLANTE NO DIA DA TRANSFORMAÇÃO

[0175] As mudas desta vez tinham epicótilos alongados de pelo menos 0,5 cm, mas geralmente entre 0,5 e 2 cm. Os epicótilos alongados até 4 cm de comprimento forma empregados com sucesso. Os explantes foram então preparados com: i) com ou sem algumas raízes, ii) com um parcial, um ou ambos os cotilédones, todas as folhas pré-formadas foram removidas inclusive o meristema apical, e o nó localizado no primeiro conjunto de folhas foi machucado com vários cortes pelo uso de um bisturi agudo.

[0176] Este corte no nó não apenas induziu infecção por Agrobacterium, mas também distribuiu as células do meristema axilar e brotos pré-formados danificados. Após ferimento e preparação, os explantes foram desprezados em uma placa de Petri e subsequentemente co-cultivados com a mistura líquida de CCM/Agrobacterium por 30 minutos. Os explantes foram então removidos do meio líquido e plaqueados no topo de um papel de filtro estéril em 15. vezes. placas de Petri de 100 mm com meio sólido de co-cultivo. Os tecidos alvo feridos foram colocados de modo que eles estivessem em contato direto com o meio. 3.3.2 MÉTODO MODIFICADO A: PREPARAÇÃO DE EXPLANTE DE EPICÓTILO

[0177] Os segmentos de epicótilo de soja preparados a partir de mudas com 4 a 8 dias foram usadas como explantes para regeneração e transformação. As sementes de soja L00106CN, 93-41131 e Jack foram germinadas em sais 1/10 MS ou um meio de composição similar com ou sem citocinas para explantes de epicótilo com 4 a cerca de 8 dias foi preparado por remoção do nó cotiledonar o nó do caule da seção do caule. O epicótilo foi cortado em 2 a 5 segmentos. Especialmente preferenciais são segmentos anexos ao nó primário ou nó mais alto que compreende tecido meristemático axilar.

[0178] O explantes foram usados para infecção com Agrobacterium. Agrobacterium AGL1 que abriga um plasmídeo com o constructo da invenção e o gene marcador selecionável AHAS, bar ou dsdA foram cultivados em meio LB com antibióticos apropriados durante a noite, colhidos e ressuspensos em um meio de inoculação com acetoseringona. Segmentos de epicótilo recentemente preparados foram encharcados na suspensão de Agrobacterium por 30 a 60 min e então os explantes foram borrados a seco em papéis de filtro estéreis. Os explantes inoculados foram então cultivados em um meio de cocultura com L-cisteína e TTD e outros produtos químicos como acetosiringona para melhorar a distribuição de T-DNA por 2 a 4 dias. O explantes de epicótilo infectados foram então colocados em um meio de indução de broto com agentes de seleção como imazapirina (para gene AHAS), glufosinato (para gene bar) ou D-serina (para gene dsdA). Os brotos regenerados foram subcultivados em meio de alongamento com o agente seletivo.

[0179] Para regeneração de plantas transgênicas os segmentos foram então cultivados em um meio com citocinas como BAP, TDZ e/ou cinetina para indução de broto. Depois de 4 a 8 semanas, os tecidos cultivados foram transferidos para um meio com concentração mais baixa de citoquinina para alongamento do broto. Os brotos alongados foram transferidos para um meio com auxina para enraizamento e desenvolvimento da planta. Brotos múltiplos foram regenerados.

[0180] Muitos setores transformados de maneira estável que mostraram forte expressão do constructo da invenção foram recuperados. Plantas de soja foram regeneradas a partir de explantes de epicótilo. A distribuição eficiente de T-DNA e setores estáveis transformados foram demonstrados. 3.3.3 MÉTODO B: EXPLANTES DE FOLHA

[0181] Para a preparação do explante de folha o cotilédone foi retirado do hipocótilo. Os cotilédones foram separados um do outro e o epicótilo foi removido. As folhas primárias, que consistem na lâmina, no pecíolo e nas estípulas, foram removidas do epicótilo cortando-se cuidadosamente na base das estípulas de modo que os meristemas axilares fossem incluídos no explante. Para ferir o explante, bem como estimular de novo a formação de broto, quaisquer brotos pré-formados foram removidos e a área entre as estípulas foi cortada com um bisturi agudo 3 a 5 vezes.

[0182] O explantes são completamente imersos ou a extremidade do pecíolo ferido mergulhada na suspensão de Agrobacterium imediatamente após a preparação do explante. Depois da inoculação, os explantes são borrados sobre papel de filtro estéril para remover o excesso de cultura de Agrobacterium e colocar os explantes com o lado ferido em contato com um papel Whatman redondo de 7 cm sobreposto ao meio sólido CCM (consulte acima). Este papel de filtro previne o crescimento excessivo de A. tumefaciens nos explantes de soja. Placas foram embrulhadas cinco vezes com Parafilm.TM. “M” American National Can, Chicago, Ill., EUA) e incubadas por três a cinco dias no escuro ou luz a 25° C. 3.3.4 MÉTODO C: MERISTEMA AXILAR PROPAGADO

[0183] Para a preparação do explante de meristema axilar propagado foram usadas plântulas propagadas com 3 a 4 semanas. Os explantes de meristema axilar podem ser pré-preparados a partir do primeiro até o quarto nó. Uma média de três a quatro explantes puderam ser obtidos a partir de cada muda. Os explantes foram preparados a partir de plântulas cortando-se 0,5 a 1,0 cm abaixo do nó axilar no internó e removendo-se o pecíolo e a folha do explante. A ponta onde fica o meristema axillar foi cortado com um bisturi para induzir novamente o crescimento do broto e permitir acesso às células alvo para Agrobacterium. Portanto, um explante de 0,5 cm incluíu o caule e a gema.

[0184] Uma vez cortado, os explantes foram imediatamente colocados na suspensão de Agrobacterium por 20 a 30 minutos. Após a inoculação, os explantes foram borrados sobre papel de filtro estéril para remover o excesso de cultura de Agrobacterium, depois colocados quase completamente imersos em CCM sólido ou no topo de um papel de filtro redondo com 7 cm sobrepondo o CCM sólido, dependendo da linhagem de Agrobacterium. Este papel de filtro previne o crescimento excessivo de Agrobacterium nos explantes de soja. As placas foram embrulhadas com Parafilm.TM “M” (American National Can, Chicago, IL., EUA) e incubadas por dois a três dias no escuro a 25° C. 3.4 - INDUÇÃO DE BROTO

[0185] Depois de 3 a 5 dias de co-cultivo no escuro a 25° C., os explantes foram enxaguados em meio SIM líquido (para remover o excesso de Agrobacterium) (SIM, consulte Olhoft et al 2007 A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soyusing primary-node explants from seedlings In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant (2007) 43:536-549) ou meio de Modwash (1X sais principais B5, 1X sais secundários B5, 1X ferro MSIII, Sacarose 3%, 1X vitaminas B5, 30 mM de MES, 350 mg/L de TimentinTM pH 5,6, documento WO 2005/121345) e borrado a para seco em papel de filtro estéril (prevenir dano, especialmente na lâmina) antes de serem colocados no meio sólido SIM. Aproximadamente 5 explantes (Método A) ou 10 a 20 explantes (Métodos B e C) foram colocados de modo que o tecido alvo estivesse em contato direto com o meio. Durante as primeiras 2 semanas, oe explantes podiam ser cultivado com ou sem meio seletivo. Preferencialmente, os explantes foram transferidos sobre SIM sem seleção por uma semana.

[0186] Para explantes de folha (Método B), o explante deve ser colocado no meio de modo que esteja perpendicular à superfície do meio com o pecíolo embebido no meio e a lâmina para fora do meio.

[0187] Para o meristema axilar propagado (Método C), o explante foi colocado no meio de modo que ficasse paralelo à superfície do meio (em direção à base) com o explante parcialmente embebido no meio.

[0188] As placas embrulhadas com fita adesiva 394 (3M, St. Paul, Minn., EUA) foram colocadas em uma câmara de crescimento por duas semanas com uma temperatura variando em média 25° C mediante ciclo de 18 h de luz/6h de escuro a 70-100 .mu.E/m.sup.2s. Os explantes permaneceram no meio SIM com ou sem seleção até que o crescimento de novos brotos ocorreu novamente na área alvo (por exemplo, meristemas no primeiro nó acima do epicótilo). As transferências para o meio fresco podem ocorrer durante esse tempo. Os explantes foram transferidos do SIM com ou sem seleção para SIM com seleção após cerca de uma semana. Desta vez, havia considerável novo desenvolvimento de broto na base do pecíolo dos explantes de folha em uma variedade de SIM (Método B), no nó primário para explantes de muda (Método A), e nos nós axilares de explantes propagados (Método C).

[0189] Preferencialmente, todos os brotos formados antes da transformação foram removidos até 2 semanas após o co-cultivo para estimular novo crescimento dos meristemas. Isso ajudou a reduzir quimerismo no transformante primário e aumento de amplificação de células meristemáticas transgênicas. Durante este tempo o explante pode ou não pode ser cortado em pedaços menores (isto é, destar o nó do explante por corte do epicótilo). 3.5 - ALONGAMENTO DO BROTO

[0190] Depois que 2 a 4 semanas (ou até que uma massa de brotos fosse formada) no meio SIM (preferencialmente com seleção), os explantes foram transferidos para meio SEM (meio de alongamento de broto, consulte Olhoft et al 2007 A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soy using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant (2007) 43:536-549) que estimula o alongamento de broto do primórdio de broto. Este meio pode ou não pode conter um composto de seleção.

[0191] Após cada 2 a 3 semanas, os explantes foram transferidos para o meio fresco SEM fresco (preferencialmente contendo seleção) após remover cuidadosamente o tecido morto. Os explantes devem permanecer unidos e não fragmentado em pedaços, e mantidos saudáveis de alguma forma. Os explantes continuaram a ser transferidos até que o explante morresse ou os brotos se alongassem. Os brotos que alongaram >3 cm foram removidos e foram colocados em meio RM por cerca de 1 semana (Método A e B), ou cerca de 2 a 4 semanas dependendo do cultivar (Método C), nesse período as raízes começaram a se formar. No caso de explantes com raízes, eles foram transferidos diretamente para o solo. Brotos enraizados foram transferidos para o solo e endurecidos em uma câmara de crescimento por 2 a 3 semanas antes de serem transferidos para a estufa. Plantas regeneradas obtidas com o uso deste método eram férteis e produziram uma média de 500 sementes por planta.

[0192] A expressão temporária do constructo da invenção após 5 dias de co-cultivo com Agrobacterium tumefaciens foi difundida nos explantes de meristema axilar das mudas, especialmente nas regiões de ferimento durante a preparação do explante (Método A). Os explantes foram colocados no meio de indução de brotos sem seleção para observar como os nós principais respondem à indução de brotos e regeneração. Até agora, mais de 70% dos explantes formaram novos brotos nessa região. A expressão do constructo da invenção era estável depois de 14 dias em SIM, implicando integração do T-DNA no genoma de soja. Além disso, experimentos preliminares resultaram na formação de brotos positivos que expressam o constructo da invenção que se formaram após 3 semanas no SIM.

[0193] Para o Método C, o tempo médio de regeneração de uma planta de soja com o uso do protocolo de meristema axilar propagado foi de 14 semanas a partir da inoculação do explante. Portanto, este método tem um tempo rápido de regeneração que leva a plantas de soja férteis e saudáveis. EXEMPLO 4 ENSAIO DE PATÓGENO 4.1. RECUPERAÇÃO DE CLONES

[0194] 2 a 3 clones por evento T0 foram plantados vasos pequenos de 6cm. Para recuperação, os clones foram mantidos por 12 a 18 dias em estufa (foram cultivadas em ritmo de 16h-dia e 8h-noite a uma temperatura de 16° bis 22°C e umidade de 75%). 4.2 INOCULAÇÃO

[0195] O fungo da ferrugem é um isolado selvagem do Brasil. As plantas foram inoculadas com P.pachyrhizi.

[0196] A fim de se obter material de esporos apropriados para a inoculação, as folhas de soja que foram infectadas com ferrugem entre 15 a 20 dias anteriores, foram tiradas de 2 a 3 dias antes da inoculação e transferidas para placas de ágar (1% de agar em H2O). As folhas foram colocadas com o seu lado superior sobre o ágar, o que permitiu que o fungo crescesse através do tecido e produzisse esporos muito jovens. Para a solução de inoculação, os esporos foram removidos das folhas e foram adicionados a uma solução de Tween-H2O. A contagem de esporos foi realizada com um microscópio de luz, por meio de uma câmara de contagem Thoma. Para a inoculação das plantas, a suspensão de esporos foi adicionada a um frasco de pulverização operado com ar comprimido e aplicada uniformemente sobre as plantas ou nas folhas, até que a superfície da folha estivesse bem úmida. Para os ensaios macroscópicos nós usamos uma densidade de esporos de 1- 5x105 esporos/ml. Para os ensaios microscópicos é usada uma densidade de esporos >5 x 105 esporos/ml. As plantas inoculadas foram colocadas durante 24 horas em uma câmara de estufa com uma média de 22°C e > 90% de umidade do ar. A cultura a seguir foi realizada em uma câmara com uma média de 25°C e 70% de umidade no ar. EXEMPLO 5 SELEÇÃO MICROSCÓPICA

[0197] Para a valiação do desenvolvimento do patógeno, as folhas de plantas inoculadas foram coradas com anilina azul 48 horas após a infecção.

[0198] A anilina azul que cora serve para a detecção de substâncias fluorescentes. Durante as reações de defesa nas interações de hospedeiro e interações de não hospedeiro, substâncias como fenois, calose ou lignina se acumularam ou foram produzidas e foram incorporadas na parede celular tanto localmente na papila como na célula inteira (reação hipersensível, HR). Os complexos foram formados em associação com anilina azul que leva, por exemplo no caso de calose, à fluorescência amarela. O material foliar foi transferido para tubos falcon ou pratos contendo solução descolorante II (etanol/ácido acético 6/1) e foi incubado em banho maria a 90°C por 10 a 15 minutos. A solução descolorante II foi removida imediatamente depois, e as folhas foram lavadas 2x com água. Para coloração, as folhas foram incubadas por 1,5 a 2 horas em solução corante II (anilina azul 0,05% = azul de metila, difosfato de hidrogênio potássio 0,067 M) e analisadas por microscopia imediatamente depois.

[0199] Os tipos diferentes de interação foram avaliados (contados) por microscopia. Um microscópio BX61 Olympus UV (luz incidente) e um filtro UV Longpath (excitação: 375/15, divisor de feixe: 405 LP) são usados. Após coloração com anilina azul, os esporos apareceram azuis mediante luz UV. A papila pode ser reconhecida debaixo do apressório fúngico por uma coloração verde/amarelo. A reação hipersensível (HR) foi caracterizada por uma fluorescência celular inteira. EXEMPLO 6 AVALIAÇÃO DA SUSCEPTIBILIDADE À FERRUGEM DA SOJA

[0200] A progressão da doença de ferrugem da soja foi avaliada pela estimativa da área doente (área que foi coberta por uredinia esporulante) na parte traseira (lado abaxial) da folha. Adicionalmente, o amarelamento da folha foi levado em conta. (para esquema consulte Figura 2) 6.1 SUPEREXPRESSÃO DE ERF-1

[0201] Plantas de soja T0 que expressam proteína ERF-1 foram inoculadas com esporos de Phakopsora pachyrhizi. Os sintomas de doença macroscópica de soja contra P. pachyrhizi de 31 plantas de soja T0 foram avaliados 14 dias após a inoculação.

[0202] A média da porcentagem da área de folha mostrando colônias de fungos ou amarelado/acastanhado forte em todas as folhas foi considerada como área de folha doente. Todas as 31 plantas T0 de soja que expressam ERF-1 (expressão verificada por RT-PCR) foram avaliadas em paralelo a plantas de controle não transgênicas. Os clones de plantas de soja não transgênica foram usados como controle. A mediana da área de folha doente é mostrada na Figura 5 para plantas que expressam ERF-1 em comparação com plantas tipo selvagem. . A superexpressão de ERF-1 reduz a área de folha doente em comparação a plantas de controle não transgênicas em 40%. Estes dados claramente indicam que na expressão de plantas do constructo de vetor de expressão de ERF-1 leva a um escore menor da doença de plantas transgênicas em comparação com controles não transgênicos. Então, a expressão de ERF-1 e, portanto, o priming da via de sinalização de etileno na soja aumenta a resistência da soja contra a ferrugem da soja. 6.2 SUPEREXPRESSÃO DE ATI-4

[0203] As plantas de soja T0 que expressam proteína Pti-4 foram inoculadas com esporos de Phakopsora pachyrhizi. Os sintomas de doença macroscópica de soja contra P. pachyrhizi de 33 plantas de soja T0 foram avaliados 14 dias após a inoculação.

[0204] A média da porcentagem da área de folha mostrando colônias de fungos ou amarelado/acastanhado forte em todas as folhas foi considerada como área de folha doente. Todas as 31 plantas T0 de soja que expressam Pti-4 (expressão verificado por RT-PCR) foram avaliadas em paralelo a plantas de controle não transgênicas. Os clones de plantas de soja não transgênica foram usados como controle. A mediana da área de folha doente é mostrada na Figura 8 para plantas que expressam Pti-4 em comparação com plantas tipo selvagem. A superexpressão de Pti-4 reduz a área de folha doente em comparação a plantas de controle não transgênicas em 28%. Estes dados claramente indicam que na expressão de plantas do constructo de vetor de expressão de Pti-4 leva a um escore menor da doença de plantas transgênicas em comparação com controles não transgênicos. Então, a expressão de Pti-4 e, portanto, o priming da via de sinalização de etileno na soja melhora a resistência da soja contra a ferrugem da soja. 6.3 SUPEREXPRESSÃO DE PTI-5

[0205] As plantas de soja T0 que expressam proteína Pti-5 foram inoculadas com esporos de Phakopsora pachyrhizi. Os sintomas de doença macroscópica de soja contra P. pachyrhizi de 34 plantas de soja T0 foram avaliados 14 dias após a inoculação.

[0206] A média da porcentagem da área de folha mostrando colônias de fungos ou amarelado/acastanhado forte em todas as folhas foi considerada como área de folha doente. Todas as 34 plantas T0 de soja que expressam Pti-5 (expressão verificado por RT-PCR) foram avaliadas em paralelo a plantas de controle não transgênicas. Os clones de plantas de soja não transgênica foram usados como controle. A mediana da área de folha doente é mostrada na Figura 11 para plantas que expressam Pti-5 em comparação com plantas tipo selvagem. A superexpressão de Pti- 5 reduz a área de folha doente em comparação a plantas de controle não transgênicas em 43%. Estes dados claramente indicam que na expressão de plantas do constructo de vetor de expressão de Pti-4 leva a um escore menor da doença de plantas transgênicas em comparação com controles não transgênicos. Então, a expressão de Pti-4 e, portanto, o priming da via de sinalização de etileno na soja aumenta a resistência da soja contra a ferrugem da soja. 6.4 SUPEREXPRESSÃO DE ERF-2

[0207] Plantas de soja T0 que expressam proteína ERF-2 foram inoculadas com esporos de Phakopsora pachyrhizi. Os sintomas de doença macroscópica de soja contra P. pachyrhizi de 29 plantas de soja T0 foram avaliados 14 dias após a inoculação.

[0208] A média da porcentagem da área de folha mostrando colônias de fungos ou amarelado/acastanhado forte em todas as folhas foi considerada como área de folha doente. Todas as 29 plantas T0 de soja que expressam ERF-2 (expressão verificada por RT-PCR) foram avaliadas em paralelo a plantas de controle não transgênicas. Os clones de plantas de soja não transgênica foram usados como controle. A mediana da área de folha doente é mostrada na Figura 14 para plantas que expressam ERF-2 em comparação com plantas tipo selvagem. A superexpressão de ERF-2 reduz a área de folha doente em comparação a plantas de controle não transgênicas em 45%. Estes dados claramente indicam que na expressão de plantas do constructo de vetor de expressão de ERF-2 leva a um escore menor da doença de plantas transgênicas em comparação com controles não transgênicos. Então, a expressão de ERF-2 e, portanto, o priming da via de sinalização de etileno na soja aumenta a resistência da soja contra a ferrugem da soja. 6.5 SUPEREXPRESSÃO DAS ENZIMAS CTR-1 E EBF-1 DE INIBIÇÃO DA VIA DE ET

[0209] As plantas de soja T0 que expressam proteínas CTR-1 e EBF-1 que inibem a via de ET foram inoculadas com esporos de Phakopsora pachyrhizi. Os sintomas de doença macroscópica de soja contra P. pachyrhizi de 27, respectivamente 28 plantas de soja T0 foram avaliadas 14 dias após a inoculação.

[0210] A média da porcentagem da área de folha mostrando colônias de fungos ou amarelado/acastanhado forte em todas as folhas foi considerada como área de folha doente. Todas as 27 plantas de soja T0 que superexpressam CTR-1 e 28 plantas de soja T0 que superexpressam EBF-1 foram avaliadas em paralelo a plantas não transgênicas de controle. Os clones de plantas de soja não transgênica foram usados como controle. A superexpressão das proteínas CTR-1 e EBF-1 de inibição da via de sinalização de etileno aumenta a área de folha doente em comparação a plantas de controle não transgênicas. Estes dados claramente indicam que inibição em planta da via de ET leva a um escore menor da doença de plantas transgênicas em comparação com controles não transgênicos. Então, a inibição da via de sinalização de etileno na soja reduz a resistência da soja contra ferrugem da soja. 6.6 PRIMING DA VIA DE SINALIZANDO DE ETILENO PELA INIBIÇÃO DE ENZIMAS CTR-1 POR RNAI

[0211] Quatro conjuntos de plantas de soja transgênica T0 que expressam constructos de RNAi que direcionam GmCTR1a (SEQ ID 13), GmCTR1b (SEQ ID 15) ou GmCTR1c (SEQ ID 17) são produzidos individualmente ou todos os três genes homólogos respectivamente. Os constructos de RNAi são sintetizados e subsequentemente clonados em vetores de transformação sob o controle de promotores constitutivos, induzíveis por patógeno, específicos de folha e/ou de epiderme. Os constructos de RNAi são SEQ ID 25, que direcionam GmCTR1a, SEQ ID 26 que direcionam GmCTR1b, SEQ ID 27 que direcionam GmCTR1c e SEQ ID28 que direcionam GmCTR1 a, b e c.

[0212] As plantas transgênicas são analisadas por RTqPCR quanto à infrarregulação dos respectivos gene(s). Plantas que mostram forte repressão da expressão of CTR1 são inoculadas com esporos de Phakopsora pachyrhizi. Os sintomas de doença macroscópica de soja contra P. pachyrhizi de até 30 plantas de soja T0 por constructo são avaliados 14 dias após a inoculação.

[0213] A média da porcentagem da área de folha mostrando colônias fúngicas ou forte amarelamento/acastanhado em todas as folhas é considerada como área de folha doente. Todo as plantas de soja T0 que exibem repressão de CTR1a, b ou c ou CTR1 a e b e c são avaliadas em paralelo a plantas de controle não transgênicas. Os clones de plantas de soja não transgênica são usados como controle. A repressão da expressão de CTR1 reduz significativamente a área de folha doente em comparação a plantas de controle não transgênicas. A repressão da expressão de CTR1 e, portanto, o priming da via de sinalização de etileno na soja aumenta a resistência da soja contra a ferrugem da soja. 6.7 PRIMING DA VIA DE SINALIZAÇÃO DE ETILENO PELA INIBIÇÃO DE ENZIMAS CTR-1 PELA EXPRESSÃO DE MICRORNA

[0214] Plantas transgênicas de soja T0 que expressam um precursor de microRNA recombinante que compreende um microRNA que direciona todos os três genes homólogos GmCTR1a (SEQ ID 13), GmCTR1b (SEQ ID 15) e GmCTR1c (SEQ ID 17) são produzidas. O precursor de RNAi é sintetizado e subsequentemente clonado em vetores de transformação sob o controle de promotores constitutivos, induzíveis por patógeno, específicos de folha e/ou de epiderme. O precursor de microRNA é mostrado na SEQ ID 33.

[0215] As plantas transgênicas são analisadas por RTqPCR para infrarregulação dos homólogos de CTR1. Plantas que mostram forte repressão da expressão of CTR1 são inoculadas com esporos de Phakopsora pachyrhizi. Os sintomas de doença macroscópica de soja contra P. pachyrhizi de até 30 plantas de soja T0 são avaliados 14 dias após a inoculação.

[0216] A média da porcentagem da área de folha mostrando colônias fúngicas ou forte amarelamento/acastanhado em todas as folhas é considerada como área de folha doente. Todas as plantas de soja T0 que exibem repressão de CTR1 são avaliadas em paralelo às plantas não transgênicas de controle. Os clones de plantas de soja não transgênica são usados como controle. A repressão da expressão de CTR1 reduz significativamente a área de folha doente em comparação a plantas de controle não transgênicas. A repressão da expressão de CTR1 e, portanto, o priming da via de sinalização de etileno na soja aumenta a resistência da soja contra a ferrugem da soja. 6.8 PRIMING DA VIA DE SINALIZAÇÃO DE ETILENO PELA INIBIÇÃO DE ENZIMAS EBF-1 POR RNAI

[0217] Três conjuntos de plantas de soja transgênica T0 que expressam constructos de RNAi que direcionam GmEBF1a são produzidos individualmente, GmEBF1a (SEQ ID 19), GmEBF1b (SEQ ID 21) ou GmEBF1c (SEQ ID 23). Os constructos de RNAi são sintetizados e subsequentemente clonados em vetores de transformação sob o controle de promotores específicos de epiderme, constitutivos, induzíveis por patógeno, específicos de folha e/ou de epiderme. Os constructos de RNAi são SEQ ID 29, que direcionam GmEBF1a, SEQ ID 30 que direcionam GmEBF1b, SEQ ID 31.

[0218] As plantas transgênicas são analisadas por RTqPCR quanto à infrarregulação dos respectivos gene(s). Plantas que mostram forte repressão da expressão do respectivo gene GmEBF1 são inoculadas com esporos de Phakopsora pachyrhizi. Os sintomas de doença macroscópica de soja contra P. pachyrhizi de até 30 plantas de soja T0 por constructo são avaliados 14 dias após a inoculação.

[0219] A média da porcentagem da área de folha mostrando colônias fúngicas ou forte amarelamento/acastanhado em todas as folhas é considerada como área de folha doente. Todas as plantas de soja T0 que exibem repressão de EBF1a, b ou c respectivamente são avaliadas em paralelo a plantas de controle não transgênicas. Os clones de plantas de soja não transgênica são usados como controle. A repressão da expressão de EBF1 reduz significativamente a área de folha doente em comparação a plantas de controle não transgênicas. A repressão da expressão de EBF1 e, portanto, o priming da via de sinalização de etileno na soja aumenta a resistência da soja contra a ferrugem da soja. 6.9 PRIMING DA VIA DE SINALIZAÇÃO DE ETILENO PELA INIBIÇÃO DE ENZIMAS EBF-1 PELA EXPRESSÃO DE MICRORNA

[0220] Plantas transgênicas de soja T0 que expressamr um precursor de microRNA recombinante que compreende um microRNA que direciona todos os três genes homólogos GmEBF1a (SEQ ID 19), GmEBF1b (SEQ ID 21) e GmEBF1c (SEQ ID 23) são produzidas. O precursor de RNAi é sintetizado e subsequentemente clonado em vetores de transformação sob o controle de promotores constitutivos, induzíveis por patógeno, específicos de folha e/ou de epiderme. O precursor de microRNA é mostrado na SEQ ID 32.

[0221] As plantas transgênicas são analisadas por RTqPCR para infrarregulação dos homólogos de EBF1. Plantas que mostram forte repressão da expressão of EBF1 são inoculadas com esporos de Phakopsora pachyrhizi. Os sintomas de doença macroscópica de soja contra P. pachyrhizi de até 30 plantas de soja T0 são avaliados 14 dias após a inoculação.

[0222] A média da porcentagem da área de folha mostrando colônias fúngicas ou forte amarelamento/acastanhado em todas as folhas é considerada como área de folha doente. Todas as plantas de soja T0 que exibem repressão de EBF1 são avaliadas em paralelo às plantas não transgênicas de controle. Os clones de plantas de soja não transgênica são usados como controle. A repressão da expressão de EBF1 reduz significativamente a área de folha doente em comparação a plantas de controle não transgênicas. A repressão da expressão de EBF1 e, portanto, o priming da via de sinalização de etileno na soja aumenta a resistência da soja contra a ferrugem da soja. 1/1

Claims (5)

1. MÉTODO PARA AUMENTAR A RESISTÊNCIA A FERRUGEM DE SOJA PHACOSPORACEA EM PLANTAS DE SOJA, caracterizado por compreender a etapa de expressão de uma proteína de SEQ ID NO: 6 nas células das plantas.

2. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA DE SOJA QUE TEM RESISTÊNCIA AUMENTADA CONTRA FERRUGEM DE SOJA PHACOSPORACEA, caracterizado por compreender: a) transformar a célula vegetal com um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico recombinante, em que o ácido nucleico recombinante de SEQ ID NO:5 codifica uma proteína de SEQ ID NO: 6 ligado de maneira funcional com um promotor; b) regenerar uma planta a partir da dita célula vegetal transformada.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo promotor ser um promotor constitutivo, induzível por patógeno, promotor específico de mesófilo e/ou promotor específico de epiderme.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela ferrugem de soja Phacosporacea ser causada por Phakopsora meibomiae e/ou Phakopsora pachyrhizi.

5. VETOR DE TRANSFORMAÇÃO, caracterizado por compreender um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico recombinante, em que o ácido nucleico recombinante de SEQ ID NO: 5 codifica uma proteína de SEQ ID NO: 6 ligado de maneira funcional com um promotor.

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