BR112013023010B1 - Polipeptídeo isolado, ácido nucleico isolado que codifica o polipeptídeo, vetor de expressão, processo para a produção de um polipeptídeo isolado e composição farmacêutica compreendendo o polipeptídeo - Google Patents

Polipeptídeo isolado, ácido nucleico isolado que codifica o polipeptídeo, vetor de expressão, processo para a produção de um polipeptídeo isolado e composição farmacêutica compreendendo o polipeptídeo Download PDF

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Abstract

FUSÃO DE PROTEÍNA NPP1 ISOLADA; ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO; VETOR DE EXPRESSÃO OU REPLICAÇÃO; CÉLULA HOSPEDEIRA; E ANIMAL TRANSGÊNICO. Trata-se de um polipeptídeo de fusão inovador que contém um domínio catalítico de NPP1 fundido a uma porção química de alvejamento, ácidos nucleicos que codificam o polipeptídeo de fusão, um vetor que contêm o ácido nucleico integrado ao mesmo, uma célula hospedeira transformada com o vetor e composições farmacêuticas que compreendem o polipeptídeo de fusão.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica o benefício do documento PCT/US2011/028233, depositado em 11 de março de 2011, que reivindica o benefício do Pedido Provisório sob No U.S. 61/340.066, depositado em 12 de março de 2010. Todos os ensinamentos do pedido acima são incorporados ao presente documento a título de referência.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Ectonucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase 1 (NPP1/ENPP1/PC-1) é uma glicoproteína de transmembrana do tipo II que forma um homodímero. A proteína cliva uma variedade de substratos, incluindo a ligação de fosfodiéster de nucleotídeos e açúcares de nucleotídeo e ligações de pirofosfato de nucleotídeos e açúcares de nucleotídeo. A proteína de NPP1 funciona para hidrolisar nucleosídeo 5’ trifosfatase a monofosfatos correspondentes e também hidrolisa polifosfatos de diadenosina. As mutações no gene de NPP1 foram associadas à calcificação arterial infantil idiopática (IIAC), resistência à insulina, raquitismo hipofosfatêmico e ossificação do ligamento longitudinal posterior da espinha. IIAC, um distúrbio raro autossômico recessivo e quase sempre fatal, é caracterizada pela calcificação da lâmina elástica interna de artérias musculares e estenose devido à proliferação miointimal. Existem mais que 160 casos de IIAC que foram relatados mundialmente. Os sintomas da doença aparecem com mais frequência no início da infância e a doença é letal aos 6 meses de idade, geralmente por conta da cardiomiopatia isquêmica e outras complicações de arteriopatia obstrutiva que incluem estenose de artéria renal. Em mais de uma dúzia de casos relatados de IIAC, 5 calcificações periarticulares de juntas grandes também se desenvolveram na infância. Rutsch et ai. (2003) relatou que as mutações no ENPP1 estão associadas à IIAC caracterizada pelas calcificações aórticas e periarticulares espontâneas nos primeiros anos de vida e diminuição sistêmica de 10 atividade de pirofosfatase/fosfodiesterase de nucleotideo nos individuos afetados.
Embora defeitos na proteina de NPP1 tenham sido implicados nessa doença séria como IIAC, não existe tratamento disponível na técnica para aqueles que foram 15 afetados pela. Portanto, uma necessidade desesperadora existe para um medicamento, formulação e composição segura e eficaz para o tratamento de IIAC, resistência à insulina, raquitismo hipofosfatêmico e ossificação do ligamento longitudinal posterior da espinha.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção inclui proteínas de fusão de domínios truncados de NPP1 (isto é, um componente de NPP1) fundidas a uma porção química de alvejamento. A porção química de alvejamento funciona para acentuar a eficácia no 25 alvejamento da proteina de fusão de NPP1 para uma importância biológica ou clinica de sitio (por exemplo, sitio de calcificação em um indivíduo que precisa de diminuição de calcificação). Sem desejar limitar a invenção a qualquer mecanismo de operação ou teoria particular acredita-se que o 30 componente de NPP1 funciona para inibir a calcificação acentuando-se a formação de pirofosfato (PPi) e/ou clivando- se pirofosfato para produzir fosfato solúvel (Pi) e/ou aumentando-se a disponibilidade de monofosfato de adenosina (AMP) e/ou adenosina. Contempla—se que a porção química de alvejamento pode ser fixada ao N-terminal e/ou ao C-terminal do componente de NPP1 em qualquer posição útil. Adicionalmente, a proteína de fusão de NPP1 revelada no 5 presente documento também pode incluir um ou mais dentre fragmento de Fc, PEG, ligante de polipeptídeo ou outros polipeptídeos adicionais para acentuar o alvejamento, estabilidade ou atividade enzimática.
As proteínas de fusão da invenção podem ser usadas 10 para tratar uma variedade ampla de condições em um indivíduo.
Qualquer condição que pode ser tratada de forma benéfica através da administração de uma proteína de fusão da invenção é incluída dentro do escopo da invenção. Por exemplo, o tratamento de condições que pode ser aprimorado reduzindo 15 e/ou eliminando-se uma ou mais estruturas de calcificação e/ou evitando que estruturas de calcificação se formem em um indivíduo tal como um mamífero, por exemplo, um paciente humano está dentro do escopo da invenção. As condições tal como bloqueio arterial são contempladas para tratamento 20 empregando-se proteínas de fusão da invenção. Em uma modalidade particularmente útil, a condição a ser tratada é calcificação arterial generalizada infantil também denominada calcificação arterial idiopática infantil e calcificação de meio arterial infantil. As condições tal como resistência à 25 insulina, raquitismo hipofosfatêmico e ossificação do ligamento longitudinal posterior da espinha também são contemplados para o tratamento.
As proteínas de fusão da invenção podem ser produzidas em qualquer sistema de expressão de proteína útil 30 que inclui, sem limitação, cultura celular (por exemplo, células CHO, células COS, células HEK203), bactérias tal como Escherichia coli (E. coli) e animais transgênicos, que incluem, sem limitação, mamíferos e aves (por exemplo, galinhas, codornas, patos e perus).
A fabricação de composições farmacêuticas (ou formulações farmacêuticas) é bem conhecida na técnica e essas composições farmacêuticas são contempladas para uso de acordo com as proteínas de fusão da invenção.
Geralmente, a dosagem de proteína de fusão administrada a um indivíduo irá variar dependendo de fatores conhecidos tal como idade, saúde e peso do recipiente, tipo <de tratamento concorrente, frequência do tratamento e similares. Geralmente, uma dosagem de ingrediente ativo (isto é, proteína de fusão) pode estar entre cerca de 0,0001 e cerca de 50 miligramas por quilograma de peso corporal. A dosagem precisa, frequência de administração e intervalo de tempo tratamento podem ser determinados por um médico versado na técnica de administração de proteínas terapêuticas.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A Figura 1 é uma representação esquemática de um vetor de expressão (isto é, pTT22) que contém um construto de TAGsNPPl. A porção química de alvejamento de oito resíduos de ácido aspártico consecutivos é fundida ao C-terminal do sNPPl.
A Figura 2 ilustra a análise por Western blot do TAGsNPPl. Condição de redução; NR, Condição sem redução.
A Figura 3 demonstra a atividade enzimática de TAGsNPPl produzida e isolada da células HEK293.
As Figuras 4A a 4C ilustram esquemáticos de construtos de proteína de fusão de TAGNPP1 descrito no presente documento.
A Figura 5 demonstra níveis de calcificação de células de músculo liso aórtico humano tratadas com sNPPl solúvel (WT), TAGsNPPl (D8 fundido a C-terminal de sNPPl) e sNPPl-Fc.
A Figura 6 retrata uma representação esquemática de um vetor de expressão (isto é, pTT22) que contém um construto de TAGsNPPl. A porção química de alvejamento de oito resíduos de ácido aspártico consecutivos (D8) é fundida ao C-terminal do sNPPl.
A Figura 7 retrata uma representação esquemática de um vetor de expressão (isto é, pTT22) que contém um construto de fusão de sNPPl-Fc.
DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
SEQ ID NO 1: sequência de aminoácidos da proteína de NPP1 do tipo selvagem. As regiões transmembranares e citossólicas, os sítios de N-glicosilação potencial e o PSCAKE (prolina, serina, cisteína, alanina, lisina e ác. glutâmico),que é o início de NPP1 solúvel que inclui a região rica em cisteína, estão indicados.
SEQ ID NO 2: sequência de aminoácidos do(s) domínio (s) catalítico (s) de proteína de NPP1 que não tem porção química alvo fixa ("sssNPPl"). A sequência N-terminal do domínio truncado solúvel NPP1 e os sítios de N- glicosilação estão identificados.
SEQ ID NO 3: sequência de aminoácidos de TAGsssNPPl. A porção química de alvejamento de oito resíduos de ácido aspártico consecutivos é fundida ao N-terminal do sssNPPl. O peptídeo sinal e a porção química de alvejamento estão indicados.
SEQ ID NO 4: sequência de aminoácidos de TAGsssNPPl que contém a porção química de alvejamento de dez resíduos de ácido aspártico consecutivos fundida ao C- terminal do sssNPPl. O peptídeo sinal é sublinhado e a porção química de alvejamento é indicada em negrito.
SEQ ID NO 5: sequência de ácidos nucleicos de proteína de fusão de TAGssNPPl. A porção química de alvejamento de oito resíduos de ácido aspártico consecutivos é fundida ao N-terminal do ssNPPl.
SEQ ID NO 6: sequência de aminoácidos de proteína de fusão de TAGssNPPl. A porção química de alvejamento de oito resíduos de ácido aspártico consecutivos é fundida ao N- terminal do ssNPPl. O peptídeo sinal e a porção química de alvejamento estão indicados .
SEQ ID NO 7: sequência de ácidos nucleicos de ssNPPl.
SEQ ID NO 8: sequência de aminoácidos de ssNPPl. O peptídeo sinal está indicado.
SEQ ID NO 9: sequência de ácidos nucleicos de sNPPl.
SEQ ID NO 10: sequência de aminoácidos de sNPPl. O peptídeo sinal está indicado.
SEQ ID NO 11: sequência de ácidos nucleicos de TAGsNPPl. A porção química de alvejamento de oito resíduos de ácido aspártico consecutivos é fundida ao N-terminal do sNPPl.
SEQ ID NO 12: sequência de aminoácidos de TAGsNPPl. A porção química de alvejamento de oito resíduos de ácido aspártico consecutivos é fundida ao N-terminal do ssNPPl. O peptídeo sinal é sublinhado e a porção química de alvejamento estão indicados .
SEQ ID NO 13: sequência de ácidos nucleicos de TAGsNPPl. A porção química de alvejamento de oito resíduos de ácido aspártico consecutivos é fundida ao C-terminal do sNPPl.
SEQ ID NO 14: sequência de aminoácidos de TAGsNPPl. A porção química de alvejamento de oito resíduos de ácido aspártico consecutivos é fundida ao N-terminal do sNPPl. O peptídeo sinal e a porção química de alvejamento estão indicados.
SEQ ID NO 15: sequência de aminoácidos de um peptídeo ligante.
SEQ ID NO 16: sequência de aminoácidos de um segmento de Fc de imunoglobulina.
SEQ ID NO 17 : sequência de aminoácidos de TAGsssNPPl que contém a porção alvo de oito residues de ácido aspártico consecutivos fundida ao N-terminal do sssNPPl por meio de um ligante de peptideo. O segmento de Fc é fundido ao N-terminal da porção alvo. O peptideo sinal, a porção alvo e o peptideo ligante estão indicado.s.
SEQ ID NO 18 : sequência de aminoácidos de TAGsssNPPl que contém a porção alvo de oito resíduos de ácido aspártico consecutivos fundida ao C-terminal do sssNPPl por meio de um ligante de peptideo. O segmento de Fc é fundido ao N-terminal do sssNPPl. O peptideo sinal, a porção alvo e o peptideo ligante estão indicados. A SEQ ID NO 19: sequência de ácidos nucleicos de uma proteína de fusão de TAGsNPPl.
SEQ ID NO 20: sequência de aminoácidos de uma proteína de fusão de TAGsNPPl.
SEQ ID NO 21: sequência de ácidos nucleicos de uma proteína de fusão de sNPPl-Fc.
SEQ ID NO 22: sequência de aminoácidos de uma proteína de fusão de sNPPl-Fc.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece proteínas de fusão de NPP1 de humano inovadoras que são solúveis e contêm domínio(s) biologicamente ativo(s) e truncado(s) de NPP1 (isto é, componentes de NPP1 que contêm pelo menos um domínio catalítico extracelular de NPP1 de ocorrência natural para a atividade de pirofosfatase e/ou fosfodiesterase) e uma ou mais porções químicas de alvejamento (isto é, "TAG"). As proteínas de fusão de NPP1 da presente invenção compreendem pelo menos o domínio de NPP1 essencial para executar a atividade de pirofosfatase e/ou fosfodiesterase.
Consequentemente, a invenção apresenta proteínas de fusão isoladas que compreendem os resíduos de aminoácidos A205 a L591 da SEQ ID NO:1 fundidos a uma ou mais porções químicas de alvejamento. A porção química de alvejamento pode ser fundida de forma recombinante ou ligada quimicamente (por exemplo, ligação covalente, ligação iônica, ligação hidrofóbica e força de Van der Waals) ao componente de NPP1 através de métodos bem conhecidos na técnica e direciona o componente de NPP1 a um determinado sítio alvo em que o componente de NPP1 fixado terá um efeito desejável (por exemplo, catálise de uma reação tal como solubilização de um substrato tal como PPi ou prevenção da formação de um substrato tal como PPi) em um indivíduo para o qual a proteína de fusão da presente invenção é administrada.
TAGNPPls
Todas as proteínas de fusão de NPP1 ("TAGNPPls") da presente invenção têm os domínios transmembranares e citosólicos de N-terminal do NPP1 de humano de ocorrência natural removidos. Opcionalmente, as proteínas de fusão de TAGNPPls da presente invenção também podem conter a truncamento de C-terminal de NPP1 do tipo selvagem em vários comprimentos. A sequência de aminoácidos de NPP1 do tipo selvagem de comprimento completo é apresentada na SEQ ID NO: 1.
Em uma modalidade, a proteína de fusão contém um polipeptídeo que compreende os resíduos de aminoácidos A205 a L591 da SEQ ID NO:1 ("sssNPPl") fundidos a um TAG no N- terminal ou no C-terminal do polipeptídeo ("TAGsssNPPl"). Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo que compreende os resíduos de aminoácidos A205 a D925 da SEQ ID N0:l ("ssNPPl") fundidos a um TAG no N- terminal ou no C-terminal ("TAGssNPPl"). Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo que compreende os resíduos de aminoácidos P99 a D925 da SEQ ID NO:1 ("sNPPl") fundidos a um TAG ou no N- ou no C-terminal do polipeptideo ("TAGsNPPl"). Contempla-se também qualquer fragmento consecutivo de sNPPl que compreende pelo menos os resíduos de aminoácidos A205 a L591 da SEQ ID NO:1 e o fragmento de polipeptideo é fundido a um TAG no N-terminal ou no C-terminal.
Quando expressas em uma cultura celular ou animal transgênico, as proteínas de fusão de TAGNPP1 podem compreender adicionalmente um peptídeo sinal (ou sequência líder) em seu N-terminal. O peptídeo sinal direciona de forma pós-traducional ou co-traducional o transporte das proteínas de fusão de TAGNPP1 através das organelas subcelulares da célula que expressa as proteínas de fusão de TAGNPPT e, determinando através disso a modificação pós-traducional das proteínas de fusão de TAGNPP1. Deve ser compreendido que porque o peptídeo sinal é clivado no estágio pós-traducional ou co-traducional da proteína de fusão, as proteínas de fusão de TAGNNP1 são geralmente desprovidas do peptídeo sinal quando uma vez secretado e isolado. Consequentemente, nas modalidades que são direcionadas para as sequências de ácidos nucleicos que codificam as proteínas de fusão de TAGNPP1 são descritas, as sequências líder também são contempladas conforme usadas no presente invenção. Por exemplo, as sequência de nucleotídeos apresentadas na SEQ ID NO: 2 contêm um exemplo da sequência líder para TAGNNP1 em sua extremidade 5' .
Cada uma das proteínas de fusão revelada no presente documento é contemplada com uma ou mais porções químicas de alvejamento ("TAG"). 0 componente TAG de acordo com a presente invenção compreende quatro ou mais aminoácidos carregados negativamente tal como ácido aspártico e ácido glutâmico. O componente TAG pode ser um trecho de resíduos de aminoácidos carregados negativamente, por exemplo, ácidos aspárticos e/ou ácidos glutâmicos que são entre cerca de 4 e cerca de 20 resíduos de aminoácidos em comprimento. O TAG pode ser fundido ao N-terminal ou ao C-terminal do componente de NPP1. 0 TAG também pode ser fundido a ambos os N- e C- terminais do componente de NPP1. Consequentemente, a sequência de aminoácidos da proteína de fusão de TAGsNPPl, por exemplo, inclui PSCAKE através da extremidade de C- terminal do componente de NPP1 e uma ou mais porções químicas de alvejamento (por exemplo, etiqueta de ácido poliglutâmico ou etiqueta de ácido poliaspártico) na extremidade de N- e/ou C-terminal do componente de NPP1. A proteína de fusão que compreende o componente de NPP1 que tem o TAG fundido ao C- terminal é uma modalidade particularmente útil. Em uma modalidade muito específica, o TAG que tem um trecho de oito ácidos aspárticos é empregado conforme pode ser visto nas sequências exemplificativas para TAGsNPPl e TAGssNPPl nas sequências, de qualquer forma qualquer número útil de resíduos de aminoácidos carregados negativamente (por exemplo, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ou 18) pode ser usado de acordo com a invenção. 0 componente TAG é indicado como "A" nas Figuras 4A a 4C.
A invenção também engloba polinucleotídeos que codificam várias proteínas de fusão de TAGNPP1 descritas no presente documento. Consequentemente, qualquer sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos de qualquer proteína de fusão de TAGNPP1 pode ser usada para gerar moléculas recombinantes que expressam a correspondente proteína de fusão de TAGNPP1. Em uma modalidade particular, a invenção engloba o polinucleotídeo que compreende a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID N0:2.
Dentro de determinadas modalidades específicas, a proteína de fusão compreende múltiplos polipeptídeos conforme descrito no presente documento ou que compreende pelo menos um polipeptídeo conforme descrito no presente documento e uma sequência não relacionada. Determinado polipeptídeo preferencial pode, por exemplo, auxiliar na dimerização e estabilidade ou minimizar agregação das proteínas de fusão. Por exemplo, o polipeptídeo adicional pode ser a região Fc da imunoglobulina G1 para aumentar a estabilidade no soro. O uso do segmento de Fc é bem conhecido na técnica e descrito na Patente sob N- U.S. 7.902.151; e Patente sob N- U.S. 7.858.297, cujos ensinamentos inteiros são incorporados a título de referência no presente documento em sua totalidade. A região rica em cisteína de NPP1 do tipo selvagem (isto é, PSCAKE a NEPQCP; a sequência de aminoácidos de P99 a P204 da SEQ ID NO:1) pode ser empregada para facilitar a dimerização das proteínas de fusão de TAGNPP1.
Em outra modalidade, o polietileno glicol (PEG) pode ser conjugado para as proteínas de fusão de TAGNPP1. Outros polipeptídeos podem ser selecionados de modo a minimizar a agregação e imunogenicidade, para aumentar a solubilidade da proteína ou para habilitar a proteína para ser alvejada para sítios desejados de importância biológica ou clínica.
O TAGNPP1 também pode ser fundido ou conjugado a um ligante de polipeptídeo apropriado ou outra sequência para facilidade de identificação, síntese ou purificação da proteína de fusão ou para melhor preservar a estrutura nativa do componente de NPP1 que pode acentuar a atividade e alvejamento do TAGNPP1. Especificamente, uma sequência de ligante de peptídeo pode ser empregada para separar o primeiro e o segundo componentes de polipeptídeo por uma distância suficiente par assegurar que cada polipeptídeo dobre em suas estruturas secundária e terciária. Essa sequência de ligante de peptídeo é incorporada no interior da proteína de fusão entre o componente de NPP1 e o componente TAG com o uso de técnicas padrão bem conhecidas na técnica. As sequências de ligante de peptídeo podem ser escolhidas com base na sua capacidade de adotar uma conformação estendida flexível e seu inabilidade de adotar uma estrutura secundária que poderia interagir com a porção funcional no NPP1, TAG ou outros polipeptídeos secundários descritos no presente documento (por exemplo, Fc) . As sequências de ligante de peptídeo contêm resíduos de Gly, His, Asn e Ser. Os ligantes de peptídeo úteis incluem, sem limitação, poli-Gly, poli-His, poli-Asn ou poli-Ser. Outros aminoácidos quase neutros, tal como Thr e Ala também podem ser usados na sequência de ligante. As sequências de aminoácidos que podem ser empregadas completamente como ligantes incluem aquelas reveladas em Maratea et al., Gene 40:39 a 46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 83:8.258 a 8.262, 1986; Patente sob N- U.S. 4.935.233 e Patente sob N- U.S. 4.751.180. A sequência de ligante pode ter de 1 a cerca de 20 resíduos de aminoácidos de comprimento. Preferencialmente, o ligante de polipeptideo está entre cerca de 8 e cerca de 12 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade preferencial, o ligante de peptídeo usado na invenção é GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:15), embora qualquer combinação funcional de Gly, Ser, His ou Asn possa ser empregada.
As proteínas de fusão também podem compreender um TAGNPP1 da presente invenção junto com um polipeptideo não relacionado. Preferencialmente o polipeptideo não relacionado tem a capacidade de acentuar o alvejamento da proteína de fusão para o sítio de importância biológica ou clínica (por exemplo, sítio de calcificação). Por exemplo, os peptídeos que tem uma afinidade alta até o fim são descritos na Patente sob N- U.S. 7.323.542, cujos ensinamentos inteiros são incorporados no presente documento a título de referência.
O TAGNPP1 pode ser preparado com o uso de métodos padrão que incluem técnicas recombinantes ou conjugação química bem conhecida na técnica. As técnicas úteis para isolar e caracterizar os ácidos nucleicos isolados e as proteínas da presente invenção são bem conhecidas para aqueles indivíduos técnicos no assunto e biologia molecular padrão e manuais químicos podem ser consultados para selecionar protocolos adequados para uso sem experimentação indevida. Consulte, por exemplo, Sambrook et al, 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2- edição, Cold Spring Harbor, cujo conteúdo é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade. Brevemente, as sequências de DNA que codificam os componentes de polipeptídeo podem ser coletadas separadamente e ligadas a um vetor de expressão apropriado. Por exemplo, a extremidade 3' da sequência de DNA que codifica o componente de NPP1 é ligada, com ou sem um ligante de peptideo, à extremidade 5' de uma sequência de DNA que codifica o segundo componente de polipeptídeo tal como TAG, PEG ou Fc de modo que os quadros de leitura das sequências estejam na fase. Isso permite a tradução em uma única proteína de fusão que retém atividade biológica de ambos os componentes de polipeptídeo. As sequências de DNA ligadas são ligadas de forma operacional a elementos reguladores traducionais ou transcricionais adequados que incluem um promotor. Os elementos reguladores responsáveis pela expressão do DNA estão localizado somente 5' para a sequência de DNA que codifica o primeiro polipeptídeo tal como a sequência líder que codifica um peptideo sinal. De forma semelhante, os códons de parada requeridos para finalizar sinais de terminação de transcrição e tradução estão somente presentes 3' para a sequência de DNA que codifica o segundo polipeptídeo.
A invenção também engloba variantes de TAGNPP1.
Uma variante de TAGNPP1 preferencial é uma que tem 80%, 85%, 90%, 95% e com mais preferência 96% de identidade de sequência de aminoácidos para a sequência de aminoácidos A205 a L591 da SEQ ID NO:1. Uma variante de TAGNPP1 com máxima preferência é uma que tem pelo menos 97% de identidade de sequência de aminoácidos para a sequência de aminoácidos A205 a L591 da SEQ ID NO:1.
A invenção também se refere a sequências de polinucleotideos que compreendem o complemento da SEQ ID NO:2 ou variantes do mesmo. Adicionalmente, a presente invenção também apresenta sequências de polinucleotideos que hibridizam sob condições rigorosas para SEQ ID NO: 2 e cuja sequência antissenso é 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO:2. As condições de hibridização são baseadas na temperatura de fusão (Tm) da sonda ou complexo de ligação de ácido nucleico isolado, conforme ensinado em Wahl, G. M. e S. L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152:399 a 407) e Kimmel, A. R. (1987; Methods Enzymol. 152:507 a 511) e podem ser usadas e em uma rigorosidade definida.
A invenção contempla adicionalmente sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos, oligonucleotídeos, ácidos nucleicos isolados de peptídeo (PNA), fragmentos, porções ou moléculas antissenso dos mc srnos .
Embora as sequências de nucleotídeos que codificam TAGNPP1 e suas variantes tenham preferencialmente a capacidade de hibridizar para as sequência de nucleotídeos do TAGNPP1 sob condições de rigorosidade selecionadas de forma apropriada, pode ser vantajoso produzir sequência de nucleotídeos que codificam TAGNPP1 ou seus derivados que possuem um uso de códon substancialmente diferente. Os códons podem ser selecionados para aumentar a taxa em que a expressão do peptídeo ocorre em um hospedeiro eucariótico ou procariótico particular de acordo com a frequência com a qual os códons particulares são utilizados pelo hospedeiro. Outras razões para alterar substancialmente as sequência de nucleotideos que codificam TAGNPP1 e seus derivados sem alterar as sequências de aminoácidos codificadas incluem a produção de transcritos de RNA que têm propriedades mais desejáveis, tal como uma meia vida maior.
As sequências de ácidos nucleicos alteradas que codificam TAGNPP1 que são englobadas pela invenção incluem deleções, inserções ou substituições de nucleotideos diferentes que resultam em um polinucleotideo que codifica o mesmo ou um equivalente funcional de TAGNPP1. A proteina codifica também pode conter deleções, inserções ou substituições de residues de aminoácidos que produzem uma mudança silenciosa em um TAGNPP1 funcionalmente equivalente. Substituições de aminoácido deliberadas podem ser feitas com base na semelhança em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfipática dos residues desde que a atividade biológica de TAGNPP1 seja mantida. Por exemplo, residues de aminoácidos carregados positivamente incluem Lys e Arg; os residues de aminoácidos carregados negativamente incluem Asp e Glu; e aminoácidos com grupos principais polares não carregados que têm hidrofilicidade semelhante podem incluir Leu, Ile e Vai; Gly e Ala; Asp e Gin; Ser e Thr; Phe e Tyr.
VETOR DE EXPRESSÃO
Os métodos que são bem conhecidos por aqueles indivíduos técnicos no assunto podem ser usados para construir vetores de expressão que contêm sequências que codificam TAGNPP1 e elementos de controle traducional e transcricional apropriados. Esses métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. Essas técnicas são descritas, por exemplo, em Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., e Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., cujos ensinamentos são incorporados no presente documento a titulo de referência em sua totalidade.
Uma variedade de sistemas hospedeiros/vetor de expressão pode ser utilizada para conter e expressar sequências que codificam TAGNPP1. Essas incluem, sem limitação, microrganismos tal como bactérias transformadas com vetores de expressão de DNA de cosmideo, plasmideo e bacteriófago recombinante; levedura transformada com vetores de expressão de levedura; sistemas celulares de inseto infectados com vetores de expressão de virus (por exemplo, baculovirus) ou com vetores de expressão bacterianos (por exemplo, plasmideos de Ti ou pBR322); ou sistemas celulares de animal (por exemplo, vetor de pTT22).
Os elementos de controle ou sequências reguladoras podem incluir aquelas regiões não traduzidas dos acentuadores de vetor, promotores, regiões não traduzidas 5' e 3' que interagem com proteinas celulares hospedeiras para executar a transcrição ou tradução. Esses elementos podem variar em sua força e especificidade. Dependendo do sistema de vetor e hospedeiro utilizado, qualquer número de elementos de tradução e transcrição adequados, que incluem promotores induziveis, constitutivos e específicos por tecido, pode ser usado. Por exemplo, quando clonando em sistemas bacterianos, promotores induziveis tal como o promotor de lacZ híbrido do fagomideo Bluescript™ (Stratagene, LaJolla, California) ou plasmideo pSportl™ (Gibco BRL) e similares podem ser usados. Em sistemas celulares de mamífero, promotores de genes de mamifero ou de virus de mamífero são preferenciais. Se for necessário gerar uma linhagem celular que contêm múltiplas cópias da sequência que codifica TAGNPP1, vetores baseados em SV40 ou EBV podem ser usados com um marcador selecionável apropriado. Quando um sistema de expressão de ave for usado, vetores adequados para expressar vários construtos de TAGNPP1 são descritos na Patente sob N- U.S. 6.730.822; Patente sob N- U.S. 6.825.396; Patente sob N2 U.S. 6.875.588; Patente sob N2 U.S. 7.294.507; Patente sob N2 U.S. 7.521.591; Patente sob N2 U.S. 7.534.929; e Pedido de Patente sob No de série U.S. 11/376.023, cujos ensinamentos inteiros são incorporados no presente documento a titulo de referência em sua totalidade. Brevemente, quando um sistema de expressão de ave é empregado para expressar TAGNPP1, promotores especificos por oviduto adequados, por exemplo, e sem limitação, promotores ovomucoides, promotores de ovalbumina, promotores de lisozima, promotores de conalbumina, promotores de ovomucina, promotores de ovotransferrina e porções funcionais de cada um desses promotores são contempladas. Os promotores não especificos adequados podem incluir, por exemplo e sem limitação, promotores de citomegalovirus (CMV), promotores de MDOT e promotores de virus de sarcoma de Rous (RSV), promotores de virus de leucemia de murina (MLV), promotores de virus de tumor mamário de camundongo (MMTV) e promotores de SV40 e porções funcionais de cada um desses promotores. Os exemplos não limitadores de outros promotores que podem ser úteis na presente invenção incluem, sem limitação, promotores de Pol III (por exemplo, promotores de Pol III do tipo 1, tipo 2 e tipo 3} tal como promotores de Hl, promotores de U6, promotores de tRNA, promotores de MPR de RNase e porções funcionais de cada um desses promotores. Tipicamente, sequências terminadoras funcionais são selecionadas para uso na presente invenção de acordo com o promotor que é empregado.
CÉLULAS HOSPEDEIRAS
A presente invenção inclui a produção de TAGNPP1 solúvel em um sistema de ave transgênica (por exemplo, galinha transgênica) conforme é bem conhecido na técnica, por exemplo, na Patente sob N2 U.S. 7.534.929, cuja revelação é 5 incorporada em sua totalidade no presente documento a titulo de referência. A produção no sistema aviário (por exemplo, no oviduto aviário) de um componente de NPP1 com ou sem uma porção quimica de alvejamento (por exemplo, ssNPPl, sNPPl, TAGsNPPl e TAGssNPPl) está dentro do escopo da invenção. Além 10 disso, o TAGNPP1 produzido em qualquer sistema de expressão de proteina útil que inclui, sem limitação, aves transgênicas, mamifero transgênico, cultura celular (por exemplo, células CHO, células HEK293 e células COS) , bactérias tal como E. coli, animais transgênicos tal como 15 mamíferos e aves (por exemplo, galinhas, codornas, patos e perus) e em sistemas de planta que incluem lentilha de água, é contemplado no presente documento.
Uma cepa de célula hospedeira pode ser escolhida por sua capacidade de modular a expressão das sequências 20 inseridas ou de processar os TAGNPP1 expressos na forma desejada. Tais modificações do polipeptideo de TAGNNP1 incluem, sem limitação, acetilação, carboxilação, sialilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. As células - hospedeiras diferentes tal como CHO, COS, HeLa, MDCK, HEK293 e W138, que têm mecanismos característicos e maquinário celular especifico para tais atividade pós-traducionais, podem ser escolhidos para assegurar a modificação correta e processamento da proteina de fusão da presente invenção. A linhagem celular de tumor aviário também é contemplada como 30 uma célula hospedeira para expressar o polipeptideo da presente invenção. Os exemplos de linhagens celulares de ave úteis (por exemplo, uma linhagem celular de tumor de oviduto aviário) que podem ser empregados na presente invenção são descritos na Publicação de Patente sob N- U.S. 2009/0253176, cujos ensinamentos inteiros são incorporados no presente documento a titulo de referência.
PRODUÇÃO DE TAGNPP1
O TAGNPP1 pode ser produzido com o uso de qualquer uma dentre uma variedade de técnicas bem conhecidas. O TAGNPP1 codificado por sequências de DNA conforme descrito acima podem ser preparados prontamente a partir das sequências de DNA com o uso de qualquer um dentre uma variedade de vetores de expressão descritos no presente documento ou bem conhecidos para aqueles individuos de habilidade comum na técnica. A expressão pode ser alcançada em quer uma célula hospedeira apropriada que foi transformada ou transfectada com um vetor de expressão que contém uma molécula de DNA que codifica um polipeptídeo recombinante da presente invenção. Os sobrenadantes de sistemas de vetor/hospedeiro adequados que secretam proteina de fusão ou polipeptídeo recombinante no interior do meio de cultura podem ser primeiro concentrados com o uso de um filtro comercialmente disponível. Após a concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma matriz de purificação adequada tal como uma matriz de afinidade ou uma resina de troca iônica. Uma ou mais etapas de HPLC de fase inversa podem ser empregadas para purificar adicionalmente um polipeptídeo recombinante.
Para produção de rendimento alto de proteínas recombinantes, a expressão estável é preferencial. As linhagens celulares que expressam TAGNPP1 de forma estável podem ser transformadas com o uso de vetores de expressão que contêm origens virais de replicação e/ou elementos de expressão endógenos e/ou um gene de marcador selecionável no mesmo ou em um vetor separado. Após a introdução do vetor, pode-se permitir que as células cresçam por 1 a 2 dias em um meio enriquecido antes que elas são trocadas para um meio seletivo. O propósito do marcador selecionável é conferir resistência à seleção e sua presença permite o crescimento e recuperação de células que expressam com sucesso as sequências introduzidas. Os clones resistentes de células transformadas de forma estável podem ser proliferados com o uso de técnicas de cultura de tecido apropriadas para o tipo de célula. Os métodos de produção de proteina exógena em linhagens celulares de mamífero são bem conhecidos na técnica. Os exemplos ilustrativos desse e outros aspectos e modalidades da presente invenção para a produção de polipeptídeos heterólogos tal como proteínas de fusão de TAGNPP1 em células aviárias são reveladas completamente no Pedido de Patente sob N2 de série U.S. 09/877.374, depositado em 8 de junho de 2001, publicado como U.S. 2002/0108132-Al em 8 de agosto de 2002 e Pedido de Patente sob N2 de série U.S. 10/251.364, depositado em 18 de setembro de 2002, cada um dos quais é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade. Os exemplos de produção de proteínas exógenas em linhagens celulares de tumor aviário também são descritos na Publicação de Patente sob N2 U.S. 2009/0253176, cujos ensinamentos inteiros são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade.
A contempla especificamente a produção das proteínas de TAGNPP1 reveladas no presente documento em um sistema de ave transgênica. Em uma modalidade particularmente útil, a invenção é atraída para a produção de TAGNPP1 que pode ser produzido no oviduto de uma ave transgênica, tal como uma galinha, de acordo com a invenção. Os exemplos de produção de proteínas exógenas no sistema de expressão de ave transgênica também são descritos na Patente sob N2 U.S. 6.730.822, cujos ensinamentos inteiros são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade.
Brevemente, um vetor de ave adequado descrito acima que contém uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteina de fusão de TAGNPP1, ligado de forma operacional a um promotor constitutivo ou especifico por tecido que aciona a expressão da sequência de codificação no oviduto de galinha é introduzido no interior das células embrionárias de estágio X da galinha. As células embrionárias transformadas são incubadas sob condições condutivas para eclodir pintos vivos. Os pintos vivos são nutridos em uma galinha quimérica adulta que são reproduzidos com uma galinha não transgênica naturalmente ou por meio de inseminação artificial. Uma galinha transgênica é identificada por triagem da progénie para incorporação de linhagem germinativa da sequência de codificação de proteina. A progénie transgênica pode ser reproduzida com outra transgênica ou uma galinha não transgênica para produzir ovos que contêm a proteina de fusão de TAGNPP1. O TAGNPP1 é então isolado e purificado por métodos bem conhecidos na técnica. Consequentemente, a invenção fornece proteínas de fusão de TAGNPP1 recombinantes que foram produzidas por aves transgênicas.
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA
A presente invenção também apresenta composições farmacêuticas que compreendem TAGNPP1 substancialmente purificado e isolado ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A composição farmacêutica da presente invenção também pode incluir um excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável do mesmo. As composições que compreendem esses carreadores, que incluem moléculas compósitas, são formuladas por métodos convencionais bem conhecidos {consulte, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 14- Edição, Mack Publishing Co., Easton, Pa.), cujos ensinamentos inteiros são incorporados no presente documento a titulo de referência. 0 carreador pode compreende um diluente. Em uma modalidade, o carreador farmacêutico pode ser um liquido e a proteína de fusão pode estar na forma de uma solução. O carreador farmacêutico pode ser cera, gordura ou álcool. Em outra modalidade, o carreador farmaceuticamente aceitável pode ser um sólido na forma de um pó, um pó liofilizado ou um tablete. Em uma modalidade, o carreador pode compreender um lipossomo ou uma microcápsula.
As composições farmacêuticas podem estar na forma de um pó liofilizado estéril para injeção mediante reconstituição com um diluente. O diluente pode ser água para injeção, água bacteriostática para injeção ou solução salina estéril. O pó liofilizado pode ser produzido através de secagem por congelamento de uma solução da proteina de fusão para produzir a proteína na forma seca. Conforme é conhecido na técnica, a proteína liofilizada geralmente tem estabilidade aumentada e uma vida de prateleira maior do que uma solução líquida da proteína.
DEFINIÇÕES:
Conforme usado no presente documento, o termo "aceitável" em relação a uma formulação, composição ou ingrediente, conforme usado no presente documento, significa não ter efeito prejudicial persistente na saúde geral do indivíduo a ser tratado.
Conforme usado no presente documento, o termo "administração" ou "administrando" se refere ao fornecimento de uma proteína de fusão da invenção a um indivíduo em necessidade do tratamento. "Alterações", conforme usado no presente documento, compreendem qualquer alteração na sequência de polinucleotídeos que codifica TAGNPP1 que inclui deleções, inserções e mutações pontuais que podem ser detectadas com o uso de ensaios de hibridização.
O termo "animal" é usado no presente documento para incluir todos os animais vertebrados, que incluem aves e mamíferos tais como ratos, camundongos e seres humanos. O mesmo também inclui um animal individual em todos os estágios de desenvolvimento, que inclui os estágios fetal e embrionário.
Quando a "sequência de aminoácidos" é recitada no presente documento para se referir a uma sequência de aminoácidos de uma molécula de proteína de fusão, "sequência de aminoácidos" e termos similares, tal como "polipeptideo" ou "proteína" não são destinados a limitarem a sequência de aminoácidos à sequência de aminoácidos completa associada com a molécula de polipeptideo ou proteína recitada.
O termo "aviário" conforme usado no presente documento se refere a qualquer espécie, subespécie ou cepa de organismo da classe ava taxonômica, tal como, sem limitação, tais organismos como galinhas, perus, patos, gansos, codornas, faisões, papagaios, tentilhões, falcões, corvos e ratites que incluem avestruzes, emas e casuares. O termo inclui as várias cepas conhecidas de Galo-Banquiva ou galinhas, (por exemplo, Legorne Branco, Legorne Marrom, Barred-Rock, Sussex, New Hampshire, Rhode Island, Ausstralorp, Minorca, Amrox, California Gray, Italian Partridge-colored), bem como cepas de perus, faisões, codornas, patos, avestruzes e outras aves domésticas comumente reproduzidas em quantidades comerciais.
A frase "com base em" ou "derivado a partir de" como em um vetor retroviral sendo baseado ou derivado a partir de um retrovirus particular ou baseado em sequência de nucleotideos de um retrovirus particular significa que o genoma do vetor retroviral contém uma porção substancial das sequência de nucleotideos do genoma do retrovirus particular. A porção substancial pode ser um gene particular ou sequência de nucleotideos tal como as sequência de nucleotideos que codificam as proteinas gag, pol e/ou env ou outras sequência de nucleotídeos funcionais ou estruturais do genoma de vírus tal como sequências que codificam os LTRs ou podem ser substancialmente o genoma de retrovirus completo, por exemplo, a maioria (por exemplo, mais que 60% ou mais que 70% ou mais que 80% ou mais que 90%) ou todos os genomas de retrovirus, como será aparente a partir do contexto no relatório descritivo como o conhecimento de um indivíduo versado na técnica. Os exemplos de vetores retrovirais que são baseados ou derivados a partir de um retrovirus são os vetores retrovirais de NL (por exemplo, NLB) que são baseados no retrovirus de ALV conforme revelado em Cosset et al., Journal of Virology (1991) vol 65, páginas 3.388 a 3.394.
O termo "biologicamente ativo", conforme usado no presente documento, se refere a uma proteína de fusão que tem funções bioquímicas, reguladoras ou estruturais de pirofosfatase/fosfodiesterase de uma proteína de NPP1 de ocorrência natural.
O termo "construto", conforme usado no presente documento, se refere a uma sequência de nucleotídeos circular ou linear tal como DNA que foi montado a partir de mais que um segmento da sequência de nucleotídeos que foi isolada de uma fonte natural ou foi sintetizada quimicamente ou combinações dos mesmos.
O termo "complementar", conforme usado no presente documento, se refere a duas moléculas de ácido nucleico isolado que podem formar interações específicas entre si. Nas interações específicas, uma base de adenina dentro de um filamento de um ácido nucleico isolado pode formar duas ligações de hidrogênio com timina dentro de um segundo filamento de ácido nucleico isolado quando os dois filamentos ácido nucleico isolado estão em polaridades opostas. Além disso, nas interações específicas, uma base de guanina dentro de um filamento de um ácido nucleico isolado pode formar três ligações de hidrogênio com citosina dentro de um segundo filamento de ácido nucleico isolado quando os dois filamentos ácido nucleico isolado estão em polaridades opostas. Os ácidos nucleicos isolados complementares conforme referido no presente documento, podem compreender adicionalmente bases modificadas em que uma adenina modificada pode formar ligações de hidrogênio com uma timina ou timina modificada e uma citosina modificada pode formar ligações de hidrogênio com uma guanina ou uma guanina modificada.
Uma "deleção", conforme usada no presente documento, se refere a uma mudança ou na sequência de aminoácidos ou na sequência de nucleotideos em que um ou mais residues de aminoácidos ou nucleotideo, respectivamente, estão ausentes.
O termo "expressado" ou "expressão" conforme usado no presente documento se refere à transcrição de um gene para obter uma molécula de ácido nucleico isolado de RNA pelo menos complementar em parte para uma região de um dos dois filamentos de ácido nucleico isolado do gene. 0 termo "expressado" ou "expressão" conforme usado no presente documento também pode ser referir à tradução do RNA para produzir uma proteina ou peptideo.
O termo "vetor de expressão" conforme usado no presente documento se refere a um vetor de ácido nucleico isolado que compreende uma região de controle de expressão de gene, tal como um promotor ou componente de promotor, ligado de forma operacional a uma sequência de nucleotideos que codifica pelo menos um polipeptídeo. "Porção funcional" ou "fragmento funcional" são usados de forma intercambiável e conforme usado no presente documento significam uma porção ou fragmento de um todo que tem capacidade de realizar, totalmente ou em parte, uma função do todo. Por exemplo, uma porção biologicamente funcional de uma molécula significa uma porção da molécula que realiza uma função biológica da molécula intacta ou inteira. Por exemplo, uma porção funcional de uma região de controle de expressão de gene é um fragmento ou porção da região de controle de expressão de gene especificada que, totalmente ou em parte, regula ou controla a expressão de gene (por exemplo, facilita ou totalmente ou em parte) em um sistema biológico (por exemplo, um promotor). As porções funcionais pode ser de qualquer tamanho útil.
O termo "região de controle de expressão de gene" conforme usado no presente documento se refere às sequências de nucleotideos que são associadas a uma sequência de codificação e que regulam, totalmente ou parte, a expressão da sequência de codificação, por exemplo, regulam, totalmente ou em parte, a transcrição da sequência de codificação. As regiões de controle de expressão de gene podem ser isoladas de uma fonte de ocorrência natural ou podem ser sintetizadas quimicamente e podem ser incorporadas no interior de um vetor de ácido nucleico isolado para habilitar a transcrição regulada em células apropriadas. "Regiões de controle de expressão de gene" podem preceder, sem limitação à precedência, a região de uma sequência de ácidos nucleicos que está na região 5' da extremidade de uma sequência de codificação que pode ser transcrita em mRNA.
Os termos "heterólogo", "exógeno" e "estranho" são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem em geral a uma biomolécula tal como um ácido nucleico isolado ou uma proteina que não é encontrada normalmente em um determinado organismo ou em uma determinada célula, tecido ou outro componente contido ou produzido por um organismo. Por exemplo, uma proteina que é heteróloga ou exógena a um ovo é uma proteina que não é encontrada normalmente no ovo.
Conforme usado no presente documento, os termos "heteróloga", "exógena" e "estranho" com referência aos ácidos nucleicos isolados, tal como DNA e RNA, são usados de forma intercambiável e se refere a um ácido nucleico isolado que não corre naturalmente como parte de um cromossomo, um genoma ou célula em que está presente ou que é encontrado em uma localização(ões) e/ou em quantidades que diferem da(s) localização(ões) e/ou quantidades em que o mesmo ocorre na natureza. 0 mesmo pode ser ácido nucleico isolado que não é endógeno ao genoma, cromossomo ou célula e foi introduzido exogenamente no interior do genoma, cromossomo ou célula. Os exemplos de DNA heterólogo incluem, sem limitação, um DNA que compreende uma região de controle de expressão de gene e DNA que codifica um produto ou produtos, por exemplo, produto de proteina ou RNA. Os exemplos de DNA heterólogo incluem, sem limitação, regiões de controle de expressão de gene ou promotores revelados no presente documento uma vez que isolados da ave e conforme usado posteriormente, por exemplo, após a reintrodução no interior de um genoma de ave.
O termo "ácido nucleico isolado" conforme usado no presente documento cobre, por exemplo, (a) um DNA que tem a sequência de parte de uma molécula genômica de ocorrência natural, mas não flanqueada por pelo menos uma das sequências que flanqueiam aquela parte da molécula no genoma da espécie em que a mesma ocorre naturalmente e; (b) um ácido nucleico isolado que foi incorporado no interior de um vetor ou no interior do DNA genômico de um procariota ou eucariota de modo que o DNA genômico ou vetor resultante não seja idêntico ao DNA de ocorrência natural a partir do qual o ácido nucleico isolado foi obtido; (c) uma molécula separada tal como um cDNA, um fragmento genômico, um fragmento produzido por reação em cadeia de polimerase (PCR), reação em cadeia de ligase (LCR) ou sintese química ou um fragmento de restrição; (d) uma sequência de nucleotideos recombinante que é parte de um gene hibrido, isto é, um gene que codifica uma proteina de fusão e (e) uma sequência de nucleotideos recombinante que é parte de uma sequência hibrida que não é de ocorrência natural. As moléculas de ácido nucleico isolado da presente invenção podem incluir, por exemplo, variantes alélicos naturais bem como moléculas de ácido nucleico isolado modificadas por deleções, inserções, inversões ou substituições de nucleotideo.
Uma "inserção" ou "adição", conforme usado no presente documento, se refere a uma mudança em um aminoácido ou sequência de nucleotideos que resulta na adição de um ou mais residuos de aminoácidos ou nucleotideo, respectivamente, em comparação à molécula de TAGNPP1.
O termo "ácido nucleico isolado" conforme usado no presente documento se refere a qualquer armação linear ou sequencial de nucleotideos e nucleosideos, por exemplo cDNA, DNA genômico, mRNA, tRNA, oligonucleotideos, oligonucleosideos e derivados dos mesmos. Para facilidade de discussão, os ácidos nucleicos isolados sem ocorrência natural podem se preferenciais no presente documento como construtos. Os ácidos nucleicos podem incluir vetores de plasmideo bacteriano que inclui expressão, clonagem, cosmideo e vetores de transformação tal como, vetores virais de animal tal como, sem limitação, adenovirus modificado, virus influenza, virus de pólio, poxvirus, retrovirus tal como vetor retroviral de virus de leucose aviária (ALV), um vetor retroviral de virus de leucemia de murina (MLV) , e um vetor de lentivirus e similares e fragmentos dos mesmos. Adicionalmente, o ácido nucleico isolado pode ser um LTR de um vetor retroviral de virus de leucose aviária (ALV), um vetor retroviral de virus de leucemia de murina (MLV) ou um vetor de lentivirus e fragmentos dos mesmos. Os ácidos nucleicos também podem incluir vetores de NL tal como NLB, NLD e NLA e fragmentos dos mesmos e oligonucleotideos sintéticos tal como DNA ou RNA sintetizados quimicamente. Os ácidos nucleicos podem incluir nucleotideos e nucleosideos derivatizados ou modificados tal como, sem limitação, nucleotideos halogenados tal como, mas não somente, 5- bromouracil e nucleotideos derivatizados tal como nucleotideos identificados por biotina. "Sequência de ácidos nucleicos" conforme usada no presente documento se refere a um oligonucleotideo, nucleotideo ou polinucleotideo e fragmentos ou porções dos mesmos e a DNA ou RNA de origem sintética ou genômica que pode ser um de filamento único ou duplo e representa o filamento de senso ou antissenso.
O termo "ligado de forma operacional" se refere a uma disposição de elementos em que os componentes assim descritos são configurados de modo a realizar sua função normal. Os promotores ou regiões de controle de expressão de gene (por exemplo, componentes de promotor) ligadas de forma operacional a uma sequência de codificação têm a capacidade de efetuar a expressão da sequência de codificação. As sequências de controle não precisam ser contíguas com a sequência de codificação, desde que elas funcionem para direcionar a expressão das mesmas. Portanto, por exemplo, sequências transcritas, porém não traduzidas, intervenientes podem estar presentes entre uma sequência de promotor e a sequência de codificação e a sequência de promotor ainda pode ser considerada "ligada de forma operacional" à sequência de codificação.
O termo "promotor especifico por oviduto" conforme usado no presente documento se refere a promotores e componentes de promotor que são funcionais, isto é, fornecem a transcrição de uma sequência de codificação, por uma extensão grande, por exemplo, primeiramente (isto é, mais que 50% do produto de transcrição produzido no animal através de um tipo de promotor particular a ser produzido nas células de oviduto) ou exclusivamente nas células de oviduto de um pássaro. Os exemplos de promotores especificos por oviduto incluem, sem limitação, promotor de ovalbumina, promotor de ovomucoide, promotor de ovoinibitor, promotor de lisozima e promotor de ovotransferrina e porções funcionais desses promotores, por exemplo, componentes de promotor.
Os termos "polinucleotideo", "oligonucleotideo", "sequência de nucleotídeos" e "sequência de ácidos nucleicos" podem ser usadas de forma intercambiável no presente documento e incluem, sem limitação, sequências de codificação, isto é, polinucleotideo(s) ou sequência(s) de ácidos nucleicos que são transcritas e traduzidas em polipeptídeo in vitro ou in vivo quando colocadas sobre o controle de sequências de controle ou reguladoras apropriadas; sequências de controle, por exemplo, códons de parada e inicio de tradução, sequências de promotor, sitios de ligação de ribossomo, sinais de poliadenilação, sitios de ligação de fato de transcrição, sequências de terminação de transcrição, domínios reguladores a jusante e a montante, acentuadores, silenciadores, sequências de DNA para as quais um fator (es) de transcrição liga e altera a atividade de um promotor do gene ou positivamente (indução) ou negativamente (repressão) e similares. Nenhuma limitação quanto ao comprimento ou à origem sintética são sugeridas pelos termos descritos no presente documento.
Conforme usado no presente documento, os termos "polipeptídeo" e "proteina" podem ser usados de forma intercambiável e se referem a um polímero de aminoácidos de três ou mais aminoácidos em uma armação em série ligados através de ligações peptidicas. 0 termo "polipeptídeo" inclui proteínas tal como proteínas de fusão, fragmentos de proteína, análogos de proteína, oligopeptídeos e similares. O termo "polipeptídeos" inclui polipeptídeos conforme definido acima que são codificados por ácidos nucleicos isolados, produzidos através de tecnologia recombinante (por exemplo, isolados de um pássaro transgênico) ou sintetizados quimicamente.
Conforme usado no presente documento, o termo "promotor" se refere a uma sequência de DNA útil para iniciar a iniciação de transcrição por uma polimerase de RNA em uma célula aviária. Um "componente de promotor" é uma sequência de DNA que pode, por si própria ou e, combinação com outras sequências de DNA efetuarem ou facilitarem a transcrição. Os componentes de promotor específicos tal como componentes de promotor ovalbumina, componentes de promotor ovomucoide e componentes de promotor de lisozima e outros promotores e componentes de promotor revelados e reivindicados no presente documento não descrevem uma sequência de promotor específica. Em vez disso, eles englobam qualquer sequência ou fragmento de sequência do respectivo promotor que é útil para efetuar ou facilitar a transcrição de uma sequência de codificação. Por exemplo, um componente de promotor de ovomucoide inclui, sem limitação, os promotores de ovomucoides de cerca de 1,8 kb, cerca de 3,9 kb e cerca de 10 kb revelados na Publicação sob N- U.S. 11/649.543, publicada em 17 de maio de 2007, que é incorporada em sua totalidade no presente documento a título de referência. "Componentes de Promotor" também pode englobar regiões de controle de expressão de gene que funcionam para iniciar a transcrição de RNA e moléculas de DNA híbridas compostas de sequências de DNA de ocorrência natural e/ou sequências de DNA sintética que funcionam para iniciar a transcrição de RNA.
Os termos "ácido nucleico isolado recombinante" e "DNA recombinante" conforme usados no presente documento se referem a combinações de pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos que não são encontradas naturalmente uma célula procariótica ou eucariótica. As sequências de ácidos nucleicos podem incluir, sem limitação, vetores de ácido nucleico isolado, elementos reguladores de expressão de gene, origens de replicação, sequências de gene adequadas que quando expressas conferem resistência antibiótica, sequências de codificação de proteina e similares. O termo "polipeptideo recombinante" ou "proteina recombinante" é destinado a incluir um polipeptideo produzido por técnicas de DNA recombinante de modo que seja distinto de um polipeptideo de ocorrência natural ou em sua localização, pureza ou estrutura. Geralmente, tal polipeptideo recombinante estará presente em uma célula em uma quantidade diferente daquela observada normalmente na natureza.
O termo "condições rigorosas", conforme usado no presente documento, é a "rigorosidade" que ocorre dentro de uma faixa de cerca de Tm - 5°C (5 °C abaixo da temperatura de fusão (Tm) da sonda) a cerca de 20‘C a 25’C abaixo de Tm. Conforme será compreendido por aqueles indivíduos técnicos no assunto, a rigorosidade de hibridização pode ser alterada a fim de identificar ou detectar sequências de polinucleotideos relacionadas e idênticas.
Conforme usado no presente documento, o termo "indivíduo" ou "paciente" engloba mamíferos e não mamíferos. Os exemplos de mamíferos incluem, sem limitação, seres humanos, chimpanzés, macacos primatas, gado, cavalos, ovelhas, cabras, porcos; coelhos, cachorros, gatos, ratos, camundongos, porquinhos-da-india e similares. Os exemplos de não mamíferos incluem, sem limitação, pássaros, peixe e similares. conforme usada no presente documento, se refere à substituição de um ou mais aminoácidos ou nucleotídeos por aminoácidos ou nucleotídeos diferentes, respectivamente.
Conforme usado no presente documento, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a qualquer quantidade de um composto que, em comparação a um indivíduo correspondente que não recebeu tal quantidade, resulta em tratamento, cura, prevenção ou atenuação aprimorada de uma doença, distúrbio ou efeito colateral ou uma diminuição na taxa de avanço de uma doença ou distúrbio. O termo também inclui dentro de seu escopo quantidades eficazes para acentuar função fisiológica normal.
Conforme usado no presente documento, os termos "TAGNPP1", "proteína de fusão", "polipeptídeo de TAGNPP1" e "componente de NPP1 fundido a uma porção química de alvejamento" são usados de forma intercambiável.
Conforme usado no presente documento, o termo "tratar", "tratando" ou "tratamento" se referem a métodos de suavização, diminuição ou atenuação de sintomas de doença ou condição, evitar sintomas adicionais, atenuar ou evitar as causas subjacentes de sintomas, inibir a doença ou condição, interromper o desenvolvimento da doença ou condição, aliviar a doença ou condição, causar regressão da doença ou condição, aliviar uma condição causada pela doença ou condição ou parar os sintomas da doença ou condição ou profilaticamente e/ou terapeuticamente. Uma "variante" de TAGNPP1, conforme usado no presente documento, se refere a uma sequência de aminoácidos que é alterada por um ou mais aminoácidos. Preferencialmente, uma variante contém substituições conversadoras. Uma "substituição conservadora" é uma em que um aminoácido é substituído por outro aminoácido que tem propriedades semelhantes, de modo que uma pessoa versada na técnica de química de peptideo esperaria que a estrutura secundária e natureza hidropática do polipeptídeo fossem substancialmente inalterados. As substituições de aminoácido podem, em geral, ser feitas com base na semelhança em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfipática dos resíduos. Por exemplo, aminoácidos carregados negativamente incluem Asp e Glu; aminoácidos carregados positivamente incluem lisina e arginina; e aminoácidos com grupos principais polares não carregados que têm valores de hidrofilicidade semelhantes incluem Leu, Ile e Vai; Gly e Ala; Asp e Gin; e Ser, Thr, Phe e Tyr. Outros grupos de aminoácidos que podem representar mudanças conservadoras incluem: Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gin, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Vai, He, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; e (5) Phe, Tyr, Trp, His. Uma variante também pode, ou alternativamente, contém mudanças não conservadoras. Em uma modalidade preferencial, polipeptídeos variantes diferem de uma sequência nativa por substituição, deleção ou adição de cinco aminoácidos ou menos ou através de, por exemplo, substituição de um Gly com um Trp. As variantes também podem (ou alternativamente) ser modificadas através de, por exemplo, a deleção ou adição de aminoácidos que têm influência mínima sobre a imunogenicidade, estrutura secundária e natureza hidropática do componente de NPP1. A orientação na determinação de quais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou deletados sem abolir a atividade imunológica ou biológica pode ser encontradas com o uso de programas de computador bem conhecidos na técnica.
O termo "vetor" e "vetor de ácido nucleico isolado" conforme usado no presente documento se refere a uma molécula de ácido nucleico isolado virai ou de plasmideo de filamento único ou duplo sintética ou natural que pode ser transíectada ou transformada em células e duplicar independentemente, ou dentro de, do genoma de célula hospedeira. Um vetor de filamento duplo circular pode ser linearizado pelo tratamento com uma enzima de restrição 5 apropriada com base na sequência de nucleotideos do vetor. Um ácido nucleico isolado pode ser inserido no interior de um vetor cortando-se o vetor com enzimas de restrição e ligando os pedaços desejados juntos.
O termo "porção", conforme usado no presente 10 documento, em relação a uma proteina de fusão se refere a fragmentos daquela proteína. Os fragmentos podem variar em tamanho a partir de quatro resíduos de aminoácidos para a sequência de aminoácidos inteira menos um aminoácido. Portanto, uma proteína "que compreende pelo menos uma porção 15 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1" engloba o TAGNPP1 de comprimento completo e fragmentos do mesmo. "Transformação" ou "transfecção", conforme usado no presente documento, descreve um processo através do qual o DNA exógeno entra e muda uma célula recipiente com o uso de 20 vários métodos bem conhecidos na técnica. A transformação pode depender de qualquer método conhecido para a inserção de sequências de ácidos nucleicos estranhas no interior de uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica. 0 método é selecionado com base na célula hospedeira a ser transformada 25 e pode incluir, sem limitação, eletroporação, bombardeamento de partícula, infecção virai e lipofecção. Tais células "transformadas" incluem células transformadas de forma estável nas quais o DNA inserido tem a capacidade de replicar ou como um plasmídeo de replicação autônoma ou como parte do 30 cromossomo hospedeiro. Eles também incluem células que expressam de forma transiente o DNA ou RNA inserido por períodos limitados de tempo.
EXEMPLOS
A presente invenção é exemplificada adicionalmente pelos exemplos a seguir. Os exemplos são somente para propósito ilustrativo e não devem ser interpretados nem se destinam a ser limitadores da invenção de nenhuma maneira.
EXEMPLO I
O construto de TAGsNNPl que contém a porção quimica de alvejamento que tem oito ácidos aspárticos consecutivos fundido a sNPPl foi ligado ao vetor de pTT22 com o uso dos sitios de EcoRI e HindIII (pTT22-sNPPl.D8; Figura 1). pTT22-sNPPl.D8 foi transfectado para as células HEK203E e os transformantes foram cultivados para expressar TAGsNNPl. TAGsNNPl foi isolado do meio de cultura e parcialmente purificado conforme bem conhecido na técnica. Após a purificação, a atividade de pirofosfase/fosfodiesterase de TAGsNPPl foi medida quanto a sua capacidade de hidrolisar timidina 5' monofosfato p-nitrofenil éster. Brevemente, TAGsNPPl foi diluido até 1 ng/μl em 50 mM de Tris, 250 mM de NaCl, pH 9,5. Em uma placa que contém 50 μl de 1 ng/μl de TAGsNPPl, 50 μl de 10 mM de substrato de timidina 5' monofosfato p-nitrofenil éster (Sigma™, N- de Catálogo T4510) foi adicionado. A atividade enzimática de TAGsNPPl foi medida em 405 nm (absorbância) em modo cinético por 5 minutos. Conforme mostrado na Figura 3, a atividade de TAGsNPPl foi detectada acima do nivel observado no controle que contém no TAGsNPPl. Particularmente, TAGsNPPl produzido a partir de HEK203D6 exibiu o nivel mais alto da atividade enzimática. Esses resultados sugeriram com veemência que o NPP1 truncado fundido a uma porção quimica de alvejamento (isto é, D8) manteve suficientemente sua função normal como nuclease.
EXEMPLO II
Esse exemplo profético não limitador descreve como para tratar calcificação arterial infantil idiopática por administração de uma formulação que compreende uma proteina de fusão de TAGNPP1.
Um clínico usa um teste diagnóstico para verificar que um paciente tem níveis altos de calcificação na artéria. Um teste genético também pode ser realizado quanto a defeitos de NPP1 conforme descrito em Rutsch et ai. (2003), Nature Genetics 34:379 a 81.
As composições farmacêuticas da presente invenção são administradas preferencialmente de forma intravenosa, embora administração oral, intramuscular ou intradérmica sejam empregadas em determinadas circunstâncias.
O clínico determina uma dose que pode variar dependendo do gênero, idade, saúde e peso do paciente. A determinação da dosagem ou rota apropriada de administração está dentro da habilidade de um médico comum.
A formulação que contém TAGNPP1 pode ser infundida, entre cerca de 10 mg/kg e cerca de 1.000 mg/kg por semana. 10 a 30 mg/kg podem ser administrados uma vez. Durante o período de infusão, os pacientes são monitorados intimamente e intervenção clínica apropriada é tomada no caso de um evento adverso. 0 tratamento dura pelo menos 1 mês ou pela vida do paciente. Uma janela de 48 horas pode ser permitida para cada infusão. Um cronograma de infusão em que a taxa de infusão aumenta o tempo reduz ou elimina eventos adversos. As infusões para recém-nascidos podem ser administradas de acordo com o seguinte cronograma: 5 a 10 cc/hr por 60 minutos em cada intervalo.
Por outro lado, quando uma administração intravenosa contínua for desejada, um exemplo típico dos sistemas de liberação lenta compreende que 1 a 100 mg/kg de proteínas de TAGNPP1 eficazes podem ser liberadas continuamente por mais de 1 dia.
EXEMPLO III Purificação de TAGsNPPl-D8 solúvel
A forma solúvel de TAGsNPPl (D8 etiquetado por C- terminal) (consulte, SEQ ID NO:20) foi purificada a partir de meio condicionado de HEK293. O meio condicionado (500 ml) foi equilibrado para hidroxiapatite (HA)-Tampão A (10 mM Na3PO4, pH 6,8) e filtrado com um 0,2 μm de Filtro de MidiCap de Tamanho 8 de Sartobran P (Sartorius Stedim). Uma coluna de 20 ml de HA-Ultrogel (Pall Life Sciences) foi equilibrada com 5 volume de coluna (CV) de Tampão A antes de carregar o meio condicionado filtrado em 3 ml/min. A coluna foi lavada para base de UV com o Tampão A. A proteina foi eluida em etapas com o uso de 2,5 CV de cada um dentre HA-Tampão B (150 mM de Na3PO4, pH 6,8), HA-Tampão C (250 mM de Na3PO4, pH 6,8), e HA- Tampão D (500 mM de Na3PO4, pH 6,8) enquanto coleta frações de 5 ml. As frações ativas da coluna de HA foram agrupadas (50 ml) e equilibradas para Tampão A de WGA (20 mM de Tris, pH 8,0, 150 mM de NaCl, 0,7% de CHAPS). Após filtrar, 6 a 7 mg de proteína total (15 a 18 ml) foi carregado em uma coluna de gravidade de Aglutinina do Germe de Trigo (WGA) de 1 ml (EMD Chemicals) que foi equilibrado com 5 CV de Tampão A de WGA. A coluna foi lavada com 7 CV de Tampão A de WGA e então a proteína foi eluida com 5x1 ml de Tampão B de WGA (20 mM de Tris, pH 8,0, 150 mM de NaCl, 500 mM de N-Acetilglucosamina, 0,7% tampão de CHAPS). Permitiu-se que o Tampão B de WGA incubasse com a coluna em temperatura ambiente por 10 minutos antes de coletar as frações de 1 ml. O processo foi repetido até que todo o material de partida tivesse sido purificado pela coluna de WGA (total de 4 ciclos). As frações ativas (29 ml) foram agrupadas e concentradas para 1,2 ml com o uso de um Vivaspin-15 (Sartorius Stedim) de corte de peso molecular (MWCO) de 100.000 (MWCO), trocando-se tampão por PBS ao mesmo tempo.
SNPP1-D8 ativo (TAGsNPPl) foi purificado para 91,5% com base em HPLC. Quando o agrupamento final foi analisado por SDS-PAGE uma banda dimera correspondeu a ~210kD sob condições não redutoras e sob condições redutora uma banda de monômero correspondeu a ~105kD.
EXEMPLO IV As células de músculo liso aórtico humano foram
plaqueadas em IxlO4 células por cavidade em placas com 48 cavidades e mantidas no Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) sob condições padrão. Após 2 dias, o DMEM foi complementado com NaPO4 e ATP em 3,8 mM e 50 uM, 10 respectivamente. sNPPl (WT; SEQ. ID No 9), TAGsNPPl que tem oito residuos de ácido aspártico consecutivos (D8) fundidos ao C-terminal (SEQ. ID No 20) e sNPPl-Fc (SEQ. ID No 22) foram complementados em 1 ug/ml. O meio foi substituído pelo mesmo todo dia. Após 5 dias, o meio foi removido a partir da 15 cultura e substituído por 100 ul de 0, 6N de HC1 e incubado por 16 a 20 horas em temperatura ambiente, dissolvendo-se fosfatos de cálcio na solução. Os niveis de cálcio foram então quantificados por uma reação de Cálcio-Cresolftaleina colorimétrica com o uso do Kit de Ensaio de Cálcio (#700550) da Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI.
Conforme mostrado na Figura 5, TAGsNPPl demonstrou uma inibição aumentada na calcificação em comparação com aquela de sNPPl (WT), sugerindo que o dominio D8 contido em TAGsNPPl fornece uma capacidade de orientação aumentada para 25 sitios de calcificação e/ou um efeito inibidor acentuado.
EXEMPLO V Ensaio de Atividade Enzimática de sNPPl-Fc
A adição de 1 ug de sNPPl-Fc (SEQ. ID No 22) foi baseada em 70% de pureza (isto é -1,1 μg de sNPPl-Fc foi 30 usado no ensaio) . A coluna de exclusão por tamanho de HPLC (SEC) indica que o sNPPl-Fc é -78% puro. O gel não reduzido mostrou um dimero no tamanho esperado (-250kD). O banda de dimero reduziu para o tamanho de monômero esperado (~125kD) quando tratada com DTT. Análise por Western blot confirmou as bandas de dimero e monômero. 0 tratamento da amostra de sNPPl-Fc com PNGase F reduziu a banda de monômero de ~125kD para -lOOkD, que é o peso molecular esperado considerando que sNPPl-Fc continha 12 sitio de N-glicano. Em 78% de pureza, a quantificação final rendeu -0,808 mg de sNPPl-Fc (2,2 μg/ml de meio condicionado). A atividade enzimática de sNPPl-Fc foi determinada conforme conhecido na técnica. TABELA 1. Atividade enzimática de sNPPl-Fc
Figure img0001
Cada exemplo no relatório descritivo acima é fornecido a título de explicação da invenção, e não de limitação da invenção. De fato, será evidente para aqueles indivíduos técnicos no assunto que várias modificações, combinações, adições, deleções e variações podem ser feitas na presente invenção sem sair do escopo ou espírito da invenção. Por exemplo, os recursos ilustrados ou descritos como parte de uma modalidade podem ser usados em outra modalidade para render ainda outra modalidade adicional. Pretende-se que a presente invenção cubra tais modificações, combinações, adições, deleções e variações.
Todas as publicações, patentes, pedidos de patente, sites da internet e números de acesso/sequências de base de dados (incluindo as sequências de polinucleotideos e de polipeptídeos) citados no presente documento são incorporados aqui a titulo de referência em sua totalidade para todos os propósitos na mesma medida como se cada publicação, patente, pedido de patente, site da internet ou número de acesso/sequência de base de dados individual fosse 5 indicado específica e individualmente para ser então incorporado a título de referência.

Claims (9)

1. POLIPEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado por consistir essencialmente de um componente de NPP1 tendo uma sequência de aminoácido apresentada em P99 a D925 da SEQ ID NO: 1 e uma região Fc de uma imunoglobulina, em que o componente de NPP1 é um NPP1 truncado compreendendo uma região rica em cisteína e um domínio catalítico tendo atividade de pirofosfatase e/ou fosfodiesterase mas com atividade citosólica do N-terminal e domínios transmembranares removidos, e em que a dita região Fc está ligada ao C-terminal do componente NPP1.
2. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ter a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 22, opcionalmente sem o peptídeo sinal no seu N- terminal.
3. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela dita polipeptídeo formar um homodímero.
4. ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO QUE CODIFICA O POLIPEPTÍDEO, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo ácido nucléico por possuir uma sequência de nucleotídeos conforme apresentada na SEQ ID NO: 21 e compreender uma sequência de DNA que codifica o componente NPP1 e uma sequência de DNA que codifica a região Fc, em que a extremidade 3' da sequência de DNA que codifica o componente NPP1 está ligada, com ou sem um ligante, para a extremidade 5' da sequência de DNA que codifica a região Fc, de modo que as estruturas de leitura das sequências estejam em fase.
5. VETOR DE EXPRESSÃO, caracterizado por carrear o ácido nucléico isolado, conforme definido na reivindicação 4.
6. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO ISOLADO, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por compreender a expressão das sequências de DNA da reivindicação 4 em uma única proteína de fusão que possui a atividade biológica do dito componente NPP1 e da dita região Fc.
7. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO O POLIPEPTÍDEO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por compreender a combinação com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
8. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ser para uso em terapia.
9. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizado por ser para uso no tratamento de bloqueio arterial, calcificação arterial 15 generalizada da infância, resistência à insulina, raquitismo hipofosfatêmico ou ossificação do ligamento longitudinal posterior da coluna vertebral.
BR112013023010-0A 2010-03-12 2011-09-15 Polipeptídeo isolado, ácido nucleico isolado que codifica o polipeptídeo, vetor de expressão, processo para a produção de um polipeptídeo isolado e composição farmacêutica compreendendo o polipeptídeo BR112013023010B1 (pt)

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BR112013023010-0A BR112013023010B1 (pt) 2010-03-12 2011-09-15 Polipeptídeo isolado, ácido nucleico isolado que codifica o polipeptídeo, vetor de expressão, processo para a produção de um polipeptídeo isolado e composição farmacêutica compreendendo o polipeptídeo

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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2628841T3 (es) 2010-03-12 2017-08-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Proteínas de fusión npp1
AR082953A1 (es) 2010-09-09 2013-01-23 Synageva Biopharma Corp Metodos para tratar deficiencia de acido lisosomal lipasa en pacientes
EP2675472A4 (en) 2011-02-15 2014-09-17 Synageva Biopharma Corp METHOD FOR THE TREATMENT OF LACK OF LYSOSOMAL SAURER LIPASE
AU2011362576B2 (en) * 2011-03-11 2017-06-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. NPP1 fusion proteins
JP6894664B2 (ja) 2013-02-13 2021-06-30 イエール ユニバーシティ 病的な石灰化および骨化を治療するための組成物および方法
JP6514190B2 (ja) * 2013-05-06 2019-05-15 バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド 参照物質における不安定な被分析物の安定化
EP3234116B1 (en) * 2014-12-19 2021-09-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating tissue calcification
RU2757417C2 (ru) * 2015-05-19 2021-10-15 Йейл Юниверсити Композиции для лечения патологических состояний кальцификации и способы их применения
WO2017087936A1 (en) * 2015-11-20 2017-05-26 Yale University Compositions for treating ectopic calcification disorders, and methods using same
EP3471747A1 (en) * 2016-06-16 2019-04-24 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating myointimal proliferation
EP3493829B1 (en) * 2016-08-05 2024-04-17 Yale University Compositions and methods for stroke prevention in pediatric sickle cell anemia patients
US20220119782A1 (en) * 2018-08-31 2022-04-21 Yale University ENPP1 Polypeptides and Methods of Using Same
BR112022024958A2 (pt) 2020-06-09 2022-12-27 Inozyme Pharma Inc Proteínas enpp1 solúveis e usos das mesmas

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US6825396B2 (en) 1996-06-12 2004-11-30 Board Of Trustees Operating Michigan State University Methods for tissue specific synthesis of protein in eggs of transgenic hens
AU6278298A (en) 1997-02-14 1998-09-08 Salk Institute For Biological Studies, The Methods and compositions for delivery of therapeutic agents to bone tissue employing conjugates of negatively charged peptide oligomers with therapeutic agents
EP2133421A1 (en) 1997-10-16 2009-12-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Transgenic birds and protein production in the egg white
US20040019923A1 (en) 1997-10-16 2004-01-29 Ivarie Robert D. Exogenous proteins expressed in avians and their eggs
DK1032662T3 (da) 1997-11-07 2006-07-03 Trillium Therapeutics Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til immunmodulation
DE20121960U1 (de) * 2000-04-06 2004-01-15 Epigenomics Ag Nukleinsäuren für die Diagnose von mit Metastase assoziierten Krankheiten
US20020108132A1 (en) 2001-02-02 2002-08-08 Avigenics Inc. Production of a monoclonal antibody by a transgenic chicken
US7294507B2 (en) 2001-11-30 2007-11-13 Avigenics, Inc. Ovomucoid promoters and methods of use
US6875588B2 (en) 2001-11-30 2005-04-05 Avigenics, Inc. Ovomucoid promoter and methods of use
US7858297B2 (en) 2001-12-18 2010-12-28 Centre National De La Recherche Scientifique Cnrs Chemokine-binding protein and methods of use
US7323542B2 (en) 2002-02-21 2008-01-29 University Of Virginia Patent Foundation Bone targeting peptides
US20050090001A1 (en) 2003-10-07 2005-04-28 Parker Stephen H. Cell lines and methods for producing proteins
DK1759001T3 (da) 2004-04-21 2011-08-01 Enobia Pharma Inc Konjugat til tilførsel til knogler og fremgangsmåde til fremstilling deraf ved at målrette proteiner til knoglen
WO2006031994A2 (en) * 2004-09-14 2006-03-23 Xencor, Inc. Monomeric immunoglobulin fc domains
GB0426397D0 (en) * 2004-12-01 2005-01-05 Health Prot Agency Fusion proteins
US20090180989A1 (en) * 2005-10-05 2009-07-16 Synageva Biopharma Corp. Compositions and methods for delivering nucleotide sequences to vertebrates
EP2662448B1 (en) 2007-05-11 2016-12-21 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Bone targeted alkaline phosphatase, kits and methods of use thereof
PE20100141A1 (es) * 2008-05-23 2010-02-22 Wyeth Corp Proteina de union al receptor de interleuquina 21
ES2628841T3 (es) 2010-03-12 2017-08-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Proteínas de fusión npp1

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