BR112013013526B1

BR112013013526B1 - uso de pacap para o tratamento de infecções virais em organismos aquáticos, e combinação veterinária

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Publication number: BR112013013526B1
Application number: BR112013013526A
Authority: BR
Inventors: Tafalla Piñeiro Carolina; María Lugo González Juana; Pablo Estrada Garcia Mario; Carpio Gonzalez Yamila
Original assignee: Ct Ingenieria Genetica Biotecnologia
Priority date: 2010-12-01
Filing date: 2011-11-30
Publication date: 2020-04-07
Also published as: CA2819206C; CU23975B1; MX347844B; US20160030519A1; CN103298452B; PT2647369T; KR20140031840A; CA2819206A1; WO2012072055A1; RU2567802C2; AR084049A1; AU2011335519B2; JP2013544262A; SG191823A1; RU2013129830A; ES2621332T3; EP2647369B1; JP5997702B2; US9603900B2; ZA201304025B

Abstract

uso de pacap para o tratamento de infecções virais em organismos aquáticos, e combinação veterinária a presente invenção refere-se ao uso do polipeptídio ativador da adenilato ciclase da pituitária (pacap) para o tratamento de infecções virais e doenças infecciosas causadas por vírus, em organismos aquáticos. o pacap isolado, ou combinado com uma molécula antiviral, administrado por via oral, injeção ou por banhos de imersão, demonstra sua eficácia ao aumentar a sobrevida de peixes ou crustáceos infectados por vírus. além disso, depois de sua aplicação observa-se que o peso corporal desses organismos mantém-se igual ou aumenta em comparação com os organismos infectados e não tratados com as referidas preparações. por meio de uma reação de transcrição reversa em cadeia da polimerase de tecidos e órgãos suscetíveis à infecção viral foi demonstrado que pacap ou combinações que contêm pacap diminuem a carga viral nos organismos infectados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para USO DE PACAP PARA O TRATAMENTO DE INFECÇÕES VIRAIS EM ORGANISMOS AQUÁTICOS, E COMBINAÇÃO VETERINÁRIA.

Campo Técnico

A presente invenção refere-se ao campo da biotecnologia aquática, em particular com o uso de PACAP e de composições que contêm PACAP para o tratamento de infecções virais, ou doenças infecciosas causadas por vírus, em organismos aquáticos. Ela também se refere ao uso de PACAP combinado com antivirais para o tratamento das referidas infecções.

Estado da técnica anterior

Aminoácido contribuição anual do cultivo de espécies aquáticas para a produção total de peixes, moluscos e crustáceos aumentou nos últimos anos. No entanto, as altas densidades dos cultivos sugerem que esses animais vivem em condições de estresse, e que geralmente são mais susceptíveis a infecções. Os surtos de doenças causadas por patógenos na aquicultura resultam em grandes perdas econômicas e ainda, em algumas ocasiões, causam a interrupção de cultivos em determinadas regiões.

Nos salmonídeos, as infestações causadas pelo vírus da necrose pancreática infecciosa (do inglês: infectious pancreatic necrosis virus, abreviado IPNV), pelo vírus da septicemia hemorrágica viral (do inglês: viral hemorrhagic septicemia virus, abreviado VHSV), pelo vírus da anemia infecciosa do salmão (do inglês: infectious salmon anemia virus, abreviado ISAV) e pelo vírus da necrose hematopoiética infecciosa (do inglês: infectious hematopoietic necrosis virus, abreviado IHNV) são algumas das causas de doenças mais importantes em seu cultivo (Marroquí et al. (2008). Antiviral Research 80: 332338). Por exemplo, estima-se que a produção de salmão chileno até o fim do ano de 2010 cairá em 38,7% (de 403.000 toneladas no ano de 2009 para 245.000 toneladas no ano de 2010) como resultado da mortalidade provocada pelo ISAV (http://www.aqua.cl).

Por outro lado, os crustáceos representam um dos setores econômicos mais importantes na aquicultura global, aportando mais de 10 bilhões de dólares anualmente. Os camarões em cultivo são suscetíveis a

Petição 870190048243, de 23/05/2019, pág. 6/12

2/36 uma ampla variedade de patógenos que incluem os vírus. Estima-se que em meados dos anos 90, aproximadamente 40% da produção mundial (equivalente a 3 bilhões de dólares) foram perdidos em decorrência das doenças. Os principais contribuintes foram as doenças virais, dentre as quais existem cinco especialmente importantes: o vírus da mancha branca (do inglês: white spot syndrome virus, abreviado WSSV), o vírus da cabeça amarela (do inglês: yellow head virus, abreviado YHV), o vírus da síndrome de Taura (do inglês: taura syndrome vírus, abreviado TSV), o vírus da necrose hipodérmica e hematopoiética infecciosa (do inglês: infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus, abreviado IHNNV) e o baculovírus monodon (do inglês: monodon baculovírus, abreviado MBV) (revisado por Johnson et al. (2008) Vaccine 26: 4885-4992).

Os bivalvulados constituem uma parte importante da produção global de moluscos. Estes organismos por terem a característica de ser filtradores constituem depósitos importantes de vírus, e por isso seu cultivo pode enfrentar epizootias que põem em risco a produção. Já foram reportadas na literatura mortalidades maciças de ostras adultas da espécie Crassostrea angulata, associadas a infecções por vírus similares ao iridovírus. Adicionalmente, também foram descritos outros vírus das famílias Herpesviridae, Papovavirídae, Togaviridae, Retrovirídae, Reoviridae, Birnaviridae e Picomaviridae capazes de infectar cultivos de bivalvulados. No entanto, devido à ausência de linhagens celulares derivadas de moluscos e a ferramentas moleculares existentes limitadas para esses organismos, a virologia dos bivalvulados é, todavia, uma ciência primitiva baseada fundamentalmente em estudos morfológicos e alguns poucos estudos experimentais (revisado porT. Renault and B. Novoa (2004) Aquat. Living Resour. 17: 397-409).

Os antivirais são compostos químicos utilizados para o tratamento de infecções produzidas por vírus. Os primeiros antivirais experimentais foram descobertos na década dos anos 60. Estes foram desenvolvidos por meio da metodologia de ensaio e erro. Entretanto, depois de meados da década dos anos 80, o cenário mudou dramaticamente. Nos últimos anos foram registradas numerosas drogas antivirais novas, a maioria para o tra

3/36 tamento do vírus da imunodeficiência humana (VIH). Não obstante, há muito aspectos que precisam ser melhorados, pelo fato de que esses compostos nem sempre são eficazes ou bem tolerados. Por outro lado, algumas das principais razões para refinar o desenho e a aplicação dessas drogas são o surgimento de resistência viral ou os efeitos secundários associados às mesmas (De Clercq (2002) Nature Reviews Drug Discovery 1: 13-25). O desenho de drogas antivirais tem como alvo as proteínas virais ou as proteínas da célula hospedeira. A primeira estratégia dá lugar a compostos mais específicos e menos tóxicos, porém com um espectro mais estreito de atividade antiviral e uma maior probabilidade de desenvolvimento de resistência. A segunda estratégia permite obter compostos antivirais com um espectro de atividade mais amplo e uma menor probabilidade de desenvolver resistência, mas apresenta como inconveniente uma maior probabilidade de toxicidade celular. A estratégia de eleição depende da natureza do vírus e dos possíveis alvos encontrados no vírus ou na célula hospedeira (De Clercq (2002) Nature Reviews Drug Discovery 1: 13-25).

A ribavirina é um agente antiviral de amplo espectro, com atividade contra uma ampla gama de vírus de genoma de DNA e RNA. Ela é um análogo de nucleosídeo, o qual depois de ser fosforilado intracelularmente, é convertido em um inibidor competitivo da inosina monofosfato desidrogenase (IMPDH) celular que é uma enzima envolvida na síntese da guanosina monofosfato (GMP) (Graci e Cameron, (2006) Reviews in Medical Virology 16: 49-63; Parker, (2005) Virus Research 107: 165-171). Além da inibição dessa enzima IMPDH, foram propostos outros três mecanismos para explicar a atividade antiviral desse composto: mediante a inibição direta da RNA polimerase viral (Toltzis et al. (1988) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 32: 492-497), inibição da adição da cobertura na extremidade 5' do RNA mensageiro (mRNA) viral (Goswami et al. (1979) Biochemical and Biophysical Research Communications 89: 830-836) e pela acumulação de mutações (Graci e Cameron, (2002) Virology 298: 175-180). Até o momento, não existem drogas antivirais específicas aprovadas para o tratamento de doenças virais em organismos aquáticos. No Chile uma subsidiária da Diag

4/36 notec S.A. denominada Andrómaco desenvolveu um antiviral para ser usado em peixes, denominado VIROTOP. Este antiviral espera aprovação pelo Servicio Agrícola y Ganadero (“Ministério da Agricultura e Pecuária”) daquele país (SAG) (http://www.aqua.cl). Não obstante, um número importante de compostos foram avaliados in vitro e in vivo (Hudson et al. (1988) Antiviral Research 9:379-385; Jashés et al. (2000) Antiviral research 45: 9-17; Kamei and Aoki, (2007) Archives of Virology 152: 861-869; LaPatra et al. (1998) Fish and Shellfish Immunology 8: 435-446; Mas et al. (2006) Antiviral Research 72: 107-115; Micol et al. (2005) Antiviral Research 66: 129-136; Moya et al. (2000) Antiviral Research 48: 125-130), mostrando vários graus de eficácia.

A administração de um análogo de ribavirina, o 5-etinil-1-b-Dribofuranosilimidazol-carboxamida (EICAR), foi avaliada in vivo em larvas de salmão prateado (Oncorhynchus kisutch) e truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) infectadas de forma experimental com IPNV (Moya et al. (2000) Antiviral Research 48: 125-130). O tratamento consistiu em banhos diários em uma solução de 0,4 e 0,8 pg/mL de EICAR durante duas horas por 20 dias. Os resultados mostraram que a sobrevida dos grupos infectados e tratados com EICAR foi similar à sobrevida dos grupos não infectados com o vírus. Foi feita uma análise da carga viral no rim e baço, por meio da técnica de reação de transcrição reversa em cadeia da polimerase (do inglês; reverse transcription-polymerase chain reaction, abreviado RT-PCR). Esta análise demonstrou uma diminuição da carga viral nos animais tratados com o antiviral. Desse estudo concluiu-se que o EICAR é um inibidor da replicação do IPNV, e por isso seu uso para diminuir a carga viral e evitar a mortalidade de peixes constitui um instrumento vantajoso para aumentar a produtividade dos cultivos. Entretanto, o tratamento com antivirais não é útil para a seleção de reprodutores, pelo fato de que os peixes infectados e tratados continuam sendo portadores do vírus e podem transmitir o mesmo para sua descendência. Não obstante, o uso de antivirais é vantajoso porque sem tratamento os peixes morrem e aqueles que sobrevivem sem tratamento antiviral também constituem portadores do vírus.

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Por outro lado, observamos que um dos danos causados por algumas infecções virais é a perda de peso nos peixes infectados (Wolf (1986) The fish viruses. En: Espinosa de los Monteros, J., Labarta, U. (Eds.), Patologia en Acuicultura. Industrias gráficas, Espana, SL, págs. 93-95; Moya et al. (2000) Antiviral Research 48: 125-130). Esta perda de peso é muito menor nos peixes tratados com antivirais, o que representa uma vantagem adicional do uso dos mesmos. Este efeito foi mais evidente na truta do que no salmão prateado (Moya et al. (2000) Antiviral Research 48: 125-130).

O polipeptídio ativador da adenilato ciclase da pituitária (PACAP) pertence à superfamília da secretina/glucagon/peptídio intestinal vasoativo. Este peptídio foi isolado pela primeira vez no ano de 1989, a partir de hipotálamo bovino, e sua capacidade de estimular a secreção do hormônio de crescimento foi demonstrada através da ativação da adenilato ciclase e da subsequente estimulação da produção de adenosina monofosfato cíclico (AMPc) (Miyata et al. (1989) Biochem Biophys Res Commun 164 567-574). O PACAP é um neuropeptídio multifuncional que desempenha funções importantes como fator hipofisiotrópico e neurotrópico, como neurotransmisor, neuromodulador e vasodilatador nos mamíferos (Arimura A. (1998) Japanese Journal of Physiology 48:301-31). Foi demonstrada ainda seu papel na regulação da divisão celular, da diferenciação e da morte celular (Sherwood et al. (2000) Endocrine Review 21: 619-670). Este peptídio existe biologicamente em duas formas moleculares de 38 (PACAP38) e 27 (PACAP27) aminoácidos (Miyata et al. (1990) Biochemical and Biophysical Research Communications 170:643-8). As ações biológicas do PACAP são mediadas pela interação com dois tipos de receptores que pertencem à família dos receptores acoplados à adenilato ciclase: o receptor de tipo I, que é altamente específico para o PACAP e denominado PAC-1, e os receptores de tipo II, que manifestam pelo PACAP a mesma afinidade que pelo peptídio intestinal vasoativo (VIP) e que são conhecidos como VPAC-1 e VPAC-2 (Vaudry etal. (2000) Pharmacol Rev 52: 269-324).

O PACAP está amplamente distribuído no cérebro dos mamíferos, especialmente no hipotálamo, nos núcleos paraventricular e dorsamedi

6/36 al do tálamo, no septo, no cortex cerebral, na amígdala, no hipocampo e no cerebelo (Montero et al. (2000) Journal of Molecular Endocrinology 25: 157168). Nos tecidos periféricos assim como nos tecidos do sistema nervoso central, a forma molecular do PACAP mais abundante é aquela de 38 aminoácidos. Os estudos que foram realizados em diferentes espécies de mamíferos mostram a presença de PACAP nas gônadas (Shioda et al. (1994) Endocrinology 135: 818-5 825), nas glândulas adrenais (Arimura et al. (1991) Endocrinology 129: 2787- 2789), nas glândulas paratireoides (Vaudry et al. (2000) Pharmacol Rev 2000;52: 269-324), no pâncreas endócrino (Arimura e Shioda (1995) Neuroendocrinology 16: 53-88) e no trato gastrointestinal (Arimura et al. (1991) Endocrinology 129: 2787-2789; Vaudry et al. (2000) Pharmacol Rev 52: 269-324; Hannibal et al. (1998) Cell. Tissue. Res. 291: 65-79). Foi ainda descrita a expressão do PACAP em células imunes, apesar de a expressão deste peptídio e de seus receptores em células do sistema imunológico dos mamíferos já ter sido parcialmente esclarecida (Gaytan et al. (1994) Cell Tissue Res 276:223-7; Abad et al. (2002) NeurolmmunoModulation 10:177-86).

Nos mamíferos, entre os tecidos hematopoiéticos foi observada a expressão constitutiva do receptor VPAC-1 em linfócitos do sangue periférico em humanos e em linfócitos e macrófagos murinos, ao passo que a expressão do VPAC-2 é induzível nas referidas células. Por outro lado, foi observada a expressão constitutiva do receptor PAC-1 em macrófagos peritoneais de rato e na linhagem celular mielomonocítica humana THP-1. Adicionalmente, foi reportada a expressão de PACAP em timócitos, diferentes subtipos de células T, em células B, esplenócitos e em linfonodos de rato (Delgado et al. (2001) J Biol Chem 276:369-80; Pozo et al. (2003) Trends Mol Med 9:211-7).

Nos peixes a presença de PACAP e a expressão de seu ácido ribonucleico mensageiro (ARNm), foi observada principalmente no sistema nervoso central (especialmente no hipotálamo, cérebro e cordão espinhal) e no sistema nervoso periférico inervando os olhos, a glândula pituitária, o trato respiratório, as glândulas salivares, o trato gastrointestinal, o trato repro

7/36 dutivo, o pâncreas, e o trato urinário (Sherwood et al. (2000) Endocrine Review 21: 619-670).

Em ratos, o PACAP inibe a apoptose espontânea de timócitos (Delgado. (1996) Blood 87: 5152-5161). O fato de que o PACAP pode controlar a proliferação dos timócitos sugere que ele é um importante regulador da maturação dessas células do sistema imunológico (Delgado. (1996) Blood 87: 5152-5161).

Este peptídio interfere de forma indireta na maturação dos linfócitos mediante a estimulação da liberação de interleucina 6 (IL-6) pelas células foliculares da pituitária. A IL-6 estimula o crescimento e a diferenciação de células B, e promove a síntese e a secreção de imunoglobulinas por estas células (Tatsuno et al. (1991) Endocrinology 129: 1797-1804; Yada et al. (1993) Peptides 14: 235-239).

O peptídio também ativa e suprime a resposta inflamatória mediante a regulação da IL-6 e da interleucina-10 (IL-10) (Martinez et al. (1996) J Immunol 156(1 ):4128-36; Martinez et al. (1998) J Neuroimmunol 85(2): 155-67); Martinez et al. (1998) J Leukoc Biol 63(5):591-601).

Em macrófagos ativados, o PACAP inibe a produção de citocinas pró-inflamatórias e estimula a produção de citocinas anti-inflamatórias, permitindo a homeostasia do sistema imunológico. Adicionalmente, ele reduz a expressão das moléculas coestimuladoras B7.1/B7.2 e a subsequente ativação das células T auxiliares (Th, do inglês T helper). Por outro lado, em macrófagos previamente estimulados, o PACAP inibe, através de seus receptores PAC-1 a produção de IL-6, suprimindo assim a inflamação (Martinez et al. (1998) J Neuroimmunol 85(2): 155-67; Martinez et al. (1998) J Leukoc Biol. 1998 May; 63(5):591-601). A ação inibidora do PACAP sobre a transcrição da IL-6 ante uma intensa estimulação inflamatória ou uma intoxicação ajuda à proteção tecidual e à homeostasia do sistema imunológico (Martinez et al. (1998) J Neuroimmunol 85(2): 155- 67; Martinez et al. (1998) J Leukoc Biol. 1998 May;63(5):591-601). Em contraste, em macrófagos não estimulados, o PACAP induz a expressão de B7.2 e promove a diferenciação celular para um fenótipo Th2. (Delgado e Ganea (2001) Arch Immunol

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Ther Exp (Warsz) 49(2): 101 -10).

De um modo geral, nos últimos anos foi parcialmente elucidada a função do PACAP na modulação do sistema imunológico em mamíferos, sendo demostrando que o PACAP regula tanto o sistema imunológico inato quanto o adquirido e modula a resposta imune pró- e anti-inflamatória nesses organismos. No entanto, a informação existente sobre a possível modulação da resposta antiviral pelo PACAP nesses organismos é escassa. Recentemente, foi demonstrado que em pacientes crônicos de hepatite B, os níveis de PACAP-38 no plasma aumentam uma vez eliminada a viremia pelo tratamento com lamivudina (Elefsiniotis et al. (2003) European Journal of Gastroenterology and Hepatology 15: 1209-1216) sugerindo uma alteração da resposta imune de células T induzida pelo peptídio resultando em uma remissão bioquímica e histológica da doença no fígado dos pacientes.

Em peixes, os estudos sobre as funções biológicas do PACAP in vivo publicados até o momento referem-se fundamentalmente à reprodução (Canosa et al. (2008) American Journal of Physiology (Regul Integr Comp Physiol) 295:1815-21), ao desenvolvimento cerebral (Sherwood et al. (2007) Peptides 28:1680-7) e ao apetite (Matsuda et al. (2005) Peptides 26:1611-6; Maruyama et al. (2006) Peptides 27:1820-6). Recentemente, foi demonstrada a função biológica desse neuropeptídio no crescimento e no desenvolvimento de diferentes espécies de peixes teleósteos no estágio larval (Lugo et al. (2008) Journal of Endocrinology 197:583-97).

O conhecimento sobre a função do PACAP na modulação do sistema imunológico em peixes limita-se a estudos realizados por nosso grupo de trabalho nos quais foi demonstrado que a administração por meio de banhos de imersão ou injeção de PACAP recombinante, isolado a partir de Ciarias gariepinus, promove não só o crescimento, como também estimula parâmetros da imunidade inata (produção de lisozima, metabólitos derivados de óxido nítrico e as defesas antioxidantes) e da imunidade adquirida (IgM), nas larvas e filhotes dos peixes tratados (Carpió et al. (2008) Fish and Shellfish Immunology 25:439-45; Lugo et al. (2010) Fish and Shellfish Immunology 29:513-520). Essas propriedades do peptídio foram divulgadas no

9/36 pedido de patente Neuropéptidos para el cultivo de organismos acuáticos, com número de publicação internacional W02007/059714.

Uma primeira linha de defesa importante contra as infecções virais em vertebrados é constituída pelo sistema interferon (IFN) tipo I. Este sistema é ativado pela indução viral de IFNs tipo I (IFNa e IFNP) através do receptor para IFN-α/β, que desencadeia a transdução de sinais através da via de JAK-STAT.

Essas citocinas produzem um estado antiviral na célula mediante a indução da expressão de proteínas com atividade antiviral como a 2', 5' oligoadenilato sintetase, a proteína quinase R e o grupo de GTPases denominadas proteínas Mx (Goodbourn et al. (2000) Journal of General Virology 81: 2341-2364). A partir dos resultados de investigações recentes ficou estabelecido que os peixes teleósteos possuem um sistema IFN inato semelhante com o dos mamíferos (Robertsen (2006) Fish and Shellfish Immunology 20: 172-191 ; Robertsen (2008) Fish and Shellfish Immunology 25: 351 357). Os IFNs foram clonados de diferentes espécies de peixes, entre os quais encontra-se o peixe-zebra (Danio reno), o peixe-gato americano 5 (Ictalurus punctatus) e o salmão do Atlântico (Salmo salar) (Altmann et al. (2003) Journal of Virology 77: 1992-2002; Lutfalla et al. (2003) BMC Genomics 4: 29; Robertsen et al. (2003) Journal of Interferon and Citokine Research 23: 601-612; Long et al. (2006) Fish and Shellfish Immunology 21: 42-59). Adicionalmente, foram identificados vários fatores reguladores de IFN e moléculas da via de sinalização JAK-STAT em várias espécies de peixes, assim como as proteínas Mx e outros genes estimulados por IFN. Também foi demonstrada a atividade antiviral de proteínas Mx no salmão do Atlântico e no linguado japonês (Paralichtys olivaceus) (revisado por Robertsen (2006) Fish and Shellfish Immunology 20: 172- 191).

Embora em crustáceos não se tenham sido encontrados genes similares aos interferons, foi observado que moléculas como STAT, que são moléculas que são ativadas durante a resposta ao interferon em vertebrados, são reguladas negativamente em resposta à infecção por WSSV. A regulação negativa de STAT durante a infecção viral em mamíferos antago

10/36 niza a resposta dos IFNs tipo I (revisado por Johnson et al. (2008) Vaccine 26: 4885-4992). Em bivalvulados o que se sabe sobre a resposta antiviral é ainda mais escasso. Existem algumas evidências de atividade antiviral na hemolinfa e foi sugerida a presença de um mecanismo tipo IFN (Olicarda et al. (2005) Antiviral Research 66(2-3): 147-152; Defer et al., (2009) Aquaculture 293(1-2): 1-7).

No desenvolvimento da aquicultura, é interessante obter novos compostos ou composições que possam ser empregados no controle das infecções virais, devido às consequências que essas infestações trazem para esta atividade.

Explicação da Invenção

A presente invenção resolve o problema mencionado acima oferecendo uma nova alternativa para o controle das infecções virais na aquicultura, mediante o uso de PACAP na fabricação de composições para o tratamento de infecções virais e doenças infecciosas causadas por vírus em organismos aquáticos.

O termo tratamento no contexto da presente invenção referese a qualquer efeito benéfico na regressão da doença que inclui atenuação, redução, decremento ou diminuição da evolução patológica depois do início da doença.

O termo antiviral, conforme usado na presente invenção, inclui qualquer molécula definida como tal na literatura, assim como qualquer análogo, derivado funcional ou fragmento ativo.

O termo polipeptídio ativador da adenilato ciclase da pituitária (PACAP), conforme usado na presente invenção, inclui essa molécula em qualquer de suas variantes (PACAP27 ou PACAP38), isolado de sua fonte natural, ou de origem sintética ou produzida pela tecnologia de DNA recombinante.

Em uma realização da presente invenção, variantes do neuropeptídio PACAP isolado (ou em combinação com uma molécula com atividade antiviral conhecida) são aplicadas a peixes, crustáceos e bivalvulados por meio de banhos de imersão a intervalos de 2-3 dias. Como alimento

11/36 formulado, o PACAP é aplicado a esses organismos como composto isolado ou em combinação com uma molécula de atividade antiviral conhecida. Como resultado principal constatamos que as preparações, administradas por banhos de imersão, injeção ou por via oral, foram eficazes em aumentar a sobrevida de organismos aquáticos infectados com vírus e tratados com as referidas preparações. Observamos ainda que o peso corporal desses organismos foi mantido ou aumentado, em comparação com aquele dos organismos infectados e não tratados. A análise de amostras de tecidos e órgãos suscetíveis à infecção viral por RT-PCR mostrou, ainda, uma diminuição da carga viral nos organismos infectados e tratados.

Até o momento da presente invenção não se sabia se o PACAP modulava ou não a resposta antiviral em peixes, crustáceos e bivalvulados e dos mecanismos envolvidos. Na presente invenção demonstramos, pela primeira vez, tanto in vitro como in vivo uma relação entre o PACAP e a resposta a vírus em peixes, crustáceos e bivalvulados. Adicionalmente, descrevemos pela primeira vez um efeito positivo inesperado do PACAP sobre moléculas envolvidas na resposta antiviral, tais como as proteínas Mx, interferon gama (IFNy) e TLR9 (do inglês: toll like receptor 9), assim como uma regulação diferencial desse peptídio e seus receptores em células do sistema imunológico de peixes tratadas com vírus e/ou poli l:C tanto in vitro como in vivo.

O tratamento de infecções virais em peixes, crustáceos e bivalvulados pela administração de PACAP ou de uma combinação de PACAP com uma molécula antiviral de ação conhecida em peixes não fora divulgado nem sugerido previamente no estado da técnica.

No contexto da invenção, a administração de PACAP e da molécula antiviral pode ser simultânea (em uma única formulação), sequencial ou separada por um intervalo de tempo. As preparações são administradas aos organismos aquáticos por via oral, injeção ou por meio de banhos de imersão.

Na presente invenção peixes, crustáceos e bivalvulados são tratados com PACAP e com preparações que contêm moléculas antivirais

12/36 combinadas com PACAP. Foi inesperadamente observado que o neuropeptídio PACAP tem atividade antiviral em peixes, crustáceos e bivalvulados. Por outro lado, foi demonstrado que a combinação de PACAP com substâncias de atividade antiviral conhecida reporta uma resposta antiviral superior (sinergística) àquela do PACAP isolado, tanto in vitro como in vivo. Em peixes, até o presente, não haviam sido atribuídas funções biológicas ao PACAP na resposta antiviral. Por outro lado, até o momento o PACAP não fora isolado em camarões nem em bivalvulados, tampouco outro peptídio pertencente à superfamília da secretina e do glucagon. Só foram reportadas evidências experimentais da estimulação do crescimento em camarões pela administração exógena de PACAP recombinante de peixes (pedido de patente com número de publicação internacional W02007/059714). Portanto, até a presente invenção não se tinha conhecimento algum acerca de sua possível relação com a resposta a vírus em crustáceos e bivalvulados.

Constitui também o objetivo desta invenção uma composição para o tratamento de infecções virais e doenças infecciosas causadas por vírus em organismos aquáticos caracterizada por compreender o polipeptídio ativador da adenilato ciclase da pituitária (PACAP). Em uma modalidade da invenção, o PACAP que faz parte da referida composição é obtido por isolamento de sua fonte natural, de forma sintética, ou pela tecnologia de DNA recombinante. A composição é administrada por via oral, por injeção, ou por banhos de imersão. Em uma modalidade da invenção o PACAP é um polipeptídio proveniente de peixes.

A presente invenção também se refere a uma combinação veterinária caracterizada por compreender o polipeptídio ativador da adenilato ciclase da pituitária (PACAP) e uma molécula antiviral. Em uma modalidade da invenção o antiviral é a ribavirina ou um análogo da ribavirina. Os elementos que fazem parte da combinação, o PACAP e o antiviral, são administrados de forma simultânea, separada ou sequencial no curso de um mesmo tratamento. Em uma modalidade da invenção, a combinação é empregada no tratamento de infecções virais e doenças infecciosas causadas por vírus em organismos aquáticos. O PACAP e o antiviral são administra13/36 dos a esses organismos por via oral, por injeção, ou por banhos de imersão.

Em uma modalidade da invenção, na referida combinação, ο PACAP é administrado como alimento formulado, a uma concentração de 50 - 750 pg/ Kg de ração e o antiviral a uma concentração de 100 a 2000 mg/ Kg de ração. Em uma segunda modalidade da invenção, o PACAP é administrado aos peixes por injeção em uma concentração de 0,1-10 pg por grama de peso corporal e o antiviral a uma concentração de 1-50 pg/g de peso, como parte da combinação veterinária. Em uma outra modalidade da invenção, na referida combinação, o PACAP é administrado aos peixes ou crustáceos por banhos de imersão em uma concentração de 50-1000 pg por litro de água e o antiviral a uma concentração de 100-2000 pg/L.

Na invenção, tanto o PACAP quando utilizado como antiviral, como a combinação do referido peptídio com uma entidade antiviral conhecida, são administrados a uma diversidade de organismos aquáticos. Por exemplo, entre eles estão os salmonídeos, os camarões peneídeos, e os bivalvulados.

A composição que compreende PACAP, assim como a combinação do referido peptídio com um antiviral, são úteis no tratamento terapêutico de infecções virais causadas por vírus das famílias Herpesviridae, Papovaviridae, Togaviridae, Retroviridae, Reoviridae, Birnaviridae e Picornaviridae.

Na invenção, tanto o PACAP quando utilizado como antiviral, como a combinação do referido peptídio com uma entidade antiviral conhecida, são utilizado para o controle de infecções causadas pelo IPNV, o VHSV e o ISAV. Também são empregados no tratamento terapêutico de infecções virais causadas pelo WSSV, o YHV, o TSV, o IHNNV, e o MBV.

Também faz parte da presente invenção um método para o controle de infecções virais na aquicultura que compreende a administração de PACAP, ou de combinações veterinárias que compreendem PACAP, a organismos aquáticos em cultivo.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1. Análise da expressão por PCR em tempo real do re

14/36 ceptor PAC-1 em leucócitos de rim anterior de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) tratados in vitro com poli l:C (30 pg/mL) ou infectados com IPNV (multiplicidade de infecção (do inglês multiplicity of infection, abreviado m.o.i) de 0,1) nas 4, 24 e 48 horas depois de iniciado o experimento. As culturas de leucócitos foram tratadas em duplicata, e os níveis de expressão do receptor PAC-1 foram analisados por PCR quantitativo em triplicata. Os dados estão expressos como a média da expressão relativa de PAC-1 em relação ao gene endógeno de expressão constitutiva EF1 α ± desvio padrão da média (DS). * (p<0,05) indica que a expressão relativa de PAC-1 foi estatisticamente superior em relação a sua expressão relativa nas culturas de leucócitos não tratados (controle negativo).

Figura 2. Análise da expressão por PCR em tempo real do receptor PAC-1 na linhagem celular de macrófagos de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) RTS-11 infectada in vitro com VHSV (m.o.i de 0,1) nos dias 1, 4 e 8 depois de iniciado o experimento. O experimento foi realizado em duplicata, e os níveis de expressão do receptor PAC-1 foram analisados por PCR quantitativo em triplicata. Os dados estão expressos como a média da expressão relativa de PAC-1 em relação ao gene endógeno de expressão constitutiva EF1 α ± desvio padrão da média (DS). * (p<0,05) indica que a expressão relativa de PAC-1 foi estatisticamente inferior em relação a sua expressão relativa nas culturas de leucócitos não tratados (controle negativo).

Figura 3. Análise da expressão por PCR em tempo real do receptor VPAC-1 em leucócitos de rim anterior de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) tratados in vitro com poli l:C (30 pg/ml_) ou infectados com VHSV (m.o.i de 0,1) nas 4, 24 e 48 horas depois de iniciado o experimento. O experimento foi realizado em duplicata e os níveis de expressão do receptor PAC-1 foram analisados por PCR quantitativo em triplicata. Os dados estão expressos como a média da expressão relativa de VPAC-1 em relação ao gene endógeno de expressão constitutiva EF1 α ± desvio padrão da média (DS). * (p<0,05) indica que a expressão relativa de VPAC-1 foi estatisticamente superior em relação a sua expressão relativa nas culturas de leu15/36 cócitos não tratados (controle negativo).

Figura 4. Análise da expressão por PCR em tempo real do receptor PAC-1 em leucócitos de rim anterior (A) e de baço (B) de trutas arcoíris (Oncorhynchus mykiss) infectadas experimentalmente in vivo com VHSV (100 μΙ_ de 1 x 10⁷ TCID₅₀ (título viral do sobrenadante da cultura) / mL por peixe). Foram feitas misturas de cinco RNAs totais de rim anterior e de cinco RNAs totais de baço, correspondentes a 5 peixes tomados ao acaso de cada grupo experimental nos dias 3, 7 e 10 depois da infecção viral. Os níveis de expressão do receptor PAC-1 foram analisados por PCR quantitativo em triplicata. Os dados estão expressos como a média da expressão relativa de PAC-1 em relação ao gene endógeno de expressão constitutiva EF1 α ± desvio padrão da média (DS). *(p<0,05).

Figura 5. Análise da expressão por PCR em tempo real do receptor VPAC- em leucócitos de rim anterior (A) e de baço (B) de truta arcoíris (Oncorhynchus mykiss) infectadas experimentalmente in vivo com VHSV (100 μΙ_ de 1 x 10⁷ TCID₅₀ / mL por peixe). Foram feitas misturas de cinco RNAs totais de rim anterior e de cinco RNAs totais de baço, correspondentes a 5 peixes tomados ao acaso de cada grupo experimental, nos dias 3, 7 e 10 depois da infecção viral. Os níveis de expressão do receptor VPAC-1 foram analisados por PCR quantitativo em triplicata. Os dados estão expressos como a média da expressão relativa de VPAC-1 em relação ao gene endógeno de expressão constitutiva EF1 α ± desvio padrão da média (DS). * (p<0,05).

Figura 6. Análise da expressão por PCR em tempo real do PACAP en leucócitos de baço de trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss) infectadas experimentalmente in vivo com VHSV (100 pL de 1 x 10⁷ TCID50 / mL por peixe). Foram feitas misturas de cinco RNAs totais de baço correspondentes a 5 peixes tomados ao acaso de cada grupo experimental, nos dias 3, 7 e 10 depois da infecção viral. Os níveis de expressão do receptor PACAP foram analisados por PCR quantitativo em triplicata. Os dados estão expressos como a média da expressão relativa de PACAP em relação ao gene endógeno de expressão constitutiva EF1 α ± desvio padrão da média

16/36 (DS). * (p<0,05).

Figura 7. Análise por PCR em tempo real do efeito do PACAP38 in vitro sobre a transcrição das proteínas Mx em leucócitos de sangue periférico (A) e de rim anterior (B) de trutas saudáveis. O efeito do PACAP38 foi avaliado nas concentrações de 10‘¹°, 10'⁹ e 10‘⁸ M depois de 48 horas de tratamento. O experimento foi repetido 4 vezes. As culturas de leucócitos foram tratadas em duplicata e as reações de PCR foram realizadas em triplicata. Os dados estão expressos como a média da expressão relativa do gene de interesse (Mx) em relação ao gene endógeno de expressão constitutiva EF1 α ± desvio padrão da média (DS). * (p<0,05) indica que a expressão relativa do gene de interesse foi estatisticamente superior em relação a sua expressão relativa nas culturas de leucócitos não tratados (controle negativo).

Figura 8. Análise por PCR em tempo real do efeito do PACAP38 in vitro sobre a transcrição de IFNy em leucócitos de sangue periférico (A) e de rim anterior (B) de trutas saudáveis. O efeito do PACAP38 foi avaliado nas concentrações de 10' ,10' e 10 M depois de 48 horas de tratamento. O experimento foi repetido 4 vezes. As culturas de leucócitos foram tratadas em duplicata e as reações de PCR foram realizadas em triplicata. Os dados estão expressos como a média da expressão relativa do gene de interesse (IFNy) em relação ao gene endógeno de expressão constitutiva EF1 α ± desvio padrão da média (DS). *(p<0,05) indica que a expressão relativa do gene de interesse foi estatisticamente superior, em relação a sua expressão relativa nas culturas de leucócitos não tratados (controle negativo).

Figura 9. Análise por PCR em tempo real do efeito do PACAP38 in vitro sobre a transcrição de TLR9 em leucócitos (A) de sangue periférico e (B) de rim anterior de trutas saudáveis. O efeito do PACAP38 foi avaliado nas concentrações de 10’¹⁰, 10’⁹ e 10'⁸ M depois de 48 horas de tratamento. O experimento foi repetido 4 vezes. As culturas de leucócitos foram tratadas em duplicata e as reações de PCR foram realizadas em triplicata. Os dados estão expressos como a média da expressão relativa do gene de interesse (TLR9) em relação ao gene endógeno de expressão constitutiva EF1 α ±

17/36 desvio padrão da média (DS). * (p<0,05) indica que a expressão relativa do gene de interesse foi estatisticamente superior em relação a sua expressão relativa nas culturas de leucócitos não tratados (controle negativo).

Figura 10. Ensaio in vitro para determinar a atividade antiviral das combinações PACAP-ribavirina (Rib-PACAP). 24 horas antes da invenção, as células foram tratadas com o antiviral ou com as combinações PACAP-antiviral. Estabeleceu-se como controle positivo células infectadas com vírus, sem tratamento antiviral (C⁺) e negativos: células sem infecção e sem tratamento com o antiviral (C-) e células tratadas com antiviral (Cn-Av) ou com diferentes doses de PACAP. As células foram infectadas com o inóculo viral por um período de 30 minutos de adsorção. Posteriormente, elas foram lavadas com PBS e os diferentes tratamentos foram novamente agregados. A avaliação da inibição dos efeitos citopáticos (CPE) foi feita empregando o método de coloração com cristal violeta (leitura de absorvência 550 nm).

Descrição Detalhada de modos de realização/Exemplos de realização

Exemplo 1. Expressão do receptor PAC-1 em leucócitos de rim anterior de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) tratados in vitro com Poli l:C e IPNV e na linhagem celular de macrófagos de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) RTS-11 infectada in vitro com VHSV

Foram utilizados filhotes de truta arco-íris (O. mykiss) de 9 a 12 gramas de peso e de 7 meses de idade, livres de VHSV e IPNV. Os peixes foram mantidos a 14°C com recirculação de água. A alimentação foi administrada duas vezes ao dia ad libitum. Os vírus, VHSV (cepa 0771) e IPNV (cepa Sp.) foram propagados na linhagem celular de gônadas de truta arcoíris RTG-2 (de Sena e Rio (1975) Infect Immun 11:815-22). As células foram cultivadas em meio mínimo essencial (MEM, Invitrogen, USA) suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (FCS, Invitrogen) contendo 100 UI/mL de penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina. Os vírus foram inoculados em células RTG-2 cultivadas em MEM com antibióticos e 2% de FCS a 14°C. Quando se observaram efeitos citopáticos extensos, os sobrenadantes das culturas foram secados e centrifugados para eliminar os restos de células.

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Para a realização dos experimentos foram usados os sobrenadantes de cultura clarificados. Os títulos virais foram determinados em placas de 96 poços segundo reportado por Reed e Muench (Reed e Muench (1998) J Hyg 27:280-9).

Foram isolados leucócitos do rim anterior de 4 trutas seguindose o método descrito por Graham e Secombes (Graham e Secombes (1998) Immunology 65:293- 7). Resumidamente, o rim anterior foi extraído assepticamente e passado através de uma malha de nylon de 100 pm utilizando o meio Leibovitz (L-15, Gibco, UK) suplementado com penicilina 100 UI/mL, estreptomicina (100 pg/mL), heparina (10 unidades/mL) e FCS a 2%. A suspensão celular resultante foi cuidadosamente colocada sobre um gradiente de Percoll a 51%. O anel de células correspondente aos leucócitos foi extraído cuidadosamente, lavado duas vezes em L-15 contendo FCS a 0,1 %. As células foram ressuspendidas em L-15 com FCS a 5% a uma concentração de 5x10⁶ células por mL e foram distribuídas em placas de 24 poços a 1 mL por poço. Os leucócitos foram expostos a 30 pg/mL de poli l:C (Sigma) ou infectados com IPNV a uma m.o.i de 0,1 e incubados a 14°C por 4 horas, 24 horas e 48 horas.

Finalmente, RNA total das culturas de leucócitos foi purificado pelo método descrito por Chomczynski e Sacchi (Chomczynski e Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162:156-9) para avaliar os níveis de expressão do receptor PAC-1 em leucócitos não tratados e tratados com poli l:C ou infectados com vírus. As amostras foram tratadas com uma nuclease de ácido desoxirribonucleico (DNA), especificamente com DNAse livre de RQ1 RNase (Promega), com o propósito de eliminar o DNA genômico que pudesse estar presente nas amostras. Para a síntese dos DNAs complementares (cDNA) foi utilizado um kit de reativos comercial que emprega a transcriptase reversa SuperScript III (Invitrogen). Para as reações de PCR quantitativas (qPCR) foi utilizada uma mistura de PCR de origem comercial: Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystem). Os resultados das qPCR foram normalizados contra urn gene endógeno de expressão constitutiva, especificamente contra o fator de elongação 1α (EF 1α) e foram feitos em triplicata.

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Os resultados foram expressos como 2 ^ACt, onde ÁCt equivale a subtração do valor de Ct do gene avaliado menos o valor de Ct do gene normalizador (EF 1a).

O resultado obtido foi que os níveis de PAC-1 são superexpressos nas culturas de leucócitos tratadas com poli l:C nas 4, 24 e 48 horas do experimento, o que sugere que o receptor PAC-1 está envolvido na resposta a vírus em peixes, levando-se em conta que o poli l:C é uma molécula que por ser estruturalmente igual ao RNA de cordão duplo, produz um efeito similar ao de uma infecção viral (muitos vírus apresentam genoma de RNA). Esses resultados são vistos na Figura 1. Poli l:C interage com o receptor tipo toll-3 (TLR3) que é expresso em compartimentos intracelulares das células B e células dendríticas. El TLR-3 é estimulado por natureza por vírus.

Por outro lado, os níveis de expressão do PAC-1 passaram de valores detectáveis nas culturas de leucócitos não tratados a valores indetectáveis nas culturas de leucócitos infectadas com IPNV nas 4, 24 e 48 horas depois da infecção, o que confirma uma participação desse receptor que se une especificamente ao PACAP na resposta antiviral em peixes (Figura 1). As diferenças observadas entre o efeito do mimético viral poli l:C e o do IPNV poderíam estar associadas a um efeito específico do vírus nas células infectadas, provavelmente em seu benefício.

Adicionalmente, foram avaliados os níveis de expressão de PAC-1 na linhagem celular de macrófagos de truta (O. mykiss) RTS-11 infectada com VHSV, o procedimento de infecção viral da linhagem RTS-11 foi semelhante àquele descrito anteriormente para a linhagem RTG-2. Igualmente, foi observada uma regulação negativa dos níveis de expressão de PAC-1 nos dias 4 e 8 posterior à infecção com VHSV (Figura 2).

Exemplo 2. Expressão do receptor VPAC-1 em leucócitos de rim anterior de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) tratados in vitro com Poli LCeVHSV

Para avaliar os níveis de expressão do receptor VPAC-1 foi feito um desenho experimental igual àquele descrito no Exemplo 1.

O resultado obtido foi que os níveis de VPAC-1 são superex

20/36 pressos nas culturas de leucócitos tratadas com poli l:C nas 4, 24 e 48 horas do experimento, o que sugere que o receptor VPAC-1 assim como o PAC-1 está envolvido na resposta a vírus em peixes, levando-se em conta que o poli l:C é considerado uma molécula mimética viral (Figura 3).

Por outro lado, os níveis de expressão do VPAC-1 foram indetectáveis nas culturas de leucócitos infectadas com VHSV nas 4, 24 e 48 horas depois da infeção, o que confirma uma participação desse receptor que une se ao VIP e ao PACAP com a mesma afinidade na resposta antiviral em peixes (Figura 3).

Assim como o observado com o receptor PAC-1 em cultura de leucócitos de rim anterior infectados com IPNV, as diferenças observadas na regulação do VPAC-1 pelo tratamento dos leucócitos in vitro com poli l:C e pela infecção por VHSV poderíam estar associadas a um efeito específico do vírus como entidade biológica completa nas células infectadas, provablemente en seu benefício.

Exemplo 3. Expressão do PACAP e dos receptores PAC-1 e VPAC-1 em leucócitos de baço e de rim anterior de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) infectadas in vivo com VHSV

O VHSV (cepa 0771) foi propagado na linhagem celular RTG-2 (de Sena e Rio (1975) Infect Immun 1 1:815-22). Em resumo, os vírus foram inoculados na linhagem celular RTG-2 cultivada em MEM com antibióticos (100 UI/mL de penicilina e 100 g/mL de estreptomicina) e 2% de FCS a 14°C. Quando se observaram efeitos citopáticos extensos, os sobrenadantes das culturas foram secados e centrifugados para eliminar os restos de células. Para a infecção das trutas foram usados os sobrenadantes de cultura clarificados. Os títulos virais foram determinados em placas de 96 poços segundo reportado por Reed e Muench (Reed e Muench (1998) J Hyg 27:280-9).

Foram utilizados filhotes de truta arco-íris (O. mykiss) de 9 a 12 gramas de peso e de 7 meses de idade e livres de VHSV e IPNV. Os peixes foram mantidos a 14°C com recirculação de água. A alimentação foi administrada duas vezes ao dia ad libitum. Foram formados dois grupos expert

21/36 mentais de 20 trutas cada grupo, um grupo foi injetado com solução viral (100 pL de 1 x 10⁷ TCID50 / mL por peixe) e 0 outro grupo (utilizado como controle negativo) foi injetado com meio de cultura de RTG-2 não infectada com VHSV.

Nos dias 1, 3, 7 e 10 pós-injeção, 5 trutas foram apanhadas ao acaso e foram sacrificadas por superexposição ao anestésico MS-22. Posteriormente foram extraídos 0 rim anterior e 0 baço para proceder à purificação de RNA total desses órgãos, de acordo com o método descrito por Chomczynski e Sacchi (Chomczynski e Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162:156-9). A síntese de cDNA e as reações das PCR quantitativas foram realizadas da maneira descrita no Exemplo 1.

Para as reações de transcrição reversa (RT), foram feitas misturas de cinco RNAs totais de cada órgão selecionado, correspondente aos cinco indivíduos de cada grupo experimental apanhados ao acaso no dia 1, 3, 7 e 10 do experimento.

O resultado obtido foi que no baço os receptores PAC-1 e VPAC-1 são superexpressos no dia 3 pós-injeção em relação ao controle negativo. Os níveis de expressão são inferiores em relação ao grupo de controle no dia 10 pós-injeção. No rim anterior, os receptores PAC-1 e VPAC-1 apresentam níveis de expressão inferiores ao do grupo de controle nos dias 1 e 3, sendo os valores de VPAC-1 no dia 10 indetectáveis. No dia 7 ambos os receptores aumentam seus níveis de expressão em relação ao grupo de controle negativo. Foi ainda observado que ambos os receptores apresentam um padrão de expressão similar no tempo posterior à infecção viral (Figuras 4 e 5).

Os valores de expressão do PACAP no dia 1 são inferiores em relação àquele de seu controle negativo e no dia 7 são superiores. Esses resultados estão correlacionados com aqueles de seus dois receptores PAC-1 e VPAC-1, no sentido de que os níveis de expressão dos receptores mostram uma tendência a ser inferiores (no dia 1) e superiores (no dia 7) em relação ao grupo de controle negativo. No dia 10 os valores de expressão do PACAP são inferiores em relação ao grupo de controle negativo (Figuras 4,

22/36 e 6).

A variação dos níveis de expressão do PACAP e de seus receptores PAC-1 e VPAC-1 no baço e no rim anterior de peixes infectados experimentalmente com VHSV e IPNV demonstram a participação de ambos os receptores na resposta antiviral em peixes in vivo. Isto foi corroborado em experimentos de desafio nos quais foi observado um efeito positivo do PACAP na resposta antiviral em salmonídeos, aumentando a sobrevida de peixes infectados, potencializando a resposta imune ante a infecção viral e removendo o vírus dos órgãos e fluidos susceptíveis à infecção viral.

Exemplo 4. Efeito do PACAP sobre a transcrição das proteínas Mx, IFNy e TLR9 em leucócitos de sangue periférico e de rim anterior de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) saudáveis

Foram utilizados filhotes de truta arco-íris (O. mykiss) de aproximadamente 50 gramas de peso, livres de VHSV e IPNV. Os peixes (n=5) foram anestesiados com sal de ácido metanossulfônico (Sigma, USA) e foram extraídos assepticamente primeiro sangue periférico da veia caudal e posteriormente o rim anterior.

Foram isolados leucócitos de sangue periférico e de rim anterior de 5 trutas de forma independente, seguindo-se o método descrito por Graham e Secombes (Graham e Secombes (1998) Immunology 65:293-7).

O sangue periférico de cada peixe foi diluído 4 vezes em meio Leibovitz (L-15, Gibco, UK) suplementado com penicilina 100 UI/mL, estreptomicina (100 pg/mL), heparina (10 unidades/mL) e FCS a 2%, e foi cuidadosamente colocado sobre um gradiente de Percoll a 51 %. O anel de células correspondente aos leucócitos foi cuidadosamente extraído, e lavado duas vezes em L-15 contendo FCS a 0,1 %.

O rim anterior foi passado através de uma malha de nylon de 100 pm utilizando meio Leibovitz (L-15, Gibco, UK) suplementado com penicilina 100 UI/mL, estreptomicina (100 pg/mL), heparina (10 unidades/mL) e FCS a 2%. A suspensão celular resultante foi diluída 1:4 no mesmo meio L15 suplementado e foi cuidadosamente colocada sobre um gradiente de Percoll a 51 %. O anel de células correspondente aos leucócitos foi cuida23/36 dosamente extraído, e lavado duas vezes em L-15 contendo FCS a 0,1 %.

As células foram ressuspendidas em L-15 com FCS a 5% a uma concentração de 5x10⁶ células por mL e foram distribuídas em placas de 24 poços a 1 mL por poço. Os leucócitos foram tratados com 3 doses de PACAP38 de Ciarias gariepinus obtido por síntese química (10'¹⁰ M, 10‘⁹ M o e 10' M) em duplicata utilizou-se como controle negativo leucócitos não tratados distribuídos em duplicata.

Os níveis de Mx, IFNy e TLR9 foram avaliados 48 horas depois dos tratamentos. Para tanto, RNA total das culturas de leucócitos controles e tratados com PACAP foi purificado nos tempos mencionados anteriormente, pelo método descrito por Chomczynski e Sacchi (Chomczynski e Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162:156-9). Tendo em conta que os iniciadores desenhos para amplificar Mx, IFNy e TLR9 não discriminam entre cDNA e DNA genômico, os RNAs totais purificados a partir de diferentes tecidos com uma nuclease de DNA, especificamente com a DNAse livre de RQ1 RNase (Promega), foram tratados com a finalidade de eliminar o DNA genômico que pudesse estar presente nas amostras.

Para a síntese dos cDNAs foi utilizado um kit de reativos comercial que emprega a transcriptase reversa SuperScript III (Invitrogen). Finalmente, para as reações de PCR quantitativas (qPCR) foi utilizada uma mistura de PCR de origem comercial: Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystem). Os resultados das qPCR foram normalizados contra urn gene endógeno de expressão constitutiva, especificamente contra o fator de elongação 1α (EF 1α) e foram feitos em triplicata. Os resultados foram expressos como 2'^ACt, onde ACt equivale a subtração do valor de Ct do gene avaliado menos o valor de Ct do gene normalizador (EF 1a).

Os níveis das proteínas Mx aumentam depois de 48 horas de tratamento nas culturas de leucócitos de sangue periférico tratadas com 10’ ¹⁰ M de PACAP38. Com a dose de 10'⁹ M, observa-se também um efeito estimulador de PACAP38 sobre a transcrição das proteínas Mx em relação ao controle negativo, mas os níveis de expressão detectados foram inferiores aos níveis obtidos com a dose de 10’ M. Com a dose de 10' M não

24/36 foram observadas diferenças nos níveis de expressão das proteínas Mx em relação ao controle negativo. Esses resultados mostram um efeito positivo de PACAP38 sobre a transcrição das proteínas Mx a concentrações baixas na faixa de (10‘⁹ -1O’¹⁰ M) (Figura 7 A). Em leucócitos de rim anterior, o efeito do PACAP 38 sobre as proteínas Mx é mais moderado que em leucócitos de sangue periférico, observando-se um efeito estimulador com a dose de 0’ ⁹ M (Figura 7B).

Adicionalmente, observou-se um efeito estimulador do PACAP38 sobre a expressão do TLR9, passando de valores indetectáveis de TLR9 nas culturas de leucócitos de sangue periférico não estimuladas com PACAP a valores detectáveis nas culturas estimuladas com PACAP38 na faixa (10' -10' M). Os maiores valores foram obtidos com a dose de 10'

M (Figura 8 A). Em leucócitos de rim anterior, assim como foi observado com a expressão das proteínas Mx, o efeito foi mais moderado, observandose níveis de expressão de TLR9 estatisticamente superiores ao controle negativo com a dose intermediária de 10'⁹ M (Figura 8 B).

Os níveis de INFy passaram de valores indetectáveis nas culturas de leucócitos de sangue periférico controle negativo para valores detectáveis nas culturas tratadas com as 3 doses de PACAP38, obtendo-se os níveis de expressão mais altos com a dose intermediária de 10‘⁹ M (Figura 9 A). Por outro lado, observou-se que o PACAP38 estimula a transcrição do INFy em cultura de leucócitos de rim anterior. Os níveis de expressão de INFy foram estatisticamente superiores em relação ao grupo de controle

Q O com as dose de 10' -10’ M, obtendo-se os melhores resultados com a dose mais alta de 10'⁸ M (Figura 9 B).

Exemplo 5. Efeito in vitro da administração de PACAP em combinação com a ribavirina sobre o IPNV

Como isolado viral, foi utilizado um sobrenadante de IPNV obtido a partir da cultura celular (ATCC cepa VR-299). A confirmação viral foi realizada através de uma PCR específica. Foi utilizada a linhagem celular CHSE-214 (Chinook salmon embryo) (ECACC n°00/F/031). Esta foi mantida a 18°C em meio MEM suplementado com sais de Eagle, 10% de soro fetal

25/36 bovino (SFB), 2 mM de glutamina e antibióticos.

O inóculo cresceu a 15°C e 2% de SFB e antes do ensaio foi titulado pela técnica de Reed e Muench, (Reed e Muench (1938) The American Journal of Hygiene 27: 493-497), determinando-se o título viral do sobrenadante da cultura (TCID₅₀). A partir do inóculo viral foi preparada uma diluição de 0,1 m.o.i. para o ensaio. Foram preparadas placas de 96 poços semeadas com CHSE-214 mantida a 18°C em MEM (com sais de Eagle) e suplementadas com 10% de SFB, 2 mM de glutamina e antibióticos. Foram avaliadas diferentes concentrações de ribavirina e 3 concentrações diferentes de PACAP (0,1, 1 e 10 mM). Nas 24 horas anteriores à infecção, as células foram tratadas com o antiviral ou com as combinações PACAPantiviral, estabelecendo controles positivos (células infectadas com vírus, sem tratamento antiviral) e negativos (células sen infecção e sem tratamento com o antiviral e células tratadas com antiviral ou com diferentes doses de PACAP e não infectadas). As células foram infectadas com o inóculo viral por um período de 30 minutos de adsorção. Posteriormente elas foram lavadas com PBS e os diferentes tratamentos diluídos em MEM suplementado com SFB a 2% e antibióticos foram novamente agregados. O ensaio terminou uma vez observado o efeito citopático (CPE) no controle positivo. A avaliação foi feita por microscopia e coloração com cristal violeta (leitura de absorvência 550 nm). O CPE no controle positivo foi observado 3 dias após a infecção, e com o isso o ensaio foi dado por finalizado. Os resultados da inibição do CPE em relação ao controle infectado e não tratado obtidos a partir dos valores de absorvência da coloração com cristal violeta estão mostrados na Figura 10. A análise da atividade antiviral da ribavirina em combinação com o PACAP foi feita utilizando o programa Calcusyn para Windows (Biosoft). O valor do índice de combinação de Chou obtido mostrou sinergismo entre ambas as drogas para os valores de concentração ensaiados.

Exemplo 6. Efeito da administração de PACAP e da combinação PACAP mais ribavirina a trutas arco-íris (O. mykiss) infectadas experimentalmente com IPNV

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Foi realizado um experimento para avaliar o efeito da administração de PACAP e da combinação PACAP-ribavirina em trutas arco-íris infectadas experimentalmente com IPNV. Foram formados 8 grupos experimentais de 50 peixes de 1,6 ± 0,4 g cada um e os peixes foram mantidos em água a 10-12°C:

Grupo 1: Peixes sem tratamento, não expostos ao vírus

Grupo 2: Peixes sem tratamento, expostos ao vírus

Grupo 3: Grupo tratado com ribavirina a uma dose de 400 pg/L de água, expostos ao vírus

Grupo 4: Grupo tratado com ribavirina a uma dose de 800 pg/L de água, expostos ao vírus

Grupo 5: Grupo tratado com PACAP a uma dose de 100 pg/L de água, expostos ao vírus

Grupo 6: Grupo tratado com PACAP a uma dose de 200 pg/L de água, expostos ao vírus

Grupo 7: Grupo tratado com a combinação 1 (ribavirina 400 pg/L-PACAP 100 pg/L), expostos ao vírus

Grupo 8: Grupo tratado com a combinação 2 (ribavirina 800 pg/L-PACAP 200 pg/L), expostos ao vírus

Os peixes se alimentaram com uma quantidade de ração equivalente a 3% da biomassa total por grupo, duas vezes ao dia. Os peixes foram expostos ao vírus colocando-se os mesmos em água a 10-12°C contendo aproximadamente 10⁵ unidades formadoras de placas (pfu)/mL de IPNV (ATCC cepa VR-299) por 2 horas. Os peixes dos Grupos 1 e 2 foram submetidos ao mesmo estresse do tratamento sem o composto antiviral ou a combinação PACAP-antiviral. Os peixes do grupo 1 foram submetidos ao mesmo procedimento com meio de cultura celular em lugar do vírus. A identificação do vírus foi feita por RT-PCR, a partir de rim e baço, de acordo com o método descrito por López-Lastra et al. (1994) Journal of Fish Diseases 17: 269-282. O tratamento com PACAP ou com a combinação PACAPantiviral foi feito 3 vezes por semana durante 20 dias. A primeira vez o tratamento foi feito 2 horas depois da infecção viral. As observações experi

27/36 mentais foram efetuadas durante o período de 20 dias de tratamento e nos 25 dias posteriores a este. Durante os 45 dias do experimento foram registrada as mortes e o comportamento anormal dos peixes.

Como resultado do experimento observou-se que os peixes infectados com IPNV e que não foram tratados começaram a mostrar sinais característicos de necrose pancreática infecciosa a partir do dia 6 pósinfecção. A primeira morte ocorreu no dia 7 pós-infecção, acompanhada pelo agravamento dos sinais da doença em todos os peixes e uma alta mortalidade nos dias 11, 12 e 13 pós-infecção. Nos peixes infectados e tratados com ribavirina ou PACAP os sinais da doença foram detectados no dia 8. Os grupos tratados com as combinações ribavirina-PACAP e expostos ao vírus não apresentaram sinais da doença durante o tempo que durou o experimento. Os peixes não tratados e infectados recuperaram o apetite no dia 15 pós-infecção. Os peixes tratados com o antiviral recuperaram o apetite no dia 13, ao passo que os peixes tratados com PACAP e com as combinações PACAP-ribavirina recuperaram o apetite no dia 9 do experimento. Os peixes controles não infectados mostraram um comportamento e não se registrou mortalidade neste grupo durante o tempo que durou o experimento. A mortalidade acumulada nos peixes não tratados e infectados com IPNV foi de 40 peixes de um total de 50 (20% de sobrevida). Nos peixes tratados com a ribavirina e infectados a sobrevida foi de 68-70% para os grupos 3 e 4, respectivamente. Nos peixes tratados com PACAP e infectados a sobrevida foi de 50-55% para os grupos 5 e 6, respectivamente. Nos grupos tratados com as combinações PACAP-ribavirina a sobrevida foi de 97 e 99% nos grupos 7 e 8, respectivamente. Nas amostras de tecido dos peixes mortos foi detectada a presença de IPNV. O vírus não foi detectado nas amostras coletadas dos grupos não tratados e daqueles não infectados.

Na Tabela 1 estão mostrados os pesos médios nos 45 dias pósinfecção. Os peixes infectados e não tratados apresentaram menor ganho de peso em comparação com os peixes não infectados. Essa perda de peso foi compensada nos grupos tratados e em maior grau nos grupos tratados com a combinação PACAP-ribavirina.

28/36

Tabela 1. Aumento no peso corporal dos alevinos de truta arco-íris durante os 45 dias pós-infecção.

grupo experimental	peso inicial (g)	peso final (g)	aumento em relação ao peso inicial (%)
1	1,6 ± 0,4	4,5 ±1,1 ^a	181
2	1,6 ± 0,4	2,7 ± 1,2 ^b	69
3	1,6 ± 0,4	3,8 ± 1,1 ^c	137
4	1,6 ± 0,4	3,7 ± 1,0 ^c	131
5	1,6 ± 0,4	5,0 ± 0,5 ^d	212
6	1,6 ± 0,4	5,2 ± 0,6 ^d	225
7	1,6 ± 0,4	5,5 ± 0,4 ^d	343
8	1,6 ± 0,4	5,6± 0,5^d	350

Foi realizado um ANOVA seguido de um teste a posteriori de

Tukey. Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas.

Exemplo 7. Efeito da administração de PACAP e da combinação PACAP mais ribavirina, formuladas em ácido polilactídeo-coglicólico, a trutas arco-íris (O. mykiss) infectadas experimentalmente com IPNV

Foi realizado um experimento para avaliar o efeito da administração de PACAP e da combinação PACAP-ribavirina formuladas em ácido polilactídeo-co-glicólico, Sigma (do inglês: Poly (D-L-lactide-coglycolic) acid, abreviado PLGA) em trutas arco-íris infectadas experimentalmente com IPNV. Foram formados 8 grupos experimentais de 30 peixes de 30 ± 4 g cada um e os peixes foram mantidos em água a 10-12°C:

Grupo 1: Peixes injetados com PLGA, não expostos ao vírus

Grupo 2: Peixes injetados com PLGA, expostos ao vírus

Grupo 3: Grupo injetado com ribavirina a uma dose de 4 pg/g de água, expostos ao vírus

Grupo 4: Grupo injetado com ribavirina a uma dose de 8 pg/g de água, expostos ao vírus

Grupo 5: Grupo injetado com PACAP a uma dose de 0,1 pg/g de água, expostos ao vírus

29/36

Grupo 6: Grupo injetado com PACAP a uma dose de 0,2 pg/g de água, expostos ao vírus

Grupo 7: Grupo injetado com a combinação 1 (ribavirina 4 pg/gPACAP 0,1 pg/g), expostos ao vírus

Grupo 8: Grupo injetado com a combinação 2 (ribavirina 8 pg/g0,2 pg/g), expostos ao vírus

As nanopartículas que contêm PACAP, ou a combinação PACAP mais ribavirina, foram administradas por meio de injeção intraperitoneal, 2 horas depois da infecção viral. As observações experimentais foram feitas durante 30 dias. Foram obtidos resultados de sobrevida similares àqueles descritos no Exemplo 6.

Exemplo 8. Efeito da administração de PACAP e da combinação PACAP mais ribavirina a salmão do Atlântico (Salmo salar infectado experimentalmente com IPNV

Foi realizado um experimento para avaliar o efeito da administração de PACAP e da combinação PACAP-ribavirina a salmões (Salmo salar) infectados experimentalmente com IPNV. Foram formados 8 grupos experimentais de 50 peixes de 1,2 ± 0,3 g cada um e os peixes foram mantidos em água a 10-12°C:

Grupo 1: Peixes sem tratamento, não expostos ao vírus

Grupo 2: Peixes sem tratamento, expostos ao vírus

Grupo 6: Grupo tratado com PACAP a uma dose de 200 pgIL de água, expostos ao vírus

Grupo 7: Grupo tratado com a combinação ribavirina 400 pg/LPACAP 100 pg/L, expostos ao vírus

Grupo 8: Grupo tratado com a combinação ribavirina 800 pg/L30/36

200 pg/L, expostos ao vírus

Os peixes se alimentaram com uma quantidade de ração equivalente a 3% da biomassa total por grupo, duas vezes ao dia. Os peixes foram expostos ao vírus colocando-se os mesmos em água a 10-12°C contendo aproximadamente 10⁵ pfu/mL de IPNV (ATCC cepa VR-299) por 2 horas. O tratamento foi realizado 3 vezes por semana durante 20 dias. As observações experimentais foram feitas durante este período e os 25 dias posteriores ao tratamento. Durante os 45 dias do experimento foram registradas as mortes e o comportamento anormal dos peixes. Os peixes dos grupos 1 e 2 foram submetidos ao mesmo estresse do tratamento sem o composto antiviral ou a combinação PACAP-antiviral. Os peixes do grupo 1 foram submetidos ao mesmo procedimento com meio de cultura celular no lugar do vírus. A identificação do vírus foi realizada por RT-PCR, a partir de rim e baço, de acordo com o método descrito por López-Lastra et al. (1994) Journal of Fish Diseases 17: 269-282.

Como resultado do experimento foi observado que os peixes infectados com o IPNV e que não foram tratados começaram a mostrar sinais característicos de necrose pancreática infecciosa a partir do dia 6 pósinfecção. A primeira morte ocorreu no dia 8 pós-infecção, acompanhada pelo agravamento dos sinais da doença em todos os peixes e uma alta mortalidade entre os dias 11-15 pós-infecção. A percentagem de sobrevida nesse grupo foi de 30%. Foi observada uma perda de apetite nos dias 10 e 11 em todos os grupos infectados com o vírus, com exceção dos grupos tratados com o PACAP, a combinação PACAP- ribavirina e o grupo não infectado. Nos peixes infectados e tratados com ambas as doses de ribavirina os primeiros sinais da doença foram detectados no dia 10 e foram registrados 7076% de sobrevida para a dose mais baixa e mais alta, respectivamente. Nos peixes infectados e tratados com PACAP foram registrados 56-60% de sobrevida para a dose mais baixa e mais alta, respectivamente. Nos grupos tratados com as combinações ribavirina-PACAP e expostos ao vírus foram registrados 96-98% de sobrevida. No grupo não infectado e não tratado a percentagem de sobrevida foi de 98%. Nas amostras de tecido dos peixes

31/36 mortos foi detectada a presença do IPNV.

Na Tabela 2 estão mostrados os pesos médios nos 45 dias pósinfecção. Os peixes infectados e não tratados apresentaram menor ganho de peso em comparação com os peixes não infectados. Essa perda de peso foi compensada nos grupos tratados e em maior grau nos grupos tratados com PACAP e com as combinações PACAP-ribavirina.

Tabela 2. Aumento no peso corporal dos alevinos de salmão do Atlântico durante os 45 dias pós-infecção.

grupo experimental	peso inicial (g)	peso final (g)	aumento (%)
1	1,2 ±0,3	2,5 ± 0,8 ^a	108
2	1,2 ± 0,3	2,0 ± 0,4 ^b	67
3	1,2 ± 0,3	2,2 ± 0,4 ^c	83
4	1,2 ± 0,3	2,3 ± 0,5 ^c	92
5	1,2 ± 0,3	2,4 ± 0,3 ^a	200
6	1,2 ± 0,3	2,8 ± 0,3	233
7	1,2 ± 0,3	3,1 ± 0,2	258
8	1,2 ± 0,3	3,4 ± 0,1	283

Foi realizado um ANOVA seguido de um teste a posteriori de

Exemplo 9. Efeito da administração de PACAP e da combinação PACAP mais ribavirina a salmão do Atlântico (Salmo salar) infectados experimentalmente com ISAV

Foi realizado um experimento para avaliar o efeito da administração de PACAP e da combinação PACAP-ribavirina em salmões (Salmo salar) infectados experimentalmente com ISAV. Foram formados 8 grupos experimentais de 25 peixes de 50 ± 10 g cada um e os peixes foram mantidos em água do mar a 10-12°C:

Grupo 1: Peixes sem tratamento, não expostos ao vírus ISA

Grupo 2: Peixes sem tratamento, expostos ao vírus ISA

32/36

Grupo 8: Grupo tratado com a combinação ribavirina 800 pg/LPACAP 200 pg/L, expostos ao vírus

Para obter vírus suficiente para os experimentos de desafio foram cultivadas células SHK-1 infectadas com a cepa Glesvaer (acesso N° AJ012285, Krossoy et al. (1999) Journal of Virology 73: 2136-2142) em frasp cos de 175 cm durante 5 dias. Os peixes foram expostos ao vírus por cohabitação com peixes injetados intraperitonealmente com 0,3 mL de meio de cultura contendo aproximadamente 10⁴ pfu/mL de ISAV. Os peixes do grupo 1 receberam igual volume de meio de cultura. A % de mortalidade no grupo 1 (sem tratamento, não exposto ao vírus ISA) foi de 4% e no grupo 2 (sem tratamento, exposto ao vírus) foi de 92%. Nos grupos 3 e 4 a mortalidade foi de 52 e 36%, respectivamente ao passo que nos grupos 5 e 6 foi de 60 e 72%, respectivamente. Nos grupos 7 e 8 tratados com a combinação PACAPribavirina a% de mortalidade foi de 8 e 4%, respectivamente. Nas amostras de tecido dos peixes mortos foi detectada a presença do ISAV. O vírus não foi detectado nas amostras coletadas dos grupos não tratados e não infectados.

Exemplo 10. Efeito da administração de PACAP e da combinação PACAP mais amantidina a trutas arco-íris (O. mykiss) infectadas experimentalmente com IHNV

Foi realizado um experimento para avaliar o efeito da administração de PACAP e da combinação PACAP-amantidina a trutas arco-íris infectadas experimentalmente com IHNV. Foram formados 8 grupos experi

33/36 mentais de 50 peixes de 50 ± 5 g cada um e os peixes foram mantidos em água a 10-12°C:

Grupo 1: Peixes sem tratamento, não expostos ao vírus

Grupo 2: Peixes sem tratamento, expostos ao vírus

Grupo 3: Grupo tratado com amantidina a uma dose de 400 pg/L de água, expostos ao vírus

Grupo 4: Grupo tratado com amantidina a uma dose de 800 pg/L de água, expostos ao vírus

Grupo 7: Grupo tratado com a combinação 1 (amantidina 400 pg/L-PACAP 100 pg/L), expostos ao vírus

Grupo 8: Grupo tratado com a combinação 2 (amantidina 800 pg/L-PACAP 200 pg/L), expostos ao vírus

As condições experimentais foram similares àquelas dos experimentos descritos nos exemplos anteriores. Os peixes foram desafiados por imersão com 5,9 X 10³ pfu/ml do vírus, em 20 L de água com aeração durante 1 hora. Como resultado do experimento foram obtidos 26% de sobrevida dos peixes não tratados e infectados com IHNV. Nos peixes tratados com a amantidina e infectados a sobrevida foi de 46%. Nos peixes tratados com o PACAP e infectados a sobrevida foi de 36%. Nos grupos tratados com as combinações PACAP-amantidina a sobrevida foi de 96-98%.

Exemplo 11. Efeito da administração de PACAP e da combinação PACAP mais ribavirina a camarão branco do Pacífico (Litopenaeus vannamei) infectado experimentalmente com o vírus da síndrome da mancha branca (WSSV)

Foi realizado um experimento para avaliar o efeito da administração de PACAP e da combinação PACAP-ribavirina ao camarão branco do Pacífico Litopenaeus vannamei infectado experimentalmente com o WSSV. Foram formados 4 grupos experimentais de 50 camarões de 5 ± 0,5 g cada

34/36 um e os camarões foram mantidos em água do mar a 28°C:

Os camarões se alimentaram com uma quantidade de alimento equivalente a 8% da biomassa total por grupo, duas vezes ao dia. Os grupos experimentais foram os seguintes:

Grupo 1: Sem tratamento, não expostos ao vírus WSSV

Grupo 2: Sem tratamento, expostos ao vírus WSSV

Grupo 3: Tratado com ribavirina, expostos ao vírus WSSV

Grupo 4: Tratado com PACAP, expostos ao vírus WSSV

Grupo 5: Tratado com a combinação ribavirina-PACAP, expostos ao vírus WSSV

Para isolamento e propagação viral foi utilizado o caranguejo Orconectes limosus. O WSSV foi purificado a partir da hemolinfa recémextraída, por centrifugação em gradiente de sacarose, como descrito por Van Hulten e colaboradores no ano de 2001 (Van Hulten et al. (2001) Virology 285: 228-33). As amostras virais foram armazenadas a -80°C até serem usadas.

Coo o objetivo de minimizar as rotas naturais de infecção por WSSV e conseguir obter um protocolo reproduzível, foi utilizada a via de imersão para provocar a infecção viral experimental. Antes da infecção viral procedeu-se à titulação viral e foi determinada a quantidade requerida para provocar 75% de mortalidade. Para tanto, os camarões foram experimentalmente infectados com diferentes diluições do vírus durante um período de incubação de 7 horas.

Depois da infecção viral os camarões foram lavados com água do mar livre de vírus e colocados em recipientes novos para realizar o experimento de acordo com o desenho de grupos experimentais descrito acima.

Os tratamentos foram administrados 3 vezes por semana, durante 30 dias por meio de banhos de imersão a uma dose do antiviral isolado (de 500 pg/L de água) ou combinado com o PACAP, pós-infecção. No caso do grupo tratado com PACAP e com a combinação ribavirina-PACAP foi utilizada uma dose de PACAP de 200 pg/L de água. Os camarões dos grupos 1 e 2 foram submetidos ao mesmo estresse do tratamento. Durante

35/36 os 30 dias do experimento foram registradas as mortes em cada grupo experimental.

A% de mortalidade no grupo 2 (sem tratamento, exposto ao vírus) foi de 60%, no grupo 1 (sem tratamento, não exposto ao vírus) foi de 0%, no grupo 3 (tratado com ribavirina, exposto ao vírus) a mortalidade foi de 16%, ao passo que no grupo tratado com o PACAP a mortalidade foi de 26%. No grupo tratado com a combinação PACAP-ribavirina a% de mortalidade foi de 2%. Nas amostras de tecido dos camarões mortos foi detectada a presença do WSSV por RT-PCR.

Exemplo 12. Efeito da administração de PACAP e da combinação PACAP mais ribavirina a ostras da espécie Pecten maximus infectadas experimentalmente com IPNV

Foi realizado um experimento para avaliar o efeito da administração de PACAP e da combinação PACAP-ribavirina a ostras da espécie Pecten maximus infectadas experimentalmente com IPNV. Foram formados 8 grupos experimentais de 30 ostras adultas cada um e as ostras foram mantidas em aquários de 250 L com fluxo de água do mar filtrada a uma temperatura de 10°C. O vírus não foi detectado nas amostras de hepatopâncreas coletadas antes do início do experimento. Os grupos experimentais foram:

Grupo 1: Sem tratamento, não expostos ao vírus

Grupo 2: Sem tratamento, expostos ao vírus

36/36

O tratamento foi realizado 3 vezes por semana durante 20 dias.

As ostras foram desafiadas mediante exposição a 25 L de água contendo 5 10⁷ TCID₅₀ mL’¹ em aquários de 80 L. Ao fim de 6 horas foi dado início à substituição de água, a um fluxo lento de 1 L/min e depois de 12 horas o fluxo foi aumentado para 3 L/min.

Duas semanas depois do desafio foram coletadas amostras de hepatopâncreas e o título viral foi determinado. Os resultados mostraram 10 uma diminuição da carga viral nos animais tratados com a ribavirina e o PACAP. Esta diminuição foi maior nos grupos tratados com a combinação (Tabela 3).

Tabela 3. Título viral médio de IPNV (logioTCID50 g'¹) no hepatopâncreas de ostras duas semanas depois do desafio. Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente

grupos	título viral
1	0
2	8,1^a
3	5,4^b
4	4,3^b
5	6,5^C
6	5,8^C
7	2,0^d
8	1,5^d

1/1

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso do polipeptídeo ativador da adenilato ciclase da pituitária (PACAP), caracterizado pelo fato de que é na fabricação de uma composição para o tratamento de infecções virais e doenças infecciosas causadas por vírus em organismos aquáticos.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o PACAP é obtido a) por isolamento de sua fonte natural, b) de forma sintética, ou c) mediante a tecnologia de DNA recombinante.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o PACAP é um polipeptídio proveniente de peixes.
4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o PACAP é empregado em um organismo aquático selecionado do grupo que consiste em salmonídeos, camarões peneídeos e bivalvulados.
5. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o PACAP é usado no tratamento de infecções virais causadas por vírus das famílias Herpesviridae, Papovaviridae, Togaviridae, Retroviridae, Reoviridae, Birnaviridae e Picornaviridae.
6. Combinação veterinária, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo ativador da adenilato ciclase da pituitária (PACAP) e uma molécula antiviral.
7. Combinação, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o PACAP é obtido a) por isolamento de sua fonte natural, b) de forma sintética, ou c) mediante a tecnologia de DNA recombinante.
8. Combinação, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o antiviral é ribavirina ou um análogo de ribavirina.