KR101838721B1 - 수중 생물에서 바이러스 감염을 치료하기 위한 pacap의 용도 - Google Patents

수중 생물에서 바이러스 감염을 치료하기 위한 pacap의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수중 생물들에 있어서 바이러스 감염 및 바이러스-유도된 감염성 질병들을 치료하기 위한 뇌하수체 아데닐레이트 싸이클라아제 활성화 폴리펩티드 (PACAP)의 이용에 관한 것이다. 단독 또는 항바이러스성 분자와 조합되어 경구, 주사 또는 침지 목욕 방법에 의해서 투여된 PACAP의 효율성을 바이러스에 감염된 어류 또는 갑각류의 생존률 증가로 입증하였다. 더욱이, 그 투여 이후에, 전술한 생물들의 체중은, 이러한 제제들로 처리되지 않은 감염 생물들의 체중에 비해서, 체중을 유지하거나 또는 체중이 증가된 것으로 나타났다. 바이러스 감염에 취약한 조직 및 장기들의 역전사 중합효소 연쇄 반응을 통해서, PACAP 또는 PACAP를 함유하는 조합이 감염된 생물들에서 바이러스 로드를 감소시키는 것으로 나타났다.

Description

수중 생물에서 바이러스 감염을 치료하기 위한 PACAP의 용도 {Use of PACAP for treating viral infections in aquatic organisms}
본 발명은 수중 생명공학 분야에 관한 것으로서, 구체적으로는 수중 생물체에서 바이러스들에 의해서 야기되는 바이러스 감염 또는 감염성 질병들을 치료하기 위한 PACAP 및 PACAP-함유 조성물의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 바이러스에 의해서 야기되는 감염들을 치료하기 위해서 PACAP을 항생제와 조합하여 사용하는 것에 관한 것이다.
수중 생물종 양식의 전체 어류 및 패류의 총생산량에 대한 연간 기여량은 최근에 증가해왔다. 그러나, 이러한 생물들이 고밀도로 생활한다는 사실은 스트레스 조건 하에서 생활한다는 것을 의미하며, 일반적으로, 그들이 감염에 더욱 취약하다는 것을 의미한다. 수중양식에서 병원성물질에 의해서 야기되는 질병의 발병은 대규모 경제적 손실을 야기하며, 때로는 특정 지역으로부터 특정 양식종이 제거되는 결과를 초래하기도 한다.
연어류에 있어서, 감염성 췌장 괴사 바이러스 (infectious pancreatic necrosis virus, IPNV), 바이러스성 출혈 패혈증 바이러스 (viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV), 감염성 연어 빈혈증 바이러스 (infectious salmon anemia virus, ISAV) 및 감염성 조혈 괴사 바이러스 (infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)에 의해서 야기되는 감염들은 연어 양식종의 질병 발병에 대한 주된 원인들이다 (Marroqui et al. (2008) Antiviral Research 80: 332-338). 예를 들어, 2010년 말에 칠레산 연어 생산은, ISAV에 의해서 야기된 폐사의 결과로서 (http://www.aqua.cl), 38.7% 감소하였다 (2009년의 403000톤에서 2010년의 245000톤으로 감소).
더 나아가, 갑각류는 전세계 수중양식에 있어서 가장 중요한 경제적 분야 중 하나이며, 연간 100억불 이상을 차지한다. 양식 새우는 바이러스들을 포함하는 다양한 병원성 물질들에 취약하다. 90년대 중반에는 대략 40% 정도의 전세계 생산 (미화 30억불 상당)이 질병의 결과로 손실된 것으로 추산된다. 5종의 바이러스들이 이러한 손실에 주된 원인제공을 한 것으로 파악된다: 백점병 바이러스 (white spot syndrome virus, WSSV), 노랑머리 바이러스 (yellow head virus, YHV), 타우라 신드롬 바이러스 (taura syndrome virus, TSV), 감염성 조혈 괴사 바이러스 (IHNV) 및 모노돈 바큐로바이러스 (monodon baculovirus, MBV) (reviewed by Johnson et al. (2008) Vaccine 26: 4885-4992).
쌍각류조개 (Bivalves)는 전세계 갑각류 생산에 있어서 중요한 부분을 차지한다. 이러한 생물들은, 거름식 섭식자 (filter feeders)라는 특징을 지니며, 중요한 바이러스 보유원들이다; 따라서 이러한 생물들을 양식하는 것은 그 생산량을 위협할 수 있는 유행병에 직면할 수 있는 위험성을 내포한다. 이리도 바이러스 (irido virus)와 유사한 바이러스성 감염과 관련된 크라소스테레아 앙굴라타 (Crassostrea angulata)의 성체 굴들에서 대규모 폐사가 보고된 바 있다. 또한, 헤르페스비리데 (Herpesviridae), 파포바비리데 (Papovaviridae), 토가비리데 (Togaviridae), 레트로비리데 (Retroviridae), 레오비리데 (Reoviridae), 비르나비리데 (Birnaviridae) 및 피코르나비리데 (Picornaviridae)과와 같은 다른 바이러스들이 쌍각류조개 양식을 감염시킬 수 있는 능력을 보유하고 있다. 그러나, 갑각류로부터 유래된 세포주의 부재, 이러한 생물들을 연구하기 위한 분자적 수단의 한계로 인해서, 쌍각류조개 바이러스학은 원초적 과학 단계에 머물러 있으며, 주로 모폴로지의 연구들 및 소수의 실험적 연구들에 기초하고 있다 (reviewed by T. Renault and B. Novoa (2004) Aquat. Living Resour. 17: 397-409).
항바이러스성 약물들은 바이러스에 의해서 야기되는 감염들을 치료하기 위해서 사용되는 화합물들이다. 최초의 실험적 항바이러스제들은 60년대 초반에 발견되었다. 이러한 물질들은 시행착오적 방법에 기반하여 개발되었다. 그러나, 80년대 중반 이후에, 이러한 경향은 급격히 변화하였으며, 최근에는 수 많은 신규 항바이러스성 약물들이 개발 및 등록되었고, 이들 중 대부분은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)를 치료하기 위한 것들이다. 그러나, 이러한 화합물들이 항상 효과적이거나 또는 잘 허용될만한 것들은 아니기 때문에, 많은 부분들이 개선될 여지가 남아있다. 이러한 약물들의 고안 및 적용을 좀더 개량하여야 하는 또 다른 이유는 이러한 약물들과 관련된 바이러스 내성 또는 부작용 문제가 제기되었기 때문이다 (De Clercq (2002) Nature Reviews Drug Discovery 1: 13-25). 항바이러스성 약물들은 주로 바이러스 단백질 또는 숙주 세포의 단백질을 표적으로 하고 있다. 첫 번째 전략은 더욱 특이적이면서도 덜 독성을 갖지만, 항바이러스성 활성에 있어서 좁은 스펙트럼을 갖고 내성이 생길 확률이 더 큰 화합물들을 개발하는 것이다. 두 번째 전략은 더욱 넓은 활성 스펙트럼을 갖고 내성이 생길 확률이 더 작지만, 세포 독성을 야기할 확률이 높은 항바이러스성 화합물들을 개발하는 것이다. 이러한 전략의 선택은 바이러스의 특성 및, 바이러스 또는 숙주세포에서의 잠재적 표적에 의존한다 (De Clercq (2002) Nature Reviews Drug Discovery 1: 13-25).
리바비린 (ribavirin)은 광범위한 DNA 및 RNA 바이러스들에 대해서 활성을 갖는 넓은 스펙트럼의 항바이러스성 화합물이다. 이는 뉴클레오시드 유사체로서 (nucleoside analog), 세포내 인산화 이후에는, 이노신 모노포스페이트 데히드로게나아제 (inosine monophosphate dehydrogenase, IMPDH)의 경쟁적 저해제가 되는데, IMPDH는 구아노신 모노포스페이트 (guanosine monophosphate, GMP)의 합성에 관여하는 세포 효소이다 (Graci y Cameron, (2006) Reviews in Medical Virology16: 49-63; Parker, (2005) Virus Research 107: 165-171). 이러한 효소의 저해와 더불어, 이러한 화합물의 항바이러스성 활성을 설명하기 위해서 제안된 3가지 다른 메카니즘들이 있는데: 바이러스성 RNA 중합효소의 직접적 저해 (Toltzis et al. (1988) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 32: 492-497), 바이러스성 메신저 RNA (mRNA) 5' 말단에서의 캡 첨가를 저해하는 것 (Goswami et al. (1979) Biochemical and Biophysical Research Communications 89: 830-836) 및 돌연변이의 축적 (Graci y Cameron, (2002) Virology 298: 175-180)이 그것이다.
현재까지도, 수중 생물의 바이러스성 질병들을 치료하기 위한 용도로서 구체적인 항바이러스성 약물들이 승인된 바는 없다. 칠레에서는, 디아그노텍 에스에이 (Diagnotic SA)의 자회사로서, 안드로마코 (Andromaco)가 어류에서의 바이러스성 질병을 치료하기 위한 용도로서 비로탑 (VIROTOP)이라 불리우는 새로운 항바이러스성 화합물을 개발하였다. 상기 항바이러스제는 "Servicio Agricola y Ganadero" (SAG) (http://www.aqua.cl)에 의한 승인 계류 중이다. 그러나, 상당 수의 화합물들이 인비트로 및 인비보에서 평가되어 (Hudson et al. (1988) Antiviral Research 9:379-385; Jasher et al. (2000) Antiviral Research 45: 9-17; Kamei and Aoki , (2007) Archives of Virology 152: 861-869; LaPatra et al. (1998) Fish and Shellfish Immunology 8: 435-446; Mas et al. (2006) Antiviral Research 72: 107-115; Micol et al. (2005) Antiviral Research 66: 129-136; Moya et al. (2000) Antiviral Research 48: 125-130), 다양한 정도의 효율성을 보여준 바 있다.
리바비린 유사체인, 5-에티닐-1-베타-D-리보푸라노실이미다졸-카르복스아미드 (5-ethynyl-1-β-D-ribofuranosylimidazole-carboxamide, EICAR)의 투여에 대해서, IPNV로 실험적으로 감염된 은연어 (Oncorhynchus kisutch) 및 무지개 송어 (Oncorhynchus mykiss)의 유충에서 인비보로 평가된 바가 있다 (Moya et al. (2000) Antiviral Research 48: 125-130). 처리는 0.4 및 0.8 ㎍/mL의 EICAR의 용액으로 2시간씩 20일 동안 매일 목욕시킴으로써 수행되었다. 결과는 감염 및 EICAR 처리군에서의 생존율이 바이러스에 감염되지 않은 군에서의 생존율과 유사한 것으로 나타났다. 역전사 중합효소연쇄반응 (reverse transcription chain reaction polymerase, RT-PCR) 기법을 사용하여 간 및 비장에서의 바이러스량을 분석하였다. 상기 분석 결과, 항바이러스제로 처리된 동물들에서 바이러스량의 감소가 관찰되었다. 이러한 연구로부터, EICAR는 IPNV 복제의 저해제이며, 이를 사용하여 바이러스량을 감소시키고 어류 폐사율을 낮추는 것이 어획량을 증가시키는데 유용한 수단이라는 사실이 밝혀졌다. 그러나, 항바이러스제 처리는 교배 선택에 있어서는 유용한 수단이 될 수 없는데, 이는 감염 및 처리된 어류가 여전히 바이러스를 보유하고 있으며, 이를 그 후손에게 전달할 수 있기 때문이다. 한편, 일부 바이러스 감염에 의해서 야기되는 피해는 감염된 어류에서 체중이 감소한다는 사실임이 밝혀졌다 (Wolf (1986) The fish viruses. In: Espinosa de los Monteros, J., Labarta, U. (Eds.), Patologia en Acuicultura. Industrias graficas, Espana, SL, pp. 93-95; Moya et al. (2000) Antiviral Research 48: 125-130). 항바이러스제를 사용함으로써 얻게 되는 부가적인 장점은 이러한 체중 감소가 처리된 어류에서는 훨씬 작게 나타난다는 점이다. 이러한 효과는 은연어보다는 송어에서 더욱 명백하게 드러난다 (Moya et al. (2000) Antiviral Research 48: 125-130).
뇌하수체 아데닐레이트 싸이클라아제 활성화 폴리펩티드 (pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP)는 세크레틴/글루카곤/혈관작동성 장 펩티드 (vasoactive intestinal peptide)의 상과 (superfamily)에 속한다. 상기 펩티드는 1989년에 소과 뇌하수체 (bovine hypothalamus)로부터 처음으로 분리되었다. 상기 펩티드는 아데닐레이트 싸이클라아제의 활성화 및 아데노신 모노포스페이트 (cAMP) 생산의 후속 촉진을 통해서 성장 호르몬의 분비를 자극하는 능력을 갖는 것으로 보고된 바 있다 (Miyata et al (1989) Biochem Biophys Res Commun 164 567-574). PACAP는 포유류에서 신경전달제 (neurotransmitter), 신경조절제 (neuromodulator) 및 혈관확장제 (vasodilator)로서 중요한 역할을 하는 다관능 신경펩티드 (multifunctional neuropeptide)인 것으로 알려져 있다 (Arimura A. (1998) Japanese Journal of Physiology 48:301-31). 세포 분열 조절, 분화 및 세포 사멸에 있어서 그 기능에 대해서도 보고된 바 있다 (Sherwood et al. (2000) Endocrine Review 21: 619-670). 상기 펩티드는 2가지 다른 분자 변이체로서 존재한다: 27 아미노산 (PACAP27) 및 38 아미노산 (PACAP38) (Miyata et al. (1990) Biochemical and Biophysical Research Communications 170:643-8). PACAP의 효과는 세크레틴 G-단백질-결합 수용체에 속하는 3가지의 VIP/PACAP 수용체 패밀리를 통해서 나타난다. VPAC-1 및 VPAC-2 수용체들은 2가지 신경펩티드들인 VIP 및 PACAP에 대해서 유사한 친화도를 나타내지만, PACAP 수용체 (PAC-1)는 VIP 보다는 PACAP에 대해서 더 높은 친화도를 나타낸다 (Vaudry et al. (2000) Pharmacol Rev 52: 269-324).
PACAP는 포유류의 뇌에 넓게 분포하고 있으며, 주로 시상하부에 분포하고, 시상의 실방핵 (paraventricular nuclei) 및 등쪽내측핵 (dorsamedial nuclei), 격막 (septum), 대뇌 피질 (cerebral cortex), 편도 (amygdala), 해마 (hippocampus) 및 소뇌 (cerebellum)에 분포되어 있다 (Montero et al. (2000) Journal of Molecular Endocrinology 25: 157-168). 중추신경계 및 말초신경계에서 가장 풍부하게 존재하는 변이체는 PACAP38이다. 포유류에서 수행된 연구는 PACAP가 또한, 생식소 (gonads) (Shioda et al. (1994) Endocrinology 135: 818-825), 부신 (adrenal glands) (Arimura et al. (1991) Endocrinology 129: 2787-2789), 부갑상선 (parathyroid glands) (Vaudry et al. (2000) Pharmacol Rev 2000;52: 269-324), 내분비성 췌장 (endocrine pancreas) (Arimura y Shioda (1995) Neuroendocrinology 16: 53-88) 및 위장관 (gastrointestinal tract) (Arimura et al. (1991) Endocrinology 129: 2787-2789; Vaudry et al. (2000) Pharmacol Rev 52: 269-324; Hannibal et al. (1998) Cell. Tissue. Res. 291: 65-79)에도 존재한다는 것을 보여주었다.
면역 세포들에서 PACAP 및 그 수용체들의 발현에 대해서는 부분적으로만 밝혀진 바가 있다 (Gaytan et al. (1994) Cell Tissue Res 276:223-7; Abad et al. (2002) NeuroImmunoModulation 10:177-86). 포유류에서, 인간 및 마우스 림프구 및 대식세포 중의 말초혈 림프구들에서는 VPAC-1 수용체의 발현이 지속ㅅ성인 반면에, VPAC-2의 발현은 유도성인 것으로 관찰된 바 있다. 더욱이, 쥐 복막 대식세포들 (rat peritoneal macrophages) 및 인간 골수단구성 세포주 (human myelomonocytic cell line) THP-1에서 PAC-1 수용체의 지속적 발현이 관찰되었다. 또한, 쥐의 흉선, T 세포들의 다른 서브타입들, B 세포들, 비장세포들 및 림프절들에서 PACAP 발현이 보고된 바 있다 (Delgado et al. (2001) J Biol Chem 276:369-80; Pozo et al. (2003) Trends Mol Med 9:211-7).
어류에서, PACAP는 중추 (특히 시상하부, 뇌 및 척수) 및 말초 신경계, 신경분포 안구, 뇌하수체, 호흡관, 침샘, 위장관, 생식관, 췌장 및 요로에서 보고된 바 있다 (Sherwood et al. (2000) Endocrine Review 21: 619-670).
PACAP가 쥐 흉선의 자발적 세포괴사를 저해한다 (Delgado. (1996) Blood 87: 5152-5161). PACAP가 흉선 생장을 조절한다는 사실은 이러한 펩티드가 면역 세포들의 성숙화에 중요한 조절자임을 암시한다 (Delgado. (1996) Blood 87: 5152-5161).
상기 펩티드는 뇌하수체의 난포 세포들 (follicular cells)에 의해서 분비되는 인터루킨 6 (IL-6)의 자극을 통해서 림프구 성숙화에 대한 간접적인 영향을 끼친다. IL-6는 B 세포들의 성장 및 분화를 자극하며, 이러한 세포들에 의한 면역글로불린의 합성 및 분비를 촉진한다 (Tatsuno et al. (1991) Endocrinology 129: 1797-1804; Yada et al. (1993) Peptides 14: 235-239). 또한, PACAP가 IL-6 및 IL-10의 조절을 통해서 염증 반응을 활성화 및 억제한다 (Martinez et al. (1996) J Immunol 156(11):4128-36; Martinez et al. (1998) J Neuroimmunol 85(2):155-67); Martinez et al. (1998) J Leukoc Biol 63(5):591-601). 활성화된 대식세포들에 있어서, PACAP는 염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokines)을 억제하고, 항-염증 사이토카인 생산을 촉진함으로써, 면역 체계의 항상성을 유지할 수 있게 한다. 이외에도, PACAP가 공동-촉진 분자들인 B7.1/B7.2의 발현을 감소시키고, 후속 T 헬퍼 세포들 (Th)의 활성화를 감소시킨다. 한편, PACAP는 활성화된 대식세포들에서, 그 수용체인 PAC-1을 통해서 IL-6의 생산을 억제함으로써, 염증을 억제한다 (Martinez et al. (1998) J Neuroimmunol 85(2):155-67; Martinez et al. (1998) J Leukoc Biol. 1998 May;63(5):591-601). 강한 염증 자극 또는 독극물 중독에 반응해서 PACAP가 IL-6 전사에 대한 억제 작용을 나타내는 것은, 조직 보호 및 면역 체계 항상성에 도움을 준다 (Martinez et al. (1998) J Neuroimmunol 85(2):155-67; Martinez et al. (1998) J Leukoc Biol. 1998 May;63(5):591-601). 이와는 대조적으로, PACAP가 B7.2의 발현을 유도하고, 비자극 대식세포들에서 Th2로의 세포 분화를 촉진한다 (Delgado y Ganea (2001) Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 49(2):101-10).
일반적으로, 포유류 면역 체계의 조절에 대한 PACAP의 기능은 최근에 부분적으로만 밝혀졌다. 이러한 연구들은 PACAP가 선천성 및 후천성 면역 체계 양자 모두를 조절하며, 염증성 및 항염증성 반응을 조절한다는 사실을 보여준다. 그럼에도 불구하고, 이러한 펩티드가 항바이러스성 반응에 미치는 효과에 대한 기존 정보는 매우 희박한 편이다. 최근에, 만성 B형 간염 환자들에서, 라미부딘 (lamivudine) 처방의 결과로 바이러스 감염이 제거되면 플라즈마 PACAP-38 수준이 증가한다는 사실이 보고된 바 있다 (Elefsiniotis et al. (2003) European Journal of Gastroenterology and Hepatology 15: 1209-1216). 이러한 결과는 T 세포 면역 반응에 대한 효과가 환자의 간에서 생화학적 및 조직학적 질병의 차도를 야기한다는 것을 의미한다.
어류에서, 현재까지 공개된 PACAP 생물학적 기능에 대한 인 비보 연구들은 주로 생식 (Canosa et al. (2008) American Journal of Physiology (Regul Integr Comp Physiol) 295:1815-21), 뇌 분화 (Sherwood et al. (2007) Peptides 28:1680-7) 및 식욕 (Matsuda et al. (2005) Peptides 26:1611-6; Maruyama et al. (2006) Peptides 27:1820-6)에 관한 것이었다. 최근에, 이러한 신경펩타이드의 성장 및 다른 유충 경골 어류 종들의 분화에 있어서 생물학적 기능에 관해서 보고된 바 있다 (Lugo et al. (2008) Journal of Endocrinology 197:583-97).
어류 면역 반응의 조절에 있어서 PACAP의 기능에 대한 연구는 본 발명자들에 의해서 수행된 연구들로 한정되어 있다. 본 발명자들은 재조합 클라리아스 가리에피누스 (Clarias gariepinus) PACAP를 목욕 또는 주사 방식에 의해서 투여하는 것이, 처리된 유충 및 치어에서, 성장을 촉진할 뿐만 아니라, 태생적 면역 패러미터들 (라이소자임, 산화질소 유래 대사산물들 및 항산화 방어) 및 후천적 면역 (IgM) 또한 자극한다는 점을 밝힌 바 있다 (Carpio et al. (2008) Fish and Shellfish Immunology 25:439-45; Lugo et al. (2010) Fish and Shellfish Immunology 29:513-520). 이러한 새로운 특성들은 특허출원 "Neuropeptidos para el cultivo de organismos acuaticos" (WO2007/059714)에 서술되어 있다.
척추동물에서, 바이러스 감염에 대한 제1차 방어선은 타입 I 인터페론 (IFN) 시스템이다. 이러한 시스템은 IFN-α/β 수용체를 통해서 타입 I 인터페론 (IFN α y IFN β)이 바이러스성으로 유도됨으로써 활성화되는데, 상기 수용체는 JAK-STAT에 의해서 매개되는 신호 전달을 촉발한다. 유도된 사이토카인들은 세포 항바이러스 상태를 야기하며, 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소, 키나아제 R 및 GTP 가수분해효소 Mx와 같은 항바이러스 활성을 갖는 단백질들의 발현을 야기한다 (Goodbourn et al. (2000) Journal of General Virology 81: 2341- 2364). 최근의 증거들은 어류가 포유류와 유사한 IFN 시스템을 갖는다는 사실을 뒷받침한다 (Robertsen (2006) Fish and Shellfish Immunology 20: 172-191; Robertsen (2008) Fish and Shellfish Immunology 25: 351-357). 인터페론들은 제브라피쉬 (zebrafish) (Danio rerio), 아메리칸 메기 (Ictalurus punctatus) 대서양 연어 (Salmo salar)와 같은 몇몇 어종에서 클로닝된 바 있다 (Altmann et al. (2003) Journal of Virology 77: 1992-2002; Lutfalla et al. (2003) BMC Genomics 4: 29; Robertsen et al. (2003) Journal of Interferon and Citokine Research 23: 601-612; Long et al. (2006) Fish and Shellfish Immunology 21: 42-59). 또한, 다른 어종들에서 몇몇 IFN 조절인자들, JAK-STAT 신호 경로의 분자들, Mx 단백질들 및 IFN에 의해서 자극되는 다른 유전자들이 확인된 바 있다. 살모 살라 (Salmo salar) 및 파라리키티스 올리바세우스 (Paralichtys olivaceus)에서 Mx 단백질들에 의해서 매개되는 항바이러스성 활성이 보고된 바도 있다 (reviewed by Robertsen (2006) Fish and Shellfish Immunology 20: 172-191).
갑각류 동물에서 아직까지 IFN 유사 유전자들이 보고된 바는 없지만, WSSV 감염에 반응하여 STAT 분자들 (이는 척추동물의 IFN 반응에서 활성화되는 분자들이다)이 네거티브 조절되는 현상이 관찰된 바 있다. 바이러스 감염 도중 STAT의 네거티브 조절은 포유류에서 타입 I IFN 반응을 중화시킨다 (reviewed by Johnson et al. (2008) Vaccine 26: 4885-4992). 쌍각류 조개에서는, 항바이러스성 반응에 대한 지식이 더욱 적다. 이러한 생물들의 혈림프 (hemolymph)에서 항바이러스 활성의 증거가 보고되었고, IFN 유사 메커니즘의 존재가 제안된 바 있다 (Olicarda et al. (2005) Antiviral Research 66(2-3): 147-152; Defer et al., (2009) Aquaculture 293(1-2): 1-7).
수산양식분야에서, 바이러스 감염의 조절에 이용될 수 있는 새로운 화합물 또는 조성물을 개발하는 것은, 이러한 감염이 그 활동으로 초래할 수 있는 피해를 생각할 때 매우 중요한 문제이다.
본 발명은 전술한 문제점에 대한 해법을 제공하여, 수산양식 생물에서 바이러스 감염 및 바이러스에 의해서 야기되는 감염성 질병들을 치료하기 위한 조성물을 제조함에 있어서, PACAP를 사용하여 수산양식에서 바이러스 감염들을 조절하기 위한 새로운 대안을 제공하고자 한다.
본 발명에 있어서, "치료 또는 처리 (treatment)"라 함은 질병이 발병된 이후에 질병 진전의 완화, 감경 또는 감소를 포함하는 질병의 차도에 있어서 유리한 효과와 관련된 것이다.
본 발명에 있어서, "항바이러스성"이라 함은 종래기술에서 항바이러스성을 갖는 것으로 정의된 임의의 분자 또는 그 유사체, 관능적 유도체 또는 활성 단편을 의미한다.
본 발명에 있어서, "뇌하수체 아데닐레이트 싸이클라아제 활성화 폴리펩티드 (pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP)"라 함은, 천연 공급원으로부터 분리되거나, 또는 합성되거나, 또는 재조합 DNA 기술에 의해서 제조된, 임의의 변형 형태로 존재하는 (PACAP 27 또는 PACAP 38) 분자를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서는, 신경펩티드 PACAP의 변이체들이 단독으로 또는 공지의 항바이러스성 분자와 함께 조합되어, 2-3일 간격으로 침지 목욕에 의해서 어류, 갑각류 및 쌍각류조개에 투여된다. 사료 첨가제로서, PACAP는 또한 단독으로 또는 공지의 항바이러스성 분자와 함께 조합되어 투여된다.
본 발명에서, 침지 목욕, 주사 또는 경구로 투여된 PACAP 함유 조성물들이 바이러스에 의해서 감염된 수중 생물들의 생존을 증가시키고 그들을 치료하는데 효과적이었다는 사실이 입증되었다. 치료된 어류들에서 체중 감소는 관찰되지 않았다. 일부 경우에는, 감염 및 비치료된 동물들과 비교할 때, 감염 및 치료된 동물들에서 전반적인 체중 증가가 수반되었다. 조직 샘플들 및 취약 기관들을 RT-PCR로 분석한 결과, 감염되고 치료된 동물들에서 바이러스 양의 감소가 관찰되었다.
본 발명 이전에는 PACAP가 어류, 갑각류 및 쌍각류조개에서 항바이러스성 반응을 조절하는지 여부 및 관여 메카니즘에 대한 지식이 전무하였다. 본 발명은, 최초로 인 비트로 및 인 비보에서 PACAP와 어류, 갑각류 및 쌍각류조개에 대한 반응 사이의 관계에 대해서 서술하였다. 이에 더해서, 본 발명자들은 인 비트로 및 인 비보에서 바이러스 및/또는 폴리 I: C로 처리된 어류의 면역 체계 세포들에서 PACAP 분자들이 항바이러스성 반응에 관여하는 분자들, 예를 들어 Mx 단백질, 인터페론 감마 (IFN g) 및 유사 톨 수용체 9 (TLR9)에 미치는 예기치 않은 포지티브 효과와 더불어 이러한 펩티드의 선별적 조절에 대해서도 서술하였다.
PACAP 또는 PACAP와 어류에서 공지된 항바이러스성 활성을 갖는 분자와의 조합물을 투여함으로써 어류, 갑각류 및 쌍각류조개에서 바이러스성 감염을 치료하는 것은 종래기술에서 전혀 개시되거나 또는 암시된 바가 없다.
본 발명에 있어서, PACAP 및 항바이러스성 분자의 투여는 동시 (단일 제제로), 연속적 또는 시간을 두고 분리된 것일 수 있다. 조제는 경구, 주사 또는 침지 목욕 방식에 의해서 수중 생물체에 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, 어류, 갑각류 및 쌍각류조개는 PACAP 및 PACAP와 조합된 항바이러스성 분자들을 포함하는 조제로 치료된다. 예기치 않게, 신경펩티드 PACAP는 어류, 갑각류 및 쌍각류조개에서 항바이러스성 활성을 갖는 것으로 관찰되었다. 다른 한편으로, PACAP와 공지된 항바이러스성 활성을 갖는 것으로 알려진 물질들을 조합하게 되면, 인 비트로 및 인 비보 모두에서, PACAP를 단독으로 사용하는 경우에 비해서 더 높은 항바이러스성 반응 (상승 효과)를 나타내는 것으로 관찰되었다. 어류에서, 지금까지는 항바이러스성 반응에 있어서 어떠한 생물학적 활성도 알려진 바가 없다. 더욱이, 현재까지 PACAP 또는 세크레틴 및 글루카곤의 상과에 속하는 어떠한 펩티드도 새우 또는 조개류에서 분리된 바가 없다. 이러한 분류군에 속하는 상기 펩티드에 대한 현재까지 지식은 단지 재조합 어류 PACAP의 외래적 투여에 의한 새우류에서의 성장 촉진에 대한 실험적 증거에 근거하고 있을 뿐이다 (특허출원 공개번호 제WO2007/059714 국제). 그러므로, 본 발명 이전에는, 갑각류 및 쌍각류 조개에서 바이러스에 대한 반응과의 그 관련가능성에 대해서 아무런 지식이 존재하지 않았다.
본 발명의 또 다른 과제는 "뇌하수체 아데닐레이트 싸이클라아제 활성화 폴리펩티드 (pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP)"를 포함하는 수중 생물에서 바이러스 감염에 의해서 야기되는 바이러스성 및 전염성 질병들을 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 일구현예에서, 조성물의 일부로서 PACAP는 그 천연 공급원으로부터의 분리되거나, 합성에 의해서 또는 재조합 DNA 기술에 의해서 얻어진다. PACAP는 경구로, 주사로 또는 침지 목욕으로 투여된다. 본 발명의 일 구현예에서, PACAP는 어류로부터 분리된 폴리펩티드 서열이다.
본 발명은 또한 "뇌하수체 아데닐레이트 싸이클라아제 활성화 폴리펩티드 (pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP)" 및 항바이러스성 분자를 포함하는 수의 조합 (veterinary combination) 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 항바이러스성 분자는 리바비린 또는 리바비린 유사체이다. 상기 조합을 구성하는 구성요소들인 항바이러스성 분자 및 PACAP는 동일 치료과정 동안 동시에, 분리되어 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 조합은 수중 생물에서 바이러스에 의해서 야기되는 바이러스성 및 감염성 질병들을 치료하는데 사용된다. 이 경우, PACAP 및 항바이러스제는 경구로, 주사로 또는 침지 목욕으로 투여된다.
본 발명의 일 구현예에서, 사료 1 kg 당 50-750 mg 농도의 PACAP 및 사료 1 kg 당 100 내지 2000 mg 농도의 항바이러스제 분자로 제제 사료로서 투여된다. 본 발명의 두 번째 구현예에서, 체중 1 g 당, 0.1-10 ㎍ 농도의 PACAP 및 1-50 ㎍ 농도의 항바이러스제가, 수의 조합 조성물의 일부로서 주사에 의해서 어류에 투여된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 물 1 L 당, 50-1000 ㎍ 농도의 PACAP 및 100-2000 ㎍ 농도의 항바이러스제가, 수의 조합 조성물의 일부로서 침지 목욕에 의해서 어류 또는 갑각류에 투여된다.
본 발명에 있어서, 항바이러스제로서 사용되는 PACAP 및 공지의 항바이러스제 분자와 조합되어 사용되는 PACAP 양자 모두 다양한 수중 생물들에 투여된다. 예를 들어, 그들은 연어과, 페나에이드 새우류 (penaeid shrimps), 및 쌍각류조개를 포함한다.
PACAP를 포함하는 조성물과 항바이러스제 분자와의 조합은 헤르페스비리데 (Herpesviridae), 파포바비리데 (Papovaviridae), 토가비리데 (Togaviridae), 레트로비리데 (Retroviridae), 레오비리데 (Reoviridae), 비르나비리데 ( Birnaviridae) 및 피코르나비리데 (Picornaviridae ) 과들의 바이러스들에 의해서 야기되는 바이러스성 감염들의 치료에 유용하다.
본 발명에 있어서, 항바이러스제로서 사용되는 PACAP 및 공지의 항바이러스제 분자와 조합되어 사용되는 PACAP 양자 모두 IPNV, VHSV 및 ISAV에 의해서 야기되는 감염들을 조절하는데 사용된다. 또한, 그들은 WSSV, YHV, TSV, IHNNV 및 MBV에 의해서 야기되는 바이러스성 감염들의 치료에 사용된다.
본 발명은 또한 수중양식 관리에 있어서 바이러스성 감염들을 조절하기 위한, 양식 중인 수중 생물들에 PACAP 또는 PACAP를 포함하는 수의 조합 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하는 것을 포함한다.
본 발명에 따라서 뇌하수체 아데닐레이트 싸이클라아제 활성화 폴리펩티드 (PACAP) 또는 PACAP와 항바이러스성 분자와의 조합을 바이러스에 감염된 어류 등에 투여하는 경우, 생존률 증가, 체중 유지 또는 증가, 및 감염된 생물체 내에서 바이러스 로드 감소의 효과를 달성할 수 있다.
도 1은 폴리 I:C (30 ㎍/mL)로 처리되거나 또는 IPNV로 감염 (복수 감염, m.o.i는 0.1)된 무지개 송어 (Oncorhynchus mykiss)로부터의 전신 백혈구들에서 PAC-1 수용체의 실시간 PCR에 의해서 발현 분석을, 실험 시작 후 4 시간, 24 시간 및 48 시간 경과 시점에서 수행한 결과이다. 백혈구 배양물들은 이중으로 처리하였으며, 발현 수준은 qPCR로 삼중 분석하였다. 데이터는 내생적 신장 인자 1α (elongation factor 1α, EF 1α) ± 표준편차 (SD)에 대해서 PAC-1의 상대적 발현의 평균으로 표현하였다. * (p<0.05).
도 2는 인 비트로에서 VHSV로 감염 (m.o.i는 0.1)로 감염된 O. mykiss RTS-11으로부터의 대식세포 세포주에서 PAC-1 수용체의 실시간 PCR에 의해서 발현 분석을, 실험 시작 후 1 시간, 4 시간 및 8 시간 경과 시점에서 수행한 결과이다. 실험은 이중으로 수행하였으며, 발현 수준은 qPCR로 삼중 분석하였다. 데이터는 내생적 신장 인자 1α (elongation factor 1α, EF 1α) ± 표준편차 (SD)에 대해서 PAC-1의 상대적 발현의 평균으로 표현하였다.
도 3은 폴리 I:C (30 ㎍/mL)로 처리되거나 또는 IPNV로 감염 (복수 감염, m.o.i는 0.1)된 무지개 송어 (Oncorhynchus mykiss)로부터의 전신 백혈구들에서 VPAC-1 수용체의 실시간 PCR에 의해서 발현 분석을, 실험 시작 후 4 시간, 24 시간 및 48 시간 경과 시점에서 수행한 결과이다. 백혈구 배양물들은 이중으로 처리하였으며, 발현 수준은 qPCR로 삼중 분석하였다. 데이터는 내생적 신장 인자 1α (elongation factor 1α, EF 1α) ± 표준편차 (SD)에 대해서 VPAC-1의 상대적 발현의 평균으로 표현하였다. * (p<0.05).
도 4는 VHSV (1 x 107 TCID50의 100 μL (물고기 당 배양 상등액 중 바이러스 역가 / mL))로 실험적으로 인 비보 감염 (복수 감염, m.o.i는 0.1)된 무지개 송어 (O. mykiss)로부터의 전신 백혈구들 (A) 및 비장 (B)에서 PAC-1 수용체의 실시간 PCR에 의해서 발현 분석을 수행한 결과이다. 5 마리 물고기의 전신 및 비장으로부터 5개 풀의 전장 RNA를, 바이러스 감염 3일, 7일 및 10일 경과후 샘플링하였다. 발현 수준은 qPCR로 삼중 분석하였다. 데이터는 내생적 신장 인자 1α (elongation factor 1α, EF 1α) ± 표준편차 (SD)에 대해서 PAC-1의 상대적 발현의 평균으로 표현하였다. * (p<0.05).
도 5는 VHSV (1 x 107 TCID50 / mL의 100 μL (물고기 당))로 실험적으로 인 비보 감염된 무지개 송어 (O. mykiss)로부터의 전신 백혈구들 (A) 및 비장 (B)에서 VPAC-1 수용체의 실시간 PCR에 의해서 발현 분석을 수행한 결과이다. 5 마리 물고기의 전신 및 비장으로부터 5개 풀의 전장 RNA를, 바이러스 감염 3일, 7일 및 10일 경과후 샘플링하였다. 발현 수준은 qPCR로 삼중 분석하였다. 데이터는 내생적 신장 인자 1α (elongation factor 1α, EF 1α) ± 표준편차 (SD)에 대해서 VPAC-1의 상대적 발현의 평균으로 표현하였다. * (p<0.05).
도 6은 VHSV (1 x 107 TCID50 / mL의 100 μL (물고기 당))로 실험적으로 인 비보 감염된 무지개 송어 (O. mykiss)로부터의 비장 백혈구들에서 PACAP의 실시간 PCR에 의해서 발현 분석을 수행한 결과이다. 5 마리 물고기의 비장으로부터 5개 풀의 전장 RNA를, 바이러스 감염 3일, 7일 및 10일 경과후 샘플링하였다. 발현 수준은 qPCR로 삼중 분석하였다. 데이터는 내생적 신장 인자 1α (elongation factor 1α, EF 1α) ± 표준편차 (SD)에 대해서 PACAP의 상대적 발현의 평균으로 표현하였다. * (p<0.05).
도 7은 건강한 무지개 송어의 말초혈 백혈구들 (A) 및 전신 (B)에서 Mx 단백질 코딩 유전자의 전사에 대한 PACAP38의 인 비트로 효과를 실시간 PCR에 의해서 발현 분석을 수행한 결과이다. 10-10, 10-9, 및 10-8 농도에서 PACAP 투여의 효과를 처리 48시간 경과 후에 평가하였다. 실험은 4회 반복하였다. 백혈구 배양물은 이중으로 처리하였고, qPCR은 삼중으로 수행하였다. 데이터는 내생적 신장 인자 1α (elongation factor 1α, EF 1α) ± 표준편차 (SD)에 대해서 Mx의 상대적 발현의 평균으로 표현하였다. * (p<0.05).
도 8은 건강한 무지개 송어의 말초혈 백혈구들 (A) 및 전신 (B)에서 IFN γ 단백질 코딩 유전자의 전사에 대한 PACAP38의 인 비트로 효과를 실시간 PCR에 의해서 발현 분석을 수행한 결과이다. 10-10, 10-9, 및 10-8 농도에서 PACAP 투여의 효과를 처리 48시간 경과 후에 평가하였다. 실험은 4회 반복하였다. 백혈구 배양물은 이중으로 처리하였고, qPCR은 삼중으로 수행하였다. 데이터는 내생적 신장 인자 1α (elongation factor 1α, EF 1α) ± 표준편차 (SD)에 대해서 IFN γ의 상대적 발현의 평균으로 표현하였다. * (p<0.05).
도 9는 건강한 무지개 송어의 말초혈 백혈구들 (A) 및 전신 (B)에서 TLR9 단백질 코딩 유전자의 전사에 대한 PACAP38의 인 비트로 효과를 실시간 PCR에 의해서 발현 분석을 수행한 결과이다. 10-10, 10-9, 및 10-8 농도에서 PACAP 투여의 효과를 처리 48시간 경과 후에 평가하였다. 실험은 4회 반복하였다. 백혈구 배양물은 이중으로 처리하였고, qPCR은 삼중으로 수행하였다. 데이터는 내생적 신장 인자 1α (elongation factor 1α, EF 1α) ± 표준편차 (SD)에 대해서 TLR9의 상대적 발현의 평균으로 표현하였다. * (p<0.05).
도 10은 PACAP-리바비린 조합 (Rib-PACAP)의 항바이러스 활성을 결정하기 위한 인 비트로 분석을 나타낸 결과이다. 바이러스 감염 24 시간 이전에, 세포들을 "항바이러스제" 또는 PACAP-항바이러스제의 조합으로 처리하였다. 양대조군 (c+): 항바이러스제 처리 없이 바이러스로 감염된 세포들. 음대조군 (c-): 비감염 및 비처리된 세포들. 세포들은 바이러스에 30분 동안 감염시킴으로써 흡착시켰다. 이후, 세포들을 PBS로 세척하고, 다른 처리들을 수행하였다. 세포변형 효과 (cytopathic effects, CPE)의 저해는 크리스탈 바이올렛 염색을 통해서 평가하였다 (흡광도 550 nm).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 한다.
실시예
실시예 1. 폴리 I:C 및 IPNV 로 처리된 무지개송어 ( O. mykiss )의 전신 (head kidney )로부터의 백혈구 및 인 비트로에서 VHSV 로 감염된 무지개송어 ( O. mykiss ) RTS -11의 대식세포 세포주에서 PAC -1 수용체의 발현
본 발명자들은 무게 9 내지 12 그램 및 7개월령의, VHSV 및 IPNV 감염되지 않은 무지개송어 (O. mykiss) 치어를 사용하였다. 물고기들은 14℃ 순환수 중에서 보관하였다. 사료는 자유식 (ad libitum)으로 하루에 2회 투여하였다. 바이러스인 VHSV (균주 0771) 및 IPNV (균주 Sp)는 무지개송어 생식소 (gonad) 세포주 RTG-2에서 번식시켰다 (Sena and Rio (1975) Infect Immun 11:815-22). 세포들은 100 IU/mL의 페니실린 및 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신을 함유하는 10% 우태아 혈청 (fetal calf serum, FCS, Invitrogen)으로 보충된 최소 필수 배지 (minimal essential medium, MEM, Invitrogen, USA)에서 성장시켰다. 바이러스들은 항생제 및 2% FCS를 함유한 MEM 중에서 14℃로 성장시킨 RTG-2 세포들로 접종시켰다. 광범위한 세포변성 효과 (cytopathic effects)가 관찰되는 때에, 배양 부유물을 수집하여 원심분리시킴으로써 세포 찌꺼기를 제거하였다. 실험용으로는 청결화된 배양 부유물을 사용하였다. 바이러스 역가 (viral titers)는 Reed 및 Muench에 의해서 보고된 바와 같이 96-웰 플레이트 중에서 결정하였다 (Reed and Muench (1998) J Hyg 27:280-9).
전신 백혈구들을 Graham 및 Secombes에 의해서 서술된 방법에 따라서 4 마리의 송어로부터 분리하였다 (Graham and Secombe (1998) Immunology 65:293-7). 요약하면, 전방 신장 (anterior kidney)을 무균 제거하고, 페니실린 100 IU/mL, 스트렙토마이신 (100 ㎍/mL), 헤파린 (10 유닛/mL) 및 2% FCS로 보충된 배지 Leibovitz (L-15, Gibco, UK)를 사용하여 100 μ의 나일론 메시를 통하여 통과시켰다. 결과물인 세포 현탁액을 Percoll 농도구배 상에 51%까지 조심스럽게 위치시켰다. 백혈구에 해당하는 세포들의 고리를 조심스럽게 제거하고, 0.1% FCS를 함유하는 L-15 중에서 2회 세척하였다. 세포들을 5% FCS를 함유하는 L-15 중에 ml 당 5x106 세포의 농도로 재현탁시키고, 웰 당 1 mL의 부피로 24-웰 플레이트 중에 분배하였다. 감염된 백혈구들을 30 ㎍/mL의 폴리 I:C (Sigma)에 노출시키거나 또는 0.1 MOI로 IPNV로 감염시킨 다음, 14 ℃에서 4 시간, 24 시간 및 48 시간 동안 배양하였다.
최종적으로, 전장 RNA를 Chomczynski 및 Sacchi (Chomczynski and Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162:156-9)에 서술된 방법을 사용하여 백혈구 배양물로부터 정제하여, 미처리 및 폴리 I:C로 처리되거나 또는 바이러스로 감염된 백혈구 상의 PAC-1 수용체의 발현 수준을 평가하였다. 샘플들은 샘플들 중에 존재하는 게놈 DNA를 제거하기 위해서 RQ1 RNase-free DNase (Promega)로 처리하였다. 상보적 DNA (cDNA)의 합성을 위해서는, 역전사 효소에 기반하는 상업적 시약인 SuperScript III (Invitrogen)를 사용하였다. 정량적 PCR 반응 (qPCR) 반응을 위해서는, 상업적 공급원으로부터의 PCR 혼합물을 사용하였다: Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). qPCR 결과는 지속적인 내생적 유전자 발현에 대해서 정규화하였는데, 구체적으로는 신장 인자 1α (elongation factor 1α, EF 1α)에 대해서 정규화하였고, 3회 수행하였다. 결과는 2-Δ Ct로 표시하였는데, 여기에서 ΔCt는 나머지 유전자의 Ct 수치에서 Ct 정규화인자 유전자 (EF 1α)의 분석된 수치를 뺀 값과 같다.
결과는 PAC-1 수준이 폴리 I:C로 4, 24 및 48 시간 처리된 배양 백혈구들에서 과발현되었으며, 이는 PAC-1 수용체가 어류 중에서 바이러스에 대한 반응에 관여한다는 것을 의미하는 바, 폴리 I:C가 이중나선 RNA와 구조적으로 동일해서 바이러스 감염과 유사한 효과를 야기하기 때문이다 (많은 바이러스들은 RNA 게놈을 보유한다). 이러한 결과를 도 1에 도시하였다. 폴리 I:C는 B 세포 및 수지상 세포 (dendritic cells)의 세포내 부분들에서 발현되는 유사 톨 수용체-3 (toll-like receptor-3, TLR3)와 상호작용한다. TLR-3는 자연에서 바이러스들에 의해서 자극된다.
더욱이, 미처리된 배양세포들 중 백혈구에서 검출가능한 수준이던 PAC-1의 발현 수준은 IPNV로 감염된 배양세포들의 백혈구에서는 감염 4, 24 및 48 시간 경과 후에 검출불가능한 수준으로 변화하였는데, 이는 이러한 수용체가 어류의 항바이러스성 반응에서 PACAP에 특이적으로 결합한다는 사실을 확인해 주는 것이다 (도 1). 바이러스성 모방 폴리 I:C의 효과와 IPNV의 효과 사이의 차이점은 감염된 세포들에서 바이러스의 특이적 효과와 관련된 것일 수 있으며, 아마도 이는 그들에 유리한 방향으로 작용하는 것일 수 있다.
부가하여, 본 발명에서는 VHSV로 감염된 대식세포주 송어 (O. mykiss) RTS-11에서 PAC-1의 발현 수준을 평가하였으며, 세포주 RTS-11의 바이러스 감염 과정은 RTG-2 세포주에 대해서 전술한 것과 유사하였다. 유사하게, 본 발명에서는 VHSV로 감염된지 4일 및 8일 경과한 이후에 PAC-1의 발현 수준이 저하되는 것을 관찰하였다 (Figure 2).
실시예 2. 폴리 I:C 및 VHSV 로 처리된 무지개 송어 ( Oncorhynchus mykiss )의 전방 신장 세포들로부터의 백혈구 중 VPAC -1 수용체의 발현
VPAC-1 수용체의 발현 수준을 분석하기 위해서, 실시예 1에 기재된 바와 유사한 실험적 디자인을 고안하였다.
실험 결과, 폴리 I:C로 4 시간, 24 시간 및 48 시간 처리된 배양 백혈구들에서 VPAC-1이 과발현되었으며, 이는, 폴리 I:C가 바이러스 모방 분자라는 점을 고려하면, VPAC-1이 PAC-1과 같이 어류에서 바이러스에 대한 반응에 관여한다는 사실을 의미한다 (도 3).
더욱이, VHSV로 감염된 배양 백혈구들에서 VPAC-1의 발현 수준은 감염 4 시간, 24 시간 및 48 시간 경과 후 검출불가능한 수준이었는데, 이는 이러한 수용체가 어류에서 항바이러스성 반응에서와 동일한 친화도로 PACAP 및 VIP와 결합하는데 관여한다는 사실을 확인해 주는 것이다 (도 3).
IPNV로 감염된 배양 전방 신장 백혈구의 PAC-1 수용체에 대해서 관찰된 바와 같이, 백혈구들을 인 비트로에서 폴리 I:C로 처리하는 것과 VHSV로 감염시키는 것에 의해서 VPAC-1을 조절하는데 있어서 관찰되는 차이점은 감염된 세포들에서 완전 생물체로서 바이러스가 갖는 특이적 효과와 관련된 것일 수 있으며, 아마도 이는 그들에 유리한 방향으로 작용하는 것일 수 있다.
실시예 3. 인 비보에서 VHSV 로 감염된 무지개송어 ( Oncorhynchus mykiss ) 비장 및 전방 신장으로부터의 백혈구들 중에서 PACAP , PAC -1 수용체 및 VPAC -1의 발현
VHSV (균주 0771)를 세포주 RTG-2 (Sena and Rio (1975) Infect Immun 11:815-22)에 감염시켰다. 요약하면, 바이러스들을 항생제 (100 IU / mL 페니실린 및 100 ㎍ / mL 스트렙토마이신)를 포함하는 MEM 중에서 성장된 RTG-2 세포주에 접종시켰다. 광범위한 세포변형 효과가 관찰되면, 배양물 상등액을 수득하고 원심분리함으로써 세포 잔류물을 제거하였다. 송어의 감염을 위해서는, 청정 배양 상등액을 사용하였다. 바이러스 역가는 Reed 및 Muench (Reed and Muench (1998) J Hyg 27:280-9)에 의해서 보고된 바에 따라서 96-웰 플레이트 중에서 결정하였다.
본 발명에서는 9 내지 12 그램 및 7개월령의 치어 무지개 송어 (O. mykiss)로서, VHSV 및 IPNV 감염되지 않은 것들을 사용하였다. 어류는 물 순환 하에서 14℃로 보관하였다. 사료는 1일 2회 자유식으로 투여하였다. 2개의 실험군들은 각 군 마다 20 마리의 송어로 구성되었으며, 하나의 군에는 바이러스 용액을 주사하고 (물고기 당 100 L의 1 x 107 TCID50 / mL), 다른 군 (음대조군으로 사용)에는 VHSV로 감염되지 않은 배양 배지 RTG-2로 주사하였다.
주사 후 1, 3, 7 및 10일이 경과한 시점들에서, 5 마리의 송어들을 무작위로 선택한 다음 마취제 MS-22에 과다 노출시킴으로써 희생시켰다. 이어서, 신장 및 비장을 제거하고, Chomczynski 및 Sacchi (Chomczynski and Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162:156-9)에 서술된 방법에 따라서 이들 기관들에서 전장 RNA를 정제하였다. cDNA 합성 및 정량적 PCR은 실시예 1에 서술된 바에 따라서 수행하였다.
역전사 (RT) 반응을 위해서는, 실험 1일, 3일, 7일 및 10일 시점에서 무작위로 선택된 각 실험군으로부터의 5개 개체들로부터 5개의 전장 RNA들을 수집하였다.
결과는, 비장에서는, 음대조군에 비해서 주사 후 3일 경과 시점에서 PAC-1 및 VPAC-1이 과발현되었다. 주사 후 10일 경과시점에서는 발현 수준이 음대조군보다 더 낮았다. 전방 신장에서는, PAC-1 및 VPAC-1 수용체들의 경우 1일 및 3일 시점에서 음대조군이 더 낮은 발현 수준을 나타내었는데, VPAC-1에 대한 수치는 10일 시점에서는 검출불가능한 수준이었다. 7일 시점에서는 두 가지 수용체들 모두 음대조군에 비해서 발현 수준이 증가하였다. 또한, 두 가지 수용체 모두 바이러스 감염 이후에 시간 경과에 따라서 유사한 발현 패턴을 나타내었다 (도 4 및 5).
1일 시점에서 PACAP 발현 수치는 그 음대조군에 비해서 더 낮았다. 7일 시점에서 이러한 발현 수치는 더 높았다. 이러한 결과들은 그 2가지 수용체들인 VPAC-1 및 PAC-1에 대한 결과들과 부합하는 것인데, 이는 수용체 발현이 음대조군과 비교할 때, 1일째에는 더 낮지만, 7일째에는 더 높은 경향을 보이기 때문이다. 10일째에, PACAP 발현 수치는 음대조군에 비해서 더 낮았다 (도 4, 5 및 6).
VHSV 및 IPNV에 의해서 실험적으로 감염된 어류의 비장 및 전방 신장에서 PACAP 및 그 수용체들인 PAC-1 및 VPAC-1의 발현 수준에 대한 변화는 두 가지 수용체 모두 인 비보에서 어류의 항바이러스성 반응에 관여한다는 사실을 보여준다. 이러한 사실은 연어류에서 항바이러스성 반응이 증가, 감염된 어류의 생존 증가, 바이러스 감염에 대한 면역 반응의 향상 및 바이러스 복제가 수행될 수 있는 기관 및 유체로부터 바이러스의 제거에 있어서 PACAP가 긍정적 효과를 나타내는 시도 실험들을 통해서 확인하였다.
실시예 4. 건강한 무지개 송어 ( Oncorhynchus mykiss )의 말초혈 백혈구들 및 전방 신장 중에서 단백질 Mx , IFN 및 TLR9 의 전사에 대한 PACAP 의 효과
본 발명에서는 대략 50 그램의, VHSV 및 IPNV에 감염되지 않은 치어 무지개 송어 (O. mykiss)를 사용하였다. 물고기들 (n = 5)은 메탄술폰산염 (Sigma, USA)으로 마취시켰으며, 무균 제거하였는 바, 먼저 꼬리 정맥으로부터 말초혈을, 다음으로 전신을 제거하였다.
5 마리의 송어들에서 각각 전신으로부터 말초혈 백혈구들을 Graham 및 Secombes에 의해서 서술된 방법에 따라서 분리하였다 (Graham and Secombe (1998) Immunology 65:293-7).
각 물고기들의 말초혈은 페니실린 100 IU/mL, 스트렙토마이신 (100 ㎍/mL), 헤파린 (10 유닛/mL) 및 2% FCS로 보충된 Leibovitz (L-15, Gibco, UK) 절반 배지에서 4회 희석시켰으며, Percoll 농도구배 상에 51%까지 조심스럽게 위치시켰다. 백혈구에 해당하는 세포들의 고리를 조심스럽게 제거하고, 0.1% FCS를 함유하는 L-15 중에서 2회 세척하였다.
전방 신장 (anterior kidney)을 페니실린 100 IU/mL, 스트렙토마이신 (100 ㎍/mL), 헤파린 (10 유닛/mL) 및 2% FCS로 보충된 배지 Leibovitz (L-15, Gibco, UK)를 사용하여 100 μ의 나일론 메시를 통하여 통과시켰다. 결과물인 세포 현탁액을 동일한 보충 배지 L-15 중에서 1:4로 희석시키고, Percoll 농도구배 상에 51%까지 조심스럽게 위치시켰다. 백혈구에 해당하는 세포들의 고리를 조심스럽게 제거하고, 0.1% FCS를 함유하는 L-15 중에서 2회 세척하였다.
세포들을 5% FCS를 함유하는 L-15 중에 ml 당 5x106 세포의 농도로 재현탁시키고, 웰 당 1 mL의 부피로 24-웰 플레이트 중에 분배하였다. 백혈구들을 화학적 합성법에 의해서 클라리아스 가리에피누스로부터 이중으로 얻어진 PACAP38을 이용하여 3가지 양으로 투여 처리하였으며 (10-10 M, 10-9 M 및 10-8 M), 음대조군으로서 이중으로 분배된 미처리 백혈구들을 사용하였다.
Mx, IFN 및 TLR9의 수준들은 처리 후 48시간이 경과된 시점에서 평가하였다. 이를 위해서, Chomczynski 및 Sacchi (Chomczynski and Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162:156-9)에 서술된 방법에 의해서, PACAP로 처리된 백혈구 배양물로부터 전장 RNA를 정제하였다.
Mx, IFN γ 및 TLR9을 증폭시키기 위해서 고안된 프라이머들은 cDNA와 게놈 DNA를 구별하지 않으며, 전장 RNA들은 DNA 뉴클레아제, 구체적으로는 샘플들 중에 존재할 수 있는 게놈 DNA를 제거하기 위해서 RQ1 RNase-free DNase (Promega)를 사용하여 다른 조직들로부터 처리 정제되었다.
cDNA의 합성을 위해서, SuperScript III 역전사효소 (Invitroge)을 사용하는 상용 시약 키트를 사용하였다. 최종적으로, 정량적 PCT 반응들 (qPCR)을 위해서, 상업적 공급원으로부터 PCR의 혼합물을 사용하였다: Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). qPCR 결과들은 지속적인 내생적 유전자, 구체적으로 신장 1α (elongation 1α, EF 1α)의 발현에 대해서 정규화하였으며, 3회 수행하였다. 결과는 2-Δ Ct로 표시하였는데, 여기에서 ΔCt는 나머지 유전자의 Ct 수치에서 Ct 정규화인자 유전자 (EF 1α)의 분석된 수치를 뺀 값과 같다.
Mx 단백질 수준은 10-10 M PACAP38로 처리된 말초혈 백혈구들의 배양물에서 48시간 처리 이후에 증가하였다. 10-9 M 투여량의 경우에도, 음대조군과 비교할 때 Mx 단백질에 대한 전사에 대해서 자극 효과가 존재하였지만, 검출된 발현 수준은 10-10 M 투여량으로 얻어진 수준보다는 낮았다. 10-8 M 투여량의 경우는 음대조군에 비해서 Mx 단백질 발현의 수준이 다르지 않았다. 이러한 결과들은 (10-9 -10-10 M)의 낮은 농도 범위에서 Mx 단백질의 전사에 PACAP38이 긍정적 효과를 미친다는 점을 보여준다 (도 7 A). 전신 백혈구들에서는, Mx 단백질에 대한 PACAP 38의 효과가 말초혈 백혈구들에서보다 더 평범하였는데, 10-9 M 투여량에서 자극 효과가 나타났다 (도 7B).
또한, 본 발명에서는 PACAP38이 TLR9의 발현에 미치는 자극 효과를 관찰하였는데, 이는 배양 말초혈 백혈구들에서는 TLR9의 발현 수준이 검출불가능한 수준이었지만, (10-10-10-8 M) 범위의 PACAP38로 자극된 배양 세포들에서는 검출가능한 수준이었다. 가장 높은 수치는 10-10 M (도 8 A)에서 얻어졌다. 전신 백혈구들에서는, Mx 단백질에 대해서 관찰된 바와 마찬가지로, 그 효과가 더욱 평범하였다. TLR9 발현 수준은 중간 투여량인 10-9 M에서 음대조군에 비해서 통계적으로 더 높은 값을 나타내었다 (도 8 B).
IFN γ 수준은 말초혈 백혈구들의 미처리된 배양물들에서는 검출불가능한 수준이었다. PACAP38의 3가지 투여량으로 처리된 배양물들에서는, 발현 수준이 검출가능한 것이었으며, 가장 높은 수준은 중간 투여량인 10-9 M에서 관찰되었다 (도 9 A). 더욱이, 배양된 전방 신장 백혈구들에서는, PACAP38이 IFN γ의 발현 수준을 촉진하는 것이 관찰되었다. IFN γ의 발현 수준은 10-9 및 10-8의 투여량에서는 대조군에 비해서 통계적으로 더 높은 값을 나타내었으며, 가장 우수한 결과는 10-9 M에서 관찰되었다 (도 9 B).
실시예 5. 리바비린과 조합하여 PACAP 를 투여한 경우 IPNV 감염에 대해서 미치는 인 비트로 효과
본 발명자들은 분리된 바이러스로서, IPNV로 감염된 세포 배양물 (균주 ATCC VR-299)로부터의 상등액을 사용하였다. 바이러스의 확인은 구체적 PCR을 통해서 수행하였다. 인 비트로 분석을 위해서는, 세포주 CHSE-214 (Chinook salmon embryo) (ECACC No 00/F/031)를 사용하였다. 이는 18℃에서 이글염 (Eagle salts), 10% 우태아 혈청 (FBS), 2 mM 글루타민 및 항생제로 보충된 MEM 배지 중에 보관하였다.
바이러스 접종물은 15℃ 및 2% FBS 하에서 성장시켰으며, 분석 이전에 배양물 상등액에서의 바이러스 역가 (TCID 50)를 Reed 및 Muench (Reed and Muench (1938) The American Journal of Hygiene 27: 493-497)의 기술에 의해서 결정하였다. 바이러스 접종물로부터, 0.1 moi의 희석액을 제조하였다. 96-웰 플레이트를 CHSE-214로 접종하고, 18℃에서 10% FBS, 2 mM 글루타민 및 항생제로 보충된 MEM (이글염) 중에 보관하였다. 본 발명자들은 다른 농도의 리바비린 및 3가지 다른 농도의 PACAP (0.1, 1 및 10 nM)을 평가하였다. 감염 24 시간 이전에, 세포들을 항생제 또는 PACAP-항생제 조합으로 처리하여, 양대조군 (항생제 처리 없이 바이러스로 감염된 세포들) 및 음대조군 (미감염 및 미처리된 세포들, 및 항생제 또는 다른 투여량의 PACAP로 처리된 미감염 세포들)을 확립하였다. 세포들은 30분의 흡착시간 동안 바이러스 접종물로 감염시켰다. 이어서, 세포들을 PBS로 세척하였다. 처리는 2% FBS 및 항생제로 보충된 MEM 중에서 희석시켰으며, 재차 첨가하였다. 테스트는 양대조군에서 세포변화 효과 (cytopathic effect, CPE)가 관찰되면 종료하였다. 평가는 현미경 및 크리스탈 바이올렛 (550 nm 흡광 판독)을 사용한 염색에 의해서 수행하였다. 양대조군에서의 CPE는 감염후 3일 째에 관찰되었다. 크리스탈 바이올렛 염색의 흡광 수치로부터 얻어진 미처리 및 감염된 대조군 세포들에 대한 CPE 억제 결과가 도 10에 도시되어 있다. PACAP와 조합된 리바비린의 항바이러스 활성에 대한 분석은 Calcusyn for Windows (Biosoft) 프로그램을 사용하여 수행하였다. 얻어진 Chou의 조합 인덱스 수치는 테스트된 농도 수치들에 대해서 두 약물들 간의 상승작용을 보여주었다.
실시예 6. IPNV 로 실험적 감염된 무지개 송어 ( O. mykiss )에서 PACAP 및 PACAP와 리바비린 조합의 투여 효과
IPNV로 실험적 감염된 무지개 송어에서 PACAP 및 PACAP와 리바비린 조합의 투여 효과를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 50마리 물고기로 이루어진 8개의 실험군에 대해서, 각 물고기의 체중이 1.6 ± 0.4 g이 되게 선별하였다. 수온은 10-12℃로 유지하였다.
그룹 1: 바이러스에 노출되지 않은 미처리된 그룹
그룹 2: 바이러스에 노출되고, 미처리된 그룹
그룹 3: 바이러스에 노출되고, 물 1L 당 400 ㎍의 리바비린 투여량으로 처리된 그룹
그룹 4: 바이러스에 노출되고, 물 1L 당 800 ㎍의 리바비린 투여량으로 처리된 그룹
그룹 5: 바이러스에 노출되고, 물 1L 당 100 ㎍의 PACAP 투여량으로 처리된 그룹
그룹 6: 바이러스에 노출되고, 물 1L 당 200 ㎍의 PACAP 투여량으로 처리된 그룹
그룹 7: 바이러스에 노출되고, 조합 1 (400 ㎍/L의 리바비린-100 ㎍/L의 PACAP)로 처리된 그룹
그룹 8: 바이러스에 노출되고, 조합 2 (800 ㎍/L의 리바비린-200 ㎍/L의 PACAP)로 처리된 그룹
물고기들은 각 탱크마다 총 체중의 3%에 해당하는 양으로 1일 2회 먹이를 주었다. 물고기들을 10-12℃에서 대략 105/mL 플라크 형성 유닛 (plaque forming units, pfu)의 IPNV (균주 ATCC VR-299)를 함유한 물에 2시간 동안 넣어둠으로써 바이러스에 노출시켰다. 그룹 1 및 그룹 2의 물고기들에 대해서는 항바이러스제 화합물 또는 PACAP-항바이러스제 조합 없이 동일한 스트레스 처리를 가하였다. 그룹 1의 물고기들에 대해서는 바이러스 대신에 세포 배양 배지를 사용하여 동일한 과정을 겪게 하였다. 신장 및 비장으로부터의 바이러스 동정은 Lopez-Lastra et al에 개시된 방법 ((1994) Journal of Fish Diseases 17: 269-282)에 따라서 RT-PCR을 사용하여 수행하였다. PACAP 또는 PACAP-항바이러스제 조합을 사용한 처리는 1주일에 3회로 20일 동안 수행하였다. 첫 번째 처리는 바이러스 감염 2시간 경과 후 수행하였다. 실험 관찰은 치료 시작 후 20일 동안, 그리고 종료 후 25일 동안 수행하였다. 실험기간 (45일) 동안, 물고기들의 사멸 및 비정상적 행동을 모니터링하였다.
미치료된 IPNV 감염 물고기들은 감염 6일이 경과한 시점부터 특징적인 감염성 췌장 궤사가 관찰되었다. 첫 번째 폐사는 감염 7일 경과 후 발생하였으며, 모든 물고기들에서 질병 징후의 악화가 수반되었고, 감염 후 11일, 12일 및 13일 경과 시점에서 높은 폐사율이 동반되었다. 감염되고, 리바비린 또는 PACAP로 처리된 어류들에서, 질병의 징후는 8일 경과 시점에서 관찰되었다. 리바비린-PACAP의 조합으로 처리되고 바이러스에 노출된 그룹들에서는 실험 기간 동안 질병의 징후가 존재하지 않았다.
미처리되고 감염된 물고기들은 감염 15일 경과 시점에서 식욕을 회복하였다. 항바이러스제로 처리된 물고기들은 13일째 식욕을 회복한 반면에, PACAP 및 PACAP-리바비린으로 처리된 물고기들은 실험 9일째 식욕을 회복하였다. 감염되지 않은 대조군 물고기들은 정상적인 행동을 나타내었으며, 실험 기간 도중에 폐사가 관찰되지 않았다. 미처리되고 IPNV-감염된 물고기들에서 축적 폐사율은 50 마리의 물고기들 중 40마리에 달하였다 (20% 생존률). 리바비린 처리되고 감염된 물고기들에서 생존률은 그룹 3 및 4 각각에 대해서 68% 및 70%였다. PACAP 처리되고 감염된 물고기들의 생존률은 그룹 5 및 6 각각에 대해서 50% 및 55%였다. PACAP-리바비린 조합으로 처리된 그룹들에서 생존률은 그룹 7 및 8 각각에 대해서 97% 및 99%였다. 폐사된 물고기들의 조직 샘플들에서는 IPNV가 존재하는 것으로 관찰되었다. 미처리되고 감염되지 않은 그룹들로부터 취한 샘플들에서는 바이러스가 검출되지 않았다.
하기 표 1에는 감염 후 45일이 경과한 시점에서 평균 체중을 나타내었다. 감염되고 미처리된 물고기들은 미감염된 물고기들에 비해서 더 낮은 체중 증가를 나타내었다. 이러한 체중 감소 현상은 처리된 그룹들에서는 덜 나타났으며, PACAP-리바비린 조합 처리된 그룹들에서는 훨씬 덜 나타났다.
감염 45일 경과 시점에서 치어 무지개 송어의 체중 증가
실험 그룹 초기 체중 (g) 최종 체중 (g) 초기 체중에 대한 증가 비율 (%)
1 1.6±0.4 4.5±1.1a 181
2 1.6±0.4 2.7±1.2b 69
3 1.6±0.4 3.8±1.1c 137
4 1.6±0.4 3.7±1.0c 131
5 1.6±0.4 5.0±0.5d 212
6 1.6±0.4 5.2±0.6d 225
7 1.6±0.4 5.5±0.4d 343
8 1.6±0.4 5.6±0.5d 350
ANOVA에 이어서 Tukey 포스트 테스트를 수행하였다. 다른 영문 알파벳들은 통계적으로 현저한 차이들을 의미하는 것이다.
실시예 7. IPNV 로 실험적 감염된 무지개 송어 ( O. mykiss )에서 폴리락티드산 - co - 글리콜산에 제제화된 PACAP 및 PACAP 와 리바비린 조합의 투여 효과
폴리락티드산-co-글리콜산 (PLGA)에 함유된 PACAP 및 PACAP-리바비린 조합을 IPNV로 실험적 감염된 무지개 송어에 투여한 경우 나타나는 효과를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 30마리 물고기로 이루어진 8개의 실험군에 대해서, 각 물고기의 체중이 30 ± 4 g이 되게 선별하였다. 수온은 10-12℃로 유지하였다.
그룹 1: PLGA를 주사하고, 바이러스에 노출되지 않은 그룹
그룹 2: PLGA를 주사하고, 바이러스에 노출된 그룹
그룹 3: 바이러스에 노출되고, 물고기 1 g 당 4 ㎍의 리바비린 투여량으로 주사된 그룹
그룹 4: 바이러스에 노출되고, 물고기 1 g 당 8 ㎍의 리바비린 투여량으로 주사된 그룹
그룹 5: 바이러스에 노출되고, 물고기 1 g 당 0.1 ㎍의 PACAP 투여량으로 주사된 그룹
그룹 6: 바이러스에 노출되고, 물고기 1 g 당 0.2 ㎍의 PACAP 투여량으로 주사된 그룹
그룹 7: 바이러스에 노출되고, 조합 1 (4 ㎍/g의 리바비린-0.1 ㎍/g의 PACAP)로 처리된 그룹
그룹 8: 바이러스에 노출되고, 조합 2 (8 ㎍/g의 리바비린-0.2 ㎍/g의 PACAP)로 처리된 그룹
PACAP 또는 PACAP-리바비린 조합을 함유한 나노입자들을 바이러스 감염 2시간 경과 후 복강내 주사로 투여하였다. 실험 관찰은 30일 동안 수행하였다. 생존률은 실시예 6에 서술된 바와 유사하게 얻어졌다.
실시예 8. IPNV 로 실험적 감염된 대서양 연어 ( Salmo salar )에서 PACAP 및 PACAP 와 리바비린 조합의 투여 효과
IPNV로 실험적 감염된 연어 (Salmo salar)에서 PACAP 및 PACAP와 리바비린 조합의 투여 효과를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 50마리 물고기로 이루어진 8개의 실험군에 대해서, 각 물고기의 체중이 1.2 ± 0.3 g이 되게 선별하였다. 수온은 10-12℃로 유지하였다.
그룹 1: 바이러스에 노출되지 않은 미처리된 그룹
그룹 2: 바이러스에 노출되고, 미처리된 그룹
그룹 3: 바이러스에 노출되고, 물 1L 당 400 ㎍의 리바비린 투여량으로 처리된 그룹
그룹 4: 바이러스에 노출되고, 물 1L 당 800 ㎍의 리바비린 투여량으로 처리된 그룹
그룹 5: 바이러스에 노출되고, 물 1L 당 100 ㎍의 PACAP 투여량으로 처리된 그룹
그룹 6: 바이러스에 노출되고, 물 1L 당 200 ㎍의 PACAP 투여량으로 처리된 그룹
그룹 7: 바이러스에 노출되고, 조합 1 (400 ㎍/L의 리바비린-100 ㎍/L의 PACAP)로 처리된 그룹
그룹 8: 바이러스에 노출되고, 조합 2 (800 ㎍/L의 리바비린-200 ㎍/L의 PACAP)로 처리된 그룹
물고기들은 각 탱크마다 총 체중의 3%에 해당하는 양으로 1일 2회 먹이를 주었다. 물고기들을 10-12℃에서 대략 105/mL 플라크 형성 유닛 (plaque forming units, pfu)의 IPNV (균주 ATCC VR-299)를 함유한 물에 2시간 동안 넣어둠으로써 바이러스에 노출시켰다. 그룹 1 및 그룹 2의 물고기들에 대해서는 항바이러스제 화합물 또는 PACAP-항바이러스제 조합 없이 동일한 스트레스 처리를 가하였다. 그룹 1의 물고기들에 대해서는 바이러스 대신에 세포 배양 배지를 사용하여 동일한 과정을 겪게 하였다. 신장 및 비장으로부터의 바이러스 동정은 Lopez-Lastra et al에 개시된 방법 ((1994) Journal of Fish Diseases 17: 269-282)에 따라서 RT-PCR을 사용하여 수행하였다.
미치료된 IPNV 감염 물고기들은 감염 6일이 경과한 시점부터 특징적인 감염성 췌장 궤사가 관찰되었다. 첫 번째 폐사는 감염 8일 경과 후 발생하였으며, 모든 물고기들에서 질병 징후의 악화가 수반되었고, 감염 후 11일 내지 15일 경과 시점에서 높은 폐사율이 동반되었다. 이러한 그룹에서 생존률은 30%였다. 바이러스에 감염된 모든 그룹들에서 10일 및 11일째에 식욕 감소가 수반되었지만, PACAP, PACAP-리바비린 조합 및 미감염된 그룹의 경우에는 예외였다. 감염되고 리바비린으로 처리된 두 가지 그룹의 물고기들에서는, 질병의 초기 징후가 10일째 관찰되었으며, 각각 저투여량 및 고투여량 그룹들에 대해서 70-76%의 생존률이 관찰되었다. 감염되고 PACAP 처리된 물고기들에서 생존률은 고투여량 및 저투여량에 대해서 각각 56-60%였다. 리바비린-PACAP 조합으로 처리되고 바이러스에 노출된 그룹들에서 생존률은 96~98%였다. 미감염되고 미처리된 그룹에서 생존률을 98%였다. 폐사된 물고기들의 조직 샘플들에서는 IPNV가 존재하는 것으로 관찰되었다.
하기 표 1에는 감염 후 45일이 경과한 시점에서 평균 체중을 나타내었다. 감염되고 미처리된 물고기들은 미감염된 물고기들에 비해서 더 낮은 체중 증가를 나타내었다. 이러한 체중 감소 현상은 처리된 그룹들에서는 덜 나타났으며, PACAP-리바비린 조합 처리된 그룹들에서는 훨씬 덜 나타났다.
감염 45일 경과 시점에서 치어 대서양 연어의 체중 증가
실험 그룹 초기 체중 (g) 최종 체중 (g) 초기 체중에 대한 증가 비율 (%)
1 1.2±0.3 2.5±0.8a 108
2 1.2±0.3 2.0±0.4b 67
3 1.2±0.3 2.2±0.4c 83
4 1.2±0.3 2.3±0.5c 92
5 1.2±0.3 2.4±0.3a 200
6 1.2±0.3 2.8±0.3 233
7 1.2±0.3 3.1±0.2 258
8 1.2±0.3 3.4±0.1 283
ANOVA에 이어서 Tukey 포스트 테스트를 수행하였다. 다른 영문 알파벳들은 통계적으로 현저한 차이들을 의미하는 것이다.
실시예 9. ISAV 로 실험적 감염된 대서양 연어 ( Salmo salar )에서 PACAP 및 PACAP 와 리바비린 조합의 투여 효과
PACAP 및 PACAP-리바비린 조합을 ISAV로 실험적 감염된 대서양 연어 (Salmo salar)에 투여한 경우 나타나는 효과를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 25마리 물고기로 이루어진 8개의 실험군에 대해서, 각 물고기의 체중이 50 ± 10 g이 되게 선별하였다. 그룹들은 해수 중에서 10-12℃로 보관하였다.
그룹 1: ISA 바이러스에 노출되지 않은 미처리된 그룹
그룹 2: ISA 바이러스에 노출되고, 미처리된 그룹
그룹 3: 바이러스에 노출되고, 물 1L 당 400 ㎍의 리바비린 투여량으로 처리된 그룹
그룹 4: 바이러스에 노출되고, 물 1L 당 800 ㎍의 리바비린 투여량으로 처리된 그룹
그룹 5: 바이러스에 노출되고, 물 1L 당 100 ㎍의 PACAP 투여량으로 처리된 그룹
그룹 6: 바이러스에 노출되고, 물 1L 당 200 ㎍의 PACAP 투여량으로 처리된 그룹
그룹 7: 바이러스에 노출되고, 조합 1 (400 ㎍/L의 리바비린-100 ㎍/L의 PACAP)로 처리된 그룹
그룹 8: 바이러스에 노출되고, 조합 2 (800 ㎍/L의 리바비린-200 ㎍/L의 PACAP)로 처리된 그룹
실험을 위해서 충분한 양의 바이러스를 얻기 위해서, SHK-1 세포들을 균주 Glesvaer (access No. AJ012285, Krossoy et al. (1999) Journal of Virology 73: 2136-2142)로 175 cm2 플라스크 중에서 5일 동안 감염시켰다.
물고기들을, 대략 104 pfu/mL의 ISAV를 함유하는 배양 배지 0.3 mL로 복강내 주사된 물고기와 공동 서식시킴으로써 바이러스에 노출시켰다. 그룹 1은 동일한 부피의 배양 배지를 수용한 그룹으로서, 그룹 1 (미처리, 바이러스 ISA에 미노출)에서의 % 폐사율은 4%였으며, 그룹 2 (바이러스에 노출 및 미처리)에서는 92%였다. 그룹 3 및 4에서는 폐사율이 각각 52% 및 36%인 반면에, 그룹 5 및 6에서는 폐사율이 각각 60% 및 72%였다. PACAP-리바비린 조합으로 처리된 그룹 7 및 8에서 % 폐사율은 각각 8% 및 4%였다. 폐사된 물고기의 조직 샘플에서는 ISAV에 존재가 관찰되었다. 미처리 및 미감염된 그룹으로부터의 샘플에서는 어떠한 바이러스도 검출되지 않았다.
실시예 10. IHNV 로 실험적 감염된 무지개 송어 ( O. mykiss )에서 PACAP 및 PACAP-아만타딘 조합의 투여 효과
IHNV로 실험적으로 감염된 무지개 송어에서 PACAP 및 PACAP-아만타딘 조합의 투여에 따른 효과를 평가하기 위해서 실험을 수행하였다. 50마리 물고기로 이루어진 8개의 실험군에 대해서, 각 물고기의 체중이 50 ± 5 g이 되게 선별하였으며, 각 그룹들은 수중에서 10-12℃로 보관하였다.
그룹 1: 바이러스에 노출되지 않은 미처리된 그룹
그룹 2: 바이러스에 노출되고, 미처리된 그룹
그룹 3: 바이러스에 노출되고, 물 1L 당 400 ㎍의 아만타딘 투여량으로 처리된 그룹
그룹 4: 바이러스에 노출되고, 물 1L 당 800 ㎍의 아만타딘 투여량으로 처리된 그룹
그룹 5: 바이러스에 노출되고, 물 1L 당 100 ㎍의 PACAP 투여량으로 처리된 그룹
그룹 6: 바이러스에 노출되고, 물 1L 당 200 ㎍의 PACAP 투여량으로 처리된 그룹
그룹 7: 바이러스에 노출되고, 조합 1 (400 ㎍/L의 아만타딘-100 ㎍/L의 PACAP)로 처리된 그룹
그룹 8: 바이러스에 노출되고, 조합 2 (800 ㎍/L의 아만타딘-200 ㎍/L의 PACAP)로 처리된 그룹
실험적 조건들은 전술한 실시예들에 서술된 실험들과 유사하였다. 물고기들은 1시간 동안 통기 조건 하에서, 20L의 물 중에 5.9 x 103 pfu/ml의 바이러스를 함유하는 물에 침지시킴으로써 감염시켰다. 실험 결과, IHNV로 감염되고 미처리된 물고기들에서 26%의 생존률이 관찰되었다. IHNV로 감염되고 아만타딘으로 처리된 물고기들에서는, 46%의 생존률이 관찰되었다. IHNV로 감염되고 PACAP로 처리된 물고기들에서는, 36%의 생존률이 관찰되었다. PACAP-아만타딘 조합으로 처리된 그룹에서는 생존률이 96-98%였다.
실시예 11. 백점병 바이러스 ( WSSV )로 실험적 감염된 태평양 흰새우 ( Litopenaeus vannamei )에서 PACAP 및 PACAP 와 리바비린 조합의 투여 효과
WSSV로 실험적으로 감염된 태평양 흰새우 (Litopenaeus vannamei)에서 PACAP 및 PACAP-리바비린 조합의 투여에 따른 효과를 평가하기 위해서 실험을 수행하였다. 50마리 새우로 이루어진 5개의 실험군에 대해서, 각 새우의 체중이 5 ± 0.5 g이 되게 선별하였으며, 각 그룹들은 해수 중에서 28℃로 보관하였다.
새우들은 총 그룹 당 생체중량의 8%에 해당하는 양으로 1일 2회 먹이를 주었다. 각 실험군들은:
그룹 1: 바이러스 WSSV에 노출되지 않은 미처리된 그룹
그룹 2: 바이러스 WSSV에 노출되고, 미처리된 그룹
그룹 3: 바이러스 WSSV에 노출되고, 리바비린으로 처리된 그룹
그룹 4: 바이러스 WSSV에 노출되고, PACAP로 처리된 그룹
그룹 5: 바이러스 WSSV에 노출되고, 리바비린-PACAP 조합으로 처리된 그룹
분리 및 바이러스 번식을 위해서는 Orconectes limosus 게를 사용하였다. WSSV는 Van Hulten et al (Van Hulten et al. (2001) Virology 285: 228-33, 2001년)에 서술된 방법에 따라서 수크로오스 농도구배 원심분리에 의해서 신선 추출된 혈림프로부터 정제하였다.
바이러스 샘플들은 사용 이전까지 -80℃에서 보관하였다.
WSSV에 의한 천연 감염 루트를 최소하고 재현가능한 프로토콜을 달성하기 위해서, 침지법을 사용하여 실험적 바이러스 감염을 유도하였다. 바이러스 감염 이전에 바이러스 역가 및 75% 폐사율을 야기하기 위해서 요구되는 양을 결정하였다. 이를 위해서, 새우들을 7 시간의 배양시간 동안 다른 바이러스 희석액을 사용하여 실험적으로 감염시켰다.
바이러스 감염에 이어서, 새우들을 바이러스가 존재하지 않는 해수로 세척하고 전술한 실험군들에 대한 고안에 따라서 새로운 용기에 넣었다.
처리는 감염 이후에, (물 1L 당 500 ㎍의 항바이러스제) 또는 (물 1L 당 500 ㎍의 항생제 및 200 ㎍의 PACAP)의 투여량으로 30일 동안 1주일에 3회 투여함으로써 수행되었다. PACAP로 처리된 그룹의 경우, 사용된 투여량은 물 1L 당 200 ㎍이었다. 그룹 1 및 2의 새우에 대해서는 동일한 스트레스의 투여 처리를 하였다. 실험 30일 동안, 각 실험군에서의 폐사를 모니터링하였다.
그룹 2 (미처리, 바이러스에 노출)에서의 % 폐사율은 60%였고, 그룹 1 (미처리, 바이러스에 미노출)은 0%였으며, 그룹 3 (리바비린 처리, 바이러스에 노출)은 16%인 반면에, PACAP 처리된 그룹의 폐사율은 26%였다. PACAP-리바비린 조합 처리된 그룹의 폐사율은 2%였다. 이러한 폐사된 새우의 조직 샘플들에서 RT-PCR에 의해 WSSV를 검출하였다.
실시예 12. IPNV 로 실험적 감염된 굴 종 ( Pecten maximus )에서 PACAP 및 PACAP와 리바비린 조합의 투여 효과
IPNV로 실험적으로 감염된 굴 종 (Pecten maximus)에서 PACAP 및 PACAP-리바비린 조합의 투여 효과를 평가하기 위해서 실험을 수행하였다. 각 그룹 당 30마리의 성체 굴을 포함하는 8개의 실험군들에 대해서 실험을 수행하였으며, 각 그룹은 10℃에서 여과된 해수 250 L 중에 보관하였다. 실험 시작 이전에 수집된 간췌장 (hepatopancreas) 샘플들에서는 어떠한 바이러스도 검출되지 않았다. 실험군들은:
그룹 1: 바이러스에 노출되지 않은 미처리된 그룹
그룹 2: 바이러스에 노출되고, 미처리된 그룹
그룹 3: 바이러스에 노출되고, 물 1L 당 400 ㎍의 리바비린 투여량으로 처리된 그룹
그룹 4: 바이러스에 노출되고, 물 1L 당 800 ㎍의 리바비린 투여량으로 처리된 그룹
그룹 5: 바이러스에 노출되고, 물 1L 당 100 ㎍의 PACAP 투여량으로 처리된 그룹
그룹 6: 바이러스에 노출되고, 물 1L 당 200 ㎍의 PACAP 투여량으로 처리된 그룹
그룹 7: 바이러스에 노출되고, 조합 1 (400 ㎍/L의 리바비린-100 ㎍/L의 PACAP)로 처리된 그룹
그룹 8: 바이러스에 노출되고, 조합 2 (800 ㎍/L의 리바비린-200 ㎍/L의 PACAP)로 처리된 그룹
처리는 20일 동안 1주일에 3회 수행하였다. 굴들은 80 L 탱크 중에 107 TCID 50 mL- 1 를 함유하는 25 L의 물에 노출시킴으로써 감염시켰다. 6 시간 경과 이후에, 물을 1 L / 분의 느린 유속으로 교환하였으며, 12 시간 경과 시점에서 유속을 3 L / 분으로 증가시켰다.
감염 2주 경과 후, 간췌장 샘플들을 취하여 바이러스 역가를 결정하였다. 결과는 리바비린 및 PACAP로 처리된 굴들에서 바이러스 로드가 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 감소는 조합으로 처리된 그룹에서 더 크게 나타났다 (표 3)
감염 2주 경과 후 굴의 간췌장에서 IPNV 평균 바이러스 역가 (log10TCID50 g-1). 다른 영문 알파벳들은 통계적으로 현저한 차이들을 의미하는 것이다.
그룹 바이러스 역가
1 0
2 8.1a
3 5.4b
4 4.3b
5 6.5c
6 5.8c
7 2.0d
8 1.5d

Claims (20)

  1. 삭제
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  6. 뇌하수체 아데닐레이트 싸이클라아제 활성화 폴리펩티드 (pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP)를 포함하는, 수중 생물에서 바이러스들에 의해 야기되는 바이러스 감염성 질병 치료용 조성물로서,
    상기 바이러스 감염성 질병은 헤르페스비리데 (Herpesviridae), 파포바비리데 (Papovaviridae), 토가비리데 (Togaviridae), 레트로비리데 (Retroviridae), 레오비리데 (Reoviridae), 비르나비리데 (Birnaviridae) 및 피코르나비리데 (Picornaviridae) 과의 바이러스로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 바이러스에 의해서 야기되는 바이러스 감염성 질병이고,
    상기 수중 생물은 어류, 각갑류 및 쌍각류조개로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 수중 생물인 것을 특징으로 하는 수중 생물의 바이러스 감염성 질병 치료용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 PACAP는 a) 그 천연 공급원으로부터 분리되거나, b) 합성되거나, 또는 c) 재조합 DNA 기술에 의해서 얻어지는 것을 특징으로 하는 수중 생물의 바이러스 감염성 질병 치료용 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 경구, 주사 또는 침지 목욕에 의해서 투여되는 것을 특징으로 하는 수중 생물의 바이러스 감염성 질병 치료용 조성물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 PACAP는 어류로부터 분리된 폴리펩티드 서열인 것을 특징으로 하는 수중 생물의 바이러스 감염성 질병 치료용 조성물.
  10. 뇌하수체 아데닐레이트 싸이클라아제 활성화 폴리펩티드 (pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP) 및 항바이러스성 분자를 포함하는, 수중 생물에서 바이러스들에 의해 야기되는 바이러스 감염성 질병 치료용 조성물로서,
    상기 바이러스 감염성 질병은 헤르페스비리데 (Herpesviridae), 파포바비리데 (Papovaviridae), 토가비리데 (Togaviridae), 레트로비리데 (Retroviridae), 레오비리데 (Reoviridae), 비르나비리데 (Birnaviridae) 및 피코르나비리데 (Picornaviridae) 과의 바이러스로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 바이러스에 의해서 야기되는 바이러스 감염성 질병이고,
    상기 수중 생물은 어류, 각갑류 및 쌍각류조개로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 수중 생물인 것을 특징으로 하는 수중 생물의 바이러스 감염성 질병 치료용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 PACAP는 a) 그 천연 공급원으로부터 분리되거나, b) 합성되거나, 또는 c) 재조합 DNA 기술에 의해서 얻어지는 것을 특징으로 하는 수중 생물의 바이러스 감염성 질병 치료용 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 항바이러스성 분자는 리바비린 또는 리바비린 유사체인 것을 특징으로 하는 수중 생물의 바이러스 감염성 질병 치료용 조성물.
  13. 제10항에 있어서, 상기 PACAP 및 상기 항바이러스성 분자는 동일한 치료 도중에 동시에, 분리되어 또는 연속적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 수중 생물의 바이러스 감염성 질병 치료용 조성물.
  14. 삭제
  15. 제10항에 있어서, 상기 PACAP 및 상기 항바이러스성 분자는 경구, 주사 또는 침지 목욕에 의해서 투여되는 것을 특징으로 하는 수중 생물의 바이러스 감염성 질병 치료용 조성물.
  16. 제10항에 있어서, 상기 항바이러스성 분자는 바이러스성 감염의 치료에 허용되는 약학적으로 허용되는 화합물, 그 유사체, 관능적 유도체 또는 그 활성 단편인 것을 특징으로 하는 수중 생물의 바이러스 감염성 질병 치료용 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 수중 생물의 바이러스 감염성 질병 치료용 조성물은 제제화 사료의 일부로서, 상기 PACAP는 상기 사료 1 kg 당 50-750 ㎍의 농도이고, 상기 항바이러스성 분자는 상기 사료 1 kg 당 100 내지 2000 mg의 농도인 것을 특징으로 하는 수중 생물의 바이러스 감염성 질병 치료용 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 상기 수중 생물의 바이러스 감염성 질병 치료용 조성물은 주사에 의해서 투여되고, 상기 PACAP는 체중 1 g (gram of body weight, gbw) 당 0.1-10 ㎍의 농도이고, 상기 항바이러스성 분자는 체중 1 g 당 1-50 ㎍의 농도인 것을 특징으로 하는 수중 생물의 바이러스 감염성 질병 치료용 조성물.
  19. 제15항에 있어서, 상기 수중 생물의 바이러스 감염성 질병 치료용 조성물은 침지 목욕에 의해서 투여되고, 상기 PACAP는 물 1 리터 당 50-1000 ㎍의 농도이고, 상기 항바이러스성 분자는 물 1 리터 당 100-2000 ㎍의 농도인 것을 특징으로 하는 수중 생물의 바이러스 감염성 질병 치료용 조성물.
  20. 양식 중인 수중 생물들에 (ⅰ) 뇌하수체 아데닐레이트 싸이클라아제 활성화 폴리펩티드 (pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP)를 포함하는, 수중 생물에서 바이러스들에 의해 야기되는 바이러스 감염성 질병 치료용 조성물 또는 (ⅱ) 뇌하수체 아데닐레이트 싸이클라아제 활성화 폴리펩티드 (pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP) 및 항바이러스성 분자를 포함하는, 수중 생물에서 바이러스들에 의해 야기되는 바이러스 감염성 질병 치료용 조성물을 투여하는 단계;를 포함하고,
    상기 바이러스 감염성 질병은 헤르페스비리데 (Herpesviridae), 파포바비리데 (Papovaviridae), 토가비리데 (Togaviridae), 레트로비리데 (Retroviridae), 레오비리데 (Reoviridae), 비르나비리데 (Birnaviridae) 및 피코르나비리데 (Picornaviridae) 과의 바이러스로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 바이러스에 의해서 야기되는 바이러스 감염성 질병이고,
    상기 수중 생물은 어류, 각갑류 및 쌍각류조개로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 수중 생물인 것을 특징으로 하는 수중양식에 있어서 바이러스 감염을 조절하기 위한 방법.
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