BR112013001978B1 - Compostos e conjugados de derivados de anticâncer, processo de preparação dos conjugados e uso terapêutico dos mesmos - Google Patents

Compostos e conjugados de derivados de anticâncer, processo de preparação dos conjugados e uso terapêutico dos mesmos Download PDF

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Abstract

derivados de anticâncer, preparação dos mesmos e uso terapêutico dos mesmos. a presente invenção refere-se aos conjugados de dímeros de pirrolo[1,4]benzodiazepina (pbd), às composições contendo-os e ao seu uso terapêutico, especialmente como agentes anticâncer. a invenção também se refere ao processo para a preparação dos conjugados e ao seu uso como agentes anticâncer,e também aos dímeros sozinhos. a fórmula (l) na qual: representa uma ligação única ou uma ligação dupla.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSTOS E CONJUGADOS DE DERIVADOS DE ANTICÂNCER, PROCESSO DE PREPARAÇÃO DOS CONJUGADOS E USO TERAPÊUTICO DOS MESMOS.
[001] A presente invenção refere-se aos conjugados de dímeros de pirrolo[1,4]benzodiazepina (PBD), às composições contendo-os e ao seu uso terapêutico, especialmente como agentes anticâncer. A invenção também refere-se ao processo para preparar os conjugados e ao seu uso como agentes anticâncer, e também aos dímeros sozinhos.
Campo Técnico [002] Dímeros de pirrolo[1,4]benzodiazepina são agentes anticâncer que agem covalentemente ligando-se ao DNA celular. Esses derivados foram descritos nos Pedidos de Patente WO 00/12508 e WO 2005/085260 e também nas seguintes publicações: Eur. J. MedChem, 2005, 40, 641-654; Tetrahedron Letters 1988, 29(40), 51055108.
[003] As substâncias químicas conjugadas foram conhecidas por muitos anos e foram aplicadas a várias famílias citotóxicas de agentes citotóxicos, por exemplo, maitansinoides (WO 04103272), taxanos (WO 06061258), leptomicinas (WO 07144709), CC-1065 e análogos dos mesmos (WO 2007102069); com respeito aos conjugados, veja também Monneret C. e outros, Bulletin du Cancer 2000, 87(1 1), 82938; Ricart A.D. e outros, Nature Clinical Practice Oncology 2007, 4, 245-255; Singh R. e Rickson H.K., Therapeutic Antibodies: Métodos and Protocols, 2009, 525, 445-467.
Técnica Anterior [004] Os conjugados dos dímeros de pirrolo[1,4]benzodiazepina foram descritos nos pedidos de patente WO 07085930 e WO 2009/016516. Os dímeros usados têm as fórmulas:
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Figure BR112013001978B1_D0001
[005] nas quais T pode representar um grupo arila ou heteroarila substituído com -G-D-(Z)p-SZa ou -G-D-(Z)p-C(=O)ZbRb. G representa uma ligação única ou dupla ou alternativamente -O-, -S- ou -NR-. D representa uma ligação única ou um dos seguintes grupos: -E-, -E-NR, -E-NR-F-, -E-O-, -E-O-F-, -E-NR-CO-, -E-NR-CO-F-, -E-CO-, -CO-E-, -E-CO-F, -E-S-, -E-S-F-, -E-NR-C-S-, -E-NR-CS-F- para os quais E e F são escolhidos de -(OCH2CH2)ialquil(OCH2CH2)i-, -alquil(OCH2CH2)ialquila, -(OCH2CH2)í, -(OCH2CH2)iCicloalquil(OCH2CH2)i-, (OCH2CH2)iheterociclil-(OCH2CH2)i-, -(OCH2CH2)iaril(OCH2CH2)i-, (OCH2CH2)iheteroaril(OCH2CH2)i-, -alquil-(OCH2CH2)ialquil(OCH2CH2)i-, -alquil-(OCH2CH2)i-, -alquil-(OCH2CH2)iCicloalquil- (OCH2CH2)i-, alquil(OCH2CH2)iheterociclil(OCH2CH2)i-, -alquil-(OCH2CH2)i-aril(OCH2CH2)j-, -alquil(OCH2CH2)iheteroaril(OCH2CH2)j-, -cicloalquilalquil-, -alquil-cicloalquil-, -heterociclil-alquil-, -alquil-heterociclil-, alquil-aril-, -aril-alquil-, -alquil-heteroaril-, -heteroaril-alquil-, i e j representam números inteiros variando de 0 a 2000. Z representa um grupo alquila e p é um número inteiro igual a 0 ou 1. Nesses compostos, o R do grupo NR não compreende uma cadeia PEG.
[006] O imunógeno descrito em novembro de 2009 no Congresso EORTC (Abstract B-126) o seguinte conjugado:
q - . NH-anticorpo
Q· ··-- N . I
H =N Q ll ] q N= i ir : ' • N _ - W·..
0[007] que é distinguido pela natureza do ligador e do composto citotóxico. Este composto foi novamente descrito no Sexto Congresso
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PEGS Anual em Boston que ocorre em 17 a 21 de maio de 2010, e também o seguinte precursor:
Figure BR112013001978B1_D0002
[008] com R = N-sucinimidila ou metila.
[009] Os seguintes dímeros são especialmente descritos, respectivamente, em WO 07085930 e WO 2009/016516:
Figure BR112013001978B1_D0003
[0010] Essas três aplicações não descrevem ou sugerem os novos ligadores da invenção, que compreendem uma ou duas cadeias pegiladas.
Problema Técnico [0011] O problema técnico que a presente invenção pretende resolver é de propor novos dímeros de pirrolo[ 1,4]benzodiazepina. Definições [0012] As seguintes definições se aplicam:
• conjugado: um agente de ligação de célula ao qual é covalentemente presa pelo menos uma molécula de um composto ciPetição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 8/136
4/109 totóxico;
• agente de ligação de célula: uma molécula que tem afinidade com um alvo biológico pode ser, por exemplo, um ligante, uma proteína, um anticorpo, mais particularmente um anticorpo monoclonal, uma proteína ou fragmento de anticorpo, um peptídeo, um oligonucleotídeo ou um oligossacarídeo. O agente de ligação tem a função de direcionar o composto biologicamente ativo como um agente citotóxico ao alvo biológico;
• agente biológico: um antígeno (ou grupo de antígenos) preferencialmente localizado na superfície de células de câncer ou células estromais associadas com este tumor; esses antígenos possivelmente sendo, por exemplo, um receptor de fator de crescimento, um gene supressor de tumor mutado ou produto de oncogene, uma molécula relacionada com angiogênese, uma molécula de adesão;
• ligador: um conjunto de átomos para covalentemente prender um composto citotóxico ao agente de ligação;
• grupo alquila: um grupo com base em hidrocarboneto alifático saturado obtido removendo-se um átomo de hidrogênio de um alcano. O grupo alquila pode ser linear ou ramificado. Os exemplos que podem ser mencionados incluem metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, terc-butila, pentila, 2,2-dimetilpropila, hexila;
• grupo cicloalquila: um grupo alquila cíclico compreendendo entre 3 e 8 átomos de carbono embutidos na estrutura de anel. Os exemplos que podem ser mencionados incluem grupos ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila e cicloexila;
• grupo arila: um grupo aromático monocíclico ou bicíclico não contendo qualquer heteroátomo. É mais particularmente um grupo fenila ou naftila;
• grupo heteroarila: um grupo aromático monocíclico ou bicíclico compreendendo pelo menos um heteroátomo (O, S, N) embu
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5/109 tidos no anel e conectados aos átomos de carbono formando o anel. É mais particularmente um grupo piridila, pirrolila, tienila, furila, pirimidinila ou triazolila;
• grupo heterocicloalquila: um grupo cicloalquila compreendendo pelo menos um heteroátomo (O, S, N) embutido no anel e conectado aos átomos de carbono formando o anel. É mais particularmente um grupo piperazine, N-metilpiperazino, morfolino, piperidino ou pirrolidino;
• grupo alcóxi: um grupo -O-alquila, no qual o grupo alquila é como definido acima;
• grupo alcanoilóxi: um grupo -O-CO-alquila, no qual o grupo alquila é como definido acima;
• grupo alquileno: um grupo divalente saturado de fórmula empírica -Cmhbm-, obtido por remoção de dois átomos de hidrogênio de um alcano. Os exemplos que podem ser mencionados incluem grupos metileno (-CH2-), etileno (-CH2CH2-), propileno (-CH2CH2CH2-), butileno (-CH2CH2CH2CH2-), isobutileno (-^^ ) e hexileno (CH2CH2CH2CH2CH2CH2-). O grupo alquileno pode mais particularmente ser da fórmula -(CH2)m-, m representando um número inteiro;
• nas faixas de valores, os limites são incluídos (por exemplo, uma faixa do tipo i variando de 1 a 6 inclui os limites 1 e 6. Além disso, a faixa também descreve todos os pontos na faixa; desse modo, i variando de 1 a 6 descreve os valores 1,2, 3, 4, 5 e 6. Abreviações Usadas [0013] EtOAc: acetato de etila; ALK: grupo alquileno; (Cx-Cy)ALK: grupo (Cx-Cy)alquileno; TLC: cromatografia de camada fina; MSC: cloreto de metanossulfonila; DBU: 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno; DCC: Ν,Ν'-dicicloexilcarbodiimida; DCM: diclorometano; DEAD: azodicarboxilato de dietila; DIC: N,N'-di-isopropilcarbodiimida; DIPEA: N,NPetição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 10/136
6/109 di-isopropiletilamina; DMA: dimetilacetamida; DMAP: 4dimetilaminopiridina; DME: dimetoxietano; DMF: dimetilformamida; DMSO: sulfóxido de dimetila; eWL nm: coeficiente de extinção molar no comprimento de onda WL; EEDQ: 2-etóxi-1-etoxicarbonil-1,2diidroquinolina; EDCI: N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida;
EDTA: ácido etilenodiaminotetraacético; Fmoc: fluorenilmetoxicarbonila; Hal: átomo de halogênio; HOBt: 1-hidroxibenzotriazol; HEPES: ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico; WL: comprimento de onda; Me: metila; NHS: N-hidroxissucinimida; NMP: Nmetilpirrolidinona; RP: pressão reduzida; Rf: fator de retenção; SEC: cromatografia de exclusão estérica; RT: temperatura ambiente; TBDMS: terc-butildimetilsilil; TEA: trietilamina; TFA: ácido trifluoroacético; TIPS: triisopropilsilila; THF: tetraidrofurano; tR: tempo de retenção. Figuras [0014] Figura 1: modificação do agente de ligação por SPDP;
[0015] Figura 2: modificação do agente de ligação por um iminotiolano;
[0016] Figura 3: espectro de massa de alta resolução desconvoluto do conjugado do Exemplo 8 após desglicosilação;
[0017] Figura 4: espectro de massa de alta resolução desconvoluto (HRMS) do conjugado não desglicosilado de Exemplo 9;
[0018] Figura 5: espectro de massa de alta resolução desconvoluto (HRMS) do conjugado não desglicosilado de Exemplo 10;
[0019] Figura 6: espectro de massa de alta resolução desconvoluto (HRMS) do conjugado não desglicosilado do Exemplo 11.
[0020] Essas figuras mostram para cada conjugado a distribuição das espécies portando de 0 a 8 dímeros de tomaimicina (D0: nenhum dímero; Dx: x dímeros).
Breve Descrição da Invenção [0021] A invenção refere-se aos compostos da fórmula (I):
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Q-( CHjCHjO^-CH jCHj-G jL -RCGd
Figure BR112013001978B1_D0004
[0022] na qual:
• — representa uma ligação única ou uma ligação dupla, com a condição que — represente uma ligação única, em seguida:
❖ U e/ou U', que podem ser idênticos ou diferentes, representam, independentemente um do outro, H;
❖ W e/ou W, que podem ser idênticos ou diferentes, representam, independentemente um do outro: OH, -OR, -OCOR, COOR, -OCOOR, -OCONRR', um carbamato cíclico tal que N10 e C11 sejam incluídos em um anel, -NRCONRR', -OCSNHR, um tiocarbamato cíclico tal que N10 e C11 sejam incluídos em um anel, -SH, -SR, SOR, -SOOR, -SO3, -NRSOOR', -NRR', uma amina cíclica tal que N10 e C11 sejam incluídos em um anel, -NROR', -NRCOR', -N3, -CN, Hal, um grupo trialquilfosfônio ou triarilfosfônio;
se — representa uma ligação dupla, então:
❖ U e LT estão ausentes;
❖ W e/ou W, que podem ser idênticos ou diferentes, representam, independentemente um do outro, H;
• R1, R2, Ri', R2', que podem ser idênticos ou diferentes, representam, independentemente um do outro: H, Hal ou um grupo (Ci-Cejalquila opcionalmente substituído com um ou mais substituintes escolhidos de: Hal, CN, NRR', CF3, OR, um grupo arila ou heteroarila,
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S(O)qR com q = 0, 1 ou 2;
[0023] ou alternativamente [0024] Ri e R2 e/ou R1' e R2' juntos formam, respectivamente, uma ligação dupla =CH2 ou =CH-CH3;
• Y e Y', que podem ser idênticos ou diferentes, representam, independentemente um do outro, H ou -OR;
• M representa CH ou N;
• ALK e ALK' significam um grupo (C1-C6)alquileno;
• R e R' representam, independentemente um do outro, H ou um grupo (C1-C6)alquila ou arila opcionalmente substituído com um ou mais substituintes escolhidos de: Hal, CN, NRR', CF3, OR, um grupo arila ou heteroarila;
• L1 representa:
o uma ligação única;
ou o o grupo -(OCH2CH2X preso ao anel de fenila ou piridila através do átomo de oxigênio, i representando um número inteiro variando de 2 a 40, preferivelmente de 2 a 10, preferivelmente igual a 3;
ou o o grupo -D-(Ci-C6)ALK- preso ao anel de fenila ou piridila através de D, no qual D representa -O-, -NH- ou -N(Ci- C4)alquil-;
• L2 representa:
[0025] o um grupo -(Ci-C6)ALK-;
[0026] ou [0027] o o grupo -(CH2CH2O)j-CH2CH2-, j representando um número inteiro variando de 1 a 40, preferivelmente de 1 a 10, preferivelmente igual a 2 ou 3;
[0028] ou [0029] o um grupo -(CH2CH2O)J-CH2CH2-NR-(C1-C6)ALK-, preso
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9/109 ao átomo de nitrogênio através da unidade -(CH2CH2O)-, j representando um número inteiro variando de 1 a 40, preferivelmente de 1 a 10, preferivelmente igual a 2 ou 3, e R representando H ou um grupo (C1C4)alquila;
• Q representa uma ligação única ou o grupo C(=0);
• k representa um número inteiro variando de 0 a 40, preferivelmente de 1 a 40, de preferência de 1 a 10;
• G representa um grupo -OR ou -NRR', R e R' sendo como definido previamente ou sendo tais que formem, com o átomo de nitrogênio ao qual eles são presos, um grupo (C4-C10)heterocicloalquila que pode compreender no anel outro heteroátomo escolhido de N, O e S e que pode ser opcionalmente substituído com pelo menos um substituinte escolhido de um grupo (C1-C4)alquila, um átomo de halogênio e um grupo hidroxila;
• RCG1 representa o grupo -SZa ou -C(=O)-ZbRb • Za representa Ac, Ra ou SRa;
• Ra representa H, ou um grupo (C1-C6)alquila, (C3C8)cicloalquila, arila, heteroarila ou (C4-Cw)heterocicloalquila opcionalmente substituído com um ou mais substituintes escolhidos de: Hal, CN, NRR', CF3, OR, NO2, um grupo arila ou heteroarila;
• Zb representa uma ligação única, -O- ou -NH- e Rb representando H ou um grupo (C1-C6)alquila, (C3-C8)cicloalquila, arila, heteroarila ou (C4-Cw)heterocicloalquila ou alternativamente Zb representa uma ligação única e Rb representa Hal;
[0030] com a condição que se L1 representa uma ligação única, então RCG1 representará -SZa, [0031] Mais particularmente, eles são compostos das fórmulas (IA) ou (IB):
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10/109
Figure BR112013001978B1_D0005
Figure BR112013001978B1_D0006
[0032] A invenção também refere-se ao processo para a preparação de um conjugado, que consiste em: (i) colocar em contato e deixar reagir uma solução aquosa, opcionalmente tamponada, do agente de ligação, opcionalmente modificada com um agente de modificação, e uma solução de um composto da fórmula (i), (ii) e em seguida em opcionalmente separar o conjugado formado na etapa (i) do composto da fórmula (I) e/ou o agente de ligação não reagido e/ou os agregados que possivelmente possam ter se formado. O grupo químico RCG1 do composto da fórmula (I) deve ser reativo para os grupos químicos RCG2 presentes no agente de ligação, especialmente para os grupos amino presentes nos anticorpos, os referidos grupos químicos RCG2 tendo sido introduzidos, onde apropriado, pelo agente de modificação de modo a unir o composto da fórmula (I) ao agente de ligação por formação de uma ligação covalente.
[0033] A invenção também refere-se a um conjugado e a uma solução de conjugado que pode ser obtida através do processo descrito acima.
[0034] A invenção também refere-se ao uso de um derivado da
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11/109 fórmula (I) para a preparação de um agente de ligação ao qual é covalentemente preso na para posição de Μ o dímero da fórmula:
Figure BR112013001978B1_D0007
[0035] O composto, o conjugado e a solução de conjugado podem ser usados como agentes anticâncer.
[0036] A invenção também refere-se ao composto da fórmula P2:
Q-( C HaC H2O)^-C H2C H2G
Figure BR112013001978B1_D0008
[0037] na qual l_2, Q, k, ALK, ALK' e G são como definidos previamente; LG e LG' representam um grupo de saída e X' representa RCG1.
[0038] A invenção também refere-se a um agente de ligação ao qual foi covalentemente preso na para posição de Μ o dímero da fórmula:
Figure BR112013001978B1_D0009
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12/109 [0039] após a reação de um composto da invenção com o agente de ligação.
Descrição da Invenção [0040] A invenção se refere aos compostos da fórmula (I):
Figure BR112013001978B1_D0010
[0041] na qual:
❖ — representa uma ligação única ou ligação dupla, com a condição que se — representa uma ligação única, então:
❖ U e/ou U', que podem ser idênticos ou diferentes, representarão, independentemente um do outro, H;
❖ W e/ou W, que podem ser idênticos ou diferentes, representarão, independentemente um do outro:
❖ OH, -OR, -OCOR, -COOR, -OCOOR, -OCONRR', um carbamato cíclico tal que N10 e C11 sejam incluídos em um anel, NRCONRR', -OCSNHR, um tiocarbamato cíclico tal que N10 e C11 sejam incluídos em um anel, -SH, -SR, -SOR, -SOOR, -SOs', NRSOOR', -NRR', uma amina cíclica tal que N10 e C11 sejam incluídos em um anel, -NROR', -NRCOR', -N3, -CN, Hal, um grupo trialquilfosfônio ou triarilfosfônio;
se — representa uma ligação dupla, então:
❖ U e LT estarão ausentes;
❖ W e/ou W, que podem ser idênticos ou diferentes, representarão, independentemente um do outro, H;
❖ R1, R2, Ri', R2', que podem ser idênticos ou diferen
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 17/136
13/109 tes, representam, independentemente um do outro: H, Hal ou um grupo (Ci-C6)alquila opcionalmente substituído com um ou mais substituintes escolhidos de: Hal, CN, NRR', CF3, OR, um grupo arila ou heteroarila, S(O)qR com q = 0, 1 ou 2;
[0042] ou alternativamente [0043] Ri e R2 e/ou Ri' e R2' juntos formam, respectivamente, uma ligação dupla =CH2 ou =CH-CH3;
• Y e Y', que podem ser idênticos ou diferentes, representam, independentemente um do outro, H ou -OR;
• M representa CH ou N;
• ALK e ALK' significam um grupo (C1-C6)alquileno;
• R e R' representam, independentemente um do outro, H ou um grupo (C1-C6)alquila ou arila opcionalmente substituído com um ou mais substituintes escolhidos de: Hal, CN, NRR', CF3, OR, um grupo arila ou heteroarila;
• L1 representa:
o uma ligação única;
ou o o grupo -(OCH2CH2)i-, preso ao anel de fenila ou piridila através do átomo de oxigênio, i representando um número inteiro variando de 2 a 40, preferivelmente de 2 a 10, preferivelmente igual a 3;
ou o o grupo -D-(Ci-C6)ALK- preso ao anel de fenila ou piridila através de D, no qual D representa -O-, -NH- ou -N(C1-C4)alquil-;
• L2 representa:
o um grupo -(Ci-C6)ALK-;
ou o o grupo -(CH2CH2O)j-CH2CH2-, j representando um número inteiro variando de 1 a 40, preferivelmente de 1 a 10, preferivelPetição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 18/136
14/109 mente igual a 2 ou 3;
ou o um grupo -(CH2CH2O)i-CH2CH2NR-(Ci-C6)ALK-, preso ao átomo de nitrogênio através da unidade -(CH2CH2O)-, j representando um número inteiro variando de 1 a 40, preferivelmente de 1 a 10, preferivelmente igual a 2 ou 3, e R representando H ou um grupo (C1-C4)alquila;
• Q representa uma ligação única ou o grupo C(=0);
• k representa um número inteiro variando de 0 a 40, preferivelmente de 1 a 40, de preferência de 1 a 10;
• G representa um grupo -OR ou -NRR', R e R' sendo como definidos previamente ou sendo tal que eles formem, como o átomo de nitrogênio ao qual eles estão presos, um grupo (C4Cw)heterocicloalquila que pode compreender no anel outros heteroátomos escolhidos de N, O e S e que possam ser opcionalmente substituídos com pelo menos um substituinte escolhidos de um grupo (C1C4)alquila, um átomo de halogênio e um grupo hidroxila;
• RCG1 representa o grupo -SZa ou-SZa or -c(=o)-Z bRb;
• Za representa Ac, Ra ou SRa;
• Ra representa H, ou um grupo (C1-C6)alquila, (C3C8)cicloalquila, arila, heteroarila ou (C4-Cw)heterocicloalquila opcionalmente substituído com um ou mais substituintes escolhidos de: Hal, CN, NRR', CF3, OR, NO2, um grupo arila ou heteroarila;
• Zb representa uma ligação única, -O- ou -NH- e Rb representando H ou um grupo (C1-C6)alquila, (C3-C8)cicloalquila, arila, heteroarila ou (C4-Cw)heterocicloalquila ou alternativamente Zb representa uma ligação única e Rb representa Hal;
[0044] com a condição que se Li representa uma ligação única, então RCG1 representará -SZa.
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15/109 [0045] Os compostos da fórmula (I) podem, desse modo, existir na forma:
Figure BR112013001978B1_D0011
Figure BR112013001978B1_D0012
na qual:
❖ — representa uma ligação única ou a ligação dupla, com a condição que se — representa uma ligação única, então:
❖ — representará uma ligação única;
❖ U e/ou U', que podem ser idênticos ou diferentes, representarão, independentemente um do outro, H;
❖ W e/ou W, que podem ser idênticos ou diferentes, representarão, independentemente um do outro: OH, -OR, -OCOR, COOR, -OCOOR, -OCONRR', um carbamato cíclico tal que N10 e C11 sejam incluídos em um anel, -NRCONRR', -OCSNHR, um tiocarbamato cíclico tal que N10 e C11 sejam incluídos em um anel, -SH, -SR, SOR, -SOOR, -SO3·, -NRSOOR', -NRR', uma amina cíclica tal que N10
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16/109 e C11 sejam incluídos em um anel, -NROR', -NRCOR', -N3, -CN, Hal, um grupo trialquilfosfônio ou triarilfosfônio;
• R1, R2, R1', R2', que podem ser idênticos ou diferentes, representam, independentemente um do outro: H, Hal ou um grupo (C1-C6)alquila opcionalmente substituído com um ou mais substitutes escolhidos de: Hal, CN, NRR', CF3, OR, um grupo arila ou heteroarila, S(O)qR com q = 0, 1 ou 2;
ou alternativamente [0047] Ri e R2 e/ou R1' e R2' juntos formam, respectivamente, uma ligação dupla =CH2 ou =CH-CH3;
• Y e Y', que podem ser idênticos ou diferentes, representam, independentemente um do outro, H ou -OR;
• M representa CH ou N;
• ALK e ALK' significam um grupo (C1-C6)alquileno;
• R e R' representam, independentemente um do outro, H ou um grupo (C1-Ce)alquila ou aril opcionalmente substituído com um ou mais substituintes escolhidos de:
• Hal, CN, NRR', CF3, OR, um grupo arila ou heteroarila;
• Li representa:
o uma ligação única;
ou o o grupo -(OCH2CH2)i-, preso ao anel de fenila ou piridila através do átomo de oxigênio, i representando um número inteiro variando de 2 a 40, preferivelmente de 2 a 10; ou o o grupo -D-(Ci-C6)ALK- preso ao anel de fenila ou piridila através de D, no qual D representa -O-, -NH- ou -N(C1-C4)alquil-;
• L2 representa:
o um grupo -(Ci-C6)ALK-;
ou
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17/109 o o grupo -(CH2-CH2O)j-CH2CH2-, j representando um número inteiro variando de 1 a 40, preferivelmente de 1 a 10;
ou o um grupo -(CH2CH2O)í-CH2CH2NR-(Ci-C6)ALK-, preso ao átomo de nitrogênio através da unidade -(CH2CH2O)-, j representando um número inteiro variando de 1 a 40, preferivelmente de 1 a 10, e R representando H ou um grupo (C1-C4)alquila;
• Q representa uma ligação única ou o grupo C(=O);
• k representa um número inteiro variando de 0 a 40, preferivelmente de 1 a 40, de preferência de 1 a 10;
• G representa um grupo -OR ou -NRR', R e R' sendo como definido previamente ou sendo tal que eles formem, com o átomo de nitrogênio ao qual eles são presos, um grupo (C4C10)heterocicloalquila que pode compreender no anel heteroátomo escolhidos de N, O e S e que podem ser opcionalmente substituídos com pelo menos um substituinte escolhido de um grupo (C1-C4)alquila, um átomo de halogênio e um grupo hidroxila; RCG1 representa o grupo SZa ou — C(=O)ZbRb;
• Za representa Ac, Ra ou SRa;
• Ra representa H, ou um grupo (C1-C6)alquila, (C3C8)cicloalquila, arila, heteroarila ou (C4-Cw)heterocicloalquila opcionalmente substituído com um ou mais substituintes escolhidos de: Hal, CN, NRR', CF3, OR, NO2, um grupo arila ou heteroarila;
• Zb representa uma ligação única, -O- ou -NH- e Rb representando H ou um grupo (C1-C6)alquila, (C3-C8)cicloalquila, arila, heteroarila ou (C4-Cw)heterocicloalquila ou alternativamente Zb representa uma ligação única e Rb representa Hal;
com a condição de que se L1 representa uma ligação única, então RCG1 representará -SZa.
[0048] O termo L significa o ligador definido por,
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Q4CHzCHzO)k-CH2CH2-G
Figure BR112013001978B1_D0013
[0049] Mais particularmente, se Li representa uma ligação única, l_2 representará -(CH2CH2O)j-CH2CH2- ou -(CH2CH2O)jCH2CH2NR(Ci-C6)ALK- e/ou k#2.
[0050] Mais particularmente, quando M representa N, -D-(CiCe)ALK- de preferência representa -O-(Ci-C6)ALK-, Mais particularmente, os dois grupos ALK e ALK' presos ao núcleo de fenila ou piridila ambos significam um grupo metileno.
[0051] Mais particularmente, D representa -O-, -NH- ou -NMe-, [0052] Nas fórmulas (I) e (II) acima, cada grupo alquileno (desse modo, por exemplo, os dois grupos ALK e ALK') preso ao núcleo de fenila ou piridila pode ser idêntico ou diferente; de acordo com outro exemplo, o grupo ALK de -D-(Ci-Ce)ALK- pode ser idêntico a ou diferente do grupo ALK preso ao núcleo de fenila ou piridila. ALK pode ser escolhido, por exemplo, de um dos seguintes: -CH2-, -CH2CH2-, CH2CMe2-, -CH2CH2CH2-.
[0053] Y e Y' mais particularmente representa um grupo (C1C4)alcóxi, especialmente 0 grupo metóxi. R e R' podem mais particularmente representar, independentemente um do outro, H ou um grupo (Ci-Ce)alquila.
[0054] De acordo com uma modalidade particular, U=U' e/ou W=W e/ou Ri=Ri' e/ou R2=R2' e/ou Y=Y' e/ou ambos os grupos ALK e ALK' presos ao núcleo de fenila ou piridila são idênticos (dímero simétrico, que é mais fácil de preparar).
[0055] Mais particularmente, W e W são idênticos ou diferentes e representam OH, OMe, OEt, NHCONH2, SMe.
R pode representar H ou um grupo (Ci-C4)alquila, especialmente Me. [0056] M mais particularmente representa um átomo de nitrogênio
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19/109 (N).
[0057] Mais particularmente, Ri e R2 e/ou Ri e R2' juntos formam, respectivamente, uma ligação dupla =CH2 ou =CH-CH3, mais especificamente =CH-CH3.
[0058] G pode representar um grupo -OR, mais particularmente um grupo -OH ou -O(Ci-Ce)alquila, especialmente -OMe. G pode também representar um grupo -NRR' no qual R e R' representam, independentemente um do outro, H ou um grupo (Ci-Ce)alquila. Mais particularmente, G pode, desse modo, representar um grupo -NH2, -NH(C1Ce)alquila ou -N(Ci-Ce)alquila2, especialmente -N(CH3)2. G pode também representar um grupo -NRR' no qual R e R' formam, juntos com o átomo de nitrogênio ao qual eles são presos, um grupo (C4Ci0)heterocicloalquila que pode compreender no anel de heteroátomo escolhido de N, O e S e que pode ser opcionalmente substituído com pelo menos um substituinte escolhidos de um grupo (Ci-C4)alquila, um átomo de halogênio e um grupo hidroxila. O grupo heterocicloalquila pode ser escolhido especialmente de piperazino, N-metilpiperazino, morfolino, piperidino e pirrolidino.
[0059] k representa um número inteiro variando de 0 a 40. k pode considerar 0 (nenhuma cadeia PEG terminando com G preso ao átomo de nitrogênio). Entre os compostos da invenção, uma distinção pode ser feita para aqueles compreendendo uma cadeia de PEG terminando com G preso ao átomo de nitrogênio e k varia de i a 40, de preferência de i a i0, de preferência de i a 5. Uma distinção pode também ser feita para aqueles compreendendo pelo menos uma cadeia PEG, isto é, aqueles para que k varie de i a 40, preferivelmente de i ao i0, de preferência de i a 5, e/ou Li= -(OCH2CH2)i e/ou L2= (CH2CH2O)j-CH2CH2- ou alternativamente -(CH2CH2O)jCH2CH2NR(Ci-Ce)ALK-.
[0060] Os compostos das fórmulas (I) e (II), incluindo aqueles de
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20/109 terminados nos exemplos, podem existir na forma de bases ou de sais de adição com ácidos farmaceuticamente aceitáveis, e também na forma de hidratos ou solvatos dessas bases ou dos sais.
[0061] Mais particularmente, uma distinção é feita para aqueles da fórmula (IA) ou (IB):
Figure BR112013001978B1_D0014
Figure BR112013001978B1_D0015
[0062] Além disso, os seguintes são distinguidos:
um primeiro subgrupo de compostos para os quais Li= -D-(Ci-C6)ALK- e L2= -(Ci-Ce)ALK-;
um segundo subgrupo de compostos para os quais Li = -(OCH2CH2)í e l_2= -(Ci-C6)ALK-;
um terceiro subgrupo de compostos para os quais Li= ligação única e L2= -(CH2CH2O)j- CH2CH2NR-(Ci-C6)ALK-;
um quarto subgrupo de compostos para os quais Li= -D-(Ci-C6)ALK-, e l_2= -(CH2CH2O)j- CH2CH2NR-(Ci-C6)ALK-;
um quinto subgrupo de compostos para os quais Li= -D-(Ci-C6)ALK- e l_2= -(CH2CH2O)j-CH2CH2-.
[0063] Os seguintes grupos de compostos também podem ser distinguidos:
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21/109
- Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q = ligação única, k=1-10, G=OR, RCG1 =-SZa;
- Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q=CO, k=1-10, G=OR, RCG1 =-SZa;
- Li= -(OCH2CH2)í-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q = ligação única, k=1-10, G=OR, RCG1 =-SZa;
- Li= -(OCH2CH2)í-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q=CO, k=1-10,
G=OR, RCG1 =-SZa;
- Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q = ligação única, k=1-10, G=NRR', RCG1 =-SZa;
- Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q=CO, k=1-10, G=NRR', RCG1 =-SZa;
- Li= ligação única, L2= -(CH2CH2O)í-CH2CH2NR-(Ci-
C6)ALK-, Q = ligação única, k=1-10, G=OR, RCG1 =-SZa;
- Li= ligação única, L2= -(CH2CH2O)í-CH2CH2NR-(Ci-
Cô)ALK-, Q=CO, k=1-10, G=OR, RCG1 =-SZa;
- Li= ligação única, L2= -(CH2CH2O)í-CH2CH2NR-(Ci-
Cô)ALK-, Q = ligação única, k=0-10, G=NRR', RCG1=-SZa;
- Li= ligação única, L2= -(CH2CH2O)i-CH2CH2NR-(Ci-
Cô)ALK-, Q=CO, k=0-10, G=NRR', RCG1 =-SZa;
- Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(CH2CH2O)i-CH2CH2NR-(Ci-
Cô)ALK-, Q = ligação única, k=0- 10, G=NRR', RCG1=-SZa;
- Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(CH2CH2O)í-CH2CH2NR-(Ci-
Cô)ALK-, Q=CO, k=0-10, G=NRR', RCG1=-SZa;
- Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2=-(CH2CH2O)i-CH2CH2NR-(Ci-
Cô)ALK-, Q = ligação única, k=1-10, G=OR, RCG1 =-SZa;
- Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2=-(CH2CH2O)i-CH2CH2NR-(Ci-
Cô)ALK-, Q=CO, k=1-10, G=OR, RCG1 =-SZa;
- Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q = ligação única, k=1-10, G=OR, RCG1 = -C(=O)ZbRb;
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22/109
- Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q=CO, k=1-10,
G=OR, RCG1 = -C(=O)ZbRb;
- Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q = ligação única, k=1-10, G=NRR', RCG1 = -C(=O)ZbRb;
- Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q=CO, k=1-10,
G=NRR', RCG1 = -C(=O)ZbRb;
- Li= -(OCH2CH2)í-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q = ligação única, k=1-10, G=OR, RCG1 = -C(=O)ZbRb;
- Li= -(OCH2CH2)í-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q=CO, k=1-10,
G=OR, RCG1 = -C(=O)ZbRb;
- Li= -(OCH2CH2)í-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q = ligação única, k=1-10, G=NRR', RCG1 = -C(=O)ZbRb;
- Li= -(OCH2CH2)í-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q=CO, k=1-10,
G=NRR', RCG1 = -C(=O)ZbRb;
- Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(CH2CH2O)í-CH2CH2-, Q = ligação única, k=1-10, G=OR, RCG1 = -C(=O)ZbRb;
- Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(CH2CH2O)í-CH2CH2-, q=co, k=1-10, G=OR, RCG1 = -C(=O)ZbRb;
- Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(CH2CH2O)j-CH2CH2-, Q = ligação única, k=0-10, G=NRR', RCG1 = -C(=O)ZbRb;
- Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(CH2CH2O)j-CH2CH2-, Q=CO, k=0-10, G=NRR', RCG1 = -C(=O)ZbRb.
[0064] Nos grupos de compostos definidos acima:
[0065] i mais particularmente representa um número inteiro variando de 2 a 10, especialmente um número inteiro igual a 3;
[0066] j mais particularmente representa um número inteiro variando de 1 a 10, especialmente um número inteiro igual a 2 ou 3;
[0067] k mais particularmente representa um número inteiro igual a
0, ou variando de 1 a 5.
[0068] Tabela 1 descreve ligadores particulares L e também
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23/109 exemplos de compostos correspondendo a isto. Cada composto desta tabela pode existir na forma com M=CH (benzeno) ou alternativamente M=N (piridina). Os compostos com M=N são mais solúveis em água. Nesta tabela, os exemplos são dados em uma forma (IA), porém, também podem existir em uma forma (IB). L, Li, L2, k e G podem ser escolhidos daqueles descritos na Tabela I ou entre os exemplos.
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 28/136
Tabela I
Li Ü2 Q G Composto da Fórmula ΙΑ N°
-D-ALK- ALK - OR O ° O ' | | | 1
-D-ALK- ALK co OR 0 N ' ''' S Za x -J- N^:-·· O O '^'XN V , o 1 1 o 2
-D-ALK- ALK - OR Ο θ X- zN.X,,Z8 N S h ,^N ,μ HT nXx' O O '^ V-N 1.., 3
-D-ALK- ALK co OR o 0 -()- ° - .° . Λ N..xszy X Í Ύ Γ ϊ V, o 1 1 o 4
24/109
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Li Ü2 Q G Composto da Fórmula IA N°
-(OCH2CHí)t ALK CO OR 0·· <> · o- O-sZ, ,.ΑΑμ:'° ° V O 1 1 0 5
-(OCH2CH CO o 0 0 ° ; , o o o Λ i i cT 6
-D-ALK- ALK - NRR' Ν'” ’-'0 1 o N-AZ’ ..... A. A'A Ο'^Α'Ν A ..- '‘o 1 1 ei 7
-D-ALK- ALK CO NRR' A ° -0’ ° ^ 1 0^NjAs,Za A ΧΝΟ0''^Ν^·'^Γ1Ν^ . A ,νΑ^Ο O >n L . β!Q 8
25/109
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Li Ü2 Q G Composto da Fórmula ΙΑ Ν°
-D-ALK- ALK - CO Ο ° Ο ° Ο I o 1 1 o 9
-D-ALK- ALK CO OR —O'—O —θ—γθ ^ΝίΎο'Α'Ν^''οΤΊίΝ^·< Λ ι ι / -- — 10
-(ChbCI-bOJr CH2CH2NR”ALK- - OR ο , 0...Ν..,ο.,,ο n..;/sz» η ΛΝν^°'--Ο^ο Ύ<^Ν='. Η Μ ΛΑ ΛΑ A Λ ι ι ο 11
26/109
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 31/136
Li Ü2 Q G Composto da Fórmula ΙΑ N°
-(CH2CH2O)jCH2CH2NR”ALK- CO OR 9 | \z .ζ,γ,Χλ YA- 0 1 1 0 12
-D-ALK- -(CH2CH2O)jCH2CH2NR”ALK- - OR 0 N O' 0 N ' χ3· z I 1 zx Λ 1 1 o r 13
-D-ALK- -(CHzCHzO)j- CH2CH2NR°ALK- co OR I 1 /x H^Np,oXNX°^N^ Λ O'XrN Jo . Λ ! ! r v->X 14
27/109
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 32/136
Li Ü2 Q G Composto da Fórmula IA N°
-(CH2CH2O)iCH2CH2NR”ALK- - NRR' 1 Λ 1 \/ , N λ O ,··'·. N Ák , Za X Ü XX X -to 1 } r 15
-(CHzCHzOjfCH2CH2NR”ALK- CO NRR' ? 1 \/ x Λ '0 O''AV Vn „ 16
-D-ALK- -(CH2CH2O))CH2CH2NR”ALK- - NRR' 'Ν' ί Ί O N O’ ' 0 N '·~>ζ5'~' z 1 /X .X Ο Ο' 'ν'VN L, O 1 1 0 17
28/109
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 33/136
Li Ü2 Q G Composto da Fórmula ΙΑ N°
-D-ALK- -(CHsCI-hOhCH2CH2NR”ALK- CO NRR' I ,N, ^,0 O N 0’ ’ 0' N >< S Z JL 1 Λ 1 i o x- 18
-D-ALK- ALK - NRR' | N CC''} oj 0^nJ><s^ ΧΝΐΊΓ°^''°ΏΝΧ Ύ 1 \ 19
-D-ALK- ALK - OR N . JL 0 -' - ZbRb 0 1 1 0 20
29/109
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Li Ü2 Q G Composto da Fórmula ΙΑ N°
-D-ALK- ALK - OR x-x. ZbRb ? ΪΙ 0 x ,/ί. .... O 1 1 0 'v'' 21
-D-ALK- ALK CO OR xxxzAaRb ΗΤΝ ΐ^°χΛΧ-°γ-ϊ Ν='^ ! ! Γ 22
-D-ALK- ALK CO OR o yf ··^·· θ 0 N I'-. Λ cT 23
30/109
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 35/136
Li Ü2 Q G Composto da Fórmula ΙΑ N°
-D-ALK- ALK - OR θ' -^ο 0 JL ZbRb 24
ώ νΝ- Η ϊ '/2
Ο 'ο 1 ΟΛ’·'- 1 II 0
-D-ALK- ALK co OR Vx ^.0 0 A - ZbRb 25
κ/Α 0^ Ο IÍNV
0 % 1 1 VN- A oz
-(OCH2Ct - OR ^0' ο' ^Ο'^Ι 0 - ,H Zt-Rb 26
.Ck_ ίχ Ν _,,0 . ίΎ
0 ο I 0>i;L· I 0
31/109
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 36/136
Li Ü2 Q G Composto da Fórmula ΙΑ N°
-(OCH£CI % CO OR o ''-'0 - 'O N zbRb .4 JT ’Ό O' ^' VN X.. O 1 1 O 27
-D-ALK- ALK - NRR' 0 N Zb Rb o 1 1 o 28
-D-ALK- ALK CO NRR' ' ^0^0^,0^0 o 1 ZbRb H^N oJJ^O^N JA^\ ·'Ό 0 'xirN V - 0 1 1 0 29
32/109
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 37/136
Li Ü2 Q G Composto da Fórmula ΙΑ N°
-D-ALK- ALK - OR ο—° ο ,N, .---. ,Κ O n,^xx-z^ZbRb 'O oVVn„ L O 1 1 O 30
-D-ALK- ALK CO OR 0--^N^^AZbRb , X o'^y-N l. „ ο I 1 o 31
-D-ALK- -(CHzCHzOjr ch2ch2- - OR o'’I o N .-. -,0,- .-. -λ <r 0--0 z Π N Π )< '-A— % i i / - 32
33/109
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 38/136
Li Ü2 Q G Composto da Fórmula IA Ν°
-D-ALK- -(ChhCHíOJr ch2ch2- CO OR ο I Ιο 33
-D-ALK- -(CH2CH2O)ích2ch2- - NRR' 'ν' S ° Ο' ν-Νχζ Ο 0 ζ Ο 1 1 0 34
-D-ALK- -(CH2CH2O)íCH2CH2- CO NRR' 1 0 0^,.Ν -,JLZ ΗγΝγ-γΟ JíX<yX^u Χν-Ζ^Ό Ο'^χΝιΧ ο 1 1 ο 35
34/109
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 39/136
Figure BR112013001978B1_D0016
35/109
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 40/136
36/109 [0069] Os compostos descritos compreendem um grupo químico reativo (RCG1) que é reativo para um grupo químico reativo (RCG2) presente no agente de ligação. A reação entre RCG1 e RCG2 realiza a ligação do composto da fórmula (I) ao agente de ligação por formação de uma ligação covalente. Desse modo, os compostos da fórmula (I) podem ser conjugados a um agente de ligação.
[0070] RCG1 representa:
(i) o grupo reativo -SZa para o qual Za representa H ou o grupo -SRa e Ra representando um grupo (Ci-Ce)alquila, (C3C?)cicloalquila, arila, heteroarila ou (C4-Cio)heterocicloalquila;
(ii) 0 grupo reativo -C(=O)-ZbRb para 0 qual Zb representa uma ligação única, -O- ou -NH-, mais particularmente -O-, e Rb representando H ou um grupo (Ci-Ce)alquila, (C3-C?)cicloalquila, arila, heteroarila ou (C4-Cio)hetero-cicloalquila.
[0071] Mais particularmente, -SZa pode representar -SH ou SS(Ci-Ce)alquila, especialmente -SSMe, ou -SS- heteroarila, especi*1
K.
Figure BR112013001978B1_D0017
— 3. S almente s n , ou (Xi e X2 sendo definidos aqui abaixo). Mais particularmente, -SZa pode representar -SH ou -SS(CiCe)alquila, especialmente -SSMe.
[0072] Mais particularmente, -ZbRb pode representar -OH (função de ácido), -O(Ci-C6)alquila, especialmente -OCH3, -OCH2CH3, OCH2CH=CH2 (função de éster) ou alternativamente -ZbRb pode repre-
Figure BR112013001978B1_D0018
Figure BR112013001978B1_D0019
no qual IG representa pelo menos um grupo electroinduti vo tal como -NO2 ou -Hal especialmente -F. Pode ser, por exemplo,
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 41/136
37/109 —o um dos seguintes grupos:
Figure BR112013001978B1_D0020
NCr ou —ο
Figure BR112013001978B1_D0021
F
Outro o
__J-N Ί tipo de grupo-C(=O) ZbRb é 0 seguinte V’L'N. Os o
grupos reativos —O-N
-SH e o mostram boa reatividade.
Mais particularmente, -ZbRb pode representar -OH (função [0073] ácida), -O-(Ci-C6)alquila, especialmente -OCH3, -OCH2CH3, - ou alterυ
-O-N nativamente -ZbRb pode representar 0 [0074] Mais particularmente, RCG1 pode ser escolhido de um daqueles descritos nos exemplos.
[0075] Como os exemplos de RCG2, menção pode ser feita dos grupos ε-amino de lisinas transportados pelas cadeias laterais de resíduos de lisina que estão presentes na superfície de um anticorpo, dos grupos sacarídeo da região de articulação ou dos tióis de cisteínas por redução de ligações de dissulfeto de intra-cadeia (Garnett M.C. e tros, Advanced Drug Delivery Reviews 2001, 53, 171-216). Maios centemente, outras metodologias foram consideradas, tal como a trodução de cisteínas por mutação (Junutula J.R. e outros, Nature Biotechnology 2008, 26, 925-932; WO 09026274) ou a introdução de aminoácidos não naturais permitindo outros tipos de substância química (de Graaf A.J. e outros, Bioconjugate Chem. 2009, Publication Date (Web): 3 de fevereiro de 2009 (Review); DOI: 10.1021/bc800294a; WO 2006/069246 e de acordo com Chin J.W. e outros, JACS 2002, 124, 9026-9027 (ReCode® technology)). Esses modos de ligação usados com anticorpos são aplicáveis a todos os agentes de alvejamento cooureinPetição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 42/136
38/109 nhecidos como uma função de sua estrutura.
[0076] É também possível quimicamente modificar o agente de alvejamento de modo a introduzir novos grupos químicos reativos RCG2. Desse modo, é também conhecido por aqueles versados na técnica como modificar um anticorpo usando um agente de modificação (vide especialmente WO 2005/077090 página 14). A modificação torna possível melhorar a reação de conjugação e usar uma ampla variedade de grupos RCG1.
Agentes de Modificação para Introduzir Grupos Dissulfeto [0077] O agente de modificação pode ser um éster ativado NHS o o
R. .8— (Ο,-CJALkJX ,.n >
S Ο τΛ da fórmula ü na qual R representa um grupo (Ci-Cejalquila, arila, heteroarila, (Cs-Cyjcicloalquila, (C4Cio)heterocicloalquila; por exemplo, é possível usar Npiridilditiopropionato (SPDP) ou piridilditiobutirato de N-sucinimidila (SPDB ou 0 éster de N-hidroxissucinimidila de ácido 4-(2piridilditio)butanoico) para introduzir os grupo reativos de ditiopiridila RCG2 (vide, Bourdon M.A. e outros, Biochem. J. 1978, 173, 723-737; US 5208020) que podem então reagir com um grupo químico reativo RCG1 do tipo -SH presente no ligador do dímero de pirrolo[1,4]benzodiazepina para formar uma nova ligação de -S-S- (vide, Ex.1) para um conjugado transportando uma ligação de dissulfeto. O grupo N-hidroxissucinimida preferivelmente reage nos grupos amino presentes no anticorpo para formar ligações de amida. Outro exemplo de um agente de modificação é descrito em WO 2004/016801 da fór
Figure BR112013001978B1_D0022
por exemplo, é possível usar
N-sucinimidila 4-(5-nitro-2-piridiltio)pentanoato (SNPP), ou um análogo
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 43/136
39/109 pegilado da fórmula
Figure BR112013001978B1_D0023
Figure BR112013001978B1_D0024
Figure BR112013001978B1_D0025
descrita em WO
2009/134976 ou um análogo sulfônico da fórmula
Figure BR112013001978B1_D0026
mulas:
descrita em WO 2009/134977, em cujas fór-
- X3, X4, X5, Xe representa H ou um grupo (Ci-Ce)alquila,
- Xi e X2 representam -H, -CONXsXg, -NO2, Xs e Xg representando H ou um grupo (Ci-Cejalquila,
-X7 representa -SOs'lVT ou H ou alternativamente um grupo amônio quaternário;
- a significa um número inteiro variando de 0 a 4 e b significa um número inteiro variando de 0 a 2000, preferivelmente entre 1 e 200; a e b podem tomar todos os valores entre, respectivamente, 0 e 4 ou entre 0 e 2000.
[0078] Preferivelmente, entre os compsotos da fórmula
Figure BR112013001978B1_D0027
, a=1, X3=Me e X2=NO2 e Xl=X4=X5=X6=X7=H).
Agentes de Modificação para Introdução de Grupos maleimida [0079] Outro agente de modificação pode ser um éster ativado
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 44/136
40/109
Figure BR112013001978B1_D0028
NHS da fórmula na qual R representa um gru po -(CH2)n-, -(CH2)n-cicloexil-, -cicloexil-(CH2)n- e n representa um nú mero inteiro variando de 1 a 10; por exemplo, é possível usar sucini midila-4-(N-maleimidome-til)cicloexano-1-carboxilato (SMCC) (de acordo com EP 0306943), ou um sulfo-SMCC (4-(Nmaleimidometil)cicloexano-1-carboxilato de sulfossucinimidila). Outros exemplos que podem ser mencionados incluem:
Figure BR112013001978B1_D0029
Ncomo 3-maleimidopropanoato de
Figure BR112013001978B1_D0030
Nsucinimidila 6-(3 maleimidopropionamido)hexanoato;
Figure BR112013001978B1_D0031
sendo um número inteiro entre 0 e 2000, preferivelmente entre 1 e 200 (b pode tomar todos os valores entre 0 e 2000), por exemplo Nsucinimidila 3-(2-{2-[3-maleimidopropionilamino]-etóxi}etóxi)propanoato
OU SM(PEG)2;
plo, o
Figure BR112013001978B1_D0032
sucinato de
Figure BR112013001978B1_D0033
N-sucinimidila de , por exemmaleimidoetila,
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 45/136
41/109
Figure BR112013001978B1_D0034
maleimidofenil)butanoato por exemplo, 4-(4de N-sucinimidila ou
O
Figure BR112013001978B1_D0035
por exemplo, 3-maleimidobenzoato de
N-sucinimidila.
Agentes de Modificação para Introdução de Grupos Tiol [0080] Outro exemplo de um agente de modificação descrito em *11
Figure BR112013001978B1_D0036
MHe 4 Hah
WO 90/06774 tem a fórmula na qual:
- Hal representa um átomo de halogênio;
- Χίο representa um átomo de halogênio ou o grupo COOXi4, nitro, (Ci-Cs)alquila mão substituída ou halogenada, (CiCsjalcóxi não substituído ou halogenado, (C2-Cs)alquenila não substituída ou halogenada, (C2-C8)alquinila não substituída ou halogenada, (Cs-Cejcicloalquila não substituída, arila que é não substituída ou substituída com um a três substituintes selecionados de amino, um átomo de halogênio, um grupo (Ci-Cs)alquila não substituído ou halogenado, ou um (Ci-Cs)alc0xi não substituído ou halogenado;
- cada dos grupos Xu, X12, X13 independentemente representa um átomo de hidrogênio ou alternativamente pode representar X10;
[0081] ou X10 e X11 juntos formam um anel de (C2-Cs)alquileno,
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 46/136
42/109 que é não substituído ou substituído com um a cinco grupos (CiC4)alquila;
[0082] ou X10 ou X11 formam, junto com X2, um anel de (C1C5)alqui-leno, que é não substituído ou substituído com um a cinco grupos (C1-C4) alquila; e [0083] X14 é -H ou um grupo (C1-Cs)alquila;
[0084] ou Xi0= Xii= Xi2=Xi3=H [0085] Preferivelmente, Hal representa um átomo de cloro ou bromo. As possibilidades para X10-X13 serão encontradas na Tabela abaixo:
X10 X11 X12 X13 Hal
Me H H H Cl
Ph H H H Cl
t-Bu H H H Cl
Me Me H H Cl
(-CH2(CH2)3CH2-) H H Cl
H (-CH2(CH2)3CH2-) H Cl
Et H H H Br
Et Me H H Cl
-CH-CH2-CH H H H Cl
Me H Me H Cl
H H Me Me Cl
Ph Me H H Cl
4-CIPh H H H Cl
3-furanila H H H Cl
i-Pr H H H Cl
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 47/136
43/109
Me Me Me Me Cl
CeHn H H H Cl
CH2Br H H H Cl
cf3 H H H Cl
ch=ch2 H H H Cl
2-NH2Ph H H H Cl
nh2ci \ 3 [0086] Um exemplo de um iminotiolano é o seguinte '—*
Agentes de Modificação para Introduzir Grupos Haloacetamida [0087] Outro exemplo de um agente de modificação é sucinimidila-
Figure BR112013001978B1_D0037
ο ο
N H
4-(N-iodoacetil)aminobenzoato (SIAB) compostos o
similares, incluindo ou sucinimidila-N-iodoacetato
Figure BR112013001978B1_D0038
(SIA) ° la-3-(N-bromoacetamido)propionato ou um composto pegilado similar descrito em WO , sucinimidila-N-bromoacetato (SBA), ou sucinimidi-
Figure BR112013001978B1_D0039
II H
--A --ο ο [0088] 2009/134976 , b sendo como descrito previamente. Figuras 1 e 2 ilustram a modificação de um grupo amino de um agente de ligação com SPDP ou alternativamente o iminotiolano preferido acima.
[0089] Desse modo, é possível introduzir no agente de ligação grupos dissulfeto RCG2 (-SSR), especialmente do tipo de piridildissulPetição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 48/136
44/109
Figure BR112013001978B1_D0040
Figure BR112013001978B1_D0041
no caso onde RCG1 representa SH. Similarmente, é possível introduzir no agente de ligação grupos tiol (-SH) RCG2, por exemplo, com um iminotiolano, no caso onde
RCG1 representa dissulfeto (isto é, RCG1 = -SZa com Za # H, por
Figure BR112013001978B1_D0042
exemplo Za= ).
É também possível modificar esses grupos tiol (-SH) RCG2 em grupos dissulfeto (-SSR) RCG2, especialmente do tipo de piridildissulfeto
Figure BR112013001978B1_D0043
-S..Xy ou sn por reação com os dissulfetos aromáticos correspondentes
Figure BR112013001978B1_D0044
Figure BR112013001978B1_D0045
ou
Figure BR112013001978B1_D0046
Em ambos os casos a ligação covalente que se forma por reação entre RCG1 e RCG2 é uma ligação de dissulfeto clivável.
[0090] É também possível, no caso onde RCG1 representa -SH, introduzir na superfície do agente de ligação os grupos RCG2 do tipo
Figure BR112013001978B1_D0047
de maleimido ( 0 ) ou haloacetamido (por exemplo bromo- ou io-
Figure BR112013001978B1_D0048
doacetamido ). Neste caso, a ligação covalente que se forma por reação entre RCG1 e RCG2 é uma ligação de sulfeto não clivável.
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 49/136
45/109 [0091] Desse modo, > na presença de um derivado da fórmula (I) compreendendo um grupo químico reativo RCG1 do tipo -SZa, o agente de ligação compreende:
grupos químicos de dissulfeto no caso onde RCG1 representa -SH;
grupos químicos de tiol no caso onde RCG1 representa -SZa com Za# H;
grupos químicos de maleimido ou haloacetamido no caso onde RCG1 representa -SH;
> na presença de um derivado da fórmula (I) compreendendo um grupo químico reativo RCG1 do tipo -C(=O)-ZbRb, o derivado da fórmula (I) é reagido com as funções de amino do agente de ligação, especialmente o grupos ε-amino transportados pelas cadeias laterais dos resíduos de lisina (Lys) de u anticorpo.
[0092] Mais particularmente, [0093] quando o grupo químico reativo RCG1 é do tipo -SH, e quando o agente de ligação transporta as funções de amino, especialmente grupos ε-amino transportado pelas cadeias laterais dos resíduos de lisina de um anticorpo, o último é modificado por meios de um agente de modificação escolhidos de um composto da fórmula:
R. .S—(C s
o na qual R representa um grupo (CiCe)alquila, arila, heteroarila, (C3-C?)cicloalquila, (C4Cw)heterocicloalquila;
Figure BR112013001978B1_D0049
, um análoPetição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 50/136
46/109 go pegilado da fórmula:
Figure BR112013001978B1_D0050
ou urn análogo sulfônico da fórmula
Figure BR112013001978B1_D0051
Xs, Χδ representam Η ou um grupo (Ci-Cejalquila, Xi e X2 representam
-H, -CONXsXg, -NO2, Xs e X9 representando H ou um grupo (C1Cejalquila, X7 representa -SOs’lVT ou H ou alternativamente um grupo amônio quaternário e a significa um número inteiro variando de 0 a 4 e b significa um número inteiro variando de 0 a 2000; ou escolhidos de sucinimidila-4-(N-maleimidometil)cicloexano-1-carboxilato;
Figure BR112013001978B1_D0052
, no qual R representa um grupo -(CH2)n-, -(CH2)n-cicloexil-, -cicloexil-(CH2)n- e n representa um número inteiro variando de 1 a 10;
Figure BR112013001978B1_D0053
sucinimidil-3-(N-bromoacetamido)propionato;
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 51/136
47/109
Figure BR112013001978B1_D0054
ο oíb , b sendo um número inteiro entre 0 e
2000.
[0094] quando o grupo químico reativo RCG1 é do tipo -SZa com Za#H, e quando o agente de ligação transporta funções de amino, especialmente grupos ε-amino grupos transportados pelas cadeias laterais do anticorpo, o ultimo é modificado por meios de um agente de ___^s
NH/ Hal· *11 —
modificação da fórmula 13 descrita previamente.
[0095] quando 0 grupo químico reativo RCG1 é do tipo -SH, e quando 0 agente de ligação contém funções de tiol, especialmente seguinte a introdução de cisteínas por mutação ou por modificação química de um agente de ligação contendo as funções de amino, 0 agente de ligação é modificado tal que suas funções de tiol sejam convertidas em função de dissulfeto possível, por exemplo, para usar um agente de modificação escolhidos de um composto da fórmula NVs's
Figure BR112013001978B1_D0055
na qual Xi e X2 representam -H, -CONXsXg ou -NO2, Xs e X9 representando H ou um grupo (Ci-Ce)alquila.
[0096] Tabela II abaixo ilustra a modificação de um grupo amino de um agente de ligação de acordo com os métodos precedentes. Por uma questão de simplicidade, as seguintes abreviações são usadas:
Tonni = w u
Figure BR112013001978B1_D0056
Figure BR112013001978B1_D0057
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 52/136
Tabela II: Exemplos de modificações de agentes de ligação quando RCG1= SZa
Agente de Modificação Exemplo após a reação em um grupo amino, especialmente lisina, de um anticorpo, notado MAb Conjugado
CL 0 iX RVS- (C.-C^ALK— O O R,S,S (C.C.JALK—k.NH MAb g ,s. ? L- S-(C,^LK^ni_ Tem,. X, Ã ^Tom^ 1 ALK M' ALK WAb .d
SPDP= fX J < S—CHCH— N S 22 ° í O íTX ° X xk .-S-CH2CHa—II N S -‘NH MAb g Γ -s ? Ί L* S-CH,CI-U__U 1 NH· Tom,. X JX ..^Tom^ 1 ALK M ALK1 J MAb J
SPDB= „ Cl íl Ί ° l\ X Xx. X-CH.CKCHt-X^N-^/ N S 2 2 2 O 0 O X -jí-k ,,3—CLLCLLCLlXk N S 2 2 2 ΜΗ MAb g O L7' Τθίϊΐ1 ALK M AL tf Tom‘i MAb d
48/109
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 53/136
Figure BR112013001978B1_D0058
49/109
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Agente de Modificação Exemplo após a reação em um grupo amino, especialmente lisina, de um anticorpo, notado MAb Conjugado
SNPP= K -jJ-x X .Ns/ N S T Ο X 1 0 ΓΟιΝνυ ° 1 II Λ ,s z, λ N S' NHMAb L Jg Ο Ί x.s-s.^ L‘x NH Tom, X .^zTom’, 1 ALK M ALK’ MAb g
XT. Ον Ζ'. Ιο, ,--]s Ζ-’-ν Α X' J r Ζ - ]? - * - MAb X,-y^ q H γ'''·-- ° '-Xo s s^n o L MAb NH, λ Γθ. z-Ί z-x ,S-S. J 4 - ií ' ϊ Tom,, A X -xTom' 1 ALK M ALK' d
*7 ° ν'^° Ζ.,ζ'Χ..-Λ 1 ?°ίΗ γ ϊ 0. ,Λγ bS. Χχ J γ Ha S Ν ο MAb X Λ ζΧ,Ί SO,H f|- NHk X< bS. .¼ Z X Ha S N 0 L -Is MAb· so3h NH. Hr i.,S— S . Ti Ha y* ° xX í| Ί .Tom', Tom... zíZ. z _ 1 ALK M ALK’ J d
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Agente de Modificação Exemplo após a reação em um grupo amino, especialmente lisina, de um anticorpo, notado MAb Conjugado
X1— Hal· xn MAb X’\.xio NH. H á sh 1NH2 XnXi2 - Hal- J g Xi ,xio X. ,S Y S' 'L“ *NH2 xi3X'2 Ax. Ha!· í| η ,Torn'i TomVx A / 1 ALK M ALK' Ί
MAb Xl\ ,x« nh'A' Ax$ s - -NH, ΑΧ* E 1 L Hal· Xí xj g
ν^Λ,' SIAB= Γ A j? MAb-NHk ΛΛγΜ o H g MAb íTX 0 NH. A, A „-Sx Ϊ H A T,™,. Ji Λ Z’'· 1 ALK M ALK' d
V^-hL JL M SIA= ° O MAb'NH--- L Jg MAb O Nh--- ÍÍJ Jom’1 T°m’-AÚ^M^ALK _ d
51/109
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Agente de Modificação Exemplo após a reação em um grupo amino, especialmente lisina, de um anticorpo, notado MAb Conjugado
/ l II H o oTb ^ γ ι ο ο MAb O g MAb O MLjJk --S. NH r- i' L* o ll Ί Tom', Tom, ·. JÍ, / 1 ALK M ALK' d
g: número de funções RCG2 em um agente de ligação modificado; d: número de dímeros de pirrolo[1,4]benzodiazepina no agente de ligação Mab L* representa -Li-N(Q-CH2CH2O)kCH2CH2-G)-L252/109
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53/109 [0097] Os compostos de acordo com a invenção podem, desse modo, ser usados para a preparação de um agente de ligação ao qual é covalentemente preso na posição de Μ o dímero da fórmula:
Figure BR112013001978B1_D0059
[0098] Mais particularmente, o agente de ligação é um anticorpo.
Mais particularmente, o dímero tem a fórmula:
Figure BR112013001978B1_D0060
Figure BR112013001978B1_D0061
Processo para a Preparação dos Compostos da Fórmula (I) [0099] Os compostos da fórmula (I) podem ser preparados de acordo com o Esquema 1 :
W u U' W‘
Figure BR112013001978B1_D0062
Esquema 1 [00100] Os compostos Pi, ΡΪ e P2 são reagidos juntos para produzir
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Ps. LG e LG' significam um grupo de saída. O termo grupo de saída significa um átomo ou um grupo de átomos que, na reação heterolítica entre P2 e P1 ou Pi', sai deixando 0 par de elétrons sozinho da ligação covalente conectando ALK e LG ou LG'. O grupo de saída é mais particularmente escolhido de um átomo de halogênio, especialmente cloro ou bromo, um grupo mesilato, tosilato ou nosilato ou -OPPIV. Os compostos intermediários P2 também formam parte da invenção.
[00101] Na preparação de um composto da fórmula (I) compreendendo 0 grupo RCG1, X' pode representar 0 referido grupo RCG1, em cujo caso P3 representa um composto da fórmula (I). X' pode também ser um precursor do referido grupo RCG1 do tipo -SZa ou alternativamente -C-(=O)ZbRbe neste caso, é necessário converter X' em RCG1 por meio de uma ou mais reações químicas. De acordo com uma variante, a conversão X' RCG 1 pode também ser realizada em P2.
[00102] Desse modo, para a preparação de um composto P3 (ou de acordo com variante P2) para 0 qual Za=H, é preferido introduzir um grupo X'=-SZa para 0 qual Za=-S(Ci-C6)alquila usando 0 precursor do ligador correspondente, e em seguida reduzir a função de dissulfeto SS(Ci-Ce)alquila para uma função de tiol -SH. Para fazer isto, uso pode ser feito, por exemplo, de tris(2-carboxietil)fosfina: veja, a este respeito Burns J.A. e outros, J. Org. Chem. 1991, 56(8), 2648-2650. Esta conversão -SS(Ci-Ce)alquila -SH pode se aplicar especialmente aos compostos 1 a 19 da Tabela I.
[00103] No caso da preparação de um composto da fórmula (I) de P3 de acordo com a conversação X' RCG 1 tal que RCG 1 represen te 0 grupo -SH, um composto P3 também pode ser formado, tal que X' também possa representar 0 grupo -SZa com Za=
Figure BR112013001978B1_D0063
correspondendo a adução de uma função de tiol
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55/109 à função de imina.
[00104] Similarmente, para a produção de um composto da fórmula (I) compreendendo um grupo RCG1 = -C(=O)ZbRb, é possível converter um grupo X'=-C(=O)ZbRb em um grupo RCG1=-C(=O)ZbRb por meio de uma ou mais reações químicas. Em particular, no caso onde -
L K
O-N
C(=O)ZbRb = o é possível introduzir em um composto P3 (ou de acordo com variante P2) 0 grupo X' = -C(=O)O-(Ci-C4)alquila ou C(=O)O-alila, que é em seguida convertido em um grupo -C(=O)OH, que finalmente reage com carbonato de N-N'-dissucinimidila ou NHS. A conversão -COOalquil/alila para -COOH pode ser realizada por tratamento com uma base tal como LiOH ou um catalisador de paládio, por exemplo, tetracis(trifenilfosfina)paládio na presença de um purificador de amina, por exemplo, morfolina. A reação com N,N'dissucinimidila é realizada na presença de uma base, por exemplo, DIPEA; a reação com NHS é realizada na presença de um agente de acoplamento, por exemplo, DCC. Similarmente, no caso onde o
C(=O)ZbRb = , é possível introduzir um grupo -C(=O)ZbRb = COOH, que então reage com Ν,Ν'-carbonildiimidazol (JACS 1958, 80, 4423; JACS 1960, 82, 4596). Esta conversão X' = -C(=O)ZbRb RCG1 = -C(=O)ZbRb pode especialmente se aplicar aos compostos dos Exemplos 20 a 36 da Tabela I.
[00105] Os compostos P1 e P'i são descritos nos pedidos de patente WO 00/12508, WO 00/12507, WO 2005/040170, WO 2005/085260, WO 07085930 ou WO 2009/016516 ou são acessíveis através da sín tese total (Mori M. e outros, Tetrahedron, 1986, 42, 3793-3806). No caso onde P1 e/ou P'i representam tomaimicina da fórmula:
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Figure BR112013001978B1_D0064
o último pode ser preparado com o auxílio da cepa Streptomyces croceus seguindo o ensinamento de FR
1516743 ou alternativamente por síntese total (vide, J. Antibiotics 1983, XXXVI(3), 276-282 Z. Tozuka Studies on tomaymycin. Total syntheses of the antitumor antibiotics E- and Z- tomaymycins). Os compostos comerciais Pi/P'i também existem.
[00106] Para a introdução dos grupos W/W, a função de imina (— = ligação dupla) é capaz de adicionar vários compostos HW/HW (por exemplo, H2O, álcool ROH).
Case onde Q = ligação única
LG
ALK
Figure BR112013001978B1_D0065
^CHXH.-OJk-ClÇCH.-G
Λ
-LG'
ALK* (I)
Esquema 2
Preparação de P2
X* ii. introdução de LG e LG’
HO
ALK M
OH
ALK'
HO
P.
ALK
OH
ALlf
A1K M
LG1
ALK·
Esquema 3
i. reação nucleofílica entre a função de amina secundária -
NH- de P4 e um reagente da fórmula LG-(CH2CH2O)k-CH2CH2-G (LG = grupo de saída) na presença de uma base, por exemplo, K2CO3 em
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57/109 um solvente polar tal como DMF ou THF.
[00107] O reagente LG'XCFhCFhOX-CFhCFh-G é obtido de um composto da fórmula HO-(CH2CH2O)k-CH2CH2-G substituindo-se o grupo -OH com o grupo de saída LG por meios de reações químicas conhecidas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, no caso onde LG representa um grupo mesilato, uso é feito de cloreto de metanossulfonila na presença de uma base tal como uma amina terciária (por exemplo, TEA). No caso onde LG representa I, o mesilato é substituído com I, por exemplo, usando iodeto de sódio, de acordo com D. Marquis e outros J. Org. Chem. 1995, 24, 7984-96.
[00108] Os PEG-álcoois da fórmula HO(CH2CH2O)kCH2CH2OCH3 estão comercialmente disponíveis (vide, por exemplo, 0 catálogo do American company QuantaBioDesign, Ltd.). Outros PEGálcoois HO(CH2CH2O)k-CH2CH2OR com R#Me estão comercialmente disponíveis ou alternativamente estão disponibilizados por HO(CH2CH2O)k-CH2CH2OH por meios de reações químicas conhecidas por aqueles versados na técnica. Similarmente, certos compostos para os quais G=NRR' e k>=1, estão comercialmente disponíveis, por exemplo:
Figure BR112013001978B1_D0066
0^ /'··..
(n-BujgN O ' V
..OH ii. introdução de LG e LG'. No caso de um grupo mesilato, uso é feito de MSC na presença de uma base tal como uma amina terciária (por exemplo, TEA).
Case onde Q= -C(=O)
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LG
ALK p:
Figure BR112013001978B1_D0067
í (CHjCHjOlk-CH/ÍHj-G *Ρ|*ΡΊ LC
ALK1 (I)
Esquema 4
Preparação de P2 (C H j€ H jC H
L LCf-OMCH'CHjOA’CH/Zrt'tG ii. introdução de LG e LG' no Jll
ALK M
OH
HG
ALH
ÜW
ALKL
LG lUK
X·
LG1
ALK'
Esquema 5
i. Reação de amidação entre P4 e um derivado de ácido carboxílico da fórmula T-C(=O)-(CH2CH2O)k-CH2CH2-G.
[00109] O derivado de ácido carboxílico pode ser um haleto de acila (T = -Hal). De acordo com um variante, uso é feito de um éster ativado (por exemplo, T = -ONHS) ou alternativamente 0 ácido carboxílico (T = -OH) na presença de um agente de acoplamento. Os PEG-ácidos da fórmula HOC(=O)-(CH2CH2O)k-CH2CH2OR podem ser preparados a partir dos PEG-álcoois correspondentes da fórmula HO-(CH2CH2O)k-iCH2CH2OR, que estão comercialmente disponibilizados por k= 1 a 11, por adição ao acrilato de sódio, de acordo com J. Huskens, J.A. Peters, H. van Bekkum, Tetrahedron 1993, 15, 3149-64. Este é também caso quando G é 0 grupo NRR' para k>=1 começando com os compostos correspondentes da fórmula H-(OCH2CH2)k-i-CH2CH2NRR'. Similarmente, os compostos HOC(=O)-(CH2CH2)-NRR' (k=0) estão comercialmente disponíveis.
ii. introdução de LG e LG'. No caso de um grupo mesilato, uso é feito de MSC na presença de uma base tal como uma amina terciária (por
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59/109 exemplo, TEA).
Preparação de P4
Caso onde X'= -C(=O)-ZbRb
Li
A
CPO . jí
ÀLK M
Pa
Figure BR112013001978B1_D0068
OH
O
LC, Ã-.
ZbRb
HO pç- o
N Λ
Lj 4 ZbRb
J iv. desproteção
OH
HO.
O
U
ZbRb
OH n, ALK M
Esquema 6
i. introdução do grupo de proteção PG. No caso de um grupo nosilato, uso é feito de cloreto de 2-nitrobenzenossulfonila na presença de uma base tal como uma amina terciária (por exemplo, TEA) ou piridina;
ii. desproteção dos grupos PG e PG'. Por exemplo, na presença de ácido clorídrico ou TFA quando os grupos PG e PG' são TBDMS.
[00110] De acordo com um variante, no caso onde ALK=ALK'=-
Figure BR112013001978B1_D0069
CH2-, P5 pode representar 0 0 . A etapa de desproteção é em seguida substituída com uma etapa de redução da função de éster para um -CH2OH, por exemplo, com boroidreto de sódio; para fazer isto, as condições de reação determinadas nas páginas 62-63 de WO 2007/085930 podem ser aplicadas. Como descrito posteriormente, este variante consistindo no uso de um diéster e em seguida aplicando uma redução pode ser generalizado para 0 outro P5. Além disso, a redução das funções de éster pode ser realizada em um P4, porém, opcionalmente também, de acordo com um variante, em um P5.
iii. Reação nucleofílica entre a função de amina protegida NH(PG) e um reagente da fórmula LG-l_2-C(=O)-ZbRb na presença de uma base, por exemplo, K2CO3 em um solvente polar tal como DMF
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60/109 ou THF.
[00111] Para o caso onde L2=(Ci-Ce)ALK, os ésteres de bromoalquila da fórmula Br-(Ci-C6)ALK-C(=O)-OMe estão comercialmente disponíveis. Para o caso onde l_2=-(CH2CH2O)j-CH2CH2-, LG pode ser introduzido começando com os PEG-álcoois correspondentes da fórmula HO-(CH2CH2O)j-CH2CH2-C(=O)ZbRb. Tais compostos estão comercialmente disponíveis ou alternativamente podem ser obtidos dos PEG-dióis correspondentes da fórmula HO-(CH2CH2O)j-H, que estão comercialmente disponibilizados por j= 1 a 11, por adição ao acrilato de sódio, de acordo com J. Huskens, J.A. Peters, H. van Bekkum, Tetrahedron 1993, 15, 3149-64.
iv. desproteção do grupo PG. Por exemplo na presença de tiofenol e uma base tal como carbonato de césio quando PG é o grupo nosilato.
Case onde X'= -SZa
Caso onde l_2 = (Ci-Ce)ALK
NH.
NH
ÇPQ |l
ALK N
ALK*
HO
ALK M
CH :l- redjçâo
ALK1
HC
ALK M
OH
Esquema 7
i. desproteção dos grupos de proteção PG e PG', preferi- velmente em meio ácido, por exemplo, na presença de ácido clorídrico ou TFA quando os grupos PG e PG' são TBDMS.
[00112] De acordo com um variante, no caso onde ALK=ALK'=CH2-, P5 [00113] pode representar
NHGP
EtO
Figure BR112013001978B1_D0070
OFl . A etapa de desproPetição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 65/136
61/109 teção das funções de álcool é em seguida substituída com uma reação para redução da função de éster para uma função -CH2OH, por exemplo, com boroidreto de sódio, seguido por uma etapa de desproteção da função de amina; para fazer isto, as condições de redução determinadas nas páginas 62-63 de WO 2007/085930 podem ser aplicadas.
ii. aminação redutiva com 0 aldeído da fórmula HC(=O)ALK-SZa;
iii. a amina intermediária é reduzida in situ com um agente de redução, por exemplo, triacetoxiboroidreto de sódio de acordo com
A.F. Abdel-Magid e outros, J. Org. Chem. 1996, 61, 3849- 62, preferivelmente em ácido acético.
Case onde L2= -(CH2CH2O)í-CH2CH2NR-ALKptr
N
Figure BR112013001978B1_D0071
NH-. L,
i. proteção ii. desproteção rt>·· ] mh
Figure BR112013001978B1_D0072
I. LG LOH7CH3a}|CH,CILHh 0H rv. redução hq
Á1.K‘
Figure BR112013001978B1_D0073
OH ALM' “!· redução t
íf'
H0
Figure BR112013001978B1_D0074
Oh vii. alquilação viii. ceaproteção
Figure BR112013001978B1_D0075
ALK M ALK'
Esquema 8
i. introdução do grupo de proteção PG. No caso de um grupo nosilato, uso é feito de cloreto de 2-nitrobenzenossulfonila na presença de uma base tal como uma amina terciária (por exemplo, TEA) ou piridina;
ii. desproteção dos grupos PG e PG'. Por exemplo, na presença de ácido clorídrico ou TFA quando os grupos PG e PG' são TBDMS.
[00114] De acordo com um variante, no caso onde ALK=ALK'=CH2-, P5
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62/109 l-nh2
EtO Ã X ,OE<
Ύ Y [00115] pode representar ο o . A etapa de des proteção é em seguida substituída com uma etapa de redução da função de éster para uma função de -CH2OH, por exemplo, com boroi dreto de sódio; para fazer isto, as condições de redução determinadas nas páginas 62-63 de WO 2007/085930 podem ser aplicadas.
iii. reação nucleofílica entre a função de amina protegida NH(PG) e um reagente da fórmula LG-íChhChhOjjChhChhNS na presença de uma base, por exemplo, K2CO3 em um solvente polar tal co mo DMF ou THF. Tais compostos podem ser obtidos de acordo com WO 07/085930, começando com os PEG-dióis correspondentes da fórmula HO-(CH2CH2O)j+i-H, que estão comercialmente disponibilizados por j= 0 a 10.
iv. redução do grupo azido, por exemplo, através da reação de Staudinger na presença de trifenilfosfina e água.
v. aminação redutiva com 0 aldeído da fórmula HC(=O)ALK-SZa;
vi. a amina intermidária é reduzida in situ com um agente de redução, por exemplo, triacetoxiboroidreto de sódio, de acordo com A.F. Abdel-Magid e outros, J. Org. Chem. 1996, 61, 3849-62, preferivelmente é ácido acético.
vii. alquilação da função de amina secundária.
viii. desproteção do grupo PG. Por exemplo na presença de tiofenol e uma base tal como carbonato de césio quando PG é 0 grupo nosilato.
Preparação de P5
Caso onde Li= -D-(Ci-Ce)ALK-, D = O ou NH
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D-H OfC^jJALK-NHBoc EHC,-C JALK.NH,
--'L^ i.Eir-<G|-QjALK4JHboc I jj. de&proteçao ρ Gp°.v -lí 3, . OGP GPO II _.A OCP GPO J] 1 OGP
ALK Μ M.K· ALK M ' ALK' *LK M ALÍÇ
Esquema 9
i. reação nucleofílica entre a função de -DH e uma bromoamina boc-protegida da fórmula Br(Ci-Ce)ALK-NHboc na presença de uma base, por exemplo K2CO3 em um solvente polar tal como DMF ou THF (vide, por exemplo, as condições na página 63 de WO 07085930).
ii. desproteção seletiva da amina, preferivelmente em meio ácido, por exemplo, na presença de ácido clorídrico ou TFA. Para os casos onde uma desproteção seletiva não pode ser realizada, por exemplo, quando os grupos PG e PG' são TBDMS, uma etapa de pro teção adicional seletiva dos álcoois é necessária.
[00116] De acordo com um variante, no caso onde ALK=ALK'=CH2-, é possível realizar a substituição nucleofílica do bromo-amina
DH
Figure BR112013001978B1_D0076
com um diéster da fórmula: o ° , para obter um com posto P5 da fórmula
EHÍ^-C^ALK-NH,
EtO
Figure BR112013001978B1_D0077
OEt que é usada na forma como obtida, para a preparação de P4.
Caso onde Li = -N((Ci-C4)alquil)-(Ci-Ce)ALK
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HH-(C(-GjALK-NHBoc M-ÍC,-C, |ALK- NHBoc R N^C, JD(}AL K-HHj,
i.R'-Hal -Zx. ii. desproteção J.
ePO I OGP· SFO .-1 OGP GPO ,[i OGP* *LK M ALK ALK M ALK' ALK M ALK*
P,
Esquema 9'
i. reação nucleofílica entre a função -NH- e urn haleto de alquila da fórmula R'-Hal com R' = (Ci-C4)alquila na presença de uma base, por exemplo, K2CO3 em um solvente polar tal como DMF ou THF.
[00117] De acordo com um variante, no caso onde ALK=ALK'=CH2-, é possível realizar a substituição nucleofílica do haleto de alquila HI-HC ,-Cf JALKN HBoc
EtO
Figure BR112013001978B1_D0078
OEt
R* .
N(C,A)ALKNH; com um diéster da fórmula: 0
EtO
Figure BR112013001978B1_D0079
0E1
O composto P5 da fórmula 0 como obtida, para a preparação de P4.
Caso onde L1 = - (OCHhCHh)!
, para obter urn , que é usada na forma
ΦΗ (OCHjChjlh, {OCHjCHJI-NHf , LLG-ÍCH^HjXOCHjCH/k^-N; X «. ledução GP0 - - X -«W* Gpo Í 1 ..OGP- CP° / ük-00”
ALK M ALK' ALK M ALK' ALK M ALK
Esquema 10
i. reação nucleofílica entre uma das funções -OH (as duas outras sendo protegidas com PG que significa um grupo de proteção) e um reagente de azido-PEG da fórmula LG-(CH2CH2)-(OCH2CH2)í-iN3 transportando um grupo nucleofugal (LG) tal como Hal ou mesilato,
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65/109 na presença de uma base, por exemplo, K2CO3 em um solvente polar tal como DMF ou THF (vide, por exemplo, as condições na página 63 de WO 07085930).
ii. redução do grupo azido, por exemplo, com trifenilfosfina na presença de água em um solvente polar tal como THF.
[00118] De acordo com um variante, no caso onde ALK=ALK'=CH2-, é possível realizar a substituição nucleofílica do reagente de aziOH
EtQ „OEt do-PEG com 0 hidróxi-diéster da fórmula:
0 , para
EtO a-ÍCHjCHjli-NH.
OEt obter um composto P5 da fórmula 0 do na forma como obtido, para a preparação de P4.
Caso onde L1 = ligação única do qual é usaHO
ALK
OH ALK
i. proteção
GPO
Esquema 11
i. proteção dos grupos de álcool Ps pode ser obtido do
ΝΗ;
X ^OGP*
ALK M ALK' halo-diol da fórmula
HO.
ALK
HAL
Figure BR112013001978B1_D0080
,,OH aLÍC . Um exemplo de um halo-diol e do diol protegido correspondente é descrito no Esquema 1 na página 48 de WO
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66/109
2009/016516 (compostos 2 e 3 do Esquema 1). Dois exemplos de dióis protegidos são aqueles de CAS N°s. 181225-40-1 e 181225-41-2. O halo-diol pode ser obtido por redução do composto de diéster ou diácido correspondente, por exemplo, aquele de CAS N°. 193010-40-1. Veja também no caso de um piridina (M=N): Liebigs Annalen der Chemie 1991, 10, 987-988 ou Tetrahedron 2005, 67(7), 1755-1763 (Composto 3 do Esquema 1).
[00119] Uma pessoa versada na técnica pode ser inspirada pelas condições operacionais dos exemplos descritos abaixo que são determinados para os ligadores particulares L1 e L2 e pode adapta-las aos outros ligadores L1 e L2.
Processo para a Preparação do Conjugado [00120] O conjugado é obtido através do processo que consiste em:
(i) colocar em contato e deixar reagir uma solução aquosa, opcionalmente tamponada, do agente de ligação, opcionalmente modificada com um agente de modificação, e uma solução de um composto da fórmula (I);
(ii) e em seguida opcionalmente separar os conjugados formados na etapa (i) do composto da fórmula (I) e/ou do agente de ligação não reagido e/ou qualquer agregado que possa ter se formado. [00121] O grupo químico RCG1 do composto da fórmula (I) deve ser reativo para os grupos químicos RCG2 presentes no agente de ligação, especialmente para os grupos amino presentes nos anticorpos, os referidos grupos químicos RCG2 foram introduzidos, onde apropriado, pelo agente de modificação, para prender o composto da fórmula (I) ao agente de ligação através da formação de uma ligação covalente.
[00122] De acordo com um variante, na etapa (ii) o conjugado formado na etapa (i) é separado do agente de ligação não reagido e de qualquer agregado que possa estar presente na solução. De acordo
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67/109 com outro variante, na etapa (ii) o conjugado da etapa (i) é separado somente do composto não reagido da fórmula (I) e dos agregados que podem ter se formados, e qualquer agente de ligação não reagido é deixado na solução.
[00123] A solução aquosa do agente de ligação pode ser tamponada com pelo menos um tampão, por exemplo, fosfato de potássio ou ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico (tampão HEPES). O tampão depende da natureza do agente de ligação. O composto da fórmula (I) é dissolvido em um solvente orgânico polar, por exemplo, DMSO ou DMA.
[00124] A reação ocorre em uma temperatura geralmente dentre 20 e 40°C. O tempo de reação pode variar entre 1 e 24 horas. A reação entre o agente de ligação e o composto da fórmula (I) pode ser monitorada por SEC com um detector refractométrico e/ou ultravioleta, para determinar seu progresso. Se o grau de enxertia for suficiente, a reação poderá se deixada durante um tempo mais longo e/ou o composto da fórmula (I) pode ser adicionado. Referência pode ser feita ao método geral dado na seção de exemplos para detalhes adicionais com respeito às condições particulares que podem ser usadas para a conjugação.
[00125] Uma pessoa versada na técnica tem à sua disposição várias técnicas cromatográficas para a separação da etapa (ii): o conjugado pode ser purificado, por exemplo, por cromatografia de exclusão estérica (SEC), por cromatografia de absorção (tal como, permuta de íon, IEC), por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), por cromatografia por afinidade, por cromatografia em suportes misturados tal como hidroxiapatita de cerâmica, ou por HPLC. A purificação por diálise ou diafiltração também pode ser usada.
[00126] O termo agregados significa associações que podem formar entre dois ou mais agentes de ligação, os agentes de ligação ten
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68/109 do sido possivelmente modificados por conjugação. Os agregados são capazes de ser formado sob a influência de um grande número de parâmetros tal como uma concentração elevada de agente de ligação na solução, o pH, forças de cisalhamento elevadas, o número de dímeros enxertados, e sua natureza hidrofóbica, a temperatura (vide, as referências citadas na introdução de J Membrane Sci. 2008, 318, 31 1316), a influência de alguns deles ocasionalmente não sendo explicada com precisão. No caso de proteínas ou anticorpos, referência pode ser feita ao AAPS Journal, Protein Aggregation and Bioprocessing 2006, 8(3), E572-E579. O teor de agregados pode ser determinado por meios de técnicas conhecidas tais como SEC (vide, neste respeito Analytical Biochemistry 1993, 212(2), 469-480).
[00127] Após a etapa (i) ou (ii), a solução do conjugado pode passar por uma etapa (iii) de ultrafiltração e/ou diafiltração. O conjugado em solução aquosa é, desse modo obtido após essas etapas. Anticorpo [00128] O anticorpo (vide a esse respeito Janeway e outros Immunobiology, 5a edição, 2001, Garland Publishing, Nova Iorque) pode ser escolhido daqueles descritos especialmente nos pedidos de patente WO 04043344, WO 08010101, WO 08047242, WO 05009369 (antiCA6). O anticorpo pode especialmente ser monoclonal, policlonal ou multiespecífico. Pode também ser um fragmento de anticorpo. Pode também ser um anticorpo de murino, humano, humanizado ou quimérico.
Conjugado [00129] Um conjugado geralmente compreende de cerca de 1 a 10 dímeros de pirrolo[1,4]benzodiazepina presos ao agente de ligação (este é o grau de enxertia ou a relação de fármaco para anticorpo (ou DAR)). Este número varia como uma função da natureza do agente de ligação e do dímero, e também das condições de operação usadas
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69/109 para a conjugação (por exemplo, o número de equivalentes de dímero relativo ao agente de ligação, o tempo de reação, a natureza do solvente e de qualquer cossolvente). Colocar o agente de ligação e o dímero em contato leva a uma mistura compreendendo: vários conjugados que são individualmente distinguidos um do outro por diferentes DAR; possivelmente o agente de ligação não reagido (no caso de uma reação incompleta); possivelmente agregados. O DAR, que é determinado na solução final, por exemplo, por espectroscopia de UV, desse modo corresponde a um DAR médio.
[00130] No caso onde o agente de ligação é um anticorpo, a espectroscopia UV pode ser um método usado para determinar o DAR. Este método é inspirado por aquele apresentado em Antony S. Dimitrov (ed), LLC, 2009, Therapeutic Antibodies and Protocols, vol. 525, 445, Springer Science. Consiste em medir a absorvência de uma solução de conjugado após a etapa de separação (ii) em dois comprimentos de onda notados WL1 e WL2. Os seguintes coeficientes de extinção molar do anticorpo nu e do dímero de pirrolo[1,4]benzodiazepina antes da conjugação são usados.
[00131] As absorvências da solução de conjugado em WL1 e WL2 (Awli) e (Awl2) são medidas no pico correspondente do espectro de SEC (que torna possível calcular um DAR(SEC)) ou usando um espectrofotômetro UV padrão (que torna possível calcular um DAR(UV)). As absorvências podem ser expressas na forma:
Awli = (Cd X eD wli) + (Ca X eA wli) Awl2 = (Cd X eD wl2) + (Ca X eA wl2) para as quais as equações:
• Cd e Ca significam, respectivamente, as concentrações na solução da parte do conjugado referindo-se ao dímero de pirrolo[1,4]benzodiazepina e a parte do conjugado referindo-se ao anticorpo;
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70/109 • eD wli e eD wl2 significam, respectivamente, os coeficientes de extinção molar do dímero de pirrolo[1,4]benzodiazepina antes da conjugação no comprimento de ondas WL1 e WL2;
• eA wli e eA wl2 significam, respectivamente, os coeficientes de extinção molar do anticorpo nu nos dois comprimentos de onda WL1 e WL2.
[00132] O termo anticorpo nu significa o anticorpo ao qual nenhum dímero de pirrolo[1,4]benzodiazepina está preso, isto é o anticorpo antes da etapa de conjugação.
[00133] A resolução dessas duas equações leva a:
Cd = [(eA wli x Awl2) - (eAWL2 x AwL1)]/[(eD wl2 x eA wli) - (eAWL2 x Sdwli)] Ca = [Awli - (cd x eD wli)]/6a wli [00134] O DAR médio então corresponde ao CD/CA. No caso dos dímeros de pirrolo[1,4]benzodiazepina, os dois comprimentos de onda considerados são: WL1 = 280 nm e WL2= 320 nm. O DAR médio é preferivelmente entre 1 e 10, e preferivelmente entre 1,5 e 7.
[00135] O conjugado pode ser usado como um agente anticâncer. Em virtude da presença do agente de ligação, o conjugado é feito muito seletivo para células de tumor em vez de células saudáveis. Isto torna possível direcionar o composto da fórmula (I) que tem atividade anticâncer em um ambiente próximo à essas células de tumor ou diretamente nelas (vide, neste respeito as seguintes publicações que descrevem o uso de conjugados de anticorpo monoclonal em tratamento de câncer: Antibody-drug conjugates for cancer therapy Carter P.J. e outros, Cancer J. 2008, 14, 154-169; Targeted cancer therapy: conferring specificity to cytotoxic drugs Chari R., Acc. Chem. Res. 2008, 41, 98-107). É possível tratar cânceres sólidos ou líquidos.
[00136] O conjugado é formulado na forma de uma solução aquosa tamponada em uma concentração geralmente dentre 1 e 10 mg/ml. Esta solução pode se injetada na forma de perfusão como tal, ou pode
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71/109 ser novamente diluída para formar uma solução de perfusão. Exemplos
Método A: Cromatografia líquida de alta pressão - Espectrometria de massa (LMSC) [00137] Os espectros foram adquiridos em uma máquina Águas UPLC-SQD no modo de ionização de eletrovaporização positiva e/ou negativa (ES+/-). Condições cromatográficas: coluna: ACQUITY BEH C18- 1.7 pmi - 2,1x50 mm; solventes: A: H2O (0,1% de ácido fórmico) B: CH3CN (0,1% de ácido fórmico); temperatura da coluna: 50°C; taxa de fluxo: 1 ml/min; gradiente (2 min): de 5 a 50% de B em 0,8 min; 1,2 min: 100% de B; 1,85 min: 100% de B; 1,95: 5% de B.
Método B: Cromatografia líquida de alta pressão - Espectrometria de massa (LMSC) [00138] Os espectros foram adquiridos em uma máquina Águas ZQ no modo de eletrovaporização positiva e/ou negativa (ES+/-) com um detector de 200<WL<400 nm DAD de U.V.. Condições cromatográficas: coluna: Phenomenex Kinetex C18 100A 3x50 mm, diâmetro da partícula
2,6 pm; solventes: A: H2O (0,1% de ácido fórmico) B: CH3CN; temperatura da coluna: 50°C; taxa de fluxo: 1 ml/min; gradiente (6 min): 6% de B durante 0,80 min; de 6 a 100% de B em 3,9 min; 4,80 min: 100% de B; 5 min: 6% de B; 6 min: 6% de B.
Método C: Cromatografia líquida de alta pressão - Espectrometria de massa (LMSC) [00139] Os espectros foram adquiridos em uma máquina Águas ZQ no modo de eletrovaporização positiva e/ou negativa (ES+/-) com um detector de U.V. DAD 200<WL<400 nm. Condições cromatográficas: coluna: coluna de Phenomenex Kinetex C18 3x100 mm, diâmetro da partícula 2,6 pm; solventes: A: H2O (0,1% de ácido fórmico) B: CH3CN; temperatura da coluna: 50°C; taxa de fluxo: 0,8 ml/min; gradiente (8,2 min): 4% de B durante 0,15 min; de 6 a 100% de B em 6,85 min; 7,1
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72/109 min: 100% de B; 7,4 min: 4% de B; 8,2 min: 4% de B.
Método D: Desglicosilação e espectrometria de massa (HRMS) de um conjugado [00140] Desglicosilação é uma técnica de digestão enzimática usando glicosidase. É realizada começando com 500 μΙ de conjugado + 100 μΙ de tampão de Tris HCI a 50 mM + 10 μΙ de enzima glicanaseF (100 unidades de enzima liofilizada/100 μΙ de água). A mistura é vortexada e mantida durante a noite a 37°C. A amostra desglicosilada está, então, pronta para ser analisada por HRMS. Dependendo do caso, a análise de HRMS da amostra pode também ser realizada sem desglicosilação anterior. Em ambos os casos, os espectros de massa foram obtidos em uma máquina Águas Xevo Q-Tof no modo de eletrovaporização positiva (ES+). Condições cromatográficas: coluna de Acquity UPLC Águas BEH 300 C4 2,1x150 mm, diâmetro da partícula
1,7 μm; solventes: A: H2O + 0,1% de ácido fórmico: B: CH3CN + 0,1% de ácido fórmico; temperatura da coluna 70°C: taxa de fluxo 0,5 ml/min; gradiente (10 min): 20% de B durante 2 min 50 seg; de 20 a
80% de B em 2 min 5 seg; 8 min 50 seg: 80% de B; 8 min 55 seg: 20% de B; 10 min: 20% de B.
Método E: Cromatografia líquida de alta pressão - Espectrometria de massa (LMSC) [00141] Os espectros foram adquiridos em uma linha Águas UPLCSQD no modo de ionização de eletrovaporização positiva e/ou negativa (ES+/-) com um detector U.V. DAD 210<WL<400 nm. Condições cromatográficas: coluna: ACQUITY UPLC BEH C18- 1,7 μm - 2,1x30 mm; solventes: A: H2O (0,1% de ácido fórmico) B: CH3CN (0,1% de ácido fórmico); temperatura da coluna: 45°C; taxa de fluxo: 0,6 ml/min; gradiente (2 min): de 5 a 50% de B em 1 min; de 50 a 100% de B em 0,3 min; 1,45 min: 100% de B; de 100 a 5% de B em 0,3 min; 2 min: 100% de B.
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Método F: Cromatografia líquida de alta pressão - Espectrometria de massa (LMSC) [00142] Os espectros foram adquiridos em uma linha Águas ZQ no modo de eletrovaporização positiva e/ou negativa (ES+/-) com um detector U.V. DAD 200<WL<400 nm. Condições cromatográficas: coluna: XSelect CSH Águas C18 3x75 mm, diâmetro da partícula 3,5 pm; solventes: A: H2O (0,1% de ácido fórmico) B: CH3CN (0,1% de ácido fórmico); temperatura da coluna: 50°C; taxa de fluxo: 0,8 ml/min; gradiente (6 min): 6% de B durante 0,80 min; de 6 a 100% B em 3,9 min; 4,80 min: 100% de B; 5 min: 6% de B; 6 min: 6% de B.
Método G: Cromatografia líquida de alta pressão - Espectrometria de massa (LMSC) [00143] Os espectros foram adquiridos em uma máquina Águas UPLC-SQD no modo de ionização de eletrovaporização positiva e/ou negativa (ES+/-). Condições cromatográficas: coluna: ACQUITY BEH C18- 1,7 pm - 2,1x50 mm; solventes: A: H2O (0,1% de ácido fórmico) B: CH3CN (0,1% de ácido fórmico); temperatura da coluna: 50°C; taxa de fluxo: 0,8 ml/min; gradiente (2,5 min): de 5 a 100% de B em 1,8 min; 2,40 min: 100% de B; 2,45 min: 100% de B; de 100 a 5% de B 0,05 min.
[00144] O anticorpo hu2H11 (também conhecido como hu53 2H11 na página 15 de WO 2008010101; é um anticorpo compreendendo um Vh tendo a sequência de aminoácido SEQ ID No. 24) ou o anticorpo hu2H11 R35R74 obtido por mutagênese direta de hu53 2H11 (referenciado na página 20 de WO 2011039721; é um anticorpo compreendendo um Vh tendo a sequência de aminoácido SEQ ID N°. 18 e um VI tendo a sequência SEQ No. 16) é usado.
Capítulo 1: Novos Derivados de Tomaimicina
Exemplo 1 :
1.1. 4-{2-[{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi1-eil}-(2-metil-(2-metil-2-mercapto
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74/109 propil)-amino1 -etóxi}-2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11atetraidropirrolo[2,1 c][ 1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridina
Figure BR112013001978B1_D0081
Figure BR112013001978B1_D0082
[00145] A 20 mg de 4-{2-[{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-(2-metil-2metildisulfanil-propil)-amino]-etóxi}-2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7dimetóxi-1,2,3,11 a-tetraidropirrolo[2,1 c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8iloximetil]-piridina dissolvido em 900 pl_ de MeOH e 400 μΙ_ de DMF são adicionados a uma solução de 17,5 mg de cloridrato de tris(2carboxietil)fosfina e 15,8 mg de NaHCOs em 370 μΙ_ de água. A mistura obtida é agitada durante uma hora em temperatura ambiente e em seguida concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em silica (Interchrom Puriflash Silica 15/35U 2G), usando um gradiente de 0 a 10% de MeOH em uma mistura de 9:1 de DCM/acetonitrila. As frações contendo o produto desejado são combinadas e concentradas sob pressão reduzida. 7 mg de 4-{2-[metil-(2metil-2-mercapto-propil)-amino]-etóxi}-2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7dimetóxi-1,2,3,11 a-tetraidro-pirrolo[2,1 c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8iloximetil]-piridina são desse modo obtidos: LC/MS (A): tr= 1,06 min; [M+H]+: m/z 941; [M+H2O+H]+: m/z 959.
12. 4-{2-[{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi1-etil}-(2-metil-2-metildisulfanilpropil)-amino1 -etóxi}-2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11atetraidropirrolo[2,1 c][4.1 ] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil1 -piridina
Figure BR112013001978B1_D0083
[00146] A uma solução de 30 mg de 4-{2-[{2-[2-(2-metóxi-etóxi)Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 79/136
75/109 etóxi]-etil}-(2-metil-2-metildisulfanil-propil)-amino]-etóxi}-2,6-bis(hidroximetil)-piri-dina e 65,5 pL de di-isopropiletilamina em 200 pL de DCM resfriados a -20°C são adicionados 19,4 pL de MSC. Após agitação durante 20 minutos, a mistura é hidrolisada e a fase orgânica é lavada com água e em seguida secada em MgSO4 e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo obtido (36 mg) dissolvido em 400 pL de DMF é adicionado a uma solução de 26 mg de tomaimicina em 425 pL de DMF, junto com 39,6 mg de K2CO3 e 15,8 mg de Kl. A mistura é agitada durante 12 horas a 30°C e em seguida hidrolisada até que a precipitação ocorra. O material insolúvel é removido por filtração em um funil sinterizado, lavado com DCM e as fases orgânicas combinadas são em seguida concentradas sob pressão reduzida e purificadas por cromatografia flash em sílica (Analogix Super Flash SiO2 SF25-8g) usando um gradiente de 0 a 10% de MeOH em DCM. As frações contendo o produto desejado são combinadas e concentradas sob pressão reduzida, absorvidas em uma mistura de 1/1 de dioxano/água e concentradas novamente sob pressão reduzida. 23 mg de 4-{2-[{2-[2(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-(2-metil-2-metildisulfanil-propil)-amino]etóxi}-2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11atetraidropirrolo[2,1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridina são desse modo obtidos. 1H RMN (500 MHz, clorofórmio-d): sinais amplos: 1,20 a 1,78 (m, 12 H); 2,40 (s, 3 H); 2,70 a 3,10 (m, 10 H); 3,34 (m, 4 H); 3,49 a 3,70 (m, 8 H); 3,71 (s, 3 H); 3,91 (m, 2 H); 4,00 (s, 6 H); 4,27 (m, 4 H); 5,27 (m, 4 H); 5,60 (m, 2 H); 6,86 (s, 2 H); 7,00 (m, 2H); 7,56 (s, 2 H); 7,65 (d, J=4,4 Hz, 2 H), LC/MS (A): Tr= 0,81 min; [M+H]+: m/z 987.
1.3. 4-{2-[{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi1-etil}-(2-metil-2-metildisulfanil- propil)-amino1-etóxi}-2,6-bis-(hidróxi metil)-piridina
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Figure BR112013001978B1_D0084
[00147] A uma solução de 100 mg de 4-[2-(2-metil-2metildissulfanil-propilamino)-etóxi]-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina em 2 mL de DMF são adicionados 99 mg de 1-iodo-2-[2-(2-metóxi-etóxi)etóxi]-etano (B. Ben Aroya Bar Nir, J.F. Kadla Carbohydrate Polymers, 2009, 76, 60-67) e 54 mg de K2CO3. Após 12 horas a 60°C, a mistura é suplementada com 40 mg de 1-iodo-2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]etano e um adicional de 55 mg de K2CO3. A mistura obtida é agitada durante um adicional de 24 horas a 80°C. Após a concentração sob pressão reduzida, 0 produto bruto desse modo obtido é dissolvido em uma quantidade mínima de MeOH e aplicado em Mega BE-SCX, 1 GM 6ML (Varian). Após a lavagem da fase com MeOH, 0 produto de interesse é eluído com uma solução a 2N de amônia em MeOH. A fase de MeOH é concentrada sob pressão reduzida e em seguida novamente aplicada em Mega BE-SCX, 2GM 12ML (Varian) de acordo com 0 mesmo protocolo. As fases de metanol/NHs são concentradas sob pressão reduzida e 0 resíduo obtido é purificado por cromatografia flash em silica (Merck SuperVarioFIash 10g coluna, Si60 15-40 pm), usando um gradiente de 0 a 10% de MeOH em DCM. As frações contendo 0 produto desejado são combinadas e concentradas sob pressão reduzida. 30 mg de 4-{2-[{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-(2-metil-
2-metildisulfanil-propil)-amino]-etóxi}-2,6-bis-(hidro-ximetil)-piridina são desse modo obtidas. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 1,27 (s, 6 H); 2,40 (s, 3 H); 2,75 (s, 2 H); 2,80 (t, J=5,9 Hz, 2 H); 3,00 (t, J=5,9 Hz, 2 H);
3,23 (s, 3 H); 3,40 (m, 2 H); 3,47 to 3,55 (m, 8 H); 4,12 (t, J=5,9Hz, 2 H); 4,45 (d, J=5,9 Hz, 4 H); 5,30 (t, J=5,9 Hz, 2 H); 6,85 (s, 2 H). LC/MS (A): tr= 0,44 min; [M+H]+: m/z 479; [M-H+HCO2H]-: m/z 523.
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1.4.____________4-[2-(2-metil-2-metildisulfanil-propilamino)-etóxi1-2,6-bis- (hidroximetil)-piridina
Figure BR112013001978B1_D0085
[00148] A uma suspensão de 390 mg de 4-[2-amino-etóxi]-2,6-bis(hidroximetil)-piridina (preparado após a desproteção do grupo boc de 4-(2-terc-butoxicarbonilamino-etóxi)-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina descrito na página 101 de WO 07085930) em 2 mL de THF são adicionados 270 pl de 2-(metilditio)-isobutiraldeído e 730 μΙ_ de isopropóxido de titânio. Após 20 min, um adicional de 270 μΙ de 2-(metilditio)isobutiraldeído e 730 μΙ_ de isopropóxido de titânio são adicionados e a mistura é agitada durante duas horas em temperatura ambiente. A mistura é em seguida suplementada com 6 mL de etanol, agitada durante 20 min em temperatura ambiente e em seguida suplementada com 124 mg de cianoboroidreto de sódio. Após agitação durante 45 minutos, um adicional de 124 mg de cianoboroidreto de sódio são adicionados e após a agitação durante uma hora, a mistura é concentrada sob pressão reduzida, e diluída com EtOAc e água. O precipitado resultante é filtrado, e dissolvido em solução de HCI a 1 M aquosa. A fase aquosa obtida é levada ao pH básico com solução de hidróxido de sódio aquosa a 5M, extraída 3x com DCM e as fases orgânicas combinadas são concentradas sob pressão reduzida. 322 mg de 4-[2(2-metil-2-metildisulfanil-propilamino)-etóxi]-2,6-bis-(hidroximetil)piridina são obtidos. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 1,26 (s, 6 H); 1,81 (amplo m, 1 H); 2,39 (s, 3 H); 2,67 (amplo s, 2 H); 2,94 (amplo t, J=5,7 Hz, 2 H); 4,11 (t, J=5,7 Hz, 2 H); 4,45 (d, J=5,5 Hz, 4 H); 5,32 (t, J=5,5 Hz, 2 H); 6,85 (s, 2 H). LC/MS (A): tr= 0,24 min; [M+H]+: m/z 347. Exemplo 2
2.1. Ácido 4-([2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a
Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 82/136
78/109 tetraidro-pirrolo[2,1 ][ 1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil1 -piridin-4ilóxi)-etin-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-amino)-butanoico
Figure BR112013001978B1_D0086
[00149] A uma solução de 28 mg de 4-([2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11 a-tetraidro-pirrolo[2,1 c][1,4]benzodiazepin-5ona-8-iloxime-til]-piridin-4-ilóxi)-etil]-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}amino)-butanoato de etila em 527 pl de THF e 61 pl de água são adicionados 32 μΙ de uma solução de hidróxido de lítio aquosa a 1M. A mistura é agitada durante uma hora 30 minutos em temperatura ambiente e um adicional de 5 μΙ de solução de hidróxido de lítio aquosa a 1M são adicionados a isto. Após agitação durante uma hora 30 minutos em temperatura ambiente, a mistura é acidificada a um pH próximo de 3 adicionando-se 800 μΙ de tampão de fosfato de potássio (pH=3) e em seguida extraída 5x com DCM. As fases orgânicas são combinadas, secadas em MgSO4, concentradas sob pressão reduzida e purificadas por cromatografia flash em silica (Analogix Super Flash S1O2 SF10-4g), usando um gradiente de 3 a 20% de MeOH em DCM. As frações contendo 0 produto desejado são combinadas e concentradas sob pressão reduzida. 10,2 mg de ácido 4-([2-(2,6-bis-[(S)-2-et(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11 a-tetraidro-pirrolo[2,1 c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-ilóxi)-etil]-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)etóxi]-etil}-amino)-butanoico, são obtidas. LC/MS (B): tr= 3,08min; [M+H]+: m/z 939.
2.2._____________4-([2-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a- tetraidropirro-lo[2,1 ][ 1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil1 -piridin-4ilóxi)-etin-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi1-etil}-amino)-butanoato de etila
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79/109
Figure BR112013001978B1_D0087
[00150] A uma solução de 50,4 mg de (S)-2-et-(E)-ilideno-8-hidróxi7-metóxi-1,2,3,11 a-tetraidro-pirrolo[2.1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona em 4 ml de DMF são adicionados 77 mg de K2CO3, 30,7 mg de iodeto de potássio e 67 mg de 4-([2-(2,6-bis-metanossulfoniloximetil-piridin-4ilóxi)-etil]-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-amino)-butirato de etila. A mistura é aquecida durante 18 horas a 30°C e em seguida resfriada em temperatura ambiente, filtrada através de uma membrana de 0,45 pm, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em silica (Analogix Super Flash SiO2SF15-12g), usando um gradiente de 0 a 10% de MeOH em DCM. As frações contendo 0 produto desejado são combinadas e concentradas sob pressão reduzida. 51 mg de 4-([2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a-tetraidropirrolo[2,1 c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-ilóxi)-etil]-{2[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi] etil}-amino)-butanoato de etila são obtidos. LC/MS (B): tr= 3,20 min; [M+H]+: m/z 967.
2.3. ([2-(2,6-Bis-metanossulfoniloximetil-piridin-4-ilóxi)-etil]-{2-[2-(2metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-amino)-butirato de etila
Figure BR112013001978B1_D0088
Figure BR112013001978B1_D0089
[00151] A uma solução de 51 mg de 4-([2-(2,6-bis-hidroximetilpiridin-4-ilóxi)-etil]-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-amino)-butanoato de etila em 5 ml de DCM, pré-resfriados a -25°C, são adicionados 110 μΙ de di-isopropiletilamina e 34 μΙ de MSC. A mistura é agitada durante
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80/109 uma hora a -15°C e em seguida lavada com 5 ml de água. A fase aquosa é extraída com 5 ml de DCM. As fases orgânicas são combinadas, secadas em MgSO4 e concentradas sob pressão reduzida. 69 mg de 4-([2-(2,6-bis-metanossulfoniloximetil-piridin-4-ilóxi)-etil]-{2-[2-(2metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-amino)-butirato de etila são obtidos. LC/MS (B): tr= 2,87 min; [M+H]+: m/z 615.
2.4. 4-([2-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etil-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)etóxi1-etil}-amino)-butanoato de etila
Figure BR112013001978B1_D0090
Figure BR112013001978B1_D0091
Figure BR112013001978B1_D0092
[00152] A uma solução de 180 mg de 4-[2-(2,6-bis-hidroximetilpiridin-4-ilóxi)-etilamino]-butanoato de etila em 18 ml de acetonitrila são adicionados 207 mg de 1-iodo-2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etano e 192 pl de di-isopropiletilamina. A mistura é aquecida durante 3 dias a 80°C e em seguida concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em silica (coluna de Merck SuperVarioFIash 15 g, Si60 15-40 pm), usando uma mistura de DCM/MeOH/água (40/5/0,5). As frações contendo o produto desejado são combinadas e concentradas sob pressão reduzida. 51 mg de 4-([2-(2,6-bis-hidroximetil-piridin4-ilóxi)-etil]-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-amino)-butanoato de etila são obtidos. LC/MS (B): tr= 0,70 min; [M+H]+: m/z 459.
2.5. 4-[2-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etilamino]-butanoato de etila
Figure BR112013001978B1_D0093
Figure BR112013001978B1_D0094
Figure BR112013001978B1_D0095
[00153] A uma solução de 390 mg de 4-[[2-(2,6-bis-hidroximetilPetição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 85/136
81/109 piridin-4-ilóxi)-etil]-(2-nitro-benzenossulfonil)-amino]-butanoato de etila em 10 ml de acetonitrila, em argônio, são adicionados 766 mg de carbonato de césio e 160 pl de tiofenol. A mistura é agitada durante 17 horas em temperatura ambiente e em seguida filtrada através de uma sinterização de porosidade 4. A massa é lavada com EtOAc e o filtrado é concentrado sob pressão reduzida e purificado em um cartucho de 12ML Mega BE-SCX, 2GM (Varian), usando lavagem com MeOH e descolamento do produto esperado com uma solução a 2N de amônia em MeOH. As frações contendo o produto desejado são combinadas e concentradas sob pressão reduzida. 183 mg de 4-[2-(2,6-bishidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etilamino]-butanoato de etila são obtidos. LC/MS (B): tr= 0,68 min; [M+H]+: m/z 313.
2.6._______4-[[2-(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etil-(2-nitro-benzeno- sulfoniD-aminol-butanoato de etila
Figure BR112013001978B1_D0096
Figure BR112013001978B1_D0097
[00154] A uma solução de 767 mg de N-[2-(2,6-bis-hidroximetilpiridin-4-ilóxi)-etil]-2-nitro-benzenossulfonamida em 15 ml de DMF, sob argônio, são adicionados 344 μΙ de 3-bromo-butirato de etila e 1,38 g de K2CO3. A mistura é agitada durante cerca de 20 horas a 40°C e em seguida filtrada através de uma sinterização de porosidade 4. A massa é lavada com EtOAc e 0 filtrado é concentrado sob pressão reduzida. O produto bruto é purificado por cromatografia flash em silica (coluna de Merck SuperVarioPrep 90 g, Si60 15-40 pm), usando um gradiente de 0 a 10% de MeOH em DCM. As frações contendo 0 produto desejado são combinadas e concentradas sob pressão reduzida. 395 mg de 4-[[2-(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etil]-(2-nitrobenzenossulfonil)-amino]-butanoato de etila são obtidos. LC/MS (B):
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82/109 tr= 2,72 min; [M+H]+: m/z 498; [M+HCO2H-H]': m/z 542.
2.7.____________________N-[2-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etil]-2-nitro- benzenossulfonamida
Figure BR112013001978B1_D0098
[00155] A uma solução de 1,3 g de 4-[2-(2-nitrobenzenossulfonilamino)-etóxi]-piridina-2,6-dicarboxilato de dietila em 200 mL de etanol são sucessivamente adicionados 315 mg de boroidreto de sódio e 941 mg de CaCb. A mistura é agitada durante uma hora 30 minutos em temperatura ambiente e 50 ml de água são em seguida adicionados a isto. O etanol é removido sob pressão reduzida e 50 ml de água são adicionados ao resíduo obtido; a fase aquosa é extraída 3x com EtOAc. As fases orgânicas são combinadas, lavadas cm solução de NaCI saturada, secadas em MgSO4 e concentradas sob pressão reduzida. 1,06 g de N-[2-(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)etil]-2-nitro-benzenossulfonamida são obtidos. LC/MS (A): tr= 0,57 min; [M+H]+: m/z 384.
2.8._____________4-[2-(2-Nitro-benzenossulfonilamino)-etóxi]piridina-2,6- dicarboxilato de dietila
Figure BR112013001978B1_D0099
<?=S -Q
Figure BR112013001978B1_D0100
[00156] A uma solução de 957 mg de monocloridrato de 4-(2amino-etóxi)-piridina-2,6-dicarboxilato de dietila em 30 ml de DCM e 734 pl de piridina, pré-resfriada a cerca de 5°C, são adicionados 798
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83/109 mg de cloreto de 2-nitrobenzenossulfonila. A mistura é aquecida em temperatura ambiente e agitada durante duas horas. Um adicional de 244 pl de piridina e 665 mg de cloreto de 2-nitrobenzenossulfonila são em seguida adicionados a isto e a agitação é continuada durante 15 horas. A mistura é lavada com 25 ml de água e a fase aquosa é extraída 2x com 25 ml de DCM. As fases orgânicas são combinadas, secadas em MgSO4, concentradas sob pressão reduzida e purificadas por cromatografia flash em silica (coluna de Merck EasyVarioPrep 150 g, Si60 15-40 pm), usando um gradiente de 0 a 10% de EtOAc em DCM. As frações contendo o produto desejado são combinadas e concentradas sob pressão reduzida. 960 mg de 4-[2-(2-nitrobenzenossulfonilamino)-etóxi]-piridina-2,6-dicarboxilato de dietila são obtidos. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 1,35 (t, J=7,2 Hz, 6H); 3,41 (t, J=5,2 Hz, 2 H); 4,22 (t, J=5,2 Hz, 2 H); 4,39 (q, J=7,2 Hz, 4 H); 7,50 (s, 2 H); 7,80 (m, 2 H); 7,92 (m, 1 H); 8,04 (m, 2 H); 8,40 (m, 1 H). LC/MS (C): tr= 3,50 min; [M+H]+: m/z 468.
2.9. Monocloridrato de 4-(2-amino-etóxi)-piridina-2,6-dicarboxilato de dietila
Figure BR112013001978B1_D0101
[00157] A uma solução de 2,64 g de 4-(2-terc-butoxyicarbonilaminoetóxi)-piridina-2,6-dicarboxilato de dietila (descrito na página 101 de WO 07085930) em 27 ml de dioxano são adicionados 20,7 ml de ácido clorídrico a 4N em dioxano. A mistura é agitada durante cerca de 20 horas em temperatura ambiente e em seguida concentrada sob pressão reduzida. O resíduo da evaporação é absorvido em cerca de 70 ml de dioxano, e em seguida concentrado novamente em pressão reduzida. A operação é repetida 3x. A mistura é absorvida em 50 ml de éter de metila de ferc-butila e a suspensão obtida é filtrada através de
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84/109 uma sinterização de porosidade 4. A massa é lavada com éter de metila de terc-butila, e secada em um dessecador em pressão reduzida em temperatura ambiente. 2 g de monocloridrato de 4-(2-amino-etóxi)piridina-2,6-dicarboxilato de dietila são obtidos. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 1,35 (t, J=7,2 Hz, 6H); 3,26 (m, 2H); 4,39 (q, J=7,2 Hz, 4 H); 4,45 (m, 2 H); 7,77 (s, 2 H); 8,16 (amplo m, 3 H). LC/MS (C): tr= 2,39 min; [M+H]+: m/z 283.
Exemplo 3
3.1. Ácido 3-([2-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11atetraidro-pirrolo[2,1 ][1.41 benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil1 -piridin-4ilóxi)-etil-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi1-etil}-amino)-propanoico '·:-ζΛ3 - Q ' Ο-·Ί
ÜH [00158] A uma solução de 30 mg de 3-([2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11 a-tetraidro-pirrolo[2,1 c][1,4]benzodiazepin-5ona-8-iloxime-til]-piridin-4-ilóxi)-etil]-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}amino)-propanoato de metila em 576 pl de THF e 67 pl de água são adicionados 35 μΙ de uma solução de hidróxido de lítio aquosa a 1M. A mistura é agitada durante uma hora 30 minutos em temperatura ambiente e em seguida absorvida em 4 ml de DCM e acidificado a um pH próximo de 3 adicionando-se 1 ml de tampão de fosfato de potássio (pH=3). A mistura é extraída 4x com DCM e as fases orgânicas são combinadas, secadas em MgSO4, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em silica (Analogix Super Flash S1O2 SF10-4g), usando um gradiente de 10 a 20% de MeOH em DCM. As frações contendo 0 produto desejado são combinadas e concentradas em pressão reduzida. 13 mg de ácido 3-([2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11 a-tetraidro-pirrolo[2,1 c][1,4]benzodiazepin-5ona-8-iloximetil]-piridin-4-ilóxi)-etil]-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 89/136
85/109 amino)-propanoico são obtidos. LC/MS (B): tr= 3,07 min; [M+H]+: m/z
925
3.2. 3-([2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11 a-tetraidro- pirrolo-[2,1c] [1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil-piridin-4-il0xi)-etil{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-amino)-propanoato de metila '0 -,. 0. .- 0 --
Figure BR112013001978B1_D0102
[00159] A uma solução de 84 mg de (S)-2-et-(E)-ilideno-8-hidróxi-7metóxi-1,2,3,11 a-tetraidro-pirrolo[2.1 -c][1,4]benzodiazepin-5-ona em 5 ml de DMF são adicionados 128 mg de K2CO3, 51 mg de Kl e 110 mg de 3-([2-(2,6-bis-metanossulfoniloximetil-piridin-4-ilóxi)-etil]-{2-[2-(2metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-amino)-propanoato de metila. A mistura é aquecida durante 18 horas a 30°C e em seguida resfriados em temperatura ambiente, filtrada através de uma membrana de 0,45 pm, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em silica (Analogix Super Flash S1O2 SF15-24g), usando um gradiente de 0 a 10% de MeOH em DCM. As frações contendo 0 produto desejado são combinadas e concentradas sob pressão reduzida. 33 mg de 3([2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11 a-tetraidropirrolo[2,1 c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-ilóxi)-etil]-{2[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-amino)-propanoato de metila são obtidos. LC/MS (B): tr= 3,21 min; [M+H]+: m/z 939
3.3. 3-([2-(2,6-Bis-metanossulfoniloximetil-piridin-4-ilóxi)-etil-{2-[2-(2- metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-amino)-propanoato de metila
Figure BR112013001978B1_D0103
Figure BR112013001978B1_D0104
[00160] A uma solução de 80 mg de 3-([2-(2,6-bis-hidroximetilPetição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 90/136
86/109 piridin-4-ilóxi)-etil]-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-amino)-propanoato de metila em 8 ml de DCM, pré-resfriados a -25°C, são adicionados 183 pl de di-isopropiletilamina e 57 μΙ de cloreto de metanossulfonila. A mistura é agitada durante uma hora a -15°C e em seguida lavada com 5 ml de água. A fase aquosa é extraída com 5 ml de DCM. As fases orgânicas são combinadas, secadas em MgSO4 e concentradas sob pressão reduzida. 110 mg de 3-([2-(2,6-bismetanossulfoniloximetil-piridin-4-ilóxi)-etil]-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]etil}-amino)-propanoato de metila são obtidos. LC/MS (B): tr= 2,67 min; [M+H]+: m/z 587
3.4. 3-([2-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etil-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)etóxi]-etil}-amino)-propanoato de metila
HO [00161] A uma solução de 284 mg de 3-[2-(2,6-bis-hidroximetilpiridin-4-ilóxi)-etilamino]-propanoato de de metila em 28 ml de acetonitrila são adicionados 356 mg de 1-iodo-2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]etano e 330 μΙ de di-isopropiletilamina. A mistura é aquecida a 80°C durante 3 dias e em seguida concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em silica (Analogix Super Flash S1O2 SF25-40g), usando um gradiente de 5 a 10% de MeOH em DCM. As frações contendo 0 produto desejado são combinadas e concentradas sob pressão reduzida. 165 mg de 3-([2-(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4ilóxi)-etil]-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-amino)-propanoato de metila são obtidos. LC/MS (B): tr= 0,44 min; [M+H]+: m/z 431.
3.5. 3-[2-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etilamino1 -propanoato de metila
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HO
Figure BR112013001978B1_D0105
Figure BR112013001978B1_D0106
[00162] A uma solução de 155 mg de 3-[[2-(2,6-bis-hidroximetil piridin-4-ilóxi)-etil]-(2-nitro-benzenossulfonil)-amino]-propanoato de metila em 6 ml de acetonitrila, em argônio, são adicionados 325 mg de carbonato de césio e 67 μΙ de tiofenol. A mistura é agitada durante 4 horas em temperatura ambiente e em seguida filtrada através de uma sinterização de porosidade 4. A massa é lavada com EtOAc e o filtrado é concentrado sob pressão reduzida e purificada em um cartucho Mega BE-SCX, 2GM de 12ML (Varian), usando lavagem com MeOH e descolamento do produto esperado com uma solução a 2N de amônia em MeOH. As frações contendo o produto desejado são combinadas e concentradas sob pressão reduzida. 82 mg de 3-[2-(2,6-bishidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etilamino]-propanoato de metila são obtidos. LC/MS (B): tr= 0,33 min; [M+H]+: m/z 285.
3.6._________________3-[[2-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etil]-(2-nitro- benzenossulfonil)-amino]-propanoato de metila
Figure BR112013001978B1_D0107
Figure BR112013001978B1_D0108
[00163] A uma solução de 670 mg de 3-[2-(2,6-bis-hidroximetilpiridin-4-ilóxi)- etilamino]-propanoato de terc-butila em 20 ml de DCM são adicionados 2 ml de TFA. A mistura é agitada durante 6 horas em temperatura ambiente e em seguida concentrada sob pressão reduzida, absorvida em DCM e concentrada novamente em pressão reduzida. Ao resíduo obtido, dissolvido em 10 ml de MeOH, são adicionaPetição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 92/136
88/109 dos, a 5°C, 7 ml de uma solução a 2M de (trimetilsilil)diazometano em hexano. A mistura é agitada durante uma hora 30 minutos a 5°C e em seguida 200 μΙ de ácido acético são adicionados. A mistura é absorvida em 30 ml de água e 30 ml de EtOAc. A fase aquosa é extraída 2x com 30 ml de EtOAc. As fases orgânicas são combinadas, lavadas com solução de NaCI saturada, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em silica (Analogix Super Flash S1O2 SF15-24g), usando um gradiente de 0 a 10% de MeOH em DCM. As frações contendo 0 produto desejado são combinadas e concentradas sob pressão reduzida. 155 mg de 3-[2-(2,6-bis-hidroximetil-piridin4-ilóxi)-etilamino]-propanoato de metila são obtidos. LC/MS (C): tr= 2,56 min; [M+H]+: m/z 470.
3.7._________________3-[[2-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etil]-(2-nitro- benzenossulfoniD-aminol-propanoato de terc-butila
Figure BR112013001978B1_D0109
[00164] A uma solução de 0,8 g de 4-{2-[(2-terc-butoxicarbonil-etil)(2-nitro-benzenossulfonil)-amino]-etóxi}-piridina-2,6-dicarboxilato de dietila em 80 mL de etanol são sucessivamente adicionados 152 mg de boroidreto de sódio e 447 mg de CaCb. A mistura é agitada em temperatura ambiente e 20 ml de água são então adicionados no final da reação. O etanol é removido em pressão reduzida, 100 ml de água são adicionados ao resíduo obtido e a fase aquosa é extraída 3x com EtOAc. As fases orgânicas são combinadas, lavadas com solução de NaCI saturada, secada em MgSO4 e concentrada sob pressão reduzida. 670 mg de 3-[[2-(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etil]-(2-nitrobenzenossulfonil)-amino]-propanoato de terc-butila são obtidos. LC/MS (C): tr= 3 min; [M+H]+: m/z 512.
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3.8. 4-{2-[(2-Terc-butoxicarbonil-etil)-(2-nitro-benzenossulfonil)-amino]etóxi}-piridina-2,6-dicarboxilato de dietila
Figure BR112013001978B1_D0110
[00165] A uma solução de 10,6 g de 3-[(2-metanossulfoniloxi-etil)(2-nitro- benzenossulfonil)-amino]-propionato de terc-butila em 220 ml de DMF são adicionados 16,2 g de K2CO3 e 5,6 g de 4-hidróxi-piridina2,6-dicarboxilato de dietila. A mistura é aquecida durante 20 horas a 60°C e em seguida concentrada sob pressão reduzida e absorvida em 200 ml de água e 200 ml de EtOAc. A fase aquosa é extraída 2x com EtOAc. As fases orgânicas são combinadas, lavadas com solução de NaCI saturada, secadas em MgSO4, concentradas sob pressão reduzida e purificadas por cromatografia flash em silica (coluna de Merck EasyVarioPrep 600 g, Si60 15-40 pm), usando um gradiente de 0 a 20% de EtOAc em DCM. As frações contendo 0 produto desejado são combinadas e concentradas sob pressão reduzida. 6,56 g de 4-{2-[(2terc-butoxicarbonil-etil)-(2-nitro-benzenossulfonil)-amino]-etóxi}piridina-2,6-dicarboxilato de dietila são obtidos. LC/MS (C): tr= 4,14 min; [M+H]+: m/z 596.
3.9. 3-[(2-Metanossulfoniloxi-etil)-(2-nitro-benzenossulfonil)-amino]propionato de terc-butila
HO [00166] A uma solução de 9,2 g de 3-[(2-hidróxi-etil)-(2-nitrobenzenos-sulfonil)-amino]-propionato de terc-butila em 92 ml de DCM são adicionados 8,1 ml de di-isopropiletilamina. A mistura é resfriada a -5°C e uma solução de 2,34 ml de MSC em 10 ml de DCM é adicio
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90/109 nada em gotas. Após aquecimento em temperatura ambiente, a mistura é agitada durante cerca de duas horas e é em seguida suplementada com 100 ml de água. A fase aquosa é extraída duas vezes com DCM e as fases orgânicas são combinadas, secadas em MgSOy concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em silica (Analogix Super Flash S1O2 SF40-240g), usando um gradiente de 0 a 5% de acetato de etila em DCM. As frações contendo 0 produto desejado são combinadas e concentrada sob pressão reduzida. 10,62 g de 3-[(2-metanossulfoniloxi-etil)-(2-nitro-benzenossulfonil)-amino]propionato de terc-butila são obtidos. LC/MS (C): tr= 3,77 min; [M+Na]+: m/z 475.
3.10.______3-[(2-Hidróxi-etil)-(2-nitro-benzenossulfonil)- aminolpropionato de terc-butila
Figure BR112013001978B1_D0111
Figure BR112013001978B1_D0112
[00167] A uma solução de 8,7 g de N-(2-hidróxi-etil)-2-nitrobenzenossulfonamida (Skerlj, R.T.; Nan, S.; Zhou, Y.; Bridger, G.J. Tetrahedron Lett. 2002 (43) 7569-7571) em 87 ml de DMF, sob argônio, são adicionados 8,8 ml de 3-bromopropionato de terc-butila e 14,6 g de K2CO3. A mistura é agitada durante 15 horas a 40°C e um adicional de 5 ml de 3-bromopropionato de terc-butila são em seguida adicionados. A mistura é aquecida a 4°C durante a noite e em seguida filtrada através de uma sinterização de porosidade 4. A massa é lavada com acetato de etila e 0 filtrado é em seguida concentrado sob pressão reduzida e purificado por cromatografia flash em silica (coluna de Merck EasyVarioPrep 400 g, Si60 15-40 pm), usando um gradiente de 0 a 10% de EtOAc em DCM. As frações contendo 0 produto desejado
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91/109 são combinadas e concentradas sob pressão reduzida. 9,54 g de 3[(2-hidróxi-etil)-(2-nitro-benzenossulfonil)-amino]-propionato de tercbutila são obtidos. LC/MS (C): tr= 3,39 min; [M+Na]+: m/z 397. Exemplo 4
4.1. 4-[2-((2-Metil-2-metildisulfanil-propil)-{2-[2-(2-morfolin-4-il-etóxi)etóxi]-etil}-amino)-etóxi]-2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-
1,2,3,11 a-tetraidro pirrolo[2.1 c][ 1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetillpiridina [00168] Preparados como para o Exemplo 1, começando com 4-[2((2-metil-2-metildisulfanil-propil)-{2-[2-(2-morfol-4-il-etóxi)-etóxi]-etil}amino)-etóxi]-2,6-bis-(hidróxi metil)-piridina:
[00169] 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6): 1,22 (s, 6 H); 1,69 (d, J=7,0 Hz, 6 H); 2,28 a 2,44 (m, 6 H); 2,36 (m, 3 H); 2,71 (s, 2 H); 2,77 (t, J=6,7 Hz, 2 H); 2,88 a 3,08 (m, 6 H); 3,42 a 3,55 (m, 12 H); 3,86 (s, 6 H); 3,88 (m, 2 H); 4,10 (s, 4 H); 4,15 (t, J=5,7 Hz, 2 H); 5,17 (d, J=13,2 Hz, 2 H); 5,23 (d, J=13,2 Hz, 2 H); 5,55 (m, 2 H); 6,93 (s, 2 H); 7,06 (s, 2 H); 7,38 (s, 2 H); 7,76 (d, J=4,4 Hz, 2 H). LC/MS (A): tr= 0,68 min; [M+H]+: m/z 1042; [M+2H]2+: m/z 521,5 (pico base)
4.2. 4-[2-((2-Metil-2-metildisulfanil-propil)-{2-[2-(2-morfolin-4-il-etóxi)etóxi]-etil}-amino)-etóxi]-2,6-bis-(hidroxi metiD-piridina [00170] Preparado como para Exemplo 1, começando com 4-{2-[2(2-iodo-etóxi)-etóxi]-etil}-morfolina e 4-[2-(2-metil-2-metildisulfanilpropilamino)-etóxi]-2,6-bis-(hidroximetil)-piridina:
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92/109 [00171] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 1,26 (s, 6 H); 2,36 (m, 4 H); 2,39 (s, 3 H); 2,43 (t, J=5,9 Hz, 2 H); 2,74 (s, 2 H); 2,79 (t, J=5,9 Hz, 2 H); 3,00 (t, J=5,9 Hz, 2 H); 3,46 to 3,55 (m, 12 H); 4,12 (t, J=5,9 Hz, 2
H); 4,45 (d, J=5,9 Hz, 4 H); 5,30 (t, J=5,9 Hz, 2 H); 6,84 (s, 2 H). LC/MS (E): tr= 0,33 min; [M+H]+: m/z 534
4.3.________4-{2[2-(2-lodo-etóxi)-etóxi]-etil}-morfolina
OH [00172] A uma solução de 1,12 g de 2-[2-(2-morfolin-4-il-etóxi)etóxi]-etanol e 940 μΙ de di-isopropiletilamina em 6 ml de DCM, resfriados a 0°C, são adicionados a uma solução de 440 μΙ de cloreto de metanossulfonila em 3mL de DCM na mesma temperatura. A mistura é agitada durante uma hora a 0°C e em seguida lavada com 8 ml de água. A fase orgânica é secada em MgSÜ4 e concentrada sob pressão reduzida.
[00173] O resíduo obtido é dissolvido em 30 ml de acetona e em seguida suplementado com 1,42 g de iodeto de sódio. Após agitação em refluxo durante 5 horas, o material insolúvel é removido por filtração em um funil de sinterização. O filtrado é concentrado sob pressão reduzida e em seguida absorvido em diclorometano. O material insolúvel é novamente removido por filtração, e o filtrado é concentrado sob pressão reduzida e purificado por cromatografia flash em silica (Analogix Super Flash S1O2 SF25-40g), usando um gradiente de 0 a 5% de MeOH em DCM. As frações contendo 0 produto desejado são combinadas e concentradas sob pressão reduzida. 1,09 g de 4-{2-[2(2-iodo-etóxi)-etóxi]-etil}-morfolina são obtidos.
[00174] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 2,39 (m, 4 H); 2,45 (t, J=5,9 Hz, 2 H); 3,32 (t, J=6,4 Hz, 2 H); 3,47 to 3,60 (m, 10 H); 3,67 (t, J=6,4
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Hz, 2 H), LC/MS (A): tr= 0,29 min; [M+H]+: m/z 330
Exemplo 5
5.1._______________4-([2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a- tetraidropirrolo-[2,1 c][ 1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil-piridin-4-il0xi)etil-(3-{2-[2-(2-metó-xi-etóxi)-etóxi]-etóxi}-propionil)-amino]-butanoato de N-Hidroxisucinimidila
Figure BR112013001978B1_D0113
Figure BR112013001978B1_D0114
[00175] A 65 mg de ácido 4-([2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7 dimetóxi-1,2,3,11 a-tetraidro-pirrolo[2,1 c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8iloximetil]-piridin-4-ilóxi)-etil]-(3-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etóxi}propionil)-amino]-butanoico dissolvido em 3,8 mL de THF são adicionados 67 μΙ de DIPEA e 33 mg de carbonato de N,N'-disucinimidila. Após uma hora em temperatura ambiente, 8 mL de DCM são adicionados e a fase orgânica resultante é lavada duas vezes com água, secada em MgSO4, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em silica (Analogix Super Flash S1O2 SF10-8g), usando um gradiente de 0 a 7,5% de metanol em DCM. 35 mg de 4([2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-i I ideno-7-d imetóxi-1,2,3,11 atetraidropirrolo[2,1 c]-[1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4ilóxi)-etil]-(3-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etóxi}-propionil)-amino]butanoato de N-hidroxissucinimidila são desse modo obtidos.
LC/MS (F): tr= 3,54 min; [M+H]+: m/z 1108; [M+H2O+H]+: m/z 1126; [M+2H2O+H]+: m/z 1144
5.2. Ácido 4-([2-(2,6-Bis-[(S)-2-eth-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a- tetraidro-pirrolo[2,1 c][ 1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4ilóxi)-etil-(3-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etóxi}-propionil)-amino1butanoico [00176] Preparado como para Exemplo 2, começando com metil 4
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94/109 ([2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-iliden ο-7-d imetóxi-1,2,3,11 atetraidropirrolo[2,1 c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4ilóxi)-etil]-(3-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etóxi}-propionil)-amino]butanoato:
[00177] LC/MS (E): tr= 1,05 min; [M+H]+: m/z 1011; [M+H2O+H]+: m/z 1029; [M+2H2O+H]+: m/z 1047
5.3._____________4-([2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a- tetraidropirrolo-[2,1 c][ 1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil-piridin-4ilóxi)-etil-(3-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etóxi}-propionil)-amino]butanoato de metila [00178] Preparado como para Exemplo 2, começando com 4-[[2(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etil]-(3-{2-[2-(2-metoxi-etóxi)-etóxi]etóxi}-propionil)-amino]-butanoato de etila:
- ο V Ύ ο 0 [00179] LC/MS (Ε): tr= 1,14 min; [Μ+Η]+: m/z 1025; [Μ+Η2Ο+Η]+: m/z 1043; [Μ+2Η2Ο+Η]+: m/z 1061
5.4. 4-[[2-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etil]-(3-{2-[2-(2-metóxietóxi)-etóxi]-etóxi}-propionil)-amino]-butanoato de metila [00180] A uma solução de 460 mg de 4-[[2-(2,6-bis-hidroximetilpiridin-4-ilóxi)-etil]-(3-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etóxi}-propionil)amino]-butanoato de terc-butila em 7 ml de DCM são adicionados 1,14 ml de TFA. A mistura é agitada durante 15 horas em temperatura ambiente e em seguida concentrada sob pressão reduzida. Ao resíduo obtido, dissolvido em 3,8 ml de MeOH, são adicionados, a 5°C, 3,1 ml
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95/109 de uma solução a 2M de (trimetilsilil)diazometano em hexano. A mistura é agitada durante uma hora a 5°C e 100 μΙ de ácido acético são em seguida adicionados. Após a concentração sob pressão reduzida, o resíduo obtido é purificado por cromatografia flash em silica (Analogix Super Flash S1O2 SF25-40g), usando um gradiente de 2 a 10% de MeOH em DCM. As frações contendo 0 produto desejado são combinadas e concentradas sob pressão reduzida. 265 mg de 4-[[2-(2,6bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etil]-(3-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etóxi}propionil)-amino]-butanoato de metila são obtidos.
[00181] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 50%-50% de mistura de confôrmeros com: 1,67 a 1,86 (m, 2 H); 2,27 (t, J=7,3 Hz, 1 H); 2,36 (t, J=7,3 Hz, 1 H); 2,57 (t, J=6,7 Hz, 1 H); 2,66 (t, J=6,7 Hz, 1 H); 3,23 (s, 3 H); 3,31 a 3,75 (m, 21 H); 4,14 (t, J=5,6 Hz, 1 H); 4,19 (t, J=5,6 Hz, 1 H); 4,45 (m, 4 H); 5,30 (m, 2 H); 6,84 (s, 1 H); 6,86 (s, 1 H). LC/MS (G): tr= 0,62 min; [M+H]+: m/z 517; [M-H+HCO2H]: m/z 561
5.5. 4-[[2-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etil]-(3-{2-[2-(2-metóxietóxi)-etóxi]-etóxi}-propionil)-amino]-butanoato de terc-butila
HO.
[00182] A uma solução de 560 mg de 3-[2-(2,6-bis-hidroximetilpiridin-4-ilóxi)-etilamino]-butanoato de terc-butila em 4 ml de DMF são adicionados a uma solução de 658 mg de 3-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)etóxi]-etóxi}-propanoato de N-hidroxissucinimidila (cf. M.A. Miller, N.B. Malkar, D. Severynse-Stevens, K.G. Yarbrough, M.J. Bednarcik, R.E. Dugdell, M.E. Puskas, R. Krishnan, K.D. James Bioconjugate Chem., 2006, 77, 267-274) em 4 mL de DMF. A mistura é agitada em temperatura ambiente durante 15 horas e em seguida concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em silica (Analogix Super Flash S1O2 SF40-80g), usando um gradiente de 0 a 10% de uma
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96/109 solução a 10% de solução de amônia em MeOH, em DCM. As frações contendo o produto desejado são combinadas e concentradas sob pressão reduzida. 460 mg de 4-[[2-(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)etil]-(3-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etóxi}-propionil)-amino]-butanoato de terc-butila são obtidos.
[00183] 1H RMN (400 MHz, DMSO-de): 50%-50% de mistura de confôrmeros com: 1,39 (s, 4,5 H); 1,40 (s, 4,5 H); 1,63 a 1,81 (m, 2 H);
2,16 (t, J=7,3 Hz, 1 H); 2,25 (t, J=7,3 Hz, 1 H); 2,57 (t, J=6,7 Hz, 1 H); 2,66 (t, J=6,7 Hz, 1 H); 3,23 (s, 3 H); 3,31 a 3,74 (m, 18 H); 4,14 (t, J=5,7 Hz, 1 H); 4,19 (t, J=5,7 Hz, 1 H); 4,45 (m, 4 H); 5,30 (m, 2 H); 6,84 (s, 1 H); 6,86 (s, 1 H), LC/MS (G): tr= 0,80 min; [M+H]+: m/z 559; [M-H+HCO2H] : m/z 603.
5.6. 3-[2-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etilamino]-butanoato de terc-butila [00184] Preparado como para Exemplo 2, começando com 3bromo-butirato e N-[2-(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etil]-2-nitrobenzenossul-fonamida de terc-butila:
Figure BR112013001978B1_D0115
[00185] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 1,39 (s, 9 H); 1,62 (t, J=7,2 Hz, 2 H); 1,84 (amplo m, 1 H); 2,22 (t, J=7,2 Hz, 2 H); 2,55 (t, J=7,2 Hz, 2 H); 2,86 (t, J=5,7 Hz, 2 H); 4,07 (t, J=5,7 Hz, 2 H); 4,45 (d, J=5,7 Hz, 4 H); 5,29 (t, J=5,7 Hz, 2 H); 6,85 (s, 2 H). LC/MS (A): tr= 0,40 min; [M+H]+: m/z 341; pico base: m/z 156.
Exemplo 6
6.1._____________4-([2-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a- tetraidropirrolo-[2,1 c][ 1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil-piridin-4ilóxi)-etil-(3-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etóxi}-propionil)-amino]
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97/109 butanoato de etila [00186] Preparado como para Exemplo 5, começando com 4-[[2(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etil]-(3-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]etóxi}-propionil)-amino]-butanoato:
Figure BR112013001978B1_D0116
[00187] 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6): 50%-50% de mistura de confôrmeros com: 1,11 a 1,18 (m, 3 H); 1,54 a 1,82 (m, 8 H); 2,24 (d, J=7,3 Hz, 1 H); 2,32 (d, J=7,3 Hz, 1 H); 2,53 a 2,68 (m, 4 H); 2,87 a 3,07 (m, 4 H); 3,20 (s, 1,5 H); 3,21 (s, 1,5 H); 3,31 a 4,27 (m, 32 H);
5,16 (d, J=13,2 Hz, 2 H); 5,22 (d, J=13,2 Hz, 2 H); 5,55 (q, J=7,0 Hz, 2 H); 6,94 (s, 2 H); 7,08 (s, 2 H); 7,37 (s, 2 H); 7,76 (d, J=4,4 Hz, 2 H). LC/MS (A): tr= 0,86 min; [M+H]+: m/z 1039; pico de base: m/z 376.
6.2. 4-[[2-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etil-(3-{2-[2-(2-metóxi etóxi)-etóxi]-etóxi}-propionil)-amino]-butanoato de etila [00188] Preparado como para Exemplo 5, começando com 3-[2(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etilaminoj-butanoato de etila:
Figure BR112013001978B1_D0117
Figure BR112013001978B1_D0118
Figure BR112013001978B1_D0119
[00189] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 50%-50% de mistura de confôrmeros com: 1,16 (t, J=7,1 Hz, 1,5 H); 1,17 (t, J=7,1 Hz, 1,5 H); 1,67 a 1,97 (m, 2 H); 2,25 (t, J=7,3 Hz, 1 H); 2,34 (t, J=7,3 Hz, 1 H); 2,57 (t, J=6,8 Hz, 1 H); 2,66 (t, J=6,8 Hz, 1 H); 3,23 (s, 3 H); 3,32 a 3,74 (m, 18 H); 4,04 (q, J=7,1 Hz, 1 H); 4,05 (q, J=7,1 Hz, 1 H); 4,14 (t, J=5,7 Hz, 1 H); 4,19 (t, J=5,7 Hz, 1 H); 4,45 (m, 4 H); 5,30 (m, 2 H); 6,84 (s, 1 H); 6,86 (s, 1 H). LC/MS (A): tr= 0,47 min; [M+H]+: m/z 531; pico de base: m/z 376; [M-H+HCO2H]: m/z 575
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Exemplo 7
7.1._____________4-([2-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a- tetraidropirrolo-[2,1 c][ 1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil-piridin-4ilóxi)-etil]-(3-{2-[2-(2-morfolin-4-il-etóxi)-etóxi]-etóxi}-propionil)-amino1butanoato de metila [00190] Preparado como para Exemplo 5, começando com 4-[[2(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etil]-(3-{2-[2-(2-morfolin-4-il-etóxi)etóxi]-etóxi}-propionil)-amino]-butanoato:
Figure BR112013001978B1_D0120
[00191] LC/MS (E): tr= 0,88 min; [M+H]+: m/z 1080; [M+H2O+H]+: m/z 1098; [M+2H2O+H]+: m/z 1116
7.2. 4-[[2-(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etil]-(3-{2-[2-(2-morfolin-4il-etóxi)-etóxi]-etóxi}-propionil)-amino]-butanoato de metila [00192] Preparado como para Exemplo 5, começando com 4-[[2(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etil]-(3-{2-oxi]-etóxi-propionil)amino]-butanoato de terc-butila:
Figure BR112013001978B1_D0121
[00193] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 1,83 (m, 2 H); 2,33 (m, 2 H); 2,42 (m, 4 H); 2,48 (t, J=5,8 Hz, 2 H); 2,61 (m, 2 H); 3,40 (m, 2 H); 3,49 a 3,55 (m, 10 H); 3,56 (m, 4 H); 3,62 (s, 3 H); 3,69 (amplo t, J=6,6 Hz, 4 H); 4,21 (t, J=5,6 Hz, 2 H); 4,49 (d, J=5,3 Hz, 4 H); 4,90 (t, J=5,3 Hz, 2 H); 6,87 (s, 2 H), LC/MS (G): tr= 0,50 min; [M+H]+: m/z 572; pico de base: m/z 198; [M-H+HCO2h]·: M/Z 616
7.3. 4-[[2-(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-ilóxi)-etil-(3-{2-[2-(2-morfolin-4il-etóxi)-etóxi]-etóxi}-propionil)-amino]-butanoato de terc-butila
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99/109 [00194] Preparado como para Exemplo 5, começando com 3-{2-[2(2-morfolin-4-il-etóxi)-etóxi]-etóxi}-propanoato de N-hidroxissucinimidila
Figure BR112013001978B1_D0122
Figure BR112013001978B1_D0123
[00195] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 1,42 (s, 9 H); 1,78 (m, 2 H);
2,22 (m, 2 H); 2,42 (m, 4 H); 2,48 (t, J=5,8 Hz, 2 H); 2,61 (m, 2 H); 3,39 (m, 2 H); 3,48 a 3,55 (m, 10 H); 3,56 (m, 4 H); 3,69 (amplo t, J=6,6 Hz, 4 H); 4,21 (t, J=5,6 Hz, 2 H); 4,49 (d, J=5,3 Hz, 4 H); 4,90 (t, J=5,3 Hz, 2 H); 6,87 (s, 2 H). LC/MS (G): tr= 0,65 min; [M+H]+: m/z 614; pico de base: m/z 240
7.4. 3-{2-[2-(2-Morfolin-4-il-etóxi)-etóxi]1-etóxi}-propanoato de N- hidroxissucinimidila
Figure BR112013001978B1_D0124
[00196] A 830mg de ácido 3-{2-[2-(2-morfolin-4-il-etóxi)-etóxi]-etóxi}propanoico dissolvido em 50 mL de THF são adicionados 1,1 g de carbonato de Ν,Ν'-dissucinimidila e 1,5 mL de DIPEA. Após 24 horas em temperatura ambiente, 200 mL de DCM são adicionados e a fase orgânica resultante é concentrada para a metade de seu volume sob pressão reduzida e em seguida lavada duas vezes com água, secada em MgSÜ4 e concentrada sob pressão reduzida. 1,05 g de 3-{2-[2-(2morfolin-4-il-etóxi)-etóxi]-etóxi}-propanoato de N-hidroxissucinimidila são desse modo obtidos.
[00197] 1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 2,39 (m, 4 H); 2,45 (t, J=5,9
Hz, 2 H); 2,81 (s, 4 H); 2,92 (t, J=6,0 Hz, 2 H); 3,45 to 3,57 (m, 14 H); 3,72 (t, J=6,0 Hz, 2 H). LC/MS (G): tr (ELSD) = 0,49 min; [M+H]+: m/z 389.
7.5._______Ácido 3-{2-[2-(2-morfolin-4-il-etóxi)-etóxi]-etóxi}-propanoico
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Figure BR112013001978B1_D0125
ο--°ο..
Figure BR112013001978B1_D0126
O [00198] A uma solução de 1 g de 3-{2-[2-(2-morfolin-4-il-etóxi)etóxi]-etóxi}-propanoato de terc-butila em 50 ml de DCM são adicionados 4 ml de TFA. A mistura é agitada durante 10 horas em temperatura ambiente e em seguida concentrada sob pressão reduzida e purificada em um cartucho de Mega BE-SCX, 25GM 150ML (Varian), usando lavagem com MeOH e descolamento do produto esperado com uma solução a 2N de amônia em MeOH. As frações contendo o produto desejado são combinadas e concentradas sob pressão reduzida. 830 mg de ácido 3-{2-[2-(2-morfolin-4-il-etóxi)-etóxi]-etóxi}-propanoico são obtidos. LC/MS (E): tr (ELSD) = 0,16 min; [M+H]+: m/z 292
7.6. 3-{2-[2-(2-Morfolin-4-il-etóxi)-etóxi1-etóxi}-propanoato de tercbutila
Figure BR112013001978B1_D0127
Figure BR112013001978B1_D0128
[00199] A uma solução de 989 mg de 2-[2-(2-morfolin-4-yl-etóxi)etóxi]-etanol em 2,8 mL de THF anidroso são adicionados 1,04 mg de sódio. Após aquecimento a 40°C durante duas horas 15 minutos, 793 pL de acrilato de ferc-butila são adicionados. Após aquecimento durante um adicional de duas horas a 40°C, a mistura de reação é deixada durante 20 horas em temperatura ambiente e em seguida concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em silica (coluna de Merck SuperVarioPrep 70 g, Si60 15-40 pm), usando um gradiente de 0 a 6% de MeOH em DCM. As frações contendo o produto desejado são combinadas e concentradas sob pressão reduzida. 1 g de 3-{2-[2-(2-Morfolin-4-il-etóxi)-etóxi]-etóxi}-propanoato de tercbutila é obtido. LC/MS (E): tr (ELSD) = 0,59 min; [M+H]+: m/z 348 Avaliação da inibição de proliferação das linhagens de célula MDA
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MB-231, MDA-A1 e HCT116 com os compostos da fórmula (IA) com RCG1 =-SZa (Za=SMe) ou RCG1 = -C(=Q)ZhRh (ZhRh=OMe) [00200] As células MDA-MB-231, MDA-A1 ou HCT116 em sua fase de crescimento exponencial são tripsinizadas e novamente suspensas em seu respectivo meio de cultura (DMEM/F12 Gibco #21331, 10% de FCS Gibco #10500-056, Glutamina a 2 nM Gibco #25030 para as células MDA; DMEM Gibco #11960, 10% de FCS Gibco #10500-056, Glutamina a 2 mM Gibco #25030 para as células HCT116). A suspensão de célula é semeada em placas de cultura de 96 cavidades Cytostar (GE Healthcare Europe, #RPNQ0163) no meio de cultura completo contendo soro a uma densidade de 5000 células/cavidade (MDA-MB231, MDA-A1, HCT116). Após incubação durante 4 horas, sucessivas diluições dos dímeros de tomaimicina são adicionados às cavidades em triplicato para cada concentração. As células são cultivadas durante 3 dias a 37°C sob uma atmosfera de 5% de CO2 na presença dos agentes citotóxicos. No quarto dia, 10 μΙ de uma solução de 14Ctimidina (0,1 μCi/cavidade, Perkin Elmer #NEC56825000) são adicionados a cada cavidade. A incorporação de 14C-timidina é medida 96 horas após o início do experimento com um contador de radioatividade de Microbeta (Perkin Elmer). Os dados são expressos na forma de porcentagens de sobrevivência determinando-se a relação entre a Contagem obtida com as células tratadas com os agentes citotóxicos e aquela obtida com as células das cavidades de controle (tratadas com o meio de cultura sozinho).
Tabela II
Inibição de proliferação (pulso de 14Ctimidina em 96 horas) IC50 (pM)
Estrutura do Composto da Fórmula (IA) HCT116 MDA- MDA- MB231 A1
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Ό $ o 1 1 o 61 128 16270
O ~ -| Ü 18 41 3465
'O'· ··'·· 0 - Ο ·| J, 0 Tl N y if (A VN- O 1 1 o 235 384 17849
y-Zy 48 81 26474
-0^0^0..^0 -.<0 o hCX,··- o 1 1 o 4984 5665 >50000
[00201] Descobriu-se que os compostos de teste, para os quais RCG1 =-SZa, com Za=SMe) ou RCG1= -C(=O)ZbRb, têm poderosa atividade anticâncer; isto sugere que compostos similares caracterizados com outro grupo ZbRb sejam propensos a ter atividade pelo menos idêntica.
Capítulo 2: Novos Conjugados de Tomaimicina
Exemplo 8: Preparação de um conjugado hu2H11 modificado com SPDB com 4-{2-[{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-(2-metil-(2-metil-2mercapto-propil)-amino]-etóxi}-2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi
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1,2,3,11a-tetraidropirrolo[2,1 c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetillpiridina [00202] A 24 mg de hu2H1 1 (anticorpo descrito também por hu53 2H11 na página 15 de WO 2008010101; este é um anticorpo compreendendo um Vh tendo a sequência de aminoácido SED ID N°. 24) em 2,37 ml de um tampão aquoso com uma concentração de fosfato de potássio de 0,05 M, NaCI a 0,05 M e ácido etilenodiaminatetraacético a 2 mM (EDTA) de pH = 6,5, são adicionados 320 pg de SPDB (descrito na página 7 de WO 2010/076474) dissolvido em 62 pL de DMA com agitação magnética. Após 4 horas em temperatura ambiente, o anticorpo modificado é purificado por filtração em gel em Sephadex G25 (coluna de PD-10 GE) pré-equilibrado em tampão aquoso com uma concentração de ácido N-(2-hidroxietil)-piperazina-N'-2etanossulfônico a 0,05 M (HEPES), NaCI a 0,05 M e ácido etilenodiaminatetraacético a 2 mM (EDTA) de pH = 8. Uma alíquota do anticorpo modificado é tratada com ditiotreitol (DTT) para clivar os grupos ditiopiridina. O anticorpo modificado junto com o piridinatiol liberado são ensaiados por espectrofotometria usando os coeficientes de extinção de piridinatiol (e343 nm= 8080 M-1 cm-1), do grupo ditiopiridina (e280 nm= 5100 M-1 cm-1) e hu2H1 1 (e28o nm= 206941 M-11cm-1): uma média de 3,2 grupos ditiopiridina por molécula de anticorpo foi determinada em uma concentração de 7,08 mg/mL.
[00203] A 12 mg do anticorpo modificado acima em 3,2 ml de um tampão aquoso com uma concentração de ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-2-etanossulfônico a 0,05 M (HEPES), NaCI a 0,05 M e ácido etilenodiaminatetraacético a 2 mM (EDTA) de pH = 8 são adicionados 713 pL de DMA e 1,22 mg de 4-{2-[{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]etil}-(2-metil-(2-metil-2-mercapto-propil)-amino]-etóxi}-2,6-bis-[(S)-2-et(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a-tetraidropirrolo[2,1 c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridina dissolvi
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104/109 do em 87 pL de dimetilacetamida (DMA) com agitação magnética. Após 12 horas a 30°C, a mistura é filtrada em MillexR-SV 0,45 μΜ (PVDF Durapore Millipore) e purificada em uma coluna de grau prep Superdex™ 200 (coluna Hiload™ 26/60 GE) pré-equilibrada em um tampão de fosfato de salina contendo 20% de N-metilpirrolidona (NMP). As frações de interesse são combinadas e concentradas em Amicon Ultra-15 (Ultracel 50k Millipore) e em seguida filtradas em Sephadex G-25 (colunas PD10, GE) pré-equilibrada em um tampão aquoso em pH=6,5, com uma concentração de histidina a 10 mM contendo 10% de sacarose e 5% de NMP.
[00204] O conjugado obtido (3,5 mL) é ensaiado por espectrofotometria usando os coeficientes de extinção e320 nm= 7843M-1 cm-1 e e280 nm= 4436 M-1 cm-1 para 4-{2-[{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-(2-metil2-metildissulfanil-propil)-amino]-etóxi}-2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7dimetóxi-1,2,3,11a-tetraidro-pirrolo[2,1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8iloximetil]-piridina e e280 nm= 206941 M-1cm-1 para hu2H11: uma média de 2,9 dímeros de tomaimicina (4-{2-[{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-(2metil-(2-metil-2-mercapto-propil)-amino]-etóxi}-2,6-bis-[(S)-2-et-(E)ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11a-tetraidropirrolo[2,1c][1.4]benzodia-zepin-5ona-8-iloximetil]-piridina) por molécula de anticorpo foi determinado em uma concentração de 1,74 mg/mL.
Exemplo 9: Preparação de um conjugado hu2H11 R35R74 modificado com SNPP com 4-{2-[{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-(2-metil-(2-metil2-mercapto-propil)-amino]-etóxi}-2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7dimetóxi-1,2,3,11a-tetraidropirrolo[2,1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8iloximetill-piridina [00205] A 100 mg de hu2H11 R35R74 (Ref na página 20 de WO 2011039721) em 8,2 ml de um tampão aquoso com uma concentração de fosfato de potássio a 0,05 M, NaCI a 0,05 M e ácido etilenodiaminatetraacético a 2 mM (EDTA) de pH = 6,5 são adicionados 1,3 mg de
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SNPP (descrito na página 36 de WO 2004/016801) dissolvido em 186 pL de DMA com agitação magnética. Após 4 horas em temperatura ambiente, a solução de anticorpo modificado é fracionada em quatro e purificada por filtração em gel em quatro colunas Sephadex G25 (coluna PD-10 GE) pré-equilibradas em um tampão aquoso com uma concentração de ácido N-(2-hidroxietil)-piperazina-N'-2-etanossulfônico a 0,05 M (HEPES), NaCI a 0,05 M e ácido etilenodiaminatetraacético a 2 mM (EDTA) de pH = 8. Após misturar e homogeneizar os quatro filtrados desse modo obtidos, o anticorpo modificado é ensaiado por espectrofotometria usando os coeficientes de extinção de nitropiridinatiol (e280 nm= 3344 M-1 cm-1 e e325 nm= 10964 M-1 cm-1), e hu2H11 R35R74 (e280 nm= 219528 M-1cm-1): uma média de 4,47 grupos ditio-nitropiridina por molécula de anticorpo foi determinada em uma concentração de 6,27 mg/mL.
[00206] A 87 mg de anticorpo modificado acima em 23,24 ml de um tampão aquoso com uma concentração de ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-2-etanossulfônico a 0,05 M (HEPES), NaCI a 0,05 M e ácido etilenodiaminatetraacético a 2 mM (EDTA) de pH = 8 são adicionados 4,38 mL de DMA e 17,73 mg de 4-{2-[{2-[2-(2-metóxi-etóxi)etóxi]-etil}-(2-metil-(2-metil-2-mercapto-propil)-amino]-etóxi}-2,6-bis[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11atetraidropirrolo[2,1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridina dissolvido em 1,43 mL de dimetilacetamida (DMA) com agitação magnética. Após 17 horas a 30°C, a mistura é carregada em SteriflipR 0,45 μΜ (PVDF Durapore Millipore) e purificada por 3 injeções em uma coluna de grau prep Superdex™ 200 (coluna Hiload™ 26/60 GE) préequilibrada em um tampão de fosfato de salina contendo 20% de Nmetilpirrolidona (NMP). As frações de interesse são combinadas e concentradas em Amicon Ultra-15 (Ultracel 50k Millipore) e em seguida filtradas em Sephadex G-25 (coluna de HiPrep 26/10 de dessalini
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106/109 zação, GE) pré-equilibrada em um tampão aquoso de pH = 6,5 com uma concentração de histidina a 10 mM, contendo 10% de sacarose e 5% de NMP.
[00207] O conjugado obtido (28 mL) é ensaiado por espectrofotometria usando o coeficiente de extinção e280 nm= 219528 M-1cm-1 para hu2H11 R35R74: uma média de 3,13 dímeros de tomaimicina (4-{2-[{2[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-(2-metil-(2-metil-2-mercapto-propil)-amino]etóxi}-2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11atetraidropirrolo[2,1 c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridina) por molécula de anticorpo foi determinado em uma concentração de 1,99 mg/mL.
Exemplo 10: Preparação de um conjugado hu2H11 R35R74 modificado com SPDB com 4-{2-[{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-(2-metil-(2metil-2-mercapto-propil)-amino]-etóxi}-2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7dimetóxi-1,2,3,11a-tetraidropirrolo[2,1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8iloximetill-piridina [00208] Preparado como para Exemplo 8, começando com hu2H11 R35R74: uma média de 2,92 dímeros de tomaimicina (4-{2-[{2-[2-(2metóxi-etóxi)-etóxi]-etil}-(2-metil-(2-metil-2-mercapto-propil)-amino]-etóxi}2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11atetraidropirrolo[2,1 c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridina) por molécula de anticorpo foi determinada.
Exemplo 11: Preparação de um conjugado hu2H11 R35R74 com 4-([2(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi-1,2,3,11atetraidropirrolo[2,1 c][ 1.4]benzodiaze-pin-5-ona-8-iloximetil-piridin-4-ilóxi)etil-(3-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etóxi}-propionil)-amino]-butanoato de
N-hidroxissucinimidila [00209] A uma solução de 1,59 mg de hu2H11 R35R74 em 150 pL um tampão aquoso com uma concentração de 0,043 M de fosfato de potássio de pH=6,6 são sucessivamente adicionados 6 pL de uma so
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107/109 lução aquosa a 1 M de HEPES, seguido por 267 pL de um tampão aquoso com uma concentração de ácido N-(2-hidroxietil)-piperazinaN'-2-etanossulfônico a 0,05 M (HEPES), NaCI a 0,05 M e ácido etilenodiaminatetraacético a 2 mM (EDTA) de pH = 8, 100 pL de DMA e em seguida 83 pg de 4-([2-(2,6-bis-[(S)-2-et-(E)-ilideno-7-dimetóxi1,2,3,11a-tetraidropirrolo[2,1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]piridin-4-ilóxi)-etil]-(3-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etóxi-propionil)-amino]butanoato de N-hidroxissucinimidila dissolvido em 5 pl de DMA. Após 4 horas a 30°C, a mistura é filtrada em Sephadex G-25 (colunas NAP-5 GE) pré-equilibrada em tampão aquoso de pH = 6,5 com uma concentração de histidina a 10 mM, contendo 10% de sacarose e 5% de NMP.
[00210] O conjugado obtido (1 mL) é ensaiado por espectrofotometria usando os coeficientes de extinção de 4-[[2-(2,6-bis-hidroximetilpiridin-4-ilóxi)-etil]-(3-{2-[2-(2-metóxi-etóxi)-etóxi]-etóxi}-propionil)amino]-butanoato de etila (e322 nm= 7971 M-1 cm-1 e e 280 nm= 5219 M1 cm-1): uma média de 4,18 dímeros de tomaimicina por molécula de anticorpo foi determinada em uma concentração de 1,14 mg/mL.
Avaliação da inibição da proliferação das linhagens de célula MDAMB-231 com o conjugado citotóxico hu2H11 (ou hu2H11 R35R74, respectivamente) [00211] As células MDA-MB-231 em sua fase de crescimento exponencial são tripsinizadas e novamente suspensas em seu meio de cultura (DMEM/F12 Gibco #21331, 10% de FCS Gibco #10500-056, Glutamina a 2 nM Gibco #25030). A suspensão de célula é semeada em placas de 96 cavidades Cytostar (GE Healthcare Europe, #RPNQ0163) em meio de cultura total contendo soro a uma densidade de 5000 células/cavidade. Após a incubação durante 4 horas, diluições sucessivas dos imunoconjugados de anticorpo-agente citotóxico são adicionados às cavidades em concentrações decrescentes de 10-
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108/109 7 a 10-12 M (em triplicata para cada concentração). As células são cultivadas a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de CO2 na presença dos imunoconjugados de anticorpo-agente citotóxico durante 3 dias. No quarto dia, 10 μΙ de uma solução 14C-timidina (0,1 pCi/cavidade, Perkin Elmer #NEC56825000) são adicionados a cada cavidade. A incorporação de 14C-timidina é medida 96 horas após 0 início do experimento com um contador de radioatividade de Microbeta (Perkin Elmer). Os dados são expressos na forma de uma porcentagem de sobrevivência determinando-se a relação entre as contagens obtidas com as células tratadas com 0 imunoconjugado e aquela obtida com as células das cavidades de controle (tratadas com 0 meio de cultura sozinho). Em certos experimentos indicados com um asterisco (*), 0 anticorpo nu hu2H11 (ou hu2H11 R35R74, respectivamente) foi adicionado às cavidades a uma concentração de 1 μΜ no início do experimento e a inibição de proliferação foi medida como descrito previamente.
Tabela III
Inibição da proliferação pulso de 14Ctimidina em 96 horas IC50(pM)
Estrutura IC50 médio IC50 médio (+ Ab* nu) relação de IC50
..... hi X a Λ .1 ..huZHii s h o 1 1 c 58 760 13
o Λ rXs à ,hu2H11R35R74 C s' ' h G I 1 O 32 502 16
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Inibição da proliferação pulso de 14Ctimidina em 96 horas IC50(pM)
Estrutura IC50 médio IC50 médio (+ Ab* nu) relação de IC50
« W s .-. 1, hu2H11R35R74 f s γ s o 1 1 o 72 3550 49
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Claims (22)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composto, caracterizado pelo fato de que possui a fór- mula (I):
    Figure BR112013001978B1_C0001
    na qual:
    ❖ — representa uma ligação única ou uma ligação dupla, com a condição que — represente uma ligação única, em seguida:
    ❖ U e/ou U', que podem ser idênticos ou diferentes, representam, independentemente um do outro, H;
    ❖ W e/ou W, que podem ser idênticos ou diferentes, representam, independentemente um do outro: OH, -OR, -OCOR, COOR, -OCOOR, -OCONRR', um carbamato cíclico tal que N10 e C11 sejam incluídos em um anel, -NRCONRR', -OCSNHR, um tiocarbamato cíclico tal que N10 e C11 sejam incluídos em um anel, -SH, -SR, SOR, -SOOR, -SO3, -NRSOOR', -NRR', uma amina cíclica tal que N10 e C11 sejam incluídos em um anel, -NROR', -NRCOR', -N3, -CN, Hal, um grupo trialquilfosfônio ou triarilfosfônio;
    se — representa uma ligação dupla, então:
    ❖ U e U' estão ausentes;
    ❖ W e/ou W, que podem ser idênticos ou diferentes, representam, independentemente um do outro, H;
    ❖ R1, R2, Ri', R2', que podem ser idênticos ou diferentes, representam, independentemente um do outro: H, Hal ou um grupo
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  2. 2/18 (Ci-C6)alquila opcionalmente substituído com um ou mais substituintes escolhidos de: Hal, CN, NRR', CF3, OR, um grupo arila ou heteroarila, S(O)qR com q = 0, 1 ou 2;
    ou alternativamente
    Ri e R2 e/ou R1' e R2' juntos formam, respectivamente, uma ligação dupla =CH2 ou =CH-CH3;
    • Y e Y', que podem ser idênticos ou diferentes, representam, independentemente um do outro, H ou -OR;
    • M representa CH ou N;
    • ALK e ALK' significam um grupo (C1-C6)alquileno;
    • R e R' representam, independentemente um do outro, H ou um grupo (C1-C6)alquila ou arila opcionalmente substituído com um ou mais substituintes escolhidos de: Hal, CN, NRR', CF3, OR, um grupo arila ou heteroarila;
    • Li representa:
    o uma ligação única;
    ou o o grupo -(OCH2CH2X preso ao anel de fenila ou piridila através do átomo de oxigênio, i representando um número inteiro variando de 2 a 40;
    ou o o grupo -D-(Ci-C6)ALK- preso ao anel de fenila ou piridila através de D, no qual D representa -O-, -NH- ou -N(C1C4)alquila-;
    • L2 representa:
    o um grupo -(Ci-C6)ALK-;
    ou o o grupo -(CH2CH2O)j-CH2CH2-, j representando um número inteiro variando de 1 a 40, ou o um grupo -(CH2CH2O)j-CH2CH2-NR-(Ci-C6)ALK-, preso
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  3. 3/18 ao átomo de nitrogênio através da unidade -(CH2CH2O)-, j representando um número inteiro variando de 1 a 40, e R representando H ou um grupo (C1-C4)alquila;
    • Q representa uma ligação única ou o grupo C(=0);
    • k representa um número inteiro variando de 0 a 40;
    • G representa um grupo -OR ou -NRR', R e R' sendo como definido previamente ou sendo tais que formem, com o átomo de nitrogênio ao qual eles são presos, um grupo (C4-C1ü)heterocicloalquila que pode compreender no anel outro heteroátomo escolhido de N, O e S e que pode ser opcionalmente substituído com pelo menos um substituinte escolhido de um grupo (C1-C4)alquila, um átomo de halogênio e um grupo hidroxila;
    • RCG1 representa o grupo -SZa ou -C(=O)-ZbRb • Za representa Ac, Ra ou SRa;
    • Ra representa H, ou um grupo (C1-Ce)alquila, (C3C8)ciclo-alquila, arila, heteroarila ou (C4-C1o)heterocicloalquila opcionalmente substituído com um ou mais substituintes escolhidos de: Hal, CN, NRR', CF3, OR, NO2, um grupo arila ou heteroarila;
    • Zb representa uma ligação única, -O- ou -NH- e Rb representando H ou um grupo (C1-Ce)alquila, (C3-C8)cicloalquila, arila, heteroarila ou (C4-C1o)heterocicloalquila ou alternativamente Zb representa uma ligação única e Rb representa Hal;
    com a condição que se L1 representa uma ligação única, então RCG1 representará -SZa,
    2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que U=U' e/ou W=W e/ou R1=R1 e/ou R2=R2' e/ou Y=Y' e/ou os dois grupos ALK e ALK' presos ao núcleo de fenila ou piridila são idênticos.
    3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que possui as fórmulas (IA) ou (IB):
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  4. 4/18
    Figure BR112013001978B1_C0002
    Figure BR112013001978B1_C0003
    4. Composto de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que possui a fórmula (IA)
    Figure BR112013001978B1_C0004
  5. 5. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Y e Y' representam um grupo (Ci-C4)alcóxi.
  6. 6. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que M representa N.
  7. 7. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se Li representa uma ligação única, l_2 representa -(CH2CH2O)í-CH2CH2- ou -(CH2CH2O)j-CH2CH2NR-(Ci-C6)ALK-.
  8. 8. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que G representa um grupo -OH, -O(Ci-Ce)alquila, NH2, -NH(Ci-Ce)alquila ou -N(Ci-Ce)alquil2 ou G representa um grupo
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    5/18
    NRR' no qual R e R' formam, juntos com o átomo de nitrogênio ao qual eles estão presos, um grupo (C4-Cw)heterocicloalquila que pode compreender no anel heteroátomos escolhidos de N, O e S e que podem ser opcionalmente substituídos com pelo menos um substituinte escolhidos de um grupo (C1-C4)alquila, um átomo de halogênio e um grupo hidroxila.
  9. 9. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que:
    • Li = -D-(Ci-C6)ALK- e L2= -(Ci-C6)ALK-; ou • Li= -(OCH2CH2)í- e L2= -(Ci-C6)ALK-; ou • Li= ligação única e L2= -(CH2CH2O)í-CH2CH2NR-(CiC6)ALK-; ou • Li= -D-(Ci-C6)ALK-, e L2= -(CH2CH2O)í-CH2CH2NR(Ci-C6)ALK-; ou • Li= -D-(Ci-C6)ALK- e L2= -(CH2CH2O)í-CH2CH2-.
  10. 10. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que:
    • Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q = ligação única, k=1-10, G=OR, RCG1 =-SZa;
    • Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q=CO, k=110, G=OR, RCG1 =-SZa;
    • Li= -(OCH2CH2)í-, l_2= -(Ci-C6)ALK-, Q = ligação única, k=1-10, G=OR, RCG1 =-SZa;
    • _1= -(OCH2CH2)í-, _2= -(C1-C6)ALK-, Q=CO, k=1-10, G=OR, RCG1 =-SZa;
    • _1= -D-(C1-C6)ALK-, _2= -(C1-C6)ALK-, Q = ligação única, k=1-10, G=NRR', RCG1 =-SZa;
    • _1= -D-(C1-C6)ALK-, _2= -(C1-C6)ALK-, Q=CO, k=1-10, G=NRR', RCG1 =-SZa;
    • _1= ligação única, _2= -(CH2CH2O)í-CH2CH2NR-(C1
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    C6)ALK-, Q = ligação única, k=1-10, G=OR, RCG1 =-SZa;
    • Li= ligação única, L2= -(CH2CH2O)í-CH2CH2NR-(CiC6)ALK-, Q=CO, k=1-10, G=OR, RCG1 =-SZa;
    • Li= ligação única, L2= -(CH2CH2O)í-CH2CH2NR-(CiC6)ALK-, Q = ligação única, k=0-10, G=NRR', RCG1=-SZa;
    • Li = ligação única, L2= -(CH2CH2O)í-CH2CH2NR-(CiC6)ALK-, Q=CO, k=0-10, G=NRR', RCG1 =-SZa;
    • Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(CH2CH2O)í-CH2CH2NR(Ci-C6)ALK-, Q = ligação única, k=0- 10, G=NRR', RCG1=-SZa;
    • Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(CH2CH2O)í-CH2CH2NR(Ci-C6)ALK-, Q=CO, k=0-10, G=NRR', RCG1=-SZa;
    • Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2=-(CH2CH2O)í-CH2CH2NR- (Ci-C6)ALK-, Q = ligação única, k=1- 10, G=OR, RCG1 =-SZa;
    • Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2=-(CH2CH2O)í-CH2CH2NR- (Ci-C6)ALK-, Q=CO, k=1-10, G=OR, RCG1 =-SZa;
    • Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q = ligação única, k=1-10, G=OR, RCG1 = -C(=O)ZbRb;
    • Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q=CO, k=1-10, G=OR, RCG1 = -C(=O)ZbRb;
    • Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q = ligação única, k=1-10, G=NRR', RCG1 = -C(=O)ZbRb;
    • Li= -D-(Ci-C6)ALK-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q=CO, k=110, G=NRR', RCG1 = -C(=O)ZbRb;
    • Li= -(OCH2CH2)í-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q = ligação única, k=1-10, G=OR, RCG1 = -C(=O)ZbRb;
    • Li= -(OCH2CH2)í-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q=CO, k=1-10, G=OR, RCG1 = -C(=O)ZbRb;
    • Li= -(OCH2CH2)í-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q = ligação única, k=1-10, G=NRR', RCG1 = -C(=O)ZbRb;
    • Li= -(OCH2CH2)í-, L2= -(Ci-C6)ALK-, Q=CO, k=1-10,
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    G=NRR', RCG1 = -C(=O)ZbRb;
    • Li= -D-(Ci-C6)ALK-, l_2= -(CH2CH2O)í-CH2CH2-, Q = ligação única, k=1 -10, G=OR, RCG1 = -C(=O)ZbRb;
    • Li= -D-(Ci-C6)ALK-, l_2= -(CH2CH2O)í-CH2CH2-, Q=CO, k=1-10, G=OR, RCG1 = -C(=O)ZbRb;
    • Li= -D-(Ci-C6)ALK-, l_2= -(CH2CH2O)í-CH2CH2-, Q = ligação única, k=0-10, G=NRR', RCG1 = -C(=O)ZbRb;
    • Li= -D-(Ci-C6)ALK-, l_2= -(CH2CH2O)í-CH2CH2-, Q=CO, k=0-10, G=NRR', RCG1 = -C(=O)ZbRb.
  11. 11. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que -COZb Rb representa -COOH, -COO(CiCe)alquila, —COO-N o so3m
    M=H or cation
    --COO—N
    Figure BR112013001978B1_C0005
    O
    -CO— Q— N
    Figure BR112013001978B1_C0006
    ou o —coo grupo
    Figure BR112013001978B1_C0007
    is , no qual IG representa pelo menos um grupo indutivo ou
    Figure BR112013001978B1_C0008
  12. 12. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que -SZa representa -SH ou -SS(Ci-Ce)alquila ou SS-heteroarila.
  13. 13. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é selecionado do grupo consistindo em:
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    8/18
    Figure BR112013001978B1_C0009
    Figure BR112013001978B1_C0010
  14. 14. Processo para preparar um conjugado, caracterizado pelo fato de que compreende um composto de fórmula (I):
    Q-(CH2CH2O)fc-CH2CH2-G jL ^RCG,
    Figure BR112013001978B1_C0011
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    9/18 e um agente de ligação, em que:
    ❖ — representa uma ligação única ou uma ligação dupla, com a condição que — represente uma ligação única, em seguida:
    ❖ U e/ou U', que podem ser idênticos ou diferentes, representam, independentemente um do outro, H;
    ❖ W e/ou W, que podem ser idênticos ou diferentes, representam, independentemente um do outro: OH, -OR, -OCOR, COOR, -OCOOR, -OCONRR', um carbamato cíclico tal que N10 e C11 sejam incluídos em um anel, -NRCONRR', -OCSNHR, um tiocarbamato cíclico tal que N10 e C11 sejam incluídos em um anel, -SH, -SR, SOR, -SOOR, -SO3, -NRSOOR', -NRR', uma amina cíclica tal que N10 e C11 sejam incluídos em um anel, -NROR', -NRCOR', -N3, -CN, Hal, um grupo trialquilfosfônio ou triarilfosfônio;
    se — representa uma ligação dupla, então:
    ❖ U e U' estão ausentes;
    ❖ W e/ou W, que podem ser idênticos ou diferentes, representam, independentemente um do outro, H;
    ❖ R1, R2, Ri', R2', que podem ser idênticos ou diferentes, representam, independentemente um do outro: H, Hal ou um grupo (C1-C6)alquila opcionalmente substituído com um ou mais substituintes escolhidos de: Hal, CN, NRR', CF3, OR, um grupo arila ou heteroarila, S(O)qR com q = 0, 1 ou 2;
    ou alternativamente
    Ri e R2 e/ou R1' e R2' juntos formam, respectivamente, uma ligação dupla =CH2 ou =CH-CH3;
    ❖ Y e Y', que podem ser idênticos ou diferentes, representam, independentemente um do outro, H ou -OR;
    • M representa CH ou N;
    • ALK e ALK' significam um grupo (C1-C6)alquileno;
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    10/18 • R e R' representam, independentemente um do outro, H ou um grupo (Ci-C6)alquila ou arila opcionalmente substituído com um ou mais substituintes escolhidos de: Hal, CN, NRR', CF3, OR, um grupo arila ou heteroarila;
    • L1 representa:
    o uma ligação única;
    ou o o grupo -(OCH2CH2X preso ao anel de fenila ou piridila através do átomo de oxigênio, i representando um número inteiro variando de 2 a 40;
    ou o o grupo -D-(Ci-C6)ALK- preso ao anel de fenila ou piridila através de D, no qual D representa -O-, -NH- ou -N(C1C4)alquila-;
    • L2 representa:
    o um grupo -(Ci-C6)ALK-;
    ou o o grupo -(CH2CH2O)j-CH2CH2-, j representando um número inteiro variando de 1 a 40, ou o um grupo -(CH2CH2O)j-CH2CH2-NR-(Ci-C6)ALK-, preso ao átomo de nitrogênio através da unidade -(CH2CH2O)-, j representando um número inteiro variando de 1 a 40, e R representando H ou um grupo (C1-C4)alquila;
    • Q representa uma ligação única ou o grupo C(=0);
    • k representa um número inteiro variando de 0 a 40;
    • G representa um grupo -OR ou -NRR', R e R' sendo como definido previamente ou sendo tais que formem, com o átomo de nitrogênio ao qual eles são presos, um grupo (C4-Cw)heterocicloalquila que pode compreender no anel outro heteroátomo escolhido de N, O e S e que pode ser opcionalmente substituído com pelo menos um subs-
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    11/18 tituinte escolhido de um grupo (Ci-C4)alquila, um átomo de halogênio e um grupo hidroxila;
    • RCG1 representa o grupo -SZa ou -C(=O)-ZbRb • Za representa Ac, Ra ou SRa;
    • Ra representa H, ou um grupo (C1-C6)alquila, (C3C8)ciclo-alquila, arila, heteroarila ou (C4-Cw)heterocicloalquila opcionalmente substituído com um ou mais substituintes escolhidos de: Hal, CN, NRR', CF3, OR, NO2, um grupo arila ou heteroarila;
    • Zb representa uma ligação única, -O- ou -NH- e Rb representando H ou um grupo (C1-C6)alquila, (C3-C8)cicloalquila, arila, heteroarila ou (C4-Cw)heterocicloalquila ou alternativamente Zb representa uma ligação única e Rb representa Hal;
    com a condição que se L1 representa uma ligação única, então RCG1 representará -SZa, o que consiste em:
    (i) colocar em contato e deixar reagir
    - uma solução aquosa opcionalmente tamponada do agente de ligação, opcionalmente modificada por meio de um agente de modificação e
    - uma solução de um composto da fórmula (I), o grupo químico RCG1 do composto da fórmula (I) sendo reativo para os grupos químicos RCG2 presentes no agente de ligação especialmente para os grupos amino presentes nos anticorpos, os referidos grupos químicos RCG2 tendo sido introduzidos, onde apropriado, pelo agente de modificação,
    Para prender o composto da fórmula (I) ao agente de ligação com a formação de uma ligação covalente;
    (ii) e em seguida opcionalmente separar o conjugado formado na etapa (i) do composto da fórmula (I) e/ou do agente de liga
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    12/18 ção não reagido e/ou de qualquer agregado que possa ter se formado.
  15. 15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que:
    > na presença de um derivado da fórmula (I) compreendendo um grupo químico reativo RCG1 do tipo -SZa, o agente de ligação compreende:
    grupos químicos de dissulfeto no caso onde RCG1 representa -SH;
    grupos químicos de tiol no caso onde RCG1 representa -SZa com Za# H;
    grupos químicos de maleimido ou haloacetamido no caso onde RCG1 representa -SH;
    na presença de um derivado da fórmula (I) compreendendo um grupo químico reativo RCG1 do tipo -C(=O)-ZbRb, o derivado da fórmula (I) é reagido com as funções de amino do agente de ligação, especialmente o grupos ε-amino transportados pelas cadeias laterais dos resíduos de lisina (Lys) de um anticorpo.
  16. 16. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que:
    quando o grupo químico reativo RCG1 é do tipo -SH, e quando o agente de ligação transporta as funções de amino, especialmente grupos ε-amino transportado pelas cadeias laterais dos resíduos de lisina de um anticorpo, o último é modificado por meios de um agente de modificação escolhidos de um composto da fórmula: o.
    o ?—\
    R S— (C^ALK-IÍ^ ,.n .)
    S· O Ti o na qual R representa um grupo (CiCe)alquila, arila, heteroarila, (C3-C?)cicloalquila, (C4Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 126/136
    13/18
    Cw)heterocicloalquila;
    Figure BR112013001978B1_C0012
    , um análogo pegilado da fórmula:
    Figure BR112013001978B1_C0013
    sulfônico da fórmula
    Figure BR112013001978B1_C0014
    Xe representam H ou um grupo (Ci-C6)alquila, Xi e X2 representam -H,
    -CONXsXg, -NO2, Xs e X9 representando H ou um grupo (Ci-C6)alquila, X7 representa -S03’M+ ou H ou alternativamente um grupo amônio quaternário e a significa um número inteiro variando de 0 a 4 e b signi fica um número inteiro variando de 0 a 2000; ou escolhidos de sucinimidila-4-(N-maleimidometil)cicloexano-1-carboxilato;
    Figure BR112013001978B1_C0015
    , no qual R representa um grupo -(CH2)n-, -(CH2)n-cicloexil-, -cicloexil-(CH2)n- e n representa um número inteiro variando de 1 a 10;
    Figure BR112013001978B1_C0016
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    14/18
    Figure BR112013001978B1_C0017
    Figure BR112013001978B1_C0018
    sucinimidil-3-(N-bromoacetamido)propionato;
    Figure BR112013001978B1_C0019
    b sendo um número inteiro entre 0 e
    2000.
    10-s Ha|· quando o grupo químico reativo RCG1 é do tipo -SZa com Za#H, e quando o agente de ligação transporta funções de amino, especialmente grupos ε-amino grupos transportados pelas cadeias laterais do anticorpo, o ultimo é modificado por meios de um agente de x x —A modificação da fórmula 13 na qual
    - Hal representa um átomo de halogênio;
    - Χίο representa um átomo de halogênio ou o grupo COOXi4, nitro, (Ci-Cs)alquila não substituída ou halogenada, (Ci-Cs)alc0xi não substituído ou halogenado, (C2-Cs)alquenila não substituída ou halogenada, (C2-Cs)alquinila não substituída ou halogenada, (C3Csjcicloalquila não substituída, arila que é não substituída ou substituída com um a três substituintes selecionados de amino, um átomo de halogênio, um grupo (Ci-Cs)alquila não substituído ou halogenado, ou um (Ci-Cs)alc0xi não substituído ou halogenado;
    - cada dos grupos Xu, X12, X13 independentemente repre
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    15/18 senta um átomo de hidrogênio ou alternativamente pode representar X10;
    ou X10 e X11 juntos formam um anel de (C2-Cs)alquileno, que é não substituído ou substituído com um a cinco grupos (CiC4)alquila;
    ou X10 ou X11 formam, junto com X2, um anel de (Ci-Cs)alquileno, que é não substituído ou substituído com um a cinco grupos (C1-C4) alquila; e
    X14 é -H ou um grupo (Ci-Cs)alquila;
    OU Xio= Xl 1= Xl2=Xl3=H quando 0 grupo químico reativo RCG1 é do tipo -SH, e quando 0 agente de ligação contém funções de tiol, especialmente seguinte a introdução de cisteínas por mutação ou por modificação química de um agente de ligação contendo as funções de amino, 0 agente de ligação é modificado tal que suas funções de tiol sejam convertidas em grupos funcionais de dissulfeto , por exemplo, para usar um agente de modificação escolhidos de um composto da fórmula
    Figure BR112013001978B1_C0020
    *2 na qual Xi e X2 representam -H, -CONXsXg ou
    -NO2, Xs e Xg representando H ou um grupo (Ci-Ce)alquila.
  17. 17. Conjugado, caracterizado pelo fato de que pode ser ob- tido através do processo como definido na reivindicação 14.
  18. 18. Conjugado, caracterizado pelo fato de que pode ser ob- tido através do processo como definido na reivindicação 14, em que 0 conjugado está em solução.
  19. 19. Processo para preparação de um conjugado, caracteri
    Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 129/136
    16/18 zado pelo fato de que compreende um agente de ligação ao qual está covalentemente preso na posição para de M um dímero da fórmula:
    Figure BR112013001978B1_C0021
    compreendendo colocar em contato e deixar reagir:
    - uma solução aquosa, opcionalmente tamponada, do agente de ligação, opcionalmente modificada com um agente de modificação, e
    - uma solução de um composto da fórmula (I) de modo a unir o composto da fórmula (I) ao agente de ligação por formação de uma ligação covalente, em que ❖ — representa uma ligação única ou ligação dupla, com a condição que se — representa uma ligação única, então:
    ❖ U e/ou U', que podem ser idênticos ou diferentes, representarão, independentemente um do outro, H;
    ❖ W e/ou W, que podem ser idênticos ou diferentes, representarão, independentemente um do outro:
    ❖ OH, -OR, -OCOR, -COOR, -OCOOR, -OCONRR', um carbamato cíclico tal que N10 e C11 sejam incluídos em um anel, NRCONRR', -OCSNHR, um tiocarbamato cíclico tal que N10 e C11 sejam incluídos em um anel, -SH, -SR, -SOR, -SOOR, -SO3; NRSOOR', -NRR', uma amina cíclica tal que N10 e C11 sejam incluídos em um anel, -NROR', -NRCOR', -N3, -CN, Hal, um grupo trialquilfosfônio ou triarilfosfônio;
    se — representa uma ligação dupla, então:
    ❖ U e LT estarão ausentes;
    ❖ W e/ou W, que podem ser idênticos ou diferentes, representarão, independentemente um do outro, H;
    Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 130/136
    17/18 • Ri, R2, R-ι', R2', que podem ser idênticos ou diferentes, representam, independentemente um do outro: H, Hal ou um grupo (Ci-Ce)alquila opcionalmente substituído com um ou mais substitutes escolhidos de: Hal, CN, NRR', CF3, OR, um grupo arila ou heteroarila, S(O)qR com q = 0, 1 ou 2;
    ou alternativamente
    R1 e R2 e/ou R1' e R2' juntos formam, respectivamente, uma ligação dupla =CH2 ou =CH-CH3;
    • Y e Y', que podem ser idênticos ou diferentes, representam, independentemente um do outro, H ou -OR;
    • M representa CH ou N;
    • ALK e ALK' significam um grupo (Ci-Cejalquileno;
    • R e R' representam, independentemente um do outro, H ou um grupo (Ci-Cejalquila ou arila opcionalmente substituído com um ou mais substituintes escolhidos de: Hal, CN, NRR', CF3, OR, um grupo arila ou heteroarila; e • Q representa uma ligação única ou 0 grupo C(=0);
  20. 20. Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que 0 agente de ligação é um anticorpo.
  21. 21. Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que 0 dímero tem a fórmula:
    Figure BR112013001978B1_C0022
    Petição 870190091102, de 13/09/2019, pág. 131/136
    18/18
  22. 22. Uso de compostos como definidos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado por ser para preparar conjugados como definidos na reivindicação 17 ou 18 para tratamento de câncer.
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