BR112012030134B1 - Processo para preparação de um extrato de folhas de vitis vinifera l - Google Patents

Abstract

processo para a produção de um extrato enriquecido de folhas de vitis vinifera l. a presente invenção refere-se a um processo para a produção de um extrato de folhas de vitis vinifera l. , compreendendo os seguintes estágios: a ) fornecimento de uma droga de folhas de vitis vinifera l., b) extração da droga com um eluente selecionado de água e misturas de água com álcool, obtendo um extrato bruto, c) separação do extrato bruto da droga extraída, d) remoção pelo menos parcial do eluente, obtendo um extrato espesso, e) redissolução do extrato espesso em água, f) separação dos componentes insolúveis, g) enriquecimento seletivo de ingredientes secundários da planta por meio de i. uma extração em duas fases ou ii. uma filtração por membranas; o extrato que pode ser obtido deste, preparações farmacêuticas contendo este extrato, bem como eu uso.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a extratos de folhas de Vitis vinifera L., à sua produção e ao uso.

[0002] Pela designação de fraqueza da parede venosa entende- se, de forma coloquial, um quadro clínico, no qual ocorrem retenções de água nos membros inferiores e que se exteriorizam por distúrbios do estado de saúde, tais como pernas pesadas e que se cansam rapidamente. O chamado afogamento de água nas pernas designa uma acumulação edematosa de água no tecido e pressupõe que a água pode passar a partir dos vasos sanguíneos. Portanto, deve-se admitir que a permeabilidade dos vasos esteja excessivamente aumentada.

[0003] A fraqueza da parede venosa pode ser vista como um es tágio precoce da insuficiência venosa crônica (CVI). A CVI, também mencionada como estase venosa crônica ou insuficiência venosa crônica, que se baseia e um distúrbio de microcirculação dos vasos em consequência de uma obstrução de drenagem venosa. O risco de sofrer de uma insuficiência venosa crônica aumenta com a idade, obesidade, de uma anamnese com inflamações das veias, trombose venosa profunda e trauma grave na perna. A frequência de CVI em mulheres é duas vezes maior que em homens.

[0004] O importante para a origem de uma insuficiência venosa crônica é a presença de uma hipertensão patológica das veias superficiais. A pressão arterial normal é de 20 - 30 mmHg, contudo, sobe devido à trombose venosa, válvulas venosas patológicas primárias ou secundárias ou bomba muscular enfraquecida, para 60-90 mmHg. Essa hipertensão provoca as alterações anatômicas, fisiológicas e histológicas dos vasos responsáveis pelas complicações posteriores. Em condições fisiológicas, o leito capilar é protegido contra fortes altera- ções de pressão, visto que as arteríolas pré-capilares podem se contrair por reflexo. Parece que pacientes com pressão venosa cronicamente aumentada, contudo, perderam esse reflexo, isto é, que nas alterações da posição do corpo, as alterações de pressão são diretamente transmitidas para o leito capilar.

[0005] Na pressão venosa permanentemente aumentada, ocorrem alterações, que se referem às paredes capilares. Nessas incluem-se uma dilatação e prolongamento do leito capilar, superfície endotelial aumentada, deposição aumentada de colágeno IV na membrana basal e deposição pericapilar de fibrina. A combinação de pressão venosa aumentada e capilares anormais com permeabilidade aumentada levam a uma lavagem de água, proteínas grandes e eritrócitos para o intestino. A fibrina que se acumula também parece ser dissolvida com menor facilidade. Ao mesmo tempo, ocorre uma troca gasosa reduzida, portanto, uma hipóxia cutânea. Isso leva, entre outros, a uma ativação de leucócitos.

[0006] Um processo semelhante é conhecido da reação de fase aguda de inflamações. Aqui, a permeabilidade das paredes vasculares aumenta através de mediadores vasculares, tais como histamina, prostaglandina (por exemplo, PGE-2), quinina e serotonina, durante poucos minutos. Desencadeadores típicos de uma tal reação de fase aguda são as citocinas, tais como a interleucina-1 (IL-1β), interleucina- 6 (IL-6), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), fator de crescimento tumoral beta (TGF-β) ou interferon-gama, que são liberados, entre outros, por células endoteliais, fibroblastos, macrófagos, granulócitos e linfócitos. Essas células imunocompetentes liberam as citocinas, por exemplo, após o dano ou a morte de células adjacentes. As citocinas entram no fígado através da corrente sanguínea onde, juntamente com cortisol, estimulam o órgão para a produção de aproximadamente 30 diferentes proteínas de fase aguda (APP). As APPs favorecem os pro- cessos de cicatrização de feridas e reagem contra o dano tecidual. Os efeitos da reação de fase aguda são tanto locais, quanto também sistêmicos. Os efeitos locais devem limitar possíveis infecções e eliminar os xenobióticos (por exemplo, corantes, pesticidas e solventes clorados produzidos sinteticamente). Células mortas ou danificadas são afastadas por meio de fagocitose e inicia-se o processo de reparo. Contudo, os efeitos sistêmicos são reações de defesa, que devem assegurar a sobrevivência de todo o organismo, por exemplo, contra en- dotoxinas.

[0007] De acordo com as diretrizes da Sociedade Alemã para Fle- bologia (registro de diretrizes AWMF no 037/009), são usados, entre outros, como farmacoterapêuticos no tratamento da insuficiência venosacrônica, os seguintes agentes: ácido acetilsalicílico, diuréticos, fibrinolíticos (defibrotide, stanazolol, sulodexide), aumentadores de fi- brinólise, iloprost, pentoxifilina, prostaglandina E1, saponinas (extratos de Centella, Hippocastanus, Ruscus), benzaron, dobesilato de cálcio, naftazonas, tribenoside, Ginkgo biloba, bem como inúmeras substâncias, que pertencem ao grande grupo dos flavonoides [Havsteen BH, the biochemistry and medical significance of the flavonoids, Pharmacol Ther 2002;96(2-3):67-202]. Foi possível demonstrar um efeito nitidamente positivo dos flavonoides sobre o desenvolvimento do edema [Martinez MJ, Bonfill X, Moreno RM, Vargas E. Capellà D. Phleboto- nics for venous insufficiency. Cochrane Database of Systematic Reviews 2005, Issue 3. Art. no: CD003229. DOI: 10.1002/14651858. CD003229.pub2.].

[0008] Tem sido demonstrado, que em regiões vinícolas o quadro clínico da fraqueza venosa é significativamente menor. Isso sugere, que na planta Vitis vinifera L. devem estar contidos compostos, que reagem antagonicamente à doença. Tradicionalmente, as folhas da videira foram comidas tanto como legume, como também foram apli- cadas na medicina sob a forma de decocções e infusões em distúrbios menopausais ou para o tratamento de hemorroidas. Na farma- copéia francesa recomenda-se um extrato de folhas de vinho tinto como tônico venoso. Há alguns anos existem no mercado preparações sob o nome Antistax® com extrato aquoso de folhas de vinho tinto, que são usadas eficientemente na insuficiência venosa crônica (CVI) [Kiesewetter H, Koscielny J, Kalus U, Vix JM, Peil H, Petrini O. e colaboradores. Efficacy of orally administered extract of red vine leaf AS 195 (folia vitis viniferae) in chronic venous insufficiency (stages I-II). A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Arznei- mittel-Forschung 2000:59(2): 109-117]. O extrato contido nessa é ca-racterizado por um teor de aproximadamente 5% de flavonoides. Como outro grupo de compostos fenólicos estão contidos aproximadamente 0,1% de antocianinas.

[0009] De acordo com a boa tolerância dos extratos de folhas de videira conhecidos até agora, o objetivo da presente invenção foi disponibilizar um novo extrato, que do mesmo modo, é adequado para o uso em toda a gama de doenças inflamatórias. Efeitos anti- inflamatórios locais eventualmente ao longo de todo o trato gastrointestinal podem ser benéficos no tratamento ou profilaxia de doenças inflamatórias. Gengivite, parodontite, estomatite, esofagite e gastrite descrevem as doenças inflamatórias da parte superior do trato digestivo. Colite linfocitária, colite ulcerosa e Morbus Crohn são os representantes mais conhecidos de doenças inflamatórias da região intestinal.

[00010] Por hemorroidas entende-se, de forma coloquial, a tumefa- ção ou dilatação semelhante à variz ou também em forma de nódulo de uma almofada vascular arteriovenosa, que se localiza entre o reto e o esfíncter anal. Essa almofada vascular é designada também como plexo hemorroidal. Este consiste em um entrelaçado arterial e venoso, que juntamente com o esfíncter, permite o fechamento fino do ânus. Quando se fala de hemorroidas, entendem-se, contudo, na maioria das vezes, sofrimentos com hemorroidas. Sintomas típicos são leves sangramentos, sensação de pressão, prurido, erupção cutânea e no estágio avançado, problemas de eliminação controlada de gases intestinais e fezes. As causas podem ser, entre outras, evaginações de vasossanguíneos próximos do ânus semelhantes às varizes. Uma doença semelhante com a designação trombose perianal (= hemorroidas falsas) ocorre devido à formação de um coágulo de sangue (trombo) nas veias da pele anal e também é denominada como trombose anal. Tromboses perianais ocorrem muitas vezes por ficar sentado por muito tempo, por sentar em superfícies frias, pela pressão forte ou prolongada ao evacuar (por exemplo, no caso de fezes ressecadas), bem como durante a gravidez e o parto. Elas também podem ser provocadas através de forte tosse, esforço corporal, falta de líquido ou por beber muito pouco e mesmo através do espirro. Também aqui, os vasos sanguíneos podem dilatar além da extensão habitual. Tanto no sofrimento hemorroidal, como também na trombose perianal, além das medidas cirúrgicas, é viável a administração de supositórios com substâncias ativas analgésicas ou anti-inflamatórias (diretriz para sofrimento hemorroidal www.uniduesseldorf.de/AWMF/II/081-007 p.htm" e diretriz para trombose anal "www.derma.de/585.0.html").

Estado da Técnica

[00011] Para outras partes da planta de Vitis vinifera L., por exemplo, os caroços de uvas, já são descritos alguns métodos de enriquecimento. Enquanto processos, tais como a extração em micro-ondas (CN 1102589C) providenciam somente baixos fatores de enriquecimento com mais rendimento, as extrações com fluidos supercríticos (CN 1107110C) são adequadas apenas para estruturas lipofílicas. CN 1454896 utiliza uma extração primária ácida em combinação com uma extração líquido-líquida para enriquecer proantocianidinas oligoméri- cas. A EP 348781 descreve um processo de enriquecimento para compostos fenólicos oligoméricos a partir de caroços de uvas por meio de uma filtração por membranas, enquanto a WO 2005036988 e a EP 1909750 reivindicam um processo cromatográfico para o enriquecimento seletivo de polifenóis e uma diminuição de monômeros.

[00012] A GB 934554 descreve uma extração alcoólico-aquosa morna (50-80% de EtOH) de folha de vinho tinto, bem como uma subsequenteacidificação para obter a cor vermelha. Para remover a clorofila e ceras, propõe-se uma extração líquido-líquida por meio de benzeno ou tetracloreto de carbono, alternativamente, uma reprecipitação em água pura. Através de separação por meio de sal, a precipitação do tanino pode ser acelerada. Segue um estágio de purificação através de uma extração líquido-líquida com butanol ou pentanol. Da fase alcoólica do extrato resultante é precipitada uma fração de procianidi- na opcionalmente com éter, petróleo ou benzeno e, em seguida, é cui-dadosamente secada (no vácuo ou em uma torre de atomização). Este processo é muito demorado e dispendioso e o produto resultante tem um desvio muito forte do extrato de referência. Por conseguinte, procura-se um processo de produção alternativo, que permite uma produção menos dispendiosa.

[00013] O objetivo da presente invenção foi fornecer extratos alternativos eficazes de folha de videira.

[00014] O objetivo é resolvido por um processo para a produção de um extrato de folhas de Vitis vinifera L., compreendendo os seguintes estágios: a) fornecimento de um fármaco de folhas de Vitis vinifera L. b) extração do fármaco com um eluente selecionado a partir de água e misturas de água com álcool, obtendo um extrato bruto, c) separação do extrato bruto do fármaco extraído, d) remoção pelo menos parcial do eluente, obtendo um extrato espesso, e) redissolução do extrato espesso em água, f) separação dos componentes insolúveis, g) enriquecimento seletivo de ingredientes secundários da planta por meio de i. uma extração em duas fases ou ii. uma filtração por membranas.

[00015] De acordo com a invenção, são usadas folhas de Vitis vini- fera L. Em princípio, essas podem ser usadas frescas ou secas.

[00016] É preferível que as folhas sejam trituradas antes da extração.

[00017] Em uma forma de execução especial da presente invenção, a preparação do fármaco é efetuada pela junção de folhas de Vitis vini- fera L. em um momento, no qual o teor de flavonoide alcança um ótimo, secagem e trituração das folhas, bem como opcionalmente pelo corte das folhas em pedaços.

[00018] A extração é efetuada com água ou misturas de água com álcool, para obter um extrato bruto. Particularmente adequadas, são mistura de 5 a 30 kg de agente de extração para 1 kg de fármaco seco.

[00019] Como eluente utiliza-se preferivelmente água ou uma mistura de etanol-água, que contém 5 a 95% em volume, de etanol.

[00020] Particularmente preferido é o uso de um eluente, que além de água, contém etanol em uma quantidade de 25 a 50% em volume.

[00021] Preferivelmente, a extração é efetuada a uma temperatura na faixa de 40 a 80o, tendo sido particularmente comprovada uma faixa de temperatura de 15 a 25°C abaixo da temperatura de ebulição do eluente usado.

[00022] A pressão predominante na extração é pouco crítica em ampla faixa. Habitualmente, a extração será efetuada, contudo, sob uma pressão na faixa de 90 a 150 kPa (900 a 1500 mbars), preferi- velmente de 95 a 110 kPa (950 a 1100 mbars) e especialmente sob pressão ambiente, isto é, a aproximadamente 101,3 kPa (1013 mbars).

[00023] O extrato bruto é separado do fármaco extraído. A separação é geralmente efetuada por meio de filtração ou por outros processos conhecidos pelo especialista. Por exemplo, uma filtração através de uma placa de orifícios com furos de 4 mm e sacos de pe- neiração de poliamida ligados em série com uma largura da malha de 250 μm. Outros processos adequados para este fim são conhecidos pelo especialista.

[00024] Em seguida, o eluente é pelo menos parcialmente removido do extrato bruto separado obtendo-se um extrato espesso. Com remoção parcial do eluente, entende-se no contexto da presente invenção uma remoção do eluente de 30 a 99% em volume, em relação ao volume do eluente usado, preferivelmente 75 a 98% em volume e especialmente uma remoção essencialmente completa do eluente, isto é, uma remoção de pelo menos 95% em volume. Habitualmente, o eluente será removido através de aquecimento e/ou sob baixa pressão. Métodos e dispositivos adequados para esse fim são conhecidos pelo especialista.

[00025] O extrato espesso obtido dessa maneira é redissolvido em água e os componentes insolúveis são separados.

[00026] Habitualmente, a redissolução é efetuada em uma quantidade de 1 parte a 10 partes de água em relação a uma quantidade de 1 parte do extrato bruto obtido. Os componentes insolúveis são separados por meio de métodos usuais na técnica, tais como filtração e/ou centrifugação.

[00027] Em seguida, é efetuado um enriquecimento seletivo de ingredientes secundários das plantas ou através de uma extração em duas fases ou de uma filtração por membranas.

[00028] Uma extração em duas fases pode ser efetuada como ex- tração em fase sólida, provando-se como fase sólida uma resina ad- sorvedora. Resinas adsorventes adequadas são, por exemplo, do grupo dos copolímeros de divinilbenzeno hidrófobicos não iônicos, polímeros de ésteres alifáticos e polímeros de formofenol e estão comercialmentedisponíveis pelas denominações Amberlite®, Levalite®, Mion- tech® e Diaion®. As resinas de adsorção adequadas para o processo de acordo com a invenção são preferivelmente caracterizadas por um tamanho interno médio de poros na faixa de 300 - 700 Angstrom, preferivelmente de 400 - 500 Angstrom.

[00029] As substâncias, que se ligam ao adsorvente, são eluídas e ulteriormente usadas; as substâncias não ligadas são rejeitadas.

[00030] Habitualmente, a extração será efetuada em uma faixa de temperatura de 10 a 30oC. A resolução do objetivo usada é habitualmente ajustada entre pH 3 e pH 6, preferivelmente entre pH 4,5 e pH 5,5, de modo particularmente preferido em pH 5.

[00031] No caso da extração em duas fases pode tratar-se também de uma extração líquido-líquida, em que preferivelmente a segunda fase é um líquido imiscível em água e é selecionado do grupo dos álcoois, cetonas, alcanos ou ésteres. Em uma forma de execução especial, a segunda fase é um álcool imiscível em água, preferivelmente um C4-C5-álcool e, de modo particularmente preferido, n-butanol. Aqui, a fração, que passa para a segunda fase, continua a ser usada e a fase aquosa é descartada.

[00032] Habitualmente, a extração será efetuada com um teor de substância seca da solução de partida entre 3 e 30%, preferivelmente entre 10 e 20%, de modo particularmente preferido a 15%.

[00033] Fundamentalmente, no caso do enriquecimento seletivo pode tratar-se também de uma filtração por membranas, em que se provaram membranas com um tamanho de exclusão de 30 a 2000 quilo Daltons (kDa).

[00034] O permeado continua a ser usado, enquanto o retentado é descartado.

[00035] Em uma forma de execução especial da presente invenção, o extrato será secado depois de um enriquecimento seletivo para obter um extrato seco de Vitis vinifera L. A secagem é efetuada com o uso de processos técnicos usuais, tais como, por exemplo, da secagem por atomização. Contudo, também é possível continuar a usar o extrato enriquecido sem prévia secagem.

[00036] Através do processo de acordo com a invenção descrito acima, obtêm-se extratos de Vitis vinifera L., cuja proporção de fárma- co nativo para extrato (DEVnativa) é de 12:1 a 40:1. O teor total de fla- vonoides dos extratos obtidos de acordo com a invenção e de acordo com a invenção importa habitualmente em pelo menos 15% em peso, preferivelmente em pelo menos 20% em peso e o teor de antocianinas é de pelo menos 0,1% em peso, preferivelmente pelo menos 0,2% em peso, de modo particularmente preferido, em pelo menos 0,3% em peso. Por esse meio, obtém-se uma maior inibição das citocinas que desencadeiam a permeabilidade em comparação com o extrato de referência (de acordo com o estado da técnica).

[00037] Em consequência disso, um outro objetivo da presente invenção é o extrato produzido de acordo com um dos processos descritos acima.

[00038] Um outro objetivo da presente invenção refere-se a uma preparação do extrato, contendo um extrato de acordo com a invenção, bem como pelo menos um coadjuvante fisiologicamente aceitável. Coadjuvantes fisiologicamente aceitáveis adequados são conhecidos pelo especialista.

[00039] Um outro objetivo da presente invenção refere-se ao uso de um extrato de acordo com a invenção ou de uma preparação de extrato de acordo com a invenção, para a produção de medicamentos, pre- parações farmacêuticas ou suplementos alimentares. A produção é efetuada por processos usuais na técnica.

[00040] Um outro objetivo da presente invenção refere-se ao uso de um extrato de acordo com a invenção ou de uma preparação de extrato de acordo com a invenção, para o tratamento ou profilaxia de doenças inflamatórias dos vasos sanguíneos ou do trato gastrointestinal, nos sofrimentos hemorroidais ou na trombose perianal. No caso da doença inflamatória dos vasos sanguíneos tratada de acordo com a invenção, trata-se especialmente de flebite. No caso do distúrbio da microcirculação venosa tratado de acordo com a invenção, trata-se em particular de uma insuficiência venosa crônica (CVI). No caso das doenças isquêmicas tratadas de acordo com a invenção, trata-se em particular de doenças do coração, especialmente de infarto do coração.

[00041] Um outro objetivo da presente invenção refere-se ao uso de um extrato de acordo com a invenção ou de uma preparação de extrato de acordo com a invenção, para o tratamento ou profilaxia de inflamações agudas ou crônicas do trato gastrointestinal ou sofrimentos hemorroidais ou tromboses perianais.

[00042] As utilizações de acordo com a invenção para o tratamento podem ser efetuadas após a administração intravascular, peroral, retal ou transdérmica do extrato de acordo com a invenção ou da preparação do extrato de acordo com a invenção. Nesse caso, os extratos de acordo com a invenção ou as preparações do extrato de acordo com a invenção, apresentam efeito tópico ou sistêmico.

[00043] A invenção é detalhadamente explicada pelos seguintes exemplos não restritivos.

Métodos de medição usados Parâmetros químicos

[00044] A determinação de teor dos flavonoides é efetuada por meio de um método HPLC, o qual abrange os flavonoides isoquerci- trina, quercetin-3-O-β-D-glucuronida e kaempferol-3-O-β-D- glicosídeo. Como fase estacionária serve, aqui, uma coluna de separação Superspher RP8, com partículas de 4 μm, na dimensão de 125 x 4 mm. A separação isocrática é efetuada com uma velocidade de fluxo de 1 ml/min em um forno de colina a 25oC. O eluente compõe-se de 107 partes de tetrahidrofurano, 55 partes de acetonitrila e 810 partes de ácido fosfórico (0,003 mol/l). A detecção é efetuada a 360 nm.

[00045] O teor de antocianinas é determinado com um método HPLC separado de maneira análoga à Ph.Eur 6.4 Monographie 2394 "Fresh Bilberry fruit dry extract, refined and standardised".

Modelo farmacológico in-vitro para a inibição da citocina

[00046] Monócitos humanos são estimulados a 37°C e 5% de CO2 durante 24 horas com LPS (10 ng/ml). Os extratos são acrescentados 30 minutos antes da adição de LPS, para provar, se esses podem influenciar a estimulação de LPS. Foram testadas concentrações de medição dos extratos entre 10 - 300 μg/ml. Depois de 24 horas, as soluções sobrenadantes foram removidas, centrifugadas e medidas para as concentrações de PGE-2, IL-6, IL-1 e TNF-alfa por meio de ELISAs / EIAs (Biotrend / Immunotools) de acordo com as instruções do fabricante.

Exemplo 1: Extrato de referência aquoso (estado da técnica)

[00047] 2 kg de folha do fármaco Vitis vinifera Ph.Eur. são extraí dos com 24 litros de água de osmose a 75°C no coador. O eluato é filtrado e concentrado na baixa pressão para formar um extrato espesso com cerca de 50% de porção de substância seca. O espessado é misturado com 4% de dióxido de silício e secado na estufa de secagem a vácuo a 50oC. O extrato obtido é caracterizado por uma DEVnativa de 5:1, um teor de flavonoide de 5,1% e por um teor de antocianinas de 0,15%.

Exemplo 2: Extrato adsorvente de acordo com a invenção (base aquosa)

[00048] 2 kg de folha do fármaco Vitis vinifera Ph.Eur. são extraídos com 44 litros de água de osmose a 75°C no coador. O eluato é concentrado na baixa pressão para formar um extrato espesso com cerca de 50% de porção de substância seca. O espessado é refrigerado durante 16 horas e rediluído com a água de osmose para uma porção de substância seca de 10%. Depois de 24 horas, os taninos precipitados são filtrados e, em seguida, o extrato fino é aplicado sobre material adsorvente XAD7HP. O adsorvente carregado é lavado com a água de osmose e, em seguida, o componente do extrato é eluído com etanol. A fase do etanol é evaporada para uma porção de substância seca de > 50%. O espessado obtido é secado de forma nativa a 50°C na estufa de secagem a vácuo. O extrato obtido é caracterizado por uma DE- Vnativa de 19:1, por um teor de flavonoide de 21,1% e um teor de an- tocianinas de 0,77%.

[00049] Para o extrai to adsorvente de acordo com o exemplo 2, foi possível comprovar um aumento da inibição de citocina comparado com o estado da técnica de acordo com o exemplo 1.

[00050] No caso de IL-6 é necessária uma concentração de extrato mais baixa do extrato de acordo com a invenção em torno do fator 5, para obter o mesmo efeito anti-inflamatório.

[00051] A influência de PGE-2 é ainda mais pronunciada. Em uma concentração medida de 300 μg/ml conforme o exemplo 1, pôde ser medida uma inibição de somente 11,6%. O extrato de acordo com a invenção conforme o exemplo 2 obteve, com uma concentração 6 vezes menor de 50 μg/ml, até mesmo uma inibição de 32,1%.

[00052] Esses dois em torno do fator 5 ou fator 18 (valor em % 3 vezes melhor x fator de concentração 6) estão acima do fator de enriquecimento de 3,8 do extrato de acordo com a invenção versus o exemplo 1. O fator de enriquecimento de 3,8 resulta do quociente do DEV nativo dos extratos a serem comparados.

Exemplo 3: Extrato de acordo com a invenção (por meio da extração FI.-FI.)

[00053] 2 kg de folha do fármaco Vitis vinifera Ph.Eur. são extraídos com 44 litros de água de osmose a 75°C no coador. O eluato é concentrado na baixa pressão para formar um extrato espesso com cerca de 50% de porção de substância seca. O espessado é refrigerado durante 16 horas e rediluido com a água de osmose para uma porção de substância seca de 10%. Depois de 24 horas, a fração de tanino precipitada é filtrada e, em seguida, o extrato fino é submetido duas vezes com n- butanol na proporção de 3:2. A fase de butanol é evaporada para uma fração de substância seca de >50%. O espessado obtido é secado de forma nativa a 50°C na estufa de secagem a vácuo. O extrato obtido é caracterizado por uma DEVnativa de 16:1, por um teor de flavonoide de 21,7% e um teor de antocianinas de 0,43%. A fase aquosa remanescente caracteriza-se por uma DEVnativa de 5:1, um teor de flavonoide de <0,1% e um teor de antocianinas abaixo do limite de determinação.

[00054] A comparação das duas fases do processamento líquido- líquido mostra nitidamente, que os princípios anti-inflamatórios na fase orgânica (butanol) podem ser enriquecidos.

[00055] Para o extrato enriquecido butanolicamente conforme o exemplo 3A, pôde ser determinado um aumento da inibição de citocina do fator 15 (TNF-a), fator 42 (IL-1β) e fator 91 (PGE-2) em relação à fase aquosa separada conforme o exemplo 3B. Por outro lado, há apenas um fator de enriquecimento de 3,2 (quociente do DEV nativo dos extratos 3A versus exemplo 3B a serem comparados).

[00056] Isso salienta o enriquecimento seletivo dos princípios ativos da fase aquosa na fase orgânica.

[00057] O extrato de acordo com a invenção conforme o exemplo 3A também é superior ao estado da técnica.

[00058] Para o extrato conforme o exemplo 3A, pôde ser comprovado um aumento da inibição da citocina em relação ao estado da técnica conforme o exemplo 1.

[00059] No TNF-alfa, é necessária uma concentração do extrato menor em torno do fator 5 do extrato 3A de acordo com a invenção, para obter o mesmo efeito anti-inflamatório.

[00060] A influência do PGE-2 ainda é mais acentuada. Em uma concentração medida de 300 μg/ml conforme o exemplo 1, pôde ser medida uma inibição de somente 11,6%. O extrato de acordo com a invenção conforme o exemplo 2 obteve com uma concentração 6 vezes mais baixa de 50 μg/ml, até mesmo uma inibição de 24,3%.

[00061] Essas duas em torno do fator 5 ou fator 12 (% de valor 2 vezes melhor x fator de concentração 6) estão acima do fator de enri- quecimento de 3,2 do extrato de acordo com a invenção versus o exemplo 1. O fator de enriquecimento de 3,2 resulta do quociente do DEV nativo dos extratos a serem comparados.

Exemplo 4: Produção de um extrato etanólico de acordo com a invenção

[00062] 2 kg de folha do fármaco Vitis vinifera Ph.Eur. são extraídos com 24 litros de EtOH 40% em volume, a 45°C no coador. O eluato é filtrado e na baixa pressão é concentrado para formar um extrato espesso com aproximadamente 50% de porção de substância seca. O espessado é refrigerado durante 16 horas e rediluído com a água de osmose para uma porção de substância seca de 10%. Depois de 24 horas, os taninos precipitados são filtrados e, em seguida, o extrato fino é liberado por meio de uma filtração por membranas (MWCO 300 kDa) de outras substâncias coextraídas de alto peso molecular. A fração resultante (permeado) é secado no vácuo a 50oC. O extrato obtido é caracterizado por uma DEVnativa de 6,7:1 e por um teor de flavonoide de 7,6%.

Exemplo 5: Produção de um extrato adsorvente de acordo com a invenção (base EtOH)

[00063] 2 kg de folha do fármaco Vitis vinifera Ph.Eur. são extraídos com 24 litros de EtOH 20% em volume, a 75°C no coador. O eluato é concentrado na baixa pressão para formar um extrato espesso com aproximadamente 50% de porção de substância seca. O espessado é resfriado durante 16 horas e rediluído com água de osmose para uma porção de substância seca de 10%. Depois de 24 horas, os taninos precipitados são filtrados e, em seguida, o extrato fino é aplicado em material adsorvente XAD7HP. O adsorvente carregado é lavado com água de osmose e, em seguida, o componente do extrato é eluído com etanol. A fase de etanol é evaporada para uma porção de substância seca de >50%. O espessado obtido é secado de forma nativa a 50°C na estufa de secagem a vácuo. O extrato obtido é caracterizado por uma DEVnativa de 21:1 e por um teor de flavonoide de 25,1%.

Claims (6)

1. Processo para preparação de um extrato de folhas de Vi- tis vinifera L., caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) preparar um fármaco de folhas de Vitis vinifera L, (b) extrair o fármaco com um eluente selecionado a partir de água e mistura de etanol-água, obtendo um extrato bruto, (c) separar o extrato bruto do fármaco extraído, (d) remover pelo menos parcialmente o eluente para obter um extrato espesso, (e) redissolver o extrato espesso em água, (f) separar quaisquer componentes insolúveis, (g) concentrar seletivamente os ingredientes secundários flavonoide e antocianinas da planta por meio de: (i) uma extração em duas fases; ou (ii) uma filtração por membranas.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mistura de etanol-água contém 5 a 95% em volume de etanol.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o eluente para a extração é aquecido a uma temperatura de 40 a 80°C, preferivelmente a 15 a 25°C abaixo da temperatura de ebulição.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a extração em duas fases é uma extração de fase sólida; em que a segunda fase é uma resina adsorvedora, preferivelmente selecionada a partir do grupo dos copolímeros de divinilben- zeno hidrófobicos não iônicos, polímeros de ésteres alifáticos e polímeros de formofenol.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a extração em duas fases é uma extração líquido-líquido; em que a segunda fase é um líquido imiscível em água, preferencialmente, um álcool imiscível em água e, mais preferencialmente, butanol.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o extrato de folhas de Vitis vinifera L. obtido apresenta uma razão de fármaco nativo para extrato (DEVna- tiva) de 6,7:1 a 21:1, um teor total de flavonoide de pelo menos 15% em peso, e um teor de antocianinas de pelo menos 0,1% em peso.