BR112012024036B1 - Profilaxia de câncer colorretal e gastrointestinal - Google Patents

Abstract

profilaxia de câncer colorretal e gastrointestinal. a presente invenção refere-se a métodos e composições úteis para prevenir câncer gastroinstestinal e/ou colorretal em animais, incluindo seres humanos, tendo pólipos adenomatosos pré-cancerosos. a presente invenção refere-se a composições compreendendo anticorpos anti-pg adequados para uso nos métodos da invenção. a presente invenção também refere-se a métodos e composições úteis para monitorar a eficácia do tratamento anti-pg em indivíduos com pólipos pré-cancerosos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROFILAXIA DE CÂNCER COLORRETAL E GASTROINTESTINAL.

1. Referência a Pedidos Correlatos

Este pedido reivindica o benefício nos termos do artigo 35 U.S.C. § 119(e) do pedido provisório n° 61/317.245, depositado em 24 de março de 2010, cujo conteúdo encontra-se aqui incorporado em sua integridade a título de referência.

2. Referência à Listagem de sequência. Tabela ou Programa de Computador

A Listagem de Sequência é apresentada junto com o presente pedido.

3. Campo da Invenção

A presente invenção refere-se, entre outras coisas, a métodos de prevenção de câncer colorretal e/ou gastrointestinal em indivíduos com predisposição a desenvolver pólipos adenomatosos por meio de administração ao indivíduo de uma composição compreendendo um anticorpo específico para progastrina.

4. Antecedentes

Câncer do trato gastrointestinal, incluindo câncer colorretal (CRC), afeta centenas de milhares de pessoas a cada ano e dezenas de milhares de mortes relacionadas com CRC ocorrem a cada ano apenas nos Estados Unidos. Vide Rustgi, 2010, The genetics of hereditary colon cancer, Genes & Development 21:2525-2538. CRC pode surgir de diferentes maneiras, uma delas sendo a transformação de pólipos adenomatosos em tumores malignos. A polipose adenomatosa pode ser herdada, como é o caso de pessoas com polipose adenomatosa familiar (FAP), ou pode ser esporádica. Pessoas com FAP ou polipose adenomatosa esporádica carregam mutações do gene supressor de tumor polipose coli adenomatosa (APC) que estão associadas à formação de pólipos adenomatosos no intestino delgado, no cólon e/ou no reto. Esses pólipos por sua vez podem se desenvolver em câncer colorretal e gastrointestinal. No caso da polipose adenomatosa esporádica, uma condição não hereditária que subjaz muitos casos de CRC, o gene APC é mutado em células somáticas. Pessoas com

2/62 polipose adenomatosa esporádica desenvolvem pólipos, sendo que um subconjunto desses pode subsequentemente se transformar em carcinomas malignos.

FAP é responsável por cerca de 1% de todos os casos de CRC e afeta um em cada 13.000 nascimentos. Id. A mutação de APC em pacientes com FAP está associada à formação de centenas a milhares de pólipos adenomatosos pequenos em todo o cólon. A evolução de pólipos em malignidade é virtualmente inevitável. Em média, sem tratamento profilático, as pessoas com FAP desenvolvem FAP por volta dos 39 anos. Tratamento profilático é o padrão de cuidados e envolve cirurgia radical, que inclui a remoção do cólon, ou do cólon e do reto, geralmente antes dos 25 anos de idade. Embora a profilaxia seja melhor que nenhum tratamento, a ressecção cirúrgica do cólon (colectomia) em pacientes jovens prejudica consideravelmente a qualidade de vida. Além disso, só a ressecção cirúrgica pode ser inadequada para manter os pacientes livres de câncer: pacientes com colectomias apresentam um alto risco de desenvolver pólipos e câncer no trato gastrointestinal superior. Há uma verdadeira necessidade de tratamentos profiláticos eficazes, especialmente tratamentos não cirúrgicos, que prolonguem a vida sem câncer de pessoas com FAP e de pessoas com polipose adenomatosa esporádica.

5. Sumário

A presente invenção oferece métodos e composições úteis para prevenir o câncer gastrointestinal, inclusive CRC, em animais, incluindo seres humanos, com predisposição para desenvolver pólipos adenomatosos. Como descrito abaixo, o presente pedido apresenta esquemas de tratamento que seguramente ligam a progastrina (PG), com a aparente capacidade de neutralizar a atividade biológica das PGs, que são úteis em indivíduos que têm uma maior probabilidade de desenvolver, mas que ainda não desenvolveram, CRC ou câncer no trato gastrointestinal superior. As várias invenções descritas no pedido baseiam-se em parte à descoberta das requerentes de que anticorpos anti-PG previnem o desenvolvimento de tumores gastrointestinais em um modelo de FAP em camundongos. Embora sem se

3/62 querer ater à qualquer teoria de operação, acredita-se que ligar PG e interferir em sua interação com outras proteínas no corpo previne que pólipos adenomatosos se desenvolvam em tumores malignos.

Por conseguinte, em um aspecto, a presente invenção oferece métodos de prevenção de câncer gastrointestinal, inclusive CRC, em indivíduos com predisposição para desenvolver pólipos adenomatosos por meio da administração de uma composição compreendendo um anticorpo antiPG. Em geral, os métodos compreendem administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-PG. Anticorpos anti-PG, e composições dos mesmos, podem ser administrados de acordo com esquemas conhecidos na literatura para terapia à base de anticorpos, a uma dosagem eficaz, isto é, uma quantidade eficaz para prevenir ou retardar o câncer gastrointestinal, inclusive CRC, em um indivíduo.

Indivíduos adequados para tratamento profilático anti-PG são aqueles com predisposição para desenvolver pólipos adenomatosos, inclusive indivíduos com histórico familiar de CRC, indivíduos com FAP, e aqueles nos quais pólipos adenomatosos já foram antes encontrados e/ou removidos. Tipicamente, os indivíduos adequados possuem uma ou mais mutações no gene APC, que levam à FAP ou polipose adenomatosa esporádica. Indivíduos adequados também incluem pessoas que já passaram por uma colectomia e correm maior risco de desenvolver pólipos e câncer no trato gastrointestinal superior.

Os anticorpos anti-PG da presente invenção incluem anticorpos capazes de ligar a PG. Qualquer anticorpo capaz de ligar a PG pode ser usado nos métodos da presente invenção, incluindo, porém sem limitação, anticorpos monoclonais e policlonais anti-PG. De preferência, o anticorpo anti-PG é específico para a PG da espécie sendo tratada. Por exemplo, um anticorpo anti-PG humana (anti-hPG) é administrado a um indivíduo humano. Anticorpos anti-PG adequados podem variar em termos de afinidade de ligação de pelo menos cerca de 5000 nM a pelo menos cerca de 0,001 nM, ou mais, ou qualquer valor entre estes.

Os anticorpos anti-PG descritos nesta invenção podem ser usa4/62 dos em combinação com, ou adjuntivo a, outros tratamentos para prevenir ou retardar o câncer gastrointestinal, incluindo CRC. Exemplos não limitativos de outros tratamentos incluem ressecção cirúrgica, quimioterapia, terapia com anticorpos, terapia por radiação, e tratamento com um segundo agente descrito nesta invenção. Os anticorpos anti-PG podem ser administrados concomitamente com um outro tratamento, ou antes ou depois do mesmo.

As composições adequadas para uso nos métodos da presente invenção podem compreender, além de um anticorpo anti-PG, um veículo, excipiente, e/ou diluente farmaceuticamente aceitável. As composições podem ser formuladas para várias vias de administração como descrito neste relatório, compreendendo veículos, excipientes, e/ou diluentes adequados para a via escolhida. Para tratamento de seres humanos e animais, as composições compreendendo anticorpos anti-PG podem ser administradas por qualquer via de administração adequada, tal como por injeção e outras vias de administração conhecidas na literatura para produtos clínicos à base de anticorpos. Para fins de tratamento, as composições podem ser embaladas em doses unitárias para facilitar seu uso.

Conforme mostrado nesta invenção, pacientes com múltiplos pólipos adenomatosos possuem níveis séricos elevados de PG, ao passo que pacientes que tiveram pólipos removidos possuem níveis séricos baixos ou não detectáveis de PG. Esta descoberta fornece novas e poderosas ferramentas para diagnosticar e monitorar o curso da polipose adenomatosa esporádica ou da polipose adenomatosa familiar e seu tratamento.

Por conseguinte, em um outro aspecto, a presente invenção oferece métodos de monitoramento da eficácia do tratamento anti-PG em um indivíduo com predisposição para desenvolver pólipos adenomatosos. Em geral, os métodos compreendem medir a concentração, ou o nível, de PG em uma amostra de sangue (soro, plasma, ou sangue total) do indivíduo que está recebendo terapia anti-PG, durante ou depois de uma série de terapia anti-PG, e comparar o nível de PG medido com um nível basal de PG (por exemplo, um nível de PG no indivíduo no início do tratamento), onde um ní5/62 vel de PG medido abaixo do nível basal é indicativo da eficácia do tratamento e um nível de PG medido acima do nível basal é indicativo de falta de eficácia. Em algumas modalidades, o método inclui ainda avaliar o número e o tamanho dos pólipos no indivíduo, por exemplo, por endoscopia.

Em ainda um outro aspecto, a presente invenção oferece métodos para selecionar indivíduos para os quais a endoscopia ou o tratamento anti-PG é indicado. Os métodos destinam-se a serem realizados em indivíduos com predisposição para desenvolver pólipos adenomatosos. Em geral, o método é realizado medindo-se o nível de PG em uma amostra de sangue do indivíduo, e comparando-se o nível de PG medido com um nível basal, onde um nível de PG medido superior ao nível basal indica necessidade de endoscopia. Em algumas modalidades, um nível de PG acima do nível basal indica necessidade de tratamento anti-PG. A linha basal pode ser obtida a partir de uma ou mais amostras do indivíduo em uma época anterior, ou pode basear-se nos níveis de PG medidos em uma população tendo características similares ao indivíduo.

6. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1 oferece sequências aminoacídicas de preprogastrina humana (SEQ ID N°: 100), onde a sequência de peptídios sinal está sublinhada, progastrina humana madura (SEQ ID N°: 20) e certos produtos do processamento de progastrina, incluindo G34 (SEQ ID N°: 102), G34-Gly (SEQ ID N°: 103), G17 (SEQ ID N°: 104), G17-Gly (SEQ ID N°: 105) e CTFP (SEQ ID N°: 106).

A figura 2 oferece sequências polinucleotídicas e aminoacídicas das cadeias leves variáveis e das cadeias pesadas variáveis de certos anticorpos monoclonais murinos anti-hPG exemplificativos. Em todos os casos, as três CDRs estão mostradas no texto sublinhado e em negrito. Especificamente:

A figura 2A oferece a sequência polipeptídica da cadeia V_H de MAb3 murino anti-hPG (SEQ ID N°: 12) e uma sequência polinucleotídica codificando a mesma (SEQ ID N°: 16);

a figura 2B oferece a sequência polipeptídica da cadeia V_L de

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MAb3 murino anti-hPG (SEQ ID N°: 13) e uma sequência polinucleotidica codificando a mesma (SEQ ID N°: 17);

a figura 2C oferece a sequência polipeptídica da cadeia V_H de MAb4 murino anti-hPG (SEQ ID N°: 14) e uma sequência polinucleotidica codificando a mesma (SEQ ID N°: 18);

a figura 2D oferece a sequência polipeptídica da cadeia V[_ de MAb4 murino anti-hPG (SEQ ID N°: 15) e uma sequência polinucleotidica codificando a mesma (SEQ ID N°: 19);

a figura 2E oferece a sequência polipeptídica da cadeia V_H de MAb8 murino anti-hPG (SEQ ID N°: 59) e uma sequência polinucleotidica codificando a mesma (SEQ ID N°: 67);

a figura 2F oferece a sequência polipeptídica da cadeia V_L de MAb8 murino anti-hPG (SEQ ID N°: 63) e uma sequência polinucleotidica codificando a mesma (SEQ ID N°: 71);

a figura 2G oferece a sequência polipeptídica da cadeia V_H de MAb13 murino anti-hPG (SEQ ID N°: 60) e uma sequência polinucleotidica codificando a mesma (SEQ ID N°: 68);

a figura 2H oferece a sequência polipeptídica da cadeia Vl de MAb13 murino anti-hPG (SEQ ID N°: 64) e uma sequência polinucleotidica codificando a mesma (SEQ ID N°: 72);

a figura 2I oferece a sequência polipeptídica da cadeia V_H de MAb16 murino anti-hPG (SEQ ID N°: 61) e uma sequência polinucleotidica codificando a mesma (SEQ ID N°: 69);

a figura 2J oferece a sequência polipeptídica da cadeia V_L de MAb16 murino anti-hPG (SEQ ID N°: 65) e uma sequência polinucleotidica codificando a mesma (SEQ ID N°: 73);

a figura 2K oferece a sequência polipeptídica da cadeia Vh de MAb19 murino anti-hPG (SEQ ID N°: 62) e uma sequência polinucleotidica codificando a mesma (SEQ ID N°: 70); e a figura 2L oferece a sequência polipeptídica da cadeia V_L de MAb19 murino anti-hPG (SEQ ID N°: 66) e uma sequência polinucleotidica codificando a mesma (SEQ ID N°: 74).

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A figura 3 oferece sequências polipeptídicas projetadas para cadeias pesadas e leves variáveis humanizadas de anticorpos monoclonais anti-hPG selecionados descritos nesta invenção. Em todos os casos, as três CDRs estão mostradas no texto sublinhado e em negrito. Especificamente:

A figura 3A oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_H de MAb3 humanizado (SEQ ID N°: 21);

a figura 3B oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_L de MAb3 humanizado (SEQ ID N°: 22);

a figura 3C oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_H de MAb4 humanizado (SEQ ID N°: 23);

a figura 3D oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_L de MAb4 humanizado (SEQ ID N°: 24);

a figura 3E oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_H de MAb8(a) humanizado (SEQ ID N°: 75);

a figura 3F oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_L de MAb8(a) humanizado (SEQ ID N°: 76);

a figura 3G oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_H de MAb8(b) humanizado (SEQ ID N°: 77);

a figura 3H oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V|_ de MAb8(b) humanizado (SEQ ID N°: 78);

a figura 3I oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_H de MAb8(c) humanizado (SEQ ID N°: 79);

a figura 3J oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_L de MAb8(c) humanizado (SEQ ID N°: 76);

a figura 3K oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_H de MAb13(a) humanizado (SEQ ID N°: 80);

a figura 3L oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_L de MAb13(a) humanizado (SEQ ID N°: 81);

a figura 3M oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_H de MAb13(b) humanizado (SEQ ID N°: 82);

a figura 3N oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_L de MAb13(b) humanizado (SEQ ID N°: 83);

8/62 a figura 30 oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_H de MAb16(a) humanizado (SEQ ID N°: 84);

a figura 3P oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_L de MAb16(a) humanizado (SEQ ID N°: 85);

a figura 3Q oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_H de MAb16(b) humanizado (SEQ ID N°: 86);

a figura 3R oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_L de MAb16(b) humanizado (SEQ ID N°: 87);

a figura 3S oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_H de MAb16(c) humanizado (SEQ ID N°: 88);

a figura 3T oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_L de MAb16(c) humanizado (SEQ ID N°: 89);

a figura 3U oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_H de MAb19(a) humanizado (SEQ ID N°: 90);

a figura 3V oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_L de MAb19(a) humanizado (SEQ ID N°: 91);

a figura 3W oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_H de MAb19(b) humanizado (SEQ ID N°: 92);

a figura 3X oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_L de MAb19(b) humanizado (SEQ ID N°: 93);

a figura 3Y oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_H de MAb19(c) humanizado (SEQ ID N°: 94); e a figura 3Z oferece a sequência aminoacídica projetada da cadeia V_L de MAb19(c) humanizado (SEQ ID N°: 95).

7. Descrição Detalhada

7.1 Câncer em polipose familiar e em polipose adenomatosa esporádica

Polipose adenomatosa familiar (FAP) é uma doença hereditária rara associada a uma mutação germinal em um alelo do gene APC. Numerosas mutações do gene APC foram mapeadas em indivíduos com FAP, muitas dessas mutações resultando em uma proteína trucada. Vide, por exemplo, Rustgi, 2010, The genetics of hereditary colon cancer, Genes & Development 21:2525-2538; Groves et al., 2002, Duodenal cancer in pati9/62 ents with familial adenomatous polyposis (FAP): results of a 10 year prospective study, Gut 50:636-641. Essas mutações no APC estão associadas à FAP de severidade variável.

A FAP caracteriza-se pelo aparecimento de múltiplos adenomas (pólipos) no intestino e no cólon das pessoas afetadas, quando ainda muito jovens. Um subconjunto desses pólipos transforma-se em câncer colorretal (CRC), e os casos de CRC derivada de FAP representam aproximadamente 1% de todos os casos de CRC. Quando existe histórico familiar de CRC, as pessoas tipicamente fazem um exame genético quando ainda muito jovens para detectar a presença de uma mutação no gene APC. O acompanhamento das pessoas nas quais tais mutações foram encontradas começa com colonoscopia, ressecção dos pólipos onde estes são encontrados, e se os pólipos forem numerosos demais para remoção endoscópia, ressecção parcial ou completa do cólon (colectomia). A maioria das pessoas com FAP já fizeram colectomia antes dos 25 anos.

Uma grande percentagem de pólipos adenomatosos esporádicos também ancoram mutações no gene APC. Vide Rutsgi, 2010, The genetics of hereditary colon cancer, Genes & Development 21.2525-2538. Na ausência de histórico familiar de CRC, as pessoas que apresentam sintomas tais como sangramento retal são tipicamente examinadas por colonoscopia. As pessoas nas quais foram encontrados grandes números de pólipos, ou aquelas nas quais os pólipos reaparecem depois da ressecção, tipicamente também farão exames genéticos. Se for encontrada uma mutação no gene APC, a colectomia é o tratamento recomendado.

Mesmo depois de colectomia, pessoas com predisposição para desenvolver pólipos adenomatosos apresentam um maior risco de desenvolver pólipos adenomatosos na porção não ressectada de seu trato gastrointestinal. Essas pessoas são regularmente acompanhadas por endoscopia e avaliadas quanto à presença de adenomatose no trato gastrointestinal superior. As pessoas são classificadas por estágios de acordo com a classificação de Spigelman, que conta com quatro parâmetros para avaliar o grau ou a severidade da adenomatose: números de pólipos, tamanho dos pólipos,

10/62 histologia dos pólipos, e grau de displasia dos pólipos (crescimento desordenado). Vide Spigelman et al., 1989, Upper gastrointestinal cancer in patients with familial adenomatous polyposis, Lancet 2:783-785. A classificação de Spigelman classificam as pessoas em um de cinco estágios de polipose duodenal, Estágio 0 a IV, com base nos quatro parâmetros, como mostrado

na i dueid i -------------------------------------- Tabela 1 Classificação de Spigelman_____
Pontos	Número de pólipos	Tamanho dos pólipos (mm)	Histologia	Displasia
1	1-4	1-4	Tubular	Leve
2	5-20	5-10	Tubulovilosa	Moderada
3	>20	> 10	Vilosa	Severa

Estágio I: 1-4 pontos; Estágio II: 5-6 pontos; Estágio III: 7-8 pontos, Estágio

IV: 9-12 pontos.

Um estudo de dez anos de 114 pessoas com FAP revelou gue pacientes no estágio IV de Spigelman corriam um risco de 36,4% de desenvolver câncer duodenal, comparado com um risco de 0% a 2,4% para pacientes classificados nos estágios 0 a III. Vide Groves et al., 2002, Duodenal cancer in patients with familial adenomatous polyposis (FAP): results of a 10 year prospective study, Gut 50:636-641.

Já foi mostrado que aproximadamente 70% dos pacientes com CRC têm níveis elevados de PG. Como mostrado nos exemplos abaixo, as requerentes descobriram agora que os níveis sanguíneos de PG podem ser elevados em pessoas com FAP que ainda não desenvolveram CRC, assim como em cerca de 20% dos pacientes que apresentam polipose adenomatosa esporádica. Embora sem se querer ater à qualquer teoria de operação, acredita-se que a PG faz parte do mecanismo por meio do qual os pólipos transformam-se em tumores malignos. Acredita-se que a ligação de PG por anticorpos anti-PG interfere nesta transição, conforme demonstrado no modelo de FAP em camundongos, APCD14. Tratamento profilático com anticorpos anti-PG apresenta a possibilidade de evitar ou retardar uma cirurgia de vulto, aumentando significativamente a qualidade de vida.

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7.2 Métodos de profilaxia

A presente invenção oferece métodos de prevenção do câncer gastrointestinal, inclusive CRC, em pacientes com predisposição para desenvolver pólipos adenomatosos. Em geral, os métodos compreendem administrar a tais pacientes uma quantidade de um ou mais anticorpos anti-PG eficaz para proporcionar um benefício terapêutico. Anticorpos anti-PG em geral, e anticorpos anti-PG específicos úteis nos métodos, estão descritos detalhadamente em uma seção mais adiante.

O indivíduo ou paciente para profilaxia é de preferência um mamífero tal como um não primata (por exemplo, vaca, porco, cavalo, gato, cachorro, rato etc.) ou um primata (por exemplo, macaco ou ser humano). O anticorpo anti-PG administrado deve ser específico para a espécie de animal sendo tratado. Para o tratamento de indivíduos humanos, os anticorpos antiPG devem se ligar especificamente à progastrina humana (doravante denominados anticorpos anti-hPG, descritos mais detalhadamente abaixo).

O indivíduo ou paciente pode ser um ser humano, tal como um paciente adulto ou um paciente pediátrico. Indivíduos adequados são pessoas que têm uma predisposição para desenvolver pólipos adenomatosos e, como resultado, têm uma maior probabilidade de desenvolver CRC ou câncer gastrointestinal, incluindo pessoas com histórico familiar de CRC, pessoas nas quais pólipos adenomatosos são ou foram detectados ou removidos, pessoas com FAP, pessoas que já fizeram um colectomia para remover pólipos, e pessoas com mutações no gene APC.

O tratamento anti-PG pode ser administrado em combinação com, ou adjuntivo a, um ou mais ou outros tratamentos para prevenir ou retardar o câncer gastrointestinal, inclusive CRC. Outros tratamentos incluem, sem limitação, tratamento quimioterapêutico, radiação, ressecção cirúrgica, terapia com anticorpos, e tratamento com um segundo agente, conforme descrito neste relatório. O tratamento combinado oferecido por esta invenção envolve a administração de pelo menos dois tratamentos a um paciente, o primeiro deles sendo um tratamento anti-PG com pelo menos um anticorpo anti-PG, e o segundo deles sendo um tratamento com um agente ou proce12/62 dimento terapêutico ou profilático.

O tratamento anti-PG pode ser combinado com procedimentos cirúrgicos, tais como resseccão cirúrgica. Anticorpos anti-PG podem ser administrados a indivíduos que já apresentam pólipos pré-cancerosos, ou com predisposição para desenvolver os mesmos, tais como pessoas com polipose adenomatosa familiar, em combinação com ressecção cirúrgica das partes afetadas do trato gastrointestinal. O tratamento anti-PG pode ser iniciado antes, concomitamente, ou depois de ressecção cirúrgica.

O tratamento anti-PG também pode ser combinado com terapia por radiação. Terapia por radiação é o uso de radiação de alta energia de raios-X, raios gama, nêutrons, prótons, e outras fontes para eliminar células cancerosas e encolher tumores. A radiação pode vir de uma máquina fora do corpo (terapia por radiação por feixe externo), ou pode vir de um material radioativo colocado no corpo perto das células cancerosas (terapia por radiação interna, ou braquiterapia). A terapia por radiação sistêmica utiliza uma substância radioativa, tal como um anticorpo monoclonal radiomarcado, que percorre o sangue atingindo tecidos em todo o corpo. A terapia por radiação também pode ser chamada de irradiação e radioterapia. Outras terapias por radiação incluem radioterapia conformacional tridimensional (3D-CRT) e radioterapia de intensidade modulada (IMRT). Outras radioterapias também são possíveis.

Onde o tratamento com anticorpo anti-PG é combinado com um um segundo agente, o segundo agente pode ser um agente quimioterapêutico. Quimioterapia é o uso de fármacos de molécula pequena que eliminam (citotóxicas ou citocidas) ou previnem o desenvolvimento (citostático) de células cancerosas. Agentes quimioterapêuticos incluem, porém sem limitação, toxinas, também denominadas citotoxinas ou agentes citotóxicos, que incluem qualquer agente que seja nocivo à viabilidade de células, agentes, e lipossomas ou outras vesículas contendo compostos quimioterapêuticos. Exemplos de agentes quimioterapêuticos adequados incluem, porém sem limitação, 1-desidrotestosterona, 5-fluorouracil decarbazina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, actinomicina D, adriamicina, aldesleucina, agentes alquilantes,

13/62 alopurinol sódico, altretamina, amifostina, anastrozol, antramicina (AMC), agentes antimitóticos, cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), diamino dicloro platina, antraciclinas, antibióticos, antimetabólitos, asparaginase, BCG vivo (intravesical), fosfato de betametasona sódica e acetato de betametasona, bicalutamida, sulfato de bleomicina, busulfan, leucouorina cálcica, caliqueamicina, capecitabina, carboplatina, lomustina (CCNU), carmustina (BSNU), clorambucil, cisplatina, cladribina, colchicina, estrogênios conjugados, ciclofosfamida, ciclotosfamida, citarabina, citarabina, citocalasina B, citoxano, dacarbazina, dactinomicina, dactinomicina (antiga actinomicina), HCI de daunirubicina, citrato de daunorucbicina, denileucina diftitox, dexrazoxano, dibromomanitol, di-hidróxi antracina diona, docetaxel, mesilado de dolasetron, HCI de doxorubicina, dronabinol, L-asparaginase de E. coli, emetina, epoetina-α, L-asparaginase de Erwinia, estrogênios esterificados, estradiol, fosfato sódico de estramustina, brometo de etidio, etinil estradiol, etidronato, fator citrovorum de etoposida, fosfato de etoposida, filgrastim, floxuridina, fluconazol, fosfato de fludarabina, fluorouracil, flutamida, ácido folinico, HCI de gencitabina, glicocorticoides, acetato de goserelina, gramicidina D, HCI de granisetron, hidroxiureia, HCI de idarubicina, ifosfamida, interferon a-2b, HCI de irinotecano, letrozol, leucovorina cálcica, acetato de leuprolida, HCI de levamisol, lidocaina, lomustina, maitansinoide, HCI de mecloretamina, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, HCI de melfalano, mercaptipurina, mesna, metotrexato, metiltestosterona, mitramicina, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, acetato de octreotida, HCI de ondansetron, oxaliplatina, paclitaxel, pamidronato dissódico, pentostatina, HCI de pilocarpina, plimicina, polifeprosan 20 com implante de carmustina, porfimero sódico, procaina, HCI de procarbazina, propranolol, rituximab, sargramostim, estreptozotocina, tamoxifeno, taxol, tegafur, teniposida, tenoposida, testolactona, tetracaina, tioepa clorambucil, tioguanina, tiotepa, HCI de topotecano, citrato de toremifeno, trastuzumab, tretinoína, valrubicina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, e tartarato de vinorelbina.

Os anticorpos anti-PG também podem ser administrados com uma combinação de agentes quimioterapêuticos. Combinações exemplifica14/62 tivas de agentes quimioterapêuticos incluem 5-fluorouracil (5FU) em combinação com leucovorina (ácido folínico ou LV); capecitabine, em combinação com uracil (UFT) e leucovorina; tegafur em combinação com uracil (UFT) e leucovorina; oxaliplatina em combinação com 5FU, ou em combinação com capecitabina; irinotecano em combinação com capecitabina, mitomicina C em combinação com 5FU, irinotecano ou capecitabina. Outras combinações de agentes quimioterapêuticos divulgados neste relatório também são possíveis.

Esquemas de dosagem tradicionais para agentes quimioterapêuticos usados para pacientes que sofrem de CRC podem ser usados nos métodos da presente invenção. Como se sabe no campo relevante, esquemas de quimioterapia para câncer colorretal usando combinações de diferentes agentes quimioterapêuticos já foram padronizados em ensaios clínicos. Tais esquemas são frequentemente conhecidos por acrônimas e incluem 5FU Mayo, 5FU Roswell Park, LVFU2, FOLFOX, FOLFOX4, FOLFOX6, bFOL, FUFOX, FOLFIRI, IFL, XELOX, CAPOX, XELIRI, CAPIRI, FOLFOXIRI. Vide por exemplo Chau, I. et al., 2009, Br. J., Cancer 100:1704-19, e Field, K. et al., 2007, World J. Gastroenterol. 13:3806-15, ambos aqui incorporados a título de referência.

Anticorpos anti-PG também podem ser usados em combinação com outros anticorpos, incluindo, porém sem limitação, anticorpos monoclonais que eliminam, reduzem ou inoterrompem direta ou indiretamente o crescimento de células cancerosas. Tais anticorpos podem funcionar através de uma variedades de mecanismos distintos. Por exemplo, certos anticorpos podem marcar as células cancerosas para serem atacadas pelo sistema imunológico do paciente via citotoxicidade mediada por células anticorpodependentes (ADCC) ou outros mecanismos. Acredita-se que a rituximab (Rituxan®), que se liga ao antígeno CD20 encontrado em células B, e edrecolomab, que se liga ao antígeno 17-1 A, funcionam desta maneira. Outros anticorpos se ligam e alteram ou inibem a função dos antígenos que as células cancerosas requerem para sobreviver e/ou crescer. Acredita-se que inúmeros anticorpos funcionam desta maneira, incluindo, por exemplo, cetuxi15/62 mab (Erbitux®) e panitumumab (Vectibix®), cada um deles se liga ao receptor EGF (EGFR); e bevacizumab (Avastin®), que se liga ao fator de crescimento VEGF. Outros mecanismos também são possíveis, e anticorpos particulares podem ser capazes de funcionar via um ou mais mecanismos de ação. Ainda outros anticorpos podem ser conjugados a porções radioativas ou quimiotóxicas direcioná-los para as células cancerosas que de preferência expressam anticorpos especificamente reconhecidos pelos anticorpos.

Os anticorpos anti-PG também podem ser administrados em combinação com fármacos anti-inflamatórios não esteroides (NSAIDs). For exemplo, celecoxib, ou 4-[5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil) pirazol-1iljbenzenossulfonamida, é um NSAID que mostrou reduzir os pólipos adenomatosos em pacientes com FAP.

O anticorpo anti-PG e um segundo agente podem ser administrados simultaneamente, sucessivamente, ou separadamente. Conforme usado neste relatório, diz-se que o anticorpo anti-PG e o segundo agente são administrados sucessivamente se eles forem administrados ao paciente no mesmo dia, por exemplo durante a mesma visita do paciente. A administração sucessiva pode ocorrer em um intervalo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 horas. Ao contrário, diz-se que o anticorpo anti-PG e o segundo agente são administrados separadamente se eles forem administrados ao paciente em dias diferentes, por exemplo, o anticorpo anti-PG e o segundo segundo agente podem ser administrados em intervalos de 1 dia, 2 dias ou 3 dias, uma semana, duas semanas ou um mês. Nos métodos da presente invenção, a administração do anticorpo anti-PG da invenção pode preceder ou suceder a administração do segundo agente.

Como um exemplo não limitativo, o anticorpo anti-PG e o segundo agente podem ser administrados concomitantemente por um período de tempo, seguido por segundo período de tempo no qual a administração do anticorpo anti-PG e do segundo agente são alternadas.

7,3 Composições farmacêuticas e kits

Os anticorpos anti-PG úteis nos métodos da presente invenção podem ser formulados em composições. Opcionalmente, as composições

16/62 podem compreender um ou mais agentes adicionais, tais como os segundos agentes descritos acima. As composições normalmente serão apresentadas como parte de uma composição farmacêutica estéril que normalmente vai incluir um veículo farmaceuticamente aceitável. Esta composição pode ter qualquer forma adequada (dependendo do método desejado para administrá-la a um indivíduo).

Os anticorpos anti-PG podem ser administrados a um indivíduo por uma diversidade de vias tais como as vias oral, transdérmica, subcutânea, intranasal, intravenosa, intramuscular, intraocular, tópica, intratecal e intracerebroventricular. A via de administração mais adequada em qualquer caso dado vai depender do anticorpo particular, do indivíduo, e da natureza e severidade da doença e do estado físico do indivíduo. Os anticorpos podem ser formulados como uma solução aquosa e administrados por injeção subcutânea. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis para uso nesta invenção podem ter uma ampla variedade de formas dependendo, por exemplo, da condição a ser tratada ou da via de administração.

As composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas em formas de dose unitária contendo uma quantidade predeterminada de um anticorpo anti-PG por dose. Tal unidade pode conter por exemplo 5 mg a 5 g, por exemplo 10 mg a 1 g, ou 20 a 50 mg de anticorpo anti-PG por dose unitária. As composições farmacêuticas podem compreender anticorpos anti-PG capazes de se ligarem a mais de um epitopo de PG. Alternativamente, as composições farmacêuticas podem compreender uma combinação de anticorpos anti-PG, cada um deles capaz de se ligar a um epitopo de PG diferente.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser preparadas para armazenamento como formulações liofilizadas ou soluções aquosas por misturação do anticorpo tendo o grau de pureza desejado com veículos, excipientes, ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais tipicamente empregados na técnica (todos eles sendo doravante chamados de veículos), isto é, agentes tamponantes, agentes estabilizantes, preservativos, isotonificantes, detergentes não iônicos, antioxidants, e outros aditi17/62 vos diversos. Vide por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980). Tais aditivos devem ser atóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações desejadas.

Agentes tamponantes ajudam a manter o pH na faixa próxima às condições fisiológicas. Eles podem estar presentes a uma concentração variando de cerca de 2 mM a cerca de 50 mM. Agentes tamponantes adequados para uso com a presente invenção incluem ácidos tanto orgânicos quanto inorgânicos e sais dos mesmos tais como tampões à base de citrato (por exemplo, mistura de citrato monossódico-citrato dissócido, mistura de ácido cítrico-citrato trissódico, mistura de ácido cítrico-citrato monossódico etc.), tampões à base de tartarato (por exemplo, mistura de ácido succínicosuccinato monossódico, mistura de ácido succínico-hidróxido de sódio, mistura de ácido succínico-succinato dissódico etc.), tampões à base de tartarato (por exemplo, mistura de ácido tartárico-tartarato de sódio, mistura de ácido tartárico-tartarato de potássio, mistura de ácido tartárico-hidróxido de sódio etc.), tampões à base de fumarato (por exemplo, mistura de ácido fumárico-fumarato monossódico, mistura de ácido fumárico-fumarato dissódico, mistura de fumarato monossódico-fumarato dissódico etc.), tampões à base de gliconato (por exemplo, mistura de ácido glicônico-gliconato de sódio, mistura de ácido glicônico-hidróxido de sódio, mistura de ácido glicônicogliconato de potássio etc.), tampões à base de oxalato (por exemplo, mistura de ácido oxálico-oxalato de sódio, mistura de ácido oxálico-hidróxido de sódio, mistura de ácido oxálico-oxalato de potássio etc.), tampões à base de lactato (por exemplo, mistura de ácido láctico-lactato de sódio, mistura de ácido láctico-hidróxido de sódio, mistura de ácido láctico-lactato de potássio etc.) e tampões à base de acetato (por exemplo, mistura de ácido acéticoacetato de sódio, mistura de ácido acético-hidróxido de sódio etc.). Adicionalmente, tampões à base de fosfato, tampões à base de histidina e sais de trietilamina tais como Tris podem ser usados.

Conservantes podem ser adicionados para retardar o crescimento microbiano, e podem ser adicionados em quantidades que variam de 0,2%-1% (p/v). Conservantes adequados para uso na presente invenção

18/62 incluem fenol, álcool benzílico, meta-cresol, metil parabeno, propil parabeno, cloreto de octadecildimetilbenzil amônio, halogenetos (por exemplo, cloreto, brometo, e iodeto) de benzalcônio, cloreto de hexametônio, e alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclo-hexanol, e 3-pentanol. Isotonificantes às vezes conhecidos como estabilizantes podem ser adicionados para garantir a isotonicidade das composições líquidas da presente invenção e incluem alcoóis de açúcar poli-hídricos, por exemplo alcoóis de açúcar tri-hídricos ou superiores, tais como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol. Estabilizantes referem-se a uma ampla categoria de excipientes que podem variam de função desde um agente de volume a um aditivo que solubiliza o agente terapêutico ou ajuda a prevenir a desnaturação ou a aderência à parede do recipiente. Estabilizantes típicos podem ser alcoóis de açúcar poli-hídricos (enumerados acima); aminoácidos tais como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutâmico, treonina etc., açúcares orgânicos ou alcoóis de açúcar, tais como lactose, trealose, estaquiose, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol, entre outros, incluindo ciclitóis tais como inositol; polietileno glicol; polímeros de aminoácidos; agentes redutores contendo enxofre, tais como ureia, glutationa, ácido tióctico, tioglicolato de sódio, tioglicerol, a-monotioglicerol e tiossulfato de sódio; polipeptídios de baixo peso molecular (por exemplo, peptídios de 10 resíduos ou menos); proteínas tais como albumina sérica humana, albumina sérica bovina, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tais como polivinilpirrolidona; monossacarídeos, tais como xilose, manose, frutose, glicose; dissacarídeos tais como lactose, maltose, sacarose e trissacarídeos tais como rafinose; e polissacarídeos tais como dextrana. Os estabilizantes podem estar presentes na faixa de 0,1 a 10.000 pesos por parte de peso de proteína ativa.

Tensoativos ou detergentes não iônicos (também conhecidos como agentes umectantes) podem ser adicionados para ajudar a solubilizar o agente terapêutico assim como para proteger a proteína terapêutica contra agregação induzida por agitação, o que também permite que a formu19/62 lação seja exposta à superfície de cisalhamento estressada sem causar desnaturação da proteína. Tensoativos não iônicos adequados incluem polissorbatos (20, 80, etc.), polioxâmeros (184, 188, etc.), polióis do tipo Pluronic, polioxietileno sorbitan monoéteres (IWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.). Os tensoativos não iônicos podem estar presentes em uma faixa de cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml, por exemplo cerca de 0,07 mg/ml a cerca de 0,2 mg/ml.

Excipientes diversos adicionais incluem agentes de volume (por exemplo, amido), agentes quelantes (por exemplo, EDTA), antioxidantes (por exemplo, ácido ascóbico, metionina, vitamina E), e cossolventes.

Os anticorpos anti-PG podem ser administrados isoladamente, como misturas de um ou mais anticorpos anti-PG, em mistura ou em combinação com outros agentes úteis na prevenção de CRC, ou como adjuntivos à terapia para CRC. Exemplos de terapias combinadas e adjuntivas adequadas estão dados abaixo.

Abrangidos pela presente invenção encontram-se kits farmacêuticos contendo os anticorpos anti-PG (incluindo conjugados de anticorpos) da invenção. O kit farmacêutico é uma embalagem compreendendo a composição de anticorpo anti-PG (por exemplo, seja em forma liofilizada seja como uma solução aquosa) e um ou mais dos seguintes.

• Um segundo agente, por exemplo como já descrito acima, • Um dispositivo para administrar uma composição de anticorpo anti-PG, por exemplo umaa caneta, agulha e/ou seringa; e • Água de grau farmacêutico ou tampão para ressuspender o anticorpo se o anticorpo estiver na forma liofilizada.

Cada dose unitária de anticorpo anti-PG pode ser embalada separadamente, e um kit pode conter uma ou mais doses unitárias (por exemplo, duas doses unitárias, três doses unitárias, quatro doses unitárias, cinco doses unitárias, oito doses unitárias, dez doses unitárias, ou mais). Em uma modalidade específica, a uma ou mais doses unitárias são, cada uma delas, acondicionadas em uma seringa ou caneta.

7,4 Dosaqens eficazes e Esquemas de tratamento

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Os anticorpos anti-PG da presente invenção são administrados ao indivíduo em uma quantidade suficiente ou eficaz para proporcionar um benefício terapêutico. No contexto de prevenir câncer gastrointestinal, inclusive CRC, em um indivíduo com predisposição para desenvolver pohpos a5 denomatosos, é possível concluir que houve um benefício terapêutico se um ou mais dos itens a seguir forem atingidos: redução ou falta de aumento no número e/ou tamanho de pólipos em um indivíduo; ausência de tumores malignos, inclusive quando um indivíduo tem ou teve pólipos; redução ou falta de aumento no nível de PG no plasma ou no soro; regressão de um estágio 10 mais avançado de polipose para um estágio menos avançado de pohpose, de acordo com a classificação de Spigelman (por exemplo, regressão do estágio IV para o estágio III, do estágio III para o estágio II, do estágio II para o estágio I); falta de evolução de polipose estágio IV de Spigelman para cancer gastrointestinal. As composições farmacêuticas compreendendo anticor15 pos anti-PG podem ser administradas aos indivíduos (por exemplo, indivíduos humanos) em dosagens eficazes.

A prevenção completa de câncer gastronintestinal, embora desejável, não é uma exigência para que exista algum benefício terapêutico. Na verdade, como a maioria dos pacientes que sofrem de FAP requer cirurgia 20 de vulta até os 25 anos de idade, uma redução da evolução da doença para que seja possível retardar essa cirurgia melhora a qualidade de vida. Além disso, qualquer retardamento do início de câncer gastrointestinal, tal como CRC, proporciona um benefício terapêutico.

Em alguns casos, o benefício terapêutico pode ter correlação com um ou mais pontos de interesse alternativos, como é de conhecimento do especialista na técnica. A título de exemplo e não de limitação, as concentrações de PG no plasma e/ou no soro podem ser medidas em um indivíduo ao longo do tempo, com uma redução nos níveis de PG, ou nível abaixo de um nível limítrofe, por exemplo, abaixo de cerca de 50 pM, 40 pM, 30 30 pM, 20 pM, 10 pM, ou 5 pM, sendo indicativo de benefício terapêutico.

O tamanho e o número de pólipos podem ser medidos por meio de técnicas endoscópicas, tais como colonoscopia, assim como outros me21/62 todos conhecidos pelos especialistas na técnica.

Não é necessária a ligação de todas as PG livres para obter eficácia terapêutica, embora esta possa ser desejável. PG livre significa que a PG está disponível para ser ligada por um anticorpo anti-PG. Ao contrário, reduzir a concentração de PG livre nos pólipos ou em volta deles, sistemicamente, em fluidos corporais particulares, ou em qualquer outra parte do corpo, para um valor mais limitada também pode ser eficaz. Exemplos de tecidos e fluidos corporais nos quais a concentração de PG livre pode ser reduzida pela administração de composições de anticorpos anti-PG incluem, porém sem limitação, amostras de pólipo ou tumor removidas de um paciente, fluido ascítico, fluido de efusões pleurais, fluido cerebrospinhal, linfa, sangue, plasma, soro e outros. A concentração de PG em um ou mais desses tecidos ou fluidos corporais pode ser quantificada por meio de uma técnica de ELISA ou outras técnicas familiares aos especialistas na técnica.

Como é de conhecimento dos especialistas na técnica, a dose de um anticorpo anti-PG pode ser titulada em um paciente para reduzir a concentração de PG livre em um tecido ou fluido corporal de interesse em um período de tempo predeterminado depois da administração de pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90, ou 100%, ou cerca de 5%-10%, cerca de 10%-15%, cerca de 15%-20%, cerca de 20%25%, cerca de 25%-30%, cerca de 30%-35%, cerca de 35%-40%, cerca de 40%-45%, cerca de 45%-50%, cerca de 50%-55%, cerca de 55%-60%, cerca de 60%-65%, cerca de 65%-70%, cerca de 70%-75%, cerca de 75%80%, cerca de 80%-85%, cerca de 85%-90%, ou cerca de 90%-95%, ou uma redução percentual na concentração de PG livre variando entre quaisquer dos valores acima.

A quantidade de anticorpo anti-PG administrada vai depender de diversos falores, que incluem o número e o tamanho de pólipos adenomatosos encontrados no indivíduo, a forma, a via e o sítio de admimstraçao, o esquema de tratamento (por exemplo, se um segundo agente terapêutico e usado), a idade e a condição do indivíduo particular sendo tratado, a sensibilidade do paciente a anticorpos anti-PG. A dosagem apropriada pode ser

22/62 facilmente determinada pelo especialista na técnica. Essencialmente, o médico vai determinar as dosagens apropriadas a serem usadas. Esta dosagem pode ser repetida com a frequência necessária. No caso de serem desenvolvidos efeitos colaterais, a quantidade e/ou a frequência da dosagem pode ser alterada ou reduzida, segundo prática clínica normal. A dosagem apropriada e o esquema de tratamento podem ser estabelecidos por monitoramento do progresso do tratamento usando-se técnicas convencionais conhecidas pelos especialistas na técnica.

Dosagens eficazes podem ser inicialmente estimadas a partir de ensaios in vitro. Por exemplo, pode-se formular uma dose inicial para uso em animais de forma a atingir uma concentração de anticorpo anti-PG no sangue circulante ou soro que é maior ou igual à afinidade de ligação do anticorpo para progastrina medida in vitro. O cálculo das dosagens de forma a atingir tais concentrações no sangue circulante ou soro levando em consideração a biodisponibilidade do anticorpo particular é de conhecimento dos especialistas na técnica. Como guia, o leitor pode consultar Fingí & Woodbury, General Principles in Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Chapter 1, latest edition, Pagamonon Press, e as referências ali citadas.

As dosagens iniciais podem ser estimadas a partir de dados in vivo, tais como modelos animais. Modelos animais úteis para testar a eficácia de compostos para retardar ou prevenir o desenvolvimento de tumores gastrointestinais, inclusive tumores de CRC, são bastante conhecidos na literatura. Adicionalmente, um modelo animal de FAP está descrito nos exemplos abaixo. Os especialistas na técnica podem adaptar de forma rotineira tais informações para determinar as dosagens adequadas para administração a seres humanos.

Em modalidades específicas, uma dose i.v. pode ser determinada para um indivíduo específico medindo-se a concetração sérica ou plasmática de PG do indivíduo algumas vezes por alguns dias a algumas semanas antes do tratamento e calculando-se uma quantidade de anticorpo antiPG que seria de saturação, isto é, uma quantidade que seria suficiente para

23/62 ligar todas as PG. Como será percebido pelos especialistas na técnica, a quantidade de qualquer anticorpo específico necessária para atingir a saturação para uma dada concentração sérica ou plasmática de PG vai depender, em parte, da constante de afinidade do anticorpo particular. Métodos para o cálculo de quantidades de saturaçãos para anticorpos anti-PG de interesse específicos são bastante conhecidos.

Para garantir saturação, uma quantidade que é maior que a quantidade de saturação calculada pode ser administrada, por exemplo, uma quantidade pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mesmo 10 vezes maior que a quantidade de saturação calculada pode ser administrada. Para modos de administração diferentes de i.v., a quantidade pode ser ajustada com base na farmacocinética e na biodisponibilidade, como é bastante conhecido na literatura.

A dose eficaz de um anticorpo anti-PG da invenção pode variar de cerca de 0,001 a cerca de 75 mg/kg por administração única (por exemplo bolo), múltiplas administrações ou administração contínua (por exemplo infusão), ou para atingir uma concentração sérica de 0,01-5000 μg/ml de concentração sérica por administração única, múltiplas administrações ou administração contínua, ou qualquer faixa ou valor eficaz dentro dos limites mencionados dependendo da condição sendo tratada, da via de administração e da idade, peso e condição do indivíduo. Em certas modalidades, cada dose pode variar de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 0,5 mg/kg; cerca de 0,25 mg/kg a cerca de 0,75 mg/kg; cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 1 mg/kg; cerca de 1 mg/kg a cerca de 2 mg/kg; cerca de 1,5 mg/kg a cerca de 2,5 mg/kg; cerca de 2 mg/kg a cerca de 3 mg/kg; cerca de 2,5 mg/kg a cerca de 3,5 mg/kg; cerca de 3 mg/kg a cerca de 4 mg/kg; cerca de 3,5 mg/kg a cerca de

4,5 mg/kg; cerca de 4 mg/kg a cerca de 5 mg/kg; cerca de 5 mg/kg a cerca de 7 mg/kg; cerca de 6 mg/kg a cerca de 8 mg/kg; cerca de 7 mg/kg a cerca de 9 mg/kg; cerca de 8 mg/kg a cerca de 10 mg/kg; cerca de 10 mg/kg a cerca de 15 mg/kg; cerca de 12,5 mg/kg a cerca de 17,5 mg/kg; cerca de 15 mg/kg a cerca de 20 mg/kg; cerca de 17,5 mg/kg a cerca de 22,5 mg/kg; cerca de 20 mg/kg a cerca de 25 mg/kg; cerca de 22,5 mg/kg a cerca de

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27,5 mg/kg; cerca de 25 mg/kg a cerca de 30 mg/kg; cerca de 30 mg/kg a cerca de 40 mg/kg; cerca de 35 mg/kg a cerca de 45 mg/kg; cerca de 40 mg/kg a cerca de 50 mg/kg; cerca de 45 mg/kg a cerca de 55 mg/kg; cerca de 50 mg/kg a cerca de 60 mg/kg; cerca de 55 mg/kg a cerca de 65 mg/kg; cerca de 60 mg/kg a cerca de 70 mg/kg; cerca de 65 mg/kg a cerca de 75 mg/kg. Outras faixas de dosagem também são possíveis.

A quantidade, a frequência, e a duração de administração vão depender de diversos fatores, tais como a idade, o peso, e a doença do paciente. O tratamento anti-PG é indicado para indivíduos nos quais pólipos adenomatosos pré-cancerosos foram detectados e/ou removidos, e para indivíduos diagnosticados com FAP que já manifestaram pólipos. Em seres humanos com FAP, os pólipos geralmente começam a aparecer na segunda décica. O tratamento anti-PG pode ser iniciado antes de os pólipos serem detectados ou quando eles forem detectados em indivíduos com FAP. Para indivíduos com polipose adenomatosa esporádica, o tratamento anti-PG pode ser iniciado quando os pólipos forem detectados. O tratamento anti-PG também pode ser iniciado em indivíduos que já tiveram pelo menos um pólipo removido, e por conseguinte correm um risco aumentado de desenvolver mais pólipos e câncer gastrointestinal, inclusive CRC.

Um esquema de tratamento para administração pode continuar por 2 semanas a indefinidamente. Opcionalmente, o esquema de tratamento proporciona a administração repetida, por exemplo, uma vez ao dia, duas vezes ao dia, a cada dois dias, três dias, cinco dias, uma semana, duas semanas, ou um mês. A administração repetida pode ser na mesma dose ou em uma dose diferente. A administração pode ser repetida uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, sete vezes, oito vezes, nove vezes, dez vezes, ou mais vezes. Uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-PG pode ser administrada como uma dose única ou no curso de um esquema de tratamento. A duração do tratamento anti-PG para pacientes com predisposição para desenvolver polipose adenomatosa é de preferência longo, por exemplo, durante anos, mas pode ser mais curto, por exemplo, um a vários meses, a um ano.

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7.5 Métodos de seleção de pacientes para acompanhamento ou tratamento, e monitoramento do paciente para determinar a eficácia do tratamento

Sem se querer ater à qualquer teoria de operação, acredita-se que níveis elevados de PG estão associados à transformação de pólipos adenomatosos de benignos para malignos. Como mostrado no Exemplo 6 abaixo, indivíduos com múltiplos pólipos mostraram níveis elevados de PG ao passo que indivíduos que não tinham pólipos mostraram níveis baixos ou não detectáveis de PG no soro. Com base nesta observação, os níveis de PG no plasma e/ou no soro podem ser usados para identificar pacientes para acomphamento ou tratamento, assim como para monitorar a efetividade da profilaxia em pacientes que estão fazendo tratamento.

O monitoramento dos níveis de PG em pessoas com FAP ou com histórico de polipose adenomatosa esporádica é útil para identificar indivíduos nos quais acompanhamento por colonoscopia é garantido, assim como pacientes com necessidade de tratamento anti-PG. A conduta padrão para pessoas com predisposição para desenvolver pólipos adenomatosos é endoscopia em um intervalo de 3 a 5 anos. Este intervalo entre os exames pode significar que, em certos indivíduos, diversos pólipos desenvolveramse ou câncer apareceu na época em que a endoscopia de acompanhamento é realizada. Um simples exame de sangue para verificação dos níveis de PG é facilmente feito em intervalos mais frequentes e pode identificar os indivíduos que precisam fazer endoscopia (por exemplo, colonoscopia) mais cedo ou aqueles que são candidatos ao tratamento anti-PG.

Um indivíduo diagnosticado com FAP ou nos quais pólipos já haviam sido detectados pode ser monitorado para determinar o nível, ou a concentração, de PG em um fluido corporal, tal como sangue total, plasma, ou soro, em relação a uma linha basal apropriada. Por conseguinte, o nível de PG é medido em uma amostrado do indivíduo e em seguida comparado com o nível basal de PG.

Onde o nível de PG em um indivíduo com FAP ou com histórico de polipose adenomatosa esporádica fica inalterado em relação a medições anteriores no indivíduo ou igual a um nível basal para a população relevante

26/62 com a qual o indivíduo está sendo comparado, o indivíduo é avaliado como não requerendo acompanhamento adicional. Ao contrário, onde a concentração de PG está acima da linha basal, ou onde se observa que ela aumenta ao longo de um período de tempo no indivíduo, o indivíduo é um candidato a acompanhamento adicional, incluindo, por exemplo, colonoscopia, e a tratamento anti-PG.

Para fins de monitoramento da eficácia do tratamento, os níveis sanguíneos, plasmáticos, ou séricos de PG podem ser medidos no paciente que está fazendo tratamento anti-PG em épocas específicas, e usados como uma indicação da eficácia do tratamento com base no fato de o nível medido estar acima ou abaixo de um nível basal de PG. Esta informação pode ser usada por profissionais de saúde para decidir se devem continuar com a administração de anticorpo anti-PG ou se devem modificar o tratamento. Estes métodos podem ser usados para monitorar o tratamento anti-PG, usado isolado, ou em combinação com outros tratamentos, como já descrito acima.

Em algumas modalidades dos métodos, o nível de PG em um ou mais fluidos corporais, tais como sangue total, plasma, sero, de um paciente fazendo tratamento com anticorpo anti-PG pode ser medido e então comparado com um nível basal. Uma redução na concentração ao longo do tempo, e/ou um nível medido abaixo de um valor limítrofe em um ponto particular no tempo, é indicativa de eficácia. Um aumento na concentração ao longo do tempo e/ou um nível de PG acima da linha basal é indicativo de falta de eficácia do tratamento. Tipicamente, nível de PG é a concentração de PG na amostra, expressa em quantidades molares (M) ou moles/litro (mol/litro).

O nível basal pode ser um único valor ou uma faixa de valores. A linha basal pode basear-se em uma ou mais medições feitas no paciente ou pode basear-se em medições da PG em amostras de uma população de indivíduos. Em algumas modalidades dos métodos, a linha basal é um nível de PG do mesmo paciente, medida em um ou mais intervalos, por exemplo, antes do início do tratamento anti-PG, durante o tratamento, ou depois que o tratamento tiver sido interrompido. Em algumas modalidades, a linha basal pode ser um nível médio de PG em uma população de indivíduos com carac27/62 terísticas semelhantes àquelas do indivíduo que está sendo monitorado. Tais características podem incluir, sexo, idade, localização da mutação no gene APC, estágio na classificação Spigelman, histórico de cirurgia, tratamento anti-PG, ou outro tratamento, mas estão necessariamente limitadas a estes fatores. Em algumas modalidades, a linha basal é um nível específico de PG, tal como cerca de 50 pM, cerca de 40 pM, cerca de 30 pM, cerca de 20 pM, cerca de 10 pM, cerca de 5 pM, cerca de 2 pM, cerca de 1 pM, ou ainda mais baixo. Em algumas modalidades, a linha basal é uma faixa.

Os níveis de PG podem ser medidos por ténicas familiares aos especialistas na técnica, tais como, porém sem limitação, RIA e ELISA. Em uma modalidade específica, os níveis de PG podem ser medidos por ELISA do tipo sanduíche com um anticorpo anti-PG atingindo o terminal N da progastrina e um segundo anticorpo anti-PG atingindo o terminal C da progastrina. Anticorpos anti-PG N- e C-terminais exemplificativos úteis para tal ensaio do tipo sanduíche estão descritos em uma seção mais adiante. Em tal ensaio, é preparada uma superfície, tal como os poços de uma placa de 96 poços, à qual uma quantidade conhecida de um primeiro anticorpo anti-PG N-terminal ou C-terminal, de captura, é ligada. Uma amostra de teste é então aplicada à superfície seguida por um período de incubação. A superfície é então lavada e uma solução contendo um segundo anticorpo anti-PG, de detecção, é aplicada, onde o anticorpo de detecção liga um epitopo diferente de PG (por exemplo, se o anticorpo de captura for um anticorpo antiPG C-terminal, um anticorpo anti-PG N-terminal é usado como o anticorpo de detecção, e vice-versa). Os níveis de PG são então medidos diretamente (se, por exemplo, o anticorpo de detecção estiver conjugado a um marcador detectável) ou indiretamente (através de um anticorpo secundário marcado que liga o anticorpo anti-PG de detecção). Para este ensaio, os anticorpos devem ser usados em excesso para que todas as PGs sejam ligadas e quantificadas. Um ensaio do tipo sanduíche específico para medir níveis plasmáticos ou séricos de PG está dado no Exemplo 1.

Várias medições em intervalos diferentes foram feitas, e então representadas graficamente para determinar se havia alguma tendência. Em

28/62 um exemplo não limitativo, os níveis de PG podem ser determinados em intervalos semanais, mensais, ou anuais enquanto o paciente está sendo medicado com anticorpos anti-PG. Outros intervalos também são possíveis.

Em uma modalidade envolvendo uma rodada de terapia usando um anticorpo anti-PG, uma ou mais medições também podem ser feitas durante a terapia para que o efeito dos anticorpos nos níveis de PG possa ser estimado. Em outras dessas modalidades, onde anticorpos anti-PG residuais estão presentes em uma paciente durante a coleta de amostra, os dados podem mostrar uma redução nos níveis de PG, devido ao sequestro de PG pelos anticorpos, acompanhada por um aumento, na medida em que este efeito diminui, seguido por um subequente declínio, se o tratamento for eficaz. Em ainda outras modalidades, medições pós-terapia podem ser feitas depois de ser estimado que os anticorpos anti-PG foram eliminados do paciente para que a ligação de PG por tais anticorpos não afete a precisão da medição da concentração de PG.

Como comer geralmente aumenta a síntese e a secreção de gastrina, esse ato também pode causar aumentos transitórios nos níveis sanguíneos de PG, que podem interferir na precisão de medição dos níveis de PG nos pacientes sendo monitorados. Para evitar este efeito, particularmente onde deve ser determinada a concentração de PG em amostras de sangue, as amostras devem ser coletadas do paciente depois de um período de jejum.

7.6 Anticorpos Anti-PG

Anticorpos úteis nos métodos divulgados nesta invenção são aqueles que especificamente ligam a progastrina sobre outros produtos do gene gastrina. Com referência à figura 1, o gene gastrina humana é transladado para um polipeptídio de 101 aminoácidos, denominado pre-progastrina, que contém uma sequência sinal (sublinhada) que é clivada, dando origem à progastrina humana, um polipeptídio de 80 aminoácidos. A progastrina, por sua vez, é clivada para gerar um produto de 34 aminoácidos, correspondendo em sequência aos resíduos 38-71 da progastrina, que é então prolongado em seu terminal carbóxi com um resíduo glicina, gerando G34 prolongado

29/62 com glicina (G34-Gly). Um subproduto desta divagem um peptídio de 6 aminoácidos, chamado peptídio flanqueador C-terminal, ou CTFP, que corresponde em sequência aos resíduos 75-80 da progastrina. G34-Gly é então clivado para gerar um polipeptídio de 17 peptídios correspondendo em sequência aos resíduos 55-71 da progastrina e indicado por G17-Gly. Remoção das glicinas C-terminais de G34-Gly e G17-Gly, seguida por amidação C-terminal, dá G34 e G17, respectivamente, ambos sendo amidados no terminal C.

Conforme usado neste relatório, um anticorpo é altamente específico para hPG ou liga de forma altamente específica a hPG se ele se ligar à progastrina de comprimento integral mas não se ligar à CTFP, à gastrina amidada, ou à gastrina prolongada com glicina, e é específico para hPG ou liga especificamente a hPG se ele exibir uma ligação pelo menos 5 vezes maior de hPG do que o CTPF e os outros produtos do gene gastrina, medida em ensaios de ligação tradicionais. Um ensaio ELISA específico que pode ser usado para avaliar a especificidade de um anticorpo anti-hPG particular está dado no Exemplo 2.

Tais anticorpos anti-hPG altamente específicos e/ou específicos (doravante denominados anticorpos anti-hPG) podem ser policlonais (antihPG PAbs) ou monoclonais (anti-hPG MAbs), embora para usos terapêuticos e, em alguns casos, para usos diagnósticos ou outros usos in vitro, anticorpos monoclonais sejam preferidos.

O epitopo ligado pelos anticorpos anti-hPG não é crítico. Anticorpos anti-hPG úteis podem ligar uma região N-terminal da hPG, uma região C-terminal da hPG, ou uma região diferente da hPG. Recentemente, foi descoberto que, pelo menos para anticorpos monoclonais anti-hPG, a seleção do antígeno usado para gerar os anticorpos anti-hPG pode ser importante (vide Pedido Internacional N° PCT/EP2010/006329 depositado em 15 de outrubro de 2010 e pedido US N° 12/906.041 depositado em 15 de outrubro de 2010, cujos relatórios e anticorpos anti-hPG especificamente divulgados estão aqui incorporados a título de referência; doravante denominados pedidos '329 e Ό41, respectivamente). Como divulgado nos pedidos '329 e Ό41,

30/62 nem todos os antígenos derivados de hPG estimulam a produção de anticorpos monoclonais que ligam especificamente a hPG em condições fisiológicas. Na verdade, certos antígenos que foram usados para gerar com sucesso anticorpos policlonais anti-hPG, tais como hPG recombinante de comprimento integral (vide, por exemplo, a patente WO 08/076454 concedida a Singh) e um peptídio correspondendo aos dez últimos aminoácidos da extremidade C-terminal de hPG (vide patente WO 07/135542 concedida a Hollande et al.) não foram capazes de gerar anticorpos monoclonais. Como observado nos pedidos '329 e Ό41, foram identificadas sequências N-terminais e C-terminais antigênicas dentro da sequência de hPG que podem ser usadas para gerar anticorpos monoclonais que ligam especificamente a hPG. Curiosamente, a sequência antigênica não precisa ser limitada a regiões da sequência de hPG que são únicas para a mesma. Antígenos de peptídios tendo regiões de sequência em comum com outros produtos do gene gastrina, por exemplo, G17, G34 e CTFP, produzem anticorpos monoclonais que não ligam apenas a hPG, mas que ligam especificamente a mesma.

Anticorpos anti-hPG obteníveis usando-se um antígeno de peptídio tendo uma sequência correspondente a uma região N-terminal de hPG e/ou que liga uma região N-terminal de hPG são denominados anticorpos anti-PG N-terminais. Uma região antigênica exemplificativa específica de hPG que pode ser usada para construir um imunógeno adequado para obtenção de anticorpos policlonais e monoclonais específicos para hPG corresponde aos resíduos 1 a 14 da hPG: SWKPRSQQPDAPLG (SEQ ID N°: 25). Imunógenos exemplificativos úteis para obtenção de anticorpos antihPG N-terminais, assim como de sequências de CDR e de V_H e V_L de anticorpos monoclonais anti-hPG N-terminais obtidos com esses imunógenos exemplificativos, estão dados na TABELA 2A, abaixo, e nas seções de Exemplos:

31/62

CM

LU CO <

Sequências de VH e VL Humanizadas (projetadas)

V- CM~ CM CM o' o’ z z Q Q σ σ LU LU co co CO CO

co ν' CM CM o' o’ z z Q Q ο σ ui lu co co xr -sr i > -C

ν' co co io CO CO CO 00 o o o o z z z z Q Q Q O σ σ σ σ LU LU LU LU co co co co ro η ο π CD CD CD CD > > > > x: x: xr -c

Sequências de VH e VL Murinas

cm co Ó Z -Z- Q Q σ σ LU LU co co co co í Í

ν' ίο τ— ο’ o' ζ ζ Ο Q σ σ LU LU co co Ε Ε

io co co o’ o' z z Q Q σ σ LU LU CO CO CO CD i Ε E

Sequências de CDR Murina

VH CDR 1.3 GYIFTSYW (SEQ ID N°: 1) VH CDR 2.3 FYPGNSDS (SEQ ID N°: 2) VH CDR 3.3 TRRDSPQY (SEQ ID N°: 3) VL CDR 1.3 QSIVHSNGNTY (SEQ ID N°: 4) VL CDR 2.3 KVS (SEQ ID N°: 5) VL CDR 3.3 FQGSHVPFT (SEQ ID N°: 6)

VH CDR 1.4 GYTFSSSW (SEQ ID Ν°: 7) VH CDR 2.4 FLPGSGST (SEQ ID Ν°: 8) VH CDR 3.4 ATDGNYDW- (SEQ ID N°: 9) FAY VL CDR 1.4 QSLVHSSGVTY (SEQ ID N°: 10) VL CDR 2.4 KVS (SEQ ID N°: 5) VL CDR 3.4 SQSTHVPPT (SEQ ID N°: 11)

VH CDR 1.16 GYTFTSYY (SEQ ID N°: 39) VH CDR 2.16 INPSNGGT (SEQ ID N°: 43) VH CDR 3.16 TRGGYYPFDY (SEQ ID N°: 47) VL CDR 1.16 QSLLDSDGKTY (SEQ ID N°: 50)

MAb

MAb1

MAb2 |

MAb3 |

| MAb4 I

MAb15

CD

Hibridoma (Depósito #)

43B9G11 I

WE5H2G7 |

o O CO LO CD CO

20D2C3G2

1E9A4A4(I- 4376)

| 1E9D9B6

Imunógeno

z

z

CM z

CM z

CM z

CM z

32/62

TABELA 2A _______________________________Anticorpos Monoclonais Anti-hPG N-Terminais__________________________________________	Sequências de VH e VL Humanizadas (projetadas)	CO 00 0 o z z Q Q ο σ LU LU ω ω -—χ ----- JD ο to co j j xz xz			ont o' o CD CD CD cd σ» CD ο ο o o o o z z z z z z Q Q Q O Q Q COO O O O LU LU LU LU LU LU ω ω ω ω ω ω tn ό ο roxo CD CD CD CD CD CD XXX > > x r £ r		Imunógeno N1 = SWKPRSQQPDAPLG-Ahx-Cys-BSA, também representado por (SEQ ID N°: 25)-Ahx-Cys-BSA Imunógeno N2 = SWKPRSQQPDAPLG-Ahx-Cys-KLH, também representado por (SEQ ID N°: 25)-Ahx-Cys-KLH
Sequências de VH e VL Murinas				<N~ CD CD CD o o z z Q Q O O LU LU ω ω Z .z CD CD T- T— E E
Sequências de CDR Murina	VL CDR 2.16 LVS (SEQ ID N°: 53) VL CDR 3.16 WQGTHSPYT (SEQ ID N°: 57)			VH CDR 1.19 GYSITSDYA (SEQ ID N°: 40) VH CDR 2.19 ISFSGYT (SEQ ID N°: 44) VH CDR 3.19 AREVNYGDS- (SEQ ID N°: 48) YHFDY VL CDR 1.19 SQHRTYT (SEQ ID N°: 51) VL CDR 2.19 VKKDGSH (SEQ ID N°: 54) VL CDR 3.19 GVG- (SEQ ID N°: 58) DAIKGQSVFV
MAb			x—	CO <	CD XI <						MAb20
Hibridoma (Depósito #)			1C8D10F5 |	1A7C3F11I	1B3B4F11						| 1C11F5E8
Imunógeno			I N2 I	1 N2 I	CM z						CXI z

Na TABELA 2A, todas as sequências aminoacídicas estão representadas usando a sequência N-»C convencional. Para cada imunógeno, o peptídio progastrina foi sintetizado com um ligador C-terminal de um resíduo ácido amino-hexanoico (Ahx) seguido por um resíduo cisteína (Cys), que foi então conjugado a um veículo de albumina sérica bovina (BSA) ou de hemocianina de lapa com perfuração (KLH) via o resíduo ligador Cys.

33/62

Os anticorpos anti-hPG obteníveis usando-se um antígeno de peptídio tendo uma sequência correspondente a uma região C-terminal de hPG, e/ou que liga uma região C-terminal de hPG, são chamados neste relatório de anticorpos anti-hPG C-terminais. Uma região antigênica exemplifi5 cativa específica que pode ser usada para construir um imunógeno útil para a obtenção de anticorpos policlonais e monoclonais anti-hPG C-terminais corresponde aos resíduos 55 a 80 de hPG: QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN (SEQ ID N°: 27). Imunógenos exemplificativos incluindo esse antígeno útil para a obtenção de anticorpos anti-hPG C-terminais, assim co10 mo sequências de CDR e de V_H e V_L de anticorpos monoclonais anti-hPG Cterminais obtidos com esses imunógenos exemplificativos, estão mostrados na TABELA 2B, abaixo, e na seção Exemplos.

34/62

35/62

LH) ou de toxina de difteria (DT) via o resíduo ligador Cys.

36/62

Os epitopos específicos ligados pelos anticorpos monoclonais anti-hPG exemplificativos MAb1-MAb23 mostrados nas Tabelas 2A e 2B foram mapeados usando-se a técnica SPOT e varredura de alanina, conforme descrito em Laune et al., 2002, J. Immunol. Methods 267:53-70 e Laune, 1997, J. Biol. Chem. 272:30937-30944, respectivamente (vide também o Exemplo 6 do pedido '329).

Na técnica SPOT, 15 sequências aminoacídicas de peptídios transpondo um epitopo putativo são geradas e colocadas sobre uma membrana de nitrocelulose que é então examinada com o anticorpo de teste para determinar a sequência de epitopo mínima reconhecida pelo anticorpo. A varredura de alanina é usada para determinar resíduos em um epitopo que são críticos para a ligação ao anticorpo. Cada resíduo em um epitopo putativo é mutado, um por um, para uma alanina, e os peptídios contendo alanina são então examinados com o anticorpo de teste.

Para os anticorpos monoclonais anti-hPG N-terminais MAbs1-4 e 15-20, os epitopos compreendem pelo menos as seguintes sequências: DAPLG (SEQ ID N°: 28), PDAPLG (SEQ ID N°: 29), PRSQQPD (SEQ ID N°: 30), WKPRSQQPD (SEQ ID N°: 31), ou WKPRSQQPDAPLG (SEQ ID N°: 32), mostradas na TABELA 3A abaixo.

TABELA 3A
MAb#	Antígeno de peptídio PG: SWKPRSQQPDAPLG	SEQ ID N°
MAb2	WKPRSQQPDAPLG	32
MAb4	WKPRSQQPDAPLG	32
MAb1	PDAPLG	29
MAb3	DAPLG	28
MAb 17	WKPRSQQPD	31
MAb 18	WKPRSQQPD	31
MAb 19	WKPRSQQPD	31
MAb20	WKPRSQQPD	31
MAb 15	PRSQQPD	30
MAb 16	PRSQQPD	30

Para os anticorpos monoclonais anti-hPG C-terminais MAbs5-7,

37/62

9-12, 14 e 21-23, os epitopos compreendem pelo menos as seguintes sequências: FGRR (SEQ ID N°: 33), MDFGR (SEQ ID N°: 34), AEDEN (SEQ ID N°: 35), e GWMDFGRR (SEQ ID N°: 36), mostradas na TABELA 3B, aaaixo. ___________________________________________________________.

TABELA 3B
MAb#	Antígeno de peptídio PG: QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN	SEQ ID N°
MAb 14	GWMDFGRR	36
MAb 11	MDFGR	34
MAb5	FGRR	33
MAb6	FGRR	33
MAb7	FGRR	33
MAb9	FGRR	33
MAb 10	FGRR..E	33
MAb 12	FGRR	33
MAb23	AEDEN	35

As experiências de mapeamento de epitopos revelam que MAb2 e MAb4 anti-hPG ligam o mesmo epitopo; MAb1 e MAb3 anti-hPG ligam aproximadamente o mesmo epitopo; MAb17, MAb18, MAb19, e MAb20 ligam aproximadamente o mesmo epitopo; MAb15 e MAb16 ligam aproximadamente o mesmo epitopo; MAb5, MAb6, MAb7, MAb9, e MAb12 anti-hPG ligam o mesmo epitopo e ligam aproximadamente o mesmo epitopo que MAb10 anti-hPG; e MAb11 e MAb14 anti-hPG ligam aproximadamente o mesmo epitopo.

Modalidades específicas de anticorpos anti-PG N-terminais úteis nos métodos e kits descritos nesta invenção incluem anticorpos que ligam um epitopo que inclui os resíduos 10 a 14 de hPG (SEQ ID N°: 28), os resíduos 9 a 14 de hPG (SEQ ID N°: 29), os resíduos 4 a 10 de hPG (SEQ ID N°: 30), os resíduos 2 a 10 de hPG (SEQ ID N°: 31), ou os resíduos 2 a 14 de hPG (SEQ ID N°: 32).

Modalidades específicas de anticorpos anti-PG C-terminais úteis nos métodos e kits descritos nesta invenção incluem anticorpos que ligam um epitopo que inclui os resíduos 71 a 74 de hPG (SEQ ID N°: 33), os resí

38/62 duos 69 a 73 de hPG (SEQ ID N°: 34), os resíduos 76 a 80 de hPG (SEQ ID N°: 35), ou os resíduos 67 a 74 de hPG (SEQ ID N°: 36).

Anticorpos anti-hPG N-terminais e C-terminais úteis nos métodos e kits divulgados nesta invenção além daqueles mostrados nas Tabelas 2A e 2B podem ser identificados em ensaios de ligação competitiva com os MAbs 1-23 exemplificativos, ou com outros anticorpos de referência que ligam epitopos N- ou C- terminais, como será descrito mais detalhadamente em uma seção posterior.

Como também relatado nos pedidos '329 e '041, nem todos os anticorpos anti-hPG, mesmo aqueles que exibem um alto grau de especificidade e afinidade para hPG, podem neutralizar a atividade biológica da hPG. Por exemplo, embora o MAb14 anti-hPG ligue a hPG com um K_D de cerca de 6 pM, ele não inibiu o crescimento de células de câncer colorretal em um ensaio in vitro, ao passo que outros anticorpos monoclonais anti-hPG exibiram atividade inibitória significativa (vide, por exemplo, o Exemplo 7 do pedido '329). Embora anticorpos tanto não neutralizadores quanto neutralizadores que ligam especificamente a hPG sejam úteis para os vários métodos diagnósticos e de monitoramento descritos nesta invenção, anticorpos antihPG úteis para métodos terapêuticos devem exibir atividade neutralizadora.

Conforme usado neste relatório, um anticorpo anti-hPG neutralizador é um anticorpo anti-hPG que produz uma redução estatisticamente significativo no número de LS174T vivas em uma amostra de teste tratada com o anticorpo anti-hPG em relação a uma amostra de controle tratada com um anticorpo inespecífico. Um ensaio específico para avaliar a capacidade de qualquer anticorpo anti-hPG particular para neutralizar a hPG está descrito no Exemplo 3. Os anticorpos anti-hPG que exibem uma redução de pelo menos cerca de 50% no número de células vivas neste ensaio são seguramente especialmente úteis nos métodos de prevenção de câncer gastrointestinal, inclusive CRC, embora também se espere que anticorpos antihPG exibindo níveis mais baixos de atividade neutralizadora, por exemplo, uma redução estatisticamente significativa de 40%, 30%, 20%, 15%, ou até mesmos de 10%, no número de células vivas neste ensaio, proporcionem

39/62 benefícios terapêuticos.

Por conseguinte, em algumas modalidades, por exemplo modalidades terapêuticas, os anticorpos anti-hPG úteis são neutralizadores. Como divulgado nos pedidos '329 e '041, a capacidade de um anticorpo monoclo5 nal anti-hPG não é epitopo-dependente, uma vez que anticorpos monoclonais anti-hPG tanto N-terminais quanto C-terminais exibiram atividade neutralizadora nos ensaios com células de câncer colorretal contendo uma mutação no gene APC. Assim sendo, em algumas modalidades específicas, os anticorpos anti-hPG neutralizadores são anticorpos anti-hPG neutralizadores 10 N-terminais. Em outras modalidades, os anticorpos anti-hPG neutralizadores são anticorpos anti-hPG neutralizadores C-terminais.

A afinidade de qualquer anticorpo anti-hPG específico não é crítica. No entanto, para alguns usos, anticorpos exibindo afinidades de pelo menos cerca de 1 μΜ podem ser preferidos. Para usos terapêuticos, uma 15 afinidade de pelo menos cerca de 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM, ou ainda maior, pode ser desejável. As afinidades medidas dos anticorpos monoclonais anti-hPG identificados nas Tabelas 2A e 2B variam de 10~⁶ a 10~¹² M, como observado na Tabela 4, abaixo:

TABELA 4
MAb#	Afinidade (KD medido)
MAb1	2,5 μΜ (2,5 x10'6M)
MAb2	185 nM (1,85 x10‘7M)
MAb3	6,4 nM (6,4 x10‘9M)
MAb4	3,5 nM (3,5 x10’9M)
MAb5	13 pM (1,30 x10'11M)
MAb6	0,6 nM (6,38 x10‘1°M)
MAb7	58 pM (5,84 χ10'11 M)
MAb8	0,1 nM (1,08 x10'1°M)
MAb 10	3,6 nM (3,62 x10’9M)
MAb 11	0,3 nM (3,12 x10’1°M)
MAb 12	0,4 nM (4,43 x10‘1°M)
MAb 13	0,6 nM (6,12 x101°M)

40/62

TABELA 4
MAb14	6,8 pM (6,86 x10'12M)
MAb15	0,2 nM (2,11 x10‘10M)
MAb16	0,2 nM (2,78 x10’10M)
MAb17	8,3 nM (8,29x10'9M)
MAb18	1,2 nM (1,24x10'9M)
MAb19	0,7 nM (7,79 x10‘1°M)
MAb20	0,2 nM (2,47 x10‘1°M)
MAb21	3,9 nM (3,90 x10'9M)
MAb22	5 nM (4,94 x10‘9M)
MAb23	0,4 μΜ (3,99 x107M)

Um anticorpo monoclonal anti-PG tendo uma afinidade especialmente adequada para uma aplicação particular desejada pode ser facilmente selecionado dentre esses, ou pode ser gerado ou desenhado usandose os vários imunógenos, sequências de regiões determinantes de complementaridade (CDR), sequências das cadeias pesadas variáveis (V_H) e das cadeias leves variáveis (V_L) dos anticorpos anti-hPG descritos nesta invenção. A afinidade de qualquer anticorpo monoclonal anti-PG particular pode ser determinada por meio de técnicas bastante conhecidas na literatura ou descritas nesta invenção, tais como por exemplo, ELISA, calorimetria de titulação isotérmica (ITC), BIAcore, ou ensaios de polarização fluorescente. Um ensaio específico está mostrado no Exemplo 4.

Como observados nas Tabelas 2A e 2B, divsersos anticorpos monoclonais anti-hPG N-terminais e C-terminais foram identificados. Todos esses anticorpos são específicos para hPG, e, à exceção do MAb14, todos eles exibiram atividade neutralizadora em testes com células de câncer colorretal. Vários dos hibridomas úteis para obtenção dos anticorpos foram depositados em 6 de outubro de 2010 junto ao Collection Nationale de Cultures de Microorganisms (CNCM) nos termos do Tratado de Budapeste. Os nomes dados aos hibridomas produtores de MAbs1-23 anti-hPG e os números de registro de depósito desses hibridomas depositados estão mostrados nas Tabelas 2A e 2B. Além disso, para vários dos anticorpos, as sequências aminoacídicas de suas cadeias pesadas variáveis (V_H), cadeias leves variá

41/62 veis (V_L), regiões determinantes de complementaridade de V_L (CDRs) e CDRs de Vh foram determinadas. Essas sequências aminoacídicas, e a nomenclatura abreviada usada para designar as mesmas em todo este relatório, também estão apresentadas nas Tabelas 2A e 2B. Em resumo, domínios variáveis das cadeias pesadas e levadas de murinos são indicados neste relatório por mV_H e mV_L seguidos pelo número do anticorpo monoclonal correspondente, por exemplo mVH.3 e mV|_.3 para as cadeias leves variáveis e cadeias pesadas variáveis do MAb3 anti-hPG, respectivamente. Similarmente, os domínios variáveis das cadeias pesadas e leves de humanos são indicados neste relatório por hV_H e hV_L seguidos pelo número do anticorpo monoclonal correspondente. As três CDRs de cadeias pesadas variáveis e as três CDRs de cadeias leves variáveis são indicadas por V_H CDR 1,2, ou 3, e V_lCDR 1, 2, ou 3, respectivamente, seguidas pelo número do anticorpo monoclonal anti-hPG específico. Por exemplo, V_H CDR 1 de MAb3 é designado Vh CDR 1.3 e V_L CDR 1 de MAb3 é designado V_L CDR 1.3. V_H CDR 2 de MAb3 é designado Vh CDR 2.3, e Vl CDR 2 de MAb3 é designado Vl CDR 2.3.

Acredita-se que CDRs e/ou cadeias V_H e V_L correspondentes de anticorpos monoclonais anti-hPG que ligam aproximadamente os mesmos epitopos podem ser intercambiados para produzir novos anticorpos monoclonais anti-hPG úteis nos métodos e kits descritos nesta invenção. Por exemplo, como observado acima, os anticorpos monoclonais anti-hPG exemplificativos MAb5 e MAb6 ligam o mesmo epitopo. É possível desenhar um anticorpo monoclonal anti-hPG que inclua, em sua cadeia V_L, várias combinações das CDRs de V_L desses dois anticorpos, e/ou em sua cadeia V_H várias combinações das CDRs de V_H desses dois anticorpos. Como um exemplo não limitative específico para ilustrar as várias combinações possíveis, tal anticorpo poderia incluir em sua cadeia Vl, CDRs 1 e 2 de MAb5 (Vl CDR 1.5 e V_L CDR 2.5, respectivamente) e CDR 3 de MAb6 (V_L CDR 3.6), e em sua cadeia Vh, CDR 1 de MAb6 (Vh CDR 1.6) e CDRs 2 e 3 de MAb5 (Vh CDR 2,5 e V_H CDR 3,5, respectivamente). Sequências aminoacídicas de CDRs de anticorpos (também chamadas de regiões hipervariáveis) produzi

42/62 das pelos hibridomas que foram depositados podem ser obtidas por meios convencionais.

Como se sabe na técnica, a posição/fronteira do aminoácido delineando uma região hipervariável de um anticorpo pode variar, dependendo do contexto e das várias definições conhecidas na literatura. Algumas posições dentro de um domínio variável podem ser vistas como posições hipervariáveis híbridas no sentido de que essas posições podem ser consideradas dentro de uma região hipervariável segundo um grupo de critérios embora sejam consideradas fora de uma região hipervariável segundo um outro grupo de critérios. Uma ou mais dessas posições também podem ser encontradas em regiões hipervariáveis prolongadas. Os anticorpos anti-PG descritos nesta invenção podem conter modificações nessas regiões hipervariáveis híbridas. Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve nativas compreendem, cada um, quatro regiões FR, adotando amplamente a configuração de uma lâmina β, conectada por três CDRs, que formam alças conectando a estrutura de lâmina β, e em alguns casos fazendo parte da mesma. As CDRs em cada cadeia são mantidas bastante próximas pelas regiões FR na ordem FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação alvo dos anticorpos (vide Kabat et al., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md.). Conforme usado neste relatório, a numeração dos resíduos aminoacídicos da imunoglobulina é feita de acordo com o sistema de numeração de resíduos aminoacídicos de imunoglobulina de Kabat et al., a menos que de outra forma indicado.

Com referência à TABELA 2A, modalidades específicas de anticorpos anti-hPG N-terminais úteis nos métodos e kits descritos neste relatório incluem, porém sem limitação, os seguintes:

(a) anticorpos tendo CDRs de V_L que correspondem em sequência às CDRs de V_L de MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, MAb15, MAb16, MAb17, MAb18, MAb19 ou MAb20, e CDRs de V_H que correspondem em sequência às CDRs de V_H de MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, MAb15, MAb16, MAb17, MAb18, MAb19 ou MAb20;

43/62 (b) anticorpos tendo CDRs de CDRs de V_L e V_H que correspondem em sequência às CDRs de Vl e Vh de MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, MAb15, MAb16, MAb17, MAb18, MAb19 ou MAb20;

(c) anticorpos nos quais:

(i) Vl CDR 1 é selecionada dentre QSIVHSNGNTY (Vl CDR 1.3; SEQ ID N°: 4), QSLVHSSGVTY (V_L CDR 1.4; SEQ ID N°: 10), QSLLDSDGKTY (V_L CDR 1.16; SEQ ID N°: 50), e SQHRTYT (V_L CDR 1.19; SEQ ID N°: 51);

(ii) V_L CDR 2 é selecionada dentre KVS (V_L CDR 2.3 ou V_L CDR 2.4; SEQ ID N°: 5), LVS (V_L CDR 2.16; SEQ ID N°: 53), e VKKDGSH (V_L CDR 2.19; SEQ ID N°: 54);

(iii) V_L CDR 3 é selecionada dentre FQGSHVPFT (V_L CDR 3.3; SEQ ID N°: 6), SQSTHVPPT (V_L CDR 3.4; SEQ ID N°: 11), WQGTHSPYT (V_L CDR 3.16; SEQ ID N°: 57), e GVGDAIKGQSVFV (V_L CDR 3.19; SEQ ID N°: 58);

(iv) V_H CDR 1 é selecionada dentre GYIFTSYW (V_H CDR 1.3; SEQ ID N°: 1), GYTFSSSW (V_H CDR 1.4; SEQ ID N°: 7), GYTFTSYY (V_H CDR 1.16; SEQ ID N°: 39), e GYSITSDYA (V_H CDR 1.19; SEQ ID N°: 40);

(v) V_H CDR 2 é selecionada dentre FYPGNSDS (V_H CDR 2.3; SEQ ID N°: 2), FLPGSGST (V_H CDR 2.4; SEQ ID N°: 8), INPSNGGT (V_H CDR 2.16; SEQ ID N°: 43), e ISFSGYT (V_H CDR 2.19; SEQ ID N°: 44); e (vi) Vh CDR 3 é selecionada dentre TRRDSPQY (V_H CDR 3.3; SEQ ID N°: 3), ATDGNYDWFAY (V_H CDR 3.4 SEQ ID N°: 9), TRGGYYPFDY (V_H CDR 3.16; SEQ ID N°: 47), e AREVNYGDSYHFDY (V_H CDR 3.19; SEQ ID N°: 48);

(d) anticorpos tendo uma V_L que corresponde em sequência à V_L de MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, MAb15, MAb16, MAb17, MAb18, MAb19 ou MAb20 e uma V_H que corresponde em sequência à V_H de MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, MAb15, MAb16, MAb17, MAb18, MAb19 ou MAb20; e (e) anticorpos tendo uma V_L e uma V_H que correspondem em sequência à Vl e Vh de MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, MAb15, MAb16, MAb17, MAb18, MAb19 ou MAb20.

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Com referência à TABELA 2B, modalidades específicas de anticorpos anti-hPG C-terminais úteis nos métodos e kits descritos neste relatório incluem, porém sem limitação, os seguintes:

(a) anticorpos tendo CDRs de V_L que correspondem em sequência às CDRs de V_L de MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAb10, MAb11, MAb12, MAb13, MAb14, MAb21, MAb22or MAb23 e CDRs de V_H que correspondem em sequência às CDRs de Vh de MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAb10, MAb11, MAb12, MAb13, MAb14, MAb21, MAb22 ou MAb23;

(b) anticorpos tendo CDRs de V_L e CDRs de V_H que correspondem em sequência às CDRs de Vl e Vh de MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAb10, MAb11, MAb12, MAb13, MAb14, MAb21, MAb22 ou MAb23;

(c) anticorpos nos quais:

(i) Vl CDR 1 é selecionada dentre KSLRHTKGITF (Vl CDR 1.8; SEQ ID N°: 49) e QSLLDSDGKTY (V_L CDR 1.13; SEQ ID N°: 50);

(ii) Vl CDR 2 é selecionada dentre QMS (Vl CDR 2.8; SEQ ID N°: 52) e LVS (V_L CDR 2.13; SEQ ID N°: 53);

(iii) V_L CDR 3 é selecionada dentre AQNLELPLT (V_L CDR 3.8; SEQ ID N°: 55) e WQGTHFPQT (V_L CDR 3.13; SEQ ID N°: 56);

(iv) V_H CDR 1 é selecionada dentre GFTFTTYA (V_H CDR 1.8; SEQ ID N°: 37) e GFIFSSYG (V_H CDR 1.13; SEQ ID N°: 38);

(v) V_H CDR 2 é selecionada dentre ISSGGTYT (V_H CDR 2.8; SEQ ID N°: 41) e INTFGDRT (V_H CDR 2.13; SEQ ID N°: 42); e (vi) Vh CDR 3 é selecionada dentre ATQGNYSLDF (Vh CDR 3.8; SEQ ID N°: 45) e ARGTGTY (V_H CDR 3.13; SEQ ID N°: 46);

(d) anticorpos tendo uma V_L que corresponde em sequência à V_L de MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAb10, MAb11, MAb12, MAb13, MAb14, MAb21, MAb22 ou MAb23 e uma V_H que corresponde em sequência à V_H de MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAb10, MAb11, MAb12, MAb13, MAb14, MAb21, MAb22 ou MAb23; e (e) anticorpos tendo uma V_L e uma V_H que correspondem em sequência às V_L e V_H que correspondem em sequência às V_L e V_H de MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAb10, MAb11, MAb12, MAb13, MAb14,

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MAb21, MAb22 ou MAb23.

Como será apreciado pelos especialistas na técnica, os anticorpos anti-hPG úteis nos métodos diagnósticos podem ser de qualquer origem, incluindo, por exemplo, mamíferos (por exemplo, seres humanos, primatas, roedores, cabras ou coelhos), não mamíferos, ou de natureza quimérica (derivados de mais de uma espécie de origem). Os anticorpos adequados para usos terapêuticos em animais, inclusive seres humanos, são de preferência derivados da mesma espécie a ser tratada, ou foram modificados ou desenhados de forma a serem não imunogênicos ou terem imunogenicidade reduzida no animal sendo tratado. Uma classe específica de anticorpos antihPG úteis para usos terapêuticos em seres humanos é a classe de anticorpos humanizados, discutidos em maiores detalhes mais adiante. Os anticorpos anti-hPG úteis nos métodos e kits descritos neste relatório também podem ser de, ou derivados de, qualquer isótopo, incluindo, por exemplo, IgA (por exemplo, lgA1 ou lgA2), IgD, IgE, IgG (por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4) ou IgM. Os anticorpos nti-hPG desenhados para usos terapêuticos são de preferência do isótipo IgG.

Em algumas modalidades, anticorpos anti-hPG úteis para os métodos terapêuticos descritos neste relatório são humanizados. Em geral, anticorpos humanizados compreendem substancialmente pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis completos, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões de CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões de estrutura são àqueles de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana, e podem ser chamados de enxertados com CDR (CDR-grafted). O anticorpo humanizado também pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. Métodos para humanizar anticorpos, incluindo métodos para desenhar anticorpos humanizados, são bastante conhecidos na literatura. Vide, por exemplo, Lefranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol. 27:55-77; Lefranc et al., 2009, Nucl. Acids Res. 37Ό1006-1012; Lefranc, 2008, Mol. Biotechnol. 40: 101-111; Riechmann et

46/62 al., 1988, Nature 332:323-7; Patentes US N^oS 5.530.101, 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 e 6.180.370 concedidas a Queen et al.; EP239400; publicação PCT WO 91/09967; Patente US N° 5.225.539; EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol. 28:489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969973; e Patente US N° 5.565.332, cujas descrições encontram-se aqui incorporadas em sua integridade a título de referência.

Versões humanizadas de anticorpos tendo sequências de CDR correspondentes às CDRs de anticorpos não humanos anti-hPG, incluindo a título de exemplo e não de limitação, os vários anticorpos monoclonais antihPG N-terminais fornecidos na TABELA 2A e os vários anticorpos monoclonais anti-hPG C-terminais fornecidos na TABELA 2B, podem ser obtidos por meios desses métodos já conhecidos. Sequências projetadas para cadeias Vl θ Vh humanizadas de anticorpos anti-hPG selecionadas estão fornecidas nas TABELAS 2A e 2B. Exemplos específicos de anticorpos humanizados incluem anticorpos compreendendo:

(a) quaisquer três CDRs de V_L e quaisquer três CDRs de V_H descritas neste relatório;

(b) uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência aminoacídica correspondente à SEQ ID N°: 21 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência aminoacídica correspondente à SEQ ID N°: 22;

(c) uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência aminoacídica correspondente à SEQ ID N°: 23 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência aminoacídica correspondente à SEQ ID N°: 24;

(d) uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência aminoacídica selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 75, 77, e 79 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência aminoacídica selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 76 e 78;

(e) uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma

47/62 sequência aminoacídica selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 80 e 82 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência aminoacídica selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 81 e 83;

(f) uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência aminoacídica selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 84, 86, e 88 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência aminoacídica selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N : 85, 87, e 89; e (g) uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência aminoacídica selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 90, 92, e 94 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência aminoacídica selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 91, 93, e 95.

Como será percebido pelos especialistas na técnica, anticorpos anti-hPG tendo propriedades de ligação específicas, tais como a capacidade de ligar um epitopo de interesse específico, podem ser facilmente obtidos usando-se os vários antígenos e imunógenos descritos neste relatório e avaliando-se sua capacidade para competir para ligar hPG a um anticorpo de referência de interesse. Qualquer um dos anticorpos anti-hPG descritos nesta invenção pode ser utilizado como o anticorpo de referência em tal ensaio competitivo. Um ensaio específico útil para avaliar a capacidade de um anticorpo para completir para ligar hPG a um anticorpo anti-hPG de referência biotinilado de interesse está descrito no Exemplo 5.

Ao conduzir um estudo de competição de anticorpos entre um anticorpo anti-hPG de referência e qualquer anticorpo de teste (independentemente da espécie ou isótipo), deve-se primeiro marcar a referência com um marcador detectável seja diretamente, tal como, por exemplo, um radioisótopo ou fluoróforo, ou indiretamente, tal como, por exemplo biotina (detectável via ligação com estreptavidina marcada com fluorescência) ou uma enzima (detectável via uma reação enzimática), para permitir subsequente identificação. Neste caso, um anticorpo anti-hPG de referência marcado (em concentrações fixas ou crescentes) é incubado com uma quantidade conhe

48/62 cida de hPG, formando um complexo hPG:anticorpo anti-hPG marcado. O anticorpo de teste não marcado é então adicionado ao complexo. A intensidade do marcador complexado é medida. Se o anticorpo de teste completir com o anticorpo anti-hPG de referência marcado pela ligação de hPG a um 5 epitopo sobreposto, a intensidade do marcador complexado diminuirá em relação a uma experiência de controle realizada na ausêcia do anticorpo de teste.

Numerosos métodos para a realização de ensaios de competição de ligação são conhecidos e podem ser adaptados para produzir resul10 tados equiparáveis aos do ensaio descrito acima e no Exemplo 5.

Considera-se que um anticorpo compete para ligar a hPG a um anticorpo anti-hPG de referência, e que portanto liga aproximadamente o mesmo epitopo ou um epitopo sobreposto de hPG como o anticorpo antihPG de referência, se ele reduzir a ligação do anticorpo anti-hPG de refe15 rência à hPG em um ensaio de ligação competitiva, e especificamente o ensaio de ligação competitiva do Exemplo 5, em pelo menos 50%, a uma concentração de anticorpo de teste na faixa de 0,01-100 pg/mL (por exemplo, 0,01 pg/mL, 0,08 pg/mL, 0,4 pg/mL, 2 pg/mL, 10 pg/mL, 50 pg/mL ou 100 pg/mL ou outra concentração dentro da faixa estipulada), embora níveis 20 mais altos de redução, por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90% ou ainda 100%, sejam desejáveis.

Os especialistas na técnica vão perceber que em alguns contextos, por exemplo, contextos diagnósticos e de monitoramento, pode ser desejável marcar os anticorpos anti-PG. Tais marcadores são úteis para detec25 ção e quantificação. Marcadores adequados são bastante conhecidos na literatura, e podem ser diretos no sentido de que eles são diretamente observáveis ou detectáveis (por exemplo, fluoróforos ou radioisótopos) ou indiretos no sentido de que eles interagem com mais alguma coisa que produz um sinal observável ou detectável (por exemplo, uma enzima que age sobre 30 um substrato para produzir um sinal detectável, ou uma molécula fixadora tal como biotina que liga uma molécula de estreptavidina marcada). Numerosos sistemas de marcação, assim como meios para marcar anticorpos com es

49/62 sés sistemas, são bastante conhecidos na literatura, e são contemplados para uso nesta invenção.

Embora os vários anticorpos anti-hPG úteis nos métodos descritos nesta invenção tenham sido exemplificados com anticorpos de comprimento integral, os especialistas na técnica vão perceber que fragmentos fixadores, ou anticorpos sub-rogados desenhados ou derivados de anticorpos de comprimento integral ou de fragmentos fixadores, também podem ser usados. Fragmentos adequados, sub-rogados etc., incluem, porém sem limitação, os fragmentos Fab', F(ab')2, Fab, Fv, vlgG, scFv e corpos subrogados. A menos que de outra forma especificado, o termo anticorpo conforme usado neste relatório destina-se a incluir todas as formas de anticorpos e moléculas sub-rogadas semelhantes a anticorpo, incluindo anticorpos de cadeia simples, corpos sub-rogados e fragmentos fixadores. Anticorpos tendo estruturas típicas de anticorpos de ocorrência natural são chamados, neste relatório, de anticorpos nativos.

7.7 Métodos de produção de anticorpos anti-PG

Anticorpos anti-PG úteis nos métodos descritos nesta invenção podem ser obtidos com o uso de métodos tradicionais bastante conhecidos. Para expressar anticorpos anti-PG úteis nos métodos descritos nesta invenção, DNAs codificando cadeias leves e pesadas parciais ou de comprimento integral são inseridos em vetores de expressão de tal forma que os genes são operacionalmente ligados a sequências de controle transcricional e translacional. Neste contexto, o termo 'Operacionalmente ligado significa que o gene de um anticorpo é ligado em um vetor de tal maneira que sequências de controle transcricional e translacional no vetor desempenham a função desejada de regular a transcrição e a translação do gene de anticorpo. O vetor de expressão e as sequências de controle de expressão são escolhidos de forma a serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão desejada. O gene da cadeia leve do anticorpo e o gene da cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vetores separados, ou mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão.

Os genes de anticorpo são inseridos no vetor de expressão por

50/62 métodos tradicionais (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementares no fragmento de gene de anticorpo e do vetor, ou ligação de extremidade cega quando nenhum sítio de restrição estiver presente). Antes da inserção das sequências da cadeia leve ou da cadeia pesada do anticorpo anti-PG, o vetor de expressão já pode carregar sequências da região constante do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem para converter as sequências de V_H e V_L do anticorpo anti-PG em genes de anticorpo de comprimento integral é inserir em vetores de expressão já codificando a região constante da cadeia pesada e a região constante da cadeia leve, respectivamente, de tal maneira que o segumento de Vh é operacionalmente ligado aos segmentos de C_H no vetor e o segmento de V_L é operacionalmente ligado ao segmento de C_L no vetor. Adicionalmente ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídio sinal que facilita a secreção da cadeia do anticorpo de uma célula hospedeira. O gene da cadeia do anticorpo pode ser clonado no vetor de tal maneira que o peptídio sinal é ligado in-frame ao terminal amino do gene da cadeia do anticorpo. O peptídio sinal pode ser um peptídio sinal de imunoglobulina ou um peptídio sinal heterólogo (isto é, um peptídio sinal de uma proteína não imunoglobulina).

Além dos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de expressão recombinantes da invenção carregam sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes de cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. O termo sequência reguladora inclui promotores, potencializadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou translação dos genes de cadeia de anticorpo. Tais sequências reguladoras estão descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990). Será apreciado pelos especialistas na técnica que o desenho do vetor de expressão, incluindo a seleção das sequências reguladoras, pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada etc. Sequências reguladoras adequadas para expressão de célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que conduzem níveis altos de

51/62 expressão de proteína nas células de mamíferos, tais como promotores e/ou potencializadores derivados de citomegalovírus (CMV) (tais como o promotor/potencializador de CMV), vírus símio 40 (SV40) (tais como o promotor/potencializador de SV40), adenovirus, (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovirus (AdMLP)) e polioma. Para mais detalhes sobre elementos reguladores virais, e sequências dos mesmos, vide, por exemplo, Patente US N° 5.168.062 de Stinski, Patente US N° 4.510.245 de Bell et al., e Patente US N° 4.968.615 de Schaffner et al.

Além dos genes de cadeia de anticorpo e das sequências reguladoras, os vetores de expressão recombinantes carregam sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vetor de expressão nas células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção das células hospedeiras nas quais o vetor fora introduzido (vide, por exemplo, as Patentes US N^oS 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas de Axel et al.). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a fármacos, tais como G418, puromicina, blasticidina, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor fora introduzido. Genes marcadores selecionáveis adequados incluem o gene di-hidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras DHFR’ com seleção/amplificação de metotrexato) e o gene neo (para seleção de G418). Para expressão das cadeias leve e pesada, os vetores de expressão codificando as cadeias pesada e leve são transfectados em uma célula hospedeira por técnicas tradicionais. As várias formas do temo transfecção destinamse a abranger uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, lipofecção, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrana, entre outras.

É possível expressar os anticorpos descritos nesta invenção em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas. Em certas modalidades, a expressão de anticorpos é feita em células eucarióticas, por exemplo, células hospedeiras de mamíferos, para secreção ótima de um anticorpo apro

52/62 priadamente enrolado e imunologicamente ativo. Exemplos de células hospedeiras de mamíferos para expressão dos anticorpos recombinantes da invenção incluem células de ovário de hamster chinês (células CHO) (incluindo células DHFRCHO, descritas em Urlaub & Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220, usadas com um marcador selecionável de DHFR, por exemplo, como aquele descrito em Kaufman & Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NS0, células COS, células 293 e células SP2/0. Quando vetores de expressão recombinantes codificando genes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos por meio de cultura das células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou a secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura por meio de métodos tradicionais de purificação de proteínas. Células hospedeiras também podem ser usadas para produzir porções de anticorpos intactos, tais como fragmentos F_ab ou moléculas scF_v. Fica entendido que variações no procedimento acima estão dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, pode ser desejável transfectar uma célula hospedeira com DNA codificando seja a cadeia leve seja a cadeia pesada (mas não ambas) de um anticorpo anti-PG descrito nesta invenção.

A tecnologia de DNA recombinante também pode ser usada para remover alguns ou todos os DNA codificando qualquer uma ou ambas as cadeias leve e pesada que não são necessárias para ligação à PG. As moléculas expressas a partir de tais moléculas de DNA truncadas também são útgeis nos métodos descritos nesta invenção.

Para expressão recombinante de um anticorpo anti-PG, a célula hospedeira pode ser cotransfectada com dois vetores de expressão, o primeiro vetor codificando um polipeptídio derivado de cadeia pesada e o segundo vetor codificando um polipeptídio derivado de cadeia leve. Tipicamente, cada um dos dois vetores contêm um marcador selecionável separado. Alternativamente, pode ser usado um único vetor que codifica tanto o polipeptídio de cadeia pesada quanto o polipeptídio de cadeia leve.

53/62

Anticorpos anti-PG também podem ser produzidos por síntese química (por exemplo, pelos métodos descritos em Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, III.). Anticorpos variantes também podem ser gerados usando-se uma plataforma de livre de células (vide, por exemplo, Chu et al., 2001, Biochemia No. 2 (Roche Molecular Biologicals)).

Depois que um anticorpo anti-PG é produzido por expressão recombinante ou por meios sintéticos, ele pode ser purificado por qualquer método conhecido na literatura para purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, cromatografia por troca iônica, afinidade, particularmente por afinidade para PG depois da seleção de proteína A ou proteína G, e cromatografia em coluna de dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica tradicional para a purificação de proteínas. Além disso, os anticorpos anti-PG ou os fragmentos fixadores dos mesmos podem ser fundidos a sequências polipeptídicas heterólogas descritas nesta invenção ou conhecidas na literatura para facilitar a purificação.

8. Exemplos

8.1 Exemplo 1: Quantificação dos níveis plasmáticos ou séricos de PG

Os níveis plasmáticos e/ou séricos de PG podem ser convenientemente determinados por meio do seguinte ensaio. Placas de microtitulação de 96 poços são revestidas com entre 0,5 e 10 pg/mL de um anticorpo antiPG C-terminal, por exemplo, um anticorpo policlonal anti-hPG C-terminal de coelho, ou um anticorpo anti-PG C-terminal descrito nesta invenção, e em seguida incubadas por uma noite. As placas são então lavadas três vezes em PBS-Tween (0,05%) e bloqueadas com leite desnatado em pó a 2% (p/v) em PBS-Tween (0,05%). Separadamente, amostras de teste, amostras de controle (amostras em branco ou amostras de plasma ou soro negativas para PG), e entre cerca de 5 pM (0,5 x 10’¹¹ M) e cerca de 0,1 nM (1x10’¹⁰ M) de um padrão de referência de hPG (hPG liofilizado diluído em plasma ou soro negativo para PG) são preparadas em um diluente apropriado (por exemplo, PBS-Tween 0,05%). As amostras são incubadas sobre as placas

54/62 revestidas por um período entre 2 e 4 horas a 37°C, ou alternativamente entre 12 e 16 horas a 21°C. Depois da incubação, as placas são lavadas três vezes com PBS-Tween (0,05%) e incubadas com entre 0,001 e 0,1 pg/mL de um anticorpo anti-hPG N-terminal, por exemplo, um anticorpo policlonal anti-hPG N-terminal ou um anticorpo monoclonal anti-hPG N-terminal já descritos neste relatório, acopladas à peroxidase de raiz-forte (HRP) (vide Nakane et al., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22(12):1084-1091) por 30 minutos a 21 °C. As placas são então lavadas três vezes em PBS-Tween (0,05%) e o substrato HRP é adicionado por 15 minutos a 21°C. A reação é interrompida pela adição de 100 pl_ de ácido sulfúrico 0,5M e é feita uma medição da densidade ótica a 405 nm. Os níveis de hPG da amostra de teste são determinados por comparação com uma curva padrão construída a partir das medidas derivadas do padrão de referência de hPG.

8.2 Exemplo 2: Ensaio ELISA para avaliar a especificidade de anticorpos anti-hPG

A especificidade de anticorpos anti-hPG pode ser convenientemente determinada por meio de um ensaio ELISA da maneira descrita a seguir. Placas de 96 poços são incubadas por uma noite a 4°C com concentrações apropriadas do polipeptídio de teste (por exemplo, 25 e 50 ng de PG humana recombinante, e 50 e 250 ng de CTFP ou outros produtos gênicos derivados de gastrina) em solução salina tamponada com fosfato (PBS), e depois disso os poços são lavados três vezes com uma solução de lavagem (PBS e 0,1% Tween-20), e em seguida incubados por 2 horas a 22°C com 100 pL de uma solução de bloqueio (PBS, 0,1% Tween-20, 0,1% de albumina sérica bovina ou hidrolisado de caseína) por compartimento. Depois do bloqueio, os poços são lavados três vezes e o anticorpo a ser analisado (anticorpo de teste) é adicionado. 100 pL do anticorpo de teste (a 0,3 a 1 ng/mL) em PBS e 0,1% de Tween-20 são adicionados a cada compartimento. As placas são então incubadas por 2 horas a 22°C, e depois disso a solução de anticorpo de teste é descartada e substituída, depois de uma etapa de lavagem (3X 100 pL de uma solução de lavagem, como observado acima), por uma solução de bloqueio contendo um anticorpo secundário, um

55/62 anticorpo tipo IgG (Fc) anticamundongo de cabra acoplado à peroxidase de raiz-forte. Depois de 1 hora de incubação com um anticorpo secundário, 100 pL de uma solução de substrato (por exemplo Fast OPD, ou dicloridrato de O-fenilenodiamina, disponível na Sigma-Aldrich Co., preparada de acordo com as instruções do fabricante) são adicionados a cada compartimento e incubados no escuro por 20 minutos a 22°C. A reação é interrompida pela adição de 50 pL de ácido sulfúrico 4N e a quantidade de substrato catalisado é determinada medindo-se a densidade ótica (O.D.) a 492 nm. A conversão de substrato é proporcional à quantidade do anticorpo primário (de teste) ligado ao antígeno. As experiências foram feitas em duplicata e as medidas da OD foram plotadas em função da concentração de antígeno. Os anticorpos de teste são classificados como específicos para PG se a O.D. medida estiver entre 0,2 e 1,5 para hPG e se não houver sinais estatisticamente significativos acima do fundo com CTFP ou qualquer um dos outros peptídios derivados do gene da gastrina, onde o fundo é sinal médio proveniente dos poços de controle contendo somente PBS.

8.3 Exemplo 3: Ensaio para avaliar a atividade neutralizadora de anticorpos anti-hPG

Um teste específico para valiar de um anticorpo anti-hPG específico é neutralizador pode ser efetuado da seguinte maneira. Células LS174T são semeadas em 6 poços de uma placa de 6 poços, a aproximadamente 50.000 células por compartimento. As células são então tratadas a intervalos de 12 horas por 48 horas com o anticorpo anti-hPG de teste ou com um anticorpo de controle, a concentrações de anticorpo de cerca de 5 pg/mL. Um anticorpo de teste é definido como neutralizador no ensaio se o número de células tratadas com o anticorpo de teste mostrar uma redução estatisticamente significativa de pelo menos 10% no número de células sobreviventes em relação ao número de células tratadas com um anticorpo de controle inespecífico, usando-se o teste de duas caudas de Mann-Whitney (com diferenças consideradas significativas quanto p<0,05). Os números totais de células são corrigidos para o número de células no inicio do período de tratamento, denominado To.

56/62

8.4 Exemplo 4: Ensaio para avaliar afinidade de um anticorpo anti-hPG

As constantes de afinidade de anticorpos anti-hPG pode ser medida pela Técnica Proteon (BioRad), de acordo com Nahshol et al., 2008, Analytical Biochemistry 383:52-60, aqui aqui incorporado em sua integridade a título de referência. Em resumo, para anticorpos murinos anti-PG, um anticorpo tipo IgG anticamundongo (50 pg/ml) é primeiro aplicado sobre um chip sensor, garantindo que o sinal detectado pelo chip depois da injeção do anticorpo cai para um valor entre 10.000 e 11.500 unidades de resposta (RU). O anticorpo murino anti-hPG de interesse (anticorpo de teste) é então injetado (a uma concentração típica de 30 pg/ml). Se o anticorpo de teste se ligar o suficiente, um sinal adicional de pelo menos 500 RU será observado. Um intervalo de tempo de ligação entre o anticorpo de teste e hPG é então obtido injetando-se concentrações variáveis de hPG, por exemplo 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, e 12,5 nM, e detectando-se o nível de associação. Tipicamente, vários canais encontram-se disponíveis para testar múltiplos anticorpos paralelamente em uma única experiência, possibilitando analisar paralelamente a ligação de um único anticorpo de teste a várias concentrações diferentes de hPG. Um canal deve ser injetado com um anticorpo monoclonal murino que não é específico para hPG como um controle para ligação inespecífica e um outro canal deve ser injetado com apenas um tampao de diluição como a linha basal para sinal de fundo. Geralmente, nenhuma ligação é detectável no canal injetado com o anticorpo murino inespecífico. Anticorpos exibindo um nível de associação elevado neste cenário, que pode resultar na saturação do anticorpo monoclonal aprisionado pela hPG, podem ser testados concentrações mais baixas de hPG (50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM e 3,125 nM), permitindo uma medição mais definida.

As constantes de afinidade (Kd) são calculadas como a razão entre a constante de dissociação (k_d) e a constante de associação (k_a). Os valores experimentais podem ser validados por análise da semelhança estatisticamente relevante entras curvas experimentais com base nas medidas de ligação e nos perfis teóricos.

As constantes de afinidade de anticorpos não murinos anti-hPG

57/62 podem ser avaliadas em um formato similar usando uma IgG específica para a espécie de origem do anticorpo anti-hPG de teste.

5 Exemplo 5: Ensaio para avaliar a ligação competitiva com um anticorpo anti-hPG de referência

Um ensaio específico para avaliar se um anticorpo de interesse (anticorpo de teste) compete para ligar hPG com um anticorpo anti-hPG de referência biotinilado pode ser realizado da seguinte maneira. Placas de 96 poços são revestidas com um anticorpo anti-hPG de captura (anticorpo policlonal ou monoclonal que reconhece uma região N- ou C-terminal da hPG 10 que é diferente do epitopo reconhecido pelo anticorpo anti-hPG de referência biotinilado), a uma concentração a ser escolhida na faixa de 1-10 pg/ml, por uma noite a 4°C (0,1 a 1 pg/compartimento). Depois de bloqueio com tampão de bloqueio (0,1% de Tween-20, 0,1% de BSA em PBS) por 2 hotas a 22°C, hPG recombinante é adicionada a uma concentração variando entre

10 pM e 1 nM (10 e 1000 pg/compartimento) e incubada por 2 horas a 22 C.

Em seguida, o anticorpo anti-hPG de referência biotinilado (ou uma mistura contendo o anticorpo anti-hPG de referência biotinilado) é adicionado, junto com concentrações crescentes do anticorpo de teste não marcado, e incubado por 1 hora a 22°C. Depois de lavagem para remover os anticorpos nao ligados, a detecção do anticorpo anti-hPG de referência não marcado é efetuada por incubação da mistura com 50 ng/ml de estreptavidina-HRP por 1 hora a 22°C, seguida por incubação com um substrato qiomioluminescente para peroxidase de raiz-forte por 5 minutos a 22°C, e em seguida quantificação das unidades relativas de luz (RLU) em um luminômetro. Os ensaios são feitos em duplicata.

Anticorpos que competem com um anticorpo anti-hPG de referênciainibem a ligação do anticorpo de referência à hPG. Um anticorpo que se liga a substancialmente o mesmo epitopo, ou a um epitopo sobreposto, como o anticorpo de referência reduz significativamente (por exemplo, em 30 pelo menos 50%) a quantidade de anticorpo anti-hPG de referência ligado, como fica evidente por uma redução nas RLUs observadas.

Um valor de controle alto é obtido a partir de uma experiência de

58/62 controle realizada incubando-se o anticorpo de referência marcado com hPG recombinante sem anticorpo de teste. Um valor de controle baixo é obtido a partir de uma experiência de controle realizada incubando-se o anticorpode referência marcado com hPG recombinante na presença de concentrações 5 excessivas do anticorpo de referência não marcado (o anticorpo de referência não marcado competindo assim com o anticorpo marcado para se ligar à hPG). A capacidade dos anticorpos de teste para competir com o anticorpo anti-hPG de referência é então determinada incubando-se o anticorpo de referência marcado com hPG recombinante na presença de concentrações crescentes do anticorpo de teste não marcado.

Em um ensaio de teste, uma redução significativa nas RLUs observadas na presença de um anticorpo de teste indica que o anticorpo reconhece substancialmente o mesmo epitopo que o anticorpo anti-hPG de referência.

_{15 A inib}iç_ão de ligação pode ser expressa como uma constante de inibição, ou K„ que é calculada de acordo com a seguinte fórmula:

K, = IC₅o / [1 ⁺ (concentração de Ab anti-hPG de referência / K_D anti-hPG de referência^ onde IC50 é a concentração de anticorpo de teste que produz . X ~ 1/ ^Ab anti-hPG de uma redução de 50% na ligação do anticorpo de referencia e K_D referência constante de dissociação do anticorpo anti-hPG de referência, uma medida de sua afinidade para a hPG. Anticorpos de teste úteis que competem com um anticorpo anti-hPG de referência (por exemplo, um dos anticorpos anti-hPG descritos nesta invenção) tipicamente terão K,s variando 25 de 10 pM a 100 nM nas condições de ensaio descritas neste relatono.

s fi Fxemnlo 6: Detecção de PG sérica em amostras de pacientes com pojl· pose adenomatosa familiar

Este exemplo mostra que níveis elevados de PG no soro podem estar correlacionados com a presença de pólipos em uma pessoa com FAP.

8.6.1 Métodos

Os níveis de PG no soro foram quantificados da maneira descrita no Exemplo 1 em amostras de 6 pacientes com polipose adenomatosa

59/62 familiar. As amostras de soro foram obtidas de pacientes com as seguintes características:

• Dois indivíduos (A e B), ambos com mais de 55 anos, já tendo passado por colectomia, regularmente monitorados por endoscopia, nos quais nenhum pólipo fora detectado desde a cirurgia.

• Um indivíduo (C), 30 anos, já tendo passado por colectomia e cirurgia de acompanhamento para remover novos pólipos. O indivíduo passou por uma cirurgia vários meses antes de a amostra de sangue ser coletada.

• Um indivíduo (D), 27 anos, já tendo passado por colectomia, apresentando múltiplos pólipos no intestino delgado (mas não câncer) na época em que a amostra de sangue fora coletada.

• Um indivíduo (E), 52 anos, já tendo passado por colectomia apresentando múltiplos pólipos no reto na época em que a amostra de sangue fora coletada.

• Um indivíduo (F), 10 anos, apresentando múltiplos pólipos colorretais na época em que a amostra de sangue fora coletada.

8.6.2 Resultados

Os resultados mostrados na Tabela 5 abaixo estão expressos como a concentração média de PG ± desvio padrão (pM):

Tabela 5
Paciente	Concentração média de PG (pM) ± s.d.
A	6,9 ±3,3
B	0,0
C	0,0
D	167,5 ±43,0
E	351,85 ±96,0
F	233 ± 11,3

Os resultados indicam que os níveis de PG são particularmente elevados em indivíduos que carregam um alto número de pólipos na época da coleta de amostra. Em comparação, pacientes que passaram por cirurgia apresentam níveis muito baixos ou não detectáveis de PG.

8.7 Exemplo 7: Detecção de PG sérica em amostras de pacientes com póli

60/62 pos adenomatosos esporádicos pré-cancerosos

Este exemplo demonstra que mais de vinte e cinco porcento dos indivíduos com polipose adenomatosa esporádica têm níveis séricos de PG aumentados.

8.7.1 Métodos

Os níveis de PG foram medidos em dois grupos diferentes de amostras: um primeiro grupo de amostras obtidas de vinte e cinco indivíduos com múltiplos pólipos adenomatosos, igual ao número que seria encontrado em pessoas com FAP, e um segundo grupo de amostras de um banco de plasma, coletadas de 104 indivíduos com idade entre 45 e 65 anos. Os níveis de progastrina no plasma foram quantificados usando-se um ensaio ELISA, como descrito acima no Exemplo 1.

8.7.2 Resultados

23% (12/52) dos indivíduos com pólipos adenomatosos estudados tiveram níveis de progastrina acima de 50 pM. A título de comparaçao, 16,3% (17/104) dos indivíduos no grupo do banco de sangue tiveram níveis de PG acima de 50 pM. O histórico médico dos indivíduos cujas amostras vieram do banco de sangue não é conhecido. Pessoas saudáveis têm níveis baixos de PG, tipicamente não ultrapassando 50 pM. Vide, por exemplo, Siddheshwar et al., 2001, Plasma levels of progastrin but not amidated gastrin or glycine extended gastrin are elevated in patients with colorectal carcinoma, Gut 48:47-52. Acredita-se que níveis acima de 50 pM sejam indicativos de uma patologia subjacente.

Quase um quarto dos indivíduos nos quais pólipos foram encontrados também tiveram níveis elevados de PG. Isto é coerente com a observação de que cerca de 20% dos pólipos adenomatosos esporádicos transformam-se em tumores malignos, uma transformação que acredita-se ser acompanhada por níveis elevados de PG. Portanto, níveis elevados de PG na presença de pólipos adenomatosos podem representar uma métrica útil na identificação de pacientes para acompanhamento médico ou para tratamento anti-PG profilático.

Com relação às amostras do banco de plasma, é provável que

61/62 algumas ou todas as amostras do banco com níveis de PG acima de 50 pM tenham vindo de indivíduos com condições subjacentes que causaram níveis elevados de PG. O uso de amostras de controle apropriamente rastreadas possivelmente mostraria uma diferença maior entre a percentagem de indivíduos com pólipos adenomatosos esporádicos e aqueles sem pólipos que têm níveis de PG acima de 50 pM.

8.8 Exemplo 8: Composições anti-PG previnem o desenvolvimento de tumor em um modelo de FAP em camundongos

Este exemplo demonstra a capacidade de anticorpos anti-hPG para prevenir a formação de tumores in vivo.

8.8.1 Métodos

Camundongos transgênicos carregando uma mutação em um alelo do gene polipose coli adenomatosa (APC) semelhante àquela encontrada em pessoas com polipose adenomatosa familiar (FAP), foram tratados com um anticorpo anti-hPG. Esses camundongos, doravante denominados camundongos APCA14, desenvolveram espontaneamente tumores em seus intestinos quando o segundo alelo de APC (tipo selvagem) foi perdido via um mecanismo de perda de heterozigocidade (LOH), (Colnot et al., 2004, Colorectal cancers in a new mouse model of familial adenomatous polyposis: influence of genetic and environmental modifiers, Lab Investigation 84:16191630). Os primeiros tumores detectáveis podem ser encontrados por volta dos 2 meses de idade, e até 3,5 meses, o número de tumores geralmente é de cerca de 15-20. Foi mostrado que estes tumores produzem progastrina.

Camundongos APCA14 de quatro meses de idade foram tratados duas vezes por semana durante seis semanas seja com um anticorpo policlonal de controle - um antissoro anti-lgG humana de coelho (Jackson ImmunoResearch (referência n° 309-005-0089) - ou um anticorpo policlonal anti-PG, gerado contra (1) um peptídio N-terminal e (2) um peptídio Cterminal como descrito em Hollande et al., \NO 07/135542, por injeção intraperitoneal a uma dose de 9 mg/kg. Os camundongos foram pesados uma vez por semana. Ao final do esquema de tratamento de seis semanas, seus intestinos foram fotografados, e o número total de tumores foi contado. Havia

62/62 seis camundongos no grupo de tratamento e no grupo de controle. Genotipagem identificou dois camundongos do grupo de controle que não carregavam a esperada mutação heterozigótica de APC, que foram excluídos da experiências.

8.8.2 Resultados

Os resultados estão mostrados abaixo na Tabela 6. Os camundongos tratados com o anticorpo de controle apresentaram um total de 125 tumores, com 31,25 tumores em média por camundongo. Os camundongos tratados com anti-PG tiveram um total de 46 tumores ou, em média, 7,6 tumores por camundongo. Esta diferença é estatisticamente significativa (teste de Mann-Whitney, P=0,0095).

Tabela 6
Tratamento (n° de camundongos)	Número de tumores por camundongo
Controle PAb (4)	23 48	28 26
Anti-hPG PAb (6)	2 16 15	9 2 2

Os resultados indicam que o número de tumores encontrados em quatro dos seis animais tratados com anticorpos antiprogastrina caiu abaixo do número médio de quinze a vinte tumores geralmente encontrados em camundongos ΑΡΟΔ14 com 3,5 meses de idade. Vide Tabela 6 abaixo. Estes dados indicam que o tratamento com anticorpos antiprogastrina previne o desenvolvimento de novos tumores nesses animais.

Todas as publicações, patentes, pedidos de patente e outros documentos citados neste pedido estão aqui incorporados em sua integridade a título de referência para todos os fins como se fosse individualmente indicado que cada publicação, patente, pedido de patente ou outro documento individual está aqui incorporado a título de referência para todos os fins.

Embora várias modalidades específicas tenham sido ilustradas e descritas, será percebido que é possível fazer várias alterações sem se afastar do espírito e escopo da invenção.

Claims (2)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método in vitro de identificação de um indivíduo com necessidade de colonoscopia, caracterizado pelo fato de que compreende determinar se um indivíduo com predisposição a desenvolver pólipos adenomatosos tem

   5 uma concentração plasmática ou sérica de progastrina igual a ou maior que 50 pM, onde tal concentração no referido indivíduo é indicativa da necessidade de colonoscopia de acompanhamento.
2. 2. Método in vitro de identificação de um indivíduo com probabilidade aumentada de ter pólipos adenomatosos, caracterizado pelo fato de que

   10 compreende determinar o nível de PG em amostras de um fluido corporal de um indivíduo com predisposição a desenvolver pólipos adenomatosos, e comparar o nível de PG na amostra a uma linha basal, onde um nível de PG na amostra acima do nível da linha basal é indicativo da necessidade de tratamento antiprogastrina.