BR112012022108B1

BR112012022108B1 - Célula de levedura oleaginosa, cultura, bem como métodos para converter uma fonte de carboidrato em ácido graxo ou triacilglicerol e para modificar uma célula de levedura

Info

Publication number: BR112012022108B1
Application number: BR112012022108-6A
Authority: BR
Inventors: Gregory Stephanopoulos; Syed Hussain Imam Abidi
Original assignee: Massachusetts Institute Technology
Priority date: 2010-03-02
Filing date: 2011-03-02
Publication date: 2022-01-18
Also published as: CN102869768A; EP3312271A1; US8765404B2; CA2791695A1; US10006065B2; WO2011109548A2; US20110223641A1; AU2011223619B2; EP2542671A2; WO2011109548A3; AU2011223619A1; CA2791695C; US20150079645A1; BR112012022108A2

Abstract

célula oleaginosa, cultura, molécula de ácido nucleico, cassete de expressão, bem como método para a produção de ácidos graxos e derivados de ácido graxo. a presente invenção refere-se a métodos úteis para a conversão de uma fonte de carbono a um biocombustível ou precursor de biocombustível usando micróbios projetados. alguns aspectos de sta invenção se referem a descoberta de um regulador chave de metabolismo de lipídeo em micróbios. alguns aspectos desta invenção se referem a micróbios projetados para a produção de biocombustível ou precursor de biocombustível.

Description

PEDIDO RELACIONADO

[001] Este pedido reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119(e) ao pedido de patente provisório dos Estados Unidos, U.S.S.N. 61/309.782, depositado em 2 de março de 2010, os conteúdos totais do qual são incorporados aqui por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A invenção, pelo menos em parte, se refere ao campo de conversão de uma fonte de carboidrato em um biocombustível ou um precursor de biocombustível, por exemplo, um ácido graxo ou derivado de ácido graxo, tal como um triacilglicerol, usando uma célula projetada ou micróbio.

PESQUISA FEDERALMENTE PATROCINADA

[003] A pesquisa que conduz a certos aspectos da(s) invenção(ões) aqui revelada(s) foi suportada, pelo menos em parte, pelo concessão do Departamento de Energia 69106899. O Governo dos Estados Unidos tem certos direitos na invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] Biocombustíveis sustentavelmente produzidos são uma alternativa para combustíveis fósseis, e podem ajudar a aliviar a depleção de estoques de combustível fóssil facilmente acessível, enquanto que evita poluição associada com combustível e emissão de gás de estufa, satisfazendo, desse modo, uma demanda elevada de energia proporcionável em um modo sustentável. Contudo, a implementação difundida de produção de biocombustível tem sido frustrada por vários problemas de métodos de produção atuais, por exemplo, a competição de plantas de produção de biocombustível com colheitas de alimentação para extensões em acres agriculturalmente valiosas, ou o uso de substratos industriais com somente suprimentos limitados como fontes de carbono.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] O interesse do crescimento sobre a sustentabilidade e renovabilidade de combustíveis fósseis tem conduzido ao desenvolvimento de um amplo espectro de biocombustíveis alternativos de várias origens, incluindo lipídeos sintetizados de recursos renováveis por micróbios, tais como bactéria ou levedura. Os lipídeos úteis como biocombustível, ou precursores de biocombustíveis, incluem, por exemplo, ácidos graxos e seus derivados (por exemplo, triacilgliceróis).

[006] A viabilidade econômica de biocombustíveis sintetizados por micróbio, ou precursores de biocombustível, é dependente do emprego de um micróbio adequado de um fenótipo, incluindo uma combinação de traços benéficos múltiplos, por exemplo, um metabolismo que permite conversão eficiente de carbono a biocombustível ou precursor de biocombustível, alta taxa de formação de biomassa, alta produtividade de biocombustível, ou precursor de biocombustível, altos níveis de acúmulo intracelular, ou secreção de biocombustível ou precursor de biocombustível, boa tolerância a estoque de alimentação (fonte de carbono e substâncias associadas) e produto sintetizado (por exemplo, ácido graxo ou triacilglicerol), e estabilidade do biocombustível ou precursor de biocombustível, por exemplo, a baixas concentrações de fonte de carbono. O rendimento de conversão (grama de óleo produzido por grama de substrato, por exemplo, glicose) é de importância particular. Os micróbios comumente empregados na produção de biocombustível ou precursor de biocombustível não se conformam ao fenótipo requerido em um modo suficiente para permitir produção em escala industrial econômica de biocombustível.

[007] Alguns aspectos desta invenção se referem ao projeto de traços requeridos em um microorganismo para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. Enquanto que o metabolismo de lipídeo e ácido graxo tem sido estudado em micróbios a partir de 1930 e 1940 em diante (ver, por exemplo, Woodbine, M. 1959, Microbial fat: Microorganisms as potential fat producers. Prog. Ind. Microbiol.1:181), pouco progresso tem sido feito em direção ao projeto de fenótipos desejáveis relacionados a produção de biocombustível em micróbios, apesar de esforços numerosos para projetar geneticamente um micróbio, ou para otimizar as condições do processo de produção. Desse modo, os esforços da engenharia genética têm sido principalmente direcionados a manipulação de um gene alvo à montante de, ou dentro da trajetória de síntese de ácido graxo e a otimização de fermentação ou condições de crescimento, por exemplo, pelo suplemento do meio de crescimento com ácidos graxos.

[008] Um maior obstáculo para a engenharia genética de micróbios é a falta de informação genômica e anotação de reguladores de trajetória metabólica chave em micróbios alvos, por exemplo, em levedura oleaginosa. Como um resultado, identificação e anotação funcional de um regulador chave que controla conversão de carboidrato em lipídio estão ainda faltando em micróbios para produção de biocombustível.

[009] Alguns aspectos desta invenção se referem a identificação da levedura oleaginosa Y. lipolytica como um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. Alguns aspectos desta invenção se referem a descoberta de um regulador chave de metabolismo de ácido graxo em um micróbio. Alguns aspectos desta invenção se referem a descoberta de estearoila-CoA desaturase (SCD) como um regulador chave de carboidrato para conversão de lipídio em um micróbio. Alguns aspectos desta invenção se referem a um ácido nucleico isolado que codifica um regulador chave de metabolismo de ácido graxo em um micróbio. Alguns aspectos desta invenção proporcionam um ácido nucleico isolado que codifica um regulador chave de metabolismo de ácido graxo, por exemplo, um produto de gene SCD, de um micróbio oleaginoso.

[010] Alguns aspectos desta invenção se referem ao projeto de um micróbio para a produção de biocombustível por manipulação da atividade de um regulador de metabolismo de ácido graxo, por exemplo, por manipulação genética. Alguns aspectos desta invenção se referem a um micróbio isolado projetado para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. Alguns aspectos desta invenção se referem a um micróbio isolado otimizado para a conversão de uma fonte de carboidrato em um biocombustível ou precursor de biocombustível, por exemplo, um micróbio oleaginoso compreendendo uma atividade aumentada de um produto de gene SCD. Alguns aspectos desta invenção se referem a uma cultura de um micróbio projetado para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. Alguns aspectos desta invenção se referem a métodos de conversão de uma fonte de carboidrato em um ácido graxo ou derivado de ácido graxo usando um micróbio projetado para produção de biocombustível. Alguns aspectos desta invenção se referem a um biorreator para conversão de carboidrato a ácido graxo, ou conversão de derivado de ácido graxo usando um micróbio projetado para produção de biocombustível. Alguns aspectos desta invenção proporcionam um método para converter uma fonte de carboidrato, pelo menos parcialmente, em um biocombustível ou precursor de biocombustível usando um micróbio projetado.

[011] Alguns aspectos desta invenção se referem a uma célula oleaginosa isolada, compreendendo uma modificação genética que aumenta expressão de um ou mais genes escolhidos a partir do grupo de Hemoglobina, Citocromo, GLUT, Enzima Málica, ACC, SCD, FAA1, ACS, ACS2, FAT1, FAT2, PCS60, ACLY, FAS, Acila-CoA sintetase, Piruvato carboxilase, e genes AMPK, e/ou uma modificação genética que reduz expressão de um gene escolhido a partir do grupo de JNK2 e delta-12 desaturase. Em algumas concretizações, a célula oleaginosa isolada compreende um construto de ácido nucleico compreendendo (a) um cassete de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica o produto de gene sob o controle de um promotor homólogo ou heterólogo adequado; (b) um cassete de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica um RNA de interferência que tem como alvo o produto de gene sob o controle de um promotor heterólogo; e/ou (c) um construto de ácido nucleico inserido no genoma da célula, o construto compreendendo uma sequência de ácido nucleico que aumenta ou diminui a expressão do produto de gene. Em algumas concretizações, o promotor heterólogo é um promotor induzível ou um promotor constitutivo. Em algumas concretizações, o construto de ácido nucleico inibe ou rompe a regulação natural de um gene nativo que codifica o produto de gene resultando em sobre-expressão do gene nativo. Em algumas concretizações, o construto de ácido nucleico inibe ou abole expressão do gene nativo. Em algumas concretizações, a inibição ou rompimento da regulação natural do gene nativo é mediado por anulação, rompimento, mutação e/ou substituição de uma região regulatória, ou uma parte de uma região regulatória que regula expressão do gene, ou inibição ou abolimento da expressão de um gene nativo é mediado por anulação, rompimento, mutação e/ou substituição de uma sequência de codificação do gene nativo, ou de uma região regulatória, ou uma parte de uma região regulatória que regula expressão do gene nativo. Em algumas concretizações, a expressão diminuída do gene JNK2 e/ou delta-12 desaturase é mediada por expressão constitutiva ou induzível de um ácido nucleico que tem como alvo um produto de gene JNK2 e/ou delta-12 desaturase e inibindo a expressão do gene. Em algumas concretizações, o ácido nucleico que tem como alvo o transcrito de JNK2 e/ou delta-12 desaturase inibir a expressão do transcrito, via uma trajetória de RNAi. Em algumas concretizações, o ácido nucleico que tem como alvo o transcrito de JNK2 e/ou delta-12 desaturase é um siRNA, um shRNA, ou um microRNA. Em algumas concretizações, uma diminuição de expressão de JNK2 ou delta-12 desaturase é alcançada por combinação do gene tipo selvagem no micróbio, por exemplo, por recombinação homóloga de um construto de ácido nucleico, por exemplo, um vetor alvo, com o local genômico JNK2 ou delta-12 desaturase, rompendo, desse modo, a expressão do gene tipo selvagem. Em algumas concretizações, o construto de ácido nucleico é inserido no genoma da célula. Em algumas concretizações, a expressão aumentada ou diminuída do produto de gene confere um fenótipo benéfico para a conversão de uma fonte de carboidrato a um ácido graxo, derivado de ácido graxo, e/ou TAG à célula. Em algumas concretizações, o fenótipo benéfico é um perfil de ácido graxo modificado, um perfil modificado de triacilglicerol, uma taxa de síntese aumentada de ácido graxo e/ou triacilglicerol, um aumento no rendimento de conversão, um acúmulo aumentado de triacilglicerol na célula, e uma tolerância aumentada de estresse osmótico, uma taxa de proliferação aumentada, um volume aumentado de célula, e/ou uma tolerância aumentada de uma substância a uma concentração letal a e/ou inibição de proliferação de células não- modificadas do mesmo tipo de célula, pela célula. Em algumas concretizações, o perfil de ácido graxo modificado ou o perfil modificado de triacilglicerol da célula exibe pelo menos um aumento de 2 vezes da proporção de C18 ácidos graxos sobre C16 ácidos graxos, conforme comparado às células não-modificadas do mesmo tipo de célula. Em algumas concretizações, o perfil de ácido graxo modificado ou o perfil modificado de triacilglicerol da célula exibe pelo menos um aumento de 2,5 vezes da proporção de C18 ácidos graxos sobre C16 ácidos graxos, conforme comparado às células não-modificadas do mesmo tipo de célula. Em algumas concretizações, o perfil de ácido graxo modificado ou o perfil modificado de triacilglicerol da célula exibe pelo menos um aumento de 5 vezes da proporção de C18 ácidos graxos sobre C16 ácidos graxos, conforme comparado às células não-modificadas do mesmo tipo de célula. Em algumas concretizações, o perfil de ácido graxo modificado ou o perfil modificado de triacilglicerol da célula exibe pelo menos um aumento de 5 vezes da proporção de C18 ácidos graxos sobre C16 ácidos graxos, conforme comparado às células não- modificadas do mesmo tipo de célula. Em algumas concretizações, a célula é viável sob condições de tensão osmótica letal a células não- modificadas. Em algumas concretizações, a célula é viável sob condições de tensão osmótica a um nível de 200% do nível mais alto tolerado pelas células não-modificadas. Em algumas concretizações, a célula é viável sob condições de tensão osmótica a um nível de 300% do nível mais alto tolerado pelas células não-modificadas. Em algumas concretizações, a célula é viável sob condições de tensão osmótica a um nível de 400% do nível mais alto tolerado pelas células não- modificadas. Em algumas concretizações, a taxa de proliferação de célula é pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25 vezes, ou pelo menos 30 vezes aumentada, conforme comparado às células não-modificadas do mesmo tipo de célula. Em algumas concretizações, o volume da célula é pelo menos aumentado de 2 vezes, conforme comparado às células não- modificadas do mesmo tipo de célula. Em algumas concretizações, a célula tolera uma substância a uma concentração letal a e/ou inibição de proliferação de células não-modificadas do mesmo tipo de célula. Em algumas concretizações, a substância é um açúcar fermentável e a concentração é pelo menos 80 g/l, pelo menos 100 g/l, pelo menos 150 g/l, pelo menos 200 g/l, pelo menos 300 g/l. Em algumas concretizações, a taxa de síntese de um ácido graxo ou um triacilglicerol da célula é pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, aumentada, conforme comparado às células não-modificadas do mesmo tipo de célula. Em algumas concretizações, a célula converte uma fonte de carboidrato a um ácido graxo ou um triacilglicerol a uma taxa de conversão de pelo menos cerca de 20 g/g, pelo menos cerca de 25 g/g, ou pelo menos cerca de 30 g/g. Em algumas concretizações, a célula é uma célula procariótica ou uma célula eucariótica. Em algumas concretizações, a célula é uma célula bacterial, uma célula de algas, uma célula de fungos, ou uma célula de levedura. Em algumas concretizações, a célula é uma célula de levedura oleaginosa. Em algumas concretizações, a célula é uma célula de Y. lipolytica.

[012] Alguns aspectos desta invenção se referem a uma cultura, compreendendo uma célula oleaginosa isolada, compreendendo uma modificação genética que aumenta a expressão de um ou mais genes escolhidos a partir do grupo de Hemoglobina, Citocromo, GLUT, Enzima Málica, ACC, SCD, FAA1, ACS, ACS2, FAT1, FAT2, PCS60, ACLY, FAS, Acila-CoA sintetase, Piruvato carboxilase, e genes AMPK, e/ou uma modificação genética que reduz expressão de um produto de gene JNK2 e/ou delta-12 desaturase, e uma fonte de carboidrato. Em algumas concretizações, a célula oleaginosa isolada é um micróbio projetado conforme aqui proporcionado. Em algumas concretizações, a fonte de carboidrato é um açúcar fermentável. Em algumas concretizações, a fonte de carboidrato é um açúcar monomérico. Em algumas concretizações, a fonte de carboidrato é glicose e glicerol. Em algumas concretizações, a fonte de carboidrato não é esterilizada. Em algumas concretizações, a cultura é mantida sob condições não estéreis. Em algumas concretizações, a cultura não compreende um agente antibiótico e antiproliferativo seletivo para a célula oleaginosa isolada. Em algumas concretizações, a fonte de carboidrato é derivada de planta ou biomassa de alga. Em algumas concretizações, a fonte de carboidrato é derivada de celulose, hemicelulose, amido, glicerol, ou um derivado destes. Em algumas concretizações, a cultura adicionalmente compreende uma celulose ou enzima de hidrolização de hemicelulose. Em algumas concretizações, a biomassa ou a celulose ou hemicelulose é pré-tratada em um procedimento de expansão de fibra em água quente, ou ácido diluto, ou amônia, com uma enzima de hidrolização, com um pré-tratamento com vapor, e/ou um pré-tratamento com cal. Em algumas concretizações, a cultura compreende uma substância a uma concentração letal a tipo selvagem não-modificado, células não- modificadas do mesmo tipo de célula como a célula oleaginosa isolada. Em algumas concretizações, a substância é uma substância tóxica gerada durante pré-tratamento da fonte de carboidrato tal como ácido acético, furfural ou compostos aromáticos. Em algumas concretizações, a substância é a fonte de carboidrato. Em algumas concretizações, a substância é um açúcar fermentável. Em algumas concretizações, a substância é um açúcar monomérico. Em algumas concretizações, a cultura compreende o açúcar fermentável a uma concentração de pelo menos 80 g/l, pelo menos 100 g/l, pelo menos 150 g/l, pelo menos 200 g/l, pelo menos 250 g/l, ou pelo menos 300 g/l.

[013] Alguns aspectos desta invenção se referem a um método, compreendendo contatar uma fonte de carboidrato com uma célula oleaginosa isolada, a célula compreendendo uma modificação genética que aumenta a expressão de um ou mais genes escolhidos a partir do grupo de Hemoglobina, Citocromo, GLUT, Enzima Málica, ACC, SCD, FAA1, ACS, ACS2, FAT1, FAT2, PCS60, ACLY, FAS, Acila-CoA sintetase, Piruvato carboxilase, e produtos de gene AMPK, e/ou uma modificação genética que reduz expressão de um gene JNK2 e/ou um gene delta-12 desaturase, e incubação da fonte de carboidrato contatada com a célula sob condições adequadas para pelo menos conversão parcial da fonte de carboidrato em um ácido graxo ou um triacilglicerol pela célula. Em algumas concretizações, a célula oleaginosa isolada é um micróbio projetado conforme aqui proporcionado. Em algumas concretizações, a fonte de carboidrato é um açúcar, tais como glicose, xilose, etc, ou amidos derivados de planta ou biomassa de alga. Em algumas concretizações, a fonte de carboidrato é derivada de celulose ou hemicelulose. Em algumas concretizações, a fonte de carboidrato é contatada com a célula na presença de uma enzima de hidrolização de celulose ou hemicelulose. Em algumas concretizações, a fonte de carboidrato é contatada com a célula na presença de cerca de 15 IU de enzima de hidrolização de celulose ou hemicelulose por g de biomassa a 55°C por 48 horas. Em algumas concretizações, a biomassa ou a celulose ou hemicelulose é pré-tratada com procedimento de expansão de fibra em água quente, ou ácido diluto, ou amônia, e/ou uma enzima de hidrolização. Em algumas concretizações, a fonte de carboidrato contatada com a célula oleaginosa isolada compreende uma substância a uma concentração letal para células não-modificadas do mesmo tipo de célula como a célula oleaginosa isolada. Em algumas concretizações, a substância é uma substância tóxica gerada durante pré-tratamento da fonte de carboidrato, por exemplo, ácido acético. Em algumas concretizações, a substância é a fonte de carboidrato. Em algumas concretizações, a fonte de carboidrato é um açúcar fermentável e a concentração do açúcar fermentável é pelo menos 80 g/l, pelo menos 100 g/l, pelo menos 200 g/l, ou pelo menos 300 g/l após contato com a célula oleaginosa. Em algumas concretizações, a fonte de carboidrato é contatada com a célula oleaginosa isolada sob condições não estéreis. Em algumas concretizações, a fonte de carboidrato contatada com a célula oleaginosa isolada é incubada sob condições não estéreis. Em algumas concretizações, a fonte de carboidrato contatada com a célula oleaginosa isolada é incubada em um reator aberto. Em algumas concretizações, a fonte de carboidrato é contatada com a célula oleaginosa isolada e incubada para conversão da fonte de carboidrato a um ácido graxo, ou um triacilglicerol em um processo alimentado por batelada. Em algumas concretizações, a fonte de carboidrato é contatada com a célula oleaginosa isolada e incubada para conversão da fonte de carboidrato a um ácido graxo, ou um triacilglicerol em um processo contínuo. Em algumas concretizações, o ácido graxo ou o triacilglicerol é extraído a partir da fonte de carboidrato contatada com a célula oleaginosa isolada por extração de solvente. Em algumas concretizações, a extração de solvente é um solvente de extração de hexano. Em algumas concretizações, o ácido graxo, ou o triacilglicerol, é separado a partir da fonte de carboidrato contatada com a célula oleaginosa isolada e, subsequentemente, refinado por transesterificação.

[014] Alguns aspectos desta invenção se referem a um método, compreendendo modificação do perfil de ácido graxo, do perfil de triacilglicerol, da taxa de síntese de ácido graxo, da taxa de síntese de triacilglicerol, da extensão do acúmulo de derivado de ácido graxo na célula, da taxa de secreção de derivado de ácido graxo, da taxa de conversão de carboidrato a ácido graxo, ou da taxa de conversão de derivado de ácido graxo, do rendimento eficiente de conversão de carboidrato a ácido graxo, ou conversão de derivado de ácido graxo, da tolerância de tensão osmótica, da taxa de proliferação, do volume da célula, ou da tolerância de uma substância tóxica de uma célula para uso na conversão de uma fonte de carboidrato em um ácido graxo, ou triacilglicerol, pelo aumento da expressão de um ou mais produto(s) de gene escolhido(s) a partir do grupo de Hemoglobina, Citocromo, GLUT, Enzima Málica, ACC, SCD, FAA1, ACS, ACS2, FAT1, FAT2, PCS60, ACLY, FAS, e produtos de gene AMPK, e/ou diminuição da expressão de JNK2 e/ou um gene delta-12 desaturase. Em algumas concretizações, a modificação do perfil de ácido graxo, do perfil de triacilglicerol, da taxa de síntese de ácido graxo, da taxa de síntese de triacilglicerol, da extensão do acúmulo de derivado de ácido graxo na célula, ou da taxa de secreção de derivado de ácido graxo da célula, está aumentando a quantidade de um ácido graxo, um derivado de ácido graxo, e/ou um triacilglicerol é sintetizado, acumulado ou secretado pela célula. Em algumas concretizações, a modificação da eficiência de conversão de carboidrato a ácido graxo, ou conversão de derivado de ácido graxo da célula está aumentando a eficiência de conversão por pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, ou pelo menos 5 vezes. Em algumas concretizações, o derivado de ácido graxo é um triacilglicerol. Em algumas concretizações, a modificação da tolerância de tensão osmótica, ou a tolerância de uma substância tóxica da célula, está conferindo tolerância de tensão osmótica, ou de uma substância tóxica a um nível letal a células não- modificadas do mesmo tipo de célula. Em algumas concretizações, a modificação da taxa de proliferação está aumentando a taxa de proliferação pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes. Em algumas concretizações, a modificação do volume da célula está aumentando a volume da célula pelo menos 2 vezes. Em algumas concretizações, a célula é uma célula de levedura. Em algumas concretizações, a levedura é uma levedura oleaginosa. Em algumas concretizações, a levedura oleaginosa é Y. lipolytica.

[015] Alguns aspectos desta invenção se referem a uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo a) uma sequência de nucleotídeo que codifica SEQ ID NO:1 (Y. lipolytica SCD), ou b) uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos 85% idêntica à sequência de nucleotídeo de (a). Em algumas concretizações, a sequência de nucleotídeo que codifica SEQ ID NO:1 é SEQ ID NO:2. Em algumas concretizações, a sequência de nucleotídeo é pelo menos 85% idêntica à sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:2. Em algumas concretizações, a sequência de nucleotídeo é pelo menos 90% idêntica à sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:2. Em algumas concretizações, a sequência de nucleotídeo é pelo menos 95% idêntica à sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:2. Em algumas concretizações, a sequência de nucleotídeo é pelo menos 97,5% idêntica à sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:2. Em algumas concretizações, a sequência de nucleotídeo é pelo menos 99% idêntica à sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:2. Em algumas concretizações, um construto de ácido nucleico é proporcionado que compreende uma molécula de ácido nucleico isolada conforme aqui descrito, por exemplo, uma molécula nucléica isolada conforme descrito neste parágrafo, e um promotor isolado heterólogo. Em algumas concretizações, o promotor é um promotor constitutivo ou um promotor induzível. Em algumas concretizações, o promotor constitutivo é um Promotor de Fator de Alongamento de Translação (TEF). Em algumas concretizações, o promotor induzível é um promotor induzível de fármaco. Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucleico isolada inclui um promotor de SDC modificado. Em algumas concretizações, a modificação é uma anulação, completa ou parcial, e/ou uma mutação de uma sequência de promotor de SDC tipo selvagem resultando em um rompimento da inibição de realimentação de referido promotor SCD em resposta a altos níveis de um ácido graxo, um derivado de ácido graxo, e/ou um triacilglicerol. Em algumas concretizações, a modificação é uma inserção de uma sequência heteróloga em uma região de promotor de SCD tipo selvagem, opcionalmente associada com uma anulação, completa ou em parte, e/ou uma mutação de uma sequência de promotor de SDC tipo selvagem, resultando em um rompimento da inibição de realimentação de referido promotor SCD em resposta a altos níveis de um ácido graxo, um derivado de ácido graxo, e/ou um triacilglicerol.

[016] Alguns aspectos desta invenção se referem a um vetor compreendendo um cassete de expressão, por exemplo, qualquer dos cassetes de expressão aqui mencionados. Alguns aspectos desta invenção se referem a uma célula compreendendo um cassete de expressão conforme aqui descrito, ou pelo menos uma parte de um vetor conforme aqui descrito.

[017] A matéria objeto deste pedido pode envolver, em alguns casos, produtos inter-relacionados, soluções alternativas a um problema particular, e/ou uma pluralidade de usos diferentes de um sistema único ou artigo.

[018] Outras vantagens, características e usos da invenção tornar- se-ão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada de concretizações não-limitativas da invenção, quando considerada em conjunto com os desenhos acompanhantes. Nos casos onde o presente relatório e um documento incorporado por referência incluem revelação conflitante, o presente relatório descritivo pode controlar.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[019] Figura 1: Perfil de ácido graxo de Yarrowia lipolytica. A) uma cultura de fase log de Y. lipolytica crescida em meio mínimo foi ensaiada para ácido graxo livre total (FFA) usando-se espectroscopia de massa de cromatografia de gás (GC-MS) em um experimento em frasco oscilante. B) FFA total foi ensaiado na mesma cultura sob mesmas condições durante a fase de crescimento estacionária. C) Lipídios totais (FFA e ácidos graxos esterificados) foram ensaiados na mesma cultura durante fase estacionária.

[020] Figura 2: Análise de lipídios totais em Yarrowia lipolytica. A) Crescimento de cepa tipo selvagem Y. lipolytica em meio mínimo até cultura de fase estacionária de 72 horas e ensaiado para lipídios totais usando-se GC-MS em um experimento em frasco oscilante. B) Lipídios totais foram ensaiados no crescimento de cepa mutante para fase estacionária (72 horas) e sobre-expressando SCD, um Δ9 nativo desaturase sob o controle de um promotor quase-constitutivo. C) Microscopia confocal no crescimento de cepa tipo selvagem para fase estacionária foi manchado com Nile vermelho. D) Crescimento de cepa mutante para fase estacionária foi manchado com Nile vermelho e analisado com microscópio confocal.

[021] Figura 3: Consumo de glicose de Y. lipolytica mutante-1 (sobre-expressando citocromo B, hemoglobina, Glut1, e Δ9-desaturase (SCD), (D9, ■)); e o tipo selvagem (LS, ♦) na glicose pura em frasco oscilante. Y. lipolytica mutante-1 exibe características mais rápidas de consumo de glicose, conforme comparado a Y. lipolytica tipo selvagem, e também um consumo completo de glicose, conforme comparado ao consumo incompleto observado no tipo selvagem.

[022] Figura 4: A) Consumo de açúcar em Y. lipolytica mutante 1 (sobre-expressando citocromo B, hemoglobina, Glut1, e Δ9-desaturase (SCD)), e mutante 2 (sobre-expressando citocromo B, hemoglobina, e Glut1) em 72 horas em hidrolisato de palha de milho (Hz). B) Produção de óleo em mutante 1 e mutante 2 horas em palha de milho Hz.

[023] Figura 5: Comparação das características de crescimento de micróbios tipo selvagem e micróbios projetados. YL-eng: mutante Y. lipolytica sobre-expressando Δ9-desaturase (SCD). YL-selvagem: Y. lipolytica tipo selvagem. As células foram crescidas em meio mínimo contendo uma concentração de açúcar de 250 g/l. Enquanto que as células tipo selvagem falham em crescerem sob estas condições, as células mutantes foram capazes de tolerar o alto nível de açúcares e cresceram bem, sugerindo que produtividade mais alta de biocombustível ou precursor de biocombustível pode ser alcançada nos processos usando-se cepas mutantes. Eixo-Y: Valores OD. Eixo-X: tempo em horas.

[024] Figura 6: Consumo de açúcar e características de crescimento de um Y. lipolytica mutante sobre-expressando Δ9- desaturase (SCD). As células foram crescidas em meio contendo 160 g/l de açúcar, e OD e o consumo de açúcar da cultura foram monitorados. As células mutantes consumiram o açúcar suprido dentro de 48 horas, e continuaram a crescer após reabastecimento alimentado por batelada de açúcares. Esta figura exemplifica uma concretização útil para processos de produção de operações alimentadas por batelada e semi-contínua de biocombustível.

[025] Figura 7: Produção de lipídio de Y. lipolytica projetado (sobre-expressando Δ9-desaturase (SCD), Citocromo B e hemoglobina).

[026] Figura 8: Perfil de ácido graxos de cepa mutante (sobre- expressando Δ9-desaturase (SCD), citocromo B e hemoglobina; barra esquerda em cada conjunto) e cepa tipo selvagem de Y. lipolytica (barra direita em cada conjunto) após 72 horas de cultura.

[027] Figura 9: Cinéticas de crescimento de cepas diferentes mutantes de Y. lipolytica comparadas a Y. lipolytica tipo selvagem, CB: citocromo B sobre-expressador. D9: SCD sobre-expressador.

[028] Figura 10: Cinéticas de crescimento de cepas diferentes mutantes de Y. lipolytica comparadas a Y. lipolytica tipo selvagem em níveis diferentes de glicose. Selvagem: Y. lipolytica tipo selvagem; C18: Y. lipolytica mutante sobre-expressando Δ9-desaturase (SCD).

[029] Figura 11: Cinéticas de crescimento e de produção de lipídio de (sobre-expressando Δ9-desaturase (SCD)) e Y. lipolytica mutante e tipo selvagem.

[030] Figura 12: pYLEX1, um vetor de expressão útil para expressão de transgene em Y. lipolytica (A). O vetor, que é bem conhecido àqueles técnicos no assunto, pode incluir um marcador de seleção, ou um marcador defectivo URA3, que é derivado a partir do gene URA3 de Y. lipolytica, que permite complementação de auxotrofia para uracila, tais como os marcadores URA3d descritos por LE DALL et al., Curr. Genet., 26, 38-44 (1994). As sequências para controle da expressão são, por exemplo, sequências promotoras e terminadoras que são ativas em Yarrowia. Em algumas concretizações, o vetor compreende um promotor induzível ou promotor constitutivo. Em algumas concretizações, os genes pode ser sobre-expressos em micróbios de pYLEX1, por exemplo, por clonagem de um construto de interesse, por exemplo, um SCD cDNA sob o controle de um promotor, em pYLEX1. Clonagens exemplares de citocromo B e hemoglobina cDNAs sob o controle de um promotor TEF são mostradas (B, C).

[031] Figura 13: Crescimento de micróbio projetado na biomassa de alga. Algas secas foram obtidas e autoclavadas para quebrar células e gelatinizar amidos. As células autoclavadas foram enzimaticamente tratadas com alfa-amilase para liberar glicose. O meio resultante foi inoculado com nossas células de leveduras mutantes contendo Δ9- desaturase e Citocromo, Glut1, e hemoglobina. O gráfico mostra crescimento robusto de Yarrowia mutante no meio de fermentação sem qualquer aditivo. As células obtiveram OD 43 em 4-5 dias. Isto mostra que não existe inibição no crescimento de levedura mutante.

[032] Figura 14: Microscopia das células de levedura crescidas em hidrolisatos de alga. As células foram crescidas nas condições descritas na Figura 13. As células foram coletadas e manchadas com Nile Vernelho para identificar óleo. As gotículas dentro das células de levedura representam óleo.

[033] Figura 15: Microscopia das células de levedura crescidas em glicerol cru. As células foram coletadas e manchadas com Nile Vermelho para identifocar óleo. As gotículas dentro das células de levedura representam óleo.

[034] Figura 16: Estrutura esquemática de um construto de um delta-12 desaturase contendo gene delta-12 desaturase flanqueando regiões e sequência de resistência á antibiótico, que é usada para gerar cepas delta-12 desaturase.

[035] Figura 17: Crescimento de micróbios projetados em 3% de acetato com adição de 2% de glicerol em 84 horas.

DESCRIÇÃO DETALHADA INTRODUÇÃO

[036] Em vista de diminuir os recursos de combustível fóssil, numerosos esforços de pesquisa foram direcionados para desenvolver alternativas renováveis. Uma abordagem promissora é projetar micróbios para a produção de biocombustíveis, por exemplo, biodiesel ou precursores de biodiesel, tais como triacilgliceróis, de fontes de carbono renováveis, por exemplo, pelo uso de micróbios que produzem ácidos graxos ou derivados de ácido graxo. Microalgas como uma matéria prima para produção de biocombustíveis (Gouveia L, Oliveira AC.J Ind Microbiol Biotechnol. 2009 Feb;36(2):269-74). Enquanto que alguns aspectos desta invenção se referem ao uso de micróbios fotossintéticos, tais como algas, para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível, o uso de micróbios fotossintéticos cria um conjunto de desafios tecnológicos (Cadoret JP, Bernard O.J Lipídio biofuel production with microalgae: potential and challenges Soc Biol. 2008; 202(3):201-11). O foco dos esforços de pesquisa está mudando em direção ao projeto de micróbios para converter fontes de carbono renováveis, por exemplo, açúcares fermentáveis derivados de biomassa (por exemplo, glicose ou açúcares de milho ou cana de açúcar), ou polímeros de carboidrato não-fermentáveis (por exemplo, celulose ou hemicelulose) em biocombustível ou precursores de biocombustível, em processos de fermentação no escuro.

[037] A produção de biocombustível economicamente viável requer (i) a identificação de um micróbio adequado, e (ii) o projeto de um fenótipo requerido e/ou desejável, que pode incluir traços múltiplos, no micróbio. Exemplos de tais traços requeridos e/ou desejáveis em tal fenótipo incluem, mas não são limitados a, produção de biomassa rápida e eficiente, vantagem de crescimento sobre micróbios indesejados, conversão de carboidrato em óleo idealmente perto da teórica e eficiente, e alto substrato e tolerância ao produto final. Alguns destes traços são pré-requisitos para produção de biocombustível à base de micróbio, economicamente viável em uma escala industrial. Idealmente, o micróbio projetado deve mostrar uma combinação de traços benéficos conferindo um fenótipo que permite conversão eficiente de uma fonte de carbono abundante a um biocombustível ou precursor de biocombustível, em uma maneira de custo eficiente, em escala. PRODUÇÃO MICROBIAL DE UM BIOCOMBUSTÍVEL OU PRECURSOR DE BIOCOMBUSTÍVEL

[038] Alguns aspectos desta invenção se referem a produção de biocombustível ou precursor de biocombustível mediada por micróbio. O termo "biocombustível" se refere a um combustível que é derivado de uma fonte biológica, tal como uma célula viva, micróbio, fungo ou planta. O termo inclui, por exemplo, combustível diretamente obtido de uma fonte biológica, por exemplo, por extração convencional, destilação, ou métodos de refino, e combustível produzido por processamento de um precursor de biocombustível obtido de uma fonte biológica, por exemplo, por modificação química, tais como procedimentos de transesteri- ficação. Exemplos de biocombustíveis que são diretamente obtidos são alcoóis, tais como etanol, propanol, e butanol, gordura e óleo. Exemplos de biocombustíveis que são obtidos por processamento de um precursor de biocombustível (por exemplo, um lipídio), são biodiesel (por exemplo, produzido por transesterificação de um lipídio), e combustíveis de óleo diesel verde/modificado (por exemplo, produzidos por hidrogenação de um óleo). O biodiesel, também referido como ácido graxo metila (ou etila) éster, é um dos biocombustíveis economicamente mais importantes hoje, e podem ser produzidos em uma escala industrial por transesterificação de lipídios, em que hidróxido de sódio e metanol (ou etanol) reagem com um lipídio, por exemplo, um triacilglicerol, para produzir biodiesel e glicerol. Estoques de alimentação para produção de biodiesel em escala industrial include gorduras animais, óleos vegetais, óleo de palma, cânhamo, soja, semente de colza, linho, girassol, e algas oleaginosas. Em outras abordagens, a biomassa é convertida por um micróbio em um precursor de biocombustível, por exemplo, um lipídio, que é subsequentemente extraído e adicionalmente processado para produzir um biocombustível. O termo "biomassa" se refere ao material produzido pelo crescimento e/ou propagação de uma célula viva ou organismo, por exemplo, um micróbio. A biomassa pode conter células, micróbios e/ou conteúdos intracelulares, por exemplo, ácidos graxos celulares e TAGS, bem como material extracelular. Material extracelular inclui, mas não é limitado a, compostos secretados por uma célula, por exemplo, ácidos graxos secretados ou TAGs. Tipos importantes de biomassa para produção de biocombustível são biomassa de alga e biomassa derivada de planta, por exemplo, palha de milho e fibra de madeira. Em algumas concretizações, a biomassa para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível pode compreender açúcares derivados de planta, por exemplo, cana de açúcar, ou açúcares derivados de milho.

[039] Alguns aspectos desta invenção se referem a identificação, projeto e desenvolvimento de uma fonte microbial de lipídios para produção de biodiesel em escala industrial, economicamente viável, nenhuma das quais tendo sido reportadas. O termo "lipídio" se refere a ácidos graxos e seus derivados. Consequentemente, exemplos de lipídios incluem ácidos graxos (FA, ambos saturados e insaturados); glicerídeos ou glicerolipídios, também referidos como acilgliceróis (tais como monoglicerídeos (monoacilgiceróis), diglicerídeos (diacilgliceróis), triglicerídeos (triacilgliceróis, TAGs, ou gorduras neutras); fosfoglice- rídeos (glicerofosfolipídios); não-glicerídeos (esfingolipídios, lipídeos esterol, incluindo colesterol e hormônios de esteróide, lipídios prenol, incluindo terpenóides, alcoóis graxos, ceras, e policetídeos); e derivados de lipídio complexos (lipídios ligados a açúcar ou glicolipídios, e lipídios ligados a proteína). Os lipídios são uma parte essencial da membrana de plasma de células vivas e micróbios. Algumas células e micróbios também produzem lipídios para armazenar energia, por exemplo, na forma de triacilgliceróis em gotículas de lipídio.

[040] Alguns aspectos desta invenção se referem a identificação de um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível baseada em um metabolismo de lipídeo adequado do micróbio. O termo "metabolismo de lipídeo" se refere aos processos moleculares que envolvem a criação ou degradação de lipídios. Síntese de ácido graxo, oxidação de ácido graxo, desaturação de ácido graxo, síntese de TAG, armazenagem de TAG e degradação de TAG, são exemplos de processos que são parte do metabolismo de lipídeo de uma célula. Consequentemente, o termo "metabolismo de ácido graxo" se refere a todos os processos celulares ou organísmico que envolvem a síntese, criação, transformação ou degradação de ácidos graxos. A síntese de ácido graxo, oxidação de ácido graxo, síntese de TAG e degradação de TAG, são exemplos de processos são parte do metabolismo de ácido graxo de uma célula.

[041] O termo "triacilglicerol" (TAG, as vezes também referido como triglicerídeo) se refere a uma molécula compreendendo uma molécula simples de glicerol covalentemente ligada a três moléculas de ácido graxo, ácidos monocarboxílicos alifáticos, via, ligações éster, uma em cada dos três grupos hidroxila (OH) da molécula de glicerol. Os triacilgliceróis são depósitos altamente concentrados de energia metabólica devido a sua natureza anidra reduzida, e são um estoque de alimentação adequado para produção de biodiesel.

[042] Muitas células e organismos armazenam energia metabólica na forma de ácidos graxos e derivados de ácido graxo, tais como TAGs. Os ácidos graxos e seus derivados, tais como TAGs, proporcionam uma forma ideal de armazenar energia metabólica. A energia contida nas ligações C-C pode ser eficientemente liberada por e—oxidação, uma reação formalmente equivalente ao reverso de biosíntese de ácido graxo, mas mediada e regulada por enzimas diferentes que constituem uma trajetória molecular diferente. Os micróbios podem derivar ácidos graxos de suprimento externo, renovação endógena, e de novo síntese. Alguns aspectos desta invenção se referem a identificação de um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível baseado na capacidade do micróbio sintetizar e armazenar ácidos graxos ou derivados de ácido graxo, tais como TAGs, eficientemente de uma fonte de carbono fornecida externamente. UM MICRÓBIO PARA PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEL

[043] Alguns aspectos desta invenção se referem a identificação de um micróbio adequado para conversão em escala industrial de carboidrato a lipídio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. Nenhum micróbio adequado foi identificado de modo que permitiria produção economicamente viável de biocombustível ou um precursor de biocombustível de uma fonte de carboidrato em uma escala industrial. Alguns aspectos desta invenção se referem a identificação de uma levedura oleaginosa, Y. lipolytica, como um organismo para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível baseado em metabolismo base favorável de Y. lipolytica.

[044] Y. lipolytica é uma levedura oleaginosa não-patogênica que pode usar uma variedade de fontes de carbono, incluindo ácidos orgânicos, hidrocarbonetos e várias gorduras e óleos. O termo "oleaginosa" se refere a um micróbio que pode acumular mais do que 20% de seu peso de célula seco como lipídio (ver C. Ratledge et al., Microbial routes to lipides. Biochem Soc Trans. 1989 Dec;17(6):1139- 41). De acordo com alguns aspectos desta invenção, Y. lipolytica representa um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível, porque Y. lipolytica é um aeróbio obrigatório com a capacidade de assimilar carboidratos, por exemplo, glicose, ou glicerol, como uma única fonte de carbono, e, comparado a outras cepas de levedura, Y. lipolytica tem uma fluxo mais alto de glicose para ácido graxo e triacilglicerol (TAG) e capacidade de armazenagem mais alta de lipídio. Ver, por exemplo, Beopoulos A, Cescut J, Haddouche R, Uribelarrea JL, Molina-Jouve C, Nicaud JM, Yarrowia lipolytica as a model for bio-oil production. Prog Lipide Res. 2009 Nov;48(6):375-87. Adicionalmente, Y. lipolytica é uma espécie de levedura e sequenciamento de genoma 'não-convencionais' mais intensamente estudados, incluindo DNA mitocondrial, de Y. lipolytica foi completado recentemente. Kerscher S, Durstewitz G, Casaregola S, Gaillardin C, Brandt U., The complete mitochondrial genome of Yarrowia lipolytica. Comp Funct Genomics. 2001;2(2):80-90. A disponibilidade de dados de sequência genômica torna a manipulação genética mais acessível, mesmo embora a anotação funcional de sequências genômicas não seja completa. Ver, por exemplo, Sokolova L, Wittig I, Barth HD, Schagger H, Brutschy B, Brandt U., LILBID-mass spectrometry of protein complexes from blue-native gels, a sensitive top-down proteomic approach. Proteomics. Published online 2010 Feb 1, PMID: 20127694.

[045] No Y. lipolytica tipo selvagem, a síntese de ácido graxo e TAG de uma fonte de carbono é disparada durante a fase de crescimento estacionário, sugerindo um mecanismo regulatório hermético no lugar de controlar o metabolismo de lipídeo. Este mecanismo regulatório controla a quantidade de lipídios que pode ser sintetizado e armazenado, que significantemente limita a produção de conversão de estoque de alimentação para lipídios. Consequentemente, os parâmetros metabólicos de Y. lipolytica tipo selvagem não são adequados para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível em escala industrial economicamente viável. UM REGULADOR MICROBIAL CHAVE DE METABOLISMO DE ÁCIDO GRAXO

[046] Alguns aspectos desta invenção se referem as surpreendentes descobertas que (i) ácidos graxos saturados inibem de novo síntese de ácido graxo e armazenagem de TAG, via um circuito fechado de estoque de alimentação, e (ii) que sobre-expressão de SCD, uma Δ9- desaturase, em um micróbio adequado para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível, por exemplo, Y. lipolytica, é suficiente para exceder esta inibição de realimentação de síntese de ácido graxo e armazenagem de TAG, resultando em síntese significantemente aumentada, armazenagem de ácidos graxos e/ou TAGs.

[047] Alguns aspectos desta invenção se referem a surpreendente descoberta que, em adição ao efetuamento de síntese aumentada e armazenagem de ácidos graxos e/ou TAGs, sobre-expressão de SCD em um micróbio confere adicionalmente um fenótipo benéfico para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível a um micróbio, por exemplo, Y. lipolytica, incluindo, mas não limitado a: (i) hiperativação da trajetória de armazenagem de TAG, (ii) vantagem de crescimento, (iii) produção contínua de óleo, (iv) tolerância elevada para substâncias de fonte de carboidrato (por exemplo, glicose e outros açúcares) no meio de cultura, e (v) modificação do perfil de ácido graxo, por exemplo, uma alteração das proporções de ácidos graxos saturados a insaturados favoráveis para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível.

[048] A descoberta de SCD como um regulador chave de metabolismo de ácido graxo e síntese de TAG em micróbios oleaginosos, de acordo com esta invenção, tem maior implicação para processos que objetivam converter fontes de carbono renováveis em biocombustível ou precursor de biocombustível, com a ajuda de células projetadas. Baseado em alguns aspectos desta invenção, é agora possível modificar o perfil do ácido graxo e/ou TAG de um microorganismo, por exemplo, uma levedura oleaginosa, tal como Y. lipolytica, em um modo que confere fenótipos altamente desejáveis para conversão em escala industrial de carboidrato a biocombustível ou precursor de biocombustível, tal como aumento notável na síntese de ácido graxo, síntese de TAG, ácido graxo e TAG, produção de biomassa, e tolerância elevada de alto substrato, produto, e/ou concentração de toxina no meio de cultura.

[049] De acordo com alguns aspectos desta invenção, a modificação do lipídio ou metabolismo de ácido graxo em um micróbio de acordo com métodos aqui proporcionados, por exemplo, por sobre- expressando SCD sozinho ou em combinação com outras modificações genéticas ou não-genéticas, conforme aqui proporcionado, permite a geração de um micróbio otimizado para uso na produção de processos de biocombustível ou precursor de biocombustível. Alguns aspectos desta invenção se referem ao projeto do metabolismo de ácido graxo em um micróbio, resultando em taxa de síntese aumentada e acúmulo de ácidos graxos e derivados de ácidos graxo no micróbio.

[050] As moléculas de ácido graxo naturais comumente têm uma cadeia alifática não-ramificada ou calda, de 4 a 28 átomos de carbono. Os ácidos graxos são referidos como "saturados", se todos os átomos de carbono da cadeia alifática são ligados, via uma ligação simples CC, ou como "insaturados", se dois ou mais átomos de carbono são ligados, via uma dupla ligação C-C. Os ácidos graxos insaturados desempenham um papel importante na regulação de fluidez da membrana, atividade celular, metabolismo e eventos nucleares que controlam a transcrição de gene.

[051] O espectro de ácidos graxos na levedura consiste na maioria de C16 e C18 ácidos graxos, por exemplo, ácido palmítico (C16), ácido palmitoleico (C16), ácido esteárico (C18) e ácido oleico (C18). O ácido palmítico é um ácido graxo saturado não-ramificado, com uma cadeia alifática de 16 átomos de carbono (átomos de carbono/ligações insaturadas: 16.0). O ácido esteárico é um ácido graxo saturado não- ramificado com uma cadeia alifática de 18 átomos de carbono (18.0). O ácido palmitoleico é um ácido graxo mono-insaturado com uma cadeia alifática de 16 átomos de carbono (16.1). O ácido oleico é um ácido graxo mono-insaturado com uma cadeia alifática de 18 átomos de carbono (18.1). Espécies menores de ácido graxo em levedura incluem C14 e C26 ácidos graxos, que desempenham funções essenciais na modificação de proteína, ou como componentes de esfingolipídios e âncoras de GPI, respectivamente.

[052] De novo síntese de ácidos graxos utiliza quantidades substanciais de metabólitos, acetila-CoA, ATP e NADPH, e, desse modo, compete com outros processos celulares que são dependentes destes compostos. NADPH é requerido para duas etapas de redução do ciclo de alongamento de ácido graxo, ligando síntese de ácido graxo ao estado metabólico da célula, e resulta em síntese de ácido graxo sendo restrita a condições de alta carga de energia das células, indicadas pelo aumento da proporção aumentada de ATP/AMP, equivalentes de redução elevados e conjunto elevado de acetila-CoA. Quase todas as organelas subcelulares são envolvidas no metabolismo de ácido graxo, indicando que a manutenção de homeostase de ácido graxo requer regulação em níveis múltiplos.

[053] Muitos organismos, incluindo levedura, são capazes de sintetizar ácidos graxos de novo de uma variedade de fontes de carbono. Em uma etapa inicial, acetila-CoA é carboxilatada pela adição de CO2 a malonila-CoA, pela enzima acetila-CoA carboxilase (ACC; codificado por ACC1 e HFA1 em levedura). Biotin é um co-fator essencial nesta reação, e é covalentemente fixada a ACC apoproteína, pela enzima biotin:apoproteína ligase (codificado por BPL1/ACC2 em levedura). ACC é uma enzima trifuncional, que abriga um domínio de proteína transportadora de carboxila biotin (BCCP), um domínio de biotin-carboxilase (BC), e um domínio carboxila-transferase (CT). Em muitas bactérias, estes domínios são expressos como polipeptídios individuais e montados em um complexo heteromérico. Em contraste, ACC eucariótico, incluindo variantes ACC mitocondriais (Hfa1 em levedura) abriga estas funções em um polipeptídio simples. Malonila- CoA produzida por ACC serve como um doador de dois carbonos em uma série cíclica de reações catalisadas por ácido graxo sintase, FAS, e elongases.

[054] Na levedura, as funções individuais envolvidas na síntese de ácido graxo citosólica são representadas como domínios discretos em cadeias de polipeptídio simples ou em duas cadeias de polipeptídio diferentes, respectivamente. A levedura citosólica de ácido graxo sintase (FAS) é um complexo composto de duas subunidades, Fas1 (β subunidade) e Fas2 (α subunidade) que são organizadas como um complexo hexamérico α6β6. Fas1 abriga atividades de acetila transferase, enoila redutase, dehidratase, e malonila-palmitoila transferase; Fas2 contém atividades de proteína transportadora de acila, 3-cetoredutase, 3-cetosintase e a fosfopanteteína transferase.

[055] A síntese mitocondrial de ácido graxo em levedura é efetuada por um sistema tipo II FAS, abrigando as atividades enzimáticas individuais nos polipeptídios distintos: Acp1, proteína transportadora de acila que transporta o grupo fosfopanteteína prostético; Cem1, β-cetoacila-ACP sintase; Oar1, 3-oxoacila-[proteína transportadora de acila] redutase; Htd2, 3-hidroxiacila-tioéster dehidratase; Etr1, enoila-ACP redutase. O Ppt2 funciona como a fosfopanteteína: proteína transferase, catalisando a fixação do grupo prostético de fosfopanteteína ao apoACP.

[056] Os produtos imediatos de de novo síntese de ácido graxo são ácidos graxos saturados. Os ácidos graxos saturados são conhecidos por serem os precursores de ácidos graxos insaturados em eucariotes, incluindo levedura. Ácidos graxos insaturados são geralmente produzidos por desaturação de ligações simples C-C em ácidos graxos saturados por enzimas especializadas, denominadas desaturases. Os mecanismos de controle que controlam a conversão de ácidos graxos saturados a ácidos graxos insaturados não são bem compreendidos. Em eucariotes, os ácidos graxos insaturados desempenham papéis importantes na regulação de fluidez de membrana, atividade celular, metabolismo e eventos nucleares que controlam transcrição de gene. Tipicamente, cerca de 80% de ácidos graxos de levedura são monoinsaturados, significando que eles contêm uma ligação insaturada em sua cadeia alifática.

[057] Uma etapa crítica na biosíntese de ácidos graxos monoinsaturados é a introdução da primeira ligação cis-dupla na posição Δ9 (entre carbonos 9 e 10). Esta reação oxidante é catalisada por estearoila-CoA desaturase (SCD, também conhecida como delta-9- desaturase, ou Δ9-desaturase). Embora a inserção da ligação dupla ocorra em vários substratos diferentes de metileno-interrompido graxo acila-CoA, os substratos preferidos de SCD são palmitoila (16.0)- e estearoila (18.0)-CoA que são convertidos em palmitoleoila (16.1)- e oleoila(18.1)-CoA, respectivamente (Ntambi, J. Lipide Res., 1999, 40, 1549-1558).

[058] Em S. cerevisiae, um gene estearoila-CoA desaturase foi identificado como Ole1 em 1990 (Stukey JE, et al., J Biol Chem., 1990, 265(33):20144-9). O gene humano estearoila-CoA desaturase foi parcialmente caracterizado em 1994, via isolamento de 0,76 kb de cDNA parcial de tecido adiposo humano (Li et al., Int. J. Cancer, 1994, 57, 50 348-352). O gene foi totalmente caracterizado em 1999 e foi verificado que uso alternativo de locais de poliadenilação gerou dois transcritos de 3,9 e 5,2 kb (Zhang et al., Biochem. J., 1999, 340, 255264). Em S. cerevisiae, monodesaturação de ácido graxo é catalisada pelo retículo endoplasmático (ER)-residente e essencial Δ9-desaturase, Ole1 (Martin CE, Oh CS, Jiang Y, Regulation of long chain unsaturated synthesis of fatty acid in yeast.. Biochim Biophys Acta. 2007 Mar;1771(3):271-85. Epub 2006 Jul 13.

[059] Alguns aspectos desta invenção se referem, pelo menos em parte, a identificação do S. cerevisiae Ole1 homólogo SCD em Y. lipolytica, conforme aqui descrito.

[060] Exemplos não-limitativos de sequências representativas de Y. lipolytica SCD são dados abaixo: >gi|50548053|ref|XP_501496.1| YALI0C05951p [Yarrowia lipolytica] MVKNVDQVDLSQVDTIASGRDVNYKVKYTSGVKMSQGA YDDKGRHISEQPFTWANWHQHINWLNFILVIALPLSSFAAAPFVSFN WKTAAFAVGYYMCTGLGITAGYHRMWAHRAYKAALPVRIILALFGGG AVEGSIRWWASSHRVHHRWTDSNKDPYDARKGFWFSHFGWMLLV PNPKNKGRTDISDLNNDWVVRLQHKYYVYVLVFMAIVLPTLVCGFGW GDWKGGLVYAGIMRYTFVQQVTFCVNSLAHWIGEQPFDDRRTPRDH ALTALVTFGEGYHNFHHEFPSDYRNALIWYQYDPTKWLIWTLKQVGL AWDLQTFSQNAIEQGLVQQRQKKLDKWRNNLNWGIPIEQLPVIEFEE FQEQAKTRDLVLISGIVHDVSAFVEHHPGGKALIMSAVGKDGTAVFN GGVYRHSNAGHNLLATMRVSVIRGGMEVEVWKTAQNEKKDQNIVSD ESGNRIHRAGLQATRVENPGMSGMAA (SEQ ID NO:1) >gi|50548052|ref|XM_501496.1| Yarrowia lipolytica YALI0C05951p (YALI0C05951g) mRNA, cds completo ATGGTGAAAAACGTGGACCAAGTGGATCTCTCGCAGGT CGACACCATTGCCTCCGGCCGAGATGTCAACTACAAGGTCAAGTA CACCTCCGGCGTTAAGATGAGCCAGGGCGCCTACGACGACAAGG GCCGCCACATTTCCGAGCAGCCCTTCACCTGGGCCAACTGGCAC CAGCACATCAACTGGCTCAACTTCATTCTGGTGATTGCGCTGCCT CTGTCGTCCTTTGCTGCCGCTCCCTTCGTCTCCTTCAACTGGAAG ACCGCCGCGTTTGCTGTCGGCTATTACATGTGCACCGGTCTCGGT ATCACCGCCGGCTACCACCGAATGTGGGCCCATCGAGCCTACAA GGCCGCTCTGCCCGTTCGAATCATCCTTGCTCTGTTTGGAGGAGG AGCTGTCGAGGGCTCCATCCGATGGTGGGCCTCGTCTCACCGAG TCCACCACCGATGGACCGACTCCAACAAGGACCCTTACGACGCC CGAAAGGGATTCTGGTTCTCCCACTTTGGCTGGATGCTGCTTGTG CCCAACCCCAAGAACAAGGGCCGAACTGACATTTCTGACCTCAAC AACGACTGGGTTGTCCGACTCCAGCACAAGTACTACGTTTACGTT CTCGTCTTCATGGCCATTGTTCTGCCCACCCTCGTCTGTGGCTTT GGCTGGGGCGACTGGAAGGGAGGTCTTGTCTACGCCGGTATCAT GCGATACACCTTTGTGCAGCAGGTGACTTTCTGTGTCAACTCCCT TGCCCACTGGATTGGAGAGCAGCCCTTCGACGACCGACGAACTC CCCGAGACCACGCTCTTACCGCCCTGGTCACCTTTGGAGAGGGC TACCACAACTTCCACCACGAGTTCCCCTCGGACTACCGAAACGCC CTCATCTGGTACCAGTACGACCCCACCAAGTGGCTCATCTGGACC CTCAAGCAGGTTGGTCTCGCCTGGGACCTCCAGACCTTCTCCCAG AACGCCATCGAGCAGGGTCTCGTGCAGCAGCGACAGAAGAAGCT GGACAAGTGGCGAAACAACCTCAACTGGGGTATCCCCATTGAGCA GCTGCCTGTCATTGAGTTTGAGGAGTTCCAAGAGCAGGCCAAGAC CCGAGATCTGGTTCTCATTTCTGGCATTGTCCACGACGTGTCTGC CTTTGTCGAGCACCACCCTGGTGGAAAGGCCCTCATTATGAGCGC CGTCGGCAAGGACGGTACCGCTGTCTTCAACGGAGGTGTCTACC GACACTCCAACGCTGGCCACAACCTGCTTGCCACCATGCGAGTTT CGGTCATTCGAGGCGGCATGGAGGTTGAGGTGTGGAAGACTGCC CAGAACGAAAAGAAGGACCAGAACATTGTCTCCGATGAGAGTGGA AACCGAATCCACCGAGCTGGTCTCCAGGCCACCCGGGTCGAGAA CCCCGGTATGTCTGGCATGGCTGCTTAG (SEQ ID NO:2)

[061] Estearoila-CoA desaturase, ou SCD, introduz uma ligação dupla no Δ9-C destes ácidos graxos de substrato esterificados com CoA. Esta atividade afeta a proporção de ácidos graxos saturados para insaturados, por exemplo, de ácido esteárico para ácido oleico. O ácido esteárico é o substrato primário para SCD; contudo, outros ácidos graxos de comprimento de cadeia podem ser processados também por SCD. Em humanos, Estearoila-CoA desaturase foi vista como uma enzima lipogênica não somente para seu papel chave na biosíntese de ácidos graxos monoinsaturados, mas também para seu padrão de regulação por dieta e insulina (Ntambi, Lipide Res., 1999, 40, 15491558). A regulação de estearoila-CoA desaturase é, portanto, de importância fisiológica considerável, e sua atividade é sensível a mudanças dietéticas, desequilíbrio hormonal, processos de desenvolvimento, mudanças de temperatura, metais, álcool, proliferadores peroxisomais, e compostos fenólicos (Ntambi, Lipídio Res., 1999, 40, 1549-1558).

[062] Modelos de animal foram muito úteis nas investigações da regulação de estearoila-CoA desaturase por ácidos graxos poli- insaturados (PUFAs). Por exemplo, em tecido adiposo de ratos Zucker magros e obesos, Jones et al. observaram uma diminuição de 75% em estearoila-CoA desaturase mRNA quando ambos os grupos foram alimentados com uma dieta alta em PUFAs relativa a uma dieta de controle (Jones et al, Am. J. Physiol., 1996, 271, E44-49). Resultados similares foram obtidos com sistemas de cultura de tecido. Na linha de célula adipócita de murina 3T3-L1, os ácidos araquidônico, linoleico linolênico e eicosapentanenóico diminuíram a expressão de estearoila- CoA desaturase em uma maneira dependente da dose (Sessler et al, J. Biol. Chem., 1996, 271, 29854-29858).

[063] Os mecanismos moleculares pelos PUFAs que regulam a expressão de gene de estearoila-CoA desaturase em tecidos diferentes são ainda pobremente compreendidos. A compreensão atual do mecanismo regulatório envolves ligação de PUFAs a uma proteína de ligação de PUFA putativa, após a qual repressão de transcrição ocorre, via ligação da proteína de ligação de PUFA a um elemento de resposta de PUFA de cis-ação do gene de estearoila-CoA desaturase (SREBP) (Ntambi, Lipide Res., 1999, 40, 1549-1558; Zhang et al, Biochem. J., 2001, 357, 183-193).

[064] Enquanto que a regulação da atividade catalítica do gene SCD foi investigada em organismos diferentes, as implicações de expressão de gene SCD e regulação no próprio metabolismo de lipídeo não foram o objetivo de estudo extensivo. Foi citado que SCD afeta a proporção de ácidos graxos saturados a insaturados, por exemplo, de ácido esteárico a ácido oleico.

[065] Alguns aspectos desta invenção se referem a surpreendente descoberta que SCD também funciona como um regulador chave de ácido graxo e metabolismo de TAG em micróbios, por exemplo, em Y. lipolytica. Alguns aspectos desta invenção se referem a surpreendente descoberta que a sobre-expressão de um produto de gene de SCD sozinho não somente proporciona a proporção de ácidos graxos saturados a insaturados nas células afetadas, mas é suficiente para disparar aumento marcável e inesperado na taxa de síntese de ácido graxo e/ou TAG, e/ou armazenagem. A descoberta inesperada que a manipulação de expressão de desaturase sozinha confere fenótipos altamente desejáveis a micróbios, por exemplo, células de leveduras oleaginosas, para conversão de carboidrato em lipídio em escala industrial, tem implicações de alcançar a produção eficiente de biocombustíveis ou precursores de biocombustível de fontes de carbono renováveis por processos de fermentação mediados por micróbio. O excesso da regulação descendente de síntese de ácido graxo e armazenagem por sobre-expressão de SCD em um micróbio, não somente confere taxa de síntese de ácido graxo aumentada e acúmulo no micróbio, mas também excede a restrição de síntese de FA/TAG à fase estacionária de um micróbio na cultura. Surpreendentemente, a sobre-expressão de SCD em um micróbio, por exemplo, um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível, também confere tolerância aumentada a alta concentração de substrato, por exemplo, de açúcares fermentáveis, e a substâncias tóxicas associadas a substrato, por exemplo, sub-produtos de procedimentos de pré-tratamento de substrato, ao micróbio. Os fenótipos conferidos pela sobre-expressão de SCD, por exemplo, a tolerância aperfeiçoada de fenótipos descrita acima, permite a obtenção de altas concentrações de lipídios em processos de fermentação industriais que convertem açúcares em lipídios. (Ver figura 11 para regulação de excesso de síntese negativa de FA por sobre-expressão de SCD).

[066] De acordo com alguns aspectos desta invenção, a manipulação de genes adicionais pode ser benéfica para a produção de grande escala de biocombustível ou precursor de biocombustível de uma fonte de carbono por fermentação microbial. Por exemplo, genes que efetuam o desvio de substratos contendo carbono, por exemplo, açúcares, para síntese de ácido graxo. Consequentemente, alguns aspectos desta invenção proporcionam métodos para manipular a expressão de genes envolvidos na regulação de fluxo de carbono dentro ou fora de trajetórias de síntese de lipídio para alcançar um aperfeiçoamento nos parâmetros de produção de lipídio.

[067] Alguns aspectos desta invenção proporcionam um método para a manipulação da expressão e/ou atividade de outros produtos de gene que regulam o metabolismo de lipídeo de micróbios para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. As manipulações de acordo com aspectos desta invenção são alvos para aumentar conversão de carboidrato a ácido graxo e/ou TAG de modo a otimizar o organismo manipulado para produção de lipídios de grande escala das fontes de carboidrato. As manipulações proporcionados, de acordo com alguns aspectos desta invenção, por exemplo, sobre-expressão, knockout, knock-down, ativação e/ou inibição de produtos de gene específicos, podem ser efetuadas sozinhas ou em combinação, e/ou em combinação com outras manipulações conhecidas aqueles técnicos no assunto. O termo "manipulação" se refere a ambas manipulação genética, por exemplo, sobre-expressão, knockout, knock-down, ativação e/ou inibição de produtos de gene específicos, e manipulação não-genética, por exemplo, manipulação do meio de crescimento, substrato, pré-tratamento de substrato, pH, temperatura, processo de conversão, etc.

[068] Uma manipulação de expressão de gene, também referida aqui como uma modulação de expressão de gene, pode ser um rompimento ou inibição da regulação natural de expressão, uma sobre- expressão, uma inibição de expressão, ou um abolimento completo de expressão de um dado gene. Uma inserção de um promotor heterólogo à montante de uma sequência de gene nativo, por exemplo, uma sequência de gene nativo de SCD, ou a anulação de sequências regulatórias dentro de um promotor, por exemplo, sequências regulatórias que mediam a inibição de realimentação do gene SCD por ácidos graxos saturados, são exemplos de um rompimento ou inibição da regulação natural de expressão. As estratégias para a modulação de expressão de gene pode incluir alterações genéticas, por exemplo, por tecnologias recombinantes, tais como gene que tem como alvo ou transduções virais, ou alterações não-genéticas, por exemplo, alterações ambientais conhecidas por resultar na regulação ascendente e descendente de expressão de gene, ou distribuição transiente de moduladores, por exemplo, fármacos ou moléculas de RNA pequenas para as células alvos. Métodos para alteração genéticas e não-genéticas de micróbios são bem conhecido àqueles técnicos no assunto, e são descritos, por exemplo, em J. Sambrook and D. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (January 15, 2001); David C. Amberg, Daniel J. Burke; e Jeffrey N. Strathern, Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (April 2005); John N. Abelson, Melvin I. Simon, Christine Guthrie, and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Part A, Volume 194 (Methods in Enzymology Series, 194), Academic Press (March 11, 2004); Christine Guthrie and Gerald R. Fink, Guide to Levedura Genetics e Molecular and Cell Biology, Part B, Volume 350 (Methods in Enzymology, Vol 350), Academic Press; 1st edition (July 2, 2002); Christine Guthrie and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part C, Volume 351, Academic Press; 1st edition (July 9, 2002); Gregory N. Stephanopoulos, Aristos A. Aristidou and Jens Nielsen, Metabolic engineering: Principles and Methodologies, Academic Press; 1 edition (October 16, 1998); and Christina Smolke, The Metabolic Pathway Engineering Handbook: Fundamentals, CRC Press; 1 edition (July 28, 2009), todos dos quais são incorporados aqui por referência.

[069] O termo "sobre-expressão", conforme aqui usado, se refere a um nível aumentado de expressão de um dado gene em uma dada célula, tipo de célula ou estado de célula, conforme comparado a uma célula de referência, por exemplo, uma célula tipo selvagem do mesmo tipo de célula, ou uma célula do mesmo tipo de célula, mas carecendo de uma modificação específica, por exemplo, uma modificação genética. A expressão contínua forçada do gene SCD em células de Y. lipolytica que exibem concentrações de ácidos graxos saturados que inibiriam expressão de gene de SCD em células tipo selvagem é um exemplo de sobre-expressão de gene.

[070] O termo "knockout", conforme aqui usado, se refere ao rompimento funcional da expressão de um produto de gene, por exemplo, um RNA ou proteína. Isto é normalmente alcançado pelo alvejamento de uma respectiva região genômica com um construto alvo, que recombina com uma parte específica de referida região genômica e ou anula uma parte de referida região e/ou insere um nucleotídio heterólogo, ou sequência de nucleotídeo, resultando em uma inibição completa de expressão de um produto de gene, por exemplo, um mRNA ou proteína, a partir do gene recombinado. Em diplóides, tais eventos de recombinação homóloga normalmente somente afetam um dos dois alelos. A homozigosidade pode ser alcançada por várias estratégias, por exemplo, por geração de heterozigotos e classificação da descendência. Em organismos diplóides, por exemplo, levedura, o termo "cepa de knockout" geralmente se refere a uma cepa homozigota para um alelo não-funcional.

[071] O termo "knock-down", conforme aqui usado, se refere a inibição parcial da expressão de um produto de gene, por exemplo, um mRNA ou proteína. Várias estratégias para knockdown de gene conhecidas na técnica podem ser usadas para inibir expressão de gene (por exemplo, expressão de um gene que inibe ou desvia recursos para fora das trajetórias de síntese de lipídio, tais como ACS2, FAT1, PCS60, e/ou AMPK em levedura oleaginosa, por exemplo, em Y. lipolytica). Por exemplo, estratégias de knockdown de gene podem ser usadas, que fazem uso de interferência de RNA (RNAi) e/ou trajetórias de microRNA (miRNA) incluindo RNA de pequena interferência (siRNA), RNA de grampo de cabelo curto (shRNA), RNA de trançado duplo (dsRNA), miRNAs, e outras moléculas à base de ácido nucleico de interferência pequenas conhecidas na técnica. Em uma concretização, modalidades de RNAi à base de vetor (por exemplo, construtos de expressão de shRNA ou shRNA-mir) são usadas para reduzir expressão de um gene (por exemplo, de um gene que inibe ou desvia recursos fora das trajetórias de síntese de lipídio, tais como ACS2, FAT1, PCS60, e/ou AMPK) em uma célula (por exemplo, em uma célula de levedura oleaginosa, tal como uma célula de Y. lipolytica célula). Os plasmídeos isolados de acordo com os aspectos desta invenção podem compreender um promotor operavelmente ligado a um gene que codifica um ácido nucleico de interferência pequeno, por exemplo, um shRNA. Em algumas concretizações, um vetor de plasmídeo isolado pode ser empregado para gerar uma partícula viral, por exemplo, um retrovírus ou bacteriófago, capaz de infectar uma célula, por exemplo, uma célula de levedura ou célula bacterial. Vírus exemplares incluem adenovírus, retrovírus, lentivírus, vírus adeno-associados, fagos e outros que são conhecidos na técnica e aqui revelados.

[072] Alguns aspectos desta invenção proporcionam um método para a manipulação da atividade de um estearoila-CoA-desaturase (SCD) em um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. SCD é uma Δ9 desaturase que insere uma ligação dupla entre C9 e C10 de ácido esteárico acoplado a CoA, uma etapa chave na geração de ácidos graxos saturados e seus derivados, conforme descrito em maiores detalhes aqui em toda parte. Em algumas concretizações, a manipulação é uma sobre-expressão. Em algumas concretizações, a manipulação é efetuada por contato de um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível com um construto de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica para um produto de gene de SCD, por exemplo, uma proteína de SCD, operavelmente ligada a um promotor heterólogo, por exemplo, um promotor constitutivo ou um promotor induzível. Em algumas concretizações, o ácido nucleico que codifica para um produto de gene de SCD compreende a sequência de codificação de SEQ ID NO: 2. Em algumas concretizações, o SCD é SCD de Y. lipolytica, por exemplo, SCD de Y. lipolytica compreendendo a sequência de amino ácido de SEQ ID NO: 1. Em algumas concretizações, o micróbio é Y. lipolytica. Em algumas concretizações, a manipulação da atividade de um SCD em um micróbio é efetuada para conferir um fenótipo benéfico para conversão de carboidrato a lipídio em grande escala, por exemplo, taxa de síntese de lipídio aumentada, eficiência aumentada de conversão de carboidrato a lipídio, armazenagem aumentada de lipídio e, taxa de crescimento aumentada, tolerância aumentada a concentrações elevadas de uma fonte de carbono, ou um produto de lipídio. O gene de estearoila-CoA Desaturase e sequências de produto de gene são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. Gene e sequências de produto de gene exemplares e representativos podem ser encontrados sob a entrada de GeneID: 852825 na base de dados NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

[073] Alguns aspectos desta invenção proporcionam um método para a manipulação da atividade de um produto de gene c-Jun N- terminal kinase 2 (JNK2) em um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. JNK2 está localizado no citoplasma e catalisa a quebra de ácidos graxos energia e geração de bloqueio de carbono durante inanição. JNK2 é requerido para homoeostase de energia e desempenha um papel crucial na ativação de lipase em resposta a níveis baixos de açúcar celular. Ver, Grimard V, Massier J, Richter D, Schwudke D, Kalaidzidis Y, Fava E, Hermetter A, Thiele C., siRNA screening reveals JNK2 as an evolutionary conserved regulator of trigliceride homeostasis. J Lipide Res. 2008 Nov;49(11):2427-40. Epub 2008 Jul 8. Em algumas concretizações, atividade de JNK2 é abolida ou diminuída em um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível, por exemplo, por knockout ou knockdown, respectivamente. Em algumas concretizações, a atividade de JNK2 é diminuída em um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível de modo a aumentar a estabilidade do produto e/ou diminuir o catabolismo do produto. Em algumas concretizações, um sistema de repressão condicional é usado e atividade de JNK2 é reprimida durante uma fase no processo de produção em que a fonte de carboidrato, por exemplo, um açúcar fermentável, é muito baixa. Em algumas concretizações, a manipulação da atividade de um produto de gene de JNK2 em um micróbio é efetuada para conferir um fenótipo benéfico para conversão de carboidrato a lipídio em grande escala, por exemplo, taxa de síntese de lipídio aumentada, eficiência aumentada de conversão de carboidrato a lipídio, armazenagem aumentada de lipídio e, taxa de crescimento aumentada, tolerância aumentada a concentrações elevadas de uma fonte de carbono, ou um produto de lipídio. O gene e sequências de produto de gene de GNK2 são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. Gene e sequências de produto de gene exemplares representativos podem ser encontrados sob a entrada para GeneID: 5601 na base de dados NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

[074] Alguns aspectos desta invenção proporcionam um método para a manipulação da atividade de um produto de gene delta-12 desaturase em um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. Delta-12 desaturase está envolvido na conversão de ácido oleico contendo lipídios para lipídios de cadeia mais alta. Em algumas concretizações, é desejável evitar ou minimizar a produção de ácidos graxos de cadeia longa para a produção de biocombustível, por exemplo, em vista das propriedades de fluxo frio do biocombustível resultante. Em algumas concretizações, a atividade de delta-12 desaturase é abolida ou diminuída em um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível, por exemplo, por anulação ou knockdown completa ou parcial de gene (por exemplo, knockout), respectivamente. Em algumas concretizações, a atividade de delta-12 desaturase é diminuída em um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível de modo a aumentar a estabilidade do produto, alcançar um perfil de TAG desejável no micróbio, e/ou diminuir o catabolismo do produto. Em algumas concretizações, um sistema de repressão condicional é usado para a repressão de atividade de delta-12 desaturase. Em algumas concretizações, a manipulação da atividade de um produto de gene delta-12 desaturase em um micróbio é afetuada para conferir um fenótipo benéfico para conversão de carboidrato a lipídio em grande escala, por exemplo, taxa de síntese de lipídio aumentada, eficiência aumentada de conversão de carboidrato a lipídio, armazenagem aumentada de lipídio, teor aumentado de C18 ácidos graxos, percentagem aumentada de C18 ácidos graxos da reunião total de ácido graxo no micróbio, propriedades aperfeiçoadas de fluxo frio dos lipídios produzidos, óleos, ou TAGs, taxa de crescimento aumentada, tolerância aumentada a concentrações elevadas de uma fonte de carbono, ou um produto de lipídio. O gene e sequências de produto de gene de Delta- 12 desaturase são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. Gene e sequências de produto de gene exemplares representativos podem ser encontrados sob a entrada para GeneID: 2909806 na base de dados NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

[075] Alguns aspectos desta invenção proporcionam um método para a manipulação da atividade de um produto de gene hemoglobina em um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. Para um resumo de produtos de gene hemoglobina, incluindo produtos de gene hemoglobina úteis em algumas concretizações desta invenção, ver, Frey AD, Kallio PT. Bacterial hemoglobins and flavohemoglobins: versatile proteins and their impact on microbiology and biotechnology. FEMS Microbiol Rev. 2003 Oct;27(4):525-45. Em algumas concretizações, a atividade de um produto de gene hemoglobina, por exemplo, uma proteína de hemoglobina, é aumentada no micróbio, por exemplo, por sobre- expressão de uma proteína de hemoglobina ácido nucleico de codificação. Em algumas concretizações, a sobre-expressão de hemoglobina no micróbio efetua a transferência de oxigênio aumentada no micróbio. Em algumas concretizações, a atividade aumentada da hemoglobina resulta em síntese aperfeiçoada de biocombustível ou precursor de biocombustível, devido ao fluxo aumentado de oxigênio em uma trajetória de síntese que demanda altamente oxigênio, por exemplo, a trajetória de síntese de ácido graxo. Em algumas concretizações, a manipulação da atividade de um produto de gene hemoglobina em um micróbio é efetuada para conferir um fenótipo benéfico para conversão de carboidrato a lipídio em grande escala, por exemplo, taxa de síntese de lipídio aumentada, eficiência aumentada de conversão de carboidrato a lipídio, armazenagem aumentada de lipídio e, taxa de crescimento aumentada, tolerância aumentada a concentrações elevadas de uma fonte de carbono, ou um produto de lipídio. O gene e sequências de produto de gene são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. Gene e sequências de produto de gene exemplares representativos podem ser encontrados sob a entrada para GeneID: 7738539 (Deide_12990) na base de dados NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

[076] Alguns aspectos desta invenção proporcionam um método para a manipulação da atividade de um produto de gene de citocromo em um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível, tal como produto de gene de citocromo B, mais especificamente um produto de gene de citocromo B5. Em algumas concretizações, a atividade de um produto de gene de citocromo, por exemplo, uma proteína de citocromo , é aumentada no micróbio, por exemplo, por sobre-expressão de uma proteína de citocromo ácido nucleico de codificação. Em algumas concretizações, a sobre-expressão de citocromo no micróbio efetua transferência aumentada de oxigênio no micróbio. Em algumas concretizações, a atividade aumentada de citocromo resulta em síntese aperfeiçoada de biocombustível ou precursor de biocombustível, devido a fluxo aumentado de oxigênio em uma trajetória de síntese que demanda altamente oxigênio , por exemplo, a trajetória de síntese de ácido graxo. Em algumas concretizações, a manipulação da atividade de um produto de gene de citocromo em um micróbio é efetuada para conferir um fenótipo benéfico para conversão de carboidrato a lipídio em grande escala, por exemplo, taxa de síntese de lipídio aumentada, eficiência aumentada de conversão de carboidrato a lipídio, armazenagem aumentada de lipídio e, taxa de crescimento aumentada, tolerância aumentada a concentrações elevadas de uma fonte de carbono, ou um produto de lipídio. O gene e sequências de produto de gene de citocromo são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. Uma sequência de gene representativa exemplar pode ser encontrada sob a entrada para GeneID: 1528 na base de dados NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

[077] Alguns aspectos desta invenção proporcionam um método para a manipulação da atividade de um (GLUT) produto de gene transportador de glicose (GLUT), por exemplo, um produto de gene Glut1, em um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. Em algumas concretizações, a atividade de um produto de gene de GLUT, por exemplo, uma proteína de GLUT, é aumentada no micróbio, por exemplo, por sobre-expressão de uma proteína de GLUT ácido nucleico de codificação. Em algumas concretizações, a sobre- expressão de uma proteína de GLIT ácido nucleico de codificação no micróbio efetua entrada aumentada de glicose pelo micróbio. Em algumas concretizações, a atividade aumentada de GLUT resulta em síntese aperfeiçoada de biocombustível ou precursor de biocombustível, devido a entrada aumentada de glicose. Em algumas concretizações, a manipulação da atividade de um produto de gene de GLUT em um micróbio é efetuada para conferir um fenótipo benéfico para conversão de carboidrato a lipídio em grande escala, por exemplo, taxa de síntese de lipídio aumentada, eficiência aumentada de conversão de carboidrato a lipídio, armazenagem aumentada de lipídio e, taxa de crescimento aumentada, tolerância aumentada a concentrações elevadas de uma fonte de carbono, ou um produto de lipídio. O gene e sequências de produto de gene de GLUT são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. O gene e sequências de produto de gene exemplares representativos podem ser encontrados sob a entrada para GeneID: 38109 na base de dados NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

[078] Alguns aspectos desta invenção proporcionam um método para a manipulação da atividade de um produto de gene de Piruvato carboxilase (PC) em um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. Em algumas concretizações, a atividade de um produto de gene de PC, por exemplo, uma proteína de PC, é aumentada no micróbio, por exemplo, por sobre-expressão de uma proteína de PC ácido nucleico de codificação. Em algumas concretizações, a sobre-expressão de uma proteína de PC ácido nucleico de codificação no micróbio efetua entrada aumentada de glicose pelo micróbio. Em algumas concretizações, atividade aumentada de PC resulta em síntese aperfeiçoada de biocombustível ou precursor de biocombustível, devido a entrada aumentada de glicose. Em algumas concretizações, a manipulação da atividade de um produto de gene de PC em um micróbio é efetuada para conferir um fenótipo benéfico para conversão de carboidrato a lipídio em grande escala, por exemplo, taxa de síntese de lipídio aumentada, eficiência aumentada de conversão de carboidrato a lipídio, armazenagem aumentada de lipídio e, taxa de crescimento aumentada, tolerância aumentada a concentrações elevadas de uma fonte de carbono, ou um produto de lipídio. O gene e sequências de produto de gene de PC são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. O gene e sequências de produto de gene exemplares representativos podem ser encontrados sob a entrada para GeneID:5091 na base de dados NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

[079] Alguns aspectos desta invenção proporcionam um método para a manipulação da atividade de um produto de gene de Enzima Málica (ME) em um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. A ME catalisa a decarboxilação oxidativa de (S)-malato a piruvato, com a liberação concomitante de dióxido de carbono e conversão de NADP+ em NADPH. Em algumas concretizações, a atividade de um produto de gene de ME, por exemplo, uma proteína de ME, é aumentada no micróbio, por exemplo, por sobre- expressão de uma proteína de ME ácido nucleico de codificação. Em algumas concretizações, a sobre-expressão de uma proteína de ME ácido nucleico de codificação no micróbio efetua níveis aumentados de NADPH no micróbio, resultando em níveis suficientes de redução de metabólitos, por exemplo, NADPH, para síntese aumentada de ácido graxo. Em algumas concretizações, a atividade aumentada de ME na síntese aperfeiçoada de biocombustível ou precursor de biocom- bustível, devido a níveis aumentados de NADPH. Em algumas concretizações, a manipulação da atividade de um produto de gene de ME em um micróbio é efetuada para conferir um fenótipo benéfico para conversão de carboidrato a lipídio em grande escala, por exemplo, taxa de síntese de lipídio aumentada, eficiência aumentada de conversão de carboidrato a lipídio, armazenagem aumentada de lipídio e, taxa de crescimento aumentada, tolerância aumentada a concentrações elevadas de uma fonte de carbono, ou um produto de lipídio. O gene e sequências de produto de gene de ME são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. O gene e sequências de produto de gene exemplares representativos podem ser encontrados sob a entrada para GeneID: 17436 na base de dados NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

[080] Alguns aspectos desta invenção proporcionam um método para a manipulação de um produto de gene de acetila-CoA carboxilase (ACC) em um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível, por exemplo, em produtos de gene Y. lipolytica. ACC que mediam a conversão de acetila-CoA, o principal C2-precursor na síntese de ácido graxo, em malonila-CoA, que é considerada a primeira etapa na síntese de ácido graxo, e foi sugerida também ser a etapa de limitação de taxa na síntese de ácido graxo (ver Cao Y, Yang J, Xian M, Xu X, Liu W. Increasing unsaturated fatty acid contents in Escherichia coli by coexpression of three different genes. Appl Microbiol Biotechnol. 2010). Em algumas concretizações, a manipulação da atividade de ACC é a sobre-expressão de ACC. Em algumas concretizações, a sobre- expressão de ACC em um micróbio aumenta a taxa de síntese de ácido graxo e/ou confere um fenótipo benéfico para conversão em grande escala de carboidrato em biocombustível ou precursor de biocom- bustível, por exemplo, taxa de síntese de lipídio aumentada, eficiência aumentada de conversão de carboidrato a lipídio, armazenagem aumentada de lipídio e, taxa de crescimento aumentada, tolerância aumentada a concentrações de uma substância, por exemplo, uma fonte de carbono, um biocombustível ou precursor de biocombustível, ou uma substância tóxica. O gene e sequências de produto de gene de ACC são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. O gene e sequências de produto de gene exemplares representativos podem ser encontrados sob a entrada para GeneID: 855750 na base de dados NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

[081] Alguns aspectos desta invenção proporcionam um método para a manipulação da atividade de um Acila-CoA sintetase (ACS) em um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. A ACSs são uma família de enzimas que catalisam a tioesterificação de ácidos graxos com CoA para formar intermediários ativados (ver Lu X, Vora H, Khosla C., Overproduction of free fatty acid in E. coli: implications for biodiesel production Metab Eng. 2008 Nov;10(6):333-9). Estes intermediários são the precursores para fosfolipídios, ácido graxo colesterol ésteres, ou ácido graxo álcool ésteres, tais como TAGs. Y. lipolytica contém duas conhecidas e previstas Acila-CoA sintetases. Em algumas concretizações desta invenção, a sobre-expressão de uma enzima de ACS em um organismo de produção de lipídio é efetuada para conferir um fenótipo benéfico para conversão de carboidrato a lipídio em grande escala, por exemplo, taxa de síntese de lipídio aumentada, eficiência aumentada de conversão de carboidrato a lipídio, armazenagem aumentada de lipídio e/ou secreção, taxa de crescimento aumentada, tolerância aumentada a concentrações elevadas de uma fonte de carbono, ou um produto de lipídio. O gene e sequências de produto de gene de ACS são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. O gene e sequências de produto de gene exemplares representativos podem ser encontrados sob a entrada para GeneID: 851245 na base de dados NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

[082] Alguns aspectos desta invenção proporcionam um método para a manipulação da atividade de acetila-CoA sintetase 2 (ACS2), uma enzima localizada no peroxissoma e envolvida na degradação de ácidos graxos, em um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. Em algumas concretizações, a inibição de ACS2 impede ou inibe a degradação de ácidos graxos por metabolismo catabólico de levedura e, em algumas concretizações, tal inibição complementa um aumento na atividade de produto de gene FAA1 para secreção aumentada de ácido graxo no meio. Y. lipolytica contém ACS2 acetila-CoA sintetase (ver Beopoulos A, Cescut J, Haddouche R, Uribelarrea JL, Molina-Jouve C, Nicaud JM., Yarrowia lipolytica as a model for bio-oil production. Prog Lipide Res. 2009 Nov;48(6):375-87). Em algumas concretizações, knockout, knock-down, e/ou inibição de produto de expressão de gene de ACS2 ou atividade em um micróbio é efetuada para conferir um fenótipo benéfico para conversão em grande escala de carboidrato em biocombustível ou precursor de biocombus- tível, por exemplo, taxa de síntese de lipídio aumentada, eficiência aumentada de conversão de carboidrato a lipídio, armazenagem aumentada de lipídio e, taxa de crescimento aumentada, tolerância aumentada a concentrações de uma substância, por exemplo, uma fonte de carbono, um biocombustível ou precursor de biocombustível, ou uma substância tóxica. Gene e sequências de produto de gene de ACS2 são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. O gene e sequências de produto de gene exemplares representativos podem ser encontrados sob a entrada para GeneID: 850846 na base de dados NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

[083] Alguns aspectos desta invenção proporcionam um método para a manipulação da atividade de um produto de gene FAA1 em um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. O produto de gene FAA1 catalisa a tioesterificação citoplásmica de ácidos graxos de cadeia longa com CoA para intermediários ativados. Y. lipolytica FAA1 é um homólogo de ácido graxo de cadeia longa S. cerevisiae P30624 FAA1-CoA ligase. Esta enzima é envolvida na geração da reunião de ácido graxo livre e secreção de ácido graxo. Em algumas concretizações, a sobre- expressão de um produto de gene FAA1 em um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível é efetuada para conferir um fenótipo benéfico para conversão de carboidrato a lipídio em grande escala, por exemplo, taxa de síntese de lipídio aumentada, eficiência aumentada de conversão de carboidrato a lipídio, armazenagem aumentada de lipídio e, taxa de crescimento aumentada, tolerância aumentada a concentrações elevadas de uma fonte de carbono, ou um produto de lipídio. O gene e sequências de produto de gene FAA1 são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. Gene e sequências de produto de gene exemplares representativos podem ser encontrados sob a entrada para GeneID: 854495 na base de dados NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

[084] Alguns aspectos desta invenção proporcionam um método para a manipulação da atividade de ácido graxo de cadeia muito longa- CoA sintetase (FAT1) em um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. FAT1 é pensado controlar o transporte de ácido graxo e tioesterificação de ácidos graxos de cadeia muito longa com CoA. Y. lipolytica contem um FAT1 ácido graxo de cadeia muito longa-CoA sintetase. Em algumas concretizações, a inibição de atividade de FAT1, por exemplo, por manipulação genética, impede síntese de derivados de ácidos graxo muito longos e/ou aumenta a reunião de ácidos graxos livres. Em algumas concretizações, knockout, knock-down, e/ou inibição de produto de expressão de gene de FAT1 ou atividade em um micróbio é efetuada para conferir um fenótipo benéfico para conversão em grande escala de carboidrato em biocombustível ou precursor de biocombustível, por exemplo, taxa de síntese de lipídio aumentada, eficiência aumentada de conversão de carboidrato a lipídio, armazenagem aumentada de lipídio e, taxa de crescimento aumentada, tolerância aumentada as concentrações de uma substância, por exemplo, uma fonte de carbono, um biocombustível ou precursor de biocombustível, ou uma substância tóxica. O gene e sequências de produto de gene de FAT 1 são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. O gene e sequências de produto de gene exemplares representativos podem ser encontrados sob a entrada para GeneID: 852329 na base de dados NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

[085] Alguns aspectos desta invenção proporcionam um método para a manipulação de PCS60, também conhecido como FAT2, proteína de ligação de AMP acila-CoA sintetase, ou peroxisomal-CoA sintetase, que é um peroxisomal acila-CoA sintetase com especificidade de substrato indefinida. Y. lipolytica contém um homólogo de S. cerevisiae PCS60. A inibição de PCS60 impedirá síntese de derivados de ácidos graxos muito longos e aumento na reunião de ácido graxo livre. Em algumas concretizações desta invenção, knockout, knock-down, e/ou inibição de produto de expressão de gene de PCS60 ou atividade em um micróbio é efetuada para conferir um fenótipo benéfico para conversão em grande escala de carboidrato em biocombustível ou precursor de biocombustível, por exemplo, taxa de síntese de lipídio aumentada, eficiência aumentada de conversão de carboidrato a lipídio, armazenagem aumentada de lipídio e, taxa de crescimento aumentada, tolerância aumentada a concentrações de uma substância, por exemplo, uma fonte de carbono, um biocombustível ou precursor de biocom- bustível, ou uma substância tóxica. O gene e sequências de produto de gene de FAT2 são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. O gene e sequências de produto de gene exemplares representativos podem ser encontrados sob a entrada para GeneID: 852523 na base de dados NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

[086] Alguns aspectos desta invenção proporcionam um método para a sobre-expressão de ATP citrato liase (ACLY) em um micróbio, por exemplo, Y. lipolytica, para a produção em grande escala de um biocombustível ou precursor de biocombustível. Alguns micróbios adequados para produção em escala industrial de biocombustível ou precursor de biocombustível, incluindo Y. lipolytica, comumente produz grandes quantidades de citrato. ACLY media a conversão de citrato em CoA, uma reação, que, de acordo com alguns aspectos desta invenção, pode ser promovida por sobre-expressão de ACILA (ver Holz M, Forster A, Mauersberger S, Barth G., Aconitase over-expression changes the product ratio of citric acid production by Yarrowia lipolytica. Appl Microbiol Biotechnol. 2009 Jan;81(6):1087-96). Em algumas concretizações, a sobre-expressão de ACILA reduz a produção de citrato indesejável e/ou proporciona uma fonte adicional de acetila-CoA para síntese de biocombustível ou precursor de biocombustível. Em algumas concretizações, a produção excessiva de citrato é inibida em um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível, incluindo Y. lipolytica. Em algumas concretizações, a sobre-expressão de ACILA em um micróbio, por exemplo, em Y. lipolytica, aumenta a taxa de síntese de ácido graxo e/ou confere um fenótipo benéfico para conversão em grande escala de carboidrato em biocombustível ou precursor de biocombustível, por exemplo, taxa de síntese de lipídio aumentada, eficiência aumentada de conversão de carboidrato a lipídio, armazenagem aumentada de lipídio e, taxa de crescimento aumentada, tolerância aumentada à concentrações de uma substância, por exemplo, uma fonte de carbono, um biocombustível ou precursor de biocombustível, ou uma substância tóxica. Ver também Lasserre JP, Nicaud JM, Pagot Y, Joubert-Caron R, Caron M, Hardouin J.Talanta. First complexomic study of alkane-binding protein complexes in the yeast Yarrowia lipolytica. 2010 Feb 15;80(4):1576-85. O gene e sequências de produto de gene de ACILA são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. O gene e sequências de produto de gene exemplares representativos podem ser encontrados sob a entrada para GeneID: 108728 na base de dados NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

[087] Alguns aspectos desta invenção proporcionam um método para a sobre-expressão de complexo de Ácido graxo Sintase (FAS). Enquanto que ACC é provavelmente para ser a enzima de limitação de taxa na síntese de ácido graxo, outras etapas foram também sugeridas para exercer controle desta trajetória, mais notavelmente, FAS (ver Schweizer E, Kottig H, Regler R, Rottner G.J, Genetic control of Yarrowia lipolytica fatty acid sintetase biosynthesis and function. Basic Microbiol. 1988;28(5):283-92). Este complexo é um polipeptídio multifuncional que alonga a cadeia de ácido graxo no processo mais intensivo de substrato na trajetória de síntese de lipídio total. Em algumas concretizações, sobre-expressão de ACILA em um micróbio, por exemplo, em Y. lipolytica, aumenta a taxa de síntese de ácido graxo e/ou confere um fenótipo benéfico para conversão em grande escala de carboidrato em biocombustível ou precursor de biocombustível, por exemplo, taxa de síntese de lipídio aumentada, eficiência aumentada de conversão de carboidrato a lipídio, armazenagem aumentada de lipídio, e/ou secreção, taxa de crescimento aumentada, tolerância aumentada à concentrações de uma substância, por exemplo, uma fonte de carbono, um biocombustível ou precursor de biocombustível, ou uma substância tóxica. O gene e sequências de produto de gene de FAS são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. O gene e sequências de produto de gene exemplares representativos podem ser encontrados sob as entradas para GeneID: 853653 e GeneID: 855845 na base de dados NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

[088] Alguns aspectos desta invenção proporcionam um método para a inibição de AMP Proteína Kinase ativada (AMPK). AMPK é uma enzima regulatória que regula a atividade de outras proteínas por fosforilação em resposta a proporção celular de AMP:ADP (ver LeeYoung RS, Palmer MJ, Linden KC, LePlastrier K, Canny BJ, Hargreaves M, Wadley GD, Kemp BE, McConell GK. Carbohydrate ingestion does not alter skeletal muscle AMPK signaling during exercise in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2006 Sep;291(3):E566-73). Na levedura, AMPK foi mostrado ter como alvo ACC, bem como INO1, um gene requerido para uma etapa anterior na biosíntese de lipídio. A falta de fosforilação de ACC em mutantes de AMPK knockout resulta em ACC hiperativo e super-produção de ácido graxo. Em algumas concretizações, a inibição de AMPK em um micróbio conduz a hiperativação de síntese de lipídio. Em algumas concretizações, a atividade de AMPK é completamente abolida em um micróbio, por exemplo, por knockout do gene AMPK. Em algumas concretizações, a atividade de AMPK é inibida em um micróbio, por exemplo, por manipulação genética ou não-genética. A inibição, conforme oposta a abolimento completo, de atividade de AMPK pode evitar efeitos negativos nos outros processos celulares regulados por AMPK. Em algumas concretizações, knockout, knock-down, e/ou inibição de produto de expressão de gene de AMPK ou atividade em um micróbio, por exemplo, Y. lipolytica, é efetuada para conferir um fenótipo benéfico para conversão em grande escala de carboidrato em biocombustível ou precursor de biocombustível, por exemplo, taxa de síntese de lipídio aumentada, eficiência aumentada de conversão de carboidrato a lipídio, armazenagem aumentada de lipídio e/ou secreção, taxa de crescimento aumentada, tolerância aumentada à concentrações de uma substância, por exemplo, uma fonte de carbono, um biocombustível ou precursor de biocombustível, ou uma substância tóxica. O gene e sequências de produto de gene de AMPK são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. O gene e sequências de produto de gene exemplares representativos podem ser encontrados sob a entrada para GeneID: 100145903 na base de dados NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

ÁCIDOS NUCLEICOS ISOLADOS

[089] Alguns aspectos desta invenção proporcionam ácidos nucleicos que codificam para um produto de gene que conferem um fenótipo requerido e/ou desejado para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível a um micróbio, por exemplo, Y. lipolytica. Em algumas concretizações, o ácido nucleico é um ácido nucleico derivado de Y. lipolytica. Em algumas concretizações, o ácido nucleico codifica uma desaturase, por exemplo, uma Δ9 desaturase. Em algumas concretizações, o ácido nucleico codifica Y. lipolytica Δ9 desaturase. Em algumas concretizações, o ácido nucleico compreende SEQ ID NO: 1. Em algumas concretizações, o ácido nucleico é SEQ ID NO: 1. Em algumas concretizações, o ácido nucleico codifica um produto de gene, por exemplo, uma proteína, codificada por SEQ ID NO: 1.

[090] Alguns aspectos desta invenção proporcionam um produto de gene, por exemplo, uma proteína, que confere um fenótipo requerido e/ou desejável para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível a um micróbio, por exemplo, Y. lipolytica. Em algumas concretizações, a proteína é a proteína de Y. lipolytica. Em algumas concretizações, a proteína é uma desaturase, por exemplo, uma Δ9 desaturase. Em algumas concretizações, a proteína é uma Y. lipolytica Δ9 desaturase. Em algumas concretizações, a sequência de amino ácido da proteína é a sequência proporcionada em SEQ ID NO: 2.

[091] O termo "ácido nucleico" se refere a uma molécula compreendendo nucleotídeos ligados múltiplos. "Ácido nucleico" e "molécula de ácido nucleico" são usados permutavelmente e se referem a oligoribonucleotídeos, bem como oligodeoxiribonucleotídeos. Os termos também incluem polinucleosídeos (isto é, um polinucleotídeo menos um fosfato) e qualquer outra base orgânica contendo ácido nucleico. As bases orgânicas incluem adenina, uracil, guanina, timina, citosina e inosina. Os ácidos nucleicos podem ser de trançado simples ou duplo. O ácido nucleico pode ser o que ocorre naturalmente ou não- naturalmente. Ácido nucleicos podem ser obtidos de fontes naturais, ou podem ser sintetizados usando-se um sintetizador de ácido nucleico (isto é, sintético). Os isolamentos de ácidos nucleicos são rotineiramente realizados na técnica e métodos adequados podem ser encontrados em livros de texto de biologia molecular padrão. (Ver, por exemplo, Maniatis' Handbook of Molecular Biology.) O ácido nucleico pode ser DNA ou RNA, tal como DNA genômico, DNA mitocondrial, mRNA, cDNA, rRNA, miRNA, PNA ou LNA, ou uma combinação destes, conforme aqui descrito. Ácidos nucleicos que ocorrem não-naturalmente, tais como cromossomos artificiais bacteriais (BACs) e cromossomos artificiais de levedura (YACs) podem também serem usados de acordo com alguns aspectos desta invenção.

[092] Alguns aspectos desta invenção se referem ao uso de derivados de ácido nucleico. Conforme será aqui descrito, o uso de certos derivados de ácido nucleico pode aumentar a estabilidade dos ácidos nucleicos da invenção por impedimento de sua digestão, particularmente quando eles são expostos a amostras biológicas que podem conter nucleases. Conforme aqui usado, um derivado de ácido nucleico é um ácido nucleico que ocorre não-naturalmente, ou uma unidade deste. Derivados de ácido nucleico podem conter elementos que ocorrem não- naturalmente, tais como nucleotídeos que ocorrem não-naturalmente e ligações de suporte que ocorrem não-naturalmente. Derivados de ácido nucleico, de acordo com alguns aspectos desta invenção, podem conter modificações de suporte tais como, mas não limitadas a, ligações de fosforotioato, fosfodiéster ácidos nucleicos modificados, combinações de fosfodiéster e fosforotioato ácido nucleico, metilfosfonato, alquilfosfo- natos, fosfato ésteres, alquilfosfonotioatos, fosforamidatos, carbamatos, carbonatos, fosfato triésteres, acetamidatos, carboximetila ésteres, metilafosforotioato, fosforoditioato, p-etoxi, e combinações destes. A composição de suporte dos ácidos nucleicos pode ser homogênea ou heterogênea.

[093] Os derivados de ácido nucleico, de acordo com alguns aspectos desta invenção, podem conter substituições ou modificações nos açúcares e/ou bases. Por exemplo, alguns derivados de ácido nucleico podem incluir ácidos nucleicos tendo açúcares de suporte que são covalentemente fixados a grupos orgânicos de baixo peso molecular outros do que um grupo hidroxila na posição 3' e outros do que um grupo fosfato na posição 5' (por exemplo, um grupo ribose 2'-O- alquilatado). Os derivados de ácido nucleico podem incluir açúcares de não-ribose, tais como arabinose. Derivados de ácido nucleico podem conter purinas substituídas e pirimidinas, tais como bases modificadas de C-5 propina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,6-diaminopurina, hipoxantina, 2-tiouracil e pseudoisocitosina.

[094] Em algumas concretizações, um ácido nucleico pode compreender um ácido nucleico de peptídeo (PNA), um ácido nucleico travado (LNA), DNA, RNA, ou co-ácidos nucleicos dos acima tais como co-ácido nucleico de DNA-LNA.

[095] Conforme aqui usado, o termo "molécula de ácido nucleico isolado" se refere a um ácido nucleico que não está em seu ambiente natural, por exemplo, um ácido nucleico que foi (i) extraído e/ou purificado de uma célula ou micróbio, por exemplo, uma bactéria ou levedura, por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por lisis alcalina da célula hospedeira, e subsequente purificação do ácido nucleico, por exemplo, por um procedimento de adsorção de sílica; (ii) amplificado in vitro, por exemplo, por reação de cadeia polimerase (PCR); (iii) produzido recombinantemente por clonagem, por exemplo, um ácido nucleico clonado no vetor de expressão; (iv) fragmentado e dimensionado separado, por exemplo, por digestão enzimática in vitro, ou por cisalhamento, e subsequente separação de gel; ou (v) sintetizado por, por exemplo, síntese química. Em algumas concretizações, um ácido nucleico isolado pode prontamente ser manipulado por técnicas de DNA recombinante bem conhecidas na técnica. Consequentemente, um ácido nucleico clonado em um vetor, ou um ácido nucleico distribuído a uma célula hospedeira e integrado no genoma hospedeiro, é considerado isolado, mas um ácido nucleico em seu estado nativo em seu hospedeiro natural, por exemplo, no genoma do hospedeiro, não é. Um ácido nucleico isolado pode ser substancialmente purificado, mas não necessita ser. Por exemplo, um ácido nucleico que é isolado dentro de uma clonagem ou vetor de expressão não é puro, em que ele pode compeender somente uma pequena percentagem do material na célula em que ele reside. Tal ácido nucleico é isolado; contudo, conforme o termo é usado aqui.

[096] Alguns aspectos desta invenção se referem a ácidos nucleicos que codificam um produto de gene conferindo um fenótipo requerido ou desejável a um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível que são ligados a um promotor ou outro elemento de ativação de transcrição. Em algumas concretizações, o ácido nucleico que codifica o produto de gene e ligado a um promotor é compreendido em um vetor de expressão ou construto de expressão. Conforme aqui usado, os termos "vetor de expressão" ou "construto de expressão" se referem a um construto de ácido nucleico, gerado recombinantemente ou sinteticamente, com uma série de elementos de ácido nucleico especificados que permitem transcrição de um ácido nucleico particular em um micróbio hospedeiro, por exemplo, uma levedura oleaginosa. Em algumas concretizações, o vetor de expressão pode ser parte de um plasmídeo, vírus, ou fragmento de ácido nucleico. Em algumas concretizações, o vetor de expressão inclui codificação de ácido nucleico a ser transcrito operavelmente ligado a um promotor. Um promotor é um elemento de ácido nucleico que facilita a transcrição de um ácido nucleico a ser transcrito. Um promotor está tipicamente localizado no mesmo trançado e à montante, (ou 5') da sequência de ácido nucleico que a transcrição deste controla. Em algumas concretizações, o vetor de expressão inclui o ácido nucleico de codificação a ser transcrito operavelmente ligado a um promotor heterólogo. Um promotor heterólogo é um promotor não naturalmente operavelmente ligado a uma dada sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o gene SCD em Y. lipolytica é naturalmente operavelmente ligado ao promotor de gene de SCD do Y. lipolytica. Qualquer outro do que o promotor de gene SCD tipo selvagem de Y. lipolytica operavelmente ligado ao gene SCD, ou partes destes, por exemplo, em um construto de expressão, seria, portanto, um promotor heterólogo.

[097] Em algumas concretizações, o vetor de expressão inclui o ácido nucleico de codificação, por exemplo, um ácido nucleico que codifica um produto de gene de SCD, operavelmente ligado a um promotor constitutivo. O termo "promotor constitutivo" se refere a um promotor que permite transcrição contínua de seu gene associado. Em algumas concretizações, o vetor de expressão inclui o ácido nucleico de codificação, por exemplo, um ácido nucleico que codifica um produto de gene de SCD, operavelmente ligado a um promotor induzível. O termo "promotor induzível", permutavelmente aqui usado com o termo "promotor condicional", se refere a um promotor que permite transcrição de seu gene associado somente na presença ou ausência de fatores bióticos ou abióticos. Os promotores induzíveis de fármaco, por exemplo, promotores induzíveis de tetraciclina/doxiciclina, promotores induzíveis de tamoxifen, bem como promotores que dependem de um evento de recombinação de modo a serem ativos, por exemplo, a recombinação cre-mediada de locais loxP, são exemplos de promotores induzíveis que são bem conhecidos na técnica.

[098] Métodos para distribuir vetores de expressão ou construtos de expressão em micróbios, por exemplo, em células de levedura, são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. Ácidos nucleicos, incluindo vetores de expressão, podem ser distribuídos a micróbios procarióticos e eucarióticos por vários métodos bem conhecidos aqueles técnicos nas técnicas biológicas relevantes. Os métodos para a distribuição de ácido nucleicos a um micróbio, de acordo com alguns aspectos desta invenção, incluem, mas não são limitados a, abordagens químicas, eletroquímicas e biológicas, por exemplo, transformação de choque de calor, eletroporação, transfecção, por exemplo transfecção mediada por lipossomo, DEAE-transfecção mediada por Dextran, ou transfecção de fosfato de cálcio. Em algumas concretizações, um construto de ácido nucleico, por exemplo, um construto de expressão de SCD, é introduzido no micróbio hospedeiro usando-se um veículo, ou vetor, para transferência de material genético. Os vetores para material de transferência genética a micróbios são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto, e incluem, por exemplo, plasmídeos, cromossomos artificiais, vetores virais. Os métodos para a construção de construtos de ácido nucleico, incluindo construtos de expressão compreendendo promotores heterólogos constitutivos ou induzíveis, e construtos de knockout e knockdown, bem como métodos e vetores para a distribuição de um ácido nucleico ou construto de ácido nucleico a um micróbio, são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto, e são descritos, por exemplo, em J. Sambrook and D. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (January 15, 2001); David C. Amberg, Daniel J. Burke; and Jeffrey N. Strathern, Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (April 2005); John N. Abelson, Melvin I. Simon, Christine Guthrie, and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Part A, Volume 194 (Methods in Enzymology Series, 194), Academic Press (March 11, 2004); Christine Guthrie and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part B, Volume 350 (Methods in Enzymology, Vol 350), Academic Press; 1st edition (July 2, 2002); Christine Guthrie and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part C, Volume 351, Academic Press; 1st edition (July 9, 2002); Gregory N. Stephanopoulos, Aristos A. Aristidou and Jens Nielsen, Metabolic engineering: Principles and Methodologies, Academic Press; 1 edition (October 16, 1998); and Christina Smolke, The Metabolic Pathway Engineering Handbook: Fundamentals, CRC Press; 1 edition (July 28, 2009), todos dos quais são aqui incorporados por referência.

[099] Em algumas concretizações, o promotor nativo de um gene que codifica um produto de gene conferindo um fenótipo requerido ou desejável a um micróbio, por exemplo, o promotor nativo SCD, é modificado no micróbio para alterar a regulação de sua atividade transcricional. Em algumas concretizações, o promotor modificado exibe uma atividade transcricional aumentada, conforme comparado a sua contraparte não-modificada. O termo "promotor modificado", conforme aqui usado, se refere a um promotor da sequência de nucleotídeo da qual foi artificialmente alterado. As anulação(ões), inserção(ões) ou mutação(ões) de nucleotídeo, sozinhas ou em combinação, são exemplos de tais alterações artificiais. As alterações de promotores artificiais podem ser efetuadas em um modo alvo, por exemplo, por abordagens de recombinação homóloga, tais como alvejamento de gene, knockout, knockin, mutagênese direcionada de local, ou estratégias mediadas por nuclease de garra de zinco artificial. Alternativamente, tais alterações podem ser efetuadas por um evento aleatório ou quase aleatório, tal como integração de nucleotídeo de irradiação, ou não-alvo de uma seleção subsequente. As modificações do promotor, em geral, são mostradas de modo a modular as propriedades de ativação transcricional do respectivo promotor. Por exemplo, o rompimento ou anulação de um elemento regulatório que media a repressão de um promotor de SCD em resposta a níveis de ácido graxo extracelulares elevados pode conduzir a ativação transcricional continuada do gene de SCD mesmo sob condições de níveis elevados de ácido graxo intracelular. Similarmente, a inserção de um elemento ativador transcricional constitutivamente ativo em uma região promotora condicional pode efetuar sobre-expressão do respectivo gene sob condições normalmente inibitivas. Os métodos para o rompimento alvo de um promotor nativo, por exemplo, um promotor nativo de SCD, em um micróbio, por exemplo, para rompimento alvo resultando em uma taxa aumentada de transcrição, são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto.

[0100] Em algumas concretizações, um construto de ácido nucleico é proporcionado, que é útil para o knockout de um gene de delta-12 desaturase em um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. Em algumas concretizações, o construto de knockout compreende sequências genômicas de um gene microbial delta-12 desaturase que flanqueia uma sequência de nucleotídeo que, quando inserida no gene de delta-12 desaturase, rompe a expressão de um produto de gene de delta-12 desaturase. Em algumas concretizações, o ácido nucleico que rompe o produto de expressão de gene de delta-12 desaturase é um marcador de resistência á antibiótico, por exemplo, um gene de resistência á fleomicin. Em algumas concretizações, o vetor de knockout de delta-12 desaturase compreende uma sequência conforme proporcionada em SEQ IDNO: 28. Métodos de distribuição de vetores de knockout a micróbios são bem conhecido àqueles técnicos no assunto, e métodos para efetuar recombinação homóloga em micróbios, por exemplo, em leveduras, são bem conhecidos ao técnico no assunto também. A invenção não é limitada neste particular.

MÉTODOS DE PROJETO DE MICRÓBIO

[0101] Alguns aspectos desta invenção se referem a projeto de um micróbio, por exemplo, Y. lipolytica, para exibir um fenótipo requerido e/ou desejável para produção em grande escala de um biocombustível ou precursor de biocombustível. Alguns aspectos desta invenção se referem ao projeto metabólico da trajetória de SCD de modo a produzir um micróbio otimizado para produção de biocombustível. Alguns aspectos desta invenção se referem ao projeto metabólico de um fluxo de carbono que regula o gene dentro ou fora de uma trajetória de síntese de ácido graxo de modo a produzir um micróbio otimizado para produção de biocombustível.

[0102] Alguns aspectos desta invenção proporcionam métodos para aumentar grandemente a eficiência de conversão de fonte de carbono mediada por Y. lipolytica para lipídio por modulação de metabolismo de lipídio nativo de Y. lipolytica. Alguns aspectos desta invenção se referem a descoberta que uma sobre-expressão de um gene que aumenta o acúmulo de ácido graxo ou triacilglicerol, tal como SCD, não somente resulta em um aumento no acúmulo de lipídio, mas também um aumento de taxa de síntese de lipídio, teor de lipídio, e/ou taxa de crescimento. Marcadamente e inesperadamente, a modulação do metabolismo de lipídeo de acordo com alguns métodos proporcionados por esta invenção, também confere outras características benéficas, por exemplo, uma tolerância aumentada para substâncias de estoque de alimentação, incluindo altas concentrações de substrato (por exemplo, glicose), e/ou de substâncias tóxicas comumente encontradas para contaminar estoque de alimentação, por exemplo, estoque de alimentação pré-tratado. Alguns exemplos não-limitativos de tais substâncias contaminantes são furfural, 5-hidroximetilfurfural e ácido acético. Alguns exemplos não-limitativos de materiais de estoque de alimentação que geram substâncias tóxicas contaminantes após pré-tratamento, são estoques de alimentação de madeira, palha de milho, e bagaço.

[0103] Alguns aspectos desta invenção se referem a projeto de fenótipos requeridos e/ou desejáveis em Y. lipolytica, via inibição transcricional de um regulador chave de metabolismo de lipídeo, por exemplo, via inibição transcricional de SCD. A manipulação de um regulador chave de metabolismo de lipídeo, por exemplo, SCD, em outros micróbios de produção de biocombustível, por exemplo, levedura, bactéria, fungos, ou algas, é também contemplada.

[0104] De modo a projetar um organismo, por exemplo, uma levedura oleaginosa, a ser útil nas produções de biocombustível em escala industrial, uma compreensão detalhada dos mecanismos moleculares que controlam ácido graxo e metabolismo de lipídeo no respectivo organismo é essencial. Até a presente invenção, a identificação e anotação funcional de reguladores de ácido graxo e metabolismo de lipídeo em microorganismos de produção de óleo para produção de biocombustível, por exemplo, levedura oleaginosa, permanecem não-solucionadas. Alguns aspectos desta invenção proporcionam a identificação e anotação funcional de gene regulador chave, SCD, na levedura oleaginosa Y. lipolytica. Ácido nucleico de SCD isolado e moléculas de proteína são também proporcionados.

[0105] Alguns aspectos desta invenção se referem ao projeto de um fenótipo desejável para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível em um micróbio por engenharia genética. Alguns aspectos desta invenção se referem a manipulação de um gene envolvido na produção de biocombustível ou um precursor de biocombustível, por exemplo, um ácido graxo ou um triacilglicerol, em um micróbio. Alguns aspectos desta invenção se referem a manipulação de uma pluralidade de genes envolvidos na produção de biocombustível ou um precursor de biocombustível em paralelo em um micróbio.

[0106] Em algumas concretizações, um micróbio é projetado para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível por manipulação de um gene simples, de acordo com métodos proporcionados pelos aspectos desta invenção, por exemplo, uma Δ9 desaturase (por exemplo, SCD), GLUT (por exemplo, Glut1), hemoglobina, citocromo (por exemplo, citocromo B5), Enzima Málica, ACC, ACS, ACS2, FAA1, FAT1, FAT2, ACLY, FAS, AMPK, JNK2, ou delta-12 desaturase. Em algumas concretizações, um micróbio é projetado para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível por manipulação de uma pluralidade de genes de acordo com métodos proporcionados pelos aspectos desta invenção, por exemplo, qualquer combinação de duas ou mais de uma Δ9 desaturase (por exemplo, SCD), GLUT (por exemplo, Glut1), hemoglobina, citocromo (por exemplo, citocromo B5), Enzima Málica, ACC, ACS, ACS2, FAA1, FAT1, FAT2, ACLY, FAS, JNK2, delta-12 desaturase, e/ou AMPK. Em algumas concretizações, um micróbio é projetado para compreender um nível aumentado de um produto de gene de SCD e uma manipulação adicional, por exemplo, uma manipulação genética, da expressão de um produto de gene adicional, por exemplo, um GLUT (por exemplo, Glut1), hemoglobina, citocromo (por exemplo, citocromo B5), Enzima Málica, ACC, ACS, ACS2, FAA1, FAT1, FAT2, ACLY, FAS, JNK2, delta-12 desaturase, ou produto de gene de AMPK. Em algumas concretizações, um micróbio é projetado para compreender um nível aumentado de um produto de gene de SCD de um produto de gene hemoglobina. Em algumas concretizações, um micróbio é projetado para compreender um nível aumentado de um produto de gene de SCD e de um produto de gene de GLUT, por exemplo, um produto de gene Glut1. Em algumas concretizações, um micróbio é projetado para compreender um nível aumentado de um produto de gene de SCD, de um produto de gene de GLUT, por exemplo, um produto de gene Glut1, e de uma hemoglobina e/ou um produto de gene de citocromo. Em algumas concretizações, um micróbio é projetado para compreender um nível aumentado de um produto de gene de SCD e de Glut1, hemoglobina e citocromo b5, e, opcionalmente, um knockout de delta- 12 desaturase. Em algumas concretizações, o micróbio é Y. lipolytica. MICRÓBIOS PROJETADOS PARA PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEL

[0107] Alguns aspectos desta invenção se referem a um micróbio projetado e/ou otimizado para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível em grande escala. Em algumas concretizações, um micróbio projetado é provido que foi manipulado por um método, ou usando-se um ácido nucleico ou proteína providos por alguns aspectos desta invenção. Em algumas concretizações, um micróbio projetado é provido, que sobre-expressa um produto de gene que, de acordo com alguns aspectos desta invenção, confere um fenótipo requerido e/ou desejável para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível ao micróbio. Em algumas concretizações, um micróbio compreendendo uma atividade aumentada de produto de gene de SCD é proporcionado. Em algumas concretizações, o micróbio exibe uma taxa de síntese de ácido graxo aumentada, uma armazenagem aumentada de TAG, e/ou um traço adicional requerido ou desejável.

[0108] Em algumas concretizações, o micróbio projetado é uma levedura oleaginosa, por exemplo, Y. lipolytica. Em algumas concretizações, uma levedura projetada proporcionada por esta invenção exibe uma ou mais características fenotípicas altamente desejáveis e inesperadas, por exemplo: conversão aumentada de carbono em óleo, por exemplo, a uma taxa de abordagem de valores teóricos, crescimento robusto, produção contínua de óleo, produção notável de biomassa, e tolerância aumentada da fonte de carbono e substâncias associadas.

[0109] Em algumas concretizações, o micróbio projetado, por exemplo, a levedura projetada, proporcionada pelos aspectos desta invenção, exibe uma taxa de conversão de carbono em óleo dentro da faixa de cerca de 0,02 g/g (g óleo, lipídio, ou TAG produzidos/ g de Glicose consumido) a cerca de 0,3 g/g. Em algumas concretizações, o micróbio projetado, por exemplo, a levedura projetada, proporcionada pelos aspectos desta invenção, exibe uma conversão de carbono em óleo de cerca de 0,010 g/g (g TAG produzida/ g de Glicose consumido), cerca de 0,02 g/g, cerca de 0,025 g/g, cerca de 0,03g/g, cerca de 0,04 g/g, cerca de 0,05 g/g, cerca de 0,06 g/g, cerca de 0,07 g/g, cerca de 0,075 g/g, cerca de 0,08 g/g, cerca de 0,09 g/g, cerca de 0,1 g/g, cerca de 0,11 g/g, cerca de 0,12 g/g, cerca de 0,13 g/g, cerca de 0,14 g/g, cerca de 0,15 g/g, cerca de 0,16 g/g, cerca de 0,17 g/g, cerca de 0,18 g/g, cerca de 0,19 g/g, cerca de 0,2 g/g, cerca de 0,21 g/g, cerca de 0,22 g/g, cerca de 0,23 g/g, cerca de 0,24 g/g, cerca de 0,25 g/g, cerca de 0,26 g/g, cerca de 0,27 g/g, cerca de 0,28 g/g, cerca de 0,29 g/g, ou cerca de 0,3 g/g, ou valores teórico de abordagem. Em algumas concretizações, o micróbio projetado, por exemplo, a levedura projetada, proporcionada pelos aspectos desta invenção, exibe uma taxa de conversão de carbono em óleo de pelo menos cerca de 0,010 g/g (g de TAG produzido/ g de Glicose consumido), pelo menos cerca de 0,02 g/g, pelo menos cerca de 0,025 g/g, pelo menos cerca de 0,03 g/g, pelo menos cerca de 0,04 g/g, pelo menos cerca de 0,05 g/g, pelo menos cerca de 0,06 g/g, pelo menos cerca de 0,07 g/g, pelo menos cerca de 0,075 g/g, pelo menos cerca de 0,08 g/g, pelo menos cerca de 0,09 g/g, pelo menos cerca de 0,1 g/g, pelo menos cerca de 0,11 g/g, pelo menos cerca de 0,12 g/g, pelo menos cerca de 0,13 g/g, pelo menos cerca de 0,14 g/g, pelo menos cerca de 0,15 g/g, pelo menos cerca de 0,16 g/g, pelo menos cerca de 0,17 g/g, pelo menos cerca de 0,18 g/g, pelo menos cerca de 0,19 g/g, pelo menos cerca de 0,2 g/g, pelo menos cerca de 0,21 g/g, pelo menos cerca de 0,22 g/g, pelo menos cerca de 0,23 g/g, pelo menos cerca de 0,24 g/g, pelo menos cerca de 0,25 g/g, pelo menos cerca de 0,26 g/g, pelo menos cerca de 0,27 g/g, pelo menos cerca de 0,28 g/g, pelo menos cerca de 0,29 g/g, ou pelo menos cerca de 0,3 g/g, ou valores teóricos de abordagem.

[0110] Em algumas concretizações, a levedura projetada proporcionada pelos aspectos desta invenção exibe uma produção de biomassa que é aumentada cerca de 2 vezes, cerca de 2,5 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 7,5 vezes, cerca de 10 vezes, cerca de 15 vezes, cerca de 20 vezes, cerca de 25 vezes, cerca de 30 vezes, cerca de 32 vezes, cerca de 35 vezes, ou cerca de 40 vezes, conforme comparado à levedura tipo selvagem. Em algumas concretizações, a levedura projetada proporcionada pelos aspectos desta invenção exibe tolerância à fonte de carbono e/ou substâncias associadas à concentrações de até cerca de 150%, até cerca de 175%, até cerca de 200%, até cerca de 225%, até cerca de 250%, até cerca de 275%, até cerca de 300%, até cerca de 325%, até cerca de 350%, até cerca de 375%, até cerca de 400%, ou até cerca de 500% daquela das concentrações mais altas toleradas pela levedura tipo selvagem. Exemplos não-limitativos de substâncias associadas a fonte de carbono incluem substâncias tóxicas que contaminam a fonte de carbono, por exemplo, substâncias que são geradas ou usadas durante pré-tratamento da fonte de carbono (por exemplo, substâncias acídicas, tais como ácido acético, ou amônia).

[0111] Os dados aqui apresentados identificam uma nova etapa de limitação de taxa de acúmulo de lipídio na levedura oleaginosa, o projeto da qual resulta em características grandemente aperfeiçoada do micróbio manipulado em relação a geração de biocombustível de fonte de carboidratos (por exemplo, glicose). Consequentemente, os métodos e fabricantes proporcionados pela presente invenção representam um avanço significante em direção a uma produção alternativa de biocombustíveis de fontes de carboidrato renováveis usando-se fermentação microbial, por exemplo, levedura.

CULTURAS MICROBIAIS PARA PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEL

[0112] Alguns aspectos desta invenção se referem a uma cultura de um micróbio aqui proporcionado ou projetado de acordo com aspectos desta invenção, ou compreendendo um ácido nucleico isolado ou proteína aqui proporcionados.

[0113] Em algumas concretizações, a cultura compreende um micróbio aqui proporcionado ou projetado de acordo com aspectos desta invenção, ou compreendendo um ácido nucleico isolado ou proteína a partir da lista aqui proporcionada e um meio, por exemplo, um meio líquido.

[0114] Em algumas concretizações, a cultura compreende um micróbio aqui proporcionado ou projetado, de acordo com aspectos desta invenção, ou compreendendo um ácido nucleico isolado ou proteína aqui proporcionados e uma fonte de carboidrato.

[0115] Em algumas concretizações, a cultura compreende um micróbio aqui proporcionado ou projetado, de acordo com aspectos desta invenção, ou compreendendo um ácido nucleico isolado ou proteína aqui proporcionados e um sal e/ou condições de estabelecimento de tampão de salinidade, osmolaridade, e pH, que são receptivos a sobrevivência, crescimento, e/ou conversão de carboidrato a biocombustível ou precursor de biocombustível pelo micróbio.

[0116] Em algumas concretizações, a cultura compreende um componente adicional, por exemplo, um aditivo. Exemplos não- limitativos de aditivos são nutrientes, enzimas, amino ácidos, albumina, fatores de crescimento, inibidores de enzima (por exemplo, inibidores de protease), ácidos graxos, lipídios, hormônios (por exemplo, dexametasona e ácido giberélico), elementos de traço, compostos inorgânicos (por exemplo, agentes de redução, tais como manganês), reguladores redox (por exemplo, antioxidantes), agentes de estabilização (por exemplo, dimetilsulfóxido), polietileno glicol, polivinilpir- rolidona (PVP), gelatina, antibióticos (por exemplo, Brefeldin A), sais (por exemplo, NaCl), agentes quelatantes (por exemplo, EDTA, EGTA), e enzimas (por exemplo, celulase, dispase, hialuronidase, ou DNase). Em algumas concretizações, a cultura po0de compreender uma transcrição de indução ou inibição de fármaco de um promotor induzível ou condicional, por exemplo, doxiciclina, tetraciclina, tamoxifen, IPTG, hormônios, ou íons de metal.

[0117] Enquanto que condições específicas de cultura, por exemplo, a concentração da fonte de carbono, dependerá do respectivo microorganism projetado a ser cultivado, métodos gerais e condições de cultura para a geração de culturas microbiais são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto, e são descritos, por exemplo, em J. Sambrook and D. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (January 15, 2001); David C. Amberg, Daniel J. Burke; and Jeffrey N. Strathern, Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (April 2005); John N. Abelson, Melvin I. Simon, Christine Guthrie, and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Part A, Volume 194 (Methods in Enzymology Series, 194), Academic Press (March 11, 2004); Christine Guthrie and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part B, Volume 350 (Methods in Enzymology, Vol 350), Academic Press; 1st edition (July 2, 2002); and Christine Guthrie and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part C, Volume 351, Academic Press; 1st edition (July 9, 2002), todos do quais sendo aqui incorporados por referência. Para produção de óleo, as culturas de micróbios projetados aqui descritas são cultivadas sob condições adequadas para acúmulo de óleo, conforme conhecidos na técnica.

[0118] Em algumas concretizações, um micróbio projetado é proporcionado que exibe uma vantagem de crescimento sobre os micróbios tipo selvagem do mesmo tipo e/ou sobre outros micróbios, por exemplo, micróbios comumente encontrados em culturas microbiais contaminadas para conversão de fonte de carbono em biocombustível ou precursor de biocombustível. Por exemplo, em algumas concretizações, um micróbio é proporcionado que exibe uma taxa de proliferação aumentada conforme comparada aos micróbios tipo selvagem do mesmo tipo ou outros micróbios, e/ou uma tolerância aumentada a, ou viabilidade sob condições que são tóxicas ou restritas a crescimento ou proliferação para micróbios tipo selvagem do mesmo tipo e/ou outros micróbios. Em algumas concretizações, a vantagem de crescimento e/ou proliferação de um micróbio projetado proporcionada pelos aspectos desta invenção se traduzem na possibilidade de usar-se condições de cultura não estéreis e de fermentação para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível, devido ao problema de super-crescimento da cultura por micróbios de contaminação ser evitado ou completamente abolido. Em algumas concretizações, um micróbio projetado proporcionado pelos aspectos desta invenção é cultivado sob condições não estéreis para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. Por exemplo, em algumas concretizações, estoque de alimentação não esterilizado, meio de cultura não esterilizado, suplementos não esterilizados, ou um biorreator não esterilizado (por exemplo, um reator aberto sob condições não estéreis) é usado para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível.

MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEL/ESTOQUE DE ALIMENTA ÇÃ O/BIOREA TORES

[0119] Alguns aspectos desta invenção se referem a métodos para a produção de biocombustível ou precursor de biocombustível usando- se micróbios modificados de acordo com esta invenção. Em algumas concretizações, os métodos para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível em uma escala industrial são proporcionados.

[0120] Uma variedade de fontes de carbono pode ser convertida em um biocombustível ou precursor de biocombustível usando-se um método proporcionado por alguns aspectos desta invenção. Açúcares, amidos, e fibras são exemplos não-limitativos de fontes de carboidrato adequadas para métodos de conversão proporcionados por alguns aspectos desta invenção. De acordo com alguns aspectos desta invenção, uma fonte de carboidrato pode compreender um açúcar refinado e/ou não-refinado, amido, e/ou fibra, ou uma combinação de qualquer destes. Exemplos não-limitativos de açúcares são açúcares fermentáveis, tais como glicose, frutose, sucrose, xilose, e lactose. Exemplos não-limitativos de amidos são amilase e amilopectin. Exemplos não-limitativos de fibras são fibras de planta, tais como celulose, hemicelulose e fibras de madeira. Alguns aspectos desta invenção se referem ao uso de subprodutos industriais, intermediários, ou produtos de despejo, por exemplo, extratos de planta brutos, melaços, palha, ou serragem como uma fonte de carbono. Em algumas concretizações, a fonte de carbono é derivada de algas. Em algumas concretizações, a biomassa de alga é produzida especificamente para uso como uma fonte de carbono em produção de biocombustível ou precursor de biocombustível mediada por micróbio.

[0121] Em algumas concretizações, métodos para a produção de biocombustível ou precursor de biocombustível são proporcionados, que incluem o uso de um estoque de alimentação de fonte de carbono pouco custoso, abundante e prontamente disponível como a fonte de carbono. Em algumas concretizações, celulose ou hemicelulose é usada como a fonte de carbono. Em algumas concretizações, a celulose ou hemicelulose é derivada de subprodutos industriais ou de despejo. Em algumas concretizações, a celulose ou hemicelulose é derivada diretamente de planta ou biomassa de alga. Planta ou biomassa de alga é um dos estoques de alimentação mais abundantes, e compreendem uma quantidade significante de açúcares não-fermentáveis e fibras, por exemplo, celulose e hemicelulose. Em algumas concretizações, o estoque de alimentação de biomassa é pré-tratado para converter a açúcar não-fermentável ou fibra em um açúcar fermentável, tornando- os, desse modo, disponíveis para crescimento de micróbio e produção de biocombustível ou precursor de biocombustível mediada por micróbio. Em algumas concretizações, o pré-tratamento de estoque de alimentação de biomassa inclui despolimerização de componentes de celulose e/ou hemicelulose a açúcares monoméricos usando-se um método de pré-tratamento conhecido àqueles técnicos no assunto, por exemplo, um ácido diluto ou método de expansão de fibra de amônia (AFEX) (ver, por exemplo, Yang B, Wyman CE. Dilute acid and autohydrolysis pretreatment. Methods Mol Biol. 2009;581:103-14; Balan V, Bals B, Chundawat SP, Marshall D, Dale BE, Lignocellulosic biomass pretreatment using AFEX Methods Mol Biol. 2009;581:61-77). Outros métodos para despolimerização de polímeros de biomassa em açúcares monoméricos são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto, e são contemplados para serem usados em algumas concretizações desta invenção.

[0122] Em algumas concretizações, um estoque de alimentação de biomassa contendo açúcares não-fermentáveis é pré-tratado usando-se um método de ácido diluto para despolimerizar um açúcar não- fermentável a um açúcar fermentável monomérico. Em algumas concretizações, a biomassa é tratada com ácido sulfúrico diluto em temperaturas moderadamente brandas por um período de tempo definido. Por exemplo, em algumas concretizações, a biomassa é tratada com cerca de 0,5%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, ou cerca de 6% de ácido sulfúrico. Em algumas concretizações, a biomassa é tratada a cerca de 30°C, a cerca de 37°C, a cerca de 40°C, a cerca de 50°C, a cerca de 60°C, a cerca de 70°C, a cerca de 80°C, a cerca de 90°C, a cerca de 100°C, a cerca de 110°C, a cerca de 120°C, a cerca de 130°C, a cerca de 140°C, a cerca de 150°C, a cerca de 175°C, a cerca de 200°C, ou a acima de cerca de 200°C.

[0123] Em algumas concretizações, o hidrolisato resultante contém lignina insolúvel e polímeros celulósicos e hemicelulósicos solubilizados. Os últimos produtos podem ser adicionalmente tratados para gerar açúcares de hexose e pentose tais como monômeros de glicose e xilose por métodos bem conhecidos àqueles técnicos no assunto, por exemplo, por tratamento com celulase ou outra enzimas de hidrolização. Em algumas concretizações, o pré-tratamento de açúcares não-fermentáveis com ácido diluto resulta na geração de subprodutos que incluem compostos tóxicos que inibem crescimento, diminuem viabilidade, e/ou inibem produção de biocombustível ou precursor de biocombustível de micróbios não projetados de acordo com aspectos desta invenção. Em algumas concretizações, o estoque de alimentação pré-tratado é lavado, suplementado com meio de suporte de crescimento microbial e produção de biocombustível ou precursor de biocombustível, e/ou super tratado com cal para detoxificação.

[0124] Em algumas concretizações, um estoque de alimentação de biomassa contendo açúcares não-fermentáveis é pré-tratado usando-se um método AFEX para despolimerizar um açúcar não-fermentável a um açúcar fermentável monomérico. Em algumas concretizações, a biomassa é tratada com amônia líquida a alta temperatura e pressão por um período de tempo definido. Em algumas concretizações, a biomassa é tratada por cerca de 10 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 40 minutos, cerca de 50 minutos, cerca de 60 minutos, cerca de 70 minutos, cerca de 80 minutos, cerca de 90 minutos, ou mais longo. Em algumas concretizações, a biomassa é tratada a cerca de 30°C, a cerca de 37°C, a cerca de 40°C, a cerca de 50°C, a cerca de 60°C, a cerca de 70°C, a cerca de 80°C, a cerca de 90°C, a cerca de 100°C, a cerca de 110°C, a cerca de 120°C, a cerca de 130°C, a cerca de 140°C, a cerca de 150°C, a cerca de 175°C, a cerca de 200°C, ou a acima de cerca de 200°C. Em algumas concretizações, o pré-tratamento de AFEX resulta na conversão de celulose cristalina contida no estoque de alimentação em uma forma amorfa fermentável. Em algumas concretizações, o estoque de alimentação de biomassa pré-tratado com AFEX não contém quantidades significantes de subprodutos tóxicos que inibem crescimento microbial e/ou produção de biocombustível ou precursor de biocombustível, e é usado sem detoxificação anterior para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível microbial.

[0125] Em algumas concretizações, o estoque de alimentação de biomassa, com ou sem pré-tratamento, é tratado com uma enzima que hidrolisa ou despolimeriza polímeros de açúcar, por exemplo, com uma enzima celulase ou hemicelulase. Em algumas concretizações, o estoque de alimentação é contatado com a enzima em uma fase líquida e incubado a uma temperatura que permite que a enzima catalise uma reação de despolimerização ou hidrolização por um tempo suficiente para hidrolisar ou despolimerizar uma quantidade significante do açúcar não-fermentável ou fibra no estoque de alimentação de biomassa. Em algumas concretizações, a fase líquida do estoque de alimentação contatada com a enzima, que contém a fração de açúcar fermentável solúvel, é separada a partir da fase sólida, incluindo açúcares não- fermentáveis e fibras, após incubação para hidrolização e despolimerização, por exemplo, por centrifugação. Em algumas concretizações, a fração líquida do estoque de alimentação é subsequentemente contatada com um micróbio, por exemplo, um micróbio proporcionado pelos aspectos desta invenção, para conversão a biocombustível ou precursor de biocombustível. Em algumas concretizações, conversão enzimática de açúcares não-fermentáveis ou fibra ocorre em um bioprocesso consolidado, por exemplo, ao mesmo tempo e/ou no mesmo reator como conversão microbial dos açúcares fermentáveis produzidos para biocombustível ou precursor de biocombustível. Em algumas concretizações, a conversão enzimática é realizada primeiro, e o estoque de alimentação contatada com a enzima é subsequentemente contatada com o micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. Em algumas concretizações, conversões enzimática e microbial são realizadas ao mesmo tempo e no mesmo reator.

[0126] Em algumas concretizações, um micróbio projetado conforme aqui proporcionado, por exemplo, um Yarrowia lipolytica sobre-expressando um gene de SCD e, opcionalmente, conduzindo modificações adicionais conforme aqui descrito, é crescido em acetato como a fonte de carbono principal. Por exemplo, em algumas concretizações, o micróbio é crescido em uma solução de ácido acético com uma concentração de cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, ou cerca de 10%. Em algumas concretizações, a concentração de acetato é entre cerca de 3%-10%. Em algumas concretizações, culturas de célula compreendendo micróbios projetados, conforme aqui proporcionado, que são cultivados em acetato como a fonte de carbono principal são contatadas, ou "batizada" com glicerol. Em algumas concretizações, os micróbios são intermitentemente contatados com glicerol. Em algumas concretizações, os micróbios são continuamente ou semicontinuamente contatados com glicerol. Em algumas concretizações, os micróbios são contatados com glicerol a uma concentração de cerca de 0,5%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, ou cerca de 5%. Contatando os micróbios projetados aqui proporcionados com glicerol proporciona-se metabólitos muito necessários para a produção de TAGs, bem como redução de porções necessárias na produção de ácidos graxos de carboidratos. Em algumas concretizações, contato com glicerol é realizado nos métodos de produção de biocombustível ou precursor de biocombustível usando-se uma fonte de carbono outra do que acetato, por exemplo, qualquer fonte de carbono aqui descrita.

[0127] Em algumas concretizações, processos de fermentação para conversão de carboidrato e lipídio mediada por micróbio de grande escala podem ser efetuados em biorreatores. Conforme aqui usado, os termos "biorreator" e "fermentador", que são permutavelmente usados, se referem a um encerramento, ou encerramento parcial, em que uma reação biológica e/ou química ocorre, pelo menos parte da qual envolve um organismo novo ou parte de um organismo novo. Um "biorreator de grande escala" ou "biorreator de escala industrial" é um biorreator que é usado para gerar um produto, por exemplo, um biocombustível ou precursor de biocombustível, por exemplo, um ácido graxo e/ou TAG, em uma escala comercial ou quase-comercial. Bioreatores de grande escala tipicamente têm volumes na faixa de litros, centenas de litros, milhares de litros, ou mais.

[0128] Um biorreator de acordo com aspectos desta invenção pode compreender um micróbio ou uma cultura de micróbio. Em algumas concretizações, um biorreator pode compreender um esporo e/ou qualquer tipo de tipo de célula dormente de qualquer micróbio isolado proporcionado pelos aspectos desta invenção, por exemplo, em um estado seco. Em algumas concretizações, adição de uma fonte de carboidrato adequada para tais biorreatores pode conduzir a ativação da célula dormente, por exemplo, para germinação de um esporo de levedura, e subsequente conversão da fonte de carboidrato, pelo menos em parte, a um biocombustível ou precursor de biocombustível.

[0129] Alguns biorreatores, de acordo com aspectos desta invenção, podem incluir sistemas de cultura de célula onde os micróbios estão em contato com líquidos em movimento e/ou bolhas de gás. Os micróbios ou culturas de micróbio de acordo com aspectos desta invenção podem ser crescidos em suspensão ou fixados a transportadores de fase sólida. Exemplos não-limitativos de sistemas transportadores incluem micro transportadores (por exemplo, esferas de polímero, micro contas, e micro discos que podem ser porosos ou não- porosos), contas reticuladas (por exemplo, dextran) carregadas com grupos químicos específicos (por exemplo, grupos de amina terciária), micro transportadores 2D incluindo células presas em fibras de polímero não-porosas, transportadores 3D (por exemplo, fibras transportadoras, fibras ocas, reatores de multicartucho, e membranas semi-permeáveis que podem compreender fibras porosas), micro transportadores tendo capacidade de troca de íon reduzida, encapsulamento de células, capilares, e agregados. Os transportadores podem ser fabricados de materiais, tais como dextran, gelatina, vidro, e celulose.

[0130] Os processos de conversão de carboidrato em lipídio em escala industrial de acordo com os aspectos desta invenção podem ser operados em modos contínuos, semi-contínuos ou não-contínuos. Exemplos não-limitativos de modos de operação, de acordo com esta invenção, são modos em batelada, modos alimentado em batelada, modos de batelada estendido, modos em batelada repetitivo, modos de retirada/enchimento, modos de rotação-parede, frasco de centrifugação, e/ou modos de perfusão de operação.

[0131] Em algumas concretizações, os biorreatores podem ser usados que permitem reabastecimento contínuo ou semi-contínuo do estoque de substrato, por exemplo, uma fonte de carboidrato e/ou separação contínua ou semi-contínua do produto, por exemplo, um lipídio secretado, uma fase orgânica compreendendo um lipídio, e/ou células que exibem um teor desejado de lipídio, a partir do reator.

[0132] Exemplos não-limitativos de biorreatores, de acordo com esta invenção, são: fermentadores de tanque agitados, biorreatores agitados por dispositivos de mistura rotativos, estatores químicos, biorreatores agitados por dispositivos de oscilação, fermentadores de elevação de ar, reatores de leito acondicionado, reatores de leito fixo, biorreatores de leito fluidizado, biorreatores que empregam agitação induzida por ondas, biorreatores centrífugos, garrafas laminadoras, e biorreatores de fibra vazados, aparelhos laminadores (por exemplo, topo de bancada, montados em carro, e/ou variedades automáticas), placas verticalmente empilhadas, frascos centrifugadores, frascos de agitação ou oscilantes, placas de multicavidade osciladas, garrafas de MD, frascos em T, garrafas Roux, propagadores de cultura de tecido de superfície múltipla, fermentadores modificados, e contas revestidas (por exemplo, contas revestidas com proteínas de soro, nitrocelulose, ou carboximetil celulose para impedir fixação da célula).

[0133] Os biorreatores e fermentadores, de acordo com aspectos desta invenção, podem, opcionalmente, compreender um sensor e/ou um sistema de controle para medir e/ou ajustar os parâmetros de reação. Exemplos não-limitativos de parâmetros de reação são: parâmetros biológicos, por exemplo, taxa de crescimento, tamanho da célula, número de célula, densidade da célula, tipo de célula, ou estado da célula, parâmetros químicos, por exemplo, pH, potencial redox, concentração de substrato de reação e/ou produto, concentração de gases dissolvidos, tal como concentração de oxigênio e concentração de CO2, concentrações de nutriente, concentrações de metabólito, concentração de glicose, concentração de glutamina, concentração de piruvato, concentração de apatita, concentração de um oligopeptídeo, concentração de um amino ácido, concentração de uma vitamina, concentração de um hormônio, concentração de um aditivo, concentração de soro, resistência iônica, concentração de um íon, umidade relativa, molaridade, osmolaridade, concentração de outros químicos, por exemplo, agentes de tamponamento, adjuvantes, ou subprodutos de reação, parâmetros físicos/mecânicos, por exemplo, densidade, condutividade, grau de agitação, pressão, e taxa de fluxo, tensão de cisalhamento, taxa de cisalhamento, viscosidade, cor, turbidez, absorção de luz, taxa de mistura, taxa de conversão, bem como parâmetros termodinâmicos, tais como, temperatura, intensidade/qualidade de luz, etc.

[0134] Os sensores capazes de medir os parâmetros, conforme aqui descritos, são bem conhecidos àqueles técnicos nas técnicas mecânicas e eletrônicas relevantes. Sistemas de controle capazes de ajustar os parâmetros em um biorreator baseado nas entradas de um sensor, conforme aqui descrito, são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto de projeto de biorreator.

[0135] Uma variedade de micróbios diferentes proporcionada pelos aspectos desta invenção pode ser cultivada em um biorreator adequado para realizar conversão em grande escala de carboidrato em biocombustível ou precursor de biocombustível, de acordo com os aspectos da invenção, por exemplo, micróbios de várias fontes de levedura, tais como levedura oleaginosa, bactérias, algas e fungos.

[0136] Exemplos não-limitativos de células de levedura são células de Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, S. bayanus, S. K. lactis, Waltomyces lipofer. Mortierella alpine, Mortierella isabellina, Hansenula polymorpha., Mucor rouxii, Trichosporon cutaneu, Rhodotorula glutinis Saccharomyces diastasicus, Schwanniomyces occidentalis, S. cerevisiae, Pichia stipitis, e Schizosaccharomyces pombe.

[0137] Exemplos não-limitativos de bactérias são Bacillus subtilis, Salmonella, Escherichia coli, Vibrio cholerae, Streptomyces, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas sp, Rhodococcus sp, Streptomyces sp, e Alcaligenes sp.

[0138] Células de fungos podem, por exemplo, serem cultivadas de espécies tais como Aspergillus shirousamii, Aspergillus niger e Trichoderma reesei.

[0139] Exemplos não-limitativos de células de algas são células de Neochloris oleoabundans, Scenedesmus obliquus, Nannochloropsis sp., Dunaliella tertiolecta, Chlorella vulgaris, Chlorella emersonii, e Spirulina maxima.

[0140] O tipo de fonte de carboidrato a ser empregado para conversão a um biocombustível ou precursor de biocombustível, de acordo com aspectos desta invenção, depende do micróbio específico empregado. Alguns micróbios proporcionados pelos aspectos desta invenção podem ser capazes de converter eficientemente uma fonte de carboidrato específica, enquanto que uma fonte de carboidrato diferente não pode ser processada pelo mesmo micróbio em alta eficiência, ou no todo. De acordo com aspectos desta invenção, a levedura oleaginosa Y. lipolytica, por exemplo, pode converter eficientemente açúcares, tais como glicose, frutose, sucrose, e/ou lactose, e fontes de carboidrato altas em açúcares, por exemplo, melaços, e fibras de planta em ácidos graxos e seus derivados.

[0141] Em algumas concretizações, um biocombustível ou precursor de biocombustível, por exemplo, um ácido graxo ou um triacilglicerol, gerado de um estoque de alimentação de fonte de carbono é secretado, pelo menos parcialmente, por um micróbio proporcionado pelos aspectos desta invenção, por exemplo, uma levedura oleaginosa, tal como uma célula de Y. lipolytica. Em algumas concretizações, um micróbio proporcionado pelos aspectos desta invenção é contatado com uma fonte de carboidrato em uma solução aquosa em um biorreator, e secretando biocombustível ou precursor de biocombustível forma uma fase orgânica que pode ser separada a partir da fase aquosa. O termo fase orgânica, conforme aqui usado, se refere a uma fase líquida compreendendo um composto orgânico não-polar, por exemplo, um ácido graxo, TAG, e/ou outros lipídio mão polar. E fase orgânica de acordo com esta invenção pode adicionalmente conter um micróbio, um carboidrato, ou outros composto encontrado em outras fases encontradas em um respectivo biorreator. Os métodos úteis para separação de fase em escala industrial são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. Em algumas concretizações, a fase orgânica é continuamente ou semicontinuamente sifona- da. Em algumas concretizações, um biorreator é empregado compreendendo um separador, com extrai continuamente ou semicontinuamente a fase orgânica.

[0142] Em algumas concretizações, um biocombustível ou precursor de biocombustível é acumulado em células de acordo com aspectos desta invenção. Em algumas concretizações, as células que têm acumulada uma quantidade desejável de biocombustível ou precursor de biocombustível, são separadas continuamente ou semicontinuamente de um biorreator, por exemplo, por centrifugação, sedimentação, ou filtração. A separação de célula pode adicionalmente ser efetuada, por exemplo, baseado em uma mudança nas características físicas da célula, tais como tamanho ou densidade da célula, por métodos conhecidos àqueles técnicos no assunto. O biocombustível ou precursor de biocombustível acumulado pode subsequentemente ser extraído a partir das respectivas células usando-se métodos padrões de extração conhecidos àqueles técnicos no assunto, por exemplo, extração de solvente de hexano. Em algumas concretizações, as células microbiais são coletadas e extraídas com 3 vezes o volume coletado da célula de hexano. Em algumas concretizações, o biocombus- tível ou precursor de biocombustível estraído são adicionalmente refinados. Em algumas concretizações, um precursor de biocombustível, por exemplo, um triacilglicerol é convertido a um biocombustível, por exemplo, biodiesel, usando-se um método bem conhecido àqueles técnicos no assunto, por exemplo, um procedimento de transesterificação.

[0143] A função e vantagem destas e outras concretizações da presente invenção serão mais totalmente compreendidas dos exemplos abaixo. Os seguintes exemplos são pretendidos para ilustrar os benefícios da presente invenção, mas não exemplificar o escopo total da invenção.

EXEMPLOS MATERIAIS E MÉTODOS

[0144] Construtos de gene: Os respectivos genes, por exemplo, GLUT1, hemoglobina, citocromo, Piruvato carboxilase, SCD, etc., foram clonados em plasmídeo YLEX (Figura 12) entre locais PmlI e Kpn. Os locais de restrição usados foram PmlI e KpnI. Todo cDNA foi seqüenciado e mapeado para bases de dados genômicas. As entradas de base de dados de sequência representativa exemplar que os cDNAs clonados foram mapeados incluem: GLUT1: GeneID: 6513; Hemoglobina: Vitreos- cilla stercoraria bacterial gene hemoglobina, ACCESSO L77863; Citocro- mo: GeneID: 1528, CYB5A citocromo b5 tipo A; Piruvato carboxilase: GeneID: 5091; SCD estearoila-CoA desaturase (SCD): GeneID: 710155.

[0145] Sequências representativas, por exemplo, sequências de codificação, úteis para a geração de micróbios de sobre-expressão são, por exemplo: HEMOGLOBINA (bacterial) ATGTTAGACCAACAAACCGTAGACACCAGCAAAGCCACT GTTCCTGTATTGAAAGAGCATGGCGTGACCATTACCACGACGTTTTA CCAAAATTTGTTTGCCAAACATCCTGAAGTACGACCTTTGTTTGACA TGGGTCGCCAAGCATCTTTGGAACAGCCTAAGGCTTTGGCGATGAC GGTTGGGGCGGCGGCACAAAACATTGAAAATTTACCTGCAATTTTG CCTGCAGTACAAAAAATTGCCGTCAAACATTGTCAAGCAGGCGTGG CGGCACGACATTATCCGATTGTGGGTCAAGAATTGTTGGGTGCGAT TAAAGAATTATTGGGTGATGCGGCGACCGATGATATTTTGGATGCG TGGGGCAAGGCTTATGGCGTGATTGCCGATGTTTTTATTCAAGTGG AAGCGGATTTGTACGCTCAAGACGCTGAATAA (SEQ ID NO: 3) CITOCROMO B (Yarrowia) ATGATCATCAACGGCAAGGTCTACGACATCTCCAGCTT CGTTGACGAGCATCCCGGTGGAGAGGAGGTTCTTCTTGATGCCG GTGGAACTGAGGCCACCAACGCTTTCGACGACGTTGGACACTCT GAGGACGCTTACGGCATCCTTAACGACCTCTATGTCGGTGAGGTT GACCCCAGCGAGGACGTTATCCGAAAGACTCACACTGTCAAGACT TCTTACGAGGACGGCGAGTCTGTTGGTGATGACCACGGATCTTCT TCCATGATCTTCCTCATTGTTGCTGCTGCTGTTGCCGCCGCTGCTT TCTTCTACCTCCAGGGTCAGAAATAA (SEQ ID NO: 4) GLUT (rato) ATGGAGCCCAGCAGCAAGAAGGTGACGGGCCGCCTTAT GTTGGCCGTGGGAGGGGCAGTGCTCGGATCCCTGCAGTTCGGCTA TAACACCGGTGTCATCAACGCCCCCCAGAAGGTAATTGAGGAGTTC TACAATCAAACATGGAACCACCGCTATGGAGAGTCCATCCCATCCA CCACACTCACCACACTCTGGTCTCTCTCCGTGGCCATCTTCTCTGT CGGGGGCATGATTGGTTCCTTCTCTGTGGGCCTCTTTGTTAATCGC TTTGGCAGGCGGAACTCCATGCTGATGATGAACCTGTTGGCCTTTG TGTCTGCCGTGCTTATGGGTTTCTCCAAACTGGGCAAGTCCTTTGA GATGCTGATCCTGGGCCGCTTCATCATTGGAGTGTACTGTGGCCTG ACCACCGGCTTTGTGCCCATGTATGTGGGGGAGGTGTCACCCACA GCTCTTCGTGGAGCCCTGGGCACCCTGCACCAGCTGGGCATCGTC GTTGGGATCCTTATTGCCCAGGTGTTCGGCTTAGACTCCATCATGG GCAATGCAGACTTGTGGCCTCTACTGCTCAGTGTCATCTTCATCCC AGCCCTGCTACAGTGTATCCTGTTGCCCTTCTGCCCTGAGAGCCCC CGCTTCCTGCTCATCAATCGTAACGAGGAGAACCGGGCCAAGAGT GTGCTGAAAAAGCTTCGAGGGACAGCCGATGTGACCCGAGACCTG CAGGAGATGAAAGAAGAGGGTCGGCAGATGATGCGGGAGAAGAAG GTCACCATCTTGGAGCTGTTCCGCTCACCCGCCTACCGCCAGCCCA TCCTCATCGCCGTGGTGCTGCAGCTGTCCCAGCAGCTGTCGGGCA TCAATGCTGTGTTCTACTACTCAACGAGCATCTTCGAGAAGGCAGG TGTGCAGCAGCCTGTGTATGCCACCATCGGCTCGGGTATCGTCAAC ACGGCCTTCACTGTGGTGTCGCTGTTCGTCGTGGAGCGAGCTGGC CGTCGGACCCTGCACCTCATTGGTCTGGCTGGCATGGCGGGCTGT GCTGTGCTCATGACCATCGCCCTGGCCCTGCTGGAGCAGCTGCCC TGGATGTCCTATCTGAGTATCGTGGCCATCTTTGGCTTTGTGGCCTT CTTTGAAGTAGGCCCTGGTCCTATTCCATGGTTCATTGTGGCCGAG CTGTTCAGCCAGGGGCCCCGACCTGCTGCTGTTGCTGTGGCTGGC TTCTCTAACTGGACCTCAAACTTCATCGTGGGCATGTGCTTCCAATA TGTGGAGCAACTGTGTGGCCCCTACGTCTTCATCATCTTCACGGTG CTGCTGGTACTCTTCTTCATCTTCACCTACTTCAAAGTTCCTGAGAC CAAAGGCCGGACCTTCGATGAGATCGCTTCCGGCTTCCGGCAGGG GGGTGCCAGCCAGAGCGACAAGACACCTGAGGAGCTCTTCCACCC TCTGGGGGCTGACTCCCAAGTGTGA (SEQ ID NO: 5) Enzima Málica (Yarrowia) ATGTTACGACTACGAACCATGCGACCCACACAGACCAGC GTCAGGGCGGCGCTTGGGCCCACCGCCGCGGCCCGAAACATGTC CTCCTCCAGCCCCTCCAGCTTCGAATACTCGTCCTACGTCAAGGGC ACGCGGGAAATCGGCCACCGAAAGGCGCCCACAACCCGTCTGTCG GTTGAGGGCCCCATCTACGTGGGCTTCGACGGCATTCGTCTTCTCA ACCTGCCGCATCTCAACAAGGGCTCGGGATTCCCCCTCAACGAGC GACGGGAATTCAGACTCAGTGGTCTTCTGCCCTCTGCCGAAGCCAC CCTGGAGGAACAGGTCGACCGAGCATACCAACAATTCAAAAAGTGT GGCACTCCCTTAGCCAAAAACGGGTTCTGCACCTCGCTCAAGTTCC AAAACGAGGTGCTCTACTACGCCCTGCTGCTCAAGCACGTTAAGGA GGTCTTCCCCATCATCTATACACCGACTCAGGGAGAAGCCATTGAA CAGTACTCGCGGCTGTTCCGGCGGCCCGAAGGCTGCTTCCTCGAC ATCACCAGTCCCTACGACGTGGAGGAGCGTCTGGGAGCGTTTGGA GACCATGACGACATTGACTACATTGTCGTGACTGACTCCGAGGGTA TTCTCGGAATTGGAGACCAAGGAGTGGGCGGTATTGGTATTTCCAT CGCCAAGCTGGCTCTCATGACTCTATGTGCTGGAGTCAACCCCTCA CGAGTCATTCCTGTGGTTCTGGATACGGGAACCAACAACCAGGAGC TGCTGCACGACCCCCTGTATCTCGGCCGACGAATGCCCCGAGTGC GAGGAAAGCAGTACGACGACTTCATCGACAACTTTGTGCAGTCTGC CCGAAGGCTGTATCCCAAGGCGGTGATCCATTTCGAGGACTTTGGG CTCGCTAACGCACACAAGATCCTCGACAAGTATCGACCGGAGATCC CCTGCTTCAACGACGACATCCAGGGCACTGGAGCCGTCACTTTGG CCTCCATCACGGCCGCTCTCAAGGTGCTGGGCAAAAATATCACAGA TACTCGAATTCTCGTGTACGGAGCTGGTTCGGCCGGCATGGGTATT GCTGAACAGGTCTATGATAACCTGGTTGCCCAGGGTCTCGACGACA AGACTGCGCGACAAAACATCTTTCTCATGGACCGACCGGGTCTACT GACCACCGCACTTACCGACGAGCAGATGAGCGACGTGCAGAAGCC GTTTGCCAAGGACAAGGCCAATTACGAGGGAGTGGACACCAAGAC TCTGGAGCACGTGGTTGCTGCCGTCAAGCCCCATATTCTCATTGGA TGTTCCACTCAGCCCGGCGCCTTTAACGAGAAGGTCGTCAAGGAGA TGCTCAAACACACCCCTCGACCCATCATTCTCCCTCTTTCCAACCCC ACACGTCTTCATGAGGCTGTCCCTGCAGATCTGTACAAGTGGACCG ACGGCAAGGCTCTGGTTGCCACCGGCTCGCCCTTTGACCCAGTCA ACGGCAAGGAGACGTCTGAGAACAATAACTGCTTTGTTTTCCCCGG AATCGGGCTGGGAGCCATTCTGTCTCGATCAAAGCTCATCACCAAC ACCATGATTGCTGCTGCCATCGAGTGCCTCGCCGAACAGGCCCCC ATTCTCAAGAACCACGACGAGGGAGTACTTCCCGACGTAGCTCTCA TCCAGATCATTTCGGCCCGGGTGGCCACTGCCGTGGTTCTTCAGG CCAAGGCTGAGGGCCTAGCCACTGTCGAGGAAGAGCTCAAGCCCG GCACCAAGGAACATGTGCAGATTCCCGACAACTTTGACGAGTGTCT CGCCTGGGTCGAGACTCAGATGTGGCGGCCCGTCTACCGGCCTCT CATCCATGTGCGGGATTACGACTAG (SEQ ID NO: 6) Yarrowia Delta(9)-desaturase (Estearoila-CoA desaturase) ATGGTGAAAAACGTGGACCAAGTGGATCTCTCGCAGGT CGACACCATTGCCTCCGGCCGAGATGTCAACTACAAGGTCAAGTA CACCTCCGGCGTTAAGATGAGCCAGGGCGCCTACGACGACAAGG GCCGCCACATTTCCGAGCAGCCCTTCACCTGGGCCAACTGGCAC CAGCACATCAACTGGCTCAACTTCATTCTGGTGATTGCGCTGCCT CTGTCGTCCTTTGCTGCCGCTCCCTTCGTCTCCTTCAACTGGAAG ACCGCCGCGTTTGCTGTCGGCTATTACATGTGCACCGGTCTCGGT ATCACCGCCGGCTACCACCGAATGTGGGCCCATCGAGCCTACAA GGCCGCTCTGCCCGTTCGAATCATCCTTGCTCTGTTTGGAGGAGG AGCTGTCGAGGGCTCCATCCGATGGTGGGCCTCGTCTCACCGAG TCCACCACCGATGGACCGACTCCAACAAGGACCCTTACGACGCC CGAAAGGGATTCTGGTTCTCCCACTTTGGCTGGATGCTGCTTGTG CCCAACCCCAAGAACAAGGGCCGAACTGACATTTCTGACCTCAAC AACGACTGGGTTGTCCGACTCCAGCACAAGTACTACGTTTACGTT CTCGTCTTCATGGCCATTGTTCTGCCCACCCTCGTCTGTGGCTTT GGCTGGGGCGACTGGAAGGGAGGTCTTGTCTACGCCGGTATCAT GCGATACACCTTTGTGCAGCAGGTGACTTTCTGTGTCAACTCCCT TGCCCACTGGATTGGAGAGCAGCCCTTCGACGACCGACGAACTC CCCGAGACCACGCTCTTACCGCCCTGGTCACCTTTGGAGAGGGC TACCACAACTTCCACCACGAGTTCCCCTCGGACTACCGAAACGCC CTCATCTGGTACCAGTACGACCCCACCAAGTGGCTCATCTGGACC CTCAAGCAGGTTGGTCTCGCCTGGGACCTCCAGACCTTCTCCCAG AACGCCATCGAGCAGGGTCTCGTGCAGCAGCGACAGAAGAAGCT GGACAAGTGGCGAAACAACCTCAACTGGGGTATCCCCATTGAGCA GCTGCCTGTCATTGAGTTTGAGGAGTTCCAAGAGCAGGCCAAGAC CCGAGATCTGGTTCTCATTTCTGGCATTGTCCACGACGTGTCTGC CTTTGTCGAGCACCACCCTGGTGGAAAGGCCCTCATTATGAGCGC CGTCGGCAAGGACGGTACCGCTGTCTTCAACGGAGGTGTCTACC GACACTCCAACGCTGGCCACAACCTGCTTGCCACCATGCGAGTTT CGGTCATTCGAGGCGGCATGGAGGTTGAGGTGTGGAAGACTGCC CAGAACGAAAAGAAGGACCAGAACATTGTCTCCGATGAGAGTGGA AACCGAATCCACCGAGCTGGTCTCCAGGCCACCCGGGTCGAGAA CCCCGGTATGTCTGGCATGGCTGCTTAG (SEQ ID NO: 7) Piruvato carboxilase (humano) ATGCTGAAGTTCCGAACAGTCCATGGGGGCCTGAGGC TCCTGGGAATCCGCCGAACCTCCACCGCCCCCGCTGCCTCCCCA AATGTCCGGCGCCTGGAGTATAAGCCCATCAAGAAAGTCATGGTG GCCAACAGAGGTGAGATTGCCATCCGTGTGTTCCGGGCCTGCAC GGAGCTGGGCATCCGCACCGTAGCCATCTACTCTGAGCAGGACA CGGGCCAGATGCACCGGCAGAAAGCAGATGAAGCCTATCTCATC GGCCGCGGCCTGGCCCCCGTGCAGGCCTACCTGCACATCCCAGA CATCATCAAGGTGGCCAAGGAGAACAACGTAGATGCAGTGCACC CTGGCTACGGGTTCCTCTCTGAGCGAGCGGACTTCGCCCAGGCC TGCCAGGATGCAGGGGTCCGGTTTATTGGGCCAAGCCCAGAAGT GGTCCGCAAGATGGGAGACAAGGTGGAGGCCCGGGCCATCGCC ATTGCTGCGGGTGTTCCCGTTGTCCCTGGCACAGATGCCCCCATC ACGTCCCTGCATGAGGCCCACGAGTTCTCCAACACCTACGGCTTC CCCATCATCTTCAAGGCGGCCTATGGGGGTGGAGGGCGTGGCAT GAGGGTGGTGCACAGCTACGAGGAGCTGGAGGAGAATTACACCC GGGCCTACTCAGAGGCTCTGGCCGCCTTTGGGAATGGGGCGCTG TTTGTGGAGAAGTTCATCGAGAAGCCACGGCACATCGAGGTGCA 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GATAACATCTTGATAACTTCAGATAATCCATCAATAGCATTGTCAT GGTCGCTTCTGATCTTTTTAGCTAAGTCTTGAGCGAATGACTCTAA TTTCAAACCCTTTAGTTTATCGTCCAAAGTTTTGTAGTTTTCTTCAA TCCATGTTGCGACTTGCCTATCATCTTCATGGTCCACTGAAGCAG GGTACCACGATCTAATTCTTGCGATCTTTTCTAATCTTGATGCTTC GCCTACCTGATGGCTCAACCTTTTAATCAAATATTCTTCGTTCAAT CTTCTTCTCAATCTCCAGAAGAAGAAACGACGTGCCTCGGTCCAT TCCAGTTCCTTAGAAATAACACCCTTGGCCACCATACGTGAAGAC CTATCGTGCAAATCAGCAAATTGAAGACTGATTTGTCCGTAAATTG GCAATAGTTCTCTCTCACGATCAGCTAATTGCTTGGATATTTGCTG ATGTACTTCTGGAGCCAAACTCTTGTTGGATAATTGAGATCTCAAT TCTCTGTACTTGTCATCCAATCTGTTCATGGTGTCCAGCAATTTTT CTCTACGGAACTTGATACCAACCATACCTTGTGGTTCCAAAACACC AGCTCTAGCGTTGACGTCGGCATACATTTCCATTTGGTCAGCGTT GATAGTTGGATCGACAACAACCCATGAACCACCTCTTAGTTCACC GGTAGGTGGGATATAGATAATAATTGGTTGTTTGTAATCCACCAAT GCGTCAACAATAAACGAACCATACTTCAAGACTTCGTTGAACATAT CACGTTGACCACCAGAGAAACCTCTCCAGTTGGCCAAAATCATCA TTGGCAATTGTTCACCGTTGTTAAAGTCATTGATAGCTTGAGCAGT CTTGAAGGCGGAGTTTGGATGCCAAACTTGACCAGGTTCTTGAAT TAATGTTTCAGCACTATTTGGATTAGCTGGATCAGCAGGAATCAAG 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CAATGAGCATGAAACTGCTCCAAGAAGAAATTATCAATGCCGCGA GAAGCCGCTCGTCAGACCGCCTAACACAAAGTGTTCCACTGTTTA TGAGTTTGTTCTAGAGTGCTTTCAGAAGAACAAAAATTCAAATGCT ATGGGTTGGAGGGATGTTAAGGAAATTCATGAAGAATCCAAATCG GTTATGAAAAAAGTTGATGGCAAGGAGACTTCAGTGGAAAAGAAA TGGATGTATTATGAACTATCGCATTATCATTATAATTCATTTGACCA ATTGACCGATATCATGCATGAAATTGGTCGTGGGTTGGTGAAAATA GGATTAAAGCCTAATGATGATGACAAATTACATCTTTACGCAGCCA CTTCTCACAAGTGGATGAAGATGTTCTTAGGAGCGCAGTCTCAAG GTATTCCTGTCGTCACTGCCTACGATACTTTGGGAGAGAAAGGGC TAATTCATTCTTTGGTGCAAACGGGGTCTAAGGCCATTTTTACCGA TAACTCTTTATTACCATCCTTGATCAAACCAGTGCAAGCCGCTCAA GACGTAAAATACATAATTCATTTCGATTCCATCAGTTCTGAGGACA GGAGGCAAAGTGGTAAGATCTATCAATCTGCTCATGATGCCATCA ACAGAATTAAAGAAGTTAGACCTGATATCAAGACCTTTAGCTTTGA CGACATCTTGAAGCTAGGTAAAGAATCCTGTAACGAAATCGATGTT CATCCACCTGGCAAGGATGATCTTTGTTGCATCATGTATACGTCTG GTTCTACAGGTGAGCCAAAGGGTGTTGTCTTGAAACATTCAAATGT TGTCGCAGGTGTTGGTGGTGCAAGTTTGAATGTTTTGAAGTTTGT GGGCAATACCGACCGTGTTATCTGTTTTTTGCCACTAGCTCATATT TTTGAATTGGTTTTCGAACTATTGTCCTTTTATTGGGGGGCCTGCA 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GAAGAAACCGCCAAGTTCTCGGGTTACTTGCCACCTGTTCCAGTC AATTCTGAAGACCCATTGTTCTTGTTGTATACATCTGGTTCCACTG GTACTCCTAAGGGTGTTGTCCACACCACTGGGGGCTACCTCTTAG GTGCTGCCATGACCACCAAGTACATTTTCGACGTCCACCCAGAAG ACATCTTGTTCACTGCCGGTGATGTCGGTTGGATTACTGGTCACA CCTATGCTTTGTACGGACCTTTGGCTCTCGGTATCCCAACAATCGT TTTTGAAGGTACTCCAGCCTACCCAGACTTTGGTAGATTCTGGCAA ATTGTCGAAAAGCACAAGGCTACCCACTTCTACGTAGCTCCTACT GCCCTCAGATTGTTGAGAAAGAGTGGCGAGCAAGAGATTCCAAAG TACGACTTGTCTTCTTTGAGAACATTGGGCTCTGTTGGTGAACCTA TCTCCCCTGATATCTGGGAATGGTACAACGAGCACGTTGGACAAG GCAGATGCCACATCTCCGACACCTACTGGCAAACTGAGTCTGGTT CTCACTTCATTGCTCCAATTGCCGGTGTCACTCCAAACAAACCTG GTTCAGCCTCTTTGCCATTCTTTGGTATCGAGACCGCTCTTATTGA TCCAGTTTCCGGCCACGAACTCGAAGGTAACGACATCGAAGGTGT TCTTGCCATCAAGAGCACCTGGCCATCTATGGCTAGATCTGTCTG GAACAACCACACCAAGTACATGGACACATACTTGAACCCATACCC AGGCTACTACTTTACCGGCGACGGTGCTGCCAGAGATCACGACG GCTACTACTGGATTAGAGGTAGAGTCGATGATGTCGTCAATGTGT CTGGTCACAGATTGTCTACTGCTGAAATAGAAGCTGCCCTCATCG AACACAACGGTGTTTCTGAAGCTGCTGTGGTTGGTATTACCGACG 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GTTTGTAAGACAAGTTAGCGCAAAGGATGCTGATAACGATACCTTA AGGTTTGATATTGTGGATGGAAACACCAACGAATGTTTCCAGATC GAAAAATACACCGGAATAATTACAACACGAAATTTTGAAATACTAA ATAACGAAAATGATCGGGACTATGCCTTGCACGTCCGTGCCTCCG ACGGAATTTTCTCTGCAATTTTAATAGTTAAAATTAAGGTTTTGTCC GCCATCGATTCGAATTTCGCATTCCAACGTGAATCGTACAGATTTT CTGCATTTGAAAATAACACAAAGGTAGCTACCATTGGATTGGTGAA CGTAATAGGAAACACACTGGACGAAAACGTTGAGTATCGCATCCT GAACCCAACACAATTGTTTGATATTGGAATCAGTTCGGGAGCCCT AAAAACCACTGGAGTTATTTTCGATCGCGAAGTAAAGGATTTGTAC AGACTCTTCGTGGAAGCAAAGTCAATGCTATACGACGGCATGAAT TCAAATGTTCGCAGAGCAGTAACGTCCATAGATATATCCGTCTTGG ATGTGAACGACAATTGCCCCTTGTTTGTCAATATGCCCTATTATGC CACAGTCTCTATTGACGATCCAAAAGGAACGATTATTATGCAGGTC AAGGCCATTGACTTGGACAGTGCAGAAAACGGCGAAGTTCGGTAC GAACTTAAGAAGGGCAATGGGGAGTTGTTCAAACTGGACCGCAAA TCTGGGGAGTTATCCATAAAGCAGCATGTCGAAGGTCATAACCGA AACTATGAATTGACAGTGGCTGCCTATGATGGCGCCATAACACCA TGCTCCTCGGAAGCTCCTCTGCAGGTTAAGGTTATAGATCGTTCG ATGCCCGTTTTTGAAAAGCAGTTTTATACTGTTAGCGTCAAGGAAG ACGTGGAAATGTACTCAGCCCTTTCCGTATCCATTGAAGCAGAAA GTCCCCTGGGAAGGAGTTTAATTTACACAATATCTTCCGAGAGTCA ATCGTTTGAAATTGATTACAACACGGGATCAATTTTTGTCGTAAAT GAATTGGATTACGAGAAAATAAGCTCACACGATGTTTCCATTCGAG CGACTGACAGTCTTTCTGGTGTTTATGCTGAAGTCGTTTTATCTGT TTCCATTATGGATGTCAATGACTGCTATCCAGAAATTGAGAGTGAT ATATACAACCTAACCATTCCGGAAAATGCATCGTTTGGAACACAAA TTCTGAAGATTAATGCAACTGATAACGACTCGGGAGCAAATGCAA AACTTTCCTATTACATTGAGTCCATTAATGGGCAAAATAATTCAGAA CTGTTTTACATTGACGTCACAGACGGAAATCTGTATTTAAAGACTC CATTGGACTATGAACAAATCAAGTATCATCATATAGTCGTTAACGT AAAGGACCATGGATCGCCATCATTAAGTTCCCGATCAAACGTATTT ATAACAGGTAGAATTCTATGTCGCTTTATCTCTTACAAACTAATTTA TGATTCTATTATTCCAGTTAAAGACTTAAACGACAACGCTCCATGT TTCGTTGAGCCGTCGTACTTCACCAAAGTGTCAGTGGCAGCTGTT CGTGGACAATTTGTTGCTTTACCTAAAGCATACGATAAGGATATTT CCGATACCGATTCTCTGGAATACAAAATTGTTTACGGAAATGAATT GCAAACCTATAGTATTGATAAGCTAACAGGAGTGATTTCCCTTCAA AATATGTTAAATTTCACTGATAAAAGTAGCACAGTCTTGAATATTTC CGTCTCCGATGGAGTTCATACGGCATATGCCCGGCTCAAAATATC CTTATTGCCAGAAAACGTTTACAGTCCACTGTTTGATCAAAGTACT TATGAGGCTCAAGTACCTGAAAACTTGCTACACGGTCATAATATAA TCACGGTAAAAGCATCGGATGGAGACTTTGGCACCTACGCCAATC TTTACTACGAAATAGTTTCGGAGGAAATGAAAAAAATCTTTCTCAT CGACCAAACGACGGGTGTAATAACCTCAAAAGTAACTTTCGACCG TGAAAAAAAGGATGAGTACGTGGTGCTACTGAAGGTGTCCGACGG TGGCGGAAAATTCGGATTTGCCTCTCTCAAGGTCATAGTCGTCGA CGTGAACGATAACGTTCCTTACTTCCTATTGAAGGAATACAAAATG GTTGTTAGCACAACAGTGGAAGCAAACCAAACTATCCTGACGGTC AAAGCCAAAGACGACGATATTGTTGATAATGGATCGGTGCATTTC CAAATTGTTCAAAAATCCAACGATAAGGCAGTAAAGGATGTAATCG AAATCAACGAGAAAACTGGGGATATTGTGTTTAAAAGCAAGGCGG AATCTTACGGAGTGAACTCATATCAGTTTTTCGTTCGCGCTTCCGA TCGCGGTGAACCTCAATTTCATTCGGAAGTTCCAGTGTCAATCGA AATAATCGAGACTGATGCCAATATTCCCACTTTTGAGAAATCGTCA GTTCTACTAAAGATCATAGAGTCAACGCCACCAGGAACCGTGCTA ACGAAGCTACATATGATTGGAAACTATACGTTCAAATTCTCAATAG CAGCGGATCAGGATCACTTCATGATATCCGATAGTGGTGAACTGA TCCTTCAGCAGACATTGGACAGGGAGCAGCAAGAGTCGCACAATT TGATTGTAGTGGCGGAAACTTCCACGGTTCCCGTTTTTTTCGCCTA CGCTGATGTTTTGATTGACGTTAGGGACGAAAATGATAACTATCCC AAGTTTGACAACACATTCTACAGTGCCAGTGTTGCGGAAAACAGT GAAAAGGTGATATCCTTGGTGAAAGTATCGGCCACAGATGCGGAC ACTGGGCCAAATGGCGACATTCGCTACTACTTGGAAAGTGATACT GAAAACATTCAAAATATTTTTGACATTGACATTTACTCTGGCTGGAT CACCTTGCTAACCTCCTTGGACAGAGAAGTTCAGTCCGAGTACAA TTTCAAAGTAATTGCTGCCGATAATGGCCACCCAAAGCATGATGC AAAAGTACCTGTAACTATCAAAATCGTAGACTATAATGATAACGCA CCAGTATTTAAGTTGCCTATCGAAGGGCTTTCTGTTTTCGAAAACG CGCTGCCTGGCACGGTTTTAATCAACTTACTCCTAATTGATCCCGA TATCGAGAAACAGGAAATGGATTTCTTTATCGTTTCTGGGGACAAG CAAGCCCAGTTTCAGATCGGTAAGAGCGGAGAGTTATTTATTGCC AAACCATTAGATCGCGAACAACTCATGTTCTACAACTTAAGCATAA TAGCCACTGATGGAAAATTCACTGCCAAAGCCAATGTGGAAATAG ATGTAAAAGACATAAACGACAATACGCCTTACTGCCTAAAACCCCG CTATCATATCTCCACTAATGAATCAATCTCGATTGGAACTACACTC GTTGAGGTCAAGGCGATTGACTTTGATTTTCAAAGCAAACTGCGC TTCTATCTTTCGGGCAAAGGTGCGGACGACTTCAGTATAGGAAAG GAAAGTGGCATCCTGAAGGTGGCAAGCGCACTGGATCGGGAGAC AACCCCCAAGTACAAATTGGTCGCACATGTACAGGATGGCAAGGA CTTTACGCAAGAGTGTTTCTCGGAAATAATCATCACGGTCAATGAC ATAAATGACAATATGCCCATTTTCTCAATGGCTCAATATAGAGTGA GTGTACCCGAGGATGCACAACTGAACACATTGATCACGAAAGTGC ACGCGATGGATAAGGATTTCGGGGTAAATAGACAAATCAAATACT CGCTAATGGGTGAAAACCATGATTATTTCAAAATATCAAAATCGAC TGGTATCATAAGGCTGCACAAAAGTCTCGATCGTGAAACAATTTCA TTGTTTAATCTCACTGTGAAGGCGGAGGACTGTGGCGTTCCAAAA CTACACTCCATTGCAACAGTTGCTGTGAACATATTGGACATTAATG ACAATCCACCCGAGTTCAGTATGCGTCAGTATTCGTGCAAAATTCT GGAAAACGCCACACACGGCACAGAAGTGTGCAAAGTTTATGCCAC TTCGATAGATATTGGGGTAAATGCGGATATTCACTACTTCATAATG AGTGGCAACGAGCAGGGGAAGTTCAAAATGGATTCCACGACGGG CGACTTGGTGCTAAATGCAACCTTGGACTATGAAATGTCCAAGTTT TACTTCTTGACCATTCAAGCAATCGATGGCGGCACTCCACCGCTT AGCAACAATGCATATGTGAACATCTCTATTCTGGACATTAATGACA ACAGTCCCACGTTTCTGCAAAACCTGTACCGCATTAATGTCAATGA AGATATTTTCGTGGGCTCCAAGATTCTGGACGTCAAAGCCACGGA CGAAGATTCAGATGTAAATGGTCTTGTAACTTACAACATTGAAAGA GGCGACAATATAGGCCAGTTTTCAATAGATCCGAAAAACGGAACA ATTAGCGTTTCGAGGCCATTAGATCGTGAGACTATTTCGCACTACA CTCTTGAAATTCAAGCCTGTGATCAGGGAGATCCTCAGAGATGCA ACAGTGTTCCAATCAATATAAACATTTTGGACACTAACGATAATGC ACCCATATTTTCCAGCTCTAACTACAGTGTAGTACTTCAAGAAAAC CGACTTCTGGGCTATGTATTCCTTACCTTCAAGATATCAGACGCAG ACGAAACACCCAATACCACGCCATACACCTTCGATATTAGGTCTG GAAATGAGGGTGGGCTTTTCCGGCTGGAGCAAGATGGTTCCTTGA GAACGGCCTCGCGATTTAATCACAATCTGCAGGACGAATTCGTGA TTCAAGTTCGAGTTTTCGACAACGGCACACCTCCATTATATTCCGA TGCCTGGGTGGTTGTGAAAATAATTGAAGAAAGCCAATACCCGCC CATTGTCACACCCCTAGAAGTAACCATAAATTCATTCGAGGACGAT TTTTCGGGCGCATTCATTGGCAAAGTTCATGCCTCGGATCAGGAC AAGTATGATGAATTGAACTTTAGTTTGGTGTCCGGTCCCGATGACA TGTATCAGAGCTCGAAGCTGTTCAACATTTCCAACAACACGGGAA AGATCTATGCCATATCCAACCTGGATATTGGTCTGTACAAGCTAAA TGTGTCCGTTTCGGATGGTAAATTTCATGTGTTCTCCATTGTCAAA ATCAACGTGGAACTGGTAACCAATGATATGCTAAAAGAGTCGGTT GTCATTCGATTCAGAAGGATTTCAGCATCTGAGTTTCTGCTGAGTC ACAGGAAAACCTTTATGCGCTCCATTCGCAATATAATGCGATGTCG CCAAAAGGATGTAATTCTCATCACCCTTCAATCGGATTATCAAAAA GCATCACAACATGCTGTGGGTAATCGACGAGCCAGGTCCATTGAC TCCGATTTGAACGTGGTGTTTGCAGTGCGAAAGCAGCAAATAATA CCCGATTCCGATGAATTCTTCACAAGTGATGAAATTCGGCAGACA CTGATAGACAAGAAGAACGAGATTGAAAACGAAACCAACCTGGTG GTGGAGGATGTACTACCATCCACCTGTCAAAGCAACAAAAACGAC TGCGTTCACGGGGAATGCAAACAGATATTACAGATCCTGAAGAAC AACGTTACCACCACCTTTACGGATGTGATTAGTTTTGCTGCTCCAT CTTACATTCCGGTGAATACGTGTGTCTGTCGACCAGGATTCGATG GAAAGCACTGCAAAGAGACTGTGAATGCCTGCTCCACGGATCCAT GTTCCCCGCAGAGGATCTGCATGCCGTCTGGCTCGGCTTTGGGT TACCAATGTGTGTGTCCCAAGGGATTTTCAGGAACCTACTGCGAG CGGAAGTCTTCGAAGTGCAGCAATGAGTCCTGTGACATGGGTCTA TTCACTGCGGTGTCCTTTGGCGGAAAGAGCTATGCCCACTACAAG ATCAACAAGGTGAAGGCGAAGTTCACGCTGGAAAACGGGTTTTCC TACTCCCTGCAGATAAGAACTGTGCAACAAACTGGGACTCTGCTG TATGCCAGCGGCAAGGTGGACTACAACATCCTGGAGATCATAAAC GGAGCTGTTCAGTACAGATTCGATTTGGGCTCGGGCGAGGGAGT CATCAGTGTGTCCAGCATTAACATCTCTGACGGCGAGTGGCATCA AATCAGCCTAGAGCGGTCCCTCAATAGTGCCAAAGTGATGGTGGA CAACAAGCACGTCTCCCATGGCAGTGCTCCGGGTGTGAATGGCA TCCTGAACATCCAGTCGAACGATATCTTTGTAGGCGCCGAGGTTC GTCCGCATCCATCGATAATTGGCTACGAGGATATTCAGCGTGGCT TCATCGGTTGCATGGCAAACATCAAAATAGCCAAAGAGTCGCTGC CATTGTACATTTCCGGTGGGAGTACCATTGCTGCCTTGAAACGTTT TACGAATGTCGAGTTCAAGTGCGATCCGTCGAATGTTCTGGTGCG CCTGGGCATTTGCGGATCTCAGCCGTGTGCCAATAGTGGAATCTG CAAGGAACTCGATACGGACGTGTTTGAATGCGCCTGTCAGCCCC GATATTCCGGCAAGCATTGCGAGATTGATTTGGACCCTTGCTCAT CGGGACCCTGCTTGTTTGGCGGCAGGTGCGACTACCACGGACCG AACAACTACAGCTGCACGTGTCCCATCCACTTATCCGGAAAGAGG TGTGAGTACGGCAAGTTCTGCACGCCGAACCCGTGCAAAAACGG TGGCATTTGCGAGGAAGGCGATGGAATATCGCACTGCATGTGCC GCGGCTACACGGGACCCACTTGTGAGATCGATGTGGATGAGTGC GAGAACCAGCCGTGCGGCAATGGAGCGACCTGCATCAATGAACC CGGAAGTTTCCGTTGCATTTGTCCATCTTATCTCACAGGAGCCAG CTGCGGCGATCCCCTGTATTCGAACTCTATTTCTACAAAGCTGAA GAACTTTTCTATAGAGCACATTAGCGGGATCATTTCCGGCGTGGC CGTGGTACTGGTCATCATCAGTTGTGTCCTGTGTTGCGTGGTGTT GAAGAGGAGTTCCTCTTCAAAGCGAAGGAACCGACTAGAAAAGGA CAAGAACAAGTCGTCGTACAAGGAGGCGAACTTGAACTCACTGGT GGACAAGGACAATTACTGCAAACCAAACGTAAAGTTGAGTAACTT GGAGGTTAACCAGCGTCCAATTAGCTACACAGCAGTTCCAAATGA CAACCTAGTCCTGAGCAATAGGAATTTTGTAAATAACTTAGACATC TTGCGTAGCTACGGTTCGGCCGGCGATGAACTGGAAAATGTGCC ATTCGAGTACCAGAAGGTTAATCGAAACAAACAGCATGTGAACATA AACTCCTGCCATTCAACCGATGCAGATAATGCCTACAAACAAGAAT GGTGCGAGCAAATGCATTTAAGAACCTTCAGTGAAAATAAACTGAA CAATGAACTTAAACGGGATTTCGGACCATCTGTGAGTCGCTTTTCA ACTGGGAAACTAATCCAAGTTGAAATGCCCAACGTGTGCCACTCT TCCAGTGCGAATTTCGTTGATTATTCAGCTCTTGCCAATGGTCAGT ATCATTGGGACTGTTCCGACTGGGTTCGCAAAAGCCATAATCCCT TGCCAGATATAACCGAAGTTCCTGGAGCAGAAATAGCTGATTCGT CGAGCTTACACAGCAACGATAGCAACGAGTCCAAGTCGAAGAAAG CCTTTTTCGTGCACAGGGAAGACGGAGATGTTGATCCGACGAGG GATATAGCCGCGTTGAATGAGGATATCGGATCGGAGTATTTGGAC TCGGAGGCAGAGAGCTGCTTGGAGCCGTTTATGTTGCCAAGATCA AGTAATCAGCCACTTTCAAGACTGAGTTCTTTTAATAATATCGAGA ATGAAGACTATAAATCAAATACAGGCAAAGTATATTTAAGACATCC TGATTCGTATTTACCGACGATGCATTTTCCAAGTGAGACCGATGG GGAAAGCTCTATGACCGAGGGGCCGATTTCTAGGATGGAAATAAA AACCAGGAGGACGATAAGTGAAAATTCAGAGGAGGCATACCTATT TCCATGCACTGTCGGAGAAATTGGATCCAACAGCAACATTTCGGT TCGACTGTGTGAAATTGAAGATTCTGAGTTGGAGGAGTTTTTACCA CAACAACAAACAAACAATTAA (SEQ ID NO: 13) PCS (Saccharomyces cerevisiae) CTACAACTTACTCTTATTTCTGCTGCTCTTAGCAAAAGTT TCTGCGATAACTCTTCTCTGGATTTTACCTGTAGCGGTTTTTGGTAG CTTATCAACAAAGTACACCTTGGTTGGAATTTTGAAAGAGGCTAGG TGCTTCTTTAAGAAGTTCACCAGTTCTTCGTAGGTCATTTTTTCTCC CTTCTTCAAAACAATGGCGGCTTGAACTACTTGGCCGTACATATCG TCGGGAACACCAAATGCAACGGCTTCATCGATCTTTGGATGCGATA GCATAATGCCGTCGAGCTCAATGGGTGAAATCTTTTCACCACCCCT GTTGATAAGCTCTTTGATTCTGCCTGTAAGGACCAAAAACCCCTCA GGGTCGAAATAACCTTGGTCACCGGTTCTGAAATAGTTCTCTCTCT TGGTGAAGTTCTCCTTGTTAGCTTTTGGATTATTAGCATACCCCAAA GTGACGTTTTCGCCTCTGATGGAAACTTCGCCGACTTTGCCCGGG GGCAAGACATTGTCATTGTCATCTAGAATGACGACGGTGACTCCTT GTGGCTGGCCCACAGTACCAGGCTTTCTCTTTCCTGGAGGCAGAT TGTTTGAGGTCATTTGATGTGATGCTTCGGTCATCGCATAGGCCTC CAAGACAGGTGCATTGAATTCCTTCTCCAGCTTATGGAACGTTGCT GGAGCCAAAGCAGAAGAACACGATCTGATGAATCTAATGTGTGGG AAAGGGTTTGGTTTGGGCATGTTCAGCATAATCATGCTTATTGTGG GAACGCAACTGAACCAATTACAGTTGTACTTAACAAATTGGTCCCA GAATAACTTTGGATGGAATCCATCGGGAACCACAACAGAACCCTGA GTTCTAAAAGTGGAAAGTAAAACACCAATTAACCCATGGACGTGGA AAAGAGGCATCACGACATAAGATCTGTCCAAGGGCGTTAGCTTGTA AGTGTTAGCAATGTTCAACGTGCTTCTCACAATGTTCAAATGTAACA AAGGCACCGTTTTTGGAGTGGAGGTGGTACCACTGGTATGCAAAA TCAGGGCAACGTCACTGGAACGGGCAAACCCAGGGAATTTAACGG GATTTGTGTTGACAAATTTGGCGTTGTTCAAAGACCGGTAAATAAC CCTTTTGTAGTTGTCCTCTGGAGAGTATATATCATACTCTACCCTAA ACCTGGTCGCATCGAAGGCCAGCTCTACGATAAAACATCCAAACG TGGAGGCAGATTTTAGAATTTCAGAACTCTGTAACTTTGTGGTACC CTTTGGGACGCAAATCGCCTTAGATTTCAGGTCATTCAAATAAAAAT TGAACTCCTTTTCCTTATAATTGGGATTCAAGGGCGCGCCAATTTTA GCGTCCATAGTAGCACCGAGGAAAGCGACGATAAATTCCAGCCCA TTACGCATGGATATCGCCACTGTATCTTGTCTGAAAACAGCTCCGT ACAATGGAGAATTAGGATTTGTGAACATGGTCTGGAAGTGACCCAC CATGTGGGATAGATCCCTGTAGGTCACCTGAGTGTCCGTTTCAGG AACAATAACGGCGACATTATCGGATACGCTAAAAGTATCGTTGAAC GAAGCAGTAACAGTAGCGGCACTTGTCAT (SEQ ID NO: 14) ACLY (Homo sapiens): GCGAGCCGATGGGGGCGGGGAAAAGTCCGGCTGGGC CGGGACAAAAGCCGGATCCCGGGAAGCTACCGGCTGCTGGGGT GCTCCGGATTTTGCGGGGTTCGTCGGGCCTGTGGAAGAAGCTGC CGCGCACGGACTTCGGCAGAGGTAGAGCAGGTCTCTCTGCAGCC ATGTCGGCCAAGGCAATTTCAGAGCAGACGGGCAAAGAACTCCTT TACAAGTTCATCTGTACCACCTCAGCCATCCAGAATCGGTTCAAGT ATGCTCGGGTCACTCCTGACACAGACTGGGCCCGCTTGCTGCAG GACCACCCCTGGCTGCTCAGCCAGAACTTGGTAGTCAAGCCAGA CCAGCTGATCAAACGTCGTGGAAAACTTGGTCTCGTTGGGGTCAA CCTCACTCTGGATGGGGTCAAGTCCTGGCTGAAGCCACGGCTGG GACAGGAAGCCACAGTTGGCAAGGCCACAGGCTTCCTCAAGAAC TTTCTGATCGAGCCCTTCGTCCCCCACAGTCAGGCTGAGGAGTTC TATGTCTGCATCTATGCCACCCGAGAAGGGGACTACGTCCTGTTC CACCACGAGGGGGGTGTGGACGTGGGTGATGTGGACGCCAAGG CCCAGAAGCTGCTTGTTGGCGTGGATGAGAAACTGAATCCTGAGG ACATCAAAAAACACCTGTTGGTCCACGCCCCTGAAGACAAGAAAG AAATTCTGGCCAGTTTTATCTCCGGCCTCTTCAATTTCTACGAGGA CTTGTACTTCACCTACCTCGAGATCAATCCCCTTGTAGTGACCAAA GATGGAGTCTATGTCCTTGACTTGGCGGCCAAGGTGGACGCCAC TGCCGACTACATCTGCAAAGTGAAGTGGGGTGACATCGAGTTCCC TCCCCCCTTCGGGCGGGAGGCATATCCAGAGGAAGCCTACATTG CAGACCTCGATGCCAAAAGTGGGGCAAGCCTGAAGCTGACCTTG CTGAACCCCAAAGGGAGGATCTGGACCATGGTGGCCGGGGGTG GCGCCTCTGTCGTGTACAGCGATACCATCTGTGATCTAGGGGGTG TCAACGAGCTGGCAAACTATGGGGAGTACTCAGGCGCCCCCAGC GAGCAGCAGACCTATGACTATGCCAAGACTATCCTCTCCCTCATG ACCCGAGAGAAGCACCCAGATGGCAAGATCCTCATCATTGGAGG CAGCATCGCAAACTTCACCAACGTGGCTGCCACGTTCAAGGGCAT CGTGAGAGCAATTCGAGATTACCAGGGCCCCCTGAAGGAGCACG AAGTCACAATCTTTGTCCGAAGAGGTGGCCCCAACTATCAGGAGG GCTTACGGGTGATGGGAGAAGTCGGGAAGACCACTGGGATCCCC ATCCATGTCTTTGGCACAGAGACTCACATGACGGCCATTGTGGGC ATGGCCCTGGGCCACCGGCCCATCCCCAACCAGCCACCCACAGC GGCCCACACTGCAAACTTCCTCCTCAACGCCAGCGGGAGCACAT CGACGCCAGCCCCCAGCAGGACAGCATCTTTTTCTGAGTCCAGG GCCGATGAGGTGGCGCCTGCAAAGAAGGCCAAGCCTGCCATGCC ACAAGATTCAGTCCCAAGTCCAAGATCCCTGCAAGGAAAGAGCAC CACCCTCTTCAGCCGCCACACCAAGGCCATTGTGTGGGGCATGC AGACCCGGGCCGTGCAAGGCATGCTGGACTTTGACTATGTCTGCT CCCGAGACGAGCCCTCAGTGGCTGCCATGGTCTACCCTTTCACTG GGGACCACAAGCAGAAGTTTTACTGGGGGCACAAAGAGATCCTG ATCCCTGTCTTCAAGAACATGGCTGATGCCATGAGGAAGCACCCG GAGGTAGATGTGCTCATCAACTTTGCCTCTCTCCGCTCTGCCTAT GACAGCACCATGGAGACCATGAACTATGCCCAGATCCGGACCATC GCCATCATAGCTGAAGGCATCCCTGAGGCCCTCACGAGAAAGCT GATCAAGAAGGCGGACCAGAAGGGAGTGACCATCATCGGACCTG CCACTGTTGGAGGCATCAAGCCTGGGTGCTTTAAGATTGGCAACA CAGGTGGGATGCTGGACAACATCCTGGCCTCCAAACTGTACCGC CCAGGCAGCGTGGCCTATGTCTCACGTTCCGGAGGCATGTCCAA CGAGCTCAACAATATCATCTCTCGGACCACGGATGGCGTCTATGA GGGCGTGGCCATTGGTGGGGACAGGTACCCGGGCTCCACATTCA TGGATCATGTGTTACGCTATCAGGACACTCCAGGAGTCAAAATGA TTGTGGTTCTTGGAGAGATTGGGGGCACTGAGGAATATAAGATTT GCCGGGGCATCAAGGAGGGCCGCCTCACTAAGCCCATCGTCTGC TGGTGCATCGGGACGTGTGCCACCATGTTCTCCTCTGAGGTCCAG TTTGGCCATGCTGGAGCTTGTGCCAACCAGGCTTCTGAAACTGCA GTAGCCAAGAACCAGGCTTTGAAGGAAGCAGGAGTGTTTGTGCC CCGGAGCTTTGATGAGCTTGGAGAGATCATCCAGTCTGTATACGA AGATCTCGTGGCCAATGGAGTCATTGTACCTGCCCAGGAGGTGC CGCCCCCAACCGTGCCCATGGACTACTCCTGGGCCAGGGAGCTT GGTTTGATCCGCAAACCTGCCTCGTTCATGACCAGCATCTGCGAT GAGCGAGGACAGGAGCTCATCTACGCGGGCATGCCCATCACTGA GGTCTTCAAGGAAGAGATGGGCATTGGCGGGGTCCTCGGCCTCC TCTGGTTCCAGAAAAGGTTGCCTAAGTACTCTTGCCAGTTCATTGA GATGTGTCTGATGGTGACAGCTGATCACGGGCCAGCCGTCTCTG GAGCCCACAACACCATCATTTGTGCGCGAGCTGGGAAAGACCTG GTCTCCAGCCTCACCTCGGGGCTGCTCACCATCGGGGATCGGTT TGGGGGTGCCTTGGATGCAGCAGCCAAGATGTTCAGTAAAGCCTT TGACAGTGGCATTATCCCCATGGAGTTTGTGAACAAGATGAAGAA GGAAGGGAAGCTGATCATGGGCATTGGTCACCGAGTGAAGTCGA TAAACAACCCAGACATGCGAGTGCAGATCCTCAAAGATTACGTCA GGCAGCACTTCCCTGCCACTCCTCTGCTCGATTATGCACTGGAAG TAGAGAAGATTACCACCTCGAAGAAGCCAAATCTTATCCTGAATGT AGATGGTCTCATCGGAGTCGCATTTGTAGACATGCTTAGAAACTG TGGGTCCTTTACTCGGGAGGAAGCTGATGAATATATTGACATTGG AGCCCTCAATGGCATCTTTGTGCTGGGAAGGAGTATGGGGTTCAT TGGACACTATCTTGATCAGAAGAGGCTGAAGCAGGGGCTGTATCG TCATCCGTGGGATGATATTTCATATGTTCTTCCGGAACACATGAGC ATGTAA (SEQ ID NO: 15) FAS (Mycobacterium bovid subsp.bovis): ATGAGTCAGACGGTGCGCGGTGTGATCGCACGACAAAA GGGCGAACCCGTTGAGCTGGTGAACATTGTCGTCCCGGATCCCG GACCCGGCGAGGCCGTGGTCGACGTCACCGCCTGCGGGGTATGC CATACCGACCTGACCTACCGCGAGGGCGGCATCAACGACGAATAC CCTTTTCTGCTCGGACACGAGGCCGCGGGCATCATCGAGGCCGTC GGGCCGGGTGTAACCGCAGTCGAGCCCGGCGACTTCGTGATCCT GAACTGGCGTGCCGTGTGCGGCCAGTGCCGGGCCTGCAAACGCG GACGGCCCCGCTACTGCTTCGACACCTTTAACGCCGAACAGAAGA TGACGCTGACCGACGGCACCGAGCTCACTGCGGCGTTGGGCATC GGGGCCTTTGCCGATAAGACGCTGGTGCACTCTGGCCAGTGCAC GAAGGTCGATCCGGCTGCCGATCCCGCGGTGGCCGGCCTGCTGG GTTGCGGGGTCATGGCCGGCCTGGGCGCCGCGATCAACACCGGC GGGGTAACCCGCGACGACACCGTCGCGGTGATCGGCTGCGGCGG CGTTGGCGATGCCGCGATCGCCGGTGCCGCGCTGGTCGGCGCCA AACGGATCATCGCGGTCGACACCGATGACACGAAGCTTGACTGGG CCCGCACCTTCGGCGCCACCCACACCGTCAACGCCCGCGAAGTC GACGTCGTCCAGGCCATCGGCGGCCTCACGGATGGATTCGGCGC GGACGTGGTGATCGACGCCGTCGGCCGACCGGAAACCTACCAGC AGGCCTTCTACGCCCGCGATCTCGCCGGAACCGTTGTGCTGGTGG GTGTTCCGACGCCCGACATGCGCCTGGACATGCCGCTGGTCGACT TCTTCTCTCACGGCGGTGCGCTGAAGTCGTCGTGGTACGGCGATT GCCTGCCCGAAAGCGACTTCCCCACGCTGATCGACCTTTACCTGC AGGGCCGGCTGCCGCTGCAGCGGTTCGTTTCCGAACGCATCGGG CTCGAAGACGTCGAGGAGGCGTTCCACAAGATGCATGGCGGCAA GGTATTGCGTTCGGTGGTGATGTTGTGA (SEQ ID NO: 16) AMPK (Homo sapiens): AGTTCCTGGAGAAAGATGGCGACAGCCGAGAAGCAGAA ACACGACGGGCGGGTGAAGATCGGCCACTACATTCTGGGTGACAC GCTGGGGGTCGGCACCTTCGGCAAAGTGAAGGTTGGCAAACATGA ATTGACTGGGCATAAAGTAGCTGTGAAGATACTCAATCGACAGAAG ATTCGGAGCCTTGATGTGGTAGGAAAAATCCGCAGAGAAATTCAGA ACCTCAAGCTTTTCAGGCATCCTCATATAATTAAACTGCACCAGGT CATCAGTACACCATCTGATATTTTCATGGTGATGGAATATGTCTCAG GAGGAGAGCTATTTGATTATATCTGTAAGAATGGAAGGAAATCTGA TGTACCTGGAGTAGTAAAAACAGGCTCCACGAAGGAGCTGGATGA AAAAGAAAGTCGGCGTCTGTTCCAACAGATCCTTTCTGGTGTGGAT TATTGTCACAGGCATATGGTGGTCCATAGAGATTTGAAACCTGAAA ATGTCCTGCTTGATGCACACATGAATGCAAAGATAGCTGATTTTGG TCTTTCAAACATGATGTCAGATGGTGAATTTTTAAGAACAAGTTGTG GCTCACCCAACTATGCTGCACCAGAAGTAATTTCAGGAAGATTGTA TGCAGGCCCAGAGGTAGATATATGGAGCAGTGGGGTTATTCTCTA TGCTTTATTATGTGGAACCCTTCCATTTGATGATGACCATGTGCCAA CTCTTTTTAAGAAGATATGTGATGGGATCTTCTATACCCCTCAATAT TTAAATCCTTCTGTGATTAGCCTTTTGAAACATATGCTGCAGGTGGA TCCCATGAAGAGGGCCACAATCAAAGATATCAGGGAACATGAATG GTTTAAACAGGACCTTCCAAAATATCTCTTTCCTGAGGATCCATCAT ATAGTTCAACCATGATTGATGATGAAGCCTTAAAAGAAGTATGTGA AAAGTTTGAGTGCTCAGAAGAGGAAGTTCTCAGCTGTCTTTACAAC AGAAATCACCAGGATCCTTTGGCAGTTGCCTACCATCTCATAATAG ATAACAGGAGAATAATGAATGAAGCCAAAGATTTCTATTTGGCGAC AAGCCCACCTGATTCTTTTCTTGATGATCATCACCTGACTCGGCCC CATCCTGAAAGAGTACCATTCTTGGTTGCTGAAACACCAAGGGCAC GCCATACCCTTGATGAATTAAATCCACAGAAATCCAAACACCAAGG TGTAAGGAAAGCAAAATGGCATTTAGGAATTAGAAGTCAAAGTCGA CCAAATGATATTATGGCAGAAGTATGTAGAGCAATCAAACAATTGG ATTATGAATGGAAGGTTGTAAACCCATATTATTTGCGTGTACGAAG GAAGAATCCTGTGACAAGCACTTACTCCAAAATGAGTCTACAGTTA TACCAAGTGGATAGTAGAACTTATCTACTGGATTTCCGTAGTATTGA TGATGAAATTACAGAAGCCAAATCAGGGACTGCTACTCCACAGAGA TCGGGATCAGTTAGCAACTATCGATCTTGCCAAAGGAGTGATTCAG ATGCTGAGGCTCAAGGAAAATCCTCAGAAGTTTCTCTTACCTCATC TGTGACCTCACTTGACTCTTCTCCTGTTGACCTAACTCCAAGACCT GGAAGTCACACAATAGAATTTTTTGAGATGTGTGCAAATCTAATTAA AATTCTTGCACAATAA (SEQ ID NO: 17)

[0146] O vetor foi transformado em cepa Po1g Yarrowia lipolytica e selecionado em placas agar deficientes de leucina. As colônias foram classificadas para o inserto correto no genoma usando-se PCR. Δ9-FW AATGGTGAAAAACGTGGACCAAGTGGA (SEQ ID NO: 18) Δ9-REV ATGGATCCCTAAGCAGCCATGCCAGACATAC (SEQ ID NO: 19) GLUT1-FW AATGGAGCCCAGCAGCAAGAAGGTGA (SEQ ID NO: 20) GLUT1-REV AATGGGTACCTCACACTTGGGAGTCAGCC (SEQ ID NO: 21) Hemoglobina FW AGAGACCGGGTTGGCGGCGCA (SEQ ID NO: 22) Hemoglobina REV CAGCGTCTTGAGCGTACAAA (SEQ ID NO: 23) Citocromo FW A ATGATCATCAACGGCAAGGTCT (SEQ ID NO: 24) Citocromo REV TTATTTCTGACCCTGGAGGTAGAAG (SEQ ID NO: 25) Piruvato carboxilase FW AATGCTGAAGTTCCGAACAGT (SEQ ID NO: 26) Piruvato carboxilase VER CGATGGTACCTCACTCGATCT- CCAGGATG (SEQ ID NO: 27)

[0147] A colônia resultante foi crescida em meio YPD (meio total: extrato de levedura, peptona, dextrose) e meio YNB (meio mínimo, contendo todos os nutrientes, mas nenhum amino ácido, e nenhum nitrogênio ou fonte de carbono). Quando crescido em meio YNB foi usado, o nitrogênio foi proporcionado como sulfato de amônia e carbono foi proporcionado como glicose a uma proporção de Carbono para Nitrogênio de 150. Esta proporção de C/N é necessária para disparar acúmulo de óleo. Após depleção do excesso de nitrogênio, o açúcar é canalizado para acúmulo de óleo na levedura.

[0148] Coleta de Óleo: As células foram crescidas em meio de crescimento restrito á nitrogênio. Após 72 horas, as células são coletadas e secadas a 60°C por 2 dias. As células foram diretamente tratadas com ácido sulfúrico 1% e metanol por 24 horas a 90°C. O óleo foi convertido a FAME (ácido graxo metil ésteres) e extraído por hexano. A extração de hexano é repetida duas vezes para recuperar 95% de FAME. A fração de hexano é evaporada e re-suspenda em 5 ml de hexano. 10 μl da fração é injetado em GC-MS para quantificar FAME.

[0149] As culturas de célula foram coletadas e preparadas para análise de ácido graxo, conforme descrito anteriormente (Voelker and Davies, 1994). O teor de ácido graxo de cada amostra foi quantificado por GC-MS usando-se um quádruplo simples de MS com uma fonte de ionização de impacto de elétron. A coluna GC foi uma HP-5 MS de 30 m de comprimento (5% de fenil)-metilpolisiloxano com um ID de 0,25 mm e uma espessura de película de 25 μm. As condições de eluição de GC foram conforme segue: 100°C como a temperatura de partida (5 min), uma rampa de 15 min a 250°C, mantida a 250°C por 10 min.

EXEMPLO 1

[0150] Um perfil qualitativo de grupo de ácido graxo livre total (FFA) foi sondado em cultura de lipolytica crescida nas fases de crescimento de log e estacionárias usando-se GC-MS (Figura 1 A-C). O maior grupo de FFA é compreendido de ácidos palmítico e esteárico saturados e ácido oleico insaturado. Uma comparação dos perfis de FFA nas duas fases de crescimento revelou ausência de ácido oleico na fase estacionária, enquanto que intensidades de pico similares de ácido esteárico e ácido oleico foram observadas na fase de log (Fig.1 A, B). A análise dos lipídios totais (FFA + lipídios) durante a fase estacionária recuperou quantidade parcial do ácido oleico, sugerindo que ácido oleico está sendo direcionado para a formação de TAG (Fig. 1C). O grupo remanescente de ácido oleico é utilizado para ácidos graxos poli- insaturados à jusante e, portanto, não pode ser resgatado. Portanto, ácido oleico é canalizado para a formação de TAG em um modo temporal durante fase de crescimento estacionária que coincide com a regulação de ativação de trajetória de armazenagem de TAG intracelular. Isto sugere que um mecanismo de ponto de verificação pode existir para monitorar os níveis de ácido oleico para regular o acúmulo de óleo.

EXEMPLO 2

[0151] Desde que em SCD de camundongo é essencial para lipogênese (ver, por exemplo, Regulation of estearoila-CoA desaturases and role in metabolism. Prog Lipide Res. 2004 Mar;43(2):91-104) e é reportado ser importante para a síntese de ácidos graxos insaturados em muitos organismos, foi testado o papel de Y. lipolytica SCD como uma etapa de limitação de taxa em acúmulo de TAG. A análise de sequência de proteína de gene de Saccharomyces cerevisiae OLE1 que codifica SCD contra sequências de proteína de Y. lipolytica revelou uma proteína com 51% de identidade. O Y. lipolytica desaturase contém três caixas de histidina e um domínio de citocromo b5 típico para outras estearoila-CoA desaturases. Desde que as enzimas desaturase são altamente reguladas no nível de transcrição de gene (ver, por exemplo, Regulation of estearoila-CoA desaturase by fatty acids poli-insaturated and cholesterol. James M. Ntambi. Journal of Lipide Research, Vol. 40, 1549-1558, September 1999) e durante a fase de log e fase estacionária de crescimento de célula (ver Mol Cell Biol Res Commun. 1999 Apr;1(1):36-43), foi modulada a expressão de gene nativa de Y. lipolytica desaturase com um promotor quase-constitutivo. Uma cópia simples do gene modificado foi estavelmente integrada no genoma. O perfil de GC-MS entre a cepa mutante e tipo selvagem mostrou um aumento significante na proporção entre ácidos graxos insaturados para ácidos graxos saturados (Fig. 2 A, B). A microscopia confocal de lipídios intracelulares manchados com Nile vermelho mostrou uma correlação entre ácidos graxos insaturados elevados e excesso de acúmulo de TAG (Fig. 2C: tipo selvagem, Fig. 2D:SCD sobre-expressor). Em muitos casos, o volume total da célula das células sobre-expessoras de SCD é completamente preenchido com TAG (Fig. 2D). Estas descobertas proporcionam evidência de um gene regulador chave que surpreendentemente é suficiente para induzir super-acúmulo de TAG intracelular por alteração da proporção de ácidos graxos insaturados para ácidos graxos saturados.

[0152] A imagem confocal das células de crescimento e estacionárias revelou uma diferença colidente no padrão de acúmulo de óleo. foi testada a mobilidade de TAG intracelular de células mutantes ricas em óleo de fase estacionária após re-entrada em ciclo de célula mitótico. Foram alimentadas por batelada células de fase estacionária com meio mínimo contendo concentração mais alta de açúcares (300 g/l). As células eficientemente re-entraram na fase log e seguiram crescimento rápido e produção de biomassa consumindo todos os açúcares dentro de 96 horas. Interessantemente, a análise da imagem mostrou óleo extracelular com excesso de acúmulo de cepa mutante mesmo durante a fase de log, que é atípico para levedura oleaginosa. Embora as células tipo selvagem fossem incapazes de crescerem em alta concentração de açúcar, a produção contínua de óleo e corpos similares à levedura estavam ausentes na frase de log mesmo em concentrações de açúcar favoráveis ao crescimento.

[0153] Tomados juntos, estes resultados estabelecem um processo alimentado por batelada contínuo usando-se altas concentrações de açúcar, e sugerem que a cepa de levedura projetada é capaz de acumular óleo continuamente durante a fase de log e a fase de crescimento estacionária.

EXAMPLE 3

[0154] Dois tipos de levedura mutante foram gerados, que sobre expressam os seguintes genes: Mutante 1: SCD, Hemoglobina, Glut1, Citocromo; Mutante 2: Hemoglobina, Glut1, Citocromo. Os respectivos genes foram clonados em plasmídeo YLEX entre locais PmlI e Kpn. O vetor foi transformado em cepa Po1g Yarrowia lipolytica e selecionado em placas agar deficientes de Leucina. As colônias foram classificadas para o inserto correto no genoma usando-se PCR. A colônia resultante foi crescida em meio YPD e meio YNB com uma proporção de carbono para nitrogênio (C/N) de 150. Esta proporção de C/N é necessária para disparar acúmulo de óleo. Após depleção de excesso de nitrogênio, o açúcar é canalizado para acúmulo de óleo na levedura.

[0155] De modo a medir o acúmulo de óleo máximo, as células foram crescidas em meio de crescimento restrito de nitrogênio. Após 72 horas, as células foram coletadas e secadas a 60°C por 2 dias. As células foram diretamente tratadas com ácido sulfúrico 1% e metanol por 24 horas a 90°C. O óleo foi convertido a FAME (ácido graxo metil ésteres) e extraído por hexano. A extração de hexano foi repetida duas vezes para recuperar 95% de FAME. A fração de hexano foi evaporada e re-suspenda em 5 ml de hexano. 10 μl da fração foi injetado em GC- MS para quantificar FAME. O acúmulo de óleo máximo nas cepas mutantes foi 80 gramas/l.

[0156] As cinéticas de entrada de glicose do mutante 1 ("D9") e levedura tipo selvagem ("LS") foram comparadas. A Figura 3 mostra que o mutante 1 consumiu todo o açúcar proporcionado após 72 horas, pelo que a levedura tipo selvagem somente consumiu cerca de 70% do açúcar proporcionado. Foi observado que cepas tipo selvagem não consomem todos os açúcares mesmo em período de tempo estendido.

[0157] Foi, em seguida, determinado se as cepas mutantes podem usar hidrolisatos de biomassa como uma fonte de carbono. Um biorreator de 2 L foi ajustado contendo hidrolisatos de palha de milho (Hz) na presença de 1% de extrato de levedura. O Hz contém 20 gramas de glicose. Foram adicionados (alimentado por batelada) 180 g de glicose a conc. final de 200 g/l. Foi determinado que o tipo selvagem não pode crescer na biomassa tóxica Hz. As células do mutante 1 e mutante 2 foram crescidas em frasco oscilante a um OD final de 3 em 50 ml. A cultura durante a noite foi adicionada ao respectivo biorreator e fermentação foi efetuada por 72 horas a 30°C. Os dois reatores, um com mutante 1 e o outro com mutante 2, foram operados sob condições idênticas. A agitação foi 800 rpm e o pH foi ajustado para 5,5.

[0158] Ambas as cepas consumiram em torno de 50% da glicose suprida em 72 horas devido a limitação de alguns fatores de nutriente no meio (Figura 4A, mostrando cepa de mutante 1). A razão para 50% de consumo de açúcar em ambas as cepas é devido a presença de Glut1 que é conhecida por transportar glicose na célula. O mutante 1 consumiu 123 gramas de glicose, pelo que o mutante 2 consumiu 105 gramas de açúcar. Este resultado mostra que as células mutantes podem consumir quase 50% dos açúcares, e resistirem à toxicidade do Hz muito bem comparada ao tipo selvagem, que não cresce bem e consome menos do que 10 gramas de açúcares nos experimentos anteriores. As cepas mutantes mostraram crescimento robusto e bom consumo de açúcares. Os açúcares restantes não foram consumidos devido a alguma privação de fatores de nutriente (ver, Figura 5 e 6).

[0159] O mutante 1 (com combinação de genes sobre-expressos) revelou síntese de óleo aumentada, conforme comparado ao mutante 2. O mutante 1 produziu 26 gramas de óleo por litro (Figura 4B), e o mutante 2 produziu 14 gramas de óleo por litro. Isto sugere que a sobre- expressão de uma combinação de genes não somente resulta no consumo aumentado de açúcares supridos, mas também na produção aumentada de mais óleo, um precursor de biocombustível útil.

EXEMPLO 4

[0160] Foi, em seguida, medida a vantagem de crescimento, produção total de lipídio, eficiência de conversão de substrato de carboidrato para lipídio, e tolerância de substrato entre a cepa projetada e a cepa tipo selvagem em um vaso fermentador de 2 litros.

[0161] A quantidade total de lipídio foi medida usando-se GC-MS (Figura 7). Uma produção de lipídio mais alta de 10 vezes (80 g/l) foi observada na cepa projetada, conforme comparado à cepa tipo selvagem, representando um aumento de 20 vezes sobre a cepa Yarrowia lipolytica descrita por outros (S. Papanikolaou I. Chevalot, M. Komaitis, I. Marc G. Aggelis, Single cell oil production by Yarrowia lipolytica growing on an industrial derivative of animal fat in batch cultures Appl Microbiol Biotechnol. 2002 Mar;58(3):308-12.). A espécie dominante de ácido graxo mono-insaturado foi ácido oleico que aumentou 8,5 vezes (g/l), conforme comparado à cepa de controle (Figura 8). A proporção de ácido graxo total insaturado para saturado foi significantemente aumentada, os ácidos graxos insaturados totais não são aumentados sobre os ácidos graxos saturados; contudo, poucos deles estão no caso de c18.1 (ver Figuras 7 e 8). A eficiência de conversão de açúcar em óleo da cepa mutante foi determinada para ser 0,28 g/g, se aproximando perto dos valores teóricos quando se leva em consideração o açúcar utilizado para produção de biomassa.

[0162] Uma vantagem de crescimento notável e inesperada de 32 vezes foi observada entre a cepa projetada e a cepa tipo selvagem (Fig. 9). A característica de crescimento da cepa mutante permanece a mesma em concentrações de açúcar que foram osmóticas-letais à cepa tipo selvagem (Fig. 10). A tolerância á açúcar mais alta é particularmente importante para alta fermentação de gravidade comumente empregada em produção industrial de biocombustível. Previamente, uma correlação inversa foi observada entre produção mais alta de biomassa e acúmulo de lipídio em cultura de Yarrowia lipolytica (Papanikolaou S, Chevalot I, Komaitis M, Marc I, Aggelis G. Single cell oil production by Yarrowia lipolytica growing on an industrial derivative of animal fat in batch cultures. Appl Microbiol Biotechnol. 2002 Mar;58(3):308-12.). Portanto, a ligação entre produção mais alta de biomassa e acúmulo de lipídio em excesso em nossa cepa projetada foi inesperada. Desde que armazenagem de gordura é principalmente usada para síntese de membrana e atividades de brotamento (FEBS J. 2008 Nov;275(22):5552-63), uma possibilidade das células na fase de log re-direcionarem o fluxo de lipídio em excesso em direção a síntese de membrana, via ativação de trajetória de divisão de célula e/ou secreção de lipídio a meio extra-celular. Isto compensaria a produção em excesso de lipídio anteriormente no seguido acúmulo intracelular de lipídios após entrada à fase estacionária de ciclo de célula. De fato, a produção de biomassa mais alta foi acoplada a secreção de lipídio durante fase de crescimento precoce.

[0163] A Figura 11 mostra as cinéticas de crescimento e de produção de lipídio de Y. lipolytica mutante e tipo selvagem. Não somente a cepa mutante exibe uma forte vantagem de crescimento, mas ela também produz uma quantidade de ácidos graxos significantemente mais alta, conforme comparado à cepa tipo selvagem (controle).

[0164] Tomados juntos, estes resultados demonstram projeto metabólico eficiente de levedura oleaginosa para exibir fenótipos múltiplos altamente desejáveis na glicose como uma única fonte de carbono.

EXEMPLO 5

[0165] O mecanismo regulatório de SCD que realça os traços fenotípicos diversos da cepa mutante foi sondado. Dada a baixa identidade de sequência de Yarrowia lipolytica gene desaturase à genes funcionais similares no nematóide Caenorhabditis elegans e camundongo, a espécie cruzada clonada SCD para especificidade de ácido graxo em Yarrowia lipolytica foi testada. O SCD em C. elegans e camundongo tem especificidade similar em direção a ácido esteárico, mostrou produção mais alta de biomassa, similar a mutantes que sobre- expressam gene nativo de Yarrowia. A imagem confocal confirmou excesso de acúmulo de óleo durante a fase de crescimento estacionária. Estes resultados sugerem que a atividade de desaturase em direção a síntese de ácido oleico está ligada ao super-acúmulo de TAG. Desde que SCD em levedura é conhecida ser regulada no nível transcricional e pós- transcricional (ver Tabor DE, Kim JB, Spiegelman BM, Edwards PA, Identification of conserved cis-elements and transcription factors required for sterol-regulated transcription of estearoila-CoA desaturase. J Biol Chem. 1999 Jul 16;274(29):20603-10; Shimano H, Sterol regulatory element-binding protein family as global regulators of lipide synthetic genes in energy metabolism. Vitam Horm. 2002;65:167-94), a inibição de realimentação de ácido oleico no gene desaturase foi investigada como um nicho regulatório possível. Foi integrada estavelmente uma cópia simples de um gene nativo desaturase com uma sequência de 1kb à montante incluindo a região promotora. A cepa mutante acumula óleo excessivo e tem vantagem de crescimento e tolerância á açúcar como com o mutante anterior. Isto mostra que, diferente da levedura de padeiro, o acúmulo de óleo não é modulado com sequências promotoras que acionam expressão de desaturase. Isto significa que a regulação negativa de gene desaturase em Yarrowia é transcricional independente e possivelmente ocorre no nível metabólito. Este dado proporciona a primeira introvisão mecanística de regulação de óleo, via excesso dos efeitos inibitórios de ácido oleico na levedura oleaginosa.

EXEMPLO 6

[0166] Micróbios projetados aqui proporcionados podem ser crescidos em vários substratos. A Figura 13 mostra crescimento robusto de uma cepa mutante de Y. lipolytica em biomassa de alga como a fonte de carboidrato. A Figura 14 mostra acúmulo de óleo em células microbiais projetadas crescidas na biomassa de alga. A Figura 15 mostra acúmulo de óleo em células projetadas crescidas no glicerol bruto.

EXEMPLO 7

[0167] Delta-12 desaturase é responsável pela conversão de ácido oleico contendo lipídios a lipídios de cadeia mais alta. Para a proposta de produção de biocombustíveis, ácidos graxos de cadeia C18 tais como ácidos esteárico e ácido são preferidos em vista das propriedades de fluxo frio de combustível diesel. É, portanto, desejável, em algumas concretizações, bloquear ou inibir a conversão de C18 ácidos graxos a ácidos graxos de cadeia mais longa.

[0168] Isto pode ser alcançado pela inibição ou bloqueio da expressão do gene tipo selvagem delta-12 desaturase no micróbio hospedeiro, por exemplo, um micróbio sobre-expressando uma Δ9 desaturase (SCD). Para esta finalidade, um construto de ácido nucleico foi gerado para knock out delta-12 desaturase tipo selvagem em Yarrowia lipolytica. Uma estrutura esquemática do construto de knockout é mostrada na Figura 16. O vetor compreende sequências genômicas do gene delta-12 desaturase que flanqueia um gene de resistência à fleomicin (por exemplo, ZeocinTM). A sequência do construto é mostrada abaixo.

[0169] Sequência de vetor knockout delta-12 desaturase: CCAACAGACCGACCATAGAAATGGATTCGACCACGCAG ACCAACACCGGCACCGGCAAGGTGGCCGTGCAGCCCCCCACGG CCTTCATTAAGCCCATTGAGAAGGTGTCCGAGCCCGTCTACGACA CCTTTGGCAACGAGTTCACTCCTCCAGACTACTCTATCAAGGATAT TCTGGATGCCATTCCCCAGGAGTGCTACAAGCGGTCCTACGTTAA GTCCTACTCGTACGTGGCCCGAGACTGCTTCTTTATCGCCGTTTTT GCCTACATGGCCTACGCGTACCTGCCTCTTATTCCCTCGGCTTCC GGCCGAGCTGTGGCCTGGGCCATGTACTCCATTGTCCAGGGTCT GTTTGGCACCGGTCTGTGGGTTCTTGCCCACGAGTGTGGCCACT CTGCTTTCTCCGACTCTAACACCGAGAGACCGGGTTGGCGGCGC ATTTGTGTCCCAAAAAACAGCCCCAATTGCCCCAATTGACCCCAAA TTGACCCAGTAGCGGGCCCAACCCCGGCGAGAGCCCCCTTCACC CCACATATCAAACCTCCCCCGGTTCCCACACTTGCCGTTAAGGGC GTAGGGTACTGCAGTCTGGAATCTACGCTTGTTCAGACTTTGTACT AGTTTCTTTGTCTGGCCATCCGGGTAACCCATGCCGGACGCAAAA TAGACTACTGAAAATTTTTTTGCTTTGTGGTTGGGACTTTAGCCAA GGGTATAAAAGACCACCGTCCCCGAATTACCTTTCCTCTTCTTTTC TCTCTCTCCTTGTCAACTCACACCCGAAATCGTTAAGCATTTCCTT CTGAGTATAAGAATCATTCAAAATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTT CCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCT GGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGAC TTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGC GGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGT GGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGT CGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCG AGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGA CCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACT GATCCATGGCCTGTCCCCACGTTGCCGGTCTTGCCTCCTACTACC TGTCCATCAATGACGAGGTTCTCACCCCTGCCCAGGTCGAGGCTC TTATTACTGAGTCCAACACCGGTGTTCTTCCCACCACCAACCTCAA GGGCTCTCCCAACGCTGTTGCCTACAACGGTGTTGGCATTTAGGC AATTAACAGATAGTTTGCCGGTGATAATTCTCTTAACCTCCCACAC TCCTTTGACATAACGATTTATGTAACGAAACTGAAATTTGACCAGA TATTGTTGTAAATAGAAAATCTGGCTTGTAGGTGGCAAAATGCGGC GTCTTTGTTCATCAATTCCCTCTGTGACTACTCGTCATCCCTTTAT GTTCGACTGTCGTATTTCTTATTTTCCATACATATGCAAGTGAGAT GCCCGTGTCCTGGCCATCACCTACCTGCAGCACACCGACCCCAC TCTGCCCCACTACCACGCCGACCAGTGGAACTTCACCCGAGGAG CCGCCGCCACCATCGACCGAGAGTTTGGCTTCATCGGCTCCTTCT GCTTCCATGACATCATCGAGACCCACGTTCTGCACCACTACGTGT CTCGAATTCCCTTCTACAACGCCCGAATCGCCACTGAGAAGATCA AGAAGGTCATGGGCAAGCACTACCGACACGACGACACCAACTTCA TCAAGTCTCTTTACACTGTCGCCCGAACCTGCCAGTTTGTTGAAG GTAAGGAAGGCATTCAGATGTTTAGAAACGTCAATGGAGTCGGAG TTGCTCCTGACGGCCTGCCTTCTAAAAAGTAGAGCTAGAAATGTTA TTTGATTGTGTTTTAACTGAACAGCA (SEQ ID NO: 28)

[0170] Uma série de genes incluindo Δ9 desaturase, Glut1, hemoglobina e citocromo b5, foi sobre-expressa em células knockout delta-12 desaturase de Yarrowia lipolytica para adicionalmente aumentar o fluxo de açúcar na célula e aumentar o teor de óleo. Um aumento marcado no tamanho das células foi observado com até 95% por volume de células preenchidas com óleo.

EXEMPLO 8

[0171] Yarrowia lipolytica sobre-expressando SCD foi crescida em solução de ácido acético 3% por 148 horas (Figura 17). As culturas de célula foram contatadas com 2% de glicerol a cerca de 84 horas para proporcionar glicerol para acionar produção de ácido graxo. O último é o gargalo na produção de óleo usando-se acetato como estoque de alimentação. Um aumento marcado na produção de óleo foi observado por microscopia a laser confocal usando-se um contato de glicerol no meio de acetato mostrando um novo processo para eficientemente produzir óleos com melhores fatores econômicos.

[0172] Enquanto que várias concretizações da presente invenção foram descritas e ilustradas aqui, aqueles técnicos no assunto prontamente visualizarão uma variedade de outros meios e/ou estruturas para realizar as funções e/ou obtenção dos resultados e/ou uma ou mais das vantagens aqui descritas, e cada uma de tais variações e/ou modificações é pretendida estar dentro do escopo da presente invenção. Mais geralmente, aqueles técnicos no assunto apreciarão prontamente que todos os parâmetros, dimensões, materiais e configurações aqui descritos são significativos serem exemplares e que os parâmetros reais, dimensões, materiais, e/ou configurações dependerão da aplicação específica ou aplicações para qual os ensinamentos da presente invenção é/são usados. Aqueles técnicos no assunto reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando-se não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às concretizações específicas da invenção aqui descrita. É, portanto, para ser compreendido que as concretizações precedentes são apresentadas por meio de exemplo somente, e que, dentro do escopo das reivindicações em anexo e equivalentes destas, a invenção pode ser praticada, de outro modo, do que conforme especificamente descrita e reivindicada. A presente invenção é direcionada a cada característica individual, sistema, artigo, material, kit, e/ou método aqui descritos. Em adição, qualquer combinação de duas ou mais de tais características, sistemas, artigos, materiais, kits, e/ou métodos, se tais características, sistemas, artigos, materiais, kits, e/ou métodos não são mutuamente inconsistentes, está incluída dentro do escopo da presente invenção.

[0173] Todas as definições, conforme definidas e usadas aqui, devem ser compreendidas para controle de definições de dicionário, definições em documentos incorporados por referência, e/ou significados ordinários dos termos definidos.

[0174] Os artigos indefinidos "um" e "uma", conforme aqui usado, no relatório descritivo e nas reivindicações, a menos que claramente indicado, deve ser compreendido para significar "pelo menos um."

[0175] A frase "e/ou," conforme aqui usada no relatório descritivo e nas reivindicações, deve ser compreendida para significar "qualquer ou ambos" dos elementos assim unidos, isto é, elementos que estão conjuntamente presentes em alguns casos, e separadamente presentes em outros casos. Outros elementos podem, opcionalmente, estar presentes outros do que os elementos especificamente identificados pela cláusula "e/ou", se relacionados ou não-relacionados àqueles elementos especificamente identificados, a menos que claramente indicado ao contrário. Desse modo, como um exemplo não-limitativo, uma referência a "A e/ou B", quando em conjunto com linguagem de extremidade aberta, tal como "compreendendo", pode se referir, em uma concretização, a A sem B (opcionalmente incluindo elementos outros do que B); em outra concretização, a B sem A (opcionalmente incluindo elementos outros do que A); em ainda outra concretização, a ambos A e B (opcionalmente incluindo outros elementos); etc.

[0176] Conforme aqui usado no relatório descritivo e nas reivindicações, "ou" deve ser compreendido ter o mesmo significado como "e/ou", conforme definido acima. Por exemplo, quando se separa itens em uma lista, "ou" ou "e/ou" devem ser interpretados como sendo inclusivos, isto é, a inclusão de pelo menos um, mas também incluindo mais do que um, de um número de, ou lista de elementos, e, opcionalmente, itens não-listados adicionais. Somente termos claramente indicados ao contrário, tal como "somente um de", ou "exatamente um de", ou, quando usados nas reivindicações, "consistindo de", se referirão a inclusão de exatamente um elemento de um número, ou lista de elementos. Em geral, o termo "ou", conforme aqui usado, deve somente ser interpretado como indicando alternativas exclusivas (isto é, "um ou o outro, mas não ambos") quando precedido pelos termos de exclusividade, tal como "qualquer", "um de", "somente um de", ou "exatamente um de". "Consistindo essencialmente de", quando usado nas reivindicações, deve ter seu significado ordinário conforme usado no campo da lei de patente.

[0177] Conforme aqui usado no relatório descritivo e nas reivindicações, a frase "pelo menos um", em referência a uma lista de um ou mais elementos, deve ser compreendida para significar pelo menos um elemento selecionado de qualquer um ou mais dos elementos na lista de elementos, mas não necessariamente incluindo pelo menos um de cada e todo elemento especificamente listado dentro da lista de elementos, e não excluindo quaisquer combinações de elementos na lista de elementos. Esta definição também permite que os elementos possam opcionalmente estar presentes outros do que os elementos especificamente identificados dentro da lista de elementos aos quais a frase "pelo menos um" se refere, se relacionada ou não- relacionada àqueles elementos especificamente identificados. Desse modo, como um exemplo não-limitativo, "pelo menos um de A e B" (ou, equivalentemente, "pelo menos um de A ou B," ou, equivalentemente, "pelo menos um de A e/ou B") podem se referir, em uma concretização, a pelo menos um, opcionalmente incluindo mais do que um, A, com nenhum B presente (e, opcionalmente, incluindo elementos outros do que B); em outra concretização, a pelo menos um, opcionalmente incluindo mais do que um, B, com nenhum A presente (e, opcionalmente, incluindo elementos outros do que A); em ainda outra concretização, a pelo menos um, opcionalmente incluindo mais do que um, A, e pelo menos um, opcionalmente incluindo mais do que um, B (e, opcionalmente, incluindo outros elementos); etc.

[0178] Deve também ser compreendido que, a menos que claramente indicado ao contrário, em quaisquer métodos aqui reivindicados que incluem mais do que um ato, a ordem dos atos do método não é necessariamente limitada à ordem em que os atos do método são recitados. REFERÊNCIAS 1. J. Sambrook and D. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (January 15, 2001), 978-0879695774 2. David C. Amberg, Daniel J. Burke; and Jeffrey N. Strathern, Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (April 2005), 9780879697280 3. John N. Abelson, Melvin I. Simon, Christine Guthrie, and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Part A, Volume 194 (Métodos in Enzymology Series, 194), Academic Press (March 11, 2004), 978-0121827786 4. Christine Guthrie and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part B, Volume 350 (Methods in Enzymology, Vol 350), Academic Press; 1st edition (July 2, 2002), 978-0123106711 5. Christine Guthrie and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part C, Volume 351, Academic Press; 1st edition (July 9, 2002), 978-0123106728 6. Gregory N. Stephanopoulos, Aristos A. Aristidou and Jens Nielsen, Metabolic Engineering: Principles and Methodologies, Academic Press; 1 edition (October 16, 1998), 978-0126662603 7. Christina Smolke, The Metabolic Pathway Engineering Handbook: Fundamentals, CRC Press; 1 edition (July 28, 2009), 978-1439802960

[0179] Todas as publicações, patentes e entradas de base de dados de sequência aqui mencionadas, incluindo aqueles itens listados acima, são, desse modo, incorporados por referência, em que sua totalidade como se cada publicação individual ou patente fosse especificamente e individualmente indicadas para serem incorporadas por referência. No caso de conflito, o presente pedido, incluindo quaisquer definições aqui, controlará.

Claims

1. Célula de levedura oleaginosa isolada, caracterizada pelo fato de que compreende: uma modificação genética que aumenta a expressão da estearoil CoA desaturase (SCD) em relação a uma célula não modificada do mesmo tipo, em que a modificação genética compreende: (i) um promotor constitutivo ou induzível operacionalmente ligado a uma sequência que codifica SCD; ou (b) um promotor SCD modificado, em que a modificação é uma deleção e/ou uma mutação completa ou parcial de uma sequência do promotor SCD de tipo selvagem, resultando em um rompimento da inibição de realimentação do promotor SCD de tipo selvagem; e/ou em que a modificação genética é pelo menos uma cópia adicional de um gene SCD; euma modificação genética que reduz expressão de delta-12 desaturase referente a uma célula não modificada do mesmo tipo, em que a modificação genética é deleção, rompimento, mutação e/ou substituição de uma sequência de codificação de um gene nativo delta-12 desaturase, ou de uma região regulatória, ou uma parte de uma região regulatória que regula expressão de um gene nativo delta-12 desaturase.

2. Célula de levedura oleaginosa isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a expressão aumentada ou diminuída do produto de gene confere um fenótipo propício à conversão aumentada de uma fonte de carboidrato a um ácido graxo, derivado de ácido graxo e/ou triacilglicerol (TAG) à célula, referente a uma célula não modificada do mesmo tipo.

3. Célula de levedura oleaginosa isolada de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o fenótipo é um perfil de ácido graxo modificado, um perfil de TAG modificado, uma taxa de síntese aumentada de ácido graxo e/ou triacilglicerol, um aumento no rendimento de conversão, um acúmulo aumentado de triacilglicerol na célula, e uma tolerância aumentada de estresse osmótico, uma taxa de proliferação aumentada, um volume aumentado de célula, e/ou uma tolerância aumentada de uma substância a uma concentração letal para e/ou inibição de proliferação de células não modificadas do mesmo tipo de célula, pela célula.

4. Célula de levedura oleaginosa isolada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a célula é viável sob condições de tensão osmótica letal às células não-modificadas.

5. Célula de levedura oleaginosa isolada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a taxa de proliferação de célula é pelo menos aumentada 5 vezes, conforme comparada às células não modificadas do mesmo tipo de célula.

6. Célula de levedura oleaginosa isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizada pelo fato de que a célula tolera uma substância a uma concentração letal para e/ou inibição de proliferação de células não modificadas do mesmo tipo de célula.

7. Célula de levedura oleaginosa isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizada pelo fato de que a taxa de síntese de um ácido graxo ou um TAG da célula é pelo menos 5 vezes aumentada, conforme comparada às células não modificadas do mesmo tipo de célula.

8. Célula de levedura oleaginosa isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a célula oleaginosa é Yarrowia lipolytica.

9. Cultura, caracterizada pelo fato de que compreende a célula de levedura oleaginosa, como definida na reivindicação 1.

10. Cultura de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma fonte de carboidrato.

11. Método para converter uma fonte de carboidrato em ácido graxo ou triacilglicerol, caracterizado pelo fato de que compreende: contatar uma fonte de carboidrato com uma célula de levedura oleaginosa isolada, como definida na reivindicação 1, e incubar a fonte de carboidrato contatada com a célula sob condições adequadas para pelo menos conversão parcial da fonte de carboidrato em um ácido graxo, ou um triacilglicerol, pela célula.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a fonte de carboidrato contatada com a célula de levedura oleaginosa isolada compreende uma substância a uma concentração letal para células não-modificadas do mesmo tipo de célula, conforme a célula de levedura oleaginosa isolada.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a substância é a fonte de carboidrato.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a fonte de carboidrato é um açúcar fermentável, e a concentração do açúcar fermentável é pelo menos 80 g/l após contato com a célula oleaginosa.

15. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a célula de levedura oleaginosa é Yarrowia lipolytica.

16. Método para modificar em uma célula de levedura o perfil de ácido graxo, o perfil de triacilglicerol, a taxa de síntese de ácido graxo, a taxa de síntese de triacilglicerol, a extensão do acúmulo de derivado de ácido graxo, a taxa de secreção de derivado de ácido graxo, a taxa de conversão de carboidrato a ácido graxo ou taxa de conversão de derivado de ácido graxo, o rendimento eficiente de conversão de carboidrato a ácido graxo, ou conversão de derivado de ácido graxo, a tolerância de tensão osmótica, a taxa de proliferação, o volume da célula, ou a tolerância de uma substância tóxica de uma célula para uso na conversão de uma fonte de carboidrato em um ácido graxo ou triacilglicerol, caracterizado pelo fato de que compreende aumentar na célula de levedura a expressão de estearoil CoA desaturase (SCD) referente a uma célula não modificada do mesmo tipo através da introdução de um construto de ácido nucleico compreendendo um cassete de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica o SCD sob o controle de um promotor homólogo ou heterólogo adequado; e/ou em pelo menos uma cópia adicional de um gene de SCD, e diminuir na célula de levedura a expressão de um gene de delta-12 desaturase referente a uma célula não-modificada do mesmo tipo através da introdução de deleção, rompimento, mutação e/ou substituição de uma sequência de codificação de um gene nativo delta-12 desaturase, ou de uma região regulatória, ou uma parte de uma região regulatória que regula expressão do gene nativo delta-12 desaturase.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a modificação do perfil de ácido graxo, do perfil de triacilglicerol, da taxa de síntese de ácido graxo, da taxa de síntese de triacilglicerol, da extensão do acúmulo de derivado de ácido graxo na célula, ou da taxa de secreção de derivado de ácido graxo da célula de levedura está aumentando a quantidade de um ácido graxo, um derivado de ácido graxo, e/ou um triacilglicerol é sintetizado, acumulado ou secretado pela célula.

18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a célula de levedura é Yarrowia lipolytica.