BR112012019361B1 - Método para transformar uma célula vegetal de soja, métodos para preparar uma planta transgênica de soja e uso de um gene ou genes que conferem a tolerância a um inibidor de hidróxi fenil piruvato dioxigenase (hppd) - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA TRANSFORMAR UMA CÉLULA VEGETAL DE SOJA, MÉTODOS PARA PREPARAR UMA PLANTA TRANSGÊNICA DE SOJA, CÉLULA VEGETAL TRANSGÊNICA DE SOJA E USO DE UM GENE OU GENES A invenção refere-se a métodos para a transformação mediada por Agrobacterium de tecido organogênico de soja utilizando um gene ou genes para tolerância a inibidores de HPPD como marcador de seleção. A invenção também refere-se a métodos para regenerar as plantas transgênicas de soja a partir das ditas células ou tecido transformados, e a plantas e sementes transgênicas de soja obtidas por tais métodos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A invenção refere-se geralmente a métodos para a transformação vegetal e, mais particularmente, a métodos para a transformação de células ou tecidos organogênicos de soja utilizando inibidores de HPPD como agentes de seleção. A invenção também se refere a métodos para regenerar plantas transgênicas de soja a partir das ditas células ou tecidos organogênicos de soja transformados, e a plantas e sementes transgênicas de soja obtidas por tais métodos. A soja (semente de soja) é uma das culturas mais importantes em todo o mundo, que fornecem óleo e proteína para gêneros alimentícios. Essa é a segunda cultura mais importante nos Estados Unidos, e também é amplamente produzida no Brasil, Argentina, China e Índia. O óleo de soja é o óleo vegetal mais abundante encontrada, e o alimento com alto teor proteico restante após o extrato de óleo é um suplemento proteico para animais muito importante.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] As sojas consistem em uma das culturas que foram geneticamente modificadas, e as sojas geneticamente modificadas são usadas em um número crescente de produtos. Em 1997, cerca de 8% de todas as sojas cultivadas para o mercado comercial nos Estados Unidos foram geneticamente modificados. Em 2009, o número foi 95%.

[0003] Apesar dessa demanda crescente de sojas geneticamente modificadas, a soja ainda é uma planta difícil de transformar e um material difícil para a regeneração vegetal. Ainda são necessários o aprimoramento e inovação para obter um processo de transformação e regeneração confiável e eficiente.

[0004] Os métodos para transformar células vegetais geralmente compreendem as seguintes etapas: a) preparar células vegetais capazes de receber o gene heterólogo, b) transformar as células competentes com o gene heterólogo, c) desenvolver e selecionar as células transformadas que compreendem o gene heterólogo. A produção de plantas transgênicas compreende o gene heterólogo integrado em seu genoma, então consiste em realizar as seguintes etapas de: d) regenerar as plantas a partir das células transformadas e, e) quando apropriado, produzir e recuperar as sementes das plantas transformadas férteis.

[0005] Como uma regra geral, e mais particularmente para plantas que são difíceis de transformar como a soja, a disponibilidade de um meio adequado e eficaz para selecionar as células transformadas é crucial. Ademais, o marcador de seleção está geralmente presente na planta transformada, exceto quando meios subsequentes e geralmente pesados para remover o mesmo são aplicados, e algum tipo de marcador selecionável, como os genes para resistência a um antibiótico, pode ser indesejado.

[0006] Dois métodos principais são atualmente usados na transformação de soja. O primeiro método utiliza o bombardeamento de partículas, vantajosamente de calos embriogênicos, culturas celular em um sólido ou em suspensão, ou outros tecidos embriogênicos proliferativos (Trick & Finer, 1998; Maughan et al, 1999; Santarem & Finer, 1999; Droste et al, 2002), enquanto o segundo método envolve a transformação mediada por Agrobacterium de tecido organogênico, como tecidos de nós cotiledonares (Zhang et al, 1999; Clemente et al, 2000; Olhoft & Somers, 2001; Olhoft et al, 2001), ou tecido derivado de sementes de soja maduras (US 7.473.822; EP10356036.3).

[0007] McCabe et al. (1988) produziu plantas de soja utilizando uma transformação mediada por biolística e o gene gusA como um repórter, sem a seleção de um marcador de resistência. Os tecidos transformados foram sucedidos pela avaliação de expressão de GUS ao regenerar brotos e plantas. Embora esse método seja usado para produzir a linhagem resistente ao herbicida glifosato RR1 (Roundup®) que foi usada por criadores para produzir as variedades comerciais de Roundup Ready® desenvolvidas em mais da metade dos acres de soja totais dos U.S., esse é um método muito trabalhoso e dispendioso, insatisfatoriamente eficiente em relação ao número de transformantes recuperados (Padgette et al. 1995). Então, métodos mediados por biolística mais eficientes foram desenvolvidos, utilizando a seleção para um agente de resistência.

[0008] Em 1991, Finer e McMullen utilizaram de forma bem- sucedida o tecido de cultura de suspensão embriogênico de soja bombardeado com partículas revestidas com DNAs de plasmídeo que codificam a resistência à higromicina e β-glucuronidase (GUS).

[0009] Em 1997, explantes de hipocótilo foram transformados por bombardeamento de micropartículas, utilizando o gene bar como o gene marcador selecionável e a seleção em fosfinotricina (US 5,968,830).

[0010] Em 2000, o gene de hidróxi fenil piruvato dioxigenase (HPPD) vem apresentando um resultado satisfatório e, pela primeira vez, usado como o gene marcador selecionável para a transformação mediada por biolística de um tecido embriogênico proliferativo, obtido ao cultivar embriões zigóticos imaturos de soja em um meio indutor adequado (US 6.768.044). Os inibidores de HPPD atuam sobre as células vegetais ao inibir a síntese de plastoquinonas e de carotenoides. Essa ação produz um branqueamento do tecido embriogênico que não é prejudicial ao crescimento das ditas células. Apenas as células vegetais transformadas que compreendem o gene para tolerância a inibidores de HPPD permanecem verdes e podem ser selecionadas desde que se difiram das células não-transformadas. Geralmente, o agente de seleção é introduzido no meio de cultura das células após a transformação. No caso do uso de gene HPPD como o gene marcador selecionável para a transformação mediada por biolística de tecido embriogênico proliferativo, os autores foram capazes de selecionar as células transformadas ao introduzir o inibidor de HPPD no meio de cultura das células vegetais competentes antes da etapa de transformação, para branquear as ditas células. As células competentes branqueadas foram então transformadas com o gene para tolerância a inibidores de HPPD, como um marcador de seleção, e as células transformadas que integraram dito marcador de seleção em seu genoma se tornaram verdes, permitindo que essas sejam selecionadas (US 6.768.044).

[0011] Esses métodos mais recentes aprimoraram de maneira eficiente a transformação mediada por biolística de soja. Entretanto, a transformação de tecido embriogênico proliferativo por bombardeamento de partículas possui várias desvantagens: essa exige um período de cultura de tecido prolongado, geralmente produz padrões de inserção complexos de transgenes no genoma da planta, e pode resultar na regeneração de plantas estéreis (Liu et al, 1996; Singh et al, 1998; Reddy et al, 2003).

[0012] Em contrapartida, a transformação mediada por Agrobacterium de tecido organogênico pode reduzir os procedimentos de cultura de tecido extensivos antes da transformação, e resultar na integração de um padrão de inserção simples (geralmente menos do que 3 cópias, e geralmente uma única inserção), que elimina o risco de rearranjo subsequente entre as cópias.

[0013] Por esses motivos, um método mediado por Agrobacterium reproduzível e eficiente, associado com o meio de seleção eficiente e bem aceito, é altamente desejado.

[0014] Os métodos de transformação mediados por Agrobacterium são atualmente usados de forma bem sucedida com tecidos organogênicos de soja, como o nó cotiledonar (US 5.416.011; US 5.959.179) ou tecido derivado de sementes de soja maduras (US 7.473.822, EP10356036.3).

[0015] Diversos genes marcadores de seleção são atualmente usados para os ditos métodos de transformação mediados por Agrobacterium.

[0016] O gene nptll que codifica a neomicina fosfotransferase para a resistência à canamicina foi usado de maneira bem-sucedida (Hinchee et al, 1988; Di et al, 1996; Donaldson and Simmons, 2000; US 5.416.011; US 5.959.179). Entretanto, o restante de um gene marcador de resistência a antibiótico no produto final pode ser menos preferido.

[0017] O uso de gene de resistência à herbicida é geralmente considerado como uma solução preferida, e dois genes foram usados de maneira bem-sucedida para soja: o gene bar que codifica a fosfinotricina acetiltransferase que desintoxica o herbicida glufosinato (Zhang et al., 1999; Xing et al, 2000) ou bialafos (Tachibana et al., 1986; Thompson et al., 1987), e o gene EPSPS (enolpiruvilchiquimatoi3 -fosfato sintase) que codifica uma enzima que é resistente ao herbicida glifosato (US 7.002.058).

[0018] Entretanto, as taxas de eficiência obtidas com o gene bar /glufosinato, gene bar /bialafos ou gene EPSPS /seleção de glifosato ainda são relativamente fracas: uma taxa de eficiência de 0 a 3% para transformantes derivados de nós cotiledonares foi relatada quando o glufosinato for usado como o agente de seleção, enquanto bialafos proporciona 0% a 2,1% de eficiência (Paz et al, 2004). Uma faixa similar de eficiência - entre 0,5 e 2 % - foi relatada para a seleção de glifosato (US 7.002.058).

[0019] Adicionalmente, um período relativamente longo é necessário para selecionar as células transformadas utilizando antibiótico ou a seleção bar: aproximadamente 2 a 3 meses, com várias transplantações, e isso não evita obter quaisquer falsos positivos.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0020] Descreve-se aqui a surpreendente revelação dos inventores que um gene para a tolerância a inibidores de HPPD pode ser usado de maneira bem-sucedida e vantajosamente como o gene marcador selecionável para transformação mediada por Agrobacterium de um tecido organogênico de soja (ou seja, explante organogênico de soja). Em comparação com os genes marcadores selecionáveis usados até agora, a seleção, que é visual, é realmente mais fácil, mais eficiente, e mais rápida. Esse novo sistema de seleção está, de fato, associado a uma faixa inesperada de eficiência (até 4 %), sem escapatória (ou seja, sem brotos verdes não transgênicos, sem falsos positivos) e um ganho de tempo bastante visível: enquanto aproximadamente são necessários 3 meses com os genes marcadores de seleção atualmente usados, aproximadamente são necessárias apenas 3 a 4 semanas para a etapa de seleção utilizando um gene para a tolerância a inibidores de HPPD como o gene marcador selecionável.

[0021] Como uma vantagem adicional, e contrário ao outro sistema que inclui os marcadores antibióticos e marcadores que conferem resistência a herbicidas exceto inibidores de HPPD, os inibidores de HPPD usados como agentes de seleção não são letais para as células não-transformadas. Os inibidores de HPPD, ao inibir a síntese de plastoquinonas e de carotenoides, produzem o branqueamento das células vegetais que não é prejudicial ao crescimento das ditas células. Apenas as células transformadas vegetais que compreendem o gene para tolerância a inibidores de HPPD permanecem verdes e podem ser visual e facilmente selecionadas visto que essas se diferem das células não-transformadas brancas. O uso de um gene para tolerância a HPPD como o marcador selecionável é, portanto, um sistema útil para determinar rápida e facilmente a eficiência de qualquer novo método de transformação/regeneração, visto que é possível dissociar a eficiência de regeneração (número de brotos, brancos ou verdes) da eficiência de transformação (razão de broto verde/broto branco). Em outros métodos, o número de brotos corresponde a uma eficiência de transformação e regeneração global, sem dissociação entre a eficiência de transformação por um lado e a eficiência de regeneração por outro lado.

[0022] A presente invenção, portanto, se refere a um método para transformar uma célula vegetal de soja utilizando um processo mediado por Agrobacterium e um gene ou genes para tolerância a inibidores de HPPD como o gene marcador de seleção, sendo que dito método compreende as etapas de: a) preparar um explante organogênico de soja que compreende pelo menos uma célula vegetal capaz de ser transformada por uma cepa de Agrobacterium, b) expor pelo menos a região que contém dita célula vegetal no dito explante a uma cepa de Agrobacterium que contém um DNA heterólogo que compreende pelo menos um gene para tolerância a inibidores de HPPD, c) cultivar o explante na presença de um inibidor de HPPD como o agente de seleção, d) selecionar opcionalmente as células vegetais transformadas.

[0023] A presente invenção também refere-se a um método para preparar uma planta transgênica de soja que compreende pelo menos um gene heterólogo integrado em seu genoma, que compreende um método para transformar uma célula vegetal de soja como descrito acima e adicionalmente as seguintes etapas de: e) regenerar uma planta a partir da célula transformada.

[0024] Em uma modalidade particular da invenção, a etapa d) (seleção da célula vegetal transformada) não é realizada antes da etapa de regeneração. Sob as condições adequadas, os brotos são regenerados a partir de células. Esses brotos são brancos quando regenerados a partir de uma célula não-transformada, verdes quando regenerados a partir de uma célula transformada. Vantajosamente, os brotos verdes transformados são então selecionados com base em um critério visual (cor verde) e deixados se desenvolver enquanto os brotos brancos são eliminados.

[0025] Métodos que não sejam visuais também podem ser usados, como substitutos ou além daqueles visuais. Os ditos métodos são bem conhecidos pelos elementos versados na técnica. Pode-se mencionar como exemplo métodos PCR (reação em cadeia da polimerase), testes “strip”, em que o gene-alvo pode ser (um entre) o(s) gene(s) que confere a tolerância a inibidores de HPPD ou outro gene co-introduzido com dito gene que confere a tolerância a inibidores de HPPD.

[0026] Os ditos métodos também podem ser usados na etapa d).

[0027] Portanto, a presente invenção se refere a um método para preparar uma planta transgênica de soja utilizando um processo mediado por Agrobacterium e um gene ou genes para a tolerância a inibidores de HPPD como um gene marcador de seleção, sendo que dito método compreende as etapas de: a) preparar um explante organogênico de soja que compreende pelo menos uma célula vegetal capaz de ser transformada por uma cepa de Agrobacterium, b) expor pelo menos a região que contém dita célula vegetal no dito explante a uma cepa de Agrobacterium contendo um DNA heterólogo que compreende pelo menos um gene para tolerância a inibidores de HPPD, c) cultivar o explante na presença de um inibidor de HPPD como o agente de seleção, d) permitir que as plantas sejam regeneradas a partir de células ou do dito explante, e) selecionar plantas transformadas.

[0028] Em uma modalidade particular, as ditas plantas transformadas são selecionadas mediante critérios visuais (plantas verdes). As hidróxi fenil piruvato dioxigenases (HPPD; EC 1.13.11.27) são enzimas que catalisam a reação em que para-hidróxi fenil piruvato (HPP), um produto de degradação de tirosina, é transformado em homogentisato (HG), o precursor em plantas de tocoferol e plastoquinona (Crouch N.P. et al., 1997; Fritze et al, 2004). O tocoferol atua como um antioxidante associado à membrana. A plastoquinona, primeiramente atua como um transportador de elétrons entre PSII e o complexo citocromo b6/f e então, é um cofator de oxirredução para fitoeno desaturase, que está envolvido na biossíntese de carotenoides.

[0029] A maioria das plantas sintetiza tirosina através de arrogenato (Abou-Zeid et al. 1995; Bonner et al., 1995). Nessas plantas, o HPP é derivado apenas da degradação de tirosina. Por outro lado, em organismos como a levedura Saccharomyces cerevisiae ou a bactéria Escherichia coli, essa é sintetizada pela ação de uma enzima, prefenato desidrogenase (mais adiante referida como PDH), que converte prefenato em HPP (Lingens et al., 1967; Sampathkumar and Morrisson 1982). Nesses organismos, a produção de HPP é, portanto, diretamente conectada à via biossintética de aminoácido aromático (via do chiquimato), e não à via de degradação da tirosina.

[0030] Diversas HPPDs e suas sequências primárias foram descritas no estado da técnica, em particular as HPPDs de bactérias como Pseudomonas (Rüetschi et al, Eur. J. Biochem., 205, 459-466, 1992, WO 96/38567), Streptomyces avermitilis (Genebank SAV11864), de fungos como Mycosphaerella graminicola (Genebank AF038152), de plantas como Arabidopsis (WO 96/38567, Genebank AF047834), cenoura (WO 96/38567, Genebank 87257), Avena sativa (WO 02/046387), trigo (WO 02/046387), Brachiaria platyphylla (WO 02/046387), Cenchrus echinatus (WO 02/046387), Lolium rigidum (WO 02/046387), Festuca arundinacea (WO 02/046387), Setaria faberi (WO 02/046387), Eleusine indica (WO 02/046387), Hordeum vulgare (Genebank HVAJ693), Sorgo (WO 02/046387), Coptis japonica (WO2006132270), Salvia miltiorrhiza (Mol Biol Rep (2009) 36:2019-2029), de Coccicoides (Genebank COITRP), de clamidomonas ES2275365A1, ou de mamíferos como o camundongo Mus musculus (Genebank MU54HD) ou o porco. As sequências correspondentes descritas nas referências indicadas estão aqui incorporadas a título de referência.

[0031] Ao alinhar essas sequências conhecidas, utilizando o meio convencional da técnica, como, por exemplo, o método descrito por Thompson, J.D. et al. (CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions- specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22; 4673-4680, 1994), e acessar esses programas de computador para o alinhamento de sequência que são acessíveis através da Internet, por exemplo, o elemento versado na técnica é capaz de definir as homologias de sequência em relação a uma sequência de referência e encontram os aminoácidos essenciais ou ainda definem regiões comuns.

[0032] A inibição de HPPD resulta em desacoplamento de fotossíntese, deficiência em pigmentos coletores de luz adicionais e, mais importante, em destruição de clorofila por radiação UV e espécies de oxigênio reativo devido à falta de fotoproteção normalmente fornecida por carotenoides (Norris et al. 1995). O fotobranqueamento de tecidos fotossinteticamente ativos resulta na inibição do crescimento e morte da planta.

[0033] Algumas moléculas que inibem HPPD, denominadas inibidores de HPPD, e que se ligam especificamente à enzima para inibir a transformação do HPP em homogentisato, revelaram ser herbicidas seletivos muito eficazes.

[0034] Os herbicidas inibidores de HPPD mais comercialmente disponíveis pertencem a uma dessas quatro famílias químicas: 1) as tricetonas, por exemplo, sulcotriona [ou seja, 2-[2-cloro- 4-(metilsulfonil)benzoil]-1,3- cicloexanediona], mesotriona [ou seja, 2-[4- (metilsulfonil)-2-nitrobenzoil]-1,3- cicloexanediona]; tembotriona [ou seja, 2-[2- cloro-4-(metilsulfonil)-3-[(2,2,2,-tri-fluoroetoxi)metil] benzoil]-1,3-ciclo- hexanodiona]; tefuriltriona [ou seja, 2-[2-cloro-4- (metilsulfonil)-3 - [[(tetraidro-2- furanil)metoxi]metil]benzoil]-1,3-cicloexanodiona]]; biciclopirona [ou seja, 4- hidróxi-3-[[2-[(2-metóxi etóxi)metil]-6-(trifluorometil)-3- piridinil]carbonil]biciclo[3.2.1]oct-3-en-2-ona]; Benzobiciclon [ou seja, 3- (2-cloro- 4-mesilbenzoil)-2-feniltiobiciclo[3.2.1 ]oct-2-en-4-ona] 2) as dicetonitrilas, por exemplo, 2-ciano-3-ciclopropil-l-(2- metilsulfonil-4- trifluorometilfenil)-propano-1,3-diona e 2-ciano-1-[4- (metilsulfonil)-2-trifluorometilfenil] -3-(1-metilciclopropil)propano-1,3-fiona; 3) os isoxazóis, por exemplo, isoxaflutol [ou seja, (5-ciclopropil- 4-isoxazolil)[2-(metilsulfonil)-4- (trifluorometil)fenil]metanona]. Em plantas, o isoxaflutol é rapidamente metabolizado em DK, um composto dicetonitrila que exibe a propriedade inibidora de HPPD; e 4) os pirazolinatos, por exemplo topramezona [ou seja,[3-(4,5- di-hidro-3-isoxazolil)-2-metil-4-(metilsulfonil) fenil] (5-hidróxi-1-metil-1H-pirazol- 4-il)metanona], pirasulfotol [(5-hidróxi- 1,3-dimetilpirazol-4-il(2-mesil-4- trifluarometilfenil)metanona]; e pirazofeno [2-[4-(2,4-diclorobenzoil)- 1,3- dimetilpirazol-5-iloxi]acetofenona].

[0035] A tolerância a inibidores de HPPD foi até agora obtida através de diferentes estratégias. Uma estratégia é super-expressar a enzima sensível para produzir quantidades da enzima-alvo na planta que são suficientes em relação ao inibidor de HPPD (W096/38567). Considerando tal estratégia, um gene para a tolerância a inibidores de HPPD é um gene que codifica uma enzima de HPPD, ou seja, um gene de HPPD. Vários genes de HPPD foram identificados até agora, utilizando várias fontes, inclusive humanos, bactérias, e plantas. Como exemplos, os genes de HPPD de bactérias foram isolados de Pseudomonas (EP 0828837), Sphingomonas elodea ou Bacillus thuringiensis (US20050289664). Os genes de HPPD de plantas foram isolados de Arabidopsis thaliana (EP0877793, EP0938546), a cenoura (Daucus carotid) (EP 0828837), a aveia (Avena sativa) (US 7.312.379), o algodão (Gossypium hirsutum) (US 7.297.541), a colza (Brassica napus), o tomate (Lycopersicon esculentum) (US20050289664). As sequências correspondentes descritas nas referências indicadas estão aqui incorporadas a título de referência.

[0036] Uma segunda estratégia é modificar a HPPD para obter uma enzima-alvo que, enquanto mantém suas propriedades de catalisar a transformação de HPP em homogentisato, é menos sensível a inibidores de HPPD do que a HPPD nativa antes da mutação. Dita estratégia, HPPDs modificadas que satisfazem dita exigência e genes que as codificam são, por exemplo, descritas em EP 1029059, pedido de patente EP N° 08154481.9. As sequências correspondentes descritas nas referências indicadas estão aqui incorporadas a título de referência.

[0037] Uma terceira estratégia é desintoxicar os inibidores de HPPD. O citocromo da planta P450s é conhecido por estar envolvido no metabolismo e desintoxicação de inúmeros pesticidas, e US20090217415 relata a sequência de um citocromo P450 que confere tolerância a inibidores de HPPD. A sequência correspondente está aqui incorporada a título de referência.

[0038] Uma quarta estratégia é contornar a produção mediada por HPPD de homogentisato. Isso foi feito ao introduzir em células vegetais um gene que codifica uma HPP oxidase, que permite a conversão de HPP em 4-HPA, e genes que codificam enzimas que permitem a conversão de 4-HPA em homogentisato, em que todas essas enzimas são não-sensíveis a inibidores de HPPD (EP 1330530). As sequências correspondentes estão aqui incorporadas a título de referência.

[0039] Recentemente, também foi mostrado que a introdução de um gene de HPPD Pseudomonas no genoma de plastídeo pode conferir melhor tolerância ao inibidor de HPPD isoxaflutol do que a transformação nuclear (Dufourmantel et al, 2007).

[0040] Essas diferentes estratégias também podem ser combinadas, como, por exemplo, ao combinar a super-expressão de HPPD e a desintoxicação (WO 2008/150473).

[0041] De preferência, os genes para a tolerância a inibidores de HPPD compreendem, na direção de transcrição, uma sequência promotora reguladora que é funcional em células vegetai e plantas, funcionalmente ligada a uma sequência de DNA que codifica um HPPD, funcionalmente ligada a uma sequência terminadora reguladora que é funcional em células vegetais e plantas. As sequências que codificam HPPDs podem ser sequências de HPPD nativas, em particular de plantas, de microrganismos, de fungos ou de mamíferos, em particular as sequências descritas nos Pedidos de Patente WO 96/38567, US 6 087 563, WO 97/49816 e WO 99/24585 ou outras referências citadas no presente pedido. Essas são, em particular, sequências que codificam HPPDs de Pseudomonas fluorescens, de Arabidopsis thaliana, de Daucus carotta, de Avena sativa, de Gossypium hirsutum, de Brassica napus, de Lycopersicon esculentum, de trigo, ou de Synecocistys. As sequências que codificam HPPDs também são sequências modificadas, particularmente in em sua porção C- terminal como descrito no Pedido de Patente WO 99/24585, pedido de patente EP N° 08154481.9 ou HPPDs quiméricas como descrito no Pedido de Patente WO 99/24586. De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, a sequência de DNA que codifica uma HPPD é uma sequência de HPPD modificada em sua porção terminal, mais particularmente uma sequência que compreende as mutações W336 como descrito no Pedido de Patente WO 99/24585, pedido de patente EP N° 08154481.9, com mais preferência, a sequência de HPPD de Pseudomonas fluorescens que compreende as mutações W336 como descrito no Pedido de Patente WO 99/24585, pedido de patente EP N° 08154481.9 e a sequência de HPPD de Arabidopsis thaliana que compreende as mutações W336 como descrito no pedido de patente EP N° 08154481.9.

[0042] De acordo com uma modalidade particular da invenção, o gene para a tolerância a inibidores de HPPD compreende, na direção de transcrição, uma sequência promotora reguladora selecionada a partir do promotor da pequena subunidade RuBisCo de girassol, descrita no Pedido de Patente WO 99/25842, cujo conteúdo está incorporado aqui a título de referência, ou o promotor de histona de Arabidopsis thaliana combinado com o intensificador de vírus “etch” do tabaco (TEV) como descrito no Pedido de Patente WO 99/24585, cujo conteúdo está aqui incorporado a título de referência, ou um promotor CsVMV como descrito em WO04/053135, conteúdo está aqui incorporado a título de referência, funcionalmente ligado a uma sequência de DNA que codifica um peptídeo de trânsito, de preferência um peptídeo de trânsito otimizado, como definido mais adiante, funcionalmente ligado a uma sequência de DNA que codifica uma HPPD como definido acima, de preferência, uma sequência que codifica uma HPPD de Pseudomonas fluorescens, que compreende a mutação W336, funcionalmente ligada a uma sequência terminadora reguladora, em particular a sequência terminadora NOS.

[0043] Exemplos particularmente adequados de genes para a tolerância a HPPD são representados por SEQ ID NO 1 e SEQ ID NO 2. SEQ ID NO 1:

[0044] Diversas técnicas para transformar a soja por Agrobacterium, para preparar explantes ou tecidos adequados, de modo a expor pelo menos uma célula vegetal capaz de receber o gene heterólogo, foram descritas até agora (US5959179, US5416011, US 7,473,822, US 7,002,058, EP10356036.3). De preferência, o explante de soja usado nos métodos da invenção é de um tecido organogênico.

[0045] Os tecidos e células que são capazes de ser transformados, seja natural ou artificialmente, são denominados tecidos competentes e células competentes.

[0046] Para métodos de transformação mediada por biolística, as células vegetais competentes pode ser vantajosamente de calos embriogênicos, culturas celulares em um suporte sólido ou em suspensão, ou outros tecidos proliferativos embriogênicos, que são bem conhecidos pelos elementos versados na técnica e amplamente descritos na literatura. Vantajosamente, as células vegetais competentes são tecidos embriogênicos proliferativos, de preferência, mantidos em um meio semi-sólido (In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 35 :451-455, 1999).

[0047] Para métodos de transformação mediada por Agrobacterium, as células vegetais competentes podem ser de tecido organogênico. Na definição da invenção, um tecido organogênico (ou organogenético) é um tecido diferenciado não-proliferativo que é capaz de se desenvolver diretamente sob condições adequadas, nos órgãos (caules, folhas, raízes,. ..) das plantas.

[0048] Um tecido organogênico é, portanto, diferente de um tecido embriogênico, que é um tecido indiferenciado proliferativo, que não é capaz de formar qualquer estrutura como caule, folhas e raízes sem ser primeiramente convertido em embriões utilizando um meio adequado (Finer and Mc Mullen, 1991). Após diversas transferências (3-4) para esse meio, os embriões podem ser transferidos para outro meio (meio Murashige e Skoog) quando esses se desenvolvem nos órgãos das plantas.

[0049] Em uma modalidade particular da invenção, o explante organogênico de soja é um explante de cotilédone preparado a partir de uma muda de soja. Os métodos que compreendem preparar um explante de cotilédone de uma muda de soja são descritos em US5959179 e US5416011, incorporados aqui a título de referência. Os ditos métodos compreendem remover o segmento de hipocótilo, separar os dois cotilédones no nó cotiledonar, e remover o epicótilo. O método compreende ainda vantajosamente ferir o explante antes da inoculação ao fazer pelo menos um corte na região do pecíolo.

[0050] Em outra modalidade particular da invenção, o explante organogênico de soja é um explante metade semente preparado a partir de uma semente de soja madura. US 7.473.822 descreve métodos que compreendem embeber as sementes de soja maduras, dividir longitudinalmente as sementes de soja maduras e cortar totalmente o eixo embrionário, infectar os explantes de metade da semente resultados com Agrobacterium tumefaciens, e selecionar os transformantes. Os ditos métodos estão aqui incorporados a título de referência. Em outra modalidade particular da invenção, o explante organogênico de soja é um explante metade embrião-semente preparado a partir de uma semente de soja madura. EP 10356036.3 descreve métodos que compreendem embeber sementes de soja maduras, dividir longitudinalmente as sementes de soja maduras através do eixo embrionário, enquanto mantém uma parte do eixo embrionário sobre cada cotilédone, infectar os explantes de metade da semente resultados com Agrobacterium tumefaciens, e selecionar os transformantes. Os ditos métodos estão aqui incorporados a título de referência.

[0051] Um vetor de transformação mediada por Agrobacterium (vetor de Agrobacterium) pode ser usado para inserir um gene heterólogo em um explante suscetível à infecção por Agrobacterium. Geralmente, o gene compreende um promotor, uma sequência de codificação estrutural e um sinal de 3' poliadenilação ou outra sequência de terminação de transcrição. Os promotores que são conhecidos ou identificados para causar a transcrição de gene em células vegetais podem ser usados na presente invenção. Tais promotores podem ser obtidos a partir de plantas ou vírus e incluem, porém sem caráter limitativo, os promotores 35S e 19S de vírus do mosaico da couve-flor isolados de genes vegetais como EPSPS, genes ssRUBISCO e promotores obtidos de genes T-DNA de Agrobacterium tumefaciens como nopalina e manopina sintases. O promotor particular selecionado deve ser capaz de fazer com que a expressão suficiente resulte na característica fenotípica desejada. O RNA produzido pelo gene também geralmente contém uma sequência líder 5' não-traduzida. Essa sequência pode ser derivada de qualquer gene e pode ser especificamente modificada para aumentar a tradução do mRNA. As regiões 5' não-traduzidas podem ser derivadas de RNAs virais, outros genes eucarióticos adequados ou uma sequência genética sintética. Essas podem ser parte da extremidade 5' da região não-traduzida da sequência de codificação estrutural do polipeptídeo codificado ou derivadas de um promotor ou sequência de codificação não relacionada como discutido acima. A região 3' não-traduzida contém um sinal de poliadenilação que funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos de poliadenilato à extremidade 3' do mRNA, ou outra sequência de terminação. Em casos onde a sequência de codificação estrutural é derivada de uma fonte vegetal, alguém pode utilizar a região 3' não-traduzida naturalmente associada ao gene vegetal particular. Exemplos de outras regiões 3' adequadas são as regiões 3' transcritas, não-traduzidas que contêm o sinal de poliadenilação do gene de nopalina sintase (NOS) do plasmídeo indutor de tumor de Agrobacterium (Ti) ou do gene proteico de armazenamento de conglicinina (7S).

[0052] A invenção também se refere a um vetor sustentável para transformar uma célula vegetal de soja utilizando um processo mediado por Agrobacterium e compreendendo pelo menos uma construção genética heteróloga que compreende pelo menos um gene para a tolerância a inibidores de HPPD.

[0053] Várias cepas de Agrobacterium podem ser empregadas, inclusive, porém sem caráter limitativo, Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes. De preferência, as cepas desarmadas (ou seja, para as quais os genes indutores de fenótipo tumoral ou de raiz do pelo foram deletados) são utilizadas. Exemplos de cepas adequadas de A. tumefaciens incluem as cepas A208, a cepa EHA101, LBA4404 (Hood et al., 1986). Exemplos adequados de A. rhizogenes incluem a cepa K599, descrita no pedido provisório n° US 60/606789, US 20090049567. A construção de um vetor desarmado de Agrobacterium é bem conhecida na técnica, veja, por exemplo, Rogers et al, 1986, Rogers et al, 1987a, Rogers et al, 1987b, e Deblaere et al, 1987.

[0054] Os explantes podem ser submetidos à infecção por Agrobacterium na presença de um ou mais agentes que inibem o escurecimento, como antioxidantes. Exemplos dos ditos agentes incluem, porém sem caráter limitativo, cisteína, ditiotreitol, nitrato de prata, tiossulfato de sódio.

[0055] As células transformadas são selecionadas utilizando pelo menos um gene que confere tolerância à HPPD como um gene marcador de seleção, e um inibidor de HPPD como o agente de seleção. Os genes marcadores de seleção são introduzidos nas células hospedeiras simultaneamente com o gene heterólogo, ambos no mesmo vetor, sendo que os dois genes estão associados de maneira convergente, divergente ou colinear (WO 95/06128, US 5 731 179), ou nos dois vetores usados simultaneamente para transformar as células vegetais. Sob determinadas condições (US 5 731 179), e em particular quando o gene heterólogo e o gene marcador de seleção forem introduzidos separadamente em dois vetores, simultaneamente, o gene heterólogo que codifica uma proteína de interesse e o gene marcador de seleção pode se integrar em dois cromossomos diferentes no genoma da planta transformada. É possível, após recuperar as plantas transformadas férteis, eliminar o gene marcador para produzir plantas transformadas que compreendem apenas o gene heterólogo que codifica uma proteína de interesse. Essa eliminação pode ocorrer por autofertilização ou por cruzamento das plantas transformadas que compreendem o gene heterólogo e o gene marcador de seleção com uma variedade não-transformada da mesma planta, sendo que a segregação dos dois genes ocorre de maneira Mendeliana convencional.

[0056] Quando pelo menos uma segunda construção genética heteróloga for introduzida na célula vegetal de soja juntamente com a construção genética heteróloga que compreende pelo menos um gene para a tolerância a inibidores de HPPD, as construções genéticas heterólogas diferentes podem ser incluídas em um ou vários T-DNA(s). No caso de vários T-DNAs, os ditos T- DNAs podem estar presentes em um plasmídeo, ou em vários plasmídeos. No caso de vários plasmídeos, os ditos plasmídeos podem estar em uma célula de Agrobacterium ou em várias células de Agrobacterium. O agente de seleção, ou seja, o inibidor de HPPD é introduzido no meio de cultura das células após a transformação (etapa c), de acordo com as práticas comuns de elementos versados na técnica. Os inibidores de HPPD atuam sobre as células vegetais ao inibir a síntese de plastoquinonas e de carotenoides. Essa ação produz um branqueamento das células vegetais que não é prejudicial ao crescimento das ditas células, mais particularmente no caso de tecidos embriogênicos. Apenas as células da planta transformada que compreendem o gene para a tolerância a inibidores de HPPD permanecem verdes e podem ser selecionadas, visto que essas se diferem das células não-transformadas.

[0057] O inibidor de HPPD também pode ser introduzido anteriormente à etapa de transformação, para branquear as ditas células antes da etapa de transformação. As células competentes branqueadas são então transformadas com o gene para a tolerância a inibidores de HPPD, como um marcador de seleção, e as células transformadas que integraram dito marcador de seleção em seu genoma se tornaram verdes, permitindo que as mesmas sejam selecionadas.

[0058] Vantajosamente, os inibidores de HPPD são selecionados a partir de isoxazóis (EP 418 175, EP 470 856, EP 487 352, EP 527 036, EP 560 482, EP 682 659, US 5 424 276), em particular isoxaflutol, dicetonitrilas (DK ) (EP 496 630, EP 496 631), em particular 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2- CH3S02-4- CF3 fenil)propan-1,3-diona e 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-CH3S02-4-2,3- C12 fenil)propan-1,3-fiona, tricetonas (EP 625 505, EP 625 508, US 5,506,195), em particular sulcotriona, mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, e Benzobiciclona e pirazolinatos, em particular topramezona, pirasulfotol, e pirazofeno.

[0059] A quantidade adequada de inibidor de HPPD introduzida no meio adequado para selecionar as células transformadas de acordo com a invenção irá depender, por um lado, do inibidor de HPPD usado e, por outro lado, do explante usado. Os elementos versados na técnica serão capazes de determinar essa quantidade adequada utilizando técnicas convencionais para desenvolver as células competentes em várias concentrações do inibidor de HPPD usado.

[0060] De preferência, a concentração de inibidores de HPPD é entre 0,01 e 50 mg de material ativo por litro de meio, com mais preferência, entre 0,1 e 10 mg/1. Os meios e condições adequados para desenvolver e selecionar as células transformadas e os meios e condições para regenerar as plantas transformadas, são meios convencionais bem conhecidos pelos elementos versados na técnica e amplamente descritos na literatura, e em particular nas referências citadas no presente Pedido de Patente, incorporado aqui a título de referência. Exemplos de tais meios são dados, porém sem caráter limitativo, nos exemplos do presente pedido.

[0061] Entende-se na descrição acima e no texto subsequente que, quando o gene heterólogo, cuja introdução na planta é desejada, for um gene para a tolerância a inibidores de HPPD, o gene heterólogo individualmente pode ser introduzido e usado como o marcador de seleção no processo para transformar as células vegetais ou as plantas.

[0062] De preferência, os genes heterólogos que codificam uma proteína de interesse compreendem, na direção de transcrição, uma sequência promotora reguladora que é funcional em células vegetais e plantas, funcionalmente ligada a uma sequência de DNA que codifica uma proteína ou um peptídeo de interesse, funcionalmente ligada a uma sequência terminadora reguladora que é funcional em células vegetais e plantas.

[0063] As sequências de DNA que codificam uma proteína ou um peptídeo de interesse são geralmente sequências que codificam proteínas ou peptídeos que conferem, na planta transformada, novas propriedades agronômicas ou a melhora da qualidade agronômica da planta transformada.

[0064] Entre os genes que conferem novas propriedades agronômicas nas plantas transformadas, podem-se mencionar as sequências de DNA que codificam proteínas que conferem tolerância a determinados herbicidas, aqueles que conferem resistência a determinados insetos, aqueles que conferem resistência a nematódeos, aqueles que conferem tolerância a determinadas doenças, etc. Tais genes são em particular descritos nos Pedidos de Patente WO 91/02071 e WO 95/06128.

[0065] Entre as sequências de DNA que codificam proteínas que conferem tolerância a determinados herbicidas nas células de planta transformada e plantas, pode-se mencionar o gene Bar que confere tolerância a bialafos, o gene que codifica uma EPSPS adequado que confere resistência a herbicidas que possuem EPSPS como um alvo, como glifosato e seus sais (US 4.535.060, US 4.769.061, US 5.094.945, US 4.940.835, US 5.188.642, US 4.971.908., US 5.145.783, US 5.310.667, US 5.312.910, US 5.627.061, US 5.633.435, FR 2 736 926), o gene que codifica a glifosato oxidoreductase (US 5.463.175), ou um gene que codifica uma HPPD que confere tolerância aos herbicidas que possuem HPPD como um alvo e que são citados acima, como isoxazóis, em particular isoxafutol (FR 95 06800, FR 95 13570), dicetonitrilas (EP 496 630, EP 496 631) ou tricetonas, em particular tembotriona, sulcotriona ou mesotriona (EP 625 505, EP 625 508, US 5.506.195).

[0066] Entre as sequências de DNA que codificam uma EPSPS adequada que confere resistência aos herbicidas que possuem EPSPS como um alvo, pode-mencionar mais particularmente o gene que codifica uma EPSPS vegetal, em particular EPSPS de milho, que possui duas mutações, 102 e 106, e que é descrito no Pedido de Patente FR 2 736 926, mais adiante denominado mutante duplo EPSPS, ou o gene que codifica uma EPSPS isolada de Agrobacterium e que é descrito pela sequência ID No. 2 e a sequência ID No. 3 da Patente US 5.633.435, mais adiante denominada CP4.

[0067] Nos casos das sequências de DNA que codificam EPSPS ou HPPD, e mais particularmente que codificam os genes acima, a sequência que codifica essas enzimas é vantajosamente precedida por uma sequência que codifica um peptídeo de trânsito, em particular que codifica o "peptídeo de trânsito otimizado" descrito na Patente US 5.510.471 ou 5.633.448, cujo conteúdo está aqui incorporado a título de referência.

[0068] Entre as sequências de DNA que codificam as proteínas de interesse que conferem novas propriedades de resistência a insetos, pode-se mencionar mais particularmente as proteínas Bt amplamente descritas na literatura e bem conhecidas pelos elementos versados na técnica. Também serão mencionadas as proteínas extraídas de bactérias como Photorhabdus (WO 97/17432 & WO 98/08932).

[0069] Entre as sequências de DNA que codificam proteínas ou peptídeos de interesse que conferem novas propriedades de resistência a doenças, podem-se mencionar as quitinases, glucanases e oxalato oxidase, sendo que todas essas proteínas e suas sequências de codificação são amplamente descritas na literatura, ou peptídeos antibacterianos e/ou antifúngicos, em particular peptídeos de menos de 100 aminoácidos que são ricos em cisteínas, como tioninas ou defensinas vegetais, e mais particularmente peptídeos líticos de qualquer origem que compreendem uma ou mais pontes de dissulfeto entre as cisteínas e regiões que compreendem aminoácidos básicos, em particular os seguintes peptídeos líticos: androctonina (WO 97/30082 e WO 99/09189), drosomicina (WO 99/02717), tanatina (WO 99/24594) ou heliomicina (WO 99/53053). De acordo com uma modalidade particular da invenção, a proteína ou peptídeo de interesse é selecionado a partir de peptídeos elicitores fúngicos, em particular elicitinas (Kamoun et al, 1993; Panabieres et al, 1995).

[0070] Entre as sequências de DNA que codificam proteínas ou peptídeos que modificam a constituição das plantas modificadas, pode-se mencionar, em particular, as sequências de DNA que codificam proteínas ou peptídeos que modificam em particular o teor e a qualidade de alguns ácidos graxos essenciais (EP 666 918) ou o teor e a qualidade das proteínas, em particular nas folhas e/ou nas sementes das ditas plantas. Pode-se mencionar os genes que codificam proteínas enriquecidas em aminoácidos contendo enxofre (Korit, A. A. et al., Eur. J. Biochem. (1991) 195, 329-334; WO 98/20133; WO 97/41239; WO 95/31554; WO 94/20828; WO 92/14822). Essas proteínas enriquecidas em aminoácidos contendo enxofre também irão possuir a função de capturar e armazenar o excesso de metionina e/ou cisteína, tornando possível evitar os possíveis problemas de toxicidade que estão associados a uma superprodução desses em aminoácidos contendo enxofre, ao capturar os mesmos. Também pode-se mencionar os genes que codificam peptídeos ricos em aminoácidos contendo enxofre e mais particularmente em cisteínas, sendo que os ditos peptídeos também possuem atividade antibacteriana e/ou antifúngica. Mais particularmente serão mencionadas as defensinas vegetais, bem como peptídeos líticos de qualquer origem, e mais particularmente os peptídeos líticos anteriormente descritos. Também serão mencionadas as proteínas SAT descritas nos Pedidos de Patente WO 00/36127, WO 00/04167 e WO 00/01833. Como uma sequência reguladora que é um promotor em células vegetais e plantas, pode-se fazer uso de qualquer sequência promotora de um gene que é naturalmente expresso em plantas, em particular um promotor que é expresso especialmente nas folhas das plantas, como, por exemplo, promotores "constitutivos" de origem bacteriana, viral ou vegetal, ou promotores "dependentes de luz", como aqueles de um pequeno gene de subunidade de ribulose-biscarboxilase/oxigenase vegetal (RuBisCO), ou qualquer promotor conhecido adequado que pode ser usado. Entre os promotores de origem vegetal, serão mencionados os promotores de histona como descrito no Pedido EP 0 507 698, ou o promotor de actina do arroz (US 5.641.876). Entre os promotores de um gene de vírus vegetal, serão mencionados aqueles do vírus do mosaico da couve-flor (CAMV 19S ou 35S), ou o promotor de circovírus (AU 689 311).

[0071] Também pode-se fazer uso de uma sequência promotora reguladora específica de regiões ou tecidos particulares de plantas, e mais particularmente promotores específicos para sementes ([22] Datla, R. et al, Biotechnology Ann. Rev. (1997) 3, 269-296), especialmente o promotor de napina (EP 255 378), o promotor de faseolina, o promotor de glutenina, o promotor de heliantinina (WO 92/17580), o promotor de albumina (WO 98/45460), o promotor de oelosina (WO 98/45461), o promotor SAT1 ou o promotor SAT3 (PCT/US98/06978, depositados em 20 de outubro de 1998, incorporados aqui a título de referência).

[0072] Também pode-se fazer uso de um promotor induzível vantajosamente selecionado a partir da fenilalanina amônia liase (PAL), HMG- CoA redutase (HMG), quitinase, glucanase, inibidor de proteinase (PI), PR1 gene da família, nopalina sintase (nos) e promotores vspB (US 5 670 349, Tabela 3), o promotor HMG2 (US 5 670 349), o promotor de beta-galactosidase da maçã (ABG1) e o promotor de aminociclopropano carboxilato sintase da maçã (ACC sintase) (WO 98/45445).

[0073] De acordo com a invenção, também se pode fazer uso, em combinação com o promotor, de outras sequências reguladoras, que estão localizadas entre o promotor e a sequência de codificação, como ativadores de transcrição ("intensificadores"), por exemplo, o ativador de tradução do vírus do mosaico do tabaco (TMV) descrito no Pedido WO 87/07644, ou o vírus “etch” do tabaco (TEV) descrito por Carrington & Freed, por exemplo, ou íntrons como o íntron adh1 de milho ou íntron 1 de actina de arroz.

[0074] Como uma sequência terminadora reguladora ou de poliadenilação, pode-se fazer uso de qualquer sequência correspondente de origem bacteriana, como, por exemplo, o terminador nos de Agrobacterium tumefaciens, de origem viral, como, por exemplo, o terminador CaMV 35 S, ou de origem vegetal, como, por exemplo, um terminador de histona como descrito no Pedido EP 0 633 317.

[0075] As sequências que codificam uma HPPD, como as sequências que codificam uma proteína ou peptídeo de interesse, podem compreender sinais de codificação de sequência funcionalmente ligados em 5' ou em 3', direcionados para vários compartimentos da célula vegetal, como cloroplastos, mitocôndria ou o vacúolo. Tais sinais são descritos na literatura e são bem conhecidos pelos elementos versados na técnica. Os peptídeos de trânsito de cloroplasto podem ser simples, como um peptídeo de trânsito EPSPS (US 5,188,642) ou um peptídeo de trânsito de pequena subunidade de ribulose- biscarboxilase/oxigenase vegetal (RuBisCO ssu), que compreende opcionalmente alguns aminoácidos da porção N-terminal de RuBisCO ssu maduro (EP 189 707), ou um múltiplo peptídeo de trânsito que compreende um primeiro peptídeo de trânsito vegetal fundido com uma porção da sequência N- terminal de uma proteína madura localizada no plastídeo, fundida com um segundo peptídeo de trânsito vegetal como descrito na Patente EP 508 909, e mais particularmente o peptídeo de trânsito otimizado que compreende um peptídeo de trânsito RuBisCO de girassol fundido com 22 aminoácidos da extremidade N-terminal de RuBisCO ssu de milho fundido com o peptídeo de trânsito RuBisCO ssu de milho como descrito com sua sequência de codificação na Patente EP 508 909.

[0076] No documento WO2004/024928, foi mostrado que a transformação de plantas com um gene que codifica uma enzima de PDH torna possível aumentar a tolerância das ditas plantas a inibidores de HPPD. Esse aumento na tolerância é muito significativo quando as plantas transformadas com um gene que codifica uma enzima de PDH forem plantas que também super-expressam uma enzima de HPPD. Muitos genes que codificam as enzimas de PDH são descritos na literatura, e suas sequências podem ser identificadas no site da web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/. O gene que codifica a enzima de PDH da levedura Saccharomyces cerevisiae é particularmente conhecido (No. de Acesso S46037) como descrito em Mannhaupt et al. (1989, Gene 85, 303-311), de uma bactéria do gênero Bacillus, em particular da espécie B. subtilis (No. de Acesso P20692) como descrito em Henner et al. (1986, Gene 49 (1) 147-152), de uma bactéria do gênero Escherichia, em particular da espécie E. coli (No. de Acesso KMECTD) como descrito em Hudson et al. (1984, J. Mol. Biol. 180(4), 1023-1051), ou de uma bactéria do gênero Erwinia, em particular da espécie E. herbicola (No. de Acesso S29934) como descrito em Xia et al. (1992, J. Gen. Microbiol. 138(7), 13091316).

[0077] A invenção se refere adicionalmente a métodos para transformar uma célula vegetal de soja ou para preparar uma planta de soja transgênica caracterizada pelo fato de que a célula vegetal de soja ou a planta que é obtida a partir de um método descrito acima é adicionalmente transformada, simultânea ou sucessivamente, com um gene funcional nessa planta permitindo a super-expressão de uma enzima PDH (prefenato desidrogenase). A invenção refere-se adicionalmente a uma célula vegetal transgênica de soja ou uma planta de soja sustentável que será obtida por um método da invenção.

[0078] A invenção se refere adicionalmente ao uso de um gene ou genes que conferem a tolerância a inibidores de HPPD como gene marcador selecionável para a transformação de uma célula ou tecido organogênico de soja através de um processo mediado por Agrobacterium.

[0079] Uma célula vegetal organogênica de soja é definida como uma célula vegetal que é parte de um tecido ou explante organogênico de soja.

FIGURAS:

[0080] Figura 1: Seleção visual com IFT como o agente selecionável. O tecido não transformado se desenvolve em brotos brancos, alongados, enquanto o material transformado se torna verde (cinza escuro na fotografia em branco/preto) e brotos saudáveis.

[0081] Os exemplos a seguir tornam possível ilustrar a invenção para a transformação de soja, sem, entretanto, tentar limitar o escopo dessa.

[0082] Todos os métodos ou procedimentos descritos abaixo nesses exemplos são determinados a título de exemplos e correspondem a uma seleção feita dos vários métodos disponíveis para obter o mesmo resultado. A maioria dos métodos de engenharia de fragmentos de DNA é descrita em "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 and 2, Ausubel F.M. et al, publicado por Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1989) ou em Molecular cloning, T.Maniatis, E.F.Fritsch, J.Sambrook,1982.

[0083] O conteúdo de todas as referências citadas na descrição acima e nos exemplos a seguir está incorporado nos conteúdos do presente Pedido de Patente a título de referência.

EXEMPLO 1: MÉTODO DE NÓ COTILEDONAR PARA A TRANSFORMAÇÃO DE SOJA

[0084] O método de nó cotiledonar usado para transformar soja foi descrito por Zhang et al, 1999, Clemente et al. 2000, Xing et al. 2000.

[0085] Esse compreende as seguintes etapas.

ESTERILIZAÇÃO DE SEMENTE:

[0086]Colocar a semente em uma placa de petri aberta como uma única camada. Colocar a placa de petri em um dessecador de tamanho padrão dentro de uma cúpula. Colocar béquer de 250 ml com 100 ml de alvejante ChloroxTM no centro do dessecador. Adicionar 3,3 ml de 12 N de HCl, por gotejamento, ao longo do lado do béquer. Fechar o dessecador e deixar em repouso durante a noite.

GERMINAÇÃO DE SEMENTE:

[0087] O meio de germinação é despejado em placas de Petri e deixado solidificar. As sementes estéreis são colocadas na superfície do meio, com o hilo fazendo face para baixo. Colocar aproximadamente 15 sementes por caixa e incubar durante 5 dias a 24 °C com um fotoperíodo de 18/6- na Luz/no Escuro. Após a germinação, as mudas são colocadas a 4° C durante 24h.

PREPARAÇÃO DE INÓCULO:

[0088] Na manhã antes da infecção, 5mL de YEP + antibióticos são inoculados com um laço de Agrobacterium tumefaciens, retirado de uma pasta fresca no meio LB + antibiótico e deixado se desenvolver durante 8h a 28 °C e 200rpm de agitação. À noite, a subcultura é despejada em 200ml de YEP + antibióticos. As bactérias são deixadas se desenvolver durante a noite a 28 °C e 200rpm de agitação.

[0089] No dia da infecção, a cultura de Agrobacterium é centrifugada em 4000rpm, 4 °C, 15min. o pélete é ressuspenso em 40 a 50mL de meio de infecção. O DO600nm deve estar entre 0,8 e 1. Armazenar em gelo.

TRANSFORMAÇÃO:

[0090] Selecionar apenas as mudas que estão verdes e com aspecto saudável. Cortar a semente germinante do sistema de raízes ao fazer um corte através da região do hipocótilo. Com um bisturi corta-se a semente verticalmente através da região do hipocótilo. Remover o tecido do eixo embrionário que permanece ligado aos cotilédones. Fazer 7-12 talhos com uma lâmina de bisturi vertical ao eixo em torno da junção entre o cotilédone e o hipocótilo. Preparar 30 a 40 explantes (e o explante é 1 cotilédone com hipocótilo ligado, ou seja, 2 explantes por semente) e iniciar as inoculações. Enquanto o primeiro conjunto de explantes está sendo inoculado, começar a preparar mais explantes. Colocar 25 ml de inoculo de Agrobacterium em uma placa de petri. Adicionar os explantes preparados. Permitir que o tecido se assente no inoculo durante 30 minutos, com agitação ocasional.

Co-cuLTivo:

[0091] Colocar os explantes em placas de co-cultivo (5 por placa), lado adaxial para baixo (plano).

LAVAGEM:

[0092] No final da co-cultura, os explantes são brevemente lavados em meio de lavagem.

INDUÇÃO DE BROTOS:

[0093] Após a lavagem, os explantes são colocados (5 por placa) no Meio de Iniciação de Broto, inclinados a 45°, com a área de nó cotiledonar encaixada no meio e para cima. A etapa de Iniciação de Broto dura 1 mês (24 °C fotoperíodo de 16/8) com uma transferência após 15 dias em que o hipocótilo é eliminado para manter apenas a área de diferenciação e o cotilédone.

ALONGAMENTO DE BROTO:

[0094] O cotilédone é removido; os explantes estão livres de tecido necrótico. A fase de alongamento dura até o surgimento de brotos bem desenvolvidos, com transferência a cada duas semanas em Meio de Alongamento de Broto novo. (24 °C e fotoperíodo de 16/8).

ENRAIZAMENTO OU ENXERTIA:

[0095] Os brotos resistentes são colocados em meio de enraizamento ou enxertados em uma muda germinada in vitro (em meio GM).

ACLIMAÇÃO E ESTUFA:

[0096] Uma vez que as raízes aparecem, as plantas são colocadas no solo.

[0097] Para a enxertia, aguardar até o implante estar forte para ir para o solo.

MEIO • MEIO LÍQUIDO YEP:

[0098] 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de Peptona, 5 g/L de NaCl2. pH a 7,0 com NaOH. Antibióticos adequados devem ser adicionados ao meio antes da inoculação.

• MEIO DE CO-CULTIVO:

[0099] 1/10X B5 de sais maiores, 1/10X B5 de sais menores, 2,8 mg/L de Ferro, 3,8 mg/L de NaEDTA, 30 g/L de Sucrose, 3,9 g/L de MES (pH 5,4). Filtrar 1X as vitaminas B5 esterilizadas, GA3 (0,25 mg/L), BAP (1,67 mg/L), Cisteína (400 mg/L), Ditiotrietol (154,2 mg/L), e 40 mg/L de acetosiringona são adicionados a esse meio após a autoclavagem.

•MEIO DE INFECÇÃO:

[0100] 1/10X B5 de sais maiores, 1/10X B5 de sais menores, 2,8 mg/L de Ferro, 3,8 mg/L de NaEDTA, 30 g/L de Sucrose, 3,9 g/L de MES (pH 5,4). Filtrar 1X as vitaminas B5 esterilizadas, GA3 (0,25 mg/L), BAP (1,67 mg/L), e 40 mg/L de acetosiringona são adicionados a esse meio após a autoclavagem.

• MEIO DE LAVAGEM:

[0101] 1X B5 de sais maiores, 1X B5 de sais menores, 2,8 mg/L de Ferro, 3,8 mg/L de NaEDTA, 30 g/L de Sucrose, e 0,59 g/L de MES (pH 5,7). Filtrar 1X as vitaminas B5 esterilizadas, BAP (1,11 mg/L), Timentina (100 mg/L), Cefotaxima (200 mg/L), e Vancomicina (50 mg/L) são adicionados a esse meio após a autoclavagem.

• MEIO DE INDUÇÃO DE BROTO:

[0102] 1X B5 de sais maiores, 1X B5 de sais menores, 2,8 mg/L de Ferro, 3,8 mg/L de NaEDTA, 30 g/L de Sucrose, e 0,59 g/L de MES, e 7 g/L de ágar nobre (pH 5,7). Filtrar 1X as vitaminas B5 esterilizadas, BAP (1,11 mg/L), Timentina (50 mg/L), Cefotaxima (200 mg/L), Vancomicina (50 mg/L) e o agente de seleção são adicionados a esse meio após a autoclavagem.

• MEIO DE ALONGAMENTO DE BROTO:

[0103] 1X MS de sais maiores, 1X MS de sais menores, 28 mg/L de Ferro, 38 mg/L de NaEDTA, 30 g/L de Sucrose, 0,59 g/L de MES, e 7 g/L de ágar nobre (pH 5,7). Filtrar 1X as vitaminas B5 esterilizadas, Asparagina (50 mg/L), Ácido L-Piroglutâmico (100 mg/L), IAA (0,1 mg/L), GA3 (0,5 mg/L), Zeatina-R (1 mg/L), Timentina (50 mg/L), Cefotaxima (200 mg/L), Vancomicina (50 mg/L), e o agente de seleção são adicionados a esse meio após a autoclavagem.

• MEIO DE ENRAIZAMENTO:

[0104] 1X MS de sais maiores, 1X MS de sais menores, 28 mg/L de Ferro, 38 mg/L de NaEDTA, 20 g/L de Sucrose, 0,59 g/L de MES, e 7 g/L de ágar nobre (pH 5,6). Filtrar 1X as vitaminas B5 esterilizadas, Asparagina (50 mg/L), e Ácido L-Piroglutâmico (100 mg/L) são adicionados a esse meio após a autoclavagem.

[0105] Exemplo 2: Método de explante metade semente para a transformação de SOJA

[0106] O método de explante metade semente usado para transformar soja foi descrito por Paz et al, 2006.

[0107] Esse compreende as seguintes etapas.

ESTERILIZAÇÃO DE SEMENTE:

[0108] Colocar a semente em uma placa de petri aberta como uma única camada. Colocar a placa de petri em um dessecador de tamanho padrão dentro de uma cúpula. Colocar béquer de 250 ml com 100 ml de alvejante ChloroxTM no centro do dessecador. Adicionar 3,3 ml de 12 N de HCl, por gotejamento, ao longo do lado do béquer. Fechar o dessecador e deixar em repouso durante a noite.

EMBEBIÇÃO DE SEMENTE:

[0109] As sementes são colocadas em placas de Petri e imersas em água deionizada estéril durante 24 horas antes da inoculação, no escuro, em temperatura ambiente.

PREPARAÇÃO DE INOCULO:

[0110] Na manhã antes da infecção, 5 mL de YEP + antibióticos são inoculados com um laço de Agrobacterium tumefaciens, retirado de uma pasta fresca no meio LB + antibiótico e deixado se desenvolver durante 8h a 28 °C e 200 rpm de agitação. À noite, a subcultura é despejada em 200 ml de YEP + antibióticos. As bactérias são deixadas se desenvolver durante a noite a 28 °C e 200 rpm de agitação.

[0111] No dia da infecção, a cultura de Agrobacterium é centrifugada em 4000rpm, 4 °C, 15 min. O pélete é ressuspenso em 40 a 50 mL de meio de infecção. O DO600nm deve estar entre 0,8 e 1. Armazenar em gelo.

TRANSFORMAÇÃO:

[0112] As sementes imersas são dissecadas, sob condições estéreis, conforme exposto a seguir: o revestimento da semente é removido e os dois cotilédones são separados. O eixo embrionário é totalmente cortado. Cada cotilédone é mantido como o explante para inoculação. Aproximadamente 60 explantes são preparados e subsequentemente inoculados juntamente, durante 30 minutos no inoculo de Agrobacterium, com agitação ocasional.

CO-CULTIVO:

[0113] Colocar os explantes em placas de co-cultivo (5 a 6 por placa), lado adaxial para baixo (plano). Incubar durante 5 dias, a 24 °C, em um fotoperíodo de 18:6.

LAVAGEM:

[0114] No final da co-cultura, os explantes são brevemente lavados em meio de lavagem.

INDUÇÃO DE BROTOS:

[0115] Após a lavagem, os explantes são colocados (5 por placa) no Meio de Iniciação de Broto, inclinados a 45°, com a área de nó cotiledonar encaixada no meio e para cima. A etapa de Iniciação de Broto dura 1 mês (24 °C fotoperíodo de 16/8) com uma transferência após 15 dias em que o hipocótilo é eliminado para manter apenas a área de diferenciação e o cotilédone.

ALONGAMENTO DE BROTO:

[0116] O cotilédone é removido; os explantes estão livres de tecido necrótico. A fase de alongamento dura até o surgimento de brotos bem desenvolvidos, com transferência a cada duas semanas em Meio de Alongamento de Broto novo. (24 °C e fotoperíodo de 16/8).

ENRAIZAMENTO OU ENXERTIA:

[0117] Os brotos resistentes são colocados em meio de enraizamento ou enxertados em uma muda germinada in vitro (em meio GM).

ACLIMAÇÃO E ESTUFA:

[0118] Uma vez que as raízes aparecem, as plantas são colocadas no solo.

[0119] Para a enxertia, aguardar até o implante estar forte para ir para o solo.

MEIO • MEIO LÍQUIDO YEP:

[0120] 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de Peptona, 5 g/L de NaC12. pH a 7,0 com NaOH. Antibióticos adequados devem ser adicionados ao meio antes da inoculação.

• MEIO DE CO-CULTIVO:

[0121] 1/10X B5 de sais maiores, 1/10X B5 de sais menores, 2,8 mg/L de Ferro, 3,8 mg/L de NaEDTA, 30 g/L de Sucrose, 3,9 g/L de MES (pH 5,4). Filtrar 1X as vitaminas B5 esterilizadas, GA3 (0,25 mg/L), BAP (1,67 mg/L), Cisteína (400 mg/L), Ditiotrietol (154,2 mg/L), e 40 mg/L de acetosiringona são adicionados a esse meio após a autoclavagem.

• MEIO DE INFECÇÃO:

[0122] 1/10X B5 de sais maiores, 1/10X B5 de sais menores, 2,8 mg/L de Ferro, 3,8 mg/L de NaEDTA, 30 g/L de Sucrose, 3,9 g/L de MES (pH 5,4). Filtrar 1X as vitaminas B5 esterilizadas, GA3 (0,25 mg/L), BAP (1,67 mg/L), e 40 mg/L de acetosiringona são adicionados a esse meio após a autoclavagem.

• MEIO DE LAVAGEM:

[0123] 1X B5 de sais maiores, 1X B5 de sais menores, 2,8 mg/L de Ferro, 3,8 mg/L de NaEDTA, 30 g/L de Sucrose, e 0,59 g/L de MES (pH 5,7). Filtrar 1X as vitaminas B5 esterilizadas, BAP (1,11 mg/L), Timentina (100 mg/L), Cefotaxima (200 mg/L), e Vancomicina (50 mg/L) são adicionados a esse meio após a autoclavagem.

• MEIO DE INDUÇÃO DE BROTO:

[0124] 1X B5 de sais maiores, 1X B5 de sais menores, 2,8 mg/L de Ferro, 3,8 mg/L de NaEDTA, 30 g/L de Sucrose, e 0,59 g/L de MES, e 7 g/L de ágar nobre (pH 5,7). Filtrar 1X as vitaminas B5 esterilizadas, BAP (1,11 mg/L), Timentina (50 mg/L), Cefotaxima (200 mg/L), Vancomicina (50 mg/L) e o agente de seleção são adicionados a esse meio após a autoclavagem.

• MEIO DE ALONGAMENTO DE BROTO:

[0125] 1X MS de sais maiores, 1X MS de sais menores, 28 mg/L de Ferro, 38 mg/L de NaEDTA, 30 g/L de Sucrose, 0,59 g/L de MES, e 7 g/L de ágar nobre (pH 5,7). Filtrar 1X as vitaminas B5 esterilizadas, Asparagina (50 mg/L), Ácido L-Piroglutâmico (100 mg/L), IAA (0,1 mg/L), GA3 (0,5 mg/L), Zeatina-R (1 mg/L), Timentina (50 mg/L), Cefotaxima (200 mg/L), Vancomicina (50 mg/L), e o agente de seleção são adicionados a esse meio após a autoclavagem.

• MEIO DE ENRAIZAMENTO:

[0126] 1X MS de sais maiores, 1X MS de sais menores, 28 mg/L de Ferro, 38 mg/L de NaEDTA, 20 g/L de Sucrose, 0,59 g/L de MES, e 7 g/L de ágar nobre (pH 5,6). Filtrar 1X as vitaminas B5 esterilizadas, Asparagina (50 mg/L), e Ácido L-Piroglutâmico (100 mg/L) são adicionados a esse meio após a autoclavagem.

EXEMPLO 3: MÉTODO DE EXPLANTE METADE EMBRIÃO-SEMENTE PARA A TRANSFORMAÇÃO DE SOJA

[0127] O método de explante metade embrião-semente usado para transformar soja foi descrito no pedido de patente EP N° 10356036.3. Esse compreende as seguintes etapas.

[0128] As sementes de soja maduras de Thorne foram esterilizadas em superfície durante 24h com gás de cloro, em um dessecador, em que 5mL de HCl 37% foram adicionados a 150mL de Domestos em um béquer no centro. As sementes desinfetadas foram então colocadas em placas de petri e imersas em água deionizada estéril durante 24 horas antes da inoculação, no escuro, em temperatura ambiente.

[0129] As sementes imersas foram dissecadas, sob condições estéreis, conforme exposto a seguir: Utilizando uma lâmina de bisturi #15, a parte visível do hipocótilo foi removida ao cortar transversalmente no local de florescimento. A semente de soja madura germinada foi cortada longitudinalmente de maneira precisa através do eixo embrionário restante e o revestimento da semente foi removido. É importante nesse estágio evitar qualquer ruptura de tecido durante a separação do cotilédone, e manter uma parte do eixo embrionário sobre cada cotilédone. As folhas primárias fixadas no cotilédone também foram removidas. Cada cotilédone foi mantido como explante para a inoculação.

[0130] O co-cultivo com a cepa de Agrobacterium, a regeneração das plantas e o meio são conduzidos conforme descrito acima.

EXEMPLO 4: CONSTRUÇÃO DOS VETORES DE AGROBACTERIUM QUE COMPREENDEM UM GENE QUE CODIFICA A HPPD A) CONSTRUÇÃO DE PFCO117 (HPPD)

[0131] O vetor de transformação pFC0117 foi derivado de pSF49, um descendente de pBL150a2 (EP 508909). O cassete bar foi primeiramente clonado em pSF49 (Notl/ Avrll), para obter pFCO20. O cassete contém locais lox para a remoção de bar (sistema cre/lox) no evento e alguns locais de meganucleases (I-Scel, I-Crel, I-Ceul, PI-SceI) para a inserção adicional de gene no mesmo local por recombinação homóloga. pFCO20 contém sítios de restrição convenientes para a clonagem de epsps (Sbfl/ Swal) e a clonagem de HPPD (Mscl/ Xhol). Epsps está sob o controle de Ph4A7, o promotor de gene H4 histona de Arabidopsis thaliana (Chaboute M, et al., (1987)). A expressão de HPPD modificada w336 de Pseudomonas fluorescens (Boudec P. et al, (1999); Patente US US6245968) é conduzida por P35S2, um fragmento da região promotora da transcrição 35 S do Vírus do Mosaico da Couve-Flor, seguida por ENtev, uma sequência intensificadora de vírus “etch” do tabaco (Carrington J.C. and Freed D.D. 1990). As proteínas Hppd são marcadas no cloroplasto através do peptídeo de trânsito otimizado TPotpc (Lebrun et al (1996); US5510471). A sequência TPotpc-hppdPfw336 é otimizada por códon para ajustar o códon de uso de soja e algodão.

B) CONSTRUÇÃO DE PFC048 (HPPD E PDH)

[0132] O vetor de transformação pFC048 foi derivado de pFCO20. O cassete contendo o marcador selecionável HPPD e o gene PDH (pFC045) foi clonado (Smal/ Pad) em pFCO20 (I-Ceul/ Pad). A expressão de HPPD modificado w336 de Pseudomonas fluorescens (Boudec P. et al, (1999); Patente US US6245968) é conduzida por PssuHa, o promotor induzível por luz da pequena subunidade de Helianthus annuus Rubisco. O PDH está sob o controle de Ph4A7 ABBC, um promotor de fusão composto de subunidades promotoras de gene H4 histona de Arabidopsis thaliana. As proteínas HPPD e PDH são marcadas no cloroplasto através do peptídeo de trânsito otimizado TPotpc (Lebrun et al (1996); US5510471).

EXEMPLO 5: SELEÇÃO COM DKN COMO O AGENTE SELECIONÁVEL

[0133] Os eventos transgênicos (cv Thorne) foram gerados para construir o gene transportador HPPD individualmente (ou seja, pFCO117) ou em combinação com o gene PDH (ou seja, pFC048), utilizando DKN como o agente de seleção, como descrito no exemplo 1. O agente de seleção DKN (dicetonitrila) foi adicionado em SI (meio de Indução de Brotos) em uma concentração final de 2ppm e durante aproximadamente 4 semanas. Quando os explantes forem transferidos para o SE (meio de Alongamento de Brotos), a seleção foi removida. Sob condições in vitro, a DKN não mata as célula não-transformadas, porém ainda impede a síntese de clorofila. O tecido não transformado se desenvolve em brotos brancos, alongados, enquanto o material transformado se torna verde e os brotos saudáveis. Então, a DKN fornece um visual maior do que um agente de seleção convencional. O marcador selecionável visual reduz drasticamente o tempo de seleção, visto que o material não transformado pode ser identificado e eliminado em apenas 4 semanas após a transformação.

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Claims (10)

1. Método para transformar uma célula vegetal de soja, utilizando um processo mediado por Agrobacterium e um gene ou genes para tolerância a inibidores de HPPD como marcador de seleção, o dito método caracterizado por compreender as etapas de: a) preparar um explante organogênico de soja, b) expor o dito explante a uma cepa de Agrobacterium contendo pelo menos uma primeira construção genética que compreende pelo menos um gene para tolerância a um inibidor de HPPD, c) cultivar o explante na presença de um inibidor de HPPD como agente de seleção, d) selecionar opcionalmente as células vegetais transformadas, em que o dito explante organogênico de soja é um explante de cotilédone, um explante de uma metade de semente ou um explante de metade de um embrião-semente e em que o inibidor de HPPD é introduzido apenas após a etapa de transformação b).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a cepa de Agrobacterium ser Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a dita cepa de Agrobacterium compreender adicionalmente pelo menos uma segunda construção genética heteróloga que é introduzida na dita célula vegetal de soja em conjunto com a dita primeira construção genética heteróloga que compreende pelo menos um gene para tolerância a inibidores de HPPD.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por as construções genéticas heterólogas diferentes serem incluídas em um ou vários T-DNA(s).

5. Método, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado por as construções genéticas heterólogas compreenderem um gene que confere resistência a um herbicida, um gene que confere resistência a nematódeos, ou um gene que confere resistência a inseto.

6. Método para preparar uma planta transgênica de soja, que compreende pelo menos um gene heterólogo integrado em seu genoma, o dito método caracterizado por compreender o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, suplementado com a seguinte etapa de: e) regeneração de plantas e sementes que compreendem o dito gene heterólogo a partir da célula transformada ou tecido transformado.

7. Método para preparar uma planta transgênica de soja, utilizando um processo mediado por Agrobacterium e um gene ou genes para tolerância a inibidores de HPPD como gene marcador de seleção, o dito método caracterizado por compreender as etapas de: a) preparar um explante organogênico de soja, b) expor o referido explante a uma cepa de Agrobacterium contendo um DNA heterólogo que compreende pelo menos um gene para tolerância a inibidores de HPPD, c) cultivar o explante na presença de inibidores de HPPD como agente de seleção, d) permitir que as plantas sejam regeneradas a partir de células do dito explante, e) selecionar as plantas transformadas, em que o dito explante organogênico de soja é um explante de cotilédone, um explante de metade de uma semente ou um explante de metade de um embrião-semente e em que o inibidor de HPPD é introduzido apenas após a etapa de transformação b).

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o inibidor de HPPD ser selecionado a partir de: - isoxazóis, em particular isoxaflutol; - dicetonitrilas, em particular 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2- CH3SO2-4-CF3 fenil)propan-1,3- diona e 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-CH3SO2-4-2,3- Cl2 fenil)propan-1,3-fiona; - tricetonas, em particular sulcotriona, mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, benzobiciclona; e - pirazolinatos, em particular topramezona, pirasulfotol ou pirazofeno.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por a célula vegetal ou planta de soja ser adicionalmente transformada, simultaneamente ou sucessivamente, com um gene funcional nessa planta permitindo a super-expressão de uma enzima PDH (prefenato desidrogenase).

10. Uso de um gene ou genes que conferem a tolerância a um inibidor de HPPD, caracterizado por ser como gene marcador selecionável para a transformação de uma célula ou tecido organogênico de soja através de um processo mediado por Agrobacterium, em que o inibidor de HPPD é introduzido apenas após a etapa de transformação.

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