BR112012006226A2

BR112012006226A2 - método para monitorar a conversão de dna mediada por bissulfito durante a análise de metilação do dna, uso de um método e uso de uma molécula reporter

Info

Publication number: BR112012006226A2
Application number: BR112012006226A
Authority: BR
Inventors: Peitz Ingmar
Original assignee: Koninl Philips Electronics Nv; Koninklijke Philips Nv
Priority date: 2009-09-23
Filing date: 2010-09-15
Publication date: 2020-04-07
Also published as: US8889353B2; US20120171691A1; CN102549168B; JP2013505031A; JP5702789B2; EP2480685A1; CN102549168A; EP2480685B1; WO2011036609A1

Abstract

método para monitor.ar a conversão de dna mediada por bissulfito durante a análise de metilação do dna, uso de um método e uso de uma molécula repórter a presente invenção refere-se a um método para monitorar a progressão da conversão de dna mediada por bissulfito durante a análise de metilação. o método baseia-se na reação da enzima uracil-dna-glicosilase (ung) com pelo menos uma molécula repórter de dna marcado, a molécula repórter compreendendo pelo menos um resíduo de citosina não metilada em sua sequência. após a conversão mediada por bissulfito de resíduos de citosina não metilada em resíduos de uridina, a ung remove as bases uracila da estrutura principal do dna, tornando-a assim suscetível à clivagem hidrolí tica induzida por calor. finalmente, os marcadores liberados da molécula repórter de dna durante esse processo de fragmentação são detectados.

Description

MÉTODO PARA MONITORAR A CONVERSÃO DE DNA MEDIADA POR BISSULFITO DURANTE A ANÁLISE DE METILAÇÃO DO DNA, USO DE UM MÉTODO E USO DE UMA MOLÉCULA REPÓRTER

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um método para monitorar a progressão da conversão de DNA mediada por bissulfito durante a análise de metilação. O método baseia-se na reação da enzima uracil-DNA-glicosilase (UNG) com pelo menos uma molécula repórter de DNA marcado, a molécula repórter compreendendo pelo menos um resíduo de citosina não metilada em sua sequência. Após a conversão mediada por bissulfito de resíduos de citosina não metilada em resíduos de uridina, a UNG remove as bases uracila da estrutura principal do DNA, tornando-a assim suscetível à divagem hidrolítica induzida por calor. Finalmente, os marcadores liberados da molécula repórter de DNA durante esse processo de fragmentação são detectados.

Uracil-DNA-glicosilase e uracil-N-glicosilase, às vezes abreviadas como UNG ou UDG devem ser entendidas como sendo similares ou sinônimas. Em qualquer caso, os termos são usados neste pedido de patente para indicar a enzima que torna a estrutura principal do DNA susceptível à divagem hidrolítica induzida por calor.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

A metilação do DNA é encontrada nos genomas de diversos organismos, incluindo tanto procariotos como eucariotos. Em procariotos, a metilação do DNA ocorre tanto em bases de citosina como de adenina e abrange parte do sistema de restrição do hospedeiro. Em eucariotos multicelulares, entretanto, a metilação parece limitar-se às bases citosina e está associada a um estado de cromatina reprimida e inibição da expressão gênica (revisado, por exemplo, em Wilson, G. G. and Murray, N. E. (1991) Annu. Rev.

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Genet. 25, 585-627).

Em células de mamíferos, a metilação do DNA ocorre predominantemente em dinucleotídeos CpG, que são distribuídos de forma desigual e estão subrepresentados no genoma. Aglomerados de CpGs geralmente não metilados (ditos como ilhas CpG) são encontrados em muitas regiões promotoras (revisado, por exemplo, em Li, E. (2002) Nat. Rev. Genet. 3, 662-673). Alterações na metilação do DNA que levam ao silenciamento gênico aberrante foram demonstradas em diversos tipos de câncer humanos (revisado, por exemplo, em Robertson, K. D. and Wolffe, A.P. (2000) Nat. Rev. Genet. 1, 11-19) . A hipermetilação de promotores foi demonstrada como sendo um mecanismo frequente que leva à inativação de genes supressores de tumor (Bird, A.P. (2002) Genes Dev. 16, 6-21).

Existem vários métodos para determinar experimentalmente a metilação diferencial em genes individuais (revisado, por exemplo, em Rein, T. et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26, 2255-2264). Estas técnicas incluem, entre outras coisas, sequenciamento com bissulfito, PCR específico para metilação (MSP), Methylight e pirosequenciamento.

Um pré-requisito comum para realizar as técnicas acima é a conversão mediada por bissulfito (também dita como modificação de bissulfito) do DNA a ser analisado. Em particular, resíduos de citosina não metilada são convertidos em resíduos de uridina. O esquema de reação de três etapas para a conversão mediada por bissulfito de citosina em uracila é mostrado esquematicamente na Fig. 1. Em resumo, a citosina é sulfonada em citosina-bissulfito em condições ligeiramente ácidas. A desaminação hidrolítica de uracilbissulfito ocorre espontaneamente. O último é, em seguida, dessulfonado em uracila em condições básicas.

Visto que resíduos de citosina metilada não são

3/31 convertidos em resíduos de uridina, durante o tratamento de bissulfito, a sequência de DNA nas Ilhas CpG não metiladas é efetivamente alterada (C para U) , enquanto o DNA metilado retém sua sequência original.

Entretanto, para resultados de diagnóstico válido com base na análise da condição de metilação do DNA, é desejável que o DNA seja convertido com eficiência máxima, ou seja, idealmente 100% dos resíduos de citosina não metilada presentes em uma determinada sequência de DNA são convertidos em resíduos de uridina.

A conversão de DNA mediada por bissulfito é tipicamente realizada usando kits de reação comercialmente disponíveis. Nestes sistemas de teste, o DNA é frequentemente incubado por um longo período de tempo (em muitos casos, durante a noite) a uma temperatura de reação comparativamente elevada (por exemplo, 60°C). São necessárias repetidas etapas de aquecimento a 95°C durante esse período de incubação a fim de desnaturar o DNA. Em muitos casos, supões-se que o tempo de incubação alcance a maior eficiência de conversão de DNA simplesmente deixando a reação ser executada por tanto tempo quanto pareça adequado e/ou seja tolerável, enquanto é mantido certo nível de qualidade de DNA. Por outro lado, é também evidente que períodos de aquecimento prolongado finalmente resultam na degradação do DNA e, assim, em uma diminuição no rendimento e integridade do DNA. Isso pode ser fatal para quaisquer análises a jusante, por exemplo, se a concentração de DNA na amostra for baixa.

Entretanto, DNAs de diferentes amostras a serem analisadas ou diferentes aplicações provavelmente requerem planejamentos experimentais distintos a fim de alcançar máxima eficiência. Por exemplo, a utilização de um lisado bruto com DNA não purificado apresenta mais incertezas do que um DNA de amostra purificada. Em um lisado bruto, estão

4/31 presentes outras substâncias que podem potencialmente interagir com o sal de bissulfito e, assim, interferir com a reação de conversão do DNA.

Em face das considerações acima, é evidente que uma abordagem geral de um tempo de incubação único não é razoável visto que levaria a uma perda desnecessária da qualidade de DNA devido à exposição prolongada ao calor quando são analisadas amostras de DNA que são fáceis de converter (por exemplo, moléculas de DNA purificado). E viceversa, o DNA em amostras complexas (por exemplo, lisados brutos, fluidos corporais, biópsias congeladas) só pode ser convertido em extensão bastante pequena, se o for.

No momento, não existem métodos disponíveis que monitorem ativamente o desempenho e progressão da conversão de DNA mediada por bissulfito. Entretanto, a provisão desse método auxiliaria a determinar com precisão o ponto final (ou seja, a conclusão de 100%) de cada reação individual, permitindo assim mudar de um protocolo generalizado para condições de reação específicas por amostra. Tempos de incubação desnecessários e de calor excessivo poderíam ser evitados, melhorando assim a qualidade do DNA.

Portanto, permanece uma contínua necessidade de um método que permita um monitoramento preciso da conversão de DNA mediada por bissulfito superando as limitações acima. Em particular, há uma necessidade de um método correspondente, habilitando o planejamento de condições de reação individualizadas para cada amostra de DNA analisada, melhorando assim, os resultados de análises de metilação diferencial de DNA.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

É um objetivo da presente invenção prover abordagens originais para monitorar a progressão da conversão de DNA mediada por bissulfito durante a análise de metilação

5/31 do DNA.

Mais especificamente, é um objetivo prover um método que permita a determinação precisa do ponto final da conversão.

Ademais, é um objetivo prover um método que permita um controle preciso, assim como a combinação das condições de reação aplicadas aos requisitos específicos de uma amostra de DNA empregada, resultando assim em uma melhoria global da qualidade do DNA obtido.

Esses objetivos, assim como outros, que se tornarão evidentes a partir da descrição a seguir, são realizados pelo assunto em questão das reivindicações independentes. Algumas das realizações preferidas da presente invenção são definidas pelo assunto em questão das reivindicações dependentes.

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para monitorar a progressão da conversão de DNA mediada por bissulfito durante a análise de metilação, compreendendo:

(a) prover uma amostra de DNA a ser analisada e pelo menos uma molécula repórter de DNA, em que pelo menos uma molécula repórter de DNA compreenda:

(i) em sua sequência nucleotídica pelo menos um resíduo de citosina não metilada; e (ii) pelo menos um marcador;

e em que a amostra de DNA e pelo menos uma molécula repórter de DNA são providas em compartimentos de reação espacialmente separados que estão em conexão por fluido entre si;

(b) adicionar um sal de bissulfito aos compartimentos de reação espacialmente separados, assim mediando a conversão dos resíduos de citosina não metilada compreendidos nas sequências nucleotídicas da amostra de DNA e pelo menos uma molécula repórter de DNA em resíduos de

6/31 uridina;

(c) adicionar uma uracil-DNA-glicosilase a pelo menos uma molécula repórter de DNA, mediando assim a remoção das bases uracila obtidas na etapa (b) a partir da estrutura principal do DNA;

(d) a fragmentação do DNA obtido na etapa (c) por tratamento térmico; e (e) detectar pelo menos um marcador liberado de pelo menos uma molécula repórter de DNA sintética durante a etapa (d).

Em uma realização, o método compreende adicionalmente:

(f) comparar os resultados obtidos em (e) com um valor de referência.

Em outra realização, a etapa de detecção é repetida pelo menos uma vez dentro de um determinado período de tempo.

Preferivelmente, os resultados obtidos na etapa (e) são usados para controlar a progressão da reação de acordo com a etapa (b).

Em uma realização preferida, pelo menos uma molécula repórter de DNA é um oligonucleotídeo sintético. Em realizações preferidas específicas, pelo menos uma molécula repórter de DNA sintético é imobilizada em um suporte.

Em outra realização preferida, a uracil-DNAglicosilase é termoestável.

Em uma realização específica, as etapas (c), (d) e (e) são realizadas no mesmo compartimento de reação empregado para prover pelo menos uma molécula repórter de DNA. Em uma realização alternativa, qualquer uma ou mais das etapas (c), (d) e (e) são realizadas em pelo menos um compartimento de reação espacialmente separado adicional que está em conexão por fluido com o compartimento de reação empregado para prover pelo menos uma molécula repórter de DNA.

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Em uma realização específica adicional, pelo menos um, e preferivelmente todos os compartimentos de reação são providos com uma ou mais unidades de controle de temperatura para controlar e regular a temperatura dentro do(s) compartimento(s) de reação.

Em uma realização preferida, a separação espacial entre compartimentos de reação é realizada por meio de uma membrana semipermeável, preferivelmente uma membrana de exclusão por tamanho ou uma membrana de microdiálise.

Em uma realização preferida adicional, pelo menos dois compartimentos de reação espacialmente separados em conexão por fluido entre si são integrados em um dispositivo sensor, preferivelmente um dispositivo sensor contínuo.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de um método, como definido neste documento para analisar o estado de metilação de uma amostra de DNA. Preferivelmente, a análise do estado de metilação do DNA é realizada para o diagnóstico de câncer.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Fig. 1 representa esquematicamente o esquema geral de reação de três etapas para a conversão mediada por bissulfito de citosina (esquerda) em uracila (direita). A citosina é sulfonada em citosina-bissulfito em condições ligeiramente ácidas. A desaminação hidrolítica de uracilbissulfito ocorre espontaneamente. O último é, em seguida, dessulfonado em uracila em condições básicas.

A Fig. 2 representa esquematicamente a reação de uracil-DNA-glicosilase (UNG) nos resíduos de uridina em um trecho de DNA. Resíduos de uridina apenas podem ser encontrados no DNA se a citosina for desaminada a uracila, levando a mutações no DNA. A UNG remove bases uracila da estrutura principal de açúcar-fosfato do DNA. Embora a estrutura principal do DNA permaneça intacta, os sítios

8/31 abásicos resultantes são suscetíveis à divagem hidrolítica em temperaturas elevadas.

A Fig. 3 representa esquematicamente o princípio do método de acordo com a presente invenção. É provida pelo menos uma molécula repórter de DNA marcado compreendendo em sua sequência nucleotídica resíduos de citosina não metilada que são convertidos em resíduos de uridina por meios da adição de um sal de bissulfato (1.). O tratamento do DNA com UNG resulta na remoção das bases uracila da estrutura principal do DNA (2.), assim tornando-a suscetível à fragmentação induzida por calor nestes sítios abásicos (3.). Os marcadores liberados de pelo menos uma molécula repórter de DNA são opcionalmente separados (4.) e detectados por um método apropriado de análise.

A Fig. 4 representa uma representação esquemática de uma realização do método de acordo com a presente invenção realizado em um dispositivo sensor exemplar que possui pelo menos cinco compartimentos de reação separados espacialmente em conexão por fluido entre si. Uma descrição detalhada desta realização é dada no exemplo 1.

A Fig. 5 representa esquematicamente a coleção de pontos de dados discretos usando frações de moléculas repórteres de DNA imobilizadas em um suporte sólido (isto é, a superfície de microesferas) em um dispositivo sensor exemplar que possui pelo menos dois compartimentos de reação espacialmente separados em conexão por fluido entre si. Os Painéis A-C ilustram uma série de tempo esquemática da liberação fracionária. O Painel D representa uma possível plotagem para determinar a eficiência da conversão de DNA. Detalhes são dados no exemplo 3.

A Fig. 6 representa uma representação esquemática de outra realização do método de acordo com a presente invenção realizado em um dispositivo sensor exemplar que

9/31 possui pelo menos dois compartimentos de reação separados em conexão por fluido entre si. As moléculas repórteres de DNA empregadas são imobilizadas sobre a superfície de um dos compartimentos de reação. O Painel A ilustra a conversão mediada por bissulfito da amostra de DNA e as moléculas repórteres de DNA. O Painel B mostra a adição de UNG a partir de um reservatório à temperatura e condições de tampão adequadas. O Painel C mostra a fragmentação induzida por calor das moléculas repórteres de DNA convertido. Uma descrição detalhada desta realização é dada no exemplo 4.

A Fig. 7 representa uma representação esquemática de uma realização adicional do método de acordo com a presente invenção realizado em um dispositivo sensor exemplar que possui pelo menos dois compartimentos de reação separados em conexão por fluido entre si. A enzima UNG usada é termoestável e, portanto, pode ser provida com pelo menos uma molécula repórter de DNA que esteja imobilizada na superfície de um dos compartimentos de reação. Uma descrição detalhada desta realização é dada no exemplo 5.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A presente invenção baseia-se na descoberta inesperada de que, combinando a reação da enzima uracil-DNAglicosilase (UNG) com pelo menos uma molécula repórter de DNA marcado, a molécula repórter compreendendo pelo menos um resíduo de citosina não metilada em sua sequência, pode ser estabelecido um método versátil, preciso e eficiente para monitorar a progressão da conversão de DNA mediada por bissulfito durante a análise de metilação de DNA.

A presente invenção ilustrativamente descrita a seguir pode adequadamente ser praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não especificamente divulgados neste documento.

A presente invenção será descrita com relação às

10/31 realizações particulares e com referência a determinados desenhos, mas a invenção não é limitada a eles, mas apenas pelas reivindicações. Os desenhos descritos são apenas esquemáticos e devem ser considerados não limitantes.

Quando o termo compreendendo for usado na presente descrição e reivindicações, ele não exclui outros elementos ou etapas. Para efeitos da presente invenção, o termo consistindo em é considerado como sendo uma realização preferida do termo compreendendo. Se doravante um grupo é definido para compreender pelo menos certo número de realizações, isto também deve ser como divulgação do grupo, que preferivelmente consiste apenas nestas realizações .

Quando um artigo indefinido ou definido é usado quando houver referência a um substantivo no singular, por exemplo, um ou uma, o(a), isso inclui um plural desse substantivo que a menos que algo mais seja especificamente indicado.

O termo cerca de no contexto da presente invenção indica um intervalo de exatidão que o técnico no assunto compreenderá como adicionalmente garantindo o efeito técnico da característica em questão. O termo tipicamente indica o desvio do valor numérico indicado em ± 10% e preferivelmente ± 5%.

	Ademais,	os	termos primeiro,	segundo,	terceiro,
(a) ,	(b), (c)	e	semelhantes na	descrição	e nas

reivindicações, são usados para distinguir entre elementos similares e não necessariamente para descrever uma ordem sequencial ou cronológica. Deve ser entendido que os termos tão usados são intercambiáveis em circunstâncias apropriadas e que as realizações da invenção aqui descritas neste documento são capazes de funcionar em outras sequências foras as descritas ou ilustradas neste documento.

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Outras definições do termo serão dadas a seguir no contexto das quais os termos são usados.

Os seguintes termos ou definições são providos exclusivamente para auxiliar na compreensão da invenção. Essas definições não devem ser interpretadas para ter um escopo menor do que o compreendido por um técnico ordinário no assunto.

(i) em sua sequência nucleotidica pelo menos um residue de citosina não metilada; e (ii) pelo menos um marcador;

(b) adicionar um sal de bissulfito aos compartimentos de reação espacialmente separados, assim mediando a conversão dos residues de citosina não metilada compreendidos nas sequências nucleotidicas da amostra de DNA e pelo menos uma molécula repórter de DNA em residues de uridina;

(d) a fragmentação do DNA obtido na etapa (c) por tratamento térmico; e

12/31 (e) detectar pelo menos um marcador liberado de pelo menos uma molécula repórter de DNA sintética durante a etapa (d).

O termo amostra de DNA, como utilizado neste documento, indica qualquer amostra que compreenda uma ou mais moléculas de DNA, cujo estado de metilação diferencial esteja para ser analisado uma vez que os resíduos de citosina não metilada compreendidos em suas sequências nucleotídicas sejam convertidos em resíduos de uridina. As moléculas de DNA podem ser compostas de ocorrência natural ou sintéticas (por exemplo, geradas por meio da tecnologia do DNA recombinante ou por síntese química) e podem ser de fita simples ou dupla fita. As moléculas de DNA podem ter qualquer comprimento. Tipicamente, o comprimento varia entre 10 bp e 100000 bp, preferivelmente entre 100 bp e 10000 bp e particularmente preferivelmente entre 500 bp e 5000 bp.

As moléculas de DNA compreendidas na amostra de DNA podem estar presentes na forma purificada (por exemplo, providas em uma solução-tampão adequada, como TE ou PBS conhecida na técnica) ou pode ser incluída em uma solução de amostra não purificada, parcialmente purificada ou enriquecida. Exemplos de tais amostras não purificadas incluem lisados celulares brutos, fluidos corporais (por exemplo, sangue, soro, saliva e urina), tecidos solubilizados e semelhantes.

Em algumas realizações, o método de acordo com a presente invenção compreende a purificação do DNA presente em tal amostra não purificada. A purificação é tipicamente realizada após a conclusão da conversão de DNA mediada por bissulfito. Métodos e dispositivos correspondentes para purificar DNA (opcionalmente como parte integrante de um sistema automatizado ou plataforma de trabalho) são bem conhecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis em

13/31 vários fornecedores.

O termo molécula repórter de DNA, como usado neste documento, refere-se a uma molécula de DNA que compreende em sua sequência nucleotídica pelo menos um resíduo de citosina não metilada e pelo menos um marcador que é usado como substrato real para monitorar a conversão de DNA mediada por bissulfito resultando na liberação de um marcador detectável. O método da invenção é realizado pelo menos com uma molécula repórter de DNA, isto é, com uma ou mais dessas moléculas. No caso, mais de uma molécula repórter de DNA são empregadas, essas tipicamente são do mesmo tipo (ou seja, possuem a mesma sequência de ácidos nucleicos e/ou marcadores). Entretanto, também pode ser possível utilizar moléculas repórteres de DNA de tipos diferentes (ou seja, possuindo diferentes sequências de ácidos nucleicos e/ou marcadores).

Em geral, as moléculas repórteres de DNA usadas na presente invenção são moléculas de ácidos nucleicos com um comprimento de 10 a 150 nucleotídeos, por exemplo, 15 a 80 nucleotideos, 15 a 60 nucleotídeos ou 15 a 40 nucleotídeos. As moléculas repórteres de DNA podem ser moléculas de ocorrência natural ou, preferivelmente, aquelas sintéticas (por exemplo, geradas por meio da tecnologia do DNA recombinante ou síntese química). Preferivelmente, as moléculas repórteres usadas na invenção são moléculas de ácido nucleico de fita simples. Entretanto, também podem ser empregadas moléculas de dupla fita.

Em uma realização preferida, pelo menos uma molécula repórter de DNA é um oligonucleotídeo sintético (ou seja, de fita simples).

Para realizar a reação de detecção, a molécula repórter de DNA compreende um ou mais marcadores detectáveis. O termo marcador, como usado neste documento, refere-se a

14/31 qualquer composto ou unidade que compreenda uma ou mais substâncias químicas ou enzimas apropriadas, que direta ou indiretamente geram um composto ou sinal detectável em uma reação química, física ou enzimática. Como utilizado neste documento, o termo deve ser entendido por incluir tanto marcadores detectáveis, como quaisquer compostos acoplados a um ou mais desses marcadores detectáveis. Ademais, dentro do escopo da presente invenção, unidades que interferem com a geração de um sinal detectável por um marcador (por exemplo, um supressor (quencher) que sequestra as emissões que resultaram da excitação do fluoróforo, enquanto o supressor e o fluoróforo estiverem em estreita proximidade entre si) também pertencem aos marcadores. Os marcadores podem ser incorporados ou ligados às moléculas repórteres, por exemplo, em forma de ribonucleotídeos, desoxinucleotídeos ou didesoxinucleotídeos modificados e/ou marcados. Os marcadores podem ser ligados à extremidade-5' e/ou à extremidade-3' e/ou qualquer nucleotídeo interno dentro da sequência de uma molécula repórter de DNA.

Marcadores detectáveis que podem ser usados de acordo com a invenção incluem qualquer composto, que direta ou indiretamente gere um composto detectável ou sinal em uma reação química, física ou enzimática. A marcação pode ser alcançada por métodos bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Sambrook, J. et al. (1989) Molecular, Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; e Lottspeich, F., and Zorbas

H. (1998) Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlim, Alemanha). Os marcadores podem ser selecionados, entre outros, de marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos, marcadores coloridos, marcadores cromogênicos, marcadores luminescentes, marcadores radioativos, haptenos, biotina, complexos metálicos, metais e

15/31 ouro coloidal. Todos estes tipos de marcadores são bem estabelecidos na técnica. Um exemplo de uma reação física que é mediada por tais marcadores é a emissão de fluorescência ou fosforescência após irradiação ou excitação ou a emissão de raios-X quando se usa um marcador radioativo. Fosfatase alcalina, peroxidase de rábano selvagem, β-galactosidase e βlactamase são exemplos de marcadores enzimáticos, que catalisam a formação de produtos de reação cromogênicos, e que podem ser usados na invenção. Em realizações preferidas específicas da invenção, os marcadores detectáveis são marcadores fluorescentes. Numerosos marcadores fluorescentes são bem estabelecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis em diferentes fornecedores (veja, por exemplo, The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 10th ed. (2006), Molecular Probes, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EUA).

Para a detecção de tais marcadores, o dispositivo utilizado para realizar o método da invenção pode compreender um sistema de detecção adequado para determinar valores indicativos da presença e/ou quantidade dos marcadores. A seleção de um sistema de detecção adequado depende de diversos parâmetros tais como o tipo de marcadores utilizados para a detecção ou o tipo de análise realizada. Vários sistemas de detecção óptica e não óptica são bem estabelecidos na técnica. Por exemplo, métodos de detecção de fluorescência que podem ser usados na invenção incluem, entre outros, transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET- fluorescence resonance energy transfer, transferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET- bioluminescence resonance energy transfer) e espectroscopia de correlação de fluorescência.

Em realizações específicas, a detecção é realizada usando FRET ou BRET, que se baseiam na respectiva formação de

16/31 pares de supressores de fluorescência ou bioluminescência. 0 uso de FRET é também descrito, por exemplo, em Liu, B. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102, 589-593. O uso de BRET é detalhado, por exemplo, em Xu, Y. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96, 151-156.

Pelo menos uma molécula repórter de DNA pode ser provida na forma não ligada (ou seja, moléculas livres em solução). Em realizações especificas, as moléculas repórteres de DNA são imobilizadas em um suporte (ou seja, ligadas a uma matriz). Tipicamente, o suporte é um membro sólido, por exemplo, uma superfície sólida. A ligação das moléculas repórteres de DNA ao suporte pode ser obtida por qualquer interação direta (por exemplo, através de um grupo-âncora compreendido na molécula repórter) ou indireta (por exemplo, através de moléculas de captura mediando a ligação) das moléculas repórteres de DNA com um determinado membro de suporte. Essa interação pode ser uma ligação covalente ou não covalente e geralmente é reversível. Por exemplo, a química da carbodi-imida pode ser usada para ligar covalentemente as moléculas repórteres de DNA às superfícies ativadas. Um ligante de amina adequado na extremidade-5' ou -3' da molécula repórter de DNA é então provido para esse fim. Várias outras químicas estabelecidas para alcançar a imobilização das moléculas repórteres de DNA são conhecidas na técnica.

Moléculas repórteres de DNA podem ser imobilizadas em um suporte móvel, preferivelmente microesferas como microesferas magnéticas, microesferas de poliestireno e microesferas de látex. Esse membro de suporte móvel pode ser transferido no fluxo de fluido do dispositivo sensor utilizado para realizar o método.

Por outro lado, também é possível imobilizar diretamente as moléculas repórteres de DNA na superfície

17/31 interna de um compartimento de reação ou, por exemplo, em uma lâmina de microscopia, wafer ou materiais cerâmicos que são organizados em um compartimento de reação, mas não podem ser transferidos livremente.

Em algumas realizações, os resultados da reação de detecção são comparados com um valor de referência, por exemplo, o valor obtido com uma quantidade fixa de marcador (por exemplo, provido como um controle interno) ou com dados da literatura.

Preferivelmente, a etapa de detecção é repetida pelo menos uma vez dentro de um determinado periodo de tempo, por exemplo, 30 min, 60 min, 120 min, 6h, 12h, 24h, 48h e assim por diante. Várias repetições são possíveis, por exemplo, 2, 5, 8, 10, 15, 20, 30 e assim por diante. Repetições podem ser realizadas em intervalos de tempo fixos ao longo do período de tempo determinado. Entretanto, os intervalos de tempo entre as repetições também podem variar, por exemplo, tornarem-se mais curtos conforme a conversão de DNA mediada por bissulfito alcança a completude a fim de determinar precisamente o ponto final da reação. Em outras palavras, os resultados obtidos durante a detecção são usados para controlar a progressão da conversão de DNA. Se a conversão mediada por bissulfito de pelo menos uma molécula repórter de DNA for concluída, considera-se que o mesmo se aplica à amostra de DNA.

Dentro da presente invenção, a amostra de DNA e pelo menos uma molécula repórter de DNA são providas em compartimentos de reação espacialmente separados que estão em conexão por fluido entre si. Ou seja, a amostra de DNA é provida em um primeiro compartimento de reação, e pelo menos uma molécula repórter de DNA é provida em um segundo compartimento de reação, os dois compartimentos representando entidades separadas. O termo compartimento de reação

18/31 (também dito como câmara de reação), como usado neste documento, indica qualquer estrutura para acomodar amostras liquidas. Várias configurações dessas estruturas (por exemplo, com um formato tridimensional cuboide ou cilíndrico) são bem conhecidas na técnica.

Entretanto, os compartimentos de reação não estão independentes, mas em comunicação por fluido entre si, isto é, pelo menos uma parte dos componentes pode ser transferida no fluxo de fluido entre os compartimentos. Isso pode ser feito, por exemplo, por meio de conexão dos compartimentos de reação através de canais microfluídicos. Em realizações preferidas, a separação espacial entre os compartimentos de reação é realizada por meio de uma membrana semipermeável, preferivelmente uma membrana de exclusão por tamanho ou uma membrana de microdiálise. Tal membrana semipermeável permite que pequenas moléculas passem a barreira, enquanto as maiores (ou seja, que excedem um limite de tamanho determinado dependendo das propriedades da membrana) são retidas.

A adição de um sal de bissulfito (por exemplo, bissulfito de sódio, mas qualquer outro sal é adequado também) aos compartimentos de reação espacialmente separados para mediar a conversão dos resíduos de citosina não metilada compreendidos nas sequências nucleotídicas da amostra de DNA e em pelo menos uma molécula repórter de DNA em resíduos de uridina é realizada de acordo com protocolos padrões conhecidos na técnica. Os reagentes também estão comercialmente disponíveis em diferentes fornecedores. O esquema geral de reação é representado esquematicamente na Fig. 1. A conversão de DNA tipicamente é realizada a uma temperatura de reação entre 40-70°C, preferivelmente entre 55-65°, e particularmente, preferivelmente a 60°C.O período de incubação pode variar (dependendo, entre outras coisas, da amostra a ser analisada) entre vários minutos a várias horas

19/31 (por exemplo, durante a noite) ou mesmo mais longo.

A conversão do DNA da amostra de DNA e pelo menos de uma molécula repórter de DNA ocorre em paralelo (ou seja, nas mesmas condições experimentais) em compartimentos de reação espacialmente separados. Os respectivos reagentes necessários podem ser adicionados a partir de reservatórios particulares a cada um e/ou ambos os compartimentos de reação em que as respectivas moléculas de DNA são providas.

A fim de ajustar uma particular temperatura de reação, pelo menos qualquer um, e preferivelmente todos os compartimentos de reação empregados para a execução da presente invenção são providos com uma ou mais unidades de controle de temperatura para controlar e regular a temperatura dentro do(s) compartimento (s) de reação. Tal unidade de controle de temperatura pode compreender um ou mais elementos de aquecimento e/ou resfriamento separados, que podem entrar em contato diretamente com um ou mais compartimentos de reação do dispositivo utilizado. Vários sistemas de controle de calor são bem conhecidos na técnica e estão disponíveis em diferentes fornecedores.

A enzima uracil-DNA-glicosilase (UNG) é comumente usada em reações de PCR para evitar uma transferência de produtos de PCR potencialmente contaminantes de reações anteriores. Está comercialmente disponível em muitos fornecedores e atua em DNA de fita simples, assim como no de dupla fita. A UNG é parte do aparato de reparo de DNA de células, com a tarefa de remoção de resíduos de uridina. A uridina pode apenas ser encontrada no DNA se a citosina for desaminada a uracila, levando a mutações no DNA. A enzima remove as bases uracila da estrutura principal de açúcarfosfato do DNA, uma reação ilustrada esquematicamente na Fig.

2. Esta reação é parte do assim chamado mecanismo de reparo por excisão de bases, neste caso evitando mutações por

20/31 desaminação de citosina no DNA.

Qualquer uracil-DNA-glicosilase conhecida pode ser empregada na presente invenção. A enzima é adicionada a pelo menos uma molécula repórter de DNA, mas não à amostra de DNA. A reação enzimática (ou seja, a remoção das bases uracila obtidas durante a conversão mediada por bissulfito) a partir da estrutura principal de DNA ocorre em condições de reação padrão estabelecidas dependendo da enzima particular empregada.

Em realizações preferidas, uma enzima UNG termoestável é utilizada, em particular uma enzima UNG derivada de um organismo termofilico. Essas enzimas UNG termoestáveis são conhecidas na técnica (por exemplo, Sartori, A. A. et al (2001) J. Biol. Chem. 276, 29979-29986; Sartori, A. A. et al., (2002) EMBO J. 21, 3182-3191). Elas mantêm uma alta atividade mesmo em temperaturas de mais de 90°C.

A reação enzimática mediada por UNG pode ser realizada no mesmo compartimento de reação em que pelo menos uma molécula repórter de DNA foi provida ou em um compartimento de reação adicional (isto é, terceiro) que está espacialmente separado, mas em comunicação por fluido com aquele em que pelo menos uma molécula repórter de DNA foi provida. Os reagentes necessários podem ser providos a partir de reservatórios específicos em comunicação por fluido com o respectivo compartimento de reação.

As moléculas repórteres de DNA obtidas após o tratamento com UNG adicionalmente possuem uma estrutura principal de DNA intacta, mas um ou mais sítios abásicos onde bases uracila foram removidas. Esses sítios abásicos são suscetíveis à divagem hidrolítica em temperaturas elevadas, por exemplo, temperaturas entre 90°C e 95°C.

Dentro da presente invenção, a fragmentação

21/31 induzida por calor pode realizada por vários períodos de tempo, por exemplo, 10s, 30s, 1 min, 2 min, 5 min, dependendo do tipo e da quantidade de DNA presente. O técnico no assunto está bem consciente de como selecionar o tempo de incubação.

A etapa de fragmentação induzida por calor pode ser realizada no mesmo compartimento de reação em que é provida pelo menos uma molécula repórter de DNA (e em que, opcionalmente, também ocorreu a reação mediada por UNG) ou em outro compartimento de reação espacialmente separado. O último pode ser o mesmo compartimento de reação em que a reação mediada por UNG ocorreu (ou seja, o terceiro) ou um adicional (ou seja, quarto) que é espacialmente separado, mas em comunicação por fluido com o segundo e/ou o terceiro.

Por fim, a etapa de detecção pode ser realizada no mesmo compartimento de reação em que pelo menos uma molécula repórter de DNA é provida (e em que, opcionalmente, também a reação mediada por UNG e a fragmentação induzida por calor ocorreram) ou em outro compartimento de reação espacialmente separado. Último pode ser o terceiro ou o quarto já descritos acima ou pode ser um adicional (ou seja, quinto) que esteja espacialmente separado, mas em comunicação por fluido com o um segundo e/ou o terceiro e/ou o quarto.

O princípio do método de acordo com a presente invenção é resumido esquematicamente na Fig. 3.

Em algumas realizações, pelo menos dois compartimentos de reação espacialmente separados em conexão por fluido entre si são integrados em um dispositivo sensor, preferivelmente um dispositivo sensor contínuo. O dispositivo sensor pode, por sua vez, ser parte integrante de uma plataforma automatizada ou estação de trabalho também incluindo, por exemplo, meios para a purificação de amostra de DNA e/ou análises subsequentes de metilação diferencial (por exemplo, um termociclador para a realização de reações

22/31 de PCR) . Tais plataformas são conhecidas na técnica e estão comercialmente disponíveis.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de um método, como definido neste documento para analisar o estado de metilação de uma amostra de DNA. Em outras palavras, o presente método para monitorar a progressão da conversão de DNA mediada por bissulfito é um pré-requisito para assegurar a precisão e confiabilidade de aplicações a jusante pela provisão de DNA de alta qualidade (isto é, totalmente convertido). Tais aplicações a jusante incluem sequenciamento de bissulfito, análise de conformação de fita simples sensível à metilação (MS-SSCA - methylation-sensitive single-strand conformation analysis), extensão de iniciador de nucleotídeo único sensível à metilação (MS-SnuPE methylation-sensitive single nucleotide primer extension), aplicações de microarranjo {microarray) sensível à metilação, análise de restrição de bissulfito combinado (COBRA combined bisulfite restriction analysis), aplicações de PCR em tempo real sensível à metilação, e semelhantes.

Em realizações preferidas, a análise do estado de metilação do DNA é usada para diagnosticar câncer.

A invenção é descrita adicionalmente pelas figuras e pelos exemplos a seguir, que são exclusivamente para fins de ilustração de realizações específicas desta invenção, e não devem ser interpretadas como limitantes do escopo da invenção de qualquer maneira.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: MONITORAMENTO DE CONVERSÃO DE DNA MEDIADA POR BISSULFITO EM UM DISPOSITIVO SENSOR CONTÍNUO

Nesta realização, o método de acordo com a presente invenção é realizado em um sensor contínuo exemplar que é ilustrado esquematicamente na Fig. 4.

Em um cenário como esse, é desejável que as

23/31 diferentes etapas do método ocorram em diferentes compartimentos de reação espacialmente separados. Esta configuração do dispositivo sensor impede a interferência entre as diferentes etapas do método e incompatibilidades entre os componentes de reação. Por exemplo, a atividade enzimática da uracil-DNA-glicosilase (UNG) pode diminuir significativamente durante a etapa de fragmentação por calor.

O dispositivo sensor mostrado na Fig. 4 tem pelo menos cinco compartimentos de reação espacialmente separados. Em um primeiro compartimento de reação, a amostra de DNA é provida. A amostra de DNA pode ser removida deste compartimento para análises subsequentes do estado de metilação (não mostrado). O primeiro compartimento está conectado a uma quantidade adequada de reservatórios, contendo os componentes necessários para a preparação e a conversão do DNA (por exemplo, a solução de bissulfito).

O primeiro compartimento de reação está localizado imediatamente adjacente a um segundo compartimento de reação em que pelo menos uma molécula repórter de DNA (ou seja, um oligonucleotideo de DNA sintético marcado).

A separação espacial entre os dois compartimentos

de reação	é realizada	de forma	tal que os	reagentes	de
conversão	possam passar,	mas o DNA	da amostra	seja retido	na
primeira	câmara, ou	seja, at	ravés de	uma barreira

semipermeável, por exemplo, por meios de uma membrana de exclusão (filtro) de tamanho. Em outras palavras, os dois compartimentos de reação estão em comunicação por fluido entre si.

A temperatura no primeiro e no segundo compartimento de reação pode ser controlada permitindo o ajuste de condições de reação adequadas (por exemplo, 60°C), empregando um ou mais elementos de aquecimento (e/ou de resfriamento).

24/31

Em um terceiro compartimento de reação, a enzima UNG é provida e a remoção das bases uracila de pelo menos uma molécula repórter de DNA convertido ocorre. A separação espacial entre o segundo e o terceiro compartimento de reação é realizada de tal forma que os componentes de tampão possam ser substituídos ou removidos, por exemplo, por meio de uma membrana de microdiálise, para gerar condições de reação ótimas para a enzima UNG.

Em um quarto compartimento de reação que se situa adjacente a um terceiro, a divagem hidrolítica induzida por calor da molécula repórter de DNA nos sítios abásicos ocorre. A separação espacial entre o terceiro e o quarto compartimento de reação é configurada de tal forma que as moléculas da enzima UNG sejam retidas, mas não as moléculas repórteres de DNA, por exemplo, por meio de uma membrana de exclusão (filtro) de tamanho (semipermeável).

Em um quinto compartimento de reação que se situa adjacente a um quarto, ocorre a detecção dos marcadores (por exemplo, um corante fluorescente) liberados durante a etapa de fragmentação anterior. A separação espacial entre o quarto e o quinto compartimento de reação é configurada de tal forma que os marcadores e as moléculas repórteres de DNA fragmentado possam passar para o quinto compartimento de reação, mas quaisquer moléculas repórteres de DNA intacto sejam retidas no quarto compartimento de reação, por exemplo, por meio de uma membrana de exclusão (filtro) de tamanho (semipermeável).

A quantidade de pelo menos uma molécula repórter de DNA provida no segundo compartimento de reação no início do esquema de reação preferivelmente é tal que a fração que entra na via de reação subsequente pode ser considerada constante ao longo do tempo do ensaio. A quantidade detectada de marcador é então uma medida para a conversão de DNA.

25/31

O sinal gerado pelos marcadores é normalizado para a fração de moléculas repórteres de DNA que entram no terceiro compartimento de reação, por exemplo, determinado por meio de uma medição de UV do teor de ácido nucleico.

A fração de moléculas repórteres de DNA que não são convertidas e, assim, não fragmentadas pela ação combinada de UNG e calor, são redirecionadas para o segundo compartimento de reação. Então, estas moléculas repórteres de DNA entram na reação de conversão novamente. Isso pode ser feito, por exemplo, por meio de uma conexão entre o quarto e o segundo compartimento de reação (estrutura de alça fechada, não mostrada na Fig. 4).

Microfluidos convencionais podem ser utilizados para limitar quantidades de liquido e reagente e para acionar o sistema.

EXEMPLO 2: USO DE MOLÉCULAS REPÓRTERES DE DNA MARCADAS DUAS VEZES

Em outra realização do método de acordo com a invenção, pelo menos uma molécula repórter de DNA (ou seja, um oligonucleotideo sintético) compreende um primeiro e um segundo marcador.

O primeiro marcador é um corante fluorescente que pode ser escolhido de uma variedade de corantes comercialmente disponiveis. O segundo marcador é um supressor adequado para este corante. Em alternativa, a segunda molécula é outro corante fluorescente que forma com o primeiro corante um par doador-aceptor para transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET).

Mediante a fragmentação induzida por calor das moléculas repórteres de DNA, o primeiro corante fluorescente é separado da molécula supressora. Em alternativa, o par doador-aceptor de FRET é separado entre si. Um sinal de fluorescência em seguida já é detectável na etapa de

26/31 fragmentação induzida por calor.

Assim, combinando as etapas de fragmentação e detecção, um dentre pelo menos cinco compartimentos de reação do dispositivo sensor ilustrado na Fig. 4 é dispensável resultando em uma configuração simplificada do dispositivo.

EXEMPLO 3: USO DE MOLÉCULAS REPÓRTERES DE DNA IMOBILIZADAS EM MICROESFERAS

Para algumas aplicações, pode ser preferível gerar apenas alguns pontos de dados, por exemplo, limitar a quantidade de reagentes, consumo de energia, etc. Em um cenário como esse, pelo menos uma molécula repórter de DNA (ou seja, um oligonucleotídeo sintético) compreende um marcador adequado ligado uma extremidade, por exemplo, a extremidade-3', e é imobilizada através de outra extremidade, por exemplo, a extremidade-5', em uma superfície móvel, preferivelmente uma microesfera, como uma microesfera de poliestireno ou uma microesfera magnética.

Em uma realização específica, as microesferas são retidas no segundo compartimento de reação de um dispositivo sensor exemplar e em determinados momentos, uma fração das microesferas pode ser liberada para entrar no(s) compartimento(s) adicional(is).

A coleção de pontos de dados discretos usando frações de moléculas repórteres de DNA imobilizadas em um suporte sólido (isto é, a superfície de microesferas) em um dispositivo sensor exemplar que possui dois compartimentos de reação espacialmente separados é esquematicamente mostrada na Fig. 5. Os Painéis A-C ilustram uma série de tempo esquemática da liberação fracionária. O Painel D representa uma possível plotagem para determinar a eficiência da conversão de DNA.

O uso de moléculas repórteres de DNA imobilizadas em microesferas no segundo compartimento de reação também

27/31 permite a troca de soluções neste compartimento, enquanto as moléculas repórteres de DNA são retidas. O requisito de equilíbrio de tampão entre o segundo e o terceiro compartimento de reação do dispositivo sensor mostrado na Fig. 5 é, portanto, dispensável e pode ser omitido.

Ademais, a liberação fracionária das moléculas repórteres de DNA do segundo compartimento de reação permite um controle mais preciso do número absoluto de moléculas repórteres de DNA transferidas para o(s) compartimento(s) de reação adicional(is) (visto que o número de moléculas repórteres de DNA por microesfera e o número de microesferas por liberação são conhecidos). Isso, por sua vez, facilita o cálculo da razão de moléculas repórteres de DNA não convertido/convertido.

A	restrição	das	microesferas	no	segundo
compartimento	de reação	pode	ser realizada,	por	exemplo,

usando microesferas magnéticas com a aplicação de campos magnéticos ou usando microesferas de poliestireno com campos elétricos AC e forças dieletroforéticas.

EXEMPLO 4; USO DE MOLÉCULAS REPÓRTERES DE DNA IMOBILIZADAS SOBRE A SUPERFÍCIE INTERNA DE UM COMPARTIMENTO DE REAÇÃO

Em uma realização adicional, um dispositivo sensor que compreende um primeiro e um segundo compartimento de reação é empregado para realizar o método da presente invenção. O dispositivo sensor é ilustrado esquematicamente na Fig. 6.

O primeiro compartimento de reação (em que a amostra de DNA é provida) está conectado a um reservatório contendo os reagentes necessários para a conversão de bissulfito.

O segundo compartimento de reação é conectado a pelo menos um reservatório contendo a enzima UNG em um tampão

28/31 adequado. Pelo menos uma molécula repórter de DNA (ou seja, um oligonucleotideo sintético marcado) é imobilizado na superfície interna do segundo compartimento de reação, por exemplo, usando química de carbodi-imida e um amino-ligante em uma extremidade das moléculas repórteres de DNA. A outra extremidade da molécula repórter de DNA é modificada com um marcador adequado, por exemplo, um corante fluorescente.

O primeiro e o segundo compartimento de reação são espacialmente separados, mas em comunicação por fluido entre si, tal que a troca de tampão e/ou reagente de conversão seja permitida, mas a amostra de DNA e enzimas não possam passar, por exemplo, por meio de uma membrana de filtro de exclusão por tamanho semipermeável.

A temperatura em ambos os compartimentos de reação pode ser ajustada a um nível que permita uma eficiente conversão de DNA mediada por bissulfito. Entretanto, a temperatura no segundo compartimento de reação pode ser regulada independentemente daquela no primeiro compartimento de reação, por exemplo, usando um segundo elemento de aquecimento (e/ou de resfriamento).

Na primeira etapa do método, as condições de tampão e a temperatura em ambos os compartimentos de reação são adequadas para converter a amostra de DNA e as moléculas repórteres de DNA imobilizadas (Fig. 6A).

Na segunda etapa, a temperatura no segundo compartimento de reação é reduzida, permitindo que a reação da UNG ocorra, por exemplo, a 37°C. Em seguida, a enzima UNG a partir do reservatório é aplicada ao segundo compartimento (FIG. 6B).

Na terceira etapa, a temperatura no segundo compartimento de reação é elevada, por exemplo, para 95°C, a fim de fragmentar as moléculas repórteres de DNA nos sítios abásicos (FIG. 6C) . Os marcadores liberados das moléculas

29/31 repórteres de DNA fragmentado são em seguida medidos através de um detector apropriado. Em alternativa, os marcadores das moléculas repórteres de DNA adicionalmente intactas na superfície podem ser medidos, por exemplo, usando um marcador de fluorescência com TIRF, um scanner confocal, etc.

Após o tratamento térmico no segundo compartimento de reação, a temperatura é reduzida novamente para a temperatura do primeiro compartimento de reação para continuar a reação de conversão. Em determinados momentos, o protocolo é repetido, resultando em uma plotagem discreta que expressa a eficiência de conversão ao longo do tempo (similar à FIG. 6D).

Durante o tratamento com UNG, fragmentação induzida por calor e detecção de marcador no segundo compartimento, a temperatura no primeiro compartimento é tipicamente reduzida para parar a conversão da amostra de DNA. Isso permite uma melhor correlação das reações de conversão obtidas nos dois compartimentos. Assim, nesta realização, medições descontínuas são tomadas e é necessário um controle de temperatura mais sofisticado, mas a complexidade e o número de compartimentos necessários é reduzida.

EXEMPLO 5: USO DE UMA URACIL-DNA-GLICOSILASE (UNG) TERMOESTÁVEL

Em outra realização do método de acordo com a presente invenção, é usada uma enzima UNG termoestável, que permanece ativa durante a fragmentação por calor. Preferivelmente, entretanto, são usadas enzimas UNG, que foram derivadas de organismos termofílicos. Essas enzimas UNG termoestáveis são conhecidas na técnica (por exemplo, Sartori, A. A. et al (2001) J. Biol. Chem. 276, 29979-29986; Sartori, A. A. et al., (2002) EMBO J. 21, 3182-3191). Elas mantêm uma alta atividade mesmo em temperaturas de mais de 90°C.A etapa de fragmentação no dispositivo sensor é

30/31 realizada em temperaturas entre 90°C e 95°C.Assim, enzimas UNG termoestáveis permanecem ativas durante e após a fragmentação induzida por calor.

Nesta realização, a enzima UNG é provida no segundo compartimento de reação com as moléculas repórteres de DNA (ou seja, um oligonucleotideo sintético marcado) que são imobilizadas na superfície interna do compartimento. Um dispositivo sensor de dois compartimentos sem reservatório de enzima é então suficiente, com um protocolo de temperatura de duas etapas no segundo compartimento de reação. Ambos os compartimentos são conectados novamente por meio de uma membrana de filtro de exclusão por tamanho semipermeável a fim de evitar a troca de enzima e amostra de DNA entre os compartimentos de reação. Uma ilustração do dispositivo sensor empregado é dada na Fig. 7. A detecção pode ser realizada como descrito nos exemplos 1-5 acima.

EXEMPLO 6: PURIFICAÇÃO DE AMOSTRA DE DNA.

A fim de analisar adicionalmente a amostra de DNA após a conversão mediada por bissulfito, por exemplo, por PCR especifica para metilação ou qualquer outra técnica adequada, a amostra de DNA tem de ser provida na forma purificada.

Assim, por exemplo, meios e reagentes para a ligação do DNA a uma membrana de silica com um tampão de ligação adequado (por exemplo, com um teor elevado de um sal de caotrópico) , para a lavagem do DNA ligado com um tampão adequado (por exemplo, com um teor elevado de etanol), e para a eluição do DNA com um tampão adequado (por exemplo, água ou uma solução tamponada dela) podem ser incluídos no método de acordo com a presente invenção. Isto pode ser conseguido, provendo uma saída anexada ao primeiro compartimento de reação, a saída contendo a dita membrana de silica e reservatórios para as respectivas soluções de reagente.

A presente invenção ilustrativamente descrita neste

31/31 documento pode adequadamente ser praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não especificamente divulgados neste documento. Assim, por exemplo, os termos compreendendo, incluindo, contendo, etc. devem ser lidos de modo expansivo e sem limitação. Adicionalmente, os termos e expressões empregados neste documento foram usados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou suas partes, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis no escopo da invenção reivindicada.

Assim, deve ser entendido que embora a presente invenção tenha sido divulgada especificamente por realizações e características opcionais, modificações e variações das invenções realizadas neste podem ser recorridas pelos técnicos no assunto, e que tais modificações e variações são consideradas como estando dentro do escopo desta invenção.

A invenção foi descrita ampla e genericamente neste documento. Cada uma das mais estreitas espécies e agrupamentos subgenéricos que caem dentro da divulgação genérica também fazem parte da invenção. Isso inclui a descrição genérica da invenção com uma ressalva ou limitação negativa que remove qualquer assunto em questão a partir do gênero, independentemente de se o material excisado é especificamente mencionado neste documento ou não.

Outras realizações estão dentro das seguintes reivindicações. Além disso, quando as características ou aspectos da invenção forem descritos em termos de grupos de Markush, os técnicos no assunto reconhecerão que a invenção é também assim descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo de Markush.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO PARA MONITORAR A CONVERSÃO DE DNA MEDIADA POR BISSULFITO DURANTE A ANÁLISE DE METILAÇÃO DO DNA, caracterizado por compreender:

(a) prover uma amostra de DNA a ser analisada e pelo menos uma molécula repórter de DNA, em que pelo menos uma molécula repórter de DNA compreenda:

(i) em sua sequência nucleotidica pelo menos um resíduo de citosina não metilada; e (ii) pelo menos um marcador;

e em que a amostra de DNA e pelo menos uma molécula repórter de DNA sejam providas em compartimentos de reação espacialmente separados que estejam em conexão por fluido entre si;

(b) adicionar um sal de bissulfito aos compartimentos de reação espacialmente separados, assim mediando a conversão dos residues de citosina não metilada compreendidos nas sequências nucleotidicas da amostra de DNA e pelo menos uma molécula repórter de DNA em residues de uridina;

(c) adicionar uma uracil-DNA-glicosilase a pelo menos uma molécula repórter de DNA, mediando assim a remoção das bases uracila obtidas na etapa (b) a partir da estrutura principal do DNA;

(d) a fragmentação do DNA obtido na etapa (c) por tratamento térmico; e (e) detectar pelo menos um marcador liberado de pelo menos uma molécula repórter de DNA sintética durante a etapa (d).
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente:

(f) comparar os resultados obtidos em (e) com um valor de referência.

2/3
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado em que a etapa de detecção é repetida pelo menos uma vez dentro de um determinado período de tempo.
4 . MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado em que os resultados obtidos na etapa (e) são usados para controlar a progressão da reação de acordo com a etapa (b).
5. MÉTODO, de acordo qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado em que pelo menos uma molécula repórter de DNA é um oligonucleotídeo sintético.
6. MÉTODO, de acordo qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado em que pelo menos uma molécula repórter de DNA é imobilizada e um suporte.
7 . MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado em que a uracil-DNAglicosilase é termoestável.
8 . MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado em que as etapas (c), (d) e (e) são realizadas no mesmo compartimento de reação empregado para prover pelo menos uma molécula repórter de DNA.
9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado em que qualquer uma ou mais das etapas (c) , (d) e (e) são realizadas em pelo menos um compartimento de reação espacialmente separado adicional que está em conexão por fluido com o compartimento de reação empregado para prover pelo menos uma molécula repórter de DNA.
10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado em que pelo menos um, e preferivelmente todos os compartimentos de reação são providos com uma ou mais unidades de controle de temperatura para controlar e regular a temperatura dentro do(s)

3/3 compartimento (s) de reação.
11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado em que a separação espacial entre os compartimentos de reação é realizada por meio de uma membrana semipermeável, preferivelmente uma membrana de exclusão por tamanho ou uma membrana de microdiálise.
12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado em que pelo menos dois compartimentos de reação espacialmente separados em conexão por fluido entre si são integrados em um dispositivo sensor, preferivelmente um dispositivo sensor continuo.
13. USO DE UM MÉTODO, tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado em que ocorre para analisar, ou ao analisar, o estado de metilação de uma amostra de DNA.
14. USO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado em que a análise do estado de metilação do DNA é realizada para o diagnóstico de câncer.
15. USO DE UMA MOLÉCULA REPÓRTER, tal como definida na reivindicação 1, caracterizado por ocorrer no processo de análise do estado de metilação do DNA.