BR102022009653A2 - Conjunto de sondas, sonda, kit, composição, métodos para detecção de um gene de fusão e/ou salto de éxon em uma amostra e para diagnóstico ou monitoramento de um câncer, e, uso de um conjunto de sondas ou de pelo menos uma sonda - Google Patents

Conjunto de sondas, sonda, kit, composição, métodos para detecção de um gene de fusão e/ou salto de éxon em uma amostra e para diagnóstico ou monitoramento de um câncer, e, uso de um conjunto de sondas ou de pelo menos uma sonda Download PDF

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Abstract

A presente invenção é dirigida às sondas para detector genes de fusão conhecidos e desconhecidos, a métodos relacionados para detecção de genes de fusão, usos e kits relacionados às mesmas. Em particular, a invenção refere-se a métodos para diagnóstico e monitoramento de um câncer.

Description

CONJUNTO DE SONDAS, SONDA, KIT, COMPOSIÇÃO, MÉTODOS PARA DETECÇÃO DE UM GENE DE FUSÃO E/OU SALTO DE ÉXON EM UMA AMOSTRA E PARA DIAGNÓSTICO OU MONITORAMENTO DE UM CÂNCER, E, USO DE UM CONJUNTO DE SONDAS OU DE PELO MENOS UMA SONDA Campo da invenção
[001] A presente invenção refere-se ao campo da detecção de genes de fusão e, em particular, às sondas para detectar eventos de fusão gênica, a métodos de detecção de genes de fusão, usos e kits relacionados às mesmas. Em particular, a presente invenção refere-se a um método de diagnóstico e/ou monitorização de um câncer.
Fundamentos da invenção
[002] Os genes de fusão são importantes biomarcadores clínicos que orientam o diagnóstico, informam o prognóstico e dão apoio às decisões de tratamento. Esses genes têm origem em rearranjos cromossômicos, como translocações, inversões e deleções, e podem levar a RNAs e proteínas quiméricos. Os genes de fusão normalmente compreendem dois parceiros: um parceiro primário de fusão, que pode ser, por exemplo, um gene quinase, e um parceiro secundário de fusão.
[003] Os genes de fusão podem ser detectados por diversos ensaios moleculares como hibridização fluorescente in situ (FISH), reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR), imuno-histoquímica (IHC) e técnicas com base em sequenciamento de nova geração (NGS).
[004] FISH baseia-se em sondas de ácido nucleico contendo fluoróforos que hibridizam com sequências específicas de ácidos nucleicos permitindo a visualização por microscopia de fluorescência. RT-PCR utiliza conjuntos específicos de primers (iniciadores) projetados para atingir e amplificar transcritos conhecidos do gene de fusão por PCR. IHC detecta fusões com o uso de anticorpos que se ligam especificamente a proteínas de fusão e as detecta por microscopia. Apesar de amplamente utilizadas na clínica, essas técnicas distinguem-se por seu baixo rendimento e por se limitarem à detecção de eventos de fusão entre parceiros conhecidos.
[005] Em contraste, as técnicas baseadas em NGS permitem detecção abrangente e paralela de múltiplos eventos de fusão gênica em múltiplos pacientes. Existem poucas variações dessa técnica, cada uma baseada em um método diferente para preparação de bibliotecas. PCR multiplex (mPCR) é uma versão RT-PCR com rendimento maior, na qual pools de primers de genes específicos são utilizados para detectar diferentes genes de fusão, e o produto da PCR é então convertido em uma biblioteca de NGS que é sequenciada. Essa técnica tem como vantagem ser relativamente rápida, mas requer que ambos os parceiros de fusão sejam conhecidos. PCR multiplex ancorada (AMP), que é semelhante a mPCR, mas na qual primers de genes específicos são utilizados em combinação com um primer genérico que supera parcialmente essa limitação permitindo a detecção de novos eventos de fusão para um dado parceiro de fusão conhecido. No entanto, ambas, AMP e mPCR, são afetadas pelas limitações técnicas inerentes da PCR, como ligação do primer fora do alvo e dimerização do primer, o que aumenta à medida que cresce o tamanho do painel (Heyer e Blackburn, 2020 Bioessays 42(7):e2000016).
[006] Atualmente, as alternativas a técnicas com base em amplicon ou PCR são sequenciamento completo do genoma (WGS) e sequenciamento de RNA (RNA-seq). Essas técnicas permitem distinguir sem viés o genoma completo ou o transcriptoma (respectivamente), incluindo fusões conhecidas e novas. No entanto, devido ao alto custo desse tipo de abordagem com o genoma inteiro, essas técnicas são ainda raramente utilizadas para aplicações clínicas. O NGS com base na captura por hibridização provê uma alternativa de custo compensador, na qual bibliotecas de WGS ou RNA-seq são submetidas a uma etapa de enriquecimento do alvo antes do sequenciamento. Essa etapa restringe as regiões que serão sequenciadas, enquanto permite a detecção tanto de eventos de fusão conhecidos como novos (Hrdlickova et al., 2017, Wiley Interdiscip Rev RNA 2017, 8:e1364; Heyer e Blackburn, 2020, supra).
[007] O NGS com base na captura por hibridização é especialmente interessante para detecção de fusão com o uso de bibliotecas de RNA-seq. Nessa técnica, moléculas de RNA são convertidas em cDNA, que é então ligado a adaptadores de sequenciamento e amplificado para gerar bibliotecas de transcriptoma completo. Essas bibliotecas são submetidas à captura por hibridização com o uso de sondas, ligadas a uma porção bioquímica (tipicamente biotina), projetadas para atingir e isolar as sequências de interesse, que são subsequentemente amplificadas e sequenciadas (Mercer et al., 2014, Nat Protoc. 9(5):989-1009; Heyer e Blackburn, 2020, supra).
[008] Portanto, uma etapa importante para o êxito da captura por hibridização é o desenho da sonda. Vários exemplos de desenhos de sonda são conhecidos, como aqueles descritos em EP3647420A1, em que as sondas hibridizam com uma região derivada do gene A ou B do cDNA, preparado a partir do transcrito do gene de fusão, compreendendo uma parte do gene A no lado 5' e uma parte do gene B no lado 3' ligadas uma à outra em um ponto de junção potencial. O desenho da sonda com exatidão garante que somente os alvos de interesse serão capturados. Para a detecção de genes de fusão, essa tarefa é particularmente desafiadora, uma vez que o desenho de sondas depende dos parceiros de fusão e pontos de quebra, que nem sempre são conhecidos e variam em grande medida de uma aplicação médica para outra. Além do mais, uma limitação importante no desenho de sondas para fusão é como colocar as sondas visando detectar fusões novas e conhecidas da mesma forma, sem capturar leituras demais a partir dos genes parceiros do tipo selvagem (WT) que podem não ser de interesse diagnóstico.
[009] Sondas adequadas para detecção eventos de genes de fusão podem ser desenhadas de modo que sejam homólogas ao parceiro conhecido (a seguir, parceiro primário), o que permitiria a detecção de quase todas as fusões que envolvem aquela região do parceiro (a seguir, sondas universais). Alternativamente, as sondas podem também ser desenhadas sobre o ponto de quebra, sobrepondo-se tanto ao parceiro primário de fusão como ao secundário de modo a enriquecer fusões conhecidas (a seguir, sondas específicas). Desenhar sondas universais é a forma mais comum de desenho de sondas, no entanto, elas são menos específicas e podem requerer sequenciamento mais aprofundado para detectar fusões de baixa expressão. Consequentemente, para garantir a detecção ótima de fusões conhecidas relevantes, a abordagem é também desenhar sondas que sejam específicas para uma determinada fusão/ponto de quebra. Essa abordagem, no entanto, requer um equilíbrio cuidadoso do desenho a fim de otimizar as leituras do sequenciamento.
[0010] Portanto, há necessidade de melhorar as sondas e conjuntos sondas para captura e detecção simultâneas de parceiros novos e conhecidos de genes de fusão, enquanto limitando a captura da contraparte WT (tipo selvagem) do parceiro secundário de fusão.
Sumário da invenção
[0011] A presente invenção baseia-se no achado de que é possível otimizar o desenho de sondas para detectar fusões específicas conhecidas de modo a minimizar a captura de uma contraparte WT do parceiro secundário de fusão WT. Esse desenho permite captura reduzida de uma contraparte WT do parceiro secundário de uma fusão específica, permitindo a detecção da dita fusão, enquanto minimizando a geração de leituras do sequenciamento não relevantes para a detecção da dita fusão e, consequentemente, deixando espaço para a detecção de mais fusões em paralelo ou maior multiplexação de pacientes por execução de NGS.
[0012] A invenção é dirigida particularmente ao desenho das chamadas sondas de baixa sobreposição, compreendendo sondas universais e específicas. As sondas são definidas pelo número de pares de bases depois da região de ponto de quebra da fusão que se sobrepõem ao parceiro secundário, em que todas as sondas têm um comprimento total constante de 120 bp (ou seja, 100% do comprimento da sonda). As sondas universais (ou sondas 0bp) não se sobrepõe ao parceiro secundário de fusão e cobrem somente o parceiro primário até a borda do ponto de quebra. As sondas específicas iniciam no parceiro primário de fusão e sobrepõe-se ao parceiro secundário de fusão, até 10bp, 20bp, 30bp, 40bp ou 50bp para além do ponto de quebra da fusão (ou seja, 9%, 17%, 25%, 33% ou 42% de um comprimento total da sonda) (Figura 1B). Essas sondas de baixa sobreposição capturam leituras do parceiro secundário resultantes do gene de fusão alvo (Figura 2A, 3A versus Figura 2B-D e Figura 3B-D) e evitam capturar leituras derivadas da contraparte WT.
[0013] A invenção é adicionalmente dirigida particularmente à mistura de sondas uma sonda universal e sondas específicas de baixa sobreposição com sobreposição de até 10bp, 20bp, 30bp e 40bp a um parceiro secundário de fusão. Essa mistura de sondas sobrepostas pode capturar mais fragmentos de fusão do que somente sondas com 0bp ou 50bp, como mostrado no Exemplo 2 e 3. Somente uma mistura de sondas de baixa sobreposição permite reduzir as leituras do parceiro secundário WT em comparação a leituras obtidas com o uso de sondas de alta sobreposição.
[0014] A invenção é adicionalmente dirigida particularmente à mistura de sondas uma sonda universal e sondas específicas de baixa sobreposição com sobreposição de até 10bp, 20bp, 30bp e 40bp a um parceiro secundário de fusão e a mistura de uma sonda universal e uma sonda específica de baixa sobreposição com sobreposição de até 50bp a um parceiro secundário de fusão. Essas misturas de sondas de baixa sobreposição capturam números semelhantes ou maiores de fragmentos de fusão do que somente sondas de 0bp, com alguma variação dependendo da fusão em questão como mostrado no Exemplo 4. No entanto, apenas uma mistura de sondas de baixa sobreposição permite reduzir as leituras de parceiro secundário WT, em comparação a leituras obtidas com o uso de sondas de alta sobreposição.
[0015] Em uma modalidade, é provido um conjunto de sondas que compreende: pelo menos uma sonda compreendendo: uma primeira porção da sonda complementar a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e uma segunda porção da sonda complementar a uma porção secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo, em que a sonda se sobrepõe a um ponto de quebra entre a porção primária e a secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo e em que o comprimento da segunda porção da sonda representa em torno de 1% a em torno de 42% de um comprimento total da sonda, e pelo menos uma sonda adicional complementar somente à porção primária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo, em que a sonda adicional não se sobrepõe a um ponto de quebra entre a porção primária e a secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo.
[0016] Em uma modalidade, é provido um conjunto de sondas que compreende: pelo menos duas sondas compreendendo: uma primeira porção da sonda complementar a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e uma segunda porção da sonda complementar a uma porção secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo, em que as ditas sondas se sobrepõem a um ponto de quebra entre a porção primária e a secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo e em que o comprimento da segunda porção da sonda representa em torno de 1% a em torno de 42% de um comprimento total da sonda e em que as ditas sondas têm comprimentos diferentes da segunda porção da sonda.
[0017] Em uma modalidade, é provida uma sonda que compreende: uma primeira porção da sonda complementar a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e uma segunda porção da sonda complementar a uma porção secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo, em que a sonda se sobrepõe a um ponto de quebra entre a porção primária e a secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo e em que o comprimento da segunda porção da sonda representa em torno de 1% a em torno de 42% de um comprimento total da sonda.
[0018] Em uma modalidade, é provido uma sonda ou um conjunto de sondas de acordo com a invenção, em que o comprimento da segunda porção da sonda representa em torno de 1%, 9%, 17%, 25%, 33% ou 42% de um comprimento total da sonda.
[0019] Em uma modalidade, uma primeira porção da sonda é complementar a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo que é selecionada dentre um gene de fusão ou transcrito que codifica um parceiro primário de fusão ou um transcrito com salto de éxon que codifica um éxon, e uma segunda porção da sonda é complementar a uma porção secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo que é selecionada dentre um gene de fusão ou transcrito que codifica um parceiro secundário de fusão ou um transcrito com salto de éxon que codifica éxon secundário.
[0020] De acordo com um aspecto em particular, a porção primária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo é o parceiro primário de fusão que é uma molécula de quinase, e a porção secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo é o parceiro secundário de fusão que é uma molécula de não quinase.
[0021] De acordo com um aspecto em particular, as sondas da invenção são adequadas para a captura e detecção de gene de fusão e, assim, de molécula de DNA. De acordo com um aspecto em particular, as sondas da invenção são adequadas para a captura e detecção de transcrito de gene de fusão e/ou transcrito com salto de éxon e, assim, molécula de RNA.
[0022] De acordo com um aspecto em particular, as sondas da invenção são adequadas para a captura e detecção de parceiros conhecidos ou novos de genes de fusão.
[0023] De acordo com um aspecto em particular, as sondas da invenção são adequadas para a capture e detecção de pelo menos um gene de fusão e/ou salto de éxon.
[0024] De acordo com um aspecto em particular, a invenção provê um kit que compreende pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas de acordo com a invenção.
[0025] De acordo com um aspecto em particular, a invenção provê uma composição que compreende pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas de acordo com a invenção.
[0026] De acordo com um aspecto em particular, a invenção provê pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas para uso em sequenciamento de DNA ou sequenciamento de RNA direcionado com enriquecimento.
[0027] De acordo com um aspecto em particular, a invenção provê um método para detecção de uma fusão gênica e/ou salto de éxon em uma amostra que compreende uma etapa de hibridização de pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas de acordo com a invenção com a porção complementar do ácido nucleico alvo.
[0028] De acordo com um aspecto em particular, a invenção provê um método de DNA-seq ou RNA-seq direcionado com captura de um alvo (ou seja, sequenciamento direcionado com base em captura por hibridização) que compreende as etapas de:
  • a) prover um material de amostra que compreende ácidos nucleicos;
  • b) preparar uma biblioteca de sequenciamento de ácidos nucleicos;
  • c) hibridizar pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas da invenção com ácidos nucleicos alvo;
  • d) amplificar os ácidos nucleicos;
  • e) sequenciar os ácidos nucleicos; e
  • f) analisar as sequências de ácidos nucleicos obtidas na etapa e).
[0029] De acordo com um aspecto em particular, a invenção provê um método para diagnosticar ou monitorar um câncer que compreende uma etapa de hibridização de pelo menos uma sonda de acordo com a invenção ou um conjunto de sondas de acordo com a invenção com as porções complementares dos ácidos nucleicos alvo presentes em uma amostra.
[0030] De acordo com um aspecto em particular, a invenção provê um método para diagnosticar ou monitorar um câncer, em que, se a presença de um gene de fusão oncogênico e/ou um salto de éxon forem detectados em uma amostra do paciente, isso indica a presença de um câncer.
[0031] De acordo com um aspecto em particular, a invenção provê o uso de pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas de acordo com a invenção em um método de detecção de gene de fusão e/ou salto de éxon, preferivelmente do gene de fusão presentes em um câncer.
Descrição das figuras
[0032] A Figura 1 mostra uma sonda universal (uma sonda que não se sobrepõe com um parceiro secundário de fusão; aqui denominada 0bp) e exemplos de desenho de uma sonda específica (uma sonda que se sobrepõe com um parceiro secundário de fusão), e em que todas as sondas têm um comprimento total constante de 120 bp. A) mostra um desenho de sonda de alta sobreposição, onde as sondas sobrepõem-se até 60bp ou 90bp a um parceiro secundário de fusão. O painel A) também mostra uma mistura de sondas de alta sobreposição (60bp e 90bp) com uma sonda de baixa sobreposição (30bp) como utilizada no Exemplo 2 e 3. B) mostra um desenho de sonda de baixa sobreposição de acordo com a invenção onde as sondas sobrepõem-se 10bp, 20bp, 30bp, 40bp ou 50bp a um parceiro secundário de fusão.
[0033] A Figura 2 mostra um mapa de calor dos fragmentos da fusão FGFR3-TACC3, que inicia em relação ao ponto de quebra da fusão (posição 0bp), detectados com sondas de alta sobreposição (A) quando comparados àqueles detectados com sondas de baixa sobreposição (B-D) de acordo com o Exemplo 2. B) sonda 0bp; C) sonda 50bp e D) mistura de sondas 0bp, 10bp, 20bp, 30bp e 40bp. Os números no lado esquerdo dos gráficos B-D representam o número de moléculas únicas que incluem a região de ponto de quebra que sustenta a fusão (considerando a entrada de 3 milhões de fragmentos), as porcentagens no lado direito do gráfico representam a porcentagem de moléculas únicas que sustentam a fusão em comparação às moléculas únicas totais na região.
[0034] A Figura 3 um mostra mapa de calor de fragmentos da fusão PAX8-PPARG, que inicia em relação ao ponto de quebra da fusão (posição 0bp), detectados com sondas de alta sobreposição (A) quando comparados àqueles detectados com sondas de baixa sobreposição (B-D) de acordo com o Exemplo 3. B) sonda 0bp; C) sonda 50bp e D) mistura de sondas 0bp, 10bp, 20bp, 30bp e 40bp. Os números no lado esquerdo dos gráficos B-D representam o número de moléculas únicas que incluem a região de ponto de quebra que sustenta a fusão (considerando a entrada de 3 milhões de fragmentos), as porcentagens no lado direito do gráfico representam a porcentagem de moléculas únicas que sustentam a fusão em comparação às moléculas únicas totais na região.
[0035] Figura 4. O gráfico de barras mostra o número de fragmentos abrangendo o ponto de quebra (dividido por 1000), capturados com o desenho de sonda de baixa sobreposição (0bp ou 0+50bp ou mistura (0bp+10bp+20bp+30bp+40bp+50bp)) para diferentes fusões em amostras clínicas (S1, S2, S3) e amostras de referência (AR: Seraseq® FFPE Tumor Fusion RNA v2) como descrito no Exemplo 4. O número de fragmentos fundidos detectados é relatado, bem como o número de fragmentos fundidos na condição 0bp, a quantificação relativa (fold change) de fragmentos fundidos na condição 0+50bp em comparação a 0bp, a quantificação relativa de fragmentos fundidos na condição "mistura" em comparação a 0bp (observado sobre as respectivas barras).
Descrição detalhada da invenção
[0036] A "molécula de ácido nucleico" é escolhida dentre as moléculas de ácido nucleico conhecidas, como RNA (ácido ribonucleico), DNA (ácido desoxirribonucleico), LNA (ácido nucleico bloqueado), PNA (ácido nucleico peptídico), cDNA (DNA complementar) e outros.
[0037] O termo "gene de fusão" ou "fusão gênica" ou "molécula de ácido nucleico de fusão" ou "gene híbrido" ou "gene quimérico" ou "transcrito quimérico" refere-se a um gene formado a partir de dois ou mais genes anteriormente independentes e inclui todo ou um fragmento de um primeiro gene e todo ou um fragmento do segundo gene e/ou subsequente. Os genes de fusão normalmente compreendem dois parceiros: (i) um parceiro primário de fusão ou gene, que é frequentemente um gene quinase, e (ii) um parceiro secundário de fusão ou gene. Os genes de fusão ocorrem como resultado de rearranjos cromossômicos, como translocações, inversões e deleções, e podem levar a RNAs e proteínas quiméricos. Genes de fusão foram encontrados em todos os principais tipos de neoplasia humana (ou seja, benigna, potencialmente maligna ou maligna (câncer)). Os genes de fusão são importantes biomarcadores clínicos que orientam o diagnóstico, informam o prognóstico e dão apoio às decisões de tratamento.
[0038] O termo "ponto de quebra" refere-se à posição de nucleotídeos no cromossomo ou transcrito onde duas regiões genômicas distais são reunidas quer como consequência de um rearranjo genômico ou por splicing. Além disso, o termo "ponto de quebra" refere-se a um ponto entre uma porção primária e uma secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo, como entre um parceiro primário e um secundário de fusão de um gene de fusão ou transcrito, e entre um éxon e um segundo éxon do transcrito com salto de éxon (também chamado junção de éxons).
[0039] Assim, uma porção primária e uma secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo, como parceiro primário e secundário de fusão de um gene de fusão ou transcrito, e um éxon e um segundo éxon do transcrito com salto de éxon, são definidos e separados pelo ponto de quebra. Entendese que uma porção secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo inicia em um ponto de quebra. Frequentemente, uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo pode ser definida em 3' do ponto de quebra e pode ser chamada um parceiro 3'. Frequentemente, uma porção secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo pode estar 5' do ponto de quebra e pode ser chamada um parceiro 5'.
[0040] O termo "fusão" ou "molécula de fusão" inclui qualquer molécula de fusão como gene, produto gênico (cDNA, mRNA ou polipeptídeo) e variante dos mesmos que inclua todo ou um fragmento de um gene ou parceiro primário de fusão e todo ou um fragmento de um gene ou parceiro secundário de fusão.
[0041] O termo "fusão conhecida" ou " fusão gênica conhecida" ou " gene de fusão conhecido" refere-se ao gene de fusão, em que todo ou um fragmento de um primeiro gene (um parceiro primário de fusão) e todo ou um fragmento de um segundo gene (um parceiro secundário de fusão) são conhecidos. Existe um esforço permanente para catalogar as fusões gênicas e descrever as suas funções no câncer, por exemplo, COSMIC: catálogo de mutações somáticas no câncer (Tate et al, 2019, COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 47(D1):D941-D947; http://cancer.sanger.ac.uk/census), o banco de dados Mitelman de aberrações cromossômicas e fusões gênicas no câncer (https://mitelmandatabase.isbcgc.org/) e ChimerDB (Jang et al., 2020, ChimerDB 4.0: an updated e expanded database of fusion genes. Nucleic Acids Res. 48(D1):D817-D824; http://www.kobic.re.kr/chimerdb/).
[0042] A nomenclatura convencional para descrever os genes de fusão é utilizada neste relatório descritivo e, por exemplo, inclui: por exemplo, abreviações de genes de fusão (5'-3'), como FGFR3-TACC3, em que FGFR3 é a abreviação de receptor 3 do fator de crescimento de fibroblastos e é o gene de fusão primário e TACC3 é a abreviação de proteína 3 contendo bobina enrolada ácida transformadora e é o gene de fusão secundário, ou PAX8-PPARG, em que PAX8 é a abreviação de paired box gene 8 e é o gene de fusão secundário e PPARG é a abreviação de receptor gama ativado por proliferadores de peroxissoma e é o gene de fusão primário, ou por exemplo, abreviações de genes de fusão (5'-3') contendo transcrito e éxons relevantes. Por exemplo, uma fusão FGFR3:BAIAP2L1 (NM_000142:e17:NM_018842:e2) compreende um transcrito 5' de FGFR3 NM_00142 até o éxon 17 fundido com um transcrito 3' do parceiro BAIAP2L1 NM_018842 iniciando no éxon 2.
[0043] O termo "fusão desconhecida" ou "nova fusão" ou "fusão de parceiro agnóstico" ou "gene de fusão desconhecido" ou "novo gene de fusão" ou "fusão gênica de parceiro agnóstico" refere-se ao gene de fusão em que novos genes de fusão ou parceiros secundários de gene ou isoforma não foram ainda identificados.
[0044] O termo "quinase" ou "molécula de quinase" refere-se a um grupo de enzimas que catalisam a transferências de grupos fosfato de uma molécula que contém fosfato altamente energética (como ATP) para um substrato. As enzimas quinases incluem proteínas quinases (como quinases dependentes de ciclina (CDKs), proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPKs)), lipídio quinases (como fosfatidilinositol quinases, esfingosina quinase (SK)), carboidrato quinases (como hexoquinase, fosfofrutoquinase (PFK)), quinases que atuam sobre nucleotídeos (DNA e RNA), quinases que atuam sobre outras moléculas pequenas que são substratos dessas quinases (por exemplo, creatina, fosfoglicerato, riboflavina, di-hidroxiacetona, shikimate e outros). O termo "gene quinase" ou "transcrito quinase" refere-se a um grupo de genes ou transcritos que codificam uma molécula de quinase.
[0045] O termo "não quinase" ou "gene não quinase" ou "transcrito não quinase" refere-se a um grupo de genes ou transcritos que não codificam uma proteína quinase.
[0046] O termo "salto de éxon" refere-se a uma forma de splicing de RNA que faz com que as células excluam um ou mais éxons contíguos do RNA mensageiro. O "éxon" refere-se a uma região restante na sequência de nucleotídeos de um transcrito maduro, entre a sequência de nucleotídeos de um gene. Entende-se que o salto de éxon pode ser causado por deleções, mutações ou ocorrer como consequência de regulação do splicing. Os éxons incluídos, flanqueando imediatamente o éxon saltado, presentes na molécula de ácido nucleico, podem ser detectados com o uso de sondas e os princípios aqui descritos.
[0047] O termo "sequenciamento de RNA" ou "RNAseq" ou "RNAseq" ou "perfil do transcriptoma" ou "sequenciamento de RNA de alto rendimento" ou "sequenciamento paralelo maciço de RNA" ou "sequenciamento de cDNA de nova geração" refere-se a uma técnica de sequenciamento que utiliza o sequenciamento de nova geração (NGS) para revelar a presença e a quantidade de RNA, em uma amostra biológica em um dado momento, pela análise do transcriptoma celular.
[0048] O termo "sequenciamento direcionado de RNA" ou "RNA-seq direcionado" refere-se a RNA-seq acoplado com o enriquecimento de alvos específicos, o que pode ser realizado, por exemplo, por abordagens à base de captura de alvos ou de amplicon (sequenciamento de amplicon). Esse método permite selecionar e sequenciar transcritos específicos de interesse (ou seja, para enriquecer ou enriquecimento de transcritos de interesse do RNA). Do mesmo modo, o termo " sequenciamento direcionado de DNA direcionado" ou "DNA-seq direcionado" refere-se a DNA-seq acoplado com enriquecimento de alvos específicos, o que pode ser realizado, por exemplo, por abordagens à base de captura de alvos ou de amplicon (sequenciamento de amplicon).
[0049] O termo "RNA-seq/DNA-seq direcionado por captura de alvo" ou "(RNA/DNA) CaptureSeq" ou "captura por hibridização (sequenciamento)" ou "método de captura de alvo" ou "enriquecimento de alvo com base em captura por hibridização para NGS" refere-se a uma técnica de enriquecimento que compreende uma etapa de captura por hibridização. Nessa técnica, bibliotecas de sequenciamento de RNA ou DNA são submetidas à captura por hibridização com o uso de sondas especificamente desenhadas para isolar as sequências de interesse e ligar a uma porção bioquímica (tipicamente biotina). Essas bibliotecas com alvo enriquecido são então amplificadas e sequenciadas.
[0050] O termo "sonda" ou "isca" (bait) ou "molécula de ácido nucleico (sonda)" ou "sonda de captura" ou "sonda de oligonucleotídeo (DNA/RNA) (captura)" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que pode hibridizar-se com uma molécula de ácido nucleico alvo. No contexto de detecção de genes de fusão e salto de éxon, uma sonda é capaz de se hibridizar ou anelar com a molécula de ácido nucleico de um gene de fusão/transcrito e/ou transcrito resultante do salto de éxon. Se uma sonda estiver hibridizando/anelando somente com a molécula de ácido nucleico de um gene de fusão primário (parceiro), a sonda permite a detecção de qualquer fusão que envolva aquele gene e tal sonda é aqui designada como uma sonda universal. Se uma sonda estiver hibridizando/anelando com a molécula de ácido nucleico de um gene de fusão primário (parceiro) e sobre o ponto de quebra, consequentemente, no gene de fusão secundário (parceiro), a sonda permite a detecção de genes de fusão conhecidos e tal sonda é aqui designada como uma sonda específica.
[0051] O termo "ácido nucleico alvo" refere-se a uma região de ácido nucleico dentro de um gene ou um transcrito que pode ser captura pela sonda da presente invenção; por exemplo, um gene que pode formar um gene de fusão e um transcrito no qual pode ocorrer salto de éxon.
Sondas
[0052] Em uma modalidade, é provida uma sonda que compreende: uma primeira porção da sonda complementar a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e uma segunda porção da sonda complementar a uma porção secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo, em que a dita sonda se sobrepõe a um ponto de quebra entre a dita porção primária e a secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e em que o comprimento da segunda porção da sonda representa em torno de 1% a em torno de 42% de um comprimento total da sonda.
[0053] Entende-se que, em uma sonda, o comprimento da segunda porção da sonda representa em torno de 1% a em torno de 42% de um comprimento total da sonda significa que uma segunda porção da sonda se sobrepõe com uma segunda parte de um ácido nucleico alvo por essa porcentagem de seu comprimento total.
[0054] Entende-se que a sonda pode compreender uma porção da sonda complementar a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo, e outra porção da sonda complementar a uma porção secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo.
[0055] Entende-se que a sonda complementar a uma porção primária e uma secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo é uma sonda específica e permite a detecção de, por exemplo, gene de fusão conhecido ou um salto de éxon.
[0056] Em uma modalidade, um ácido nucleico alvo é um gene de fusão ou transcrito, em que uma porção primária de nucleotídeos do dito ácido nucleico alvo é um gene de fusão ou transcrito que codifica um parceiro primário de fusão, e uma porção secundária de nucleotídeos do dito ácido nucleico alvo é um gene de fusão ou transcrito que codifica um parceiro secundário de fusão.
[0057] Em uma modalidade, um ácido nucleico alvo é um transcrito com salto de éxon, em que uma porção primária de nucleotídeos do dito ácido nucleico alvo é um transcrito com salto de éxon que codifica um éxon, e uma porção secundária de nucleotídeos do dito ácido nucleico alvo é um transcrito com salto de éxon que codifica um éxon secundário.
[0058] Em uma modalidade, um ácido nucleico alvo é selecionado dentre DNA, RNA e cDNA.
[0059] Em uma modalidade, é provida uma sonda que compreende: uma primeira porção da sonda complementar a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo que é um gene de fusão ou transcrito que codifica parceiro primário de fusão ou um transcrito com salto de éxon que codifica um éxon e uma segunda porção da sonda complementar a uma porção secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo que é um gene de fusão ou transcrito que codifica um parceiro secundário de fusão ou um transcrito com salto de éxon que codifica éxon secundário, e em que a dita sonda se sobrepõe a um ponto de quebra entre a dita porção primária e a secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e em que o comprimento da segunda porção da sonda representa em torno de 1% a em torno de 42% de um comprimento total da sonda.
[0060] O comprimento em nucleotídeos de uma segunda porção da sonda complementar a uma porção secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo, expresso em porcentagem de um comprimento total da sonda, pode ser, entre outros, por exemplo, 1% ou mais, 9% ou mais, 17% ou mais, 25% ou mais, 33% ou mais, em torno de 42% e não maior do que 42%; e em torno de 1%, 9% ou menos, 17% ou menos, 25% ou menos, 33% ou menos, 42% ou menos; por exemplo, 1% a 42%, 1% a 33%, 1% a 25%, 1% a 17%, 1% a 9%. Preferivelmente, o comprimento da segunda porção da sonda, expresso em porcentagem de um comprimento total da sonda, é selecionado dentre em torno de 1%, 9%, 17%, 25%, 33% e 42%.
[0061] Em uma modalidade, é provida uma sonda que compreende: uma primeira porção da sonda complementar a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e uma segunda porção da sonda complementar a uma porção secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo, em que a dita sonda se sobrepõe a um ponto de quebra entre a dita porção primária e a secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e em que a dita segunda porção da sonda tem 1 a em torno de 50 pares de bases (bp) de comprimento, e um comprimento total da sonda é em torno de120bp.
[0062] Em uma modalidade, é provida uma sonda que compreende: uma primeira porção da sonda complementar a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo que é um gene de fusão ou transcrito que codifica um parceiro primário de fusão ou um transcrito com salto de éxon que codifica um éxon, e uma segunda porção da sonda complementar a uma porção secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo que é um gene de fusão ou transcrito que codifica um parceiro secundário de fusão ou um transcrito com salto de éxon que codifica um éxon secundário e em que a dita sonda se sobrepõe a um ponto de quebra entre a dita porção primária e a secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e em que a dita segunda porção tem 1 a em torno de 50 pares de base (bp), e um comprimento total da sonda é em torno de 120bp.
[0063] O comprimento em nucleotídeos de uma segunda porção da sonda complementar a uma porção secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo pode ser, entre outros, por exemplo, 1 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 30 ou mais, 40 ou mais, em torno de 50 e não maior do que em torno de 50; e 10 ou menos, 20 ou menos, 30 ou menos, 40 ou menos, 50 ou menos; por exemplo, 10 a 50, 10 a 40, 10 a 30, 10 a 20. Preferivelmente, o comprimento em nucleotídeos de uma segunda porção da sonda complementar a uma porção secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo é selecionado dentre em torno de 10, 20, 30, 40 e 50.
[0064] O comprimento total em nucleotídeos de uma sonda pode ser, entre outros, por exemplo, 20 ou mais, 40 ou mais, 60 ou mais, 80 ou mais, 100 ou mais, 110 ou mais ou 115 ou mais; e 220 ou menos, 200 ou menos, 180 ou menos, 160 ou menos, 140 ou menos, 130 ou menos ou 125 ou menos; por exemplo, 20 a 220, 60 a 180, 100 a 140, 110 a 130, 115 a 125 ou 120. Preferivelmente, o comprimento em nucleotídeos de uma sonda é em torno de 120.
[0065] Em uma modalidade, é provida uma sonda complementar somente a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo, em que a dita sonda não se sobrepõe a um ponto de quebra entre uma porção primária e uma secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo. Nessa modalidade, uma segunda porção da sonda não está presente. Nessa modalidade, uma segunda porção da sonda tem 0bp (sonda 0bp). Entende-se que a dita sonda é uma sonda universal e permite a detecção de gene de fusão desconhecido.
[0066] O comprimento em nucleotídeos de uma sonda universal pode ser, entre outros, por exemplo, 20 ou mais, 40 ou mais, 60 ou mais, 80 ou mais, 100 ou mais, 110 ou mais ou 115 ou mais; e 220 ou menos, 200 ou menos, 180 ou menos, 160 ou menos, 140 ou menos, 130 ou menos ou 125 ou menos; por exemplo, 20 a 220, 60 a 180, 100 a 140, 110 a 130, 115 a 125 ou 120. Preferivelmente, o comprimento em nucleotídeos de uma sonda é 120.
[0067] De acordo com a invenção, uma sonda complementar somente a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo (uma sonda universal ou sonda 0bp) e uma sonda da invenção que compreende uma segunda porção da sonda com 1 a em torno de 50bp de comprimento são aqui designadas como sondas de baixa sobreposição. Uma sonda que compreende uma segunda porção da sonda com mais de 50bp de comprimento é aqui designada como uma sonda de alta sobreposição. O desenho de sonda de baixa sobreposição de acordo com a invenção e o desenho de sonda de alta sobreposição são descritos no Exemplo 1 e mostrados na Figura 1.
[0068] Em uma modalidade, é provida uma sonda que compreende: uma primeira porção da sonda complementar a um gene de fusão ou transcrito que codifica um parceiro primário de fusão, em que o parceiro primário de fusão é preferivelmente uma molécula de quinase e uma segunda porção da sonda complementar a um gene de fusão ou transcrito que codifica um parceiro secundário de fusão, em que o parceiro secundário de fusão é preferivelmente uma molécula de não quinase, e em que a dita sonda se sobrepõe a um ponto de quebra entre o dito parceiro primário e o secundário de fusão de acordo com a invenção aqui descrita.
[0069] Em uma modalidade, é provida uma sonda da invenção que compreende uma primeira porção da sonda complementar a um gene de fusão ou transcrito que codifica um parceiro primário de fusão, em que o dito parceiro primário de fusão é uma molécula de quinase. Entende-se que tal molécula de quinase inclui qualquer quinase conhecida. Os exemplos de quinase incluem, entre outras, proteínas quinases (como CDKs, MAPKs), lipídio quinases (como fosfatidilinositol quinases, SK), carboidrato quinases (como hexoquinase, PFK), quinases que atuam sobre nucleotídeos (DNA e RNA) e quinases que atuam sobre outras moléculas pequenas. Preferivelmente, as quinases são tirosina quinases e serina/treonina quinases. Os exemplos de quinases específicas incluem, entre outras, ALK, RET, ROS, MET, BRAF, NTRKs e semelhantes.
[0070] Em uma modalidade, é provida uma sonda da invenção que compreende uma segunda porção da sonda complementar a um gene de fusão ou transcrito que codifica um parceiro secundário de fusão, em que o dito parceiro secundário de fusão é uma molécula de não quinase. Entende-se que tal molécula de não quinase inclui quaisquer moléculas conhecidas de não quinases. Os exemplos de não quinases incluem, entre outras, EML4, CD74, ETV6, TACC3, LMNA, SLC34A2 e semelhantes.
[0071] A Tabela 1 fornece exemplos de genes de fusão que podem ser capturados e detectados pelas sondas da invenção.
Figure img0001
[0072] Em uma modalidade, as sondas da invenção são feitas de DNA ou RNA, preferivelmente são feitas de DNA.
[0073] No contexto de descrição da sonda, os termos "complementar" e "homóloga" são usados indistintamente.
[0074] Em uma modalidade, é provida uma sonda de acordo com a invenção que compreende qualquer uma das seguintes sequências de nucleotídeos: (a) uma sequência de nucleotídeos compreendendo pelo menos 20, 40, 60, 80, 100, 110, 115 ou 120 nucleotídeos consecutivos, complementar a uma porção primária e/ou secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo; (b) uma sequência de nucleotídeos que tem a sequência de nucleotídeos (a) na qual um ou mais nucleotídeos são adicionados, deletados e/ou substituídos; (c) uma sequência de nucleotídeos com uma identidade de, por exemplo, 70% ou mais, 80% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais com a sequência de nucleotídeos (a); e (d) a sequência de nucleotídeos de um ácido nucleico que se hibridiza com uma porção primária e/ou porção secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo que tem pelo menos 20, 40, 60, 80, 100, 110, 115 ou 120 nucleotídeos consecutivos sob condições rigorosas.
[0075] Em uma modalidade, as sondas da invenção enriquecem (ou seja, capturam) com a fusão gênica (DNA) ou transcrito (RNA) de interesse.
[0076] Em uma modalidade, as sondas da invenção são adequadas para a captura e detecção de salto de éxon e/ou genes de fusão.
[0077] Em uma modalidade, as sondas da invenção são adequadas para a captura e detecção de um gene de fusão que compreende mais de dois parceiros.
[0078] Em outra modalidade, as sondas da invenção são ligadas a marcações detectáveis, como biotina, microesferas magnéticas, fluoróforos, radioisótopos, nanopartículas. Entende-se que tais sondas podem ser utilizadas para métodos de enriquecimento direcionado.
[0079] Em outra modalidade, as sondas da invenção são ligadas a um microarranjo, como microarranjos de DNA, microarranjos de cDNA, microarranjos de SNP. Entende-se que tais sondas podem ser utilizadas para a reação de captura de híbridos.
[0080] Em outra modalidade, a sonda da invenção tem uma sequência selecionada dentre SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 75.
[0081] Em uma modalidade, é provida uma sonda universal selecionada dentre SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, e SEQ ID NO: 20 a SEQ ID NO: 26.
[0082] Em uma modalidade, é provida uma sonda da invenção em que uma segunda porção da sonda tem 10bp de comprimento, um comprimento total da sonda é 120bp é selecionada dentre SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 37 a SEQ ID NO: 46.
[0083] Em uma modalidade, é provida uma sonda em que uma segunda porção da sonda tem 20bp de comprimento, um comprimento total da sonda é 120bp e é selecionada dentre SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 47 a SEQ ID NO: 56.
[0084] Em uma modalidade, é provida uma sonda da invenção em que uma segunda porção da sonda com 30bp de comprimento, um comprimento total da sonda é 120bp e é selecionada dentre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 57 a SEQ ID NO: 66.
[0085] Em uma modalidade, é provida uma sonda da invenção em que uma segunda porção da sonda com 40bp comprimento, um comprimento total da sonda é 120bp e é selecionada dentre SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 67 a SEQ ID NO: 76.
[0086] Em uma modalidade, é provida uma sonda da invenção em que uma segunda porção da sonda com 50bp de comprimento, um comprimento total da sonda é 120bp e é selecionada dentre SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 27 a SEQ ID NO: 36.
[0087] Em uma modalidade, é provido um método de uma preparação das sondas de acordo com a invenção.
[0088] Podem ser usados métodos padrão de síntese química de sondas de DNA ou RNA, tais como descritos em McBride LJ e Caruthers MH., 1983, Tetrahedron Letters 24(3):245-248
[0089] Em uma modalidade, é provido um método de uma preparação das sondas de acordo com a invenção, que compreende a síntese de oligonucleotídeos em microarranjos com comprimentos que variam de em torno de 60 a em torno de 120 bases ou em torno de 80 a em torno de 120 bases.
[0090] O pool de oligonucleotídeos (pool de sondas) é modificado por um processo conhecido antes da etapa de enriquecimento, de modo a incluir uma marcação detectável, como biotina, microesferas magnéticas, fluoróforos, radioisótopos ou nanopartículas, tal como com os métodos descritos em Klöcker et al., 2020, Chem. Soc. Rev.49, p. 8749-8773
[0091] Entende-se que sondas separadas podem ser utilizadas para métodos em fase de solução, enquanto sondas em microarranjos podem ser utilizadas para métodos em fase de superfície. Conjunto de sondas
[0092] Em outra modalidade, é provida um conjunto (uma combinação ou uma mistura ou um pool) das sondas de acordo com a invenção.
[0093] Em uma modalidade, é provido um conjunto de sondas que compreende pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis sondas de acordo com a invenção.
[0094] Em uma modalidade, é provido um conjunto de sondas que compreende pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400 ou pelo menos 500 sondas de acordo com a invenção.
[0095] Em uma modalidade, um conjunto de sondas de acordo com a invenção compreende pelo menos uma sonda universal e pelo menos uma sonda específica de acordo com a invenção.
[0096] Em uma modalidade, é provido um conjunto de sondas que compreende: pelo menos uma sonda compreendendo: uma primeira porção da sonda complementar a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e uma segunda porção da sonda complementar a uma porção secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo, em que a dita sonda se sobrepõe a um ponto de quebra entre a dita porção primária e a secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e em que o comprimento da segunda porção da sonda representa em torno de 1% a em torno de 42% de um comprimento total da sonda e pelo menos uma sonda adicional complementar somente a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo, em que a dita sonda não se sobrepõe a um ponto de quebra entre uma porção primária e uma secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo.
[0097] Em uma modalidade, é provido um conjunto de sondas que compreende: pelo menos uma sonda compreendendo: uma primeira porção da sonda complementar a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e uma segunda porção da sonda complementar a uma porção secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo, em que a dita sonda se sobrepõe a um ponto de quebra entre a dita porção primária e a secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e em que a dita segunda porção da sonda tem 1 a em torno de 50 pares de bases (bp) de comprimento e um comprimento total da sonda é em torno de 120bp e pelo menos uma sonda adicional complementar somente a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo, em que a dita sonda não se sobrepõe a um ponto de quebra entre uma porção primária e uma secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo.
[0098] Entende-se que um conjunto de sondas compreendendo pelo menos uma sonda universal e pelo menos uma sonda específica da invenção é adequado para a captura e detecção de parceiros conhecidos e novos de genes de fusão.
[0099] Em uma modalidade, um conjunto de sondas de acordo com a invenção compreende pelo menos duas sondas específicas de acordo com a invenção.
[00100] Em uma modalidade, é provido um conjunto de sondas que pelo menos duas sondas compreendendo: uma primeira porção da sonda complementar a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e uma segunda porção da sonda complementar a uma porção secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo, em que a dita sonda se sobrepõe a um ponto de quebra entre a dita porção primária e a secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e em que o comprimento da segunda porção da sonda representa em torno de 1% a em torno de 42% de um comprimento total da sonda. compreende:
[00101] Em uma modalidade, é provido um conjunto de sondas que compreende: pelo menos duas sondas compreendendo: uma primeira porção da sonda complementar a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e uma segunda porção da sonda complementar a uma porção secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo, em que a dita sonda se sobrepõe a um ponto de quebra entre a dita porção primária e a secundária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e em que a dita segunda porção da sonda tem 1 a em torno de 50 pares de bases (bp) de comprimento e um comprimento total da sonda é em torno de 120bp.
[00102] Entende-se que um conjunto de sondas compreendendo pelo menos duas sondas específicas da invenção é adequado para a captura e detecção de parceiros conhecidos de genes de fusão.
[00103] Em outra modalidade preferível, um conjunto de sondas de acordo com a invenção compreende pelo menos duas sondas específicas de acordo com a invenção com comprimentos diferentes da segunda porção da sonda.
[00104] Em uma modalidade, um conjunto de sondas de acordo com a invenção compreende sondas que se hibridizam com diferentes ácidos nucleicos alvo, de modo que múltiplos ácidos nucleicos alvo diferentes podem ser capturados e detectados com um conjunto de sondas.
[00105] Em uma modalidade, um conjunto de sondas de acordo com a invenção compreende sondas que se hibridizam com a mesma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo, como um gene de fusão ou transcrito que codifica um parceiro primário de fusão ou um transcrito com salto de éxon que codifica um éxon. Um conjunto exemplar de sondas compreende as sondas específicas e/ou universais que se hibridizam com o mesmo gene de fusão primário que é PPARG ou FGFR3.
[00106] Em uma modalidade, um conjunto de sondas de acordo com a invenção compreende as sondas que se hibridizam com pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 50 ou pelo menos 100 diferentes porções primárias de nucleotídeos de ácidos nucleicos alvo, como genes de fusão ou transcritos que codificam parceiros primários de fusão ou transcritos com salto de éxon que codificam um éxon.
[00107] Em uma modalidade, um conjunto de sondas de acordo com a invenção compreende pelo menos uma sonda universal complementar somente a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco sondas, em que o comprimento da segunda porção da sonda representa em torno de 1% a em torno de 42% de um comprimento total da sonda (sondas específicas) como em torno de 1%, 9%, 17%, 25%, 33% e/ou 42%.
[00108] Em uma modalidade, um conjunto de sondas de acordo com a invenção compreende pelo menos uma sonda universal complementar somente a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco sondas, em que uma segunda porção da sonda tem em torno de 1 a em torno de 50bp de comprimento (sondas específicas), como em torno de 10bp, 20bp, 30bp, 40bp e/ou 50bp de comprimento e um comprimento total da sonda é em torno de 120bp.
[00109] Em uma modalidade, um conjunto de sondas de acordo com a invenção compreende pelo menos uma sonda universal complementar somente a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e pelo menos uma sonda em que o comprimento da segunda porção da sonda representa 42% de um comprimento total da sonda (sonda específica).
[00110] Em uma modalidade, um conjunto de sondas de acordo com a invenção compreende pelo menos uma sonda universal complementar somente a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e pelo menos uma sonda em que uma segunda porção da sonda tem 50bp de comprimento e um comprimento total da sonda é em torno de 120bp.
[00111] Em uma modalidade, um conjunto de sondas de acordo com a invenção compreende pelo menos uma sonda universal complementar somente a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e pelo menos cinco sondas, em que o comprimento da segunda porção da sonda representa em torno de 1%, 9%, 17%, 25%, 33% e/ou 42% de um comprimento total da sonda (sondas específicas).
[00112] Em uma modalidade, um conjunto de sondas de acordo com a invenção compreende pelo menos uma sonda universal complementar somente a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo e pelo menos cinco sondas, em que uma segunda porção da sonda tem em torno de 10bp, 20bp, 30bp, 40bp e/ou 50bp de comprimento e um comprimento total da sonda é em torno de 120bp (sondas específicas).
[00113] Em uma modalidade, um conjunto de sondas de acordo com a invenção compreende pelo menos duas sondas, em que o comprimento da segunda porção da sonda representa em torno de 1% a em torno de 42% de um comprimento total da sonda, como em torno de 1%, 9%, 17%, 25%, 33% e/ou 42% (sondas específicas).
[00114] Em uma modalidade, um conjunto de sondas de acordo com a invenção compreende pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco sondas, em que o comprimento da segunda porção da sonda representa em torno de 1% a em torno de 42% de um comprimento total da sonda, como em torno de 1%, 9%, 17%, 25%, 33% e/ou 42% (sondas específicas). Preferivelmente, um conjunto de sondas de acordo com a invenção compreende pelo menos cinco sondas, em que o comprimento da segunda porção da sonda representa em torno de 1%, 9%, 17%, 25%, 33% e/ou 42% de um comprimento total da sonda.
[00115] Em uma modalidade, um conjunto de sondas de acordo com a invenção compreende pelo menos duas sondas, em que uma segunda porção da sonda tem em torno de 1 a em torno de 50bp de comprimento, como em torno de 10bp, 20bp, 30bp, 40bp e/ou 50bp de comprimento e um comprimento total da sonda é em torno de 120bp (sondas específicas).
[00116] Em uma modalidade, um conjunto de sondas de acordo com a invenção compreende pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco sondas, em que uma segunda porção da sonda tem em torno de 1 a em torno de 50bp de comprimento (sondas específicas), como em torno de 10bp, 20bp, 30bp, 40bp e/ou 50bp de comprimento e um comprimento total da sonda é em torno de 120bp (sondas específicas). Preferivelmente, um conjunto de sondas de acordo com a invenção compreende pelo menos cinco sondas, em que uma segunda porção da sonda tem em torno de 10bp, 20bp, 30bp, 40bp e/ou 50bp de comprimento e um comprimento total da sonda é em torno de 120bp.
[00117] Entende-se que um conjunto de sondas de acordo com a invenção pode ser uma composição ou uma mistura de reação que, opcionalmente, compreende adicionalmente uma compreendendo a molécula de ácido nucleico alvo, como uma molécula de ácido nucleico de fusão (um gene de fusão/transcrito) e/ou molécula de ácido nucleico com salto de éxon (transcrito com salto de éxon).
[00118] Entende-se que um conjunto de sondas de acordo com a invenção pode ser uma mistura de reação que compreende adicionalmente uma molécula de ácido nucleico alvo derivada de uma amostra de paciente.
[00119] Os termos "um conjunto de sondas", "um conjunto de sondas" ou "um pool de sondas" são usados indistintamente
[00120] Em uma modalidade, é provido um conjunto de sondas de acordo com a invenção que compreende adicionalmente qualquer sonda conhecida na técnica.
Métodos e usos das sondas
[00121] As sondas da invenção são desenhadas para reduzir vantajosamente a captura da contraparte WT do parceiro secundário de fusão.
[00122] De acordo com um aspecto em particular, a invenção provê pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas para detectar pelo menos um gene de fusão e/ou salto de éxon.
[00123] De acordo com outro aspecto em particular, a invenção provê o uso de pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas para detectar pelo menos um gene de fusão e/ou salto de éxon.
[00124] De acordo com um aspecto em particular, a invenção provê pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas para detectar pelo menos um gene de fusão, em que o dito gene de fusão é conhecido ou desconhecido (ou seja, fusão nova ou de parceiro agnóstico).
[00125] De acordo com um aspecto em particular, a invenção provê pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas para uso no sequenciamento de DNA ou RNA com enriquecimento direcionado.
[00126] De acordo com outro aspecto em particular, a invenção provê o uso de pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas em métodos de sequenciamento de DNA ou RNA com enriquecimento direcionado.
[00127] De acordo com um aspecto em particular, a invenção provê pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas para uso no sequenciamento de DNA ou RNA com enriquecimento direcionado com base no sequenciamento de nova geração (NGS).
[00128] De acordo com outro aspecto em particular, a invenção provê o uso de pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas em métodos de sequenciamento de DNA ou RNA com enriquecimento direcionado com base no sequenciamento de nova geração (NGS).
[00129] De acordo com um aspecto em particular, a invenção provê pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas para uso em métodos, como microarranjos, Blotting, imobilização de sondas em colunas ou microesferas para purificação de DNA alvo e semelhantes.
[00130] De acordo com outro aspecto em particular, a invenção provê o uso de pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas em métodos como microarranjos, Blotting, imobilização de sondas em colunas ou microesferas para purificação de DNA alvo e semelhantes.
[00131] De acordo com uma modalidade, é provido um método para detecção de um fusão gênica e/ou salto de éxon em uma amostra, que compreende uma etapa de hibridização de pelo menos uma sonda de acordo com a invenção ou um conjunto de sondas de acordo com a invenção com porções complementares dos ácidos nucleicos alvo.
[00132] De acordo com uma modalidade, é provido um método de RNA-seq ou direcionado com captura de um alvo (ou seja, sequenciamento com captura por hibridização) que compreende as etapas de:
  • a) prover um material de amostra que compreenda ácidos nucleicos;
  • b) preparar uma biblioteca de sequenciamento de ácidos nucleicos;
  • c) hibridizar pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas da invenção com ácidos nucleicos alvo;
  • d) amplificar os ácidos nucleicos;
  • e) sequenciar os ácidos nucleicos; e
  • f) analisar as sequências de ácidos nucleicos obtidas na etapa e).
[00133] De acordo com uma modalidade, é provido um método de RNA-seq direcionado com captura de alvo, em que a etapa a) prover um material de amostra que compreenda ácidos nucleicos compreende as etapas de:
  • a.1) prover um material de amostra que compreenda ácidos nucleicos;
  • a.2) opcionalmente, selecionar transcritos de mRNA;
  • a.3) opcionalmente, depletar rRNA (RNA ribossomal);
  • a.4) fragmentar os transcritos de mRNA.
[00134] A etapa a) e a.1)-a.4) podem ser realizadas de acordo com qualquer método conhecido seleção de poli A (a.2 e a.3), depleção de rRNA com base em hibridização (a.3), fragmentação química ou enzimática de RNA (a.4).
[00135] De acordo com uma modalidade, é provido um método de RNA-seq direcionado com captura de um alvo, em que a etapa b) preparar uma biblioteca de sequenciamento de ácidos nucleicos compreende as etapas de:
  • b.1) converter um RNA de amostra em cDNA (DNA complementar);
  • b.2) opcionalmente, converter cDNA de fita dupla em DNA de extremidade romba, seguido pela adição de uma cauda de nucleotídeos dAMP (DA) 3' não do molde;
  • b.3) opcionalmente, ligar o cDNA a adaptadores de sequenciamento;
  • b.4) opcionalmente, amplificar o produto cDNA-adaptador para gerar bibliotecas de transcriptomas completos. A etapa b) e b.1)- b.4) podem ser realizadas de acordo com qualquer método conhecido, transcrição reversa, síntese de cDNA de fita dupla (b1), reparo de extremidade e formação de cauda A (b2), ligação enzimática (b3), PCR (b4). A etapa b.3 é necessária para preparar uma biblioteca de sequenciamento de ácidos nucleicos para NGS.
[00136] De acordo com uma modalidade, é provido um método de RNA-seq direcionado com captura de um alvo em que a etapa c) hibridizar pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas da invenção com ácidos nucleicos alvo (ou seja, enriquecer com as sequências de interesse) compreende as etapas de:
  • c.1) prover bibliotecas de cDNA individual ou agrupado, obtido na etapa b);
  • c.2) hibridizar pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas da invenção com as bibliotecas alvo;
  • c.3) remover por lavagem as bibliotecas/cDNA não visados;
  • c.4) eluir as bibliotecas/cDNA;
[00137] As etapas c) e c.1)-c.4) podem ser realizadas de acordo com qualquer método conhecido, como captura de alvo por hibridização.
[00138] Em uma modalidade, a etapa c.2) é realizada por incubação de bibliotecas de cDNA individual ou agrupado com as sondas, preferivelmente a 65ºC.
[00139] Em uma modalidade, a etapa c.2) é realizada incubação de bibliotecas de cDNA individual ou agrupado com as sondas ligadas a uma porção bioquímica, como biotina, em que as ditas sondas se anelam com as sequências de interesse nas bibliotecas e o produto anelado é então capturado com o uso de um sistema que seleciona especificamente a porção bioquímica usada, como microesferas magnéticas ligadas à estreptavidina.
[00140] Em uma modalidade, as sondas ligadas a uma biotina e microesferas magnéticas ligadas à estreptavidina são usadas para capturar as ditas sondas.
[00141] Na etapa c.3) as sondas aneladas às bibliotecas são lavadas para remover sequências ligadas de modo inespecífico e o produto resultante é amplificado por PCR (etapa d) e sequenciado (etapa e).
[00142] Entende-se que, na etapa c), as sondas hibridizam com os ácidos nucleicos alvo sob condições adequadas para hibridização e lavagem, sob as quais sequências de nucleotídeos pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% idênticas umas às outras permanecem hibridizadas entre si.
[00143] A amplificação de ácidos nucleicos da etapa d) pode ser realizada de acordo com qualquer método conhecido, como reação em cadeia da polimerase (PCR).
[00144] O sequenciamento de ácidos nucleicos da etapa e) pode ser realizada de acordo com qualquer método conhecido como sequenciamento por síntese (Illumina), sequenciamento com semicondutor iônico (Ion Torrent), sequenciamento em tempo real de molécula única (SMRT) (Pacific Biosciences), sequenciamento DNA/RNA em nanoporos (Oxford Nanopore Technologies) e semelhantes.
[00145] A análise da etapa f) pode ser realizada de acordo com qualquer método conhecido de modo que o número de fragmentos que sustentam a presença do(s) evento(s) da fusão gênica de interesse seja quantificado.
[00146] Entende-se que fusões gênicas conhecidas e fusões gênicas novas são, em particular, fusão gênicas oncogênicas.
[00147] De acordo com uma modalidade, é provido um método de DNA-seq ou RNA-seq direcionado com captura de um alvo, em que uma amostra é obtida de um indivíduo que é portador ou suspeito de ser portador de uma doença, em que, preferivelmente, a doença é um câncer.
[00148] De acordo com uma modalidade, é provido um método de DNA-seq ou RNA-seq direcionado com captura de um alvo, em que se a presença de um gene de fusão e/ou salto de éxon forem detectados em uma amostra, isso indica a presença de um câncer.
Composições
[00149] De acordo com outro aspecto da invenção é provida uma composição que compreende pelo menos uma sonda de acordo com a invenção.
[00150] De acordo com outro aspecto da invenção, é provida uma composição que compreende pelo menos um conjunto de sondas de acordo com a invenção
[00151] De acordo com um aspecto em particular, as composições das invenções são úteis nos métodos da invenção, em particular, em métodos DNA-seq ou RNA-seq direcionado e métodos de diagnóstico ou monitoramento de um câncer.
[00152] De acordo com um aspecto em particular, a composição das invenções é uma mistura de reação que, opcionalmente, compreende adicionalmente a molécula do ácido nucleico alvo.
Kits
[00153] De acordo com outro aspecto da invenção, é provido um kit que compreende pelo menos uma sonda de acordo com a invenção e opcionalmente material de instrução.
[00154] De acordo com outro aspecto da invenção, é provido um kit que compreende pelo menos um conjunto de sondas de acordo com a invenção e opcionalmente material de instrução.
[00155] De acordo com um aspecto em particular, os kits das invenções são úteis nos métodos da invenção, em particular, em métodos de DNA-seq ou RNA-seq direcionado e métodos para diagnóstico ou monitoramento de um câncer.
Métodos para diagnóstico e monitoramento de câncer
[00156] Em uma modalidade, a expressão dos genes de fusão ou salto de éxon é detectado em amostras de pacientes e sugere a presença de um câncer.
[00157] De acordo com um aspecto em particular, a invenção provê pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas para uso em um método de detecção de um gene de fusão e/ou salto de éxon, preferivelmente de um gene de fusão e/ou do salto de éxon presentes em câncer.
[00158] De acordo com outro aspecto em particular, a invenção provê o uso de pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas em um método de detecção de um gene de fusão e/ou salto de éxon, preferivelmente de um gene de fusão e/ou do salto de éxon presentes em câncer.
[00159] De acordo com uma modalidade, é provido um método para diagnosticar ou monitorar um câncer que compreende uma etapa de hibridização de pelo menos uma sonda de acordo com a invenção ou um conjunto de sondas de acordo com a invenção com as porções complementares dos ácidos nucleicos alvo presentes em uma amostra.
[00160] De acordo com uma modalidade em particular, é provido um método para diagnosticar ou monitorar um câncer que compreende quaisquer métodos da invenção como aqui descritos.
[00161] De acordo com outra modalidade em particular, é provido um método para diagnosticar ou monitorar um câncer que compreende as etapas de:
  • a) prover um material de amostra que compreenda ácidos nucleicos;
  • b) preparar uma biblioteca de sequenciamento de ácidos nucleicos;
  • c) hibridizar pelo menos uma sonda ou um conjunto de sondas da invenção com ácidos nucleicos alvo;
  • d) amplificar os ácidos nucleicos;
  • e) sequenciar os ácidos nucleicos; e
  • f) analisar as sequências de ácidos nucleicos obtidas na etapa e).
[00162] De acordo com uma modalidade, é provido um método para diagnosticar ou monitorar um câncer, em que, se a presença de um gene de fusão e/ou salto de éxon forem detectados em uma amostra do paciente, isso indica a presença de um câncer.
[00163] De acordo com uma modalidade, é provido um método para diagnosticar ou monitorar um câncer, em que uma amostra é obtida de um indivíduo que é portador ou suspeito de ser portador de uma doença, em que, preferivelmente, a doença é um câncer.
[00164] De acordo com uma modalidade, é provido um método para diagnosticar ou monitorar um câncer, em que a detecção de uma presença de um gene de fusão e/ou salto de éxon em uma amostra do paciente indica o tratamento para o dito paciente.
[00165] De acordo com um aspecto, uma amostra é uma amostra de paciente e está em forma de tecido, sangue, saliva ou espécimes/preparados citológicos (FFPE, esfregaços) e semelhantes.
Pacientes
[00166] Em uma modalidade, os pacientes de acordo com a invenção estão sofrendo de um câncer.
[00167] Em outra modalidade em particular, os pacientes de acordo com a invenção estão sofrendo de câncer de pulmão, colangiocarcinoma, câncer de próstata, adenocarcinoma ductal do pâncreas, carcinoma de tireoide, câncer colorretal, câncer gástrico, glioblastoma, câncer da cabeça e pescoço, câncer de rim, cânceres do endométrio e semelhantes.
[00168] Em outra modalidade em particular, os pacientes de acordo com a invenção são suscetíveis a sofrerem de um câncer.
[00169] Em outra modalidade em particular, os pacientes de acordo com a invenção estão se submetendo ao tratamento para câncer.
[00170] As referências mencionadas são aqui incorporadas, em sua totalidade, por referência. A presente invenção não deve ter o âmbito limitado pelas modalidades específicas e os desenhos aqui descritos, os quais pretendem ser ilustrações simples de aspectos individuais da invenção, e métodos e componentes funcionalmente equivalentes são abrangidos pelo âmbito da invenção. Os exemplos que ilustram a invenção não se destinam a limitar o âmbito da invenção de modo algum.
Exemplos Exemplo 1: Desenho de sondas
[00171] Em um gene de fusão, há um parceiro primário (frequentemente uma enzima quinase), que tem níveis de expressão relativamente baixos em sua forma WT (tipo selvagem), e um parceiro secundário, que é frequentemente um gene que tem níveis de expressão maiores no WT. Isso significa que, quando a sonda é preparada, se as sondas forem desenhadas de modo que possam capturar a contraparte WT do parceiro secundário, haverá muitas leituras consumidas pela forma WT do gene em comparação à forma fundida.
[00172] As sondas a seguir foram desenhadas: i) sondas universais, que são sondas que não se sobrepõem com um parceiro secundário de fusão, ou seja, aqui denominadas sondas 0bp, em que essas sondas podem ter um comprimento total constante de 120 bp. (Figura 1). Essas sondas permitem capturar novas fusões do parceiro primário de fusão.
[00173] ii) sondas específicas, que são sondas que se sobrepõem com um parceiro secundário de fusão, ou seja, uma segunda porção da sonda tem pelo menos 1bp. Em um desenho de sonda de alta sobreposição, as sondas específicas se sobrepõem aproximadamente mais do que 50bp, como até 60bp ou 90bp ao parceiro secundário de fusão, e em que todas as sondas têm um comprimento total constante de 120 bp. (Figura 1A). Em um desenho de sonda de baixa sobreposição (de acordo com a invenção), as sondas específicas se sobrepõem até 10bp, 20bp, 30bp, 40bp ou 50bp ao parceiro secundário de fusão, e em que todas as sondas têm um comprimento total constante de 120 bp. (Figura 1B).
Exemplo 2: Comparação de desempenho entre desenho de sonda de alta sobreposição e desenho de sonda de baixa sobreposição na detecção da fusão FGFR3-TACC3
[00174] O desempenho de sondas de alta sobreposição e de baixa sobreposição foi comparado em termos de detecção da fusão FGFR3-TACC3. FGFR3 é o gene de fusão primário.
Material e métodos
[00175] Bibliotecas de RNA-seq foram preparadas utilizando 100 ng de RNA extraído do material de referência Seraseq® FFPE Tumor Fusion RNA v2. Bibliotecas de transcriptomas completos, identificados com código de barra individual, foram então capturadas com o uso da tecnologia de captura baseada em sonda xGEN Lockdown IDT® utilizando painéis personalizados. As sondas foram desenhadas de acordo com a invenção com uma mistura de sondas, que continha um misto de sondas de alta sobreposição (60bp, 90bp) com sondas de baixa sobreposição (30bp) (Figura 2A), ou sondas de baixa sobreposição: sondas 0bp (Figura 2B) ou sondas de baixa sobreposição de 50bp (Figura 2C) ou uma mistura de sondas de baixa sobreposição 0bp, 10bp, 20bp, 30bp e 40bp (Figura 2D), e incluindo sondas direcionadas para a fusão FGFR3-TACC3. Nesse gene de fusão, FGFR3 é o gene de fusão primário e TACC3 é o gene de fusão secundário. As bibliotecas capturadas foram então sequenciadas usando um instrumento Illumina MiSeq. Os dados foram analisados por mapeamento das leituras com o alinhador BWA-MEM, contra um genoma sintético de fusão preparado internamente e gerou-se um mapa de calor de fragmentos que inicia em relação ao ponto de quebra da fusão. A mistura de sondas continha sondas direcionadas para diferentes fusão gênicas, por uma questão de clareza, somente sondas direcionadas para a fusão FGFR3-TACC3 são descritas, e os resultados de detecção da fusão FGFR3-TACC3 são relatados.
[00176] As sondas a seguir foram utilizadas:
a) uma mistura de sondas de alta sobreposição (60bp e 90bp) e sondas de baixa sobreposição (30bp) (Figura 2A):
Figure img0002
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[00177] A análise do mapa de calor de fragmentos, que inicia em relação ao ponto de quebra da fusão para a fusão FGFR3-TACC3 capturada com sondas de alta sobreposição (Figura 2A), mostra que essas sondas capturam leituras demais do parceiro secundário WT. Cerca de 60% dos fragmentos em volta da fusão podem ser atribuídos ao transcrito do parceiro secundário do tipo selvagem (TACC3). A adição das sondas de baixa sobreposição (30bp) à mistura de sondas de alta sobreposição não reduz as leituras do parceiro secundário WT.
[00178] A análise do mapa de calor de fragmentos, que inicia em relação ao ponto de quebra da fusão para a fusão FGFR3-TACC3 capturada com sondas de baixa sobreposição (Figura 2B, C, D), mostra que essas sondas capturam principalmente leituras do parceiro secundário pertencente à fusão alvo. Vantajosamente, a mistura pôde capturar mais fragmentos de fusão do que as sondas 0bp e 50bp isoladamente (ou seja, mistura de sondas - 2108 fragmentos (Figura 2D); 0bp - 1101 fragmentos (Figura 2B); 50bp - 1302 fragmentos (Figura 2C)). Somente uma mistura de sondas de baixa sobreposição (Figura 2D) permite reduzir as leituras do parceiro secundário WT em comparação às leituras obtidas com o uso de sondas de alta sobreposição (Figura 2A). Vantajosamente, essa mistura de sondas de baixa sobreposição, compreendendo uma sonda universal e sondas específicas de baixa sobreposição, permite a detecção de parceiros conhecidos e novos de genes de fusão.
[00179] Esses resultados demonstram que sondas de baixa sobreposição capturam principalmente leituras do parceiro secundário pertencente à fusão alvo e que vantajosamente a mistura de sondas de baixa sobreposição captura mais fragmentos de fusão do que as sondas 0bp e 50bp isoladamente. Somente uma mistura de sondas de baixa sobreposição permite reduzir as leituras do parceiro secundário WT em comparação às leituras obtidas com o uso de sondas de alta sobreposição. Portanto, o desenho de sondas específicas de fusão para capturar fusões/pontos de quebra conhecidos foi otimizado de modo a evitar a captura da contraparte WT do parceiro secundário.
Exemplo 3: Comparação de desempenho entre desenho de sonda de alta sobreposição e desenho de sonda de baixa sobreposição na detecção da fusão PAX8-PPARG
[00180] O desempenho de sondas de alta sobreposição e de baixa sobreposição performance foi comparado na detecção da fusão PAX8- PPARG. PPARG é o gene de fusão primário.
Material e métodos como no Exemplo 2
[00181] As sondas foram desenhadas de acordo com a invenção com uma mistura de sondas que continha uma mistura de sondas de alta sobreposição (60bp, 90bp) e sondas de baixa sobreposição (30bp) (Figura 3A), ou sondas de baixa sobreposição: sonda 0bps (Figura 3B) ou sondas de baixa sobreposição de 50bp (Figura 3C) ou uma mistura de sondas de baixa sobreposição 0bp, 10bp, 20bp, 30bp e 40bp (Figura 3D), e incluindo sondas direcionadas para a fusão PAX8-PPARG. Nesse gene de fusão, PPARG é o gene de fusão primário e PAX8 é o gene de fusão secundário. A mistura de sondas continha sondas direcionadas para diferentes fusões gênicas, por uma questão de clareza, somente sondas direcionadas para a fusão PAX8-PPARG são descritas, e os resultados da detecção da fusão PAX8-PPARG são relatados.
[00182] As sondas a seguir foram utilizadas:
a) uma mistura de sondas de alta sobreposição (60bp e 90bp) e sondas de baixa sobreposição (30bp) (Figura 3A):
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[00183] A análise do mapa de calor de fragmentos, que inicia em relação ao ponto de quebra da fusão para a fusão PAX8-PPARG capturada com sondas de alta sobreposição (Figura 3A), mostra que essas sondas capturam leituras demais do parceiro secundário WT. Cerca de 39% dos fragmentos em volta da fusão podem ser atribuídos ao transcrito do parceiro secundário do tipo selvagem (PAX8). A adição das sondas de baixa sobreposição (30bp) à mistura de sondas de alta sobreposição não reduz as leituras do parceiro secundário WT.
[00184] A análise do mapa de calor de fragmentos, que inicia em relação ao ponto de quebra da fusão para a fusão PAX8-PPARG capturada com sondas de baixa sobreposição (Figura 3B, C, D), mostra que essas sondas capturam principalmente leituras do parceiro secundário pertencente à fusão alvo. Vantajosamente, a mistura pôde capturar mais fragmentos de fusão do que as sondas 0bp e 50bp isoladamente (ou seja, mistura de sondas - 1827 fragmentos (Figura 3D); 0bp - 1032 fragmentos (Figura 3B); 50bp - 1351 fragmentos (Figura 3C)). Somente uma mistura de sondas de baixa sobreposição (Figura 3D) permite reduzir as leituras do parceiro secundário WT em comparação às leituras obtidas com o uso de sondas de alta sobreposição (Figura 3A). Vantajosamente, essa mistura de sondas de baixa sobreposição, compreendendo uma sonda universal e sondas específicas de baixa sobreposição, permite a detecção de parceiros conhecidos e novos de genes de fusão.
[00185] Esses resultados demonstram que sondas de baixa sobreposição capturam principalmente leituras do parceiro secundário pertencente à fusão alvo e que vantajosamente a mistura de sondas de baixa sobreposição captura mais fragmentos de fusão do que as sondas 0bp e 50bps isoladamente. Somente uma mistura de sondas de baixa sobreposição permite reduzir as leituras do parceiro secundário WT em comparação às leituras obtidas com o uso de sondas de alta sobreposição. Portanto, o desenho de sondas específicas de fusão para capturar fusões/pontos de quebra conhecidos foi otimizado de modo a evitar a captura da contraparte WT do parceiro secundário.
Exemplo 4: Captura com sondas de baixa sobreposição de diferentes fusões em amostras clínicas e de referência
[00186] O número de fragmentos fundidos capturados com o desenho de sonda de baixa sobreposição para diferentes fusões em amostras clínicas e de referência foram comparados como descrito.
Material e métodos
[00187] Bibliotecas RNA-seq foram preparadas com o uso de 100 ng de RNA extraído de amostras FFPE clínicas ou de referência (do material de referência Seraseq® FFPE Tumor Fusion RNA v2). Bibliotecas de transcriptomas completos, identificados com código de barra individual, foram então capturadas com o uso da tecnologia de captura baseada em sonda xGEN Lockdown IDT® utilizando painéis personalizados. As sondas foram desenhadas de acordo com a invenção com uma mistura de sondas que continha sondas de baixa sobreposição 0bps (0bp) ou uma mistura de sondas de baixa sobreposição 0bp, 10bp, 20bp, 30bp, 40bp 50bps (mistura), ou uma mistura de sondas 0bp e 50bp de baixa sobreposição (0+50bp). As bibliotecas capturadas foram então sequenciadas usando um instrumento Illumina MiSeq. Os dados foram analisados por mapeamento das leituras com o alinhador BWA-MEM contra um genoma sintético de fusão preparado internamente e gerou-se um mapa de calor de fragmentos que inicia em relação ao ponto de quebra da fusão. As fusões foram detectadas em amostras clínicas (tumores sólidos; a amostra 1 e 2 continham fusões CD74-ROS1 confirmadas e a amostra 3 continha uma fusão EML4-ALK confirmada (S1, S2 e S3 respectivamente) e material de referência (RS; seracare) contendo 14 fusões diferentes e 2 eventos de saldo de éxon. As diferentes fusões alvo incluíam EML4-ALK, KIF5B-RET, NCOA4-RET, SLC34A2-ROS1, TPM3-NTRK1, FGFR3-BAIAP2L1, PAX8-PPARG, FGFR3-TACC3, ETV6-NTRK3, LMNA-NTRK1 e SLC45A3-BRAF.
[00188] O número de fragmentos fundidos detectados é relatado, bem como o número de fragmentos fundidos na condição 0bp, a quantificação relativa dos fragmentos fundidos na condição 0+50bp em comparação a 0bp e a quantificação relativa dos fragmentos fundidos na condição de mistura em comparação a 0bp (Figura 4).
[00189] As sondas a seguir foram utilizadas:
a) sonda universal (sonda 0bp):
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[00190] Note-se que as sondas universais para FGFR3-TACC3 (0bp) e FGFR3-BAIAP2L1 (0bp) têm a mesma sequência de SEQ ID NO: 4. As sondas universais para CD74-ROS1 (0bp) e SLC34A2-ROS1 (0bp) têm a mesma sequência de SEQ ID NO: 19.
[00191] Os resultados mostram que sondas 0bp, 0+50bp e a mistura de sondas capturam número semelhante ou maior de fragmentos de fusão, dependendo da fusão em questão (Figura 4).
[00192] A mistura/desenho de sondas descritos nesta invenção, consequentemente, provê a captura eficaz de moléculas de fusão, com o enriquecimento de fusões específicas desejadas enquanto otimizando as leituras que resultam da forma mutante quando comparada a formas WT de genes não visadas.

Claims (14)

  1. Conjunto de sondas, caracterizado pelo fato de que compreende: pelo menos uma sonda compreendendo: uma primeira porção da sonda complementar a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo, e uma segunda porção da sonda complementar a uma porção secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo, em que a sonda se sobrepõe a um ponto de quebra entre a porção primária e a secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo e em que o comprimento da segunda porção da sonda representa em torno de 1% a em torno de 42% de um comprimento total da sonda, e pelo menos uma sonda adicional complementar somente à porção primária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo, em que a sonda adicional não se sobrepõe a um ponto de quebra entre a porção primária e a secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo.
  2. Conjunto de sondas, caracterizado pelo fato de que compreende: pelo menos duas sondas compreendendo: uma primeira porção da sonda complementar a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo, e uma segunda porção da sonda complementar a uma porção secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo, em que as sondas se sobrepõem a um ponto de quebra entre a porção primária e a secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo, e em que o comprimento da segunda porção da sonda representa em torno de 1% a em torno de 42% de um comprimento total da sonda, e em que as sondas têm comprimentos diferentes da segunda porção da sonda.
  3. Conjunto de sondas de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a porção primária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo é um gene de fusão ou transcrito que codifica um parceiro primário de fusão ou um transcrito com salto de éxon que codifica um éxon, e em que a segunda porção da sonda complementar à porção secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo é um gene de fusão ou transcrito que codifica um parceiro secundário de fusão ou um transcrito com salto de éxon que codifica um éxon secundário.
  4. Conjunto de sondas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o comprimento da segunda porção da sonda representa em torno de 1%, 9%, 17%, 25%, 33% ou 42% de um comprimento total da sonda.
  5. Sonda, caracterizada pelo fato de que compreende: uma primeira porção da sonda complementar a uma porção primária de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo que é um gene de fusão ou transcrito que codifica parceiro primário de fusão ou um transcrito com salto de éxon que codifica um éxon, e uma segunda porção da sonda complementar a uma porção secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo que é um gene de fusão ou transcrito que codifica um parceiro secundário de fusão, ou um transcrito com salto de éxon que codifica éxon secundário, e em que a sonda se sobrepõe a um ponto de quebra entre a porção primária e a secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo, e em que a segunda porção da sonda tem 1 a em torno de 50 pares de bases (bp) de comprimento e um comprimento total da sonda é em torno de 120bp.
  6. Sonda de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o comprimento da segunda porção da sonda tem em torno de 10, em torno de 20, em torno de 30, em torno de 40 ou em torno de 50 bp.
  7. Conjunto de sondas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou sonda de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizados pelo fato de que a porção primária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo é o parceiro primário de fusão que é uma molécula de quinase, e a porção secundária de nucleotídeos do ácido nucleico alvo é o parceiro secundário de fusão que é uma molécula de não quinase.
  8. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o conjunto de sondas como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou pelo menos uma sonda como definida na reivindicação 5 ou 6.
  9. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o conjunto de sondas como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou pelo menos uma sonda como definida na reivindicação 5 ou 6.
  10. Método para detecção de um gene de fusão e/ou salto de éxon em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de hibridização de um conjunto de sondas como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou pelo menos uma sonda como definida na reivindicação 5 ou 6 com a porção complementar do ácido nucleico alvo.
  11. Método para detecção de um gene de fusão e/ou salto de éxon de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que um método é de sequenciamento de DNA ou sequenciamento de RNA direcionado com captura de um alvo que compreende as etapas de:
    • a) prover um material de amostra que compreenda ácidos nucleicos;
    • b) preparar uma biblioteca de sequenciamento de ácidos nucleicos;
    • c) hibridizar o conjunto de sondas como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou pelo menos uma sonda como definida na reivindicação 5 ou 6;
    • d) amplificar os ácidos nucleicos;
    • e) sequenciar os ácidos nucleicos; e
    • f) analisar as sequências de ácidos nucleicos obtidas na etapa e).
  12. Método para detecção de um gene de fusão e/ou salto de éxon de acordo com as reivindicações 11 e 12, caracterizado pelo fato de que a amostra é obtida de um indivíduo que é portador ou suspeito de ser portador de uma doença, em que, preferivelmente, a doença é um câncer.
  13. Método para diagnóstico ou monitoramento de um câncer, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de hibridização de um conjunto de sondas como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou pelo menos uma sonda como definida na reivindicação 5 ou 6 com a porção complementar do ácido nucleico alvo presente em uma amostra, em que a detecção do ácido nucleico alvo, como um gene de fusão e/ou salto de éxon alvo, indica a presença de um câncer.
  14. Uso de um conjunto de sondas como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou de pelo menos uma sonda como definida na reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de ser em um método de detecção de um gene de fusão e/ou salto de éxon, preferivelmente, do gene de fusão e/ou salto de éxon presentes em câncer.
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