BR102021015605A2

BR102021015605A2 - Processo para produção de xilitol a partir de xilose

Info

Publication number: BR102021015605A2
Application number: BR102021015605-8A
Authority: BR
Inventors: Ajay Kumar Sharma; Manas Ranjan Swain; Ajit Singh; Anshu Shankar Mathur; Ravi Prakash Gupta; Suresh Kumar Puri; Sankara Sri Venkata Ramakumar
Original assignee: Indian Oil Corporation Limited; Department Of Biotechnology
Priority date: 2020-08-07
Filing date: 2021-08-06
Publication date: 2022-02-15
Also published as: US20220042050A1; AU2021212080B2; EP3950950A1; AU2021212080A1; US11618907B2

Abstract

A presente patente de invenção divulga um processo de produção de xilitol a partir de xilose pura, extrato líquido contendo xilose da biomassa pré-tratada com ácido (LEPB) e co-produção de etanol e xilitol a partir de biomassa lignocelulósica pré-tratada com ácido diluído por S. cerevisiae natural DBT-IOC S24 (MTCC25086). A presente invenção também divulga um processo de produção de xilitol em que uma cepa natural termotolerante e tolerante a inibidor S. cerevisiae DBT-IOC S24 (MTCC25086) foi induzida a produzir xilitol a partir de xilose em parâmetros de processo definidos usando xilose contendo biomassa pré-tratada com ácido diluído bem como de meio sintético contendo xilose na presença de glicose, indutor de xilitol derivado de biomassa de lignocelulose mantendo a aeração em 1VVM e pH em 5,0 no meio.

Description

PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE XILITOL A PARTIR DE XILOSE

CAMPO TÉCNICO

[01] A presente patente de invenção descreve um processo de produção de xilitol a partir de xilose pura, extrato líquido contendo xilose da biomassa pré-tratada com ácido (LEPB) e co-produção de etanol e xilitol a partir de biomassa lignocelulósica pré-tratada com ácido diluído pela cepa de levedura selvagem S. cerevisiae DBT -IOC S24 (MTCC25086). A presente invenção também divulga um processo de produção de xilitol em que uma cepa natural de S. cerevisiae DBT-IOC S24 (MTCC25086) tolerante a inibidor e termotolerante foi induzida a produzir xilitol a partir de xilose em parâmetros de processo definidos. A referida produção de xilitol a partir de xilose pura, biomassa pré-tratada com ácido rico em xilose (LEPB) e co-produção de etanol e xilitol a partir de biomassa lignocelulósica pré-tratada com ácido diluído acontece quando a cepa de levedura selvagem S. cerevisiae DBT-IOC S24 (MTCC25086) é induzida por glicose e indutor de xilitol derivado de biomassa de lignoceluloses.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[02] A xilose é o segundo açúcar mais abundante no mundo depois da glicose. A fermentação da xilose em etanol é um desafio devido à falta de uma cepa natural eficiente. Várias tentativas foram feitas para desenvolver uma cepa de S. cerevisiae geneticamente modificada para a conversão de xilose em etanol.

[03] O documento US9228178 divulga construtos genéticos recombinantes e cepas de H. polymorpha tendo produtividade de etanol significativamente aumentada com uma produção diminuída simultânea de xilitol durante a fermentação de xilose em alta temperatura.

[04] O documento US20070141690 divulga uma nova xilose utilizando cepa de Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada, sendo capaz de utilizar xilose para produção de etanol, cepa que é regulada positivamente em relação aos genes para xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XDH), bem como xilulocinase (XK) e superexpressando a via não oxidativa da pentose fosfato (PPP) e compreendendo uma deleção da deleção do gene GRE3, bem como a cepa adaptada à alimentação com xilose.

[05] O documento US7482144 divulga que a modificação genética de microrganismos é um método preferido para aumentar seu potencial como produtores de xilitol e para um processo para a produção de xilitol usando os referidos microrganismos.

[06] O documento US8921082 divulga que, usando a levedura Candida sp., a xilose pode ser efetivamente convertida em xilitol. Este documento também fornece a cepa Candida com alta tolerância ao furfural e é capaz de produzir xilitol a partir de vários tipos de hidrolisados lignocelulósicos não desintoxicados. No entanto, Candida sp natural foi relatada como cepa produtora de xilitol em sua forma natural. A cepa de Candida tem capacidade de produzir xilitol devido à presença do gene da Xilose redutase.

[07] No artigo de pesquisa de Mishra et al. (2016), produção de bioetanol lignocelulósico empregando inibidor recém-isolado e cepa DBTIOC S24 termotolerante de Saccharomyces cerevisiae em SSF e SHF, (RSC Advances, Issue 29, 2016), os autores investigam produção de etanol lignocelulósico usando inibidor e termotolerante S. cerevisiae DBTIOC S24 a partir de hidrolisado de palha de arroz não desintoxicado e não esterilizado.

[08] Barbosa et. al. (1988) leveduras selecionadas para a produção de xilitol a partir de D-xilose e alguns fatores que afetam o rendimento de xilitol em Candida guilliermondii, este estudo também relatou a capacidade de leveduras de cinco gêneros para converter D-xilose em xilitol e descobriram que os melhores produtores de xilitol estavam localizados principalmente nas espécies Candida guilliermondii e C. tropicalis. Barbosa et. al., (1988) também relatou um rendimento de xilose teoricamente como 0,905 g/g de xilose.

[09] Várias tentativas foram feitas para desenvolver a cepa de S. cerevisiae produtora de xilitol por modificação genética. Essas cepas geneticamente modificadas têm limitações para uso em nível industrial e precisam de aprovações regulatórias. Na presente invenção, uma cepa natural termotolerante e tolerante a indutor/inibidor interna S. cerevisiae DBT-IOC S24 é induzida para a produção de xilitol usando compostos indutores gerados durante o pré-tratamento com ácido; esses indutores se transformaram em compostos menos tóxicos por essa cepa e a xilose também se converteu em xilitol.

SUMÁRIO

[010] A presente patente de invenção divulga um processo de produção de xilitol a partir de xilose pura, biomassa pré-tratada com ácido rico em xilose (LEPB) e co-produção de etanol e xilitol a partir de biomassa lignocelulósica pré-tratada com ácido diluído por S. cerevisiae natural DBT-IOC S24 (MTCC25086). Em um aspecto, a presente invenção divulga um processo de produção de xilitol em que uma cepa natural de S. cerevisiae DBT-IOC S24 (MTCC25086) termotolerante e tolerante a inibidor foi induzida a produzir xilitol a partir de xilose em parâmetros de processo definidos usando extrato líquido de ácido biomassa agrícola pré-tratada, co-produção de etanol e xilitol a partir de biomassa lignocelulósica pré-tratada com ácido diluído, bem como de meio sintético contendo xilose na presença de glicose, indutor de xilitol derivado de biomassa de lignocelulose, mantendo a aeração em 1VVM e pH em 5,0 no meio.

BREVE DESCRIÇÃO DE FIGURAS

[011] Outras características, aspectos e vantagens da presente invenção serão melhor compreendidos quando a seguinte descrição detalhada for lida com referência aos desenhos anexos, nos quais caracteres semelhantes representam partes semelhantes ao longo dos desenhos em que:

[012] A figura 1 ilustra a produção de xilitol por S. cerevisiae em xilose pura em meio sintético.

[013] A figura 2 ilustra a co-produção de xilitol e produção de etanol por S. cerevisiae em um processo de fermentação em duas etapas operado com biomassa lignocelulósica pré-tratada com ácido.

[014] A figura 3 ilustra a apresentação sistemática da produção de xilitol por S. cerevisiae a partir de xilose em meio sintético.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[015] Com o propósito de promover uma compreensão dos princípios da invenção, será feita referência agora às modalidades ilustradas nas figuras e linguagem específica será usada para descrevê-las. No entanto, será entendido que nenhuma limitação do escopo da invenção é pretendida, em que tais alterações e modificações adicionais no sistema ilustrado, e tais aplicações adicionais dos princípios da invenção, conforme ilustrado ali, são contempladas como normalmente ocorreria a um versado na técnica a que a invenção se refere. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. O sistema, métodos e exemplos fornecidos neste documento são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitativos.

[016] A terminologia e a estrutura empregadas neste documento são para descrever, ensinar e iluminar algumas modalidades e suas características e elementos específicos e não limitar, restringir ou reduzir o espírito e escopo da invenção.

[017] "Enzima celulase" aqui utilizada é uma forma mista de enzima que é composta principalmente por exo-hidrolase, endo-hidrolase e beta-glucosidase. Esta enzima foi produzida principalmente a partir de fontes fúngicas. A celulase decompõe a molécula de celulose em monossacarídeos e polissacarídeos ou oligossacarídeos mais curtos. Na presente invenção, a enzima celulase é selecionada a partir da enzima celulase disponível comercialmente que é adequada para essa finalidade.

[018] LEPB (pasta de biomassa pré-tratada com extrato líquido) aqui utilizada como pasta contendo extrato líquido após pré-tratamento com ácido diluído de biomassa lignocelulósica. A porção líquida da pasta contém açúcar solúvel principalmente xilose extraída a partir de parte de hemicelulose da biomassa. Esta parte líquida da pasta também contém glicose e inibidor (HMF, Furfural e outros ácidos, etc.).

[019] A levedura é um microrganismo de célula única; prefere crescer em superfícies açucaradas e fermentar os açúcares. Naturalmente, o fermento é encontrado principalmente em frutas e vegetais. Pode crescer em condição aeróbia e anaeróbia parcial. A Saccharomyces cerevisiae dentre o grupo de leveduras é considerada mais adequada para aplicação industrial devido às suas características únicas.

[020] Em um aspecto, a presente invenção fornece um processo de produção de xilitol a partir de xilose pura, em que o referido processo compreende as etapas de:

[021] (a) inocular uma cepa de levedura natural termotolerante e tolerante a inibidor (Saccharomyces cerevisiae DBT-IOC S24 (MTCC25086) em um meio sintético contendo 4% de xilose, 1% de glicose, indutor 10 mM, 0,2% de extrato de levedura e 0,1% de peptona e incubar a uma temperatura de 37°C e a 200 rpm;

[022] (b) adicionar de 290-360 mg de glicose e 8,0-12,0 mg de indutor em cada intervalo de 15 minutos a um litro de caldo fermentado contendo meio sintético como descrito acima, após 6 horas de fermentação;

[023] (c) manter a aeração em 1VVM e pH em 5,0 no meio;

[024] (d) obter rendimento em xilitol de 99%.

[025] Em uma modalidade, a referida cepa de levedura natural termotolerante e tolerante a inibidor é Saccharomyces cerevisiae DBT-IOC S24 (MTCC25086).

[026] Em outra modalidade, 300 mg de glicose e 10 mg de indutor (furfural/HMF) são adicionados a cada intervalo de 15 minutos a um litro de caldo fermentado contendo meio sintético como descrito acima, após 6 horas de fermentação,

[027] Em ainda outra modalidade, o referido indutor de xilitol derivado de biomassa de lignoceluloses é selecionado a partir de furfural ou HMF.

[028] Em mais uma modalidade, o referido meio de fermentação sintético compreende açúcares puros, 0,2% de extrato de levedura, 0,1% de peptona e furfural ou HMF.

[029] Em uma modalidade, os referidos açúcares compreendem glicose e xilose em uma proporção de combinação de 1:4.

[030] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um processo de fermentação em duas etapas para a coprodução de xilitol e etanol, em que o processo compreende as etapas de:

[031] (a) diluir biomassa pré-tratada com ácido usando uma cepa de levedura natural termotolerante e tolerante a inibidor S. cerevisiae DBTIOC S24;

[032] (b) adicionar a enzima celulase 0,3 FPU/gTS (FPU por grama de sólido total) no carregamento de sólidos de biomassa de 15% na fase inicial do processo para liberar açúcar de glicose durante o processo que facilita a absorção de xilose por Saccharomyces cerevisiae DBT-IOC S24 e manter o crescimento adequado das células de levedura;

[033] (c) obter um rendimento de conversão de xilitol até 99% do rendimento teórico;

[034] (d) submeter a biomassa restante para hidrólise enzimática por adição de celulase a 2,0 FPU/gTS a 50°C; seguida de fermentação para produção de etanol pela inoculação da levedura S. cerevisiae DBTIOC S24;

[035] (e) obter concentração de 21 g/L de etanol a 37°C por Saccharomyces cerevisiae DBT-IOC S24 (MTCC25086), após fermentação final.

[036] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece um processo de produção de xilitol a partir de biomassa pré-tratada com ácido, em que o referido processo compreende as etapas de:

[037] (a) inocular a cepa de levedura natural termotolerante e tolerante ao inibidor (Saccharomyces cerevisiae DBT-IOC S24 (MTCC25086)) na concentração de 2 g/L de células para diluir a biomassa pré-tratada com ácido (15% gTS);

[038] (b) adicionar na fase inicial da fermentação 0,3 FPU/enzima celulase gTS ao processo de fermentação para liberar glicose durante o processo, o que facilita a absorção de xilose e mantém o crescimento adequado das células de levedura;

[039] (c) manter a aeração a 1VVM e pH a 5,0 durante o processo de fermentação;

[040] (d) submeter a biomassa após a produção de biomassa de xilitol a hidrólise enzimática usando 2,0 FPU/gTS (dose de enzima cumulativa no processo 2,3FPU/gTS) a 50°C.

[041] Tendo descrito os aspectos básicos da presente invenção, os seguintes exemplos não limitativos ilustram sua modalidade específica.

[042] Exemplo-1

[043] S. cerevisiae DBT-IOC S24 é inoculado em um meio sintético contendo açúcares puros [glicose (1 %) e xilose (4%) em uma proporção de combinação 1:4], extrato de levedura (0,2%), peptona (0,1%) junto com indutores (HMF e/ou furfural) na concentração de 10 mM. A levedura foi inoculada no meio de fermentação na concentração de células de 2g/L e incubada a 37°C e 200 rpm. Após 6 horas de fermentação, 290-360 mg de glicose e 8,0-12,0 mg de indutor (furfural/HMF) são adicionados a cada intervalo de 15 minutos a um litro de caldo fermentado contendo meio sintético como descrito acima. A aeração e o pH do meio de cultura foram mantidos em 1VVM e 5,0, respectivamente, ao longo da fermentação. A cada 24h as amostras são estimadas por HPLC para detecção do xilitol (figura 1).

[044] Exemplo-2:

[045] A produção de xilitol foi observada em biomassa pré-tratada com ácido por inoculação de S. cerevisiae natural, na biomassa não destoxificada, a 37°C por 50 a 65 horas. No estágio inicial da fermentação, a enzima celulase 0,3 FPU/gTS é adicionada ao processo de fermentação para liberar açúcar durante o processo, o que facilita a absorção da xilose e mantém o crescimento adequado das células de levedura. Rendimento de conversão de xilitol semelhante (99% do rendimento teórico) também é observado neste processo de fermentação em comparação com a fermentação de xilose pura em meio sintético. Após a produção de xilitol, a biomassa pode ser submetida à hidrólise enzimática usando 2,0 FPU/gTS (dose de enzima cumulativa neste processo 2,3FPU/gTS) a 50°C e seguida de fermentação para produção de etanol (21g/L) a 37°C pela mesma cepa de levedura. Neste experimento não há adição externa de indutores (HMF e/ou furfural) ao processo porque os indutores são preexistentes na biomassa pré-tratada e a concentração existente foi suficiente para a indução de xilitol por S. cerevisiae DBT-IOC S24. (Figura 2).

[046] A presente invenção relata rendimento de conversão de xilitol quase próximo ao rendimento teórico para xilitol com título de 37 g/l. A produção global de xilitol é de 99% em comparação com a concentração inicial de xilose de rendimento teórico máximo de 0,91 g/g de produção de xilitol a partir de xilose em condições aeróbias (Barbosa et al., 1988) no caldo de fermentação.

[047] A análise comparativa foi fornecida nas tabelas dadas abaixo, mostrando que o processo da presente invenção é eficiente em termos de rendimento de xilitol individualmente, produção combinada de xilitol e etanol em comparação com outros processos conhecidos no estado da técnica.

[048] Tabela 1. Co-produção de xilitol e etanol por diferentes linhagens de leveduras

[049] Tabela 2. Produção de xilose em xilitol por diferentes linhagens de leveduras:

[050] Será assim visto que os objetivos expostos acima, entre aqueles tornados evidentes a partir da descrição anterior, são eficientemente alcançados, e uma vez que certas mudanças podem ser feitas nas construções estabelecidas sem se afastar do espírito e escopo da invenção , pretende-se que todos os assuntos contidos na descrição acima sejam interpretados como ilustrativos e não em um sentido limitativo. A invenção foi descrita com referência a modalidades preferidas e alternativas. Modificações e alterações se tornarão evidentes para os versados na técnica após a leitura e compreensão da discussão detalhada da invenção na presente invenção fornecida. Esta invenção se destina a incluir todas essas modificações e alterações na medida em que estão dentro do escopo da presente invenção. Estas e outras modificações das modalidades preferidas, bem como outras modalidades da invenção, serão óbvias a partir da divulgação na presente invenção, em que o assunto descritivo anterior deve ser interpretado meramente como ilustrativo da invenção e não como uma limitação.

[051] Finalmente, na medida necessária para compreender ou completar a divulgação da presente invenção, todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados na presente invenção são expressamente incorporados por referência nos mesmos na mesma medida como se cada um fosse individualmente assim incorporado.

Claims

Processo de produção de xilitol a partir de xilose caracterizado por compreender as etapas de:
- a) inocular uma cepa de levedura natural termotolerante e tolerante a inibidor tendo concentração de indutor 10 mM em um meio de fermentação sintético contendo 4% de xilose, 1% de glicose, 0,2% de extrato de levedura e 0,1% de peptona e incubando a uma temperatura de 37 ° C e a 200 rpm;
- b) adicionar 290-360 mg de glicose e 8,0-12,0 mg de indutor em cada intervalo de 15 minutos a um litro de caldo fermentado contendo meio sintético conforme descrito acima, após 6 horas de fermentação;
- c) manter a aeração em 1VVM e pH em 5,0 no meio; e d) obter rendimento de xilitol de 99%.
Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida cepa de levedura natural termotolerante e tolerante a inibidor é Saccharomyces cerevisiae DBT-IOC S24 (MTCC25086).
Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que 300 mg de glicose e 10 mg de indutor são adicionados a cada intervalo de 15 minutos a um litro de caldo fermentado contendo meio sintético, após 6 horas de fermentação.
Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido indutor de xilitol derivado de biomassa de lignocelulose é selecionado a partir de furfural ou HMF.
Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os referidos açúcares compreendem glicose e xilose em uma proporção de combinação de 1:4.
Processo de produção de xilitol a partir de extrato líquido de biomassa pré-tratada com ácido diluído (LEPB), caracterizado por compreender as etapas de:
- a) inocular uma cepa de levedura natural termotolerante e tolerante ao inibidor (Saccharomyces cerevisiae DBT-IOC S24 (MTCC25086)) na concentração de 2 g/L de célula para extrato líquido de biomassa pré-tratada com ácido diluído contendo 4% de xilose, 1% de glicose, indutores principais selecionados a partir de furfural ou HMF;
- b) manter a aeração em 1VVM e pH em 5,0 durante o processo de fermentação;
- c) obter rendimento de xilitol de 99%.
Processo de acordo com as reivindicações 1 e 6, caracterizado pelo fato de que a fermentação é realizada durante 120-140 horas a 37°C para a obtenção de xilitol com um rendimento de 0,89 g/g.
Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido extrato líquido de biomassa pré-tratada com ácido diluído (LEPB) contém 4% de xilose, 1% de glicose, indutores principais selecionados a partir de furfural ou HMF.
Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a concentração de indutores varia entre 0,5 a 1,2 g/L dependendo da gravidade da biomassa pré-tratada.
Processo de fermentação de duas etapas para a coprodução de xilitol e etanol a partir de biomassa pré-tratada com ácido, caracterizado por compreender as etapas de:
- a) diluir a biomassa pré-tratada com ácido usando a cepa de levedura natural termotolerante e tolerante a inibidor Saccharomyces cerevisiae DBT-IOC S24 (MTCC25086);
- b) adicionar a enzima celulase 0,3 FPU/TS ao carregamento de sólidos de biomassa de 15% no estágio inicial do processo para liberar açúcar de glicose durante o processo que facilita a absorção de xilose por Saccharomyces cerevisiae DBT-IOC S24 (MTCC25086) e mantendo o crescimento adequado das células de levedura;
- c) obter rendimento de conversão de xilitol até 99% do rendimento teórico;
- d) submeter a biomassa restante à hidrólise enzimática pela adição de celulase a 2,0 FPU/gTS a 50°C por 31 horas; seguida de fermentação para produção de etanol por inoculação de levedura Saccharomyces cerevisiae DBT-IOC S24 (MTCC25086) a partir de açúcar glicose;
- e) obter concentração de 21 g/L de etanol a 37°C por Saccharomyces cerevisiae DBT-IOC S24 (MTCC25086), após fermentação final.