BR102020013240A2 - Ligantes binucleantes fenólicos, compostos metálicos binucleares, composição médico-veterinária, processos de síntese de ligantes binucleantes, processo de síntese de compostos binucleares, método de tratamento de neoplasias e doenças fúngicas e uso - Google Patents

Abstract

ligantes binucleantes fenólicos, compostos metálicos binucleares, composição médico-veterinária, processos de síntese de ligantes binucleantes, processo de síntese de compostos binucleares, método de tratamento de neoplasias e doenças fúngicas e uso. a presente invenção trata de novas metalodrogas contendo um centro de coordenação binuclear de cobre(ii) e os ligantes binucleantes não-simétricos 2-hidroxi-3-{[(2-hidroxibenzil)(2-piridilmetil)amino]-metil}-5-metilbenzaldeído isonicotinoíl hidrazona (h3l1) ou 2-hidroxi-3-{bis[(2-piridilmetil)amino]-metil}-5-metilbenzaldeído isonicotinoíl hidrazona (h2l2) adequadas para o tratamento de neoplasias envolvendo tumores sólidos e/ou leucemias, bem como doenças de natureza oportunista, tais como as doenças causadas por fungos patogênicos.

Description

LIGANTES BINUCLEANTES FENÓLICOS, COMPOSTOS METÁLICOS BINUCLEARES, COMPOSIÇÃO MÉDICO-VETERINÁRIA, PROCESSOS DE SÍNTESE DE LIGANTES BINUCLEANTES, PROCESSO DE SÍNTESE DE COMPOSTOS BINUCLEARES, MÉTODO DE TRATAMENTO DE NEOPLASIAS E DOENÇAS FÚNGICAS E USO Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a novas metalodrogas contendo um centro de coordenação binuclear de cobre(II) e os ligantes binucleantes não-simétricos 2-hidroxi-3-{[(2-hidroxibenzil)(2-piridilmetil)amino] -metil}-5-metilbenzaldeído isonicotinoíl hidrazona (H3L1) ou 2-hidroxi-3-{bis[(2-piridilmetil)amino] -metil}-5- metilbenzaldeído isonicotinoíl hidrazona (H2L2) para tratamento de neoplasias envolvendo tumores sólidos e/ou leucemias, bem como doenças de natureza oportunista, tal como as doenças causadas por fungos patogênicos. Em uma visão mais ampla, a presente invenção se insere no campo de aplicação da química, farmácia, medicina, biologia e bioquímica, mais especificamente na área de preparações de medicamentos contendo ingredientes ativos.

Antecedentes da Invenção

[002] O câncer está entre as principais causas de óbito no mundo. Assim, o desenvolvimento de estratégias quimioterapêuticas envolvendo novos agentes antitumorais tem sido uma das áreas de foco para tratamento da doença.

[003] O pioneiro sucesso clínico da metalodroga cisplatina não só permitiu o desenvolvimento de fármacos à base de platina, mas também o uso de outros metais de transição que visam ser mais eficazes e eficientes quanto a: (i) a farmacologia; (ii) aumento da sobrevida dos pacientes; (iii) redução dos efeitos colaterais e; (iv) redução dos custos clínicos com o tratamento.

[004] Além disso, a síntese de tais compostos tem como objetivo aumentar a interação com o DNA, superando a resistência inerente ou adquirida à cisplatina. Em particular, grande foco tem sido dirigido para o desenvolvimento de compostos inéditos de cobre, cuja atividade anticâncer tem norteado muitas pesquisas com o objetivo de descobrir novos agentes que sejam capazes de superar a resistência e os efeitos colaterais associados à cisplatina. Portanto, devido aos efeitos colaterais dos fármacos empregados na clínica atual, existe uma necessidade urgente em relação à síntese e ao desenvolvimento de novos fármacos quimioterápicos.

[005] Até o presente momento, a totalidade das metalodrogas aprovadas para uso humano no tratamento do câncer apresentam a platina como elemento central. Isto acarreta uma série de desvantagens de ordem técnica, como a elevada toxicidade da platina, provocando uma gama de efeitos colaterais indesejáveis, o surgimento de linhagens celulares tumorais resistentes à terapia e econômica, porque sendo a platina um metal relativamente raro, o custo dos reagentes de partida para a síntese das metalodrogas a base deste metal são muito caros, o que eleva sobremaneira o preço final dos fármacos.

[006] Boa parte destes problemas são evitados pela aplicação do cobre na síntese, um metal barato, muito mais reativo que a platina (o que diminui o tempo de síntese das metalodrogas) e, ainda mais importante, um metal fisiológico que diminui de forma significativa os efeitos colaterais associados ao seu uso prolongado em ciclos quimioterápicos.

[007] Existem estudos e desenvolvimentos que buscam esta transição entre a platina e o cobre, porém ainda não atingiram o resultado desejado. Por exemplo, o documento brasileiro, BR1120190241353, com data de prioridade 18/05/2017, intitulado de “TERAPIAS DE COMBINAÇÃO PARA O TRATAMENTO DE CÂNCER”, reporta um método para tratamento do câncer por meio de terapia de combinação envolvendo um agente inibidor da sinalização da poli[ADPribose] polimerase (PARP) e um segundo agente que regula a atividade dentro do microambiente tumoral, sendo um inibidor de células T reguladoras (Treg), um agente inibidor de macrófagos, um agente intensificador da resposta imune específica para o antígeno ou, ainda, uma combinação deles. Mais especificamente, a composição farmacêutica descrita neste documento trata de um grupo de agentes inibidores de macrófagos, dentre os quais destacam-se um quelato de cobre. A referência brasileira trata de uma terapia contra o câncer (mama, pulmão e/ou próstata) por meio do uso coadjuvante de quelatos de cobre, mas não propõe o uso de metalodrogas baseadas no metal em si. Além disso, o mecanismo intrínseco por trás da ação antitumoral é proposto como sendo o melhoramento da resposta imune ou o aumento da atividade de uma célula imune em um paciente com uma doença ou condição.

[008] Um outro exemplo ainda mais próximo seria o documento EP145711, com data de prioridade 10/06/1983, o qual é intitulado de “COPPER COMPLEX FOR TREATING CANCER” e apresenta complexos de cobre(II) exibindo atividades análogas à da enzima superóxido dismutase (SOD) em células de mamíferos. Tal propriedade é utilizada para o tratamento de câncer, visto que substitui a atividade SOD perdida ou significativamente reduzida em células cancerígenas. O tratamento proposto no documento EP145711 realmente apresenta vantagens quando comparado a outros métodos de seu estado da técnica, demonstrando que o cobre possui potencial para a redução do crescimento tumoral, aumento da sobrevida do organismo hospedeiro, diminuição das metástases tumorais ou ainda efeitos sobre a diferenciação morfológica das células cancerosas. Porém, o documento reporta compostos de cobre que incluem complexos de ligantes do tipo salicilato, seus solvatos, bem como suas misturas. Drogas estruturalmente simples, cuja eficácia pouco tem a ver com a natureza do ligante utilizado e sim com a atividade SOD inerente a complexos de diversos metais. Além disso, o mecanismo de ação proposto visa apenas uma das características das células tumorais, que é a recomposição da atividade SOD perdida nas células de câncer, criando desta maneira uma condição para interromper a divisão celular e, consequentemente, o crescimento do tumor. Como o modo de ação destes complexos não envolve o processo de morte celular, o que acaba por inviabilizar a associação do conceito de citotoxicidade (IC50) ao de atividade, torna-se difícil a comparação de sua eficácia com a de outros compostos. Assim, fica claro que o desenvolvimento racional de novos ligantes e a preparação de complexos que exibam mecanismos alternativos, e de preferência múltiplos, de ação pode em muito melhorar a eficácia dos novos agentes antitumorais obtidos.

[009] Uma classe importante de complexos de cobre propostos no âmbito da quimioterapia do câncer é descrita nos documentos americanos US5107005 e US5576326, datados de 21/04/1992 e 19/11/1996, respectivamente. Sob os títulos “Process to obtain new mixed copper aminoacidate complexes from phenylate phenanthrolines to be used as anticancerigenic agents” e “Copper amino acidate diimine nitrate compounds and their methyl derivatives and a process for preparing them”, essas invenções se referem à síntese de uma série de novos complexos ternários mononucleares de cobre(II) contendo aminoácidos e fenantrolinas aromáticas como ligantes. Os compostos foram propostos como agentes antitumorais com uso terapêutico preferencial para o tratamento de tumores sólidos e do sangue (ex. leucemia). Os resultados de citotoxicidade mostraram que o complexo mononuclear de cobre testado, a saber [Cu(4,7-dimethyl-1,10-phenanthroline)(glycinato)] NO3 apresenta atividade sutilmente superior à cisplatina, porém inferior à mitomicina, drogas de referência empregadas na terapia do câncer. Os ensiaos com animais de experimentação (ratos da linhagem B6D2F1) mostraram que apenas para doses mais elevadas do composto foi possível verificar aumento da sobrevida dos animais afetados pela inoculação de células de leucemia linfoide. Contudo, a sua menor atividade em relação à droga de referência (mitomicina), a falta de um aprimorado teste estatístico para comparação dos resultados obtidos com a cisplatina, a falta de comparação dos ensaios em animais com as drogas de referência, a falta de definição com relação ao mecanismo de morte celular (ex. apoptose ou necrose) e o fato da invenção se referir apenas a complexos mononucleares de cobre deixam campo aberto para o aprimoramento dessas metalodrogas.

[010] O documento europeu EP2407164, publicado em 18/01/2012, e intitulado de “Copper II complexes of phenanthroline and their use in cancer treatment” revela complexos ternários mono- ou binucleares de cobre(II) em que o metal encontra-se ligado a uma das extremidades de um dicarboxilato aromático, não aromático ou alifático, o qual atua como ponte no caso dos complexos binucleares, e dois ligantes bidentados do tipo fenantrolina completam a esfera de coordenação dos centros cúpricos pentacoordenados. Eventualmente, um sexto ligante monodentado pode vir a estar presente. Os complexos são propostos como nucleases auto-ativadas para o tratamento de câncer e outras desordens proliferativas. Dentre os tipos de câncer abarcados pela tecnologia descrita no documento EP2407164 estão o câncer de colon, mama, próstata e ovário. Além disso, o mecanismo de ação está relacionado à clivagem controlada de DNA e RNA pelos complexos, os quais apresentam um importante avanço em relação à técnica anterior, pois inclui dois íons cobre(II) em alguns dos compostos reivindicados. Se trata da principal referencia do atual estado da técnica. Estes complexos, contudo, apresentaram baixa eficácia geral em relação àqueles descritos na presente invenção: por exemplo, na linhagem de câncer de mama MCF-7, sob condições similares de teste, os compostos do documento EP2407164 foram ~400 vezes menos ativos (compostos 1-3), ~40 vezes menos ativos (compostos 4 e 5) e ~8 vezes menos ativo (composto 6) que os complexos 1 e 3 da presente invenção, descritos mais à frente. Além disso, nos complexos binucleares apresentados no documento EP2407164, a distância inter-metálica é demasiado grande como para permitir um efeito cooperativo entre ambos os centros cúpricos. Desta forma, ainda é preciso desenvolver metalodrogas que contenham cobre(II), que possam atuar também por meio da fragmentação do DNA, ou mesmo através de múltiplos mecanismos simultaneamente, mas com ligantes que as tornem ainda mais ativas e mais seletivas às células cancerígenas.

[011] Com relação ao tratamento de infecções fúngicas, cabe citar o documento chinês CN102503901, datado de 20/06/2012 e intitulado “Zole antifungal compounds, and preparation method and application thereof”. Assim como o pedido de patente WO2002039963, publicado em 23/05/2002 e intitulado de “Antifungal nail composition and method of use”, ambos tratam de tecnologias que utilizam compostos que contêm cobre para o tratamento de infecções por fungos, dentre os quais destacam-se as seguintes espécies: Candida tropicalis e Candida albicans. No entanto, os documentos falham em propor um tratamento antifúngico a base de cobre aplicável a um espectro mais amplo de patógenos incluindo, por exemplo, os fungos C. parapsilosis e C. krusei, de extrema importância em situações de neoplasias e tumores avançados, e ainda outros, tais como Aspergillus spp, Cryptococcus spp, Scedosporium spp, Fusarium spp, Zygomycetes spp e Trichosporon spp, os quais são frequentemente encontrados em pacientes imunocomprometidos por conta da quimioterapia.

[012] Adicionalmente, no pedido de patente WO2002039963, é reportado um método de tratamento de micoses (onychomycosis) em unhas de humanos pela aplicação de uma composição contendo um sal de cobre. Não são apresentadas metalodrogas mais avançadas como as binucleares e nem ligantes específicos.

[013] Por fim, o documento brasileiro PI0416387-7, publicado em 21/02/2007, intitulado de “Composição desinfetante e métodos de confecção e uso da mesma”, descreve composição antimicrobiana que compreende um complexo único de metal com ligante monodentado, bidentado ou polidentado que exibe afinidade ao íon hidrogênio, um tensoativo ionogênico e um solvente, assim como um veículo farmaceuticamente aceitável. Essas composições têm propriedades antissépticas, sendo ativas contra bactérias gram-positivas e gramnegativas, fungos, vírus e esporos, e podem ser aplicadas em um intervalo amplo de temperaturas. Métodos de uso das composições da presente invenção no tratamento e prevenção de doenças causadas por uma variedade de patógenos são descritos. Entretanto, a invenção não trata da sua eficácia contra células cancerígenas e ainda faz referência a complexos mononucleares cuja atividade antimicrobiana depende da associação com outras moléculas.

[014] Diante do acima exposto, fica demonstrado que o uso do metal cobre já se mostra como uma alternativa tecnológica à platina, porém se baseia, até o presente momento, em composições mononucleares contendo o íon cobre(II). Mesmo quando dois ions cobre(II) são utilizados, em complexos binucleares voltados à atividade antitumoral, não se observa ainda o efeito cooperativo esperado, o que resulta em baixa atividade. Adicionalmente, esses compostos não têm sido capazes de associar o tratamento concomitante ou mesmo isolado de fungos, o que possibilitaria uma quimioterapia do câncer que promovesse ao mesmo tempo o combate às doenças oportunistas causadas por fungos.

[015] Assim, seria interessante se desenvolver novos compostos baseados em metais, metalodrogas com potente atividade antitumoral e antifúngica, na forma de complexos binucleares de cobre(II) contendo ligantes N-acil-hidrazônicos. Como esperado, os novos agentes agem por meio de um mecanismo diferente de ação e bases moleculares próprias envolvidas no processo de morte celular.

Descrição Resumida da Invenção

[016] A presente invenção prevê, desta maneira, novas metalodrogas, processo de síntese, método de tratamento, uso na fabricação de medicamentos para o tratamento de tumores e doenças fúngicas em humanos e outros mamíferos, assim como composição farmacêutica e veterinária, baseada em complexos binucleares de cobre(II), não-simétricos, com efeito citotóxico sobre linhagens celulares de câncer de próstata, mama e pulmão e que também venham a apresentar atividade antifúngica e baixa toxicidade para células saudáveis.

[017] Deste modo, uma primeira modalidade de invenção é o desenvolvimento de novas alternativas tecnológicas, voltadas aos novos compostos/complexos binucleares de cobre com atividade antitumoral, com potencial grande impacto sobre a atual quimioterapia do câncer, cujo arsenal de substâncias poderia ser substituído ou mesmo opcionalmente combinado aos novos compostos.

[018] O potencial biotecnológico apresentado por estes novos complexos não se limita à atividade antitumoral, pois também se mostraram ativos contra fungos patogênicos (ex. Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis e Candida krusei), mostrando grande versatilidade de aplicação para uso na terapia contra o câncer e patologias oportunistas causadas por fungos.

[019] Cabe ressaltar que as patologias causadas por fungos apresentam alta incidência mundial e impactam, muito em particular, indivíduos com algum tipo de imunodeficiência (celular ou humoral), tais como os pacientes em tratamento quimioterápico contra o câncer. Por fim, além de serem empregados na terapia de neoplasias, bem como de doenças fúngicas, tais compostos poderão servir como plataforma para síntese de novos compostos modificados estruturalmente que aumentem a eficácia contra as células tumorais e/ou fungos patogênicos.

[020] A presente invenção provê, portanto, nesta primeira modalidade, quatro metalodrogas derivadas de dois novos precursores hidrazônicos não-simétricos, a saber: 2-hidroxi-3-{[(2-hidroxibenzil)(2-piridilmetil)amino] -metil}-5- metilbenzaldeído isonicotinoíl hidrazona (H3L1), conforme formula estrutural abaixo e ilustrado na figura 1, e 2-hidroxi-3-{bis[(2-piridilmetil)amino] -metil}-5- metilbenzaldeído isonicotinoíl hidrazona (H2L2), conforme formula estrutural abaixo e ilustrado na figura 1, pertencentes ao amplo grupo dos ligantes binucleantes, isto é, capazes de formar complexos binucleares por proporcionarem ambientes de coordenação apropriados para acomodar dois centros metálicos a uma proximidade, tal, que um efeito cooperativo entre ambos seja possível, e até mesmo esperado

[021] A diferença entre esses ligantes está relacionada com sua porção nãohidrazônica: enquanto H3L1 apresenta grupos doadores terminais fenol e piridina (portanto, diferentes), H2L2 possui dois grupos piridina. Assim, como o número de átomos de oxigênio e nitrogênio disponíveis para doação de pares eletrônicos varia nesses ligantes, a dureza/maciez desse sítio de coordenação também se altera. Os complexos binucleares de cobre(II) gerados a partir de H3L1 e H2L2, tanto aqueles com uma ponte exógena hidróxido (postulada como a forma ativa) quanto aqueles com pontes exógenas acetato (pró-drogas que gerariam a forma biologicamente ativa por reação de hidrólise no organismo), apresentam centros de cobre(II) insaturados ou contendo ligantes lábeis, como a molécula de água, o que possibilita a interação dos mesmos com macromoléculas biológicas como, por exemplo, o DNA, RNA e/ou proteínas.

[022] Em uma segunda modalidade da presente invenção, temos composições farmacêuticas contendo as metalodrogas descritas acima, opcionalmente em conjunto com outras drogas antineoplásicas ou voltadas aos efeitos secundários do tratamento, e veículos farmaceuticamente aceitos.

[023] Em uma terceira modalidade da invenção temos o processo de produção de compostos com atividade anti-neoplásica, preparados a partir dos ligantes H3L1 e H2L2 (Figura 1), constituídos por etapas de síntese dos complexos binucleares de cobre(II): composto 1 e composto 2 conforme as formulas estruturais abaixo e ilustrados na figura 2, e composto 3 e composto 4 conforme as formulas estruturais abaixo e ilustrados na figura 3, podendo compreender após sua obtenção a associação de um ou mais destes complexos com outro fármaco antitumoral, preferencialmente, mas não se limitando, a cisplatina, para tratamento de neoplasias malignas de tumores sólidos ou leucemias.

[024] Em uma quarta modalidade da invenção, temos o uso dos complexos no tratamento de neoplasias e de doenças causadas por fungos, associadas ou não ao tratamento do câncer, em que uma quantidade farmaceuticamente ativa é administrada aos pacientes durante o tratamento com quimioterápicos ou, ainda, no decorrer de outros tratamentos antitumorais.

[025] Uma quinta e última modalidade corresponderia ao uso dos compostos sintetizados na fabricação de medicamentos voltados ao tratamento de neoplasias. Medicamentos que apresentam de forma concomitante pouca toxicidade às células humanas saudáveis, alta eficácia contra linhagens celulares malignas de próstata, mama e pulmão, além de efeito antifúngico.

Breve Descrição das Figuras

[026] As figuras a seguir descritas servem de orientação sobre a presente invenção, as quais ilustram:

• − Figura 1 - Estruturas dos ligantes binucleantes inéditos H3L1 (A) e H2L2 (B).
• − Figura 2 - Estruturas propostas para os novos complexos 1 (A) e 2 (B).
• − Figura 3 - Estruturas propostas para os novos complexos 3 (A) e 4 (B).
• − Figura 4 - Ensaio de sobrevivência das células de linhagens tumorais humanas MCF-7, A549 e PC-3 tratadas por 24 h na presença dos complexos 1 (A) e 3 (B); linhagem não tumoral humana, MCF10A, tratada com os complexos 1 e 3 (C) e; linhagens celulares MCF-7, A549, PC-3 e MCF10A submetidas a tratamento com o metalofármaco antitumoral cisplatina, usado como referência.
• − Figura 5 - Formação das EROs em células MCF-7 (A-C) e A549 (D-F) tratadas com os complexos 1 e 3, e a cisplatina.
• − Figura 6 - Avaliação do potencial da membrana mitocondrial em células MCF-7 (A-D) e A549 (E-H) tratadas com os complexos 1 (A, B, E e F) e 3 (C, D, G e H), e com o metalofármaco antitumoral cisplatina.
• − Figura 7 - Atividade caspase 8 e 9 em células A549 (A e B) e MCF-7 (C e D) tratadas com os complexos 1 e 3, e o metalofármaco antitumoral cisplatina.
• − Figura 8 - Análise da fragmentação do DNA (TUNEL) em células MCF-7 (A) e A549 (B) tratadas com os complexos 1 e 3, e com a cisplatina. Histogramas (C) mostrando a população de células em apoptose. As barras correspondem à média ± erro padrão de 3 experiências independentes.
• − Figura 9 - Análise da inibição do ciclo celular (proliferação celular) durante o tratamento com os complexos 1 e 3 e o metalofármaco antitumoral cisplatina em células de câncer MCF-7 (A e C) e A549 (B e C). Histogramas (C) representativos da população de células distribuídas pelo ciclo celular, correspondendo à média ± erro padrão de 3 experiências independentes.
• − Figura 10 - A toxicidade do complexo 1 foi analisada em modelo invertebrado, Galleria mellonella. (A) Curva de sobrevivência; (B) Número de larvas; (C) Número de pupas e (D) Número de mariposas.
• − Figura 11 - Rota sintética utilizada na preparação dos complexos binucleares de cobre(II) 1 e 3, incluindo as condições de síntese e rendimentos obtidos. As etapas destacadas no quadro cinza correspondem aos processos intrínsecos referentes à síntese dos novos compostos (ligante H3L1 e complexos 1 e 3), e diferenciam a presente rota sintética de outras existentes na literatura.
• − Figura 12 - Rota sintética utilizada na preparação dos complexos binucleares de cobre(II) 2 e 4, incluindo as condições de síntese e rendimentos obtidos. As etapas destacadas no quadro cinza correspondem aos processos intrínsecos referentes à síntese dos novos compostos (ligante H2L2 e complexos 2 e 4), e diferenciam a presente rota sintética de outras existentes na literatura.

Descrição Detalhada da Invenção

[027] A presente invenção descreve, portanto, “Complexos binucleares de cobre(ii) com potente atividade antitumoral, composição, processo de síntese química e uso na preparação de medicamentos e no tratamento do câncer e de infecções por fungos patogênicos”, que buscam atender a crescente demanda por novos tratamentos para as neoplasias, tanto aquelas que envolvem tumores sólidos quanto leucemias, bem como de doenças fúngicas.

[028] Mais especificamente, descreve novos compostos binucleares de cobre(II), diferentes daqueles existentes no estado da técnica, pois apresentam alterações quanto à estrutura química, atividade tóxica contra células de câncer humanas e, ao mesmo tempo, menor toxicidade às células não cancerígenas do organismo. Assim, mostram uma maior eficácia e menores efeitos colaterais, oferecendo ao paciente submetido ao tratamento quimioterápico contra o câncer maior qualidade de vida e sobrevida.

[029] Os compostos de coordenação binucleares de cobre(II) e ligantes nãosimétricos preferidos da presente invenção, são: 2-hidroxi-3-{[(2-hidroxibenzil)(2- piridilmetil)amino] -metil}-5-metilbenzaldeído isonicotinoíl hidrazona (H3L1) conforme formula estrutural abaixo e ilustrado na figura 1 e 2-hidroxi-3-{bis[(2- piridilmetil)amino] -metil}-5-metilbenzaldeído isonicotinoíl hidrazona (H2L2) conforme formula estrutural abaixo e ilustrado na figura 1, assim como os seus respectivos complexos binucleares de cobre(II) contendo pontes exógenas do tipo acetato: composto 1 e composto 2 conforme as formulas estruturais abaixo e ilustrados na figura 2 ou hidroxo: composto 3 e composto 4 conforme as formulas estruturais abaixo e ilustrados na figura 3.

[030] A escolha do metal teve como principal objetivo minimizar a toxicidade ao organismo, tratando-se o cobre, a diferença da platina, de um metal fisiológico encontrado em diversas metaloenzimas presentes nas células humanas.

[031] Neste sentido, a Figura 4 representa graficamente a citotoxicidade dos complexos de cobre(II) e cisplatina isolados nas linhagens celulares de câncer de pulmão (A549), de mama (MCF-7) e de próstata (PC-3). A citotoxicidade foi avaliada através do ensaio MTT em células tumorais tratadas por 24 horas na presença dos novos complexos binucleares de cobre, 1 (A) e 3 (B), na linhagem MCF10A (controle de célula humana não tumoral) tratada com os complexos 1 e 3 (C), e nas células MCF-7, A549, PC-3 e MCF10A tratadas com cisplatina (D). Os resultados foram calculados a partir de experiências realizadas em triplicata (n=3) e são representados como média ± erro padrão da média.

[032] Os resultados das curvas de sobrevivência foram usados para determinar a concentração necessária para matar 50% das células (IC50) tratadas com os complexos de cobre e cisplatina. A atividade citotóxica dos complexos para as células de origem tumoral foi cerca de 10-30 vezes superior às encontradas para a cisplatina (Figura 1 e Tabela 1). A linhagem MCF10A, célula epitelial de mama (célula não cancerígena) foi aproximadamente 7 e 8 vezes menos sensível aos tratamentos com os complexos de cobre, respectivamente, do que a linhagem de câncer de mama (MCF-7) (Figura 1 e Tabela 1).

[033] Em relação ao mecanismo de ação na qual se baseia a atividade destes novos complexos, observa-se que a Figura 5 representa graficamente a indução da produção de espécies reativas de oxigênio (ou EROs), um fator crítico para a indução do processo endógeno de apoptose em células de câncer, durante o tratamento com os novos complexos 1 e 3, e com o quimioterápico usado como controle do experimento, o qual também é aplicado na terapêutica do câncer, doxorubicina. O tratamento com a metade do valor de IC50 dos complexos 1 e 3 já é capaz de provocar o aumento da indução da produção das EROs. A Figura 5 mostra os resultados representativos de uma série de, no mínimo, três experimentos independentes realizados nas linhagens MCF-7 (A, B e C) e A549 (D, E e F) e representa a média ± erro padrão da média. Os símbolos (#) e (***) representam diferença estatística em relação aos tratamentos de controle.

[034] A Figura 6 representa graficamente a alteração/perda do potencial de membrana da mitocôndria ( m), alvo das espécies reativas de oxigênio e primeira etapa na indução do processo endógeno de apoptose, durante o tratamento de células de câncer com os novos complexos de cobre 1 e 3, e o metaloquimioterápico usado na terapêutica do câncer, cisplatina. Nessa figura, é apresentada uma representação gráfica do nível de potencial mitocondrial da membrana, expresso como unidades arbitrárias de fluorescência nas linhagens MCF-7 (Figura 6A e C) e A549 (Figura 6E e G). Na Figura 6 também podemos observar, em forma de barras, a média ± erro padrão da média dos valores de Δ♆m em unidades arbitrárias de fluorescência de uma série de, no mínimo, três experimentos independentes realizados para as linhagens MCF-7 (Figura 6B e D) e A549 (Figura F e H). O símbolo (*) representa diferença estatística em relação aos tratamentos de controle.

[035] A Figura 7, por sua vez, representa graficamente a ativação das enzimas caspase 8 (Figura 7A e C) e 9 (Figura 7B e D), as quais são chave na ativação do processo de apoptose, durante o tratamento das células de câncer com os complexos 1 e 3 e o quimioterápico antitumoral cisplatina. Os resultados obtidos são expressos como média ± erro padrão da média de, no mínimo, três experiências independentes e são mostrados como uma relação entre a atividade de células tratadas com os novos complexos 1 e 3 ou cisplatina e células não tratadas. O símbolo (*) representa diferença estatística em relação às células não tratadas com os compostos de cobre ou cisplatina.

[036] A Figura 8 representa graficamente a indução do processo de apoptose através da análise da quebra / fragmentação do DNA das células de câncer pela técnica TUNEL [Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-End Labeling] durante tratamento com os novos complexos 1 e 3, e o quimioterápico antitumoral cisplatina. Na Figura 8 (A e B) podem ser observados histogramas representativos TUNEL mostrando a porcentagem de células em apoptose após o tratamento com cisplatina ou com os complexos de cobre(II) nas linhagens A549 (A) e MCF-7 (B), respectivamente. A Figura 8C, por sua vez, representa a média ± erro padrão da média de, no mínimo, três experiências independentes com células A549 e MCF-7 tratadas com cisplatina ou com os complexos de cobre(II). O símbolo (*) representa diferença estatística em relação às células não tratadas com os compostos de cobre ou cisplatina.

[037] Na Tabela 2, analisamos a competição pela ligação intercalativa ao DNA entre os complexos 1 e 3 e a sonda fluorescente iodeto de propídio, que é capaz de se intercalar às bases nucleotídicas do DNA.

[038] A Figura 9, por outro lado, representa a análise da inibição do ciclo celular (proliferação celular) durante tratamento com os complexos 1 e 3 em células de câncer A549 e MCF-7. Na Figura 9 (A e B), apresentamos histogramas representativos da distribuição das fases do ciclo celular, demarcadas como Sub-G0/G1, G0/G1, S e G2/M (de esquerda para direita) em células A549 e MCF-7 tratadas com os complexos 1 e 3, e a cisplatina, respectivamente. Na Figura 9 (C), observamos a média ± erro padrão da média de, no mínimo, três experiências independentes de contagem da população de células em SubG0/G1, fase que indica que as células estão em processo de apoptose causado pelo tratamento com cisplatina ou com os complexos. O símbolo (*) representa diferença estatisticamente significativa em relação ao controle, células não tratadas com cisplatina ou com os compostos de cobre. O símbolo (#) representa diferença estatística em relação aos tratamentos com cisplatina.

[039] A Figura 10 representa graficamente a toxicidade do complexo 1 e do quimioterápico usado na terapêutica do câncer, cisplatina em modelo animal alternativo, Galeria mellonella. O experimento foi realizado pela injeção de 1 ou cisplatina, ambos nas mesmas concentrações (1,0 mg/mL), diretamente na hemocele das larvas de G. mellonella. A notar, o complexo não apresentou toxicidade e também não interferiu nas fases de desenvolvimento (larva, pupa e mariposa) do modelo animal alternativo empregado no estudo, mostrando um perfil significativamente diferente daquele observado para o tratamento com o quimioterápico usado no tratamento do câncer, cisplatina.

[040] Quanto ao processo de síntese, os complexos binucleares são resultado de uma rota preparatória bastante complexa (Figura 11), desenvolvida na busca por novos agentes com maior eficácia para eliminar ou reduzir a proliferação das células tumorais. Neste contexto, alguns trabalhos sobre compostos binucleares de cobre com uma diversa gama de aplicações já foram publicados em revistas científicas internacionais. No entanto, em todos eles, as estruturas apresentadas são diferentes das que estamos propondo no presente estudo.

[041] Destes trabalhos, iremos destacar duas referências, discutidas aqui de forma mais aprofundada, complementando assim os antecedentes da invenção. Embora possam parecer semelhantes, esses documentos são essencialmente distintos no que tange à estrutura dos ligantes utilizados, eficácia contra as células de câncer humano e seletividade.

[042] A primeira delas é a referência publicada por Rey, et al. em 2009 [J. Inorg. Biochem. 103 (2009) 1323–1330] , sendo o primeiro autor pertencente ao grupo de inventores da presente invenção. A publicação também explora um composto binuclear de cobre(II) contendo ponte exógena do tipo µ-hidroxo como agente antitumoral. Entretanto, existem importantes diferenças entre esse composto e aqueles alvos da presente invenção, diferenças essas responsáveis pela maior atividade dos novos compostos em comparação ao da publicação.

[043] A maior diferença, e, portanto, a mais digna de nota, é certamente o caráter não-simétrico dos ligantes nos complexos a serem patenteados, em contraposição à base de Schiff simétrica derivada do ligante tridentado facial 6-amino-6-metilperidro-1,4-diazepina utilizada como precursor na publicação.

[044] Ambos os ligantes descritos neste relatório técnico são não-simétricos e contêm um “braço pendente” hidrazônico como característica mais marcante. É precisamente essa característica estrutural diferenciada que torna os compostos de coordenação resultantes desta invenção de 10 até 30 vezes mais ativos que a cisplatina, frente às linhagens celulares MCF-7, PC-3 e A549, enquanto que o anterior (publicação de 2009) é 37 vezes menos ativo que essa droga de referência na linhagem de leucemia testada, K562.

[045] Por outro lado, com relação à recente publicação [Inorg. Chem. 58 (2019) 8800−8819] , também assinada pelo Prof. Nicolás A. Rey, destacamos: apesar de ambos os ligantes reportados neste artigo serem não-simétricos e possuírem também um “braço” hidrazônico, os grupos substituintes presentes na função hidrazona são diferentes dos presentes nos compostos da presente invenção. Enquanto na publicação (2019) têm-se os anéis substituintes heteroaromáticos de cinco membros 2-tiofeno e 2-furano, os compostos da presente invenção apresentam uma vantagem, a qual é caracterizada pelo anel de seis membros 4-piridina, cuja presença decorre do uso da isoniazida, conhecido agente antituberculose, como hidrazida de partida no preparo dos novos ligantes.

[046] Esta mudança estrutural causa um impacto direto sobre a atividade dos próprios ligantes orgânicos, assim como sobre o índice de seletividade dos complexos metálicos. Desta forma, sendo a isoniazida um fármaco comercial, a sua toxicidade é relativamente baixa em relação àquelas das hidrazidas contendo anéis tiofênicos e furánicos. Por esse motivo, enquanto os ligantes derivados da isoniazida não se mostram muito ativos per se, os ligantes descritos no trabalho de 2019 são bastante citotóxicos contra diversas linhagens de células de câncer. Porém, essa atividade intrínseca dos ligantes tiofênicos e furánicos está associada a uma elevada toxicidade dos complexos metálicos, o que leva à queda no índice de seletividade. Desta maneira, os complexos binucleares de cobre(II) da presente invenção possuem índices de seletividade entre 5 e 8, enquanto aqueles publicados anteriormente têm índices da ordem de 1-2, o que constitui uma vantagem para os novos compostos.

[047] Além disso, enquanto o artigo trata apenas de compostos com ponte exógena µ-hidroxo, o presente relatório técnico incorpora também complexos contendo uma ou duas pontes do tipo µ-acetato. Estas variantes podem ser consideradas pró-drogas, que manteriam a atividade em relação aos complexos com ponte µ-hidroxo mas seriam menos tóxicas para as células normais do organismo, uma vez que poderiam ser ativadas in situ, como pode ser visto nos resultados obtidos para a linhagem normal de mama humana MCF10A.

[048] Finalmente, nas publicações descritas acima, os autores não mostraram o mecanismo de ação pelo qual os compostos provocam a morte das células (ex. apoptose), o que poderia constituir uma desvantagem dos compostos publicados caso a morte celular induzida seja por necrose. Na presente invenção, devido à alta citotoxicidade e indução de grande produção de EROs e perda significativa do Δ♆m, acompanhada da ativação da caspase 9 e fragmentação de DNA, apresentamos compostos que causam claramente a morte celular por apoptose, através da via intrínseca, dependente de sinais provenientes da mitocondria. Dados proteômicos obtidos pelo grupo do presente estudo demonstram que a ativação direta da apoptose ocorre através do fator indutor de apoptose (AIF), por meio da regulação negativa da via RAS-ERK.

[049] A regulação negativa da caseína cinase, calpaína, bem como das subunidades catalíticas e reguladoras do proteossomo, também promovem a ativação das vias de degradação do DNA. Além disso, a regulação negativa da enzima glicolítica piruvato cinase, indica uma regulação negativa da glicólise, forçando as células tumorais a realizarem o metabolismo respiratório, através da fosforilação oxidativa. Estes resultados permitem considerar que 1 e 3 são potenciais agentes terapêuticos contra câncer de mama, pulmão e próstata.

[050] De forma a melhor ilustrar as formas possíveis e preferidas da presente invenção, são apresentados exemplos dos diferentes processos de síntese envolvendo os ligantes binucleantes não-simétricos e os respectivos complexos de coordenação binucleares obtidos a partir deles.

Exemplo 1: Síntese - ligante não-simétrico 2-hidroxi-3-{[(2- hidroxibenzil)(2-piridilmetil)amino] -metil}-5-metilbenzaldeído isonicotinoíl hidrazona (H3L1)

[051] Este ligante não-simétrico foi preparado a partir do intermediário sintético hbpamff, isto é, do composto 2-hidroxi-3-{[(2-hidroxibenzil)(2-piridilmetil)amino] - metil}-5-metilbenzaldeído. Uma solução metanólica (5 mL) da hidrazida do ácido isonicotínico, isoniazida (0,138 g; 1 mmol) foi gotejada, sob agitação constante, sobre uma solução de hbpamff (0,333 g; 0,9 mmol) em 10 mL de uma mistura 1:1 MeOH:Et2O, previamente preparada num balão de 50 mL. A mistura foi refluxada por 2 horas. Durante esse período, a solução reacional foi adquirindo progressivamente uma coloração castanha. Ao término da reação, transferiu-se o conteúdo do balão para um béquer de 50 mL e deixou-se o mesmo em repouso para que, com a evaporação gradual do solvente, o produto pudesse precipitar. Dessa maneira, foi isolada uma grande quantidade de cristais castanhos. Este material foi filtrado em papel e lavado com éter etílico gelado.

[052] Obtiveram-se 0,398 g (~0,8 mmol; 481,6 g mol-1; rendimento de 90%) de produto, na forma de pequenos monocristais de cor castanha adequados ao processo de determinação estrutural por difração de raios X. p.f.: 200 ºC. Análise elementar - Porcentagens encontradas: C 69,6; H 5,9; N 14,5. Porcentagens calculadas com base na formula C28H27O3N5: C 69,8; H 5,7; N 14,5. A fórmula estrutural correspondente ao ligante H3L1 pode ser observada na Figura 1A e a representação simplificada do processo de síntese, na Figura 11.

Exemplo 2: Síntese - ligante não-simétrico 2-hidroxi-3-{bis[(2-piridilmetil) amino] -metil}-5-metilbenzaldeído isonicotinoíl hidrazona (H2L2)

[053] Este ligante foi preparado a partir do intermediário sintético bpmamff, isto é, 2-hidroxi-3-{bis[(2-piridilmetil)amino] -metil}-5-metilbenzaldeído. A isoniazida, previamente dissolvida em 5 mL de uma mixtura (v/v) 1:1 diclorometano/MeOH (0,277 g; 2 mmol) foi lentamente gotejada sobre uma solução contendo bpmamff (0,703 g; 2 mmol) dissolvido em 10 mL da mesma mistura usando ultrassom. A solução (balão de 50 mL) foi então levada a refluxo por 3 horas. Ao longo da reação, a mistura, inicialmente amarela brilhante, tornou-se laranja. O solvente foi subsequentemente removido sob pressão reduzida e o óleo obtido, deixado em repouso em 1:1 MeCN/MeOH. Após duas semanas, foram isoladas agulhas microcristalinas de cor amarelo-clara.

[054] Obtiveram-se 0,957 g (~2 mmol; 466,53 g mol-1; rendimento quantitativo) do produto, na forma cristalina. p.f.: 133 ºC. Análise elementar - Porcentagens encontradas: C 69,2; H 6,1; N 18,7. Porcentagens calculadas com base na formula C27H26O2N6: C 69,5; H 5,6; N 18,0. A fórmula estrutural correspondente ao ligante H2L2 encontra-se na Figura 1B e a representação simplificada do processo de síntese pode ser observada na Figura 12.

[055] Os complexos binucleares não-simétricos de cobre(II) compreendidos na presente invenção podem ser sintetizados pelas seguintes etapas de processo:

• 1. dissolução de uma quantidade do ligante binucleante, H3L1 ou H2L2, em um solvente orgânico puro ou mistura de solventes;
• 2. adição lenta de 2 equivalentes de sal de cobre(II), previamente dissolvido em metanol ou em uma mistura de solventes. O contra-íon presente neste sal pode ser coordenante (como, por exemplo, acetato, propionato ou, mais genericamente, um ânion carboxilato capaz de gerar uma pró-droga) ou não (assim como perclorato, haleto, dentre outros contra-íons capazes de gerar uma droga final na sua forma ativa);
• 3. a mistura reacional é então agitada, sob aquecimento moderado, por um período que pode variar de 10 minutos até 24 horas – entende-se aqui por aquecimento moderado o uso de uma temperatura menor que o ponto de ebulição do solvente ou mistura de solventes utilizada;
• 4. caso o sal de cobre usado não possua como contra-íon uma espécie coordenante, adiciona-se uma quantidade adequada de base, dissolvida em água ou metanol, com o objetivo de favorecer a formação da ponte exógena do tipo μ-hidroxo; e, por fim,
• 5. o sólido obtido é filtrado, lavado com solvente orgânico gelado e seco no vácuo. Uma maior massa de produto e, eventualmente, cristais adequados ao processo de determinação estrutural por difração de raios X podem ser obtidos pela evaporação lenta da água-mãe.

Exemplo 3: COMPLEXOS sintetizados utilizando ACETATO Síntese - [Cu2( -CH3COO)(OH2)(L1)] ·1½ H2O, composto 1:

[056] Num balão de reação de 50 mL, foram dissolvidos 0,127 g (0,26 mmol) de H3L1 em aproximados 10 mL de MeOH. A essa solução, adicionou-se, gota a gota, sob agitação constante, uma solução metanólica (20 mL) contendo 0,12 g (0,58 mmol) do sal acetato de cobre(II) monoidratado, Cu(CH3COO)2·H2O. O sistema reacional permaneceu em aquecimento por 40 minutos e, ao término desse período, o aquecimento foi interrompido, mantendo-se apenas a agitação por mais 20 minutos. Durante esse período, verificou-se que houve mudança de coloração, do amarelo inicial, passando pela cor laranja, verde e, por fim, verde escuro. A solução foi filtrada em papel e transferida para um bécher de 50 mL, para que o solvente fosse completamente evaporado por aquecimento a 60 °C. O sólido resultante foi lavado com metanol gelado, filtrado em funil de Büchner e guardado sob vácuo em dessecador contendo sílica.

[057] Obtiveram-se 0,189 g (~0,25 mmol; 709,47 g mol-1; rendimento de 98%) do produto 1, na forma de um sólido verde. Análise elementar - Porcentagens encontradas: C 49,4; H 4,4; N 8,9; Cu 19,8. Calculadas com base na fórmula [Cu2(μ-CH3COO)(OH2)(C28H24O3N5)] ·1½ H2O: C 50,8; H 4,5; N 9,8; Cu 17,9. A estrutura proposta para este composto encontra-se na Figura 2A.

Síntese - [Cu2( -CH3COO)2(OH2)(L2)] ·8 H2O, composto 2:

[058] Num balão de reação de 50 mL, foram dissolvidos 0,131 g (0,26 mmol) de H2L2 em aproximados 10 mL de uma mistura 1:1 diclorometano/MeOH. A essa solução, adicionou-se, gota a gota, sob agitação constante, uma solução (15 mL; 1:1 diclorometano/MeOH) contendo 0,106 g (0,53 mmol) de Cu(CH3COO)2·H2O. Imediatamente após a adição do sal de cobre, o sistema, inicialmente amarelo claro, tornou-se verde escuro. A mistura permaneceu em aquecimento por 40 minutos. A solução foi filtrada em papel e o sólido verde obtido foi lavado com metanol gelado e seco a vácuo. O produto foi mantido em dessecador com sílica.

[059] Obtiveram-se 0,218 g (0,25 mmol; 871,84 g mol-1; rendimento de 96%) de produto. Análise elementar - Porcentagens encontradas: C 42,6; H 5,7; N 10,9; Cu 15,0. Calculadas sobre [Cu2( -CH3COO)2(OH2)(C27H24O2N6)] ·8 H2O: C 42,7; H 5,6; N 9,6; Cu 14,6. A estrutura proposta é mostrada na Figura 2B.

Exemplo 4: COMPLEXOS sintetizados utilizando HIDRÓXIDO Síntese - [Cu2( -OH)(OH2)(HL1)] ClO4·2 H2O, composto 3:

[060] Num balão de reação de 50 mL, foram dissolvidos 0,240 g (0,5 mmol) de H3L1 em 15 mL de MeOH. A essa solução de ligante, adicionou-se, gota a gota e sob agitação constante, outra solução, também metanólica (5 mL), contendo 0,37 g (1,0 mmol) de perclorato de cobre(II) hexaidratado, Cu(ClO4)2·6H2O. Após 10 minutos, foram lentamente gotejados 1,5 mL (1,5 mmol) de NaOH aquoso de concentração 1 mol L-1. O sistema reacional permaneceu em aquecimento por 40 minutos e, ao final do período, o aquecimento foi interrompido, mantendo-se apenas a agitação por mais 20 minutos. Verificou-se que ao longo da reação houve a formação progressiva de precipitado de coloração verde, a qual se intensificou próximo ao término da síntese.

[061] Obtiveram-se 0,19 g (~0,25 mmol; 777,15 g mol-1; rendimento de 50%) do produto 3, na forma de um sólido verde, o qual foi filtrado em funil de Büchner, lavado com metanol gelado e guardado sob vácuo em um dessecador contendo sílica gel. Análise elementar - Porcentagens encontradas: C 43,6; H 3,7; N 9,1; Cu 17,3. Calculadas para [Cu2( -OH)(OH2)(C28H25O3N5)] ClO4·2 H2O: C 43,3; H 4,2; N 9,0; Cu 16,3. A estrutura proposta está esquematizada na Figura 3A, na qual o contra-íon perclorato foi omitido para efeito de simplificação.

Síntese - [Cu2(OH2)2(HL2)(ClO4)] (ClO4)2·5 H2O, composto 4:

[062] Num balão de reação de 50 mL, foram dissolvidos 0,230 g (0,5 mmol) de H2L2 em aproximados 20 mL de uma mistura 1:1 diclorometano/MeOH. A essa solução, adicionou-se, gota a gota e sob agitação constante, 0,37 g (1,0 mmol) de Cu(ClO4)2·6H2O dissolvidos em 5 mL de MeOH. Após 40 minutos, 1 mL de uma solução metanólica de KOH (1 mmol; 1 mol L-1) foi lentamente gotejado sobre a mistura. O sistema permaneceu sob agitação por mais 20 minutos. Imediatamente após a interrupção da agitação, um sólido verde escuro foi filtrado em papel, lavado com metanol gelado e seco a vácuo.

[063] Obtiveram-se 0,25 g (~0,25 mmol; 1017,08 g mol-1; rendimento de 50%) de produto, o qual foi guardado em um dessecador com sílica. Análise elementar - Porcentagens encontradas: C 28,4; H 3,5; N 8,7; Cu 12,2. Calculadas com base na fórmula [Cu2(OH2)2(C27H25O2N6)(ClO4)] (ClO4)2·5 H2O: C 31,9; H 3,9; N 8,3; Cu 12,5. A estrutura proposta está esquematizada na Figura 3B.

ENSAIOS BIOLÓGICOS

[064] O presente estudo lida com os efeitos causados por uma série de novos complexos binucleares de cobre(II) (Figuras 2 e 3) em linhagens celulares de câncer de mama (MCF-7), pulmão (A549) e próstata (PC-3). O estudo realizado analisou: (i) a sobrevivência (através do ensaio com MTT) das células de câncer; (ii) a produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (EROs) (através do ensaio com a sonda DCFH2-DA); (iii) o potencial de membrana mitocondrial (através do ensaio com a sonda fluorescente JC-1); (iv) a atividade enzimática para caspases 8 e 9; (v) a fragmentação de DNA (através da técnica TUNEL [Gravrieli et al., 1992 - Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. (1992) 119(3):493-501] ); (vi) a competição pela ligação ao DNA entre os novos complexos de cobre e a sonda fluorescente iodeto de propidio; (vii) a parada do ciclo celular (através do ensaio com iodeto de propídio) e (viii) a toxicidade dos compostos em modelo animal alternativo Galleria mellonella.

[065] Para avaliar a atividade dos complexos de cobre(II), 1 x 104 células de câncer de mama (MCF-7), pulmão (A-549), próstata (PC-3) foram cultivadas em placas de 96 e após atingirem 100% de confluência nos poços foram expostas a concentrações crescentes (0,1 a 100 µM) dos complexos de cobre. A cisplatina foi usada como controle quimioterápico por se tratar de uma droga amplamente empregada na clínica e também por ser, até hoje, a referência de compostos de coordenação com atividade antitumoral. Após 24 h de tratamento, foi realizado o teste de citotoxicidade pelo método de MTT, que após metabolizado por células vivas é convertido em cristais de formazan de cor púrpura. A sobrevivência das células foi calculada como porcentagem de células vivas em relação às células não tratadas com nenhum dos compostos.

[066] A eficiência do composto foi avaliada, através de regressão logarítmica não linear, calculando-se a concentração necessária para matar 50% das células tratadas (parâmetro IC50). Quando administrados às células de câncer humano, os compostos de cobre apresentaram citotoxicidade de 10 a 30 vezes superior às encontradas para a cisplatina (Tabela 1). É interessante notar que a linhagem MCF10A, de células epiteliais não tumorais, após tratamento com os complexos 1 e 3 foi aproximadamente 7-8 vezes menos suscetível aos compostos que a linhagem de câncer MCF-7 (Tabela 1). Isto indica uma seletividade dos complexos de cobre em relação às células de câncer.

[067] Para confirmar se a morte das células humanas tumorais foi decorrente da apoptose, utilizou-se o método TUNEL, capaz de detectar a fragmentação do DNA pelo processo de apoptose. Nos resultados obtidos, é evidente que as células das linhagens de câncer humano de mama (MCF-7) e pulmão (A-549) estão morrendo por apoptose após tratamento com os complexos 1 e 3, uma vez que observa-se o aumento do número de células com fragmentação do DNA, em comparação àquelas células tratadas com cisplatina, demonstrando que tais compostos são capazes de induzir o processo de apoptose em células tumorais (Figura 8). Para verificar se os complexos de cobre interagem com o DNA, empregamos um ensaio de competição entre os compostos e o iodeto de propídio (PI). Observa-se claramente que os complexos não competem com o PI pela intercalação ao DNA (Tabela 2). Em ambas as linhagens de células tratadas com os complexos de cobre, não é possível ver alterações significativas na intensidade da fluorescência em comparação com o controle, o que garante que os compostos possam não se ligar ao DNA como agentes intercalantes.

[068] Ensaios de citometria de fluxo empregando a sonda fluorescente acetato de 2',7'-diclorodiidrofluoresceína (H2DCFDA) em células de câncer humano das linhagens MCF-7 e A549 tratadas com três diferentes concentrações: ½ × IC50 (0,5 M), IC50 (1,0 M) e 2 × IC50 (2,0 M) dos complexos 1 e 3 mostraram, visivelmente, que eles provocam o aumento na produção intracelular das EROs (Figura 5). No caso de todos os compostos testados, o aumento da produção das EROs foi maior que o observado quando se empregou como controle a droga antitumoral doxorubicina, usada na terapêutica de alguns tipos de câncer (Figura 5). Ressalta-se que a indução da produção de EROs constitui um dos mecanismos de ação de diversas drogas, tal como a doxorubicina, empregadas na terapia do câncer e que atuam como disparadores do processo de apoptose.

[069] A perda de potencial de membrana mitocondrial constitui outro evento que desencadeia o processo de apoptose. A incubação durante 30 minutos com o JC-1 indicou que as células tratadas com os complexos 1 e 3 apresentaram uma redução ou uma perda significativa do potencial de membrana mitocondrial em comparação com as células controle (não tratadas) ou tratadas com cisplatina (Figura 6). Os resultados indicam uma redução acentuada na despolarização mitocondrial das células tumorais nas concentrações analisadas (Figura 6).

[070] A determinação das atividades caspase 8 e 9 mostrou que somente a atividade da enzima caspase 9 foi alterada, tendo seus níveis aumentados nas linhagens celulares tratadas com os complexos 1 e 3. O resultado indica claramente que os complexos 1 e 3 ativam a via intrínseca que dispara o processo de apoptose em células humanas de câncer (Figura 7).

[071] Devido à sua citotoxicidade e genotoxicidade, indução na produção das EROs, perda do potencial de membrana mitocondrial e, em conjunto, ativação da caspase 9 e presença de quebra do DNA, concluímos que o tratamento com os complexos binucleares de cobre(II) provoca a morte das células tumorais humanas através do processo de apoptose, o qual é induzido pela via intrínseca. Os resultados permitem considerar os compostos de cobre deste estudo como potenciais agentes terapêuticos para diferentes tipos de câncer. Cabe ressaltar que os complexos 1 e 3 não apresentaram toxicidade para Galleria mellonella (Figura 10), um modelo invertebrado que tem sido bastante empregado como alternativa para substituir os modelos de experimentação animal.

[072] Em pacientes com câncer, doenças oportunistas como doença invasiva ou não-invasiva causada por fungos patogênicos constitui uma complicação importante, provocando considerável mortalidade e morbidade. Além disso, os procedimentos de quimioterapia ou transplante costumam ser cancelados ou adiados em pacientes com doenças fúngicas invasivas, o que pode comprometer a sobrevida geral da pessoa acometida. Avaliamos a atividade antifúngica dos novos compostos binucleares de cobre e observamos que tanto o complexo 1 quanto o complexo 3 foram capazes de inibir o crescimento de quatro amostras de isolados clínicos de fungos patogênicos Candida spp (ex. Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis e Candida krusei) (Tabela 3).

[073] Os perfis de suscetibilidade microbiana aos compostos de cobre foram determinados de acordo com o protocolo descrito no documento M27-A3, publicado pelo Clinical and Laboratory Standards Institutes (CLSI, 2008).

[074] As metalodrogas da presente invenção podem constituir composições farmacêuticas, sendo utilizadas de forma isolada ou em combinação entre si, adicionando-as a veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[075] A terapêutica do câncer apresenta elevada dificuldade de tratamento, devido a suas distintas origens, podendo apresentar uma resistência intrínseca e/ou adquirida aos tratamentos disponíveis. Além disso, o uso excessivo de uma mesma droga/medicamento pode provocar sérios efeitos colaterais ao paciente. Diante deste cenário, as metalodrogas descritas na presente invenção podem ser combinadas/associadas a quaisquer outras drogas utilizadas em tratamentos de neoplasias e doenças correlacionadas. Sobretudo a fármacos antitumorais, tais como quelantes de cobre e drogas quimioterápicas, principalmente aquelas baseadas na platina, tal como a cisplatina [cis-diaminodicloroplatina(II)] .

[076] Uma outra possibilidade de combinação das metalodrogas da presente invenção compreende a que pode ser realizada com outros complexos de cobre, porém mononucleares. Sendo diferentes dos apresentados nesta invenção, os compostos podem demonstrar efeitos sinérgicos durante o tratamento.

[077] O tratamento inclui administrar uma quantidade dos complexos isolados ou em combinação que seja eficaz para aliviar, alterar, remediar, melhorar ou afetar a doença, os sintomas da doença ou ainda de doenças decorrentes de infecções oportunistas causadas por fungos patogênicos, de forma a impedir o agravamento da doença principal, o câncer.

[078] Será considerado que as dosagens necessárias dos compostos e suas composições compreendendo os complexos isolados ou em combinação podem variar em cada caso, sendo diferentes para cada individuo tratado. A definição da dosagem ideal será determinada através do equilíbrio entre o benefício terapêutico e qualquer risco ou efeitos colaterais dos tratamentos aqui descritos.

[079] A administração in vivo destes metalofármacos pode ser efetuada em dose contínua ou, ainda, intermitentemente (por exemplo, em doses divididas em intervalos apropriados), ao longo do curso do tratamento. Os protocolos de administração mais eficazes dos quimioterápicos utilizados na terapêutica dos diversos tipos de câncer são bem conhecidos dos especialistas na técnica e variarão com a formulação utilizada para a terapia, o objetivo da terapia, a célula alvo e o sujeito a ser tratado.

[080] Uma dose adequada de uma terapêutica à base de platina pode ser uma dose padrão; uma dosagem padrão de cisplatina para o tratamento do câncer testicular é de 20 mg/m2 intravenoso (IV) diariamente por 1 a 5 dias consecutivos a cada 3 semanas por 3-4 ciclos de terapia quando usada em terapia combinada; por outro lado, uma dosagem padrão de cisplatina para o tratamento de carcinoma ovariano avançado varia de 75 a 100 mg/m2 IV uma vez a cada 3-4 semanas por 6 ciclos quando a cisplatina é usada em terapia combinada. Para o tratamento do câncer avançado de bexiga, uma dosagem padrão de cisplatina é de 70 a 100 mg/m2 IV uma vez a cada 3-4 semanas por 4 ciclos quando a cisplatina é usada em terapia combinada. Uma dosagem padrão para o tratamento de câncer de cabeça e pescoço recorrente ou avançado é de 80 a 120 mg/m2 IV uma vez a cada 3 semanas ou 20 a 100 mg/m2 IV quando usada em esquemas de quimioterapia combinada, com a frequência de administração dependendo do regime específico empregado. Uma dosagem padrão de cisplatina para o tratamento de câncer de colo do útero é 40 mg/m2 administrada semanalmente por 6 semanas quando associada com radioterapia ou 40 a 80 mg/m2 a cada 3 semanas por 3-4 ciclos quando for administrada em combinação com outros quimioterápicos. Para o tratamento de carcinoma pulmonar de células não pequenas, uma dosagem padrão de cisplatina em terapia combinada é de 75 a 100 mg/m2 IV uma vez a cada 3-4 semanas por 4-6 ciclos, dependendo do regime específico utilizado. Para o tratamento do câncer de esôfago avançado, uma dosagem padrão de cisplatina é de 50 a 120 mg/m2 IV uma vez a cada 3-4 semanas nos regimes de quimioterapia combinada ou 10 a 50 mg/m2 IV a cada 3 semanas por 2 ciclos quando combinada com radiação. Finalmente, para o tratamento do câncer de mama recorrente e metastático, uma dosagem padrão de cisplatina é de 50 a 100 mg/m2 IV uma vez a cada 3-4 semanas nos regimes de quimioterapia isolada ou combinada.

[081] A dose da combinação entre os complexos binucleares de cobre da presente invenção e outro agente quimioterápico, tal como a cisplatina, mas não se limitando exclusivamente à cisplatina, deverá estar compreendida entre 20 a 120 mg/m2 de superfície corporal do fármaco antitumoral, acrescida de 10 a 480 mg/m2 de superfície corporal dos complexos binucleares de cobre(II) em infusão intravenosa única, a cada 3–4 semanas pelo número necessário de ciclos, respeitando-se, obviamente, o protocolo padrão empregado na quimioterapia especifica para o câncer em tratamento.

[082] Assim, as taxas de diluição da nova composição estarão compreendidas entre 1 parte do fármaco antitumoral : 0,5 - 4,0 partes do complexo binuclear de cobre ou, alternativamente, 0,5 parte do fármaco antitumoral : 0,5 - 4,0 partes do complexo binuclear de cobre.

[083] A composição é utilizada no preparo de uma solução injetável ou formulação farmacêutica para uso oral composta por ambas as drogas e deve ser administrada exclusivamente por infusão intravenosa ou via oral.

[084] Quando os complexos binucleares de cobre(II) e o quimioterápico a base de platina são administrados em combinação com radiação, esta terapia combinada pode ser empregada com doses mais baixas do agente administrado, reduzindo uma possível toxicidade ou complicação associada às várias terapias.

[085] Os complexos binucleares de cobre(II), isolados ou combinados com outros antitumorais, podem ainda ser administrados em combinação com um antimicrobiano ou antifúngico empregados na clinica médica e na dosagem padrão para tratamento de infecções bacterianas e fungicas.

[086] Os complexos binucleares de cobre(II), isolados ou em combinação, podem ser administrados em associação com um agente ou procedimento para reduzir qualquer possível efeito colateral (ex. diarréia, náusea e vômito).

[087] Exemplos de outros agentes antitumorais que podem ser administrados em associação com os complexos de cobre, isolados ou em combinação com a cisplatina, incluem: pemetrexedo, vinorelbina, gemcitabina, vinblastina, dacarbazina, temozolomida, 5FU (5-fluorouracila), ciclofosfamida, bleomicina, etoposídeo, ifosfamida, paclitaxel, metotrexato, doxorubicina, adriamicina, vincristina, mitomicina, docetaxel e ainda combinações dos agentes acima. Estes agentes também podem ser administrados em conjunto com a realização de processos cirúrgicos e / ou aplicação de radiação.

[088] Exemplos de outros agentes antifúngicos que podem ser administrados em associação com os complexos de cobre, incluem os agentes das classes: poliênicos, azóis e equinocandinas.

[089] O escopo da presente invenção também abarca as diferentes formas de produção, composições, usos e aplicações das metalodrogas descritas.

[090] Os exemplos acima foram descritos para ilustrar as diferentes formas de produção e ensaios biológicos das composições / compostos que constam do presente documento, não devendo assim ser encarados como limitativos desta invenção, sabendo-se que pequenas variações do que fora acima descrito ainda farão parte do escopo da mesma.

Claims (19)

1. LIGANTES BINUCLEANTES FENÓLICOS, caracterizados por serem nãosimétricos, possuindo um “braço pendente” hidrazônico com um anel de seis membros do tipo 4-piridina, decorrente da isoniazida, compreendendo ainda um número de átomos de oxigênio e nitrogênio derivados de fenol e/ou piridina disponíveis para doação de pares eletrônicos para variação de dureza/maciez dos sítios de coordenação, e sendo ainda capazes de formar metalodrogas antitumorais e antifúngicas.
2. LIGANTES, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo ligante binucleante ser o 2-hidroxi-3-{[(2-hidroxibenzil)(2-piridilmetil)amino] -metil}-5- metilbenzaldeído isonicotinoíl hidrazona (H3L1) (1A), que apresenta grupos doadores terminais fenol e piridina (sítio “N2O”).
3. LIGANTES, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo ligante binucleante ser o 2-hidroxi-3-{bis[(2-piridilmetil)amino] -metil}-5- metilbenzaldeído isonicotinoíl hidrazona (H2L2) (1B), que possui 02 (dois) grupos doadores do tipo piridina como substituintes (sítio “N3”).
4. COMPOSTOS METÁLICOS BINUCLEARES, isto é, que acomodam dois centros metálicos, neste caso de cobre(II), caracterizados por serem metalodrogas antitumorais e antifungicas, não-simétricas, para uso médico e veterinário, possuindo como precursor químico comum um dos dois ligantes hidrazônicos não-simétricos definidos nas reivindicações 1 a 3, e ligantes exógenos, voltados para a formação de uma pró-droga ou de complexos já na sua forma ativa, ditos compostos possuindo as estruturas:

   
5. COMPOSTOS, de acordo com a reivindicação 4, caracterizados por acomodarem dois centros metálicos de cobre(II) que interagem com macromoléculas biológicas tais como o DNA e/ou proteínas, levando à apoptose de células cancerígenas e fúngicas.
6. COMPOSTOS, de acordo com a reivindicação 4, caracterizados por compreenderem ligantes externos capazes de formar pontes exógenas hidróxido, postulada como a forma ativa, ou pontes exógenas acetato, constituindo pró-drogas, e apresentarem centros de cobre(II) insaturados ou contendo ligantes lábeis, como a molécula de água para interação dos mesmos com macromoléculas biológicas como o DNA, RNA e/ou proteínas.
7. COMPOSIÇÃO MÉDICO-VETERINÁRIA, caracterizada por compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz das metalodrogas binucleares nãosimétricas de cobre(II) definidas nas reivindicações 4 ou 5, isoladas ou em combinação, e compreender ainda uma quantidade terapeuticamente eficaz de outras drogas adjuvantes, tais como as antineoplásicas, antifúngicas, antimicrobianas, drogas contra enjoos, vômitos, náuseas, diarreia e outras comorbidades e efeitos secundários, assim como uma quantidade determinada de agentes, excipientes e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.
8. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelas drogas adjuvantes antineoplásicas serem selecionadas dentre: quelantes de cobre, outros complexos mono- ou binucleares de cobre(II), e/ou outros fármacos quimioterápicos, principalmente aqueles baseados na platina, tal como a cisplatina [cis-diaminodicloroplatina(II)] .
9. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizada pelas drogas adjuvantes antineoplásicas que podem ser administrados em associação aos complexos de cobre definidos na reivindicação 4, isolados ou em combinação entre si ou com outras drogas, serem selecionadas dentre: pemetrexedo, vinorelbina, gemcitabina, vinblastina, dacarbazina, temozolomida, 5FU (5-fluorouracila), ciclofosfamida, bleomicina, etoposídeo, ifosfamida, paclitaxel, metotrexato, doxorubicina, adriamicina, vincristina, mitomicina, docetaxel, ou ainda suas combinações.
10. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelos agentes antifúngicos ser selecionados preferencialmente dentre as classes dos poliênicos, azois e equinocandinas.
11. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pela taxa de diluição da composição estar compreendida entre 1 parte do fármaco antitumoral para 0,5 - 4,0 partes do complexo binuclear de cobre.
12. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pela taxa de diluição da composição estar compreendida entre 0,5 parte do fármaco antitumoral para 0,5 - 4,0 partes do complexo binuclear de cobre.
13. PROCESSO DE SÍNTESE DE LIGANTES BINUCLEANTES, caracterizado pela rota sintética para o ligante H3L1 seguir as seguintes etapas:

    • a) partir do intermediário sintético hbpamff, 2-hidroxi-3-{[(2- hidroxibenzil)(2-piridilmetil)amino] -metil}-5-metilbenzaldeído;
    • b) uma solução metanólica (5 mL) da hidrazida do ácido isonicotínico, isoniazida (0,138 g; 1 mmol) ser gotejada, sob agitação constante, sobre uma solução de hbpamff (0,333 g; 0,9 mmol) em 10 mL de uma mistura 1:1 MeOH:Et2O, previamente preparada num balão de 50 mL;
    • c) a mistura ser refluxada por 2 horas até adquirir progressivamente uma coloração castanha;
    • d) ao término da reação, transferir o conteúdo do balão para um béquer de 50 mL; e
    • e) deixar o mesmo em repouso para que, com a evaporação gradual do solvente, o produto precipitar, sendo isolada uma grande quantidade de cristais castanhos, o qual é filtrado e lavado com éter etílico gelado.
14. PROCESSO DE SÍNTESE DE LIGANTES BINUCLEANTES, caracterizado pela rota sintética para o ligante H2L2 seguir as seguintes etapas:

    • a) partir do intermediário sintético bpmamff, 2-hidroxi-3-{bis[(2- piridilmetil)amino] -metil}-5-metilbenzaldeído;
    • b) gotejar lentamente isoniazida previamente dissolvida em 5 mL de uma mixtura (v/v) 1:1 diclorometano/MeOH (0,277 g; 2 mmol) foi sobre uma solução contendo bpmamff (0,703 g; 2 mmol) dissolvido em 10 mL da mesma mistura usando ultrassom;
    • c) refluxo da solução (balão de 50 mL) por 3 horas; e
    • d) remoção do solvente sob pressão reduzida, sendo o óleo obtido deixado em repouso em 1:1 MeCN/MeOH, obtendo-se o ligante na forma cristalina.
15. PROCESSO DE SÍNTESE DE COMPOSTOS BINUCLEARES, caracterizado por serem gerados a partir de H3L1 e H2L2 conforme definidos nas reivindicações 1 a 3, seguindo rotas de síntese para os complexos de fórmulas 1, 2, 3 e 4 definidas nas reivindicações 4 e 5, os quais possuem maior eficácia para eliminar ou reduzir a proliferação das células tumorais e fúngicas, dito processo compreendendo as seguintes etapas:

    • a. dissolução de uma quantidade do ligante binucleante em um solvente orgânico puro ou mistura de solventes;
    • b. adição lenta de 2 equivalentes de um sal de cobre(II), previamente dissolvido em metanol ou em mistura de solventes, sendo o contra-íon presente neste sal coordenante, tais como acetato, propionato ou, mais genericamente, um ânion carboxilato, capazes de gerar uma pródroga, ou não tal como perclorato, haleto, entre outros contra-íons capazes de gerar uma droga final na sua forma ativa;
    • c. a mistura reacional sendo então agitada, sob aquecimento moderado, por um período que pode variar de 10 minutos até 24 horas;
    • d. caso o sal de cobre usado não possua um contra-íon coordenante, adiciona-se uma quantidade adequada de base, dissolvida em água ou metanol, com o objetivo de favorecer a formação da ponte exógena do tipo μ-hidroxo; e, por fim,
    • e. o sólido obtido sendo filtrado, lavado com solvente orgânico gelado e seco no vácuo, sendo que uma maior massa de produto e, eventualmente, cristais adequados ao processo de determinação estrutural por difração de raios X podendo ser obtidos pela evaporação lenta da água-mãe.
16. MÉTODO DE TRATAMENTO DE NEOPLASIAS E DOENÇAS FÚNGICAS, caracterizado por compreender a administração dos complexos binucleares definidos nas reivindicações 4 a 6, de forma isolada ou em combinação entre eles, e/ou com outras drogas adjuvantes, ou ainda a administração das composições definidas nas reivindicações 7 a 12 em uma dose determinada, em um paciente humano ou animal.
17. MÉTODO DE TRATAMENTO DE NEOPLASIAS E DOENÇAS FÚNGICAS, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por compreender a administração de uma dose compreendida entre 20 a 120 mg/m2 , de superfície corporal, de um fármaco antitumoral acrescida de 10 a 480 mg/m2 , de superfície corporal, dos complexos binucleares de cobre(II) em infusão intravenosa ou a dose equivalente por via oral, a cada 3–4 semanas pelo número necessário de ciclos, respeitando o protocolo padrão empregado na quimioterapia especifica para o tipo de câncer em tratamento.
18. MÉTODO DE TRATAMENTO DE NEOPLASIAS E DOENÇAS FÚNGICAS, de acordo com qualquer uma das reividicações 16 ou 17, caracterizado por compreender a administração de complexos binucleares de cobre(II) 1, 2, 3, 4, isolados ou combinados entre si, podendo ser em combinação com antimicrobianos e/ou antifúngicos empregados na clínica médica e na dosagem padrão para tratamento de infecções bacterianas e fúngicas, em conjunto com cirurgia e/ou radiação, que seja eficaz para aliviar, alterar, remediar, melhorar ou afetar a doença, os sintomas da doença ou doenças decorrentes de infecções oportunistas causadas por fungos patogênicos, de forma a impedir o agravamento do câncer.
19. USO, dos compostos binucleares das reivindicações 4 a 6, de forma isolada ou em combinação entre eles, e/ou com outras drogas adjuvantes, ou ainda das composições descritas nas reivindicações 7 a 12, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamentos antitumorais e antifúngicos, para aliviar, alterar, remediar, melhorar ou afetar a doença neoplásica, os sintomas da doença ou doenças decorrentes de infecções oportunistas, como as causadas por fungos patogênicos, de forma a impedir o agravamento da doença primária, o câncer, ou ainda para tratamento de infecções de natureza bacteriana e/ou fúngica.

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