BR102019025397A2

BR102019025397A2 - Proteína quimérica recombinante, kit e método para diagnóstico de tripanossomíases, e uso

Info

Publication number: BR102019025397A2
Application number: BR102019025397-5A
Authority: BR
Inventors: Ricardo Toshio Fujiwara; Daniella Castanheira Bartholomeu; Lilian Lacerda Bueno; Renato De Lima Santos; Luiza Almeida De Figueiredo; Tiago Antônio De Oliveira Mendes; Rayane Cristina Silva Lucas; Agostinho Gonçalves Viana; Guilherme Rafael Gomide Pinheiro; Jandra Pacheco Dos Santos; Mario Steindel; Álvaro Ferreira Júnior; Luiz Cláudio Miletti; Edmundo Carlos Grisard
Original assignee: Universidade Federal De Minas Gerais; Universidade Federal De Santa Catarina - Ufsc; Fundação Universidade Do Estado De Santa Catarina - Udesc; Universidade Federal De Goiás - Ufg
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2022-03-08

Abstract

proteína quimérica recombinante, kit e método para diagnóstico de tripanossomíases, e uso. a presente tecnologia trata de proteína quimérica recombinante, definida pela seq id n°1, composta por regiões conservadas de proteínas de diferentes parasitas da família trypanosomatidae, além de um kit e um método para detecção de tripanossomatídeos em amostras biológicas de mamíferos.

Description

PROTEÍNA QUIMÉRICA RECOMBINANTE, KIT E MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE TRIPANOSSOMÍASES, E USO

[01] A presente tecnologia trata de proteína quimérica recombinante, definida pela SEQ ID N°1, composta por regiões conservadas de proteínas de diferentes parasitas da família Trypanosomatidae, além de um kit e um método para detecção de tripanossomatídeos em amostras biológicas de mamíferos.

[02] As tripanossomoses são infecções parasitárias de homens e animais, causadas por protozoários da ordem Kinetoplastida, incluídos na família Trypanosomatidae e no gênero Trypanosoma.

[03] Trypanosoma vivax, T. congolense e T. brucei são as espécies que acometem bovinos e são as principais causadoras da doença nesses animais. Estes parasitos são responsáveis por grandes perdas na bovinocultura, principalmente pela redução do ganho de peso dos animais e da produção de leite e pelo aumento da mortalidade e dos gastos com tratamentos.

[04] Na África, esses parasitos são transmitidos biologicamente por moscas tsé-tsé (Glossina spp.), mas T. vivax também pode ser transmitido mecanicamente por tabanídeos e Stomoxys calcitrans, permitindo a disseminação da doença em áreas onde a tsé-tsé não está presente. A transmissão transplacentária de T. vivax também tem sido relatada como uma forma importante para a epidemiologia da doença na América do Sul.

[05] Os tripanossomatídeos podem ser detectados a partir de amostras de sangue, linfonodos, líquor, secreções genitais, esfregaço de órgãos, entre outros. A sensibilidade desses métodos depende do estágio da doença (aguda ou crônica), sendo bastante reduzida em quadros crônicos.

[06] Em geral, o diagnóstico parasitológico é o método mais aplicado para identificar T. vivax no campo. No entanto, o exame direto de um material fresco possui baixa sensibilidade, além de nem sempre ser possível a identificação da espécie do parasita com base na sua morfologia e motilidade.

[07] O diagnóstico molecular é altamente sensível e permite realizar um diagnóstico espécie-específico de infecções por Trypanosoma. No entanto, nem todas as infecções podem ser detectadas pela PCR, especialmente durante a ausência de parasitemia.

[08] Já a detecção de anticorpos é uma ferramenta importante para avaliar a frequência de animais que se infectaram. Antígenos comuns às diversas espécies de Trypanosoma são utilizados, não representando métodos espécie-específicos. O diagnóstico sorológico utilizando antígeno bruto é frequentemente realizado por métodos indiretos de ELISA e imunofluorescência. Porém, segudo Rosati S, Ortoffi M, et al. Clin Diagn Lab Immunol. 2003 Nov;10(6):1153-6, o uso de antígeno bruto nesta técnica tem se mostrado um fator limitante de sua especificidade. Outra condição limitante ao uso deste tipo de antígeno é a dificuldade de gerar uma quantidade significativa e padronizada de antígeno. Portanto, a utilização de proteínas sintéticas surge como uma alternativa ao uso de antígenos brutos nos diagnósticos sorológicos.

[09] O documento de patente BR1020170050688, intitulado “Proteína recombinante, método e kit para triagem de tripanossomatídeos e uso”, depositado em 14 de março de 2017, trata de uma proteína recombinante altamente específica para detecção de tripanossomatídeos. O referido documento se difere da presente tecnologia por compreender sequencia proteica recombinante diferente e não quimérica.

[010] No estado da técnica não foi encontrada tecnologia contendo a proteína quimera recombinante definida no presente pedido para utilização no diagnóstico de tripanossomíases.

[011] A presente tecnologia trata de proteína quimérica recombinante, além de um kit contendo a proteína e um método para detecção de tripanossomatídeos em amostras biológicas de mamíferos. A tecnologia apresenta elevada sensibilidade e especificidade, melhorando o desempenho do diagnóstico da tripanossomose tanto para o diagnóstico de fase aguda quanto para o diagnóstico de fase crônica.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[012] A Figura 1 apresenta o mapa do vetor pUC57.

[013] A Figura 2 demonstra a comparação da reatividade dos soros bovinos nos testes de ELISA com as proteínas TryPan e extrato bruto de Trypanosoma sp.. No eixo das ordenadas estão representadas as absorbâncias de comprimento de 492nm. No eixo das abscissas estão indicados os diferentes grupos de soros bovinos testados. A linha pontilhada é o limite inferior de positividade (cut-off). A curva ROC foi utilizada para determinar o cut-off de cada teste. (A) ELISA anti-IgM:PanTryp, (B) ELISA anti-IgG:PanTryp, (C) ELISA anti-IgM:antígeno bruto e (D) ELISA anti-IgG: antígeno bruto.

[014] A Figura 3 demonstra a comparação das curvas ROC obtidas de cada teste de ELISA com soros bovinos para as proteínas TryPan e extrato bruto de Trypanosoma sp. As curvas ROC foram geradas pelo software Prisma 7.0 e com elas foram determinados os valores de cut-off, sensibilidade, especificidade e AUC (área sob a curva). O eixo das ordenadas representa as sensibilidades de cada teste e o eixo das abscissas indica a especificidade de cada teste. (A) Curva ROC da proteína Trypan (IgM), (B) Curva ROC da proteína Trypan (IgG), (C) Curva ROC do antígeno bruto (IgM) e (D) Curva ROC do antígeno bruto (IgG).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

[015] A presente tecnologia trata de proteína quimérica recombinante, definida pela SEQ ID N°1,composta por regiões conservadas de proteínas de diferentes parasitas da família Trypanosomatidae, além de um kit e um método para detecção de tripanossomatídeos em amostras biológicas de mamíferos.

[016] A proteína quimérica recombinante compreende a sequência definida pela SEQ ID N°1, preferencialmente codificada pela sequência de nucleotídeos definida pela SEQ ID No2.

[017] O kit para diagnóstico de tripanossomíases proposto na presente tecnologia compreende:

a) a proteína quimérica recombinante definida acima;
b) um anticorpo secundário ou uma proteína, onde o anticorpo secundário (IgG, IgM, IgA, IgE e/ou suas respectivas subclasses), ou a proteína (proteína A e/ou proteína G), são conjugados a uma enzima ou a um marcador;
c) um reagente para detectar a enzima ou marcador.

[018] No item “a”, a proteína pode estar ligada a um suporte sólido, selecionado do grupo de material compreendendo nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e/ou poliestireno; ou a um carreador, preferencialmente partículas de ouro.

[019] No item “b”, o marcador deve ser selecionado do grupo consistindo de enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.

[020] No item “c”, a enzima deve ser selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase.

[021] O método para diagnóstico de tripanossomíases compreende as seguintes etapas:

a) exposição de uma amostra à proteína quimérica recombinante definida acima, ou seus epitopos correspondentes, estando tais antígenos ligados a um suporte sólido ou a um carreador;
b) adição de um anticorpo ou uma proteína, que estejam conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se liguem aos anticorpos da amostra da etapa (a);
c) detecção dos anticorpos específicos para leishmaniose visceral na amostra citada na etapa (a), utilizando-se reagentes capazes de detectar a enzima ou o marcador citados na etapa (b).

[022] Na etapa “a”, a amostra pode ser selecionada do grupo compreendendo sangue, soro, plasma ou outro fluído corporal. O suporte sólido pode compreender materiais consistindo de nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno, poliestireno ou outro utilizado com a mesma finalidade dos demais descritos.

[023] Na etapa “b”, o anticorpo secundário pode compreender IgG, IgM, IgA, IgE e respectivas subclasses. A proteína relacionada a esta etapa pode ser Proteína A e/ou Proteína G. A enzima descrita nessa etapa pode ser selecionada do grupo consistindo de peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase. Além do mais, o marcador pode ser selecionado do grupo consistindo de enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.

[024] Na etapa “c”, o anticorpo de detecção pode ser selecionado do grupo compreendendo detecção de fluorescência, imunofluorescência, imunoluminescência, absorbância ou de radioisótopos.

[025] A proteína definida na presente tecnologia pode ser utilizada para o diagnóstico de tripanossomíases em mamíferos.

[026] A presente tecnologia pode ser mais bem compreendida através dos exemplos que se seguem, não limitantes.

EXEMPLO 1. OBTENÇÃO DA PROTEÍNA QUIMÉRICA

[027] A presente tecnologia descreve a produção da proteína quimérica aqui denominada TryPan, que consiste em uma proteína formada pela fusão de sequências de DNA que codificam regiões conservadas nos diferentes parasitos da família Trypanosomatidae, mas ausentes em espécies hospedeiras, que apresenta alto potencial para uso em testes diagnósticos para detecção de doenças causadas por tripanossomatídeos.

[028] A sequência (SEQ ID No2) foi sintetizada pela empresa GenScript e clonada no plasmídeo pUC57 (GenScript) que contém um gene de resistência à ampicilina e o gene da β-galactosidase para permitir a seleção dos transformantes (Figura 1). A esse gene sintético foi acrescentado o sítio das enzimas NdeI (Thermo Scientific, EUA), antes do início da sequência, e HindIII (Thermo Scientific, EUA), após o códon de parada (TAA).

[029] O plasmídeo pUC57-TryPan foi submetido a um processo de transformação bacteriana por eletroporação em células eletrocompetentes de Escherichia coli das cepas XL1-Blue (Phoneutria, Brasil), utilizando Micro Pulser Electroporation Cuvettes (Bio-Rad, EUA) de 0,1 cm e submetendo-as a um pulso (1,8 kV) no eletroporador MicroPulser™ Electroporation Apparatus (Bio-Rad, EUA). Em seguida, a suspensão bacteriana foi distribuída uniformemente em placas de Petri, contendo meio sólido 2xYT (Triptona 16 g/L; Extrato de Levedura 10 g/L; NaCl 5 g/L) com ágar a 1,5% e ampicilina (Neo química, Brasil) a 100 μg/mL. Após o crescimento de colônias isoladas, os transformantes XL1-Blue/pUC57-TryPan foram cultivados em meio 2xYT líquido (Triptona 16 g/L; Extrato de Levedura 10 g/L; NaCl 5 g/L), com o antibiótico descrito anteriormente, permanecendo no período de 12 a 16 horas a 37°C em agitação no shaker (Maxq 400, Thermo Scientific, EUA) a 180 rpm (rotações por minuto) para obter uma maior quantidade de plasmídeos recombinantes.

[030] Após o cultivo dos transformantes, foi realizada a extração do DNA plasmidial através do kit QIAprep® Spin Miniprep Kit (Qiagen, Alemanha) de acordo com instruções do fabricante. Em seguida, o plasmídeo pUC57-TryPan juntamente com o vetor de expressão pET28a-TEV, produzido pelo centro de Biologia Molecular e Estrutural (CeBiME, Campinas/SP) e que possui o gene de resistência a kanamicina para seleção positiva dos transformantes, foram submetidos à dupla digestão, durante 16 horas a 37°C, com as enzimas de restrição NdeI (Thermo Scientific) e HindIII (Thermo Scientific) gerando extremidades coesivas que propiciaram a subclonagem do inserto ao vetor de expressão. Os produtos da digestão foram verificados, sob luz UV, após separação eletroforética em gel de agarose a 0,7%, em tampão TAE 1X (4,8 g/L Tris-base pH = 8,0; 1,14 mL ácido acético glacial; 2 mL EDTA 0,5M), contendo 0,5 μg/mL de brometo de etídio (Bio-Rad, Brasil). Em seguida, foi realizada a purificação dos fragmentos de interesse excisados do gel através do kit “QIAquick® Gel Extraction Kit” (Qiagen, EUA), de acordo com as instruções do fabricante.

[031] A ligação do DNA alvo (inserto) ao vetor de expressão (pET28a-TEV) foi realizada por meio das extremidades coesivas dos sítios de NdeI e HindIII por meio da reação com a enzima T4 ligase (Promega) e o tampão de ligação 10x (Promega), realizada a 4°C por 16 horas, resultando no plasmídeo pET28a-TEV/TryPan. Através de uma nova transformação, o produto da reação de ligação foi inserido em bactérias E. coli eletrocompetentes das cepas BL-21Star, que é uma cepa específica para a expressão heteróloga de proteínas. Estas bactérias foram plaqueadas em meio em meio 2xYT sólido, contendo o antibiótico Kanamicina (Sigma-Aldrich, EUA) a 50 μg/mL.

[032] Após a transformação do plasmídeo pET28a-TEV/TryPan na bactéria BL-21Star, a identificação dos clones que contêm o gene sintético foi realizada por meio de reação de PCR de colônia. Os primers T7 forward e reverse foram utilizados na amplificação por PCR e a análise das colônias positivas foi feita por eletroforese em gel de agarose a 1%, seguindo os mesmo padrões da eletroforese já descrita. Os clones que se mostraram positivos na PCR de colônia tiveram o DNA plasmidial extraído pelo kit “PureLink®-Quick Plasmid Miniprep Kit” (Invitrogen) e forão encaminhados para sequenciamento pela empresa Macrogen (Seul, Coréia do Sul) empregando os mesmos primers utilizados na PCR de colônia.

[033] Para a obtenção da proteína quimérica, a colônia denominada BL-21Star/pET-TEV/TryPan foi cultivada em 25 mL de meio 2xYT líquido contendo Kanamicina a 50 μg/mL a 37°C por 16 horas sob agitação e cultivada até o alcance da densidade óptica (DO) ideal (entre 0,6 e 0,8). Após atingir a OD esperada, foi feita a indução da expressão com isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG) a 1 mM (Invitrogen, Brasil), seguida de incubação por 3 horas a 37° C sob agitação. Em seguida, as frações solúveis e insolúveis da cultura bacteriana foram separadas por centrifugação a 2.000 g por 25 minutos a 4° C para realização do teste de solubilidade da proteína. De posse das frações, as mesmas foram analisadas pela técnica de Western blot utilizando o anticorpo primário anti-His, capaz de se ligar a cauda de histidina inserida à proteína, devido à construção do vetor de expressão, durante sua expressão em E. coli BL21. Dessa forma, ficou comprovado que a proteína quimérica foi expressa, com tamanho estimado de 66,3 kDa.

[034] Após verificar a presença da proteína TryPan na fração insolúvel do lisado bacteriano, a expressão em larga escala da proteína foi realizada utilizando 6 L de meio 2xYT com kanamicina, a 37°C, sob agitação. Ao atingir a DO ideal (entre 0,6 e 0,8) foi acrescentado IPTG 1 M seguida de indução por 3 horas a 37°C sob agitação 180 rpm. Ao término das 3 horas de indução, o extrato bacteriano foi centrifugado a 2.000 g por 30 minutos a 4°C para ser submetido ao processo de purificação da proteína. Os sedimentos bacterianos foram ressuspendidos em tampão Akta “A”(PBS 1x + 30 mM de imidazol) ”, adicionado de 8 molar de uréia, na presença de Lisozima (10 μg/mL). Posteriormente, a suspensão de bactérias foi lisada mecanicamente no homogeneizador EmulsiFlex™ C3 (Avestin), utilizando picos de pressão entre 15.000 e 20.000 psi. Após 5 ciclos de lise, a amostra celular foi submetida a centrifugação a 6.000 g, por 1 hora, a 4°C, e o sobrenadante resultante foi filtrado em filtro de 0,45 μm e mantido no gelo até o momento da purificação.

[035] A purificação da proteína foi realizada por meio de separação por cromatografia de afinidade em resina de níquel. O extrato filtrado foi aplicado em uma coluna HisTrap HP de 5 mL (GE Healthcare Life Sciences, EUA) conectada a um HPLC (High Performance/Pressure Liquide Chromatography - AktaPrime Plus, GE). A coluna foi lavada com o tampão A [fosfato de sódio 20mM; NaCl 500mM; imidazol 30mM], ”, adicionado de 8 molar de uréia, seguida da aplicação de todo lisado celular que foi eluído por meio da adição do tampão B [fosfato de sódio 20mM; NaCl 500mM; imidazol 500mM].

[036] As alíquotas obtidas na eluição descrita acima foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS a 12,5% e realizado a técnica de Western blot com o anticorpo anti-His.

EXEMPLO 2. ANÁLISES SOROLÓGICAS UTILIZANDO A PROTEÍNA QUIMÉRICA

[037] Placas de ELISA de 96 poços foram sensibilizadas por 12-16 horas a 2-8 °C com 50 ng do antígeno diluído em tampão carbonato (Na2CO3 0,16%, NaHCO3 0,24% e pH 9,6). Após a sensibilização, a placa foi bloqueada com PBS acrescido de 3,0% de BSA (Invitrogen, São Paulo, Brasil) durante 2 horas a 37°C. Após o bloqueio, toda a solução dos poços foi removida e em seguida foram adicionados aos poços 50 μL dos soros diluídos 1:200 em solução de lavagem (PBS-0,05% Tween20) e incubados a 37 °C por 60 minutos. As placas foram lavadas 5 vezes com a solução de lavagem e, em seguida, foi adicionado aos poços 50 μL do anticorpo anti-IgM bovino diluído 1:10000 em solução de lavagem. Após incubação a 37°C por 60 minutos, as placas foram novamente lavadas por 5 vezes com a solução de lavagem, e posteriormente foi adicionado 50 μL da solução reveladora (ácido cítrico 0,1 M, Na2PO4 0,2 M, OPD 0,05% e H2O2 0,1%). As placas foram incubadas a temperatura ambiente ao abrigo de luz por 10 minutos com a solução reveladora, quando a reação foi interrompida pela adição de 25 μL de H2SO4 2 M. A absorbância resultante foi obtida em leitor de ELISA a 492 nm.

[038] Foram realizados testes de ELISA com a proteína TryPan e seu desempenho foi comparado ao desempenho do extrato bruto de Trypanosoma sp., utilizando soros bovinos. O painel consistiu em: 17 soros de bovinos naturalmente infectados com Trypanosoma sp. e 23 bovinos de campo não infectados foram utilizados como controles negativos.

[039] As análises de ELISA com TryPan, utilizando soros individuais de bovinos apresentaram resultados superiores quando comparado ao antígeno bruto. Os dados referentes à reatividade e ao desempenho da TryPan e do antígeno bruto estão representados nas Figura 2. Por sua vez, na Figura 3 estão as curvas ROC geradas pelo software Prisma 7.0 e com elas foram determinados os cut-off, valores de sensibilidade, especificidade e AUC (área sob a curva ROC).

[040] Nas Tabelas 1 e 2 estão representados os compilados das principais medidas utilizadas para a validação da TryPan como um potencial alvo para o diagnóstico da Tripanossomose Animal. Como pode ser observada, a nova proteína recombinante mostrou desempenho superior em todos os critérios analisados (sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo e acurácia) em comparação ao antígeno bruto testado.

[041] Tabela 1. Valores percentuais de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo e acurácia dos ensaios imunoenzimáticos da proteína quimera (TryPan) e do extrato bruto de Trypanosoma sp com soros bovinos utilizando o anticorpo Anti-IgM para diagnóstico da Tripanossomose Animal. Abreviações: (VPP) valor preditivo positivo; (VPN) valor preditivo negativo; (AC) acurácia;

[042] Tabela 2. Valores percentuais de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo e acurácia dos ensaios imunoenzimáticos da proteína quimera (TryPan) e do extrato bruto de Trypanosoma sp com soros bovinos utilizando o anticorpo Anti-IgG para diagnóstico da Tripanossomose Animal. Abreviações: (VPP) valor preditivo positivo; (VPN) valor preditivo negativo; (AC) acurácia.

[043] Estes resultados indicam que a proteína quimérica aumenta a especificidade do teste, melhorando o desempenho do diagnóstico da Tripanossomose Animal, podendo assim contribuir para o controle da doença em bovinos através de um teste mais eficiente e confiável quando comparado com o extrato bruto de Trypanosoma sp.

Claims

PROTEÍNA QUIMÉRICA RECOMBINANTE, caracterizada por compreender a sequência definida pela SEQ ID N° 1, preferencialmente codificada pela sequência de nucleotídeos definida pela SEQ ID No2.
KIT PARA DIAGNÓSTICO DE TRIPANOSSOMÍASES, caracterizado por compreender:
- a) a proteína quimérica recombinante definida na reivindicação 1;
- b) um anticorpo secundário ou uma proteína, onde o anticorpo secundário (IgG, IgM, IgA, IgE e/ou suas respectivas subclasses), ou a proteína (proteína A e/ou proteína G), são conjugados a uma enzima ou a um marcador;
- c) um reagente para detectar a enzima ou marcador.
KIT PARA DIAGNÓSTICO DE TRIPANOSSOMÍASES, de acordo com a reivindicação 2, item “a”, caracterizado pela proteína estar ligada a um suporte sólido, selecionado do grupo de material compreendendo nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e/ou poliestireno; ou a um carreador, preferencialmente partículas de ouro.
KIT PARA DIAGNÓSTICO DE TRIPANOSSOMÍASES, de acordo com a reivindicação 2, item “b”, caracterizado pelo marcador ser selecionado do grupo consistindo de enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.
KIT PARA DIAGNÓSTICO DE TRIPANOSSOMÍASES, de acordo com a reivindicação 2, item “c”, caracterizado pela enzima ser selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase.
MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE TRIPANOSSOMÍASES, caracterizado por compreender as seguintes etapas:
- a) exposição de uma amostra à proteína quimérica recombinante definida na reivindicação 1, ou seus epitopos correspondentes, estando tais antígenos ligados a um suporte sólido ou a um carreador;
- b) adição de um anticorpo ou uma proteína, que estejam conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se liguem aos anticorpos da amostra da etapa (a);
- c) detecção dos anticorpos específicos para leishmaniose visceral na amostra citada na etapa (a), utilizando-se reagentes capazes de detectar a enzima ou o marcador citados na etapa (b).
MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE TRIPANOSSOMÍASES, de acordo com a reivindicação 6, etapa “a”, caracterizado pela amostra ser selecionada do grupo compreendendo sangue, soro, plasma ou outro fluído corporal; e o suporte sólido compreender materiais consistindo de nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno, poliestireno ou outro utilizado com a mesma finalidade dos demais descritos.
MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE TRIPANOSSOMÍASES, de acordo com a reivindicação 6, etapa “a”, caracterizado pelo anticorpo secundário compreender IgG, IgM, IgA, IgE e respectivas subclasses; a proteína relacionada a esta etapa ser Proteína A e/ou Proteína G; a enzima descrita nessa etapa ser selecionada do grupo consistindo de peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase; e o marcador ser selecionado do grupo consistindo de enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.
MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE TRIPANOSSOMÍASES, de acordo com a reivindicação 6, etapa “c”, caracterizado pelo anticorpo de detecção ser selecionado do grupo compreendendo detecção de fluorescência, imunofluorescência, imunoluminescência, absorbância ou de radioisótopos.
USO da proteína definida na reivindicação 1, caracterizado por ser para o diagnóstico de tripanossomíase em mamíferos.