BR102019020778A2 - processo para a produção de ácido butírico e seus usos - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um processo para a produção de ácido butírico como único produto, a partir da fermentação de matérias-primas constituintes da cana-deaçúcar, como a xilose, utilizando o Clostridium beijerinckii Br21 como biocatalisador. O referido processo compreendendo as etapas de: (a) Preparação do inóculo; (b) Preparação dos meios de cultura; (c) Fermentação em batelada; e (d) Quantificação do ácido butírico. O ácido butírico produzido pode ser utilizado como aditivo em alimentação animal visando a proteção da microbiota intestinal e podendo diminuir o uso de antibióticos normalmente utilizados para o crescimento animal.

Description

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE ÁCIDO BUTÍRICO E SEUS USOS CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se insere no campo da Quimica, e refere-se a um processo biotecnológico altamente específico para a produção de ácido butírico, a partir da fermentação de matérias primas renováveis, constituintes da cana-de-açúcar e outros subprodutos da indústria sucroalcooleira. Sob condições de nutrição, pH e pressão controladas e utilizando o Clostridium beijerinckii Br21 como biocatalisador, o ácido butírico é obtido como único produto do processo, facilitando as etapas posteriores de purificação. O ácido butírico obtido pode ser utilizado como aditivo em alimentação animal, visando à proteção da microbiota intestinal, e podendo diminuir o uso de antibióticos normalmente utilizados para o crescimento animal.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] O ácido butiríco é um ácido carboxílico saturado com quatro carbonos. Industrialmente, ele é utilizado em indústrias químicas, farmacêuticas, alimentícias e de ração animal (JANG, et al. 2014) . Na indústria química é principalmente utilizado como precursor na produção de butirato de acetato celulose (CAB), um termoplástico vastamente utilizado na indústria automobolilística (JANG, et al. 2014). Na forma de ácido puro é aplicado na indústria de laticínios para melhorar o sabor, sendo que os ésteres derivados deste ácido são aditivos na indústria alimentícia para acentuar sabores, também podendo ser utilizado na produção de perfumes (ALAM, et al. 1998) . Ao lado de outros ácidos orgânicos de cadeia curta, o ácido butírico, também denominado de butirato, e seus derivados são amplamente aplicados como substitutos dos antibióticos na alimentação animal (ALAM, et al. 1998) . O butirato é conhecido por melhorar a saúde gastrointestinal e prevenir infecções microbianas e doenças em aves domésticas, suínos, peixes e ruminantes (WU, et al. 2 018; LEE, et al. 2 014; HASSAN, et al. 2 018) .

[003] De acordo com o relatório Transparency Market Research, o mercado mundial de derivados de ácido butírico para aplicação em ração animal foi avaliado em US$ 227,5 milhões em 2015 e deverá atingir US$ 542,8 milhões até 2024, com expansão de 10,3% entre 2016 e 2024.

[004] Atualmente, o ácido butírico comercial é obtido a partir de matéria-prima derivada de petróleo, o propileno, em uma reação economicamente vantajosa. No entanto, tal processo além de empregar matéria-prima não renovável, ainda utiliza uma grande quantidade de energia para a sua síntese (JANG, et al. 2014; FU, et al. 2017).

[005] Alternativamente à síntese química, o ácido butírico pode ser obtido pela fermentação de carboidratos (açúcares), principalmente por microrganismos do gênero Clostridium. Embora a produção fermentativa de ácido butírico seja comparativamente mais cara do que a sua síntese química, a demanda pela via biossintética aumentou muito devido à procura do consumidor por produtos naturais e obtidos a partir de matérias-primas renováveis (FU, et al. 2017).

[006] Diferentes espécies de Clostridium têm a capacidade de produzir o ácido butírico por fermentação, tais como o Clostridium butyricum, Clostridium thermobutyricum, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium acetobutylicum e Clostridium pasteurianum, entre outras cepas geneticamente modificadas (JANG, et al. 2014; LEE, et al. 2014; JIANG, et al. 2011; PI0313303-6).

[007] A maioria dos métodos para a obtenção de ácido butírico por fermentação utiliza o Clostridium tyrobutyricum como biocatalisador (FU, et al. 2017; JIANG, et al. 2011; CN109355318A; WO2012139492A1; CN109355318A), por este fornecer elevadas concentrações do butirato (Tabela 1). Outros utilizam microrganismos modificados geneticamente (PI0313303-6; CN109355318A) . Entretanto, o rendimento dos processos, o qual se refere à quantidade da fonte de carbono (carboidrato) convertida em ácido butírico é em torno de 80 % da relação estequiométrica, que é de 0,49 g/g tanto para hexose, quanto uma pentose (Eq. 1 e Eq. 2). Nas condições de processo deste invento foi obtido rendimento similar ao estequiométrico, ou seja, 100% da fonte de carbono consumida é convertida em ácido butírico. O único trabalho na literatura que apresentou rendimento de 0,69 g/g, utilizou espiga de milho que, certamente, possui outras fontes de carbono do que apenas carboidratos e o C. tyrobutyricum ATCC 25755 como biocatalisador (Tabela 1).

[008] Os substratos, ou matérias primas renováveis empregadas nas fermentações com diferentes espécies de Clostridium variam desde hidrolisados ácidos de biomassa lignocelulósica (PI0313303-6; CN109355318A; WO2012139492A1; CN107746862A; WO2009154624A1; NZ721787A) sacarificados de palha e/ou as espigas por irradiação com feixe de elétrons (FONSECA, et al. 2016) ou ainda mistura de açúcares, tal como o manitol e glicose e ainda, hidrolisados de biomassa de alga (CN107746862A) .

[009] Apesar de ser possível a utilização de algumas destas matérias-primas pelo C. beijerinckii (FONSECA, et al. 2016; FONSECA, et al. 2018), a presente invenção pressupõe o uso de substratos derivados da cana-de-açúcar, podendo ser celobiose, frutose, arabinose, xilose e a glicose como fonte de carbono, mas também a sacarose na sua forma pura, semipurificada ou na forma de melaço de cana de açúcar. Além disso, pode-se também utilizar hidrolisado ácido de biomassa lignocelulósica, palha e bagaço de cana, mas com adição controlada de nutrientes.

[010] Na presente invenção, concentrações controladas de nutrientes são adicionadas à fonte de carbono em um meio de cultura, no qual, especialmente a relação carbono e fonte de nitrogênio é importante.

[011] Os métodos descritos anteriormente na literatura que adotaram o C. beijerinckii como biocatalisador para a obtenção de ácido butírico aplicaram o soro de leite como matéria-prima (ALAM, et al. 1988; STEVENS, et al. 1988) , ou o ácido lático puro (WO2012139492A1 - Tabela 1). Com o soro de leite como substrato em fermentação em batelada, pH 5,5, foram atingidos valores de concentração, rendimento e produtividade de ácido butírico de 12,5 g.L-1, 0,23g.g-1, 0,08g.L-1.h-1, respectivamente (LUO, et al. 2018) .

[012] O ácido lático também foi relatado como matéria-prima para a obtenção de ácido butírico por fermentação com o uso de ao menos uma cepa não especificada de Clostridium, enquanto na nossa invenção é utilizada uma única cepa de Clostridium e carboidratos como fonte de carbono (WO2012139492A1) .

[013] Outro método descrito inclui, juntamente com o ácido butírico, a obtenção de diferentes produtos de fermentação por Clostridium, tais como etanol, ácido cítrico, acetaldeído, entre outros; produzidos a partir de material de origem vegetal em uma suspensão ácida (PI0313306-6) . Na presente invenção o único produto é o ácido butírico, com o rendimento similar ao teórico de 0,49 g/g (Tabela 1,) o que facilita a etapa de separação do produto.

[014] Espécies de Clostridium têm sido conhecidas por produzirem mistura de ácido acético, ácido butírico, acetona, butanol e etanol (BELLIDO, et al. 2015; LUTKE-EVERSLOH, et al. 2011). Entretanto, outros compostos de interesse industrial também podem ser obtidos, sob condições nutricionais e ambientais específicas, tais como o isopropanol, 1,3-propanodiol e 2,3-butanediol (LUTKE-EVERSLOH, et al. 2011; GHESHLAGHI, et al. 2009). Normalmente, uma mistura de vários compostos são obtidos ao final do processo fermentativo, tais como descritos nas patentes (PI0313303-6) e (WO2009154624A1).

[015] O C. beijerinckii, não tem sido visto como o biocatalisador preferencial para a obtenção de ácido butírico em processos fermentativos, pois o principal produto de maior interesse comercial obtido neste tipo de processo é o butanol. O C. beijerinckii é conhecido por realizar a fermentação Acetona, Butanol e Etanol, mais conhecida como fermentação ABE. Normalmente, o processo de fermentação de carboidratos por Clostridium solventogênicos, tal como o C. beijerinckii, envolve duas fases distintas, uma chamada acidogênica, e outra conhecida como solventogênica. O metabolismo bifásico acidogênico/solventogênico do C. beijerinckii é bem conhecido e as enzimas envolvidas já foram identificadas e caracterizadas. Este metabolismo bifásico está relacionado com diferentes estágios de crescimento do microrganismo. No primeiro estágio, onde há crescimento exponencial do Clostridium, as células produzem preferencialmente acetato e butirato, além de gás hidrogênio e dióxido de carbono. Quando os ácidos orgânicos atingem uma determinada concentração no meio, as enzimas CoA-transferases começam a reassimilação dos ácidos para dentro da célula. Então, na segunda fase, no estado estacionário de crescimento do microrganismo, os ácidos orgânicos reassimilados dão origem aos solventes butanol:acetona:etanol na proporção em torno de 6:3:1 (LUTKE-EVERSLOH, et al. 2011; GHESHLAGHI, et al. 2009) . Esta capacidade dos Clostridium solventogênicos de converterem os ácidos acético e butírico em solventes ABE, que são neutros, tem a finalidade de eles se protegem da queda de pH do meio e da concentração de ácidos orgânicos não dissociados (DÜRRE, et al. 2007) . Portanto, em uma fermentação "tradicional" de carboidratos por C. beijerinckii espera-se que os principais produtos finais sejam os solventes ABE acima mencionados.

[016] A cepa Br21 de C. beijerinckii empregada neste processo se diferencia de outras cepas da mesma espécie por ser não-solventogênica, ou seja, não é capaz de migrar da fase acidogência para a solventogênica e produzir os solventes. Esta perda da capacidade de produzir solventes por cepas de Clostridium está relacionada à perda de sua habilidade de reassimilação dos ácidos, acumulando os ácidos acético e butírico no meio. A perda da capacidade de solventogênese em cepas de C. beijerinckii, que não possuem plasmídeos, tem sido relacionada principalmente à falta de enzimas, tais como acetilCoA acetiltransferase, acetoacetato descarboxilase e butirato quinase (WANG, et al. 2011) . O biocatalisador utilizado no processo de obtenção do ácido butírico, a cepa Br21 do C. beijerinckii não possui a capacidade de sintetizar a enzima acetoacetato descarboxilase (FONSECA, et al. 2019) . A atividade da acetoacetato descarboxilase não está diretamente ligada à formação do butanol, porém, a descarboxilação do intermediário acetoacetato a acetona, catalisada pela acetoacetato descarboxilase, fornece a energia livre necessária para que as reações das transferases, responsáveis pela reabsorção dos ácidos do meio, seja possível (HARTMANIS, et al. 1984) . Assim, sem a atividade desta enzima tanto o ácido acético, quanto o ácido butírico podem ser acumulados no meio. Entretanto, acúmulo de um ou outro ácido pode ser maior ou menor dependendo das condições aplicadas no biorreator.

[017] O acúmulo dos ácidos orgânicos, sem o devido controle do pH pode levar à inibição da fermentação, devido à concentração de ácidos orgânicos não dissociados. Por exemplo, em pH inferiores a 5,0 os ácidos acético e butírico apresentam-se em grande parte na sua forma não-dissociada, pois estes apresentam pKa igual a 4,75 e 4,82, respectivamente (SCHIEL-BENGELSDORF, et al. 2013). Na forma não dissociada os ácidos orgânicos atravessam a membrana celular, onde, no pH intracelular próximo à neutralidade se dissociam e liberam prótons (H+), o que por sua vez compromete o gradiente da membrana e causa a morte celular, e ainda a célula na tentativa de remover os íons H+ reduz o ATP intracelular. Portanto, a concentração inicial da fonte de carbono e o pH devem ser controlados de forma a não exceder uma quantidade de ácido butírico não dissociado inibitória ao microrganismo.

[018] Portanto, a cepa de Clostridium beijerinckii Br21 utilizada neste método, sob condições nutricionais e ambientais controladas, sintetiza o ácido butírico como único produto de fermentação. A obtenção específica do ácido butírico e com alto rendimento a partir da matéria-prima utilizada facilita os posteriores processos de separação e purificação.

[019] Portanto, o ácido butírico é obtido de forma bastante específica, ou seja, como único produto da fermentação e, consequentemente, com elevado rendimento.

ESTADO DA TÉCNICA

[020] Existem no estado da técnica, vários trabalhos relacionados a produção de ácido butírico utilizando microrganismos como biocatalisadores, por exemplo:

[021] O documento intitulado "GENOME SEQUENCE OF THE H2 -PRODUCING CLOSTRIDIUM BEIJERINCKII STRAIN BR21 ISOLATED FROM A SUGARCANE VINASSE TREATMENT PLANT", refere-se ao C. beijerinckii, mais especificamente a cepa Br21. Adicionalmente, tal documento informa que esse microrganismo é um candidato para uso direto em processos biotecnológicos, tais como fermentação. Ainda, é informado que o seu genoma inclui genes que permitem a conversão de fontes de carbono em ácido butírico, ácido acético, hidrogênio, etanol entre outros. Entretanto, o referido documento em momento algum diz respeito ao processo, nem a possibilidade de produzir o ácido butírico como único metabólico, como acontece na presente invenção.

[022] O documento intitulado "ADVANCES IN BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTION OF BUTYRIC ACID" apresenta uma revisão da literatura a respeito da produção de ácido butírico, mas tratando-se de outros gêneros de Clostridium. O único C. beijerinckii citado no texto é um artigo que usa soro de leite e lactose, já amplamente conhecido e superado pela presente invenção.

[023] O documento intitulado "PRODUÇÃO DE ÁCIDO BUTÍRICO POR CLOSTRIDIUM BUTYRICUM A PARTIR DE GLICERINA" tem como objetivo analisar a síntese do ácido butírico e aborda o uso do gênero Clostridium. Adicionalmente, informa que existem diversas matérias-primas complexas para serem utilizadas como substrato da reação de síntese. Entretanto, tal documento utiliza glicerina como matéria-prima, a qual não é utilizada no processo da presente invenção.

[024] O documento intitulado "BUTANOL PRODUCTION FROM WHEAT STRAW BY SIMULTANEOUS SACCHARIFICATION AND FERMENTATION USING CLOSTRIDIUM BEIJERINCKII: PART I-BATCH FERMENTATION", informa sobre a obtenção de ácido butírico a partir da fermentação de matérias-primas como sacarídeos. Ainda, informa o uso de C. beijerinckii. Entretanto, o produto da fermentação obtido em tal documento é o butanol, enquanto que na presente invenção, o produto da fermentação é o ácido butírico.

[025] O documento intitulado "BUTYRIC ACID PRODUCTION FROM ACID HYDROLYSATE OF CORN FIBRE BY CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM IN A FIBROUS-BED BIOREACTOR", aborda a produção de ácido butírico. Entretanto, a matéria-prima utilizada neste caso é o hidrolisado de fibra de milho, diferente de derivados da cana-de-açúcar utilizada no processo da presente invenção. Embora os hidrolisados de materiais lignocelulósicos, como a palha de cana e a fibra de milho apresentem características em comum, após a sua hidrólise, apresentam também potenciais inibidores de fermentação, sendo estes compostos diferem para materiais lignocelulósicos, que variam também dependendo do método de hidrólise utilizado. O reator utilizado em tal documento também é diferente daquele utilizado na presente invenção, que é um reator em batelada por agitação.

[026] O documento CN107937305 (A) intitulado "CLOSTRIDIUM BUTYRICUM AGENT WITH STRONG BUTYRIC ACID RESISTANCE AND STRESS RESISTANCE AND APPLICATION THEREOF" aborda o uso do gênero Clostridium para aumentar a produção de ácido butírico. Entretanto, tal documento utiliza outro biocatalisador em seu processo, o Clostridium butyricum, enquanto que a presente invenção utiliza o Clostridium beijerinckii. Este documento chinês descreve o uso do próprio microrganismo, o qual possui alta resistência a ácido butírico. O processo proposto se refere, apenas, ao cultivo do Clostridium, que deve ser usado desta forma, e não, a um processo para obtenção do produto do Clostridium. Apesar de o rendimento de ácido butírico ser maior com a utilização do Clostridium butyricum descrito, este apresenta em seus ensaios fermentativos a formação de outros produtos do metabolismo diferentes do ácido de interesse, dificultando a sua separação. Já na utilização do Clostridium beijerinckii nas condições propostas há geração do ácido butírico como único produto.

[027] O documento CN108504697 (A) intitulado "METHOD FOR FERMENTING CLOSTRIDIUM BUTYRICUM SIGNIFICANTLY INCREASING YIELD OF BUTYRIC ACID" descreve um método de fermentação por Clostridium butyricum, que aumenta significativamente o rendimento de ácido butírico. Assim como o documento anterior, este documento utiliza outro biocatalisador em seu processo, o Clostridium butyricum, enquanto que a presente invenção utiliza o Clostridium beijerinckii. Conforme mencionado anteriormente, o C beijerinckii normalmente não é um bom produtor de ácido butírico, pois o produto final de sua fermentação é acetona, butanol e etanol. Mas, no presente pedido foram desenvolvidos para esta cepa, condições controladas de nutrientes, pH e pressão de H2, capazes de produzir ácido butírico como único produto. Caso fosse adotada as condições e parâmetros conforme mencionado nesta anterioridade, seriam gerados produtos indesejados, diferentes do ácido butírico desejado.

[028] O documento CN108048355 (A) intitulado "METHOD FOR FERMENTATION OF CLOSTRIDIUM BUTYRICUM AND SOLID FERMENTATION METHOD OF CLOSTRIDIUM BUTYRICUM" apresenta um método que utiliza Clostridium para fermentação de sacarídeos, com intuito de obter majoritariamente ácido butírico. Tal documento, utiliza um biocatalisador diferente daquele utilizado na presente invenção, o Clostridium butyricum, e faixa de pH 4.0-9.8, também diferente. Além disso, o referido documento descreve um método de fermentação em estado sólido para o Clostridium, enquanto que na presente invenção, utiliza- se meio líquido durante no processo.

[029] O documento CN109504713 (A) intitulado "METHOD AND APPLICATION FOR PREPARING HIGH ESTER BOND HUMIC ACID PREPARATION FROM CLOSTRIDIUM BEIJERINCKII" apresenta Clostridium beijerinckii como produtor de ácido butírico através de fermentação. Entretanto, o produto obtido em tal documento, isto é, um éster de ácido húmico, é bastante diferente do produto alcançado na presente invenção, além de utilizar o ácido butírico como matéria-prima e não como produto.

[030] Pode-se observar por meio das equações 1 e 2 apresentadas abaixo, o rendimento teórico pelas reações estequiométricas de formação do ácido butírico a partir da glicose e da xilose, respectivamente (PROCENTESE, et al. 2015). A partir da glicose ou da xilose pode ser obtido 1 mol de ácido butírico por 1 mol de glicose ou 1,2 mol de xilose consumida, ou seja 0,49 g de ácido butírico/g glicose ou de xilose.
Glicose: C6H12O6 →+1CH3CH2CH2COOH + 2CO2 + 2 H2 (Eq. 1)

Tabela 1. Comparação da produção de ácido butírico por diferentes microrganismos.

* cepa fornecida por Biodiesel Corporation of Iowa, U.S.A.
**valores máximos obtidos até o momento.

[031] Assim, de maneira surpreendente e inesperada a presente invenção propõe um processo específico sob condições controladas de atmosfera de hidrogênio, pH e concentração de açúcares provenientes do processamento da cana-de-açúcar e de seus resíduos lignocelulósicos para a produção de ácido butírico como único produto, utilizando como biocatalisador Clostridium beijerinckii Br21.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[032] O objetivo da invenção é proporcionar um processo para a produção de ácido butírico, pela fermentação de substratos sacarídicos derivados da cana-de-açúcar na presença do Clostridium beijerinckii Br21. Os sacarídeos contidos no substrato adotado deve ser ou glicose, ou xilose, ou frutose, ou arabinose, ou celobiose, ou sacarose, ou melaço, ou a mistura destes em diferentes proporções. Além do sacarídeo, o substrato deverá conter uma fonte de nitrogênio inorgânico e/ou orgânico e minerais, incluindo cobre, enxofre, ferro, fósforo, magnésio, manganês e potássio.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS:

[033] Para obter uma total e completa visualização do objetivo desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme segue.

[034] A FIG. 1 apresenta um fluxograma das principais etapas do processo para a produção de ácido butírico.

[035] A FIG. 2 apresenta um esquema das etapas de ativação e preparação do inóculo.

[036] A FIG. 3 apresenta um esquema das etapas de preparo do meio de cultura e do processo fermentativo.

[037] A FIG. 4 apresenta um esquema das etapas de quantificação do ácido butírico.

[038] A FIG. 5 apresenta cromatogramas sobrepostos de uma amostra inicial (preto) e final (rosa) do processo fermentativo com xilose como substrato, demonstrando o consumo deste com posterior aparecimento do ácido butírico, como único produto. O ácido acético permanece igual no início e no final do ensaio e se refere a um sal de acetato adicionado ao meio de cultivo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO:

[039] A presente invenção refere-se a um processo para a produção de ácido butírico mediante fermentação de substratos derivados da cana-de-açúcar contendo sacarídeos, principalmente glicose, xilose, frutose, arabinose, celobiose, sacarose, melaço, ou a mistura destes em diferentes proporções, e fontes de nitrogênio inorgânico e/ou orgânico e minerais, incluindo cobre, enxofre, ferro, fósforo, magnésio, manganês e potássio, na presença do Clostridium beijerinckii Br21. O referido processo compreende as seguintes etapas:

• (a) Ativação e Preparação do inóculo;
• (b) Preparação dos meios de cultura;
• (c) Fermentação em batelada; e
• (d) Quantificação do ácido butírico.

[040] Diferentemente de processos anteriormente descritos para a obtenção de ácido butírico por fermentação utilizando espécies de Clostridium, a presente invenção fornece um método altamente específico para produzir ácido butírico, que compreende a fermentação de um substrato contendo sacarídeos pela cepa Br21 de C. beijerinckii. O processo da presente invenção proporciona uma produção mínima de subprodutos, resultando num melhor rendimento de ácido butírico com relação ao substrato consumido.

Microrganismo

[041] A cepa foi caracterizada segundo (FONSECA, et al. 2016; FONSECA, et al. 2019), e identificada como um Clostridium beijerinckii, nomeada como Br21. O projeto Whole Genome Shotgun foi depositado em DDBJ / ENA / GenBank sob o acesso MWMH00000000 (FONSECA, et al. 2019) .

[042] Os ensaios realizados usaram, portanto, a cepa de C. beijerinckii Br21 e também uma cepa de C. beijerinckii comercial (ATCC 35702) para comparação do potencial na produção de ácido butírico.

Ativação e Preparação do inóculo

[043] O C. beijerinckii Br21 foi cultivado em Reinforced Clostridium Medium (RCM - Sigma-Aldrich®) (Tabela 1 - meio A) contendo 5 g/L de glicose, como fonte de carbono e pH inicial 6,5 (± 0,3) e após 2 ml da cultura contendo 30% de glicerol foi mantida a temperatura de -80°C.

[044] A partir dessa cultura armazenada é realizada a ativação das células em frascos tipo penicilina de 50 mL, contendo 30 mL do meio RCM líquido, com pH ajustado para 6,5 (± 0,3), contendo glicose (5 g/L) como fonte de carbono para o crescimento da cepa. Gás nitrogênio deve ser borbulhado durante 5 minutos para assegurar a anaerobiose do sistema. Estas células são cultivadas a 35 °C, com agitação de 135 rpm.

[045] Após 24 horas de crescimento, as células são reinoculadas em frascos tipo penicilina de 100 mL, contendo 60 mL do meio RCM líquido, com a fonte de carbono ajustada na mesma concentração desejada para a fermentação ser realizada. Nesta etapa, o pH deve ser ajustado a 6,5 (± 0,3), com ausência de oxigênio e cultivo em 35 °C com agitação de 135 rpm por 24h. Um tempo de crescimento do inóculo excessivo pode resultar em subprodutos na fermentação, tais como o etanol e o ácido lático, que serão adicionados ao meio já no início da fermentação.

[046] Após o crescimento, ao apresentar uma densidade óptica de 1,0 (± 0,2) medida a 600nm, as células são centrifugadas e ressuspendidas em solução de NaCl (0,9% m/v), estando prontas para serem inoculadas nos ensaios de fermentação.

[047] Outra forma de inocular é sem realizar a etapa de centrifugação e ressuspensão. Dessa forma, após o crescimento das células no meio de interesse, tendo alcançado uma densidade óptica de 1,0 (±0,3) em 600nm, o inóculo é diretamente acrescentado ao ensaio de fermentação, obedecendo uma proporção de 10% (v/v) de meio contendo o inóculo em relação ao meio de cultura do ensaio. As etapas que compõem esta fase do processo estão representadas na FIG. 2.

Preparação dos meios de cultura

[048] Diferentes composições de meio de cultura podem ser utilizadas para o crescimento do C. beijerinckii Br21 e para as fermentações dos carboidratos a ácido butírico, tais como o meio A, B, C, D, E e F. (Tabela 2).
Tabela 2. Composição dos meios de cultura com substrato contendo sacarídeos entre 5 e 60 g/L.

[049] Podem ser utilizados substratos que compreendem um ou mais sacarídeos. Exemplos de sacarídeo adequado (também chamado de "carboidrato") incluem, mas não estão limitados a monossacarídeos (por exemplo, glicose, frutose, arabinose e xilose); dissacarídeos (por exemplo, sacarose, celobiose), melaço, e hidrolisados ácidos de biomassa lignocelulósica derivada da cana-de-açúcar.

[050] Cabe ressaltar que, embora os hidrolisados de materiais lignocelulósicos, como a palha de cana e a fibra de milho apresentem em comum, após a sua hidrólise, açúcares que podem ser utilizados como matérias primas do referido processo, tais como os hidrolisados, apresentam também potenciais inibidores de fermentação, sendo estes compostos diferentes para materiais lignocelulósicos, que diferem também dependendo do método de hidrólise utilizado. Assim, no processo apresentado, o C. beijerinckii Br21 não foi inibido pelo hidrolisado ácido de palha de cana para a produção de ácido butírico, podendo consumir além dos açúcares, ácidos orgânicos como o ácido acético. Isso se deve ao controle da hidrólise ácida realizada no bagaço para que não excedesse a concentração de inibidores que pudessem atuar sobre o C. beijerinckii Br21.

[051] O metabolismo do Clostridium é bem amplo e vários podem ser os produtos gerados da fermentação de açúcares. Desta forma, sob condições controladas de atmosfera de hidrogênio, pH e concentração de açúcares e fonte de nitrogênio é possível controlar o metabolismo do Clostridium para que este siga a rota exclusiva do ácido butírico.

[052] A concentração destes substratos pode variar de 5 a 60 g/L de açúcares redutores totais (ART).

[053] Além do substrato sacarídico, o meio de cultura também deve conter uma fonte complexa de nitrogênio que pode ser peptona, triptona, extrato de carne, extrato de levedura, levedura seca, casaminoácidos isoladamente ou em mistura em diferentes proporções. O meio ainda deve ser suplementado, dependendo da fonte de carbono utilizada, com uma fonte de nitrogênio inorgânico e minerais, incluindo cobre, cálcio, enxofre, ferro, fósforo, magnésio, manganês e potássio.

[054] Os componentes de cada meio de cultura, exceto os açúcares e vitaminas, são solubilizados em água deionizada, previamente fervida para remoção de oxigênio, resfriados para ajuste do pH entre 7,0 e 6,5 e em seguida, autoclavados a 121 °C durante 15 minutos. A solução de carboidratos é preparada e autoclavada separadamente nas mesmas condições. As soluções de vitaminas são preparadas com água autoclavada e em seguida filtrada com filtro Millipak® de 0,22 μm. As soluções são misturadas no fermentador, previamente pasteurizado a 90°C por 30 min, assepticamente por meio de bombas peristálticas acopladas, ou nos frascos por meio de seringas estéreis.

[055] Gás de nitrogênio é borbulhado durante 10 minutos para garantir a anaerobiose e, em seguida, o sistema é parcialmente fechado, deixando apenas uma mangueira estéril conectada a uma saída mergulhada em água para permitir a saída de CO2. Todo o procedimento é realizado de forma estéril.

Fermentação

[056] A fermentação é conduzida em modo batelada simples com agitação e com composições de meio de cultura similar ao meio A a F, dependendo da fonte de carbono utilizada (Tabela 2). Como inóculo para os ensaios, utiliza-se uma cultura de C. beijerinckii Br21 crescida em meio E (Tabela 1) com a mesma concentração inicial de açúcar que a batelada, mantida a 35 °C durante 24 horas a 135 rpm. O inóculo é padronizado como 1,0 (± 0,3) de densidade óptica (DO) a 600nm. O biorreator é inoculado com 10% (v/v) da suspensão de inóculo e mantido a 35 °C com agitação a 50 rpm com controle de pH e por aproximadamente 100 horas. Durante a fermentação, amostras do meio são coletadas periodicamente com seringa estéril para medir a DO a 600 nm. As principais etapas envolvendo o meio de cultura e o processo fermentativo estão descritas na FIG. 3.

[057] Consideram-se como condições nutricionais, especialmente, a concentração de sacarídeo (xilose, arabinose, glicose, frutose, celobiose, sacarose ou melaço, ou hidrolisado ácido de biomassa lignocelulósica derivada de cana de açúcar) entre 5 e 60 g/L e mistura destes açúcares. Celulose na sua forma bruta ou purificada não pode ser utilizada como fonte de carbono para a produção de ácido butírico por este método.

[058] Partindo da concentração de carboidrato entre 5 e 60 g/L a concentração da fonte de nitrogênio orgânico complexa (peptona, extrato de levedura, triptona, casaminoácidos e extrato de carne) pode variar entre 6 e 30 g/L para favorecer o processo. Além disso, fontes inorgânicas de nitrogênio, tais como o sulfato de amônio, entre 1 e 2 g/L também auxiliam na produção.

[059] Aliado aos aspectos do biocatalisador, do pH, e da concentração inicial de substrato, a relação C/N no meio de cultura e o tipo da fonte de nitrogênio influenciam na conversão específica do carboidrato em ácido butírico. Relação C/N entre 5 e 30 g/g, sendo que o nitrogênio compreende a soma do nitrogênio orgânico e inorgânico adicionado ao meio.

[060] O intervalo de pH que mais favorece a obtenção de ácido butírico por este microrganismo é entre 5,5 e 6,8, dependendo da concentração inicial de açúcar utilizada na fermentação. Em pH abaixo de 5,0 ± 0,2 o microrganismo deixa de crescer, o substrato não é mais consumido. Em um Clostridium solventogênico haveria reassimilação do ácido butírico o que não é observado neste processo, sendo este acumulado no meio. Entretanto, se o pH não for controlado o próprio ácido butírico inibe a fermentação. O pH do meio e a concentração dos ácidos orgânicos irá determinar a concentração da forma não dissociada, de acordo com o pKa. A concentração de ácidos orgânicos não dissociados pode ser calculada de acordo com a equação 3.

[061] Onde Cha é a concentração de ácido não dissociado, Ctotal é a concentração total do ácido e pKa é o logaritmo da constante de dissociação do ácido. O pKa para os ácidos acético, lático e butírico a 35° C é 4,75, 3,86 e 4,83, respectivamente.

[062] De acordo com esta equação é possível determinar a concentração de ácidos orgânicos totais e de ácido butírico não dissociados limite para a fermentação, que foi de 13 e 8 mmol/L, respectivamente. Portanto, a combinação entre a concentração de substrato e o pH do meio não deverá propiciar uma concentração de ácido butírico acima deste valor.

[063] Fermentação em batelada com controle de pH foi realizada em biorreator de dois litros (New Brunswick, Bioflo 115). O pH inicia em 6,8 cai até 6,3 nas primeiras 10 horas de fermentação e é controlado neste patamar até o final da fermentação, acoplando uma bomba peristáltica com uma solução de NaOH a 1,0 mol/L. A temperatura é mantida a 35 °C e a agitação constante de 50 rpm. O biorreator é mantido sob anaerobiose no decorrer da fermentação. A atmosfera anaeróbia se refere a uma atmosfera com preferencialmente menos que 0,2 ppm de oxigênio no meio. Vários métodos podem ser usados para garantir a anaerobiose do método. Por exemplo, gás inerte (nitrogênio ou argônio) pode ser aspergido no início da fermentação para purgar o oxigênio do meio. Ou a fermentação pode ser conduzida dentro de uma câmara de anaerobiose na qual, a atmosfera foi preenchida com gás inerte.

[064] A pressão total dentro do biorreator deve ser mantida abaixo de 0,5 bar, sendo que a pressão parcial de H2 deve permanecer acima de 0,1 bar.

[065] A pressão total dentro do biorreator e a pressão parcial de H2, aliado ao decréscimo de pH pode levar à formação de subprodutos diferentes do ácido butírico, tais como ácido acético e acetona. Surpreendentemente, a acetona, um produto da fase solventogênica do Clostridium foi detectada no meio de fermentação da cepa Br21. Entretanto, como a cepa Br21 não é capaz de formar a acetona pela via bioquímica, por não sintetizar a enzima acetoacetato descarboxilase, a acetona é formada em decorrência de uma decomposição química do ácido acetoacético. Esta reação é possível em baixas temperaturas e pressões, como uma exceção aos cetoácidos, pois o grupo carbonila está na posição beta do grupo carboxílico, ou seja, o ácido acetoacético como um β-cetoácido pode sofrer descarboxilação em uma reação química intramolecular, facilitada por pH ácido.

[066] Em ensaios de fermentação com o Clostridium beijerinckii ATCC 35702, realizados sob as mesmas condições, foram detectados outros produtos, tais como ácido acético, acetona, etanol e butanol. Portanto, ao contrário deste, o citado não foi específico para o ácido butírico.

Quantificação do ácido butírico

[067] A quantificação das matérias primas e a concentração de ácido butírico e outros produtos formados foi realizada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE, com uso da coluna Aminex HPX-87H (7,8 mm x 300 mm) com temperatura controlada em 60 °C, sob condições isocráticas. A fase móvel utilizada foi de H2SO4 5 mmol/L com o fluxo de 0,4 mL/min. O detector utilizado foi o RID (índice de refração) e a aquisição e o tratamento dos dados foram realizados pelo software LabSolutions. Foi realizada uma curva padrão para cada analito de interesse. As etapas estão representadas na FIG. 4.

[068] Os cromatogramas extraídos depois das análises de uma amostra inicial e final de um processo fermentativo, nas condições até então descritas, usando xilose como fonte de carbono e o Clostridium beijerinckii Br21 como inóculo estão demostrados na FIG. 5, em que ambas as amostras estão sobrepostas, indicando um elevado consumo do substrato e formação do ácido butírico como único produto.

[069] A composição do gás do head space do fermentador foi determinada utilizando cromatógrafo a gás (CG 2014, Shimadzu, Japão) equipado com detector de condutividade térmica (DCT). Para as análises, utilizou-se uma coluna empacotada de peneira molecular 5A (2,0 m x 4,7 mm), com gás argônio como gás arraste com vazão de 30 mL/min. As temperaturas do injetor, da coluna e do detector foram de 80, 50 e 100°C, respectivamente.

[070] Para quantificação do H2 produzido, foi construída uma curva padrão a partir da correlação entre as áreas dos picos obtidas nos cromatogramas pela porcentagem de H2 injetada no equipamento a partir de volumes conhecidos de H2.
y = 43831,68x - 325957,30 (Eq. 4)

[071] A partir desta curva, foi calculada a porcentagem de H2 presente na fase gasosa (headspace) do fermentador. Esta porcentagem foi utilizada na Equação 5 com o intuito de calcular a quantidade de H2 obtida, em mmol.

[072] Em que P é a pressão interna dos frascos (atm), medida utilizando um medidor Cerophant T (Endress+Hauser®), V é o volume da fase gasosa (em L), %H2 é porcentagem de H2 presente na fase gasosa, R é a constante universal dos gases (0,082 L.atm/mol.K) e T é a temperatura (K).

Cálculo de rendimento

[073] A partir da estequiometria dessa reação sabe-se que a cada 6/5 ou 1,2 mol de xilose, 1 mol de ácido butírico é produzido, o que fornece um fator teórico de conversão de 0,80 mol de ácido butírico/mol de xilose, que corresponderia a 100% de rendimento. Dessa forma, foi calculado o rendimento obtido na conversão de xilose a ácido butírico, utilizando a Equação 6.

[074] A quantidade de ácido butírico obtido por açúcar consumido é similar ao valor teórico estequiométrico, que é de 1,0 mol 0,80 de ácido butírico/mol de hexose ou pentose consumida respectivamente e de 0,49 g/g.

[075] Embora a invenção tenha sido amplamente descrita, é óbvio para aqueles versados na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas visando aprimoramento do projeto sem que as referidas alterações não estejam cobertas pelo escopo da invenção.

Referências bibliográficas

[076] JANG, Y.-S. et al. Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum for butyric acid production with high butyric acid selectivity. Metabolic Engineering, v. 23, p. 165-174, maio 2014.

[077] ALAM, S. (MISSOURI U. . C. (USA). D. OF C. E.; STEVENS, D.; BAJPAI, R. Production of butyric acid by batch fermentation of cheese whey with Clostridium beijerinckii. Journal of Industrial Microbiology (Netherlands), 1988.

[078] WU, W. et al. Dietary sodium butyrate improves intestinal development and function by modulating the microbial community in broilers. PLOS ONE, v. 13, n. 5, p. e0197762, 24 maio 2018.

[079] LEE, W. S. et al. A review of the production and applications of waste-derived volatile fatty acids. Chemical Engineering Journal, v. 235, p. 83-99, 1 jan. 2014.

[080] HASSAN, Y. I. et al. Innovative drugs, chemicals, and enzymes within the animal production chain. Veterinary Research, v. 49, n. 1, p. 71, 31 dez. 2018.

[081] Butyric Acid Derivatives Market for Animal Feed Application is Estimated to Reach US$ 542.8 mn by 2024: Transparency Market Research. Disponível em: <https://www.prnewswire.com/news-releases/butyric-acid-derivatives-market-for-animal-feed-application-is-estimated-to-reach-us-5428-mn-by-2024-transparency-market-research-618341533.html>. Acesso em: 13 set. 2019.

[082] FU, H. et al. Butyric acid production from lignocellulosic biomass hydrolysates by engineered Clostridium tyrobutyricum overexpressing xylose catabolism genes for glucose and xylose co-utilization. Bioresource Technology, v. 234, p. 389-396, jun. 2017.

[083] JIANG, L. et al. Enhanced butyric acid tolerance and bioproduction by Clostridium tyrobutyricum immobilized in a fibrous bed bioreactor. Biotechnology and Bioengineering, v. 108, n. 1, p. 31-40, jan. 2011.

[084] FONSECA, B. C.; GUAZZARONI, M. E.; REGINATTO, V. Fermentative production of H2from different concentrations of galactose by the new isolate Clostridium beijerinckii Br21. International Journal of Hydrogen Energy, v. 41, n. 46, p. 21109-21120, 2016.

[085] FONSECA, B. C. et al. Use of Algae Biomass Obtained by Single-Step Mild Acid Hydrolysis in Hydrogen Production by the β-Glucosidase-Producing Clostridium beijerinckii Br21. Waste and Biomass Valorization, 25 ago. 2018.

[086] STEVENS, D.; ALAM, S.; BAJPAI, R. Fermentation of cheese whey by a mixed culture of Clostridium beijerinckii and Bacillus cereus. Journal of Industrial Microbiology, v. 3, n. 1, p. 15-19, fev. 1988.

[087] LUO, H. et al. Recent advances and strategies in process and strain engineering for the production of butyric acid by microbial fermentation. Bioresource Technology, v. 253, p. 343-354, 1 abr. 2018.

[088] BELLIDO, C. et al. Efficient acetone-butanol-ethanol production by Clostridium beijerinckii from sugar beet pulp. Bioresource Technology, v. 190, p. 332-338, 2015.

[089] LUTKE-EVERSLOH, T.; BAHL, H. Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum: Recent advances to improve butanol production. Current Opinion in Biotechnology, v. 22, n. 5, p. 634-647, 2011.

[090] GHESHLAGHI, R. et al. Metabolic pathways of clostridia for producing butanol. Biotechnology Advances, v. 27, n. 6, p. 764-781, nov. 2009.

[091] DÜRRE, P. Biobutanol: An attractive biofuel. Biotechnology Journal, v. 2, n. 12, p. 1525-1534, 2007.

[092] WANG, Y. et al. Single-nucleotide resolution analysis of the transcriptome structure of Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 using RNA-Seq. BMC Genomics, v. 12, n. 1, p. 479, 2011.

[093] FONSECA, BRUNA CONSTANTE. GUAZZARONI, MARIA EUGENIA. REGINATTO, VALERIA. RIANO-PACHON, D. Genome sequence of the H2-producing Clostridium beijerinckii strain Br21 isolated from a sugarcane vinasse treatment plant. Genetics and Molecular Biology, [s.d.].

[094] HARTMANIS, M. G. N.; KLASON, T.; GATENBECK, S. Applied Microbiology Biotechnology Uptake and activation of acetate and butyrate in Clostridium acetobutylicum. p. 66-71, 1984.

[095] SCHIEL-BENGELSDORF, B. et al. Butanol fermentation. Environmental technology, v. 34, n. 13-16, p. 1691-710, 2013.

[096] PROCENTESE, A. et al. Continuous xylose fermentation by Clostridium acetobutylicum - Assessment of solventogenic kinetics. Bioresource Technology, v. 192, p. 142-148, set . 2015.

[097] FOND, O. et al. The role of acids on the production of acetone and butanol by Clostridium acetobutylicum. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 22, n. 3, p. 195-200, jul. 1985.

[098] CHEN, T. et al. Butyric Acid Fermentation by Clostridium tyrobutyricum in Sugar Mixtures and Corncob Hydrolysate Containing Arabinose. [s.l.] Dept. of Wood and Paper Science, College of Natural Resources, North Carolina State University, 2017. v. 12

[099] BAROI, G. N. et al. Butyric acid fermentation from pretreated and hydrolysed wheat straw by an adapted Clostridium tyrobutyricum strain. Microbial Biotechnology, v. 8, n. 5, p. 874-882, set. 2015.

[100] LIU, S. et al. Butyric acid from anaerobic fermentation of lignocellulosic biomass hydrolysates by Clostridium tyrobutyricum strain RPT-4213. Bioresource Technology, v. 143, p. 322-329, 1 set. 2013.

[101] HUANG, J. et al. Butyric acid production from recycled waste paper by immobilized Clostridium tyrobutyricum in a fibrous-bed bioreactor. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, v. 91, n. 4, p. 104 81054, 1 abr. 2016a.

[102] KIM, M. et al. Butyric acid production from softwood hydrolysate by acetate-consuming Clostridium sp. S1 with high butyric acid yield and selectivity. Bioresource Technology, v. 218, p. 1208-1214, 1 out. 2016.

[103] WEI, D.; LIU, X.; YANG, S.-T. Butyric acid production from sugarcane bagasse hydrolysate by Clostridium tyrobutyricum immobilized in a fibrous-bed bioreactor. Bioresource Technology, v. 129, p. 553-560, 1 fev. 2013.

[104] HUANG, J. et al. Butyric acid production from oilseed rape straw by Clostridium tyrobutyricum immobilized in a fibrous bed bioreactor. Process Biochemistry, v. 51, n. 12, p. 1930-1934, 1 dez. 2016b.

[105] HUANG, J. et al. Efficient production of butyric acid from Jerusalem artichoke by immobilized Clostridium tyrobutyricum in a fibrous-bed bioreactor. Bioresource Technology, v. 102, n. 4, p. 3923-3926, 1 fev. 2011.

Claims (14)

1. Processo para a produção de ácido butírico caracterizado pelo fato compreender as seguintes etapas:

   • (a) Ativação e preparação do inóculo da cepa de bactérias;
   • (b) Preparação dos meios de cultura;
   • (c) Fermentação; e
   • (d) Quantificação do ácido butírico.

   em que a bactéria é do gênero Clostridium, mais precisamente Clostridium beijerinckii Br21.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o inóculo ser preparado em meio RCM contendo 5g/L de glicose como fonte de carbono, pH de 6,5 ± 0,3.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o inóculo ser padronizado com 1,0 ± 0,3 de densidade ótica a 600 nm.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o meio de cultura compreender de 5 e 60 g/L de substratos sacarídicos, de 6 e 30 g/L de fontes orgânicas de nitrogênio e minerais.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de os substratos sacarídicos serem selecionados do grupo consistindo principalmente em glicose, xilose, frutose, arabinose, celobiose, sacarose, melaço, e hidrolisados ácidos de biomassa lignocelulósica derivada da cana de açúcar, ou a mistura destes em diferentes proporções.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de as fontes orgânicas de nitrogênio serem selecionadas do grupo consistindo principalmente em peptona, triptona, extrato de carne, extrato de levedura, levedura seca, casaminoácidos isoladamente ou em mistura em diferentes proporções.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de adicionalmente usar fontes inorgânicas de nitrogênio, principalmente sulfato de amônio, entre 1 e 2 g/L.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de os minerais serem selecionados do grupo consistindo principalmente em cobre, cálcio, enxofre, ferro, fósforo, magnésio, manganês e potássio.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a fermentação ser conduzida em modo batelada simples em biorreatores.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de o biorreator ser inoculado com 10% v/v da suspensão de inóculo e mantido a 35 °C com agitação a 50 rpm por 100 horas.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de a pressão total dentro do biorreator ser mantida abaixo de 0,5 bar, sendo que a pressão parcial de H2 deve permanecer acima de 0,1 bar
12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de o pH estar na faixa entre 5,5 e 6,8.
13. Uso do ácido butírico conforme produzido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser um aditivo em alimentação animal, protegendo a microbiota intestinal.
14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de permitir a redução do uso de antibióticos normalmente utilizados para o crescimento animal.

Images