BR102018074877A2 - Biomarcadores lipídicos, método e kit para diagnóstico laboratorial de esquizofrenia a partir de soro sanguíneo - Google Patents

Abstract

A presente tecnologia trata de um conjunto de 38 biomarcadores lipídicos para o diagnóstico laboratorial de esquizofrenia a partir de soro sanguíneo. Trata também de um kit e do método para tal diagnóstico. O kit compreende 38 isótopos de lipídeos marcados como padrão de referência para utilização como base de cálculo da concentração dos biomarcadores na amostra de soro. O método consiste na análise de amostras de soro sanguíneo por análise por injeção em fluxo e detecção por espectrometria de massas em tandem (FIA-MS/MS), e avaliação das concentrações do painel de lipídeos selecionados na presente tecnologia. O método apresenta alta sensibilidade e especificidade.

Description

BIOMARCADORES LIPÍDICOS, MÉTODO E KIT PARA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE ESQUIZOFRENIA A PARTIR DE SORO SANGUÍNEO

[001] A presente tecnologia trata de um conjunto de 38 biomarcadores lipídicos para o diagnóstico laboratorial de esquizofrenia a partir de soro sanguíneo. Trata também de um kit e do método para tal diagnóstico. O kit compreende 38 isótopos de lipídeos marcados como padrão de referência para utilização como base de cálculo da concentração dos biomarcadores na amostra de soro. O método consiste na análise de amostras de soro sanguíneo por análise por injeção em fluxo e detecção por espectrometria de massas em tandem (FIA-MS/MS), e avaliação das concentrações do painel de lipídeos selecionados na presente tecnologia. O método apresenta alta sensibilidade e especificidade.

[002] A esquizofrenia é uma doença crônica com numerosos sintomas, onde nenhum sintoma é patogênico. O diagnóstico de esquizofrenia é alcançado através de uma avaliação dos sinais e sintomas específicos do paciente. Os critérios de diagnóstico para esquizofrenia incluem a persistência de dois ou mais dos seguintes sintomas de fase ativa, cada um com duração de uma parcela significativa de pelo menos um mês: delírios, alucinações, discurso desorganizado, comportamento grosseiramente desorganizado ou catatônico e sintomas negativos. Ainda não existem testes laboratoriais para o diagnóstico da doença. Pesquisas recentes sugerem que a absorção deficiente ou a quebra excessiva de fosfolípidos de membrana podem estar associadas à esquizofrenia. [Vahia, V.N., Diagnostic and statistical manual of mental disorders 5: A quick glance. Indian Journal of Psychiatry, 2013. 55(3): p. 220-223; Patel, K.R., et al., Schizophrenia: Overview and Treatment Options. Pharmacy and Therapeutics, 2014. 39(9): p. 638-645; Fenton, W.S., J. Hibbeln, and M. Knable, Essential fatty acids, lipid membrane abnormalities, and the diagnosis and treatment of schizophrenia. Biol Psychiatry, 2000. 47(1): p. 821); Solberg, D.K., et al., Association between serum lipids and membrane fatty acids and clinical characteristics in patients with schizophrenia. Acta Psychiatr Scand, 2015. 132(4): p. 293-300].

[003] Várias linhas de evidência sugerem que a fisiopatologia da esquizofrenia envolve vias inflamatórias e imunológicas, integradas com a regulação redox. Tem sido sugerido que a composição dos lipídios de membrana celular é anormal, potencialmente devido à perturbação da regulação redox. O estresse oxidativo também pode afetar os lipídios séricos e causar dislipidemia. Na esquizofrenia, os níveis de lipídeos séricos e de membrana parecem aberrantes. Assim, uma alteração na regulação redox pode ser um fator comum que liga anormalidades dos lipídeos séricos e de membrana na esquizofrenia. Uma alteração na composição lipídica da membrana nas células neuronais pode afetar a neurotransmissão, os sintomas e o comportamento na esquizofrenia..

[004] A identificação de biomarcadores que possam ser utilizados no diagnóstico ou como preditores de resposta ao tratamento em pessoas com esquizofrenia será um passo importante no sentido de oferecer um tratamento personalizado. Os achados dos estudos em tecido cerebral ainda não foram traduzidos em biomarcadores que sejam práticos no uso clínico, pois biópsias cerebrais não são aceitáveis e técnicas de neuroimagem são caras e os resultados são inconclusivos. Assim, nos últimos anos, tem havido a procura de biomarcadores sanguíneos para esquizofrenia como uma alternativa válida. Porém, deve-se reconhecer que a esquizofrenia é uma desordem complexa e heterogênea que ainda precisa ser dissecada profundamente para o encontro de marcadores biológicos e clínicos úteis.

[005] Neste contexto, a presente tecnologia foi desenvolvida a partir da investigação de um painel de lipídeos presentes no soro sanguíneo de pacientes com esquizofrenia e de indivíduos sem a doença (controles). Um painel de 38 lipídeos que conjuntamente são capazes de caracterizar a esquizofrenia e diferenciar pacientes com a doença de indivíduos controles é o objeto da presente tecnologia.

[006] Existem no estado da técnica algumas soluções propostas para o diagnóstico da esquizofrenia com base no uso de biomarcadores lipídicos, como as citadas a seguir.

[007] O documento de patente US8026099-B2, cuja data de prioridade é 25/07/2008, intitulado “Lipid profile as a biomarker for early detection of neurological disorders”, descreve a análise de amostras de pacientes com doença de Alzheimer (DA). O mecanismo molecular dessa doença não se manifesta em pacientes com esquizofrenia, de modo que indivíduos com esquizofrenia, provavelmente, possuem um perfil lipídico diferente de DA. O volume de amostra de plasma sanguíneo necessário para a extração de lipídeos pelo método descrito nesse documento é muito grande (500μL), e os extratos de lipídeos obtidos necessitam de várias etapas de tratamento para a separação de classes diferentes de lipídeos como, por exemplo, um tratamento exclusivo para a extração de esfingomielinas das amostras biológicas. Deste modo, para obter diferentes classes, precisam injetar e analisar (por ESI-MS) vários extratos de uma mesma amostra. Dessa forma, os protocolos utilizados no documento US8026099-B2 são extremamente complexos e extensos, inviáveis para uso como método de diagnóstico/prognóstico.

[008] O documento de patente US8304246-B2, cuja data de prioridade é 28/02/2007, intitulado “Methods for the diagnosis of dementia and other neurological disorders”, descreve a análise de amostras de pacientes com demência cuja etiologia foi a doença de Alzheimer, e não a esquizofrenia. Foram obtidos painéis de massas moleculares de lipídeos (em Daltons) para a diferenciação entre os grupos de estudo. Esse conjunto de massas é útil para a identificação de lipídeos, mas pode ser substituído por bibliotecas de massas virtuais, como LIPIMAPS (https://www.lipidmaps.org/data/structure/index.php) e outras que são adquiridas junto com os softwares dos equipamentos. Para obter os painéis de massas, o documento US8304246 necessitou da utilização de quatro plataformas analíticas diferentes (FT-ICRMS, LC/MS, HRAPCI-MS e MS/MS). Para uso em análises clínicas, o custo destes equipamentos e o tempo de análise são inviáveis.

[009] No estado da técnica não foi encontrada uma seleção de biomarcadores lipídicos para diagnóstico específico da esquizofrenia a partir de soro sanguíneo, para detecção por um método simples e de baixo custo, conforme descrito na presente invenção. A presente invenção apresenta vantagens em relação ao estado da técnica, pois trata de um método para o diagnóstico laboratorial da esquizofrenia utilizando um painel de 38 lipídeos biomarcadores da doença, com alta sensibilidade e especificidade. Trata-se de um diagnóstico pouco invasivo, baseado apenas em punção venosa, que utiliza um pequeno volume de amostra para análise, apenas 10 μl. Além disso, o tempo de análise por FIA é pequeno, apenas 3 minutos; e já existem programas disponíveis para interpretação rápida dos resultados. O método proposto permite a identificação e quantificação de esfingomielinas e glicerofosfolipídeos em uma única análise e em uma única fração de 10μL de amostra de plasma. Trata-se de uma forma direta e precisa de quantificação e identificação de metabólitos a partir de padrões marcados. Utiliza-se uma faixa de concentração (μM) de metabólitos mensurável e capaz de caracterizar pacientes com esquizofrenia, utilizando uma única técnica (FIA-MS).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[010] A figura 1 mostra a plotagem dos modelos construídos por estatística multivariada e validação: (A) modelo de PCA apresentando a tendência de separação entre os grupos de pacientes com esquizofrenia e controles baseado no perfil de lipídeos; (B) modelo de PLS-DA confirmando a separação entre os grupos; (C) avaliação da sensibilidade e especificidade do modelo PLS-DA (AUROC=1); (D) teste de permutação para avaliação do ajuste do modelo e capacidade preditiva. Os interceptos R2= 0, 698 e Q2= -1,42 indicam, respectivamente, que não houve sobreposição do modelo e que ele possui significativa capacidade preditiva.

[011] A figura 2 representa a plotagem do modelo construído por OPLS-DA. O modelo foi construído usando duas componentes principais (PCs) e teve como parâmetros de validação R2=0,987 e Q2=0,966.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

[012] A presente tecnologia trata de um conjunto de 38 biomarcadores lipídicos para o diagnóstico laboratorial de esquizofrenia a partir de soro sanguíneo. Trata também de um kit e do método para tal diagnóstico. O kit compreende 38 isótopos de lipídeos marcados como padrão de referência para utilização como base de cálculo da concentração dos biomarcadores na amostra de soro. O método consiste na análise de amostras de soro sanguíneo por análise por injeção em fluxo e detecção por espectrometria de massas em tandem (FIA-MS/MS), e avaliação das concentrações do painel de lipídeos selecionados na presente tecnologia. O método apresenta alta sensibilidade e especificidade.

[013] Os biomarcadores lipídicos para diagnóstico da esquizofrenia a partir de soro sanguíneo de pacientes compreende o seguinte conjunto de lipídeos ou uma combinação de dois ou mais dos seguintes lipídeos: lysoPC a C14:0; lysoPC a C16:1; lysoPC a C17:0 ; lysoPC a C18:0; lysoPC a C18:1; lysoPC a C18:2; lysoPC a C20:3; lysoPC a C20:4; PC aa C30:0; PC aa C32:0; PC aa C32:1; PC aa C34:4; PC aa C36:4; PC aa C36:5; PC aa C38:4; PC aa C38:5; PC aa C38:6; PC aa C40:2; PC aa C40:5; PC aa C40:6; PC ae C32:1; PC ae C34:0; PC ae C34:1; PC ae C36:0; PC ae C36:1; PC ae C36:4; PC ae C38:1; PC ae C38:2; PC ae C38:3; PC ae C38:4; PC ae C38:5; PC ae C38:6; PC ae C40:2; PC ae C40:3; PC ae C40:6; PC ae C44:5; PC ae C44:6; e C0.

[014] O método para diagnóstico laboratorial de ESQUIZOFRENIA compreende as seguintes etapas:

• a. Obtenção de no mínimo 10 microlitros de soro sanguíneo, a partir de centrifugação do sangue coletado do paciente em tubo de vácuo sem anticoagulante;
• b. Preparação do soro sanguíneo coletado em “a” para análise pelo método de injeção em fluxo (FIA) utilizando padrões internos marcados com isótopos estáveis de lipídeos;
• c. Análise das amostras obtidas em “b” através de espectrometria de massas, utilizando a intensidade dos sinais MS/ MS de cada biomarcador definido na reivindicação 1 em relação ao seu padrão interno marcado com isótopo, como base de cálculo da concentração do biomarcador na amostra;
• d. Avaliação das faixas de concentração obtidas em c, sendo que, nas seguintes faixas de concentração (em μmol/L) o diagnóstico é considerado positivo para esquizofrenia: lysoPC a C14:0 (4,38 ± 0,96); lysoPC a C16:1 (4,24± 1,67); lysoPC a C17:0 (3,74 ± 1,11);lysoPC a C18:0 (82,15 ± 23,34); lysoPC a C18:1 (25,45 ± 7,94); lysoPC a C18:2 (32,87 ± 5,47); lysoPC a C20:3 (3,80 ± 0,96); lysoPC a C20:4 (11,22 ± 5,20); PC aa C30:0 (2,96 ± 0,43); PC aa C32:0 (11,85 ± 2,04); PC aa C32:1 (12,21 ± 3,95); PC aa C34:4 (1,70 ± 0,34); PC aa C36:4 (189,00 ± 44,42); PC aa C36:5 (18,37 ± 4,10); PC aa C38:4 (121,02 ± 38,68); PC aa C38:5 (50,36 ± 13,55); PC aa C38:6 (43,36 ± 16,20); PC aa C40:2 (2,19 ± 1,01); PC aa C40:5 (13,94 ± 5,15); PC aa C40:6 (20,17 ± 10,79); PC ae C32:1 (1,97±0,38); PC ae C34:0 (0,99 ± 0,18); PC ae C34:1 (5,84 ± 1,08); PC ae C36:0 (0,55 ± 0,13); PC ae C36:1 (19,36 ± 6,88); PC ae C36:4 (12,21 ± 3,68); PC ae C38:1 (6,90 ± 3,16); PC ae C38:2 (7,76 ± 3,38); PC ae C38:3 (20,01 ± 8,52); PC ae C38:4 (13,02 ± 2,17); PC ae C38:5 (12,02 ± 4,08); PC ae C38:6 (4,37 ± 0,70); PC ae C40:2 (4,14 ± 1,48); PC ae C40:3 (11,53 ± 4,70); PC ae C40:6 (3,34 ± 0,54); PC ae C44:5 (0,93 ± 0,21); PC ae C44:6 (1,09 ± 0,29); e C0 (34,96 ± 8,68).

[015] O kit para o diagnóstico laboratorial de esquizofrenia compreende 38 isótopos de lipídeos marcados como padrão de referência (lysoPC a C14:0; lysoPC a C16:1; lysoPC a C17:0 ; lysoPC a C18:0; lysoPC a C18:1; lysoPC a C18:2; lysoPC a C20:3; lysoPC a C20:4; PC aa C30:0; PC aa C32:0; PC aa C32:1; PC aa C34:4; PC aa C36:4; PC aa C36:5; PC aa C38:4; PC aa C38:5; PC aa C38:6; PC aa C40:2; PC aa C40:5; PC aa C40:6; PC ae C32:1; PC ae C34:0; PC ae C34:1; PC ae C36:0; PC ae C36:1; PC ae C36:4; PC ae C38:1; PC ae C38:2; PC ae C38:3; PC ae C38:4; PC ae C38:5; PC ae C38:6; PC ae C40:2; PC ae C40:3; PC ae C40:6; PC ae C44:5; PC ae C44:6; e C0) para base de cálculo da concentração dos biomarcadores definidos na reivindicação 1 na amostra de soro.

[016] A presente invenção pode ser mais bem compreendida através dos exemplos que se seguem, não limitantes.

EXEMPLO 1 - SELEÇÃO DOS BIOMARCADORES

[017] O grupo de indivíduos selecionados como doadores de sangue periférico para estudo foi composto por dez pacientes com esquizofrenia crônica recrutados no Ambulatório de Esquizofrenia do Instituto Raul Soares / FHEMIG, Belo Horizonte-MG, Brasil, e da Clínica de Saúde Mental de Nova Lima-MG, Brasil; e por dez indivíduos saudáveis recrutados da comunidade local que participaram do estudo como controles. A entrevista MINI-Plus (Amorim 2000), utilizando os critérios do DSM-IV TR (Association 2000), foi utilizada para confirmar o diagnóstico de esquizofrenia nos pacientes e a ausência de transtorno psiquiátrico nos controles [Amorim P: Mini International Neuropsychiatric Interview (MINI): validação de entrevista breve para diagnóstico de transtornos mentais. Revista Brasileira de Psiquiatria 2000, 22:106-115].

[018] O estudo foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinque, e seu protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Raul Soares / FHEMIG (Protocolo número 034-B / 2010). Cinco mililitros de sangue foram retirados de cada indivíduo por punção venosa para um tubo de vácuo sem anticoagulante. O sangue foi imediatamente centrifugado a 3000 rpm durante 10 minutos e o soro foi separado e mantido congelado a -80°C até o momento de uso.

[019] Para a preparação de amostras e análises por FIA, cada amostra de soro (10 μΙ) foi pipetada em um poço de placa de 96 poços equipada com um sistema de filtragem e sensibilizada com padrões internos marcados com isótopos estáveis de lipídeos (Biocrates Life Science AG, Áustria). Em seguida a placa foi colocada em um evaporador sob um fluxo de nitrogênio (pressão de 3-4 bars), sob temperatura ambiente durante 30 minutos. Após a secagem, foram adicionados 50 μl de uma solução contendo 300 μl de fenilisotiocianato (PITC) + 1900 μl de etanol + 1900 μl de H2O + 1900 μl de piridina em cada poço e a placa ficou incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente. Após, a placa foi submetida à secagem durante 60 minutos no evaporador sob um fluxo de nitrogênio (pressão de 3-4 bars). Em seguida foram adicionados 300 μl de uma solução de acetato de amônio em metanol (5 mM) a cada poço e incubado em um agitador (450 rpm) por 30 minutos. A placa foi centrifugada a 100 g por 2 minutos. Após a filtragem, 250 μΙ de amostra foram transferidos para a placa de análise por injeção em fluxo (FIA). Foram adicionados 400 μl de solvente de corrida (todo conteúdo de 1 ampola de solvente I - Biocrates diluído em 290 mL de metanol). Após, a placa foi incubada por 2 minutos em um agitador a 600 rpm. Em seguida, 20 μl de cada amostra foram analisados em um espectrômetro de massa quadrupolo em tandem Xevo-TQ-S (Waters Technologies, Massachusetts, EUA). As amostras foram injetadas através de um amostrador automático diretamente em uma fonte de íons do tipo electrospray e analisadas em modo positivo. Como solução carreadora foi utilizada água ultrapura (mili-Q) contendo 0,2% de ácido fórmico, seguindo a taxa de fluxo de acordo com a tabela 1. O tempo total de corrida para cada amostra foi de 3 minutos. A intensidade dos sinais MS/ MS de cada analito (lipídeo) em relação ao seu padrão interno marcado com isótopo foi utilizada como base de cálculo da concentração do analito na amostra. Os cálculos das concentrações foram realizados de forma automatizada pelo software MetIDQ (Biocrates Life Science AG, Áustria).

[020] Tabela 1. Taxa de fluxo da solução carreadora durante as análises por injeção em fluxo

[021] O conjunto de dados obtidos foi submetido a análises estatísticas multivariadas utilizando o software SIMCA 14.0 (Umetrics, Umea, Suécia). Os dados foram normalizados por escala de variância unitária (UV) e depois foram submetidos à análise de componentes principais (PCA), análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA) e projeção ortogonal para análise discriminante de estruturas latentes (OPLS- DA). Os modelos OPLS-DA foram examinados para determinar quais variáveis foram as principais responsáveis por qualquer separação observada entre os grupos (esquizofrenia e controles). Para identificar quais variáveis foram responsáveis por essa separação, a influência da variável no parâmetro de projeção (VIP) acima de 1 foi utilizada para selecionar as variáveis que tiveram a contribuição mais significativa na discriminação entre os perfis de ácidos graxos. As análises de PCA apresentaram que houve uma tendência de separação em pacientes com esquizofrenia e controles com base no perfil de lipídeos (Figura 1A). Essa tendência foi confirmada pelas análises de PLS-DA (Figura 1B), cuja validação do modelo foi realizada através de método estatístico de reamostragem (Teste de permutação).

[022] A sensibilidade e especificidade dos perfis de lipídeos em separar controles e pacientes com esquizofrenia foram calculadas através da área acima da curva (AUROC). Quanto mais próximos de 1 estiverem os valores da AUROC melhor é discriminação entre grupos, sendo que 1 indica discriminação perfeita entre grupos e valores iguais ou inferiores a 0,5 geralmente significam nenhuma discriminação. Em nosso modelo encontramos como resultado AUROC=1 (Figura 1C). O modelo PLS-DA foi validado pelo teste de permutação (200 permutações) de acordo com o parâmetro de ajuste do modelo (R2) e pelo parâmetro de capacidade preditiva (Q2). Ambos os parâmetros apresentaram resultados significativos (Figura 1D).

[023] As análises por OPLS-DA demonstraram total separação entre os grupos (Figura 2) através dos perfis lipídicos e a subsequente análise de VIP apresentou quais lipídeos foram mais importantes para tal separação e que possuem potencial para serem biomarcadores de esquizofrenia (Tabela 2).

[024] Tabela 2. Principais lipídeos encontrados como potenciais biomarcadores para esquizofrenia

a importância da variável na projeção (VIP) foi obtida do modelo OPLS-DA com um limiar acima de 1,0; b Fold-change (FC) foi calculada pelo valor da média de concentração de lipídeos do grupo Esquizofrenia em relação ao grupo Controle, sendo que os valores indicam quantas vezes o metabólito está mais alto ou mais baixo entre os grupos;c O valor de p foi calculado pelo teste de Wilcoxon Mann Whitney; d q-values foi calculado usando o valor p ajustado com a taxa de descoberta falsa (FDR). “Baixo” e “alto” se referem aos resultados obtidos no cálculo de fold-change (FC), por exemplo: lysoPC a C18:1 é 1,94 vezes mais baixo em esquizofrenia do que o controle.

Claims (3)

1. BIOMARCADORES LIPÍDICOS, caracterizados por compreender o seguinte conjunto de lipídeos ou uma combinação de dois ou mais dos seguintes lipídeos: lysoPC a C14:0; lysoPC a C16:1; lysoPC a C17:0 ; lysoPC a C18:0; lysoPC a C18:1; lysoPC a C18:2; lysoPC a C20:3; lysoPC a C20:4; PC aa C30:0; PC aa C32:0; PC aa C32:1; PC aa C34:4; PC aa C36:4; PC aa C36:5; PC aa C38:4; PC aa C38:5; PC aa C38:6; PC aa C40:2; PC aa C40:5; PC aa C40:6; PC ae C32:1; PC ae C34:0; PC ae C34:1; PC ae C36:0; PC ae C36:1; PC ae C36:4; PC ae C38:1; PC ae C38:2; PC ae C38:3; PC ae C38:4; PC ae C38:5; PC ae C38:6; PC ae C40:2; PC ae C40:3; PC ae C40:6; PC ae C44:5; PC ae C44:6; e C0.
2. MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE ESQUIZOFRENIA, caracterizada por compreender as seguintes etapas:

   • a) Obtenção de no mínimo 10 microlitros de soro sanguíneo, a partir de centrifugação do sangue coletado do paciente em tubo de vácuo sem anticoagulante;
   • b) Preparação do soro sanguíneo coletado em “a” para análise pelo método de injeção em fluxo (FIA) utilizando padrões internos marcados com isótopos estáveis de lipídeos;
   • c) Análise das amostras obtidas em “b” através de espectrometria de massas, utilizando a intensidade dos sinais MS/ MS de cada biomarcador definido na reivindicação 1 em relação ao seu padrão interno marcado com isótopo, como base de cálculo da concentração do biomarcador na amostra;
   • d) Avaliação das faixas de concentração obtidas em c, sendo que, nas seguintes faixas de concentração (em μmol/L) o diagnóstico é considerado positivo para esquizofrenia: lysoPC a C14:0 (4,38 ± 0,96); lysoPC a C16:1 (4,24± 1,67); lysoPC a C17:0 (3,74 ± 1,11);lysoPC a C18:0 (82,15 ± 23,34); lysoPC a C18:1 (25,45 ± 7,94); lysoPC a C18:2 (32,87 ± 5,47); lysoPC a C20:3 (3,80 ± 0,96); lysoPC a C20:4 (11,22 ± 5,20); PC aa C30:0 (2,96 ± 0,43); PC aa C32:0 (11,85 ± 2,04); PC aa C32:1 (12,21 ± 3,95); PC aa C34:4 (1,70 ± 0,34); PC aa C36:4 (189,00 ± 44,42); PC aa C36:5 (18,37 ± 4,10); PC aa C38:4 (121,02 ± 38,68); PC aa C38:5 (50,36 ± 13,55); PC aa C38:6 (43,36 ± 16,20); PC aa C40:2 (2,19 ± 1,01); PC aa C40:5 (13,94 ± 5,15); PC aa C40:6 (20,17 ± 10,79); PC ae C32:1 (1,97±0,38); PC ae C34:0 (0,99 ± 0,18); PC ae C34:1 (5,84 ± 1,08); PC ae C36:0 (0,55 ± 0,13); PC ae C36:1 (19,36 ± 6,88); PC ae C36:4 (12,21 ± 3,68); PC ae C38:1 (6,90 ± 3,16); PC ae C38:2 (7,76 ± 3,38); PC ae C38:3 (20,01 ± 8,52); PC ae C38:4 (13,02 ± 2,17); PC ae C38:5 (12,02 ± 4,08); PC ae C38:6 (4,37 ± 0,70); PC ae C40:2 (4,14 ± 1,48); PC ae C40:3 (11,53 ± 4,70); PC ae C40:6 (3,34 ± 0,54); PC ae C44:5 (0,93 ± 0,21); PC ae C44:6 (1,09 ± 0,29); e C0 (34,96 ± 8,68).
3. KIT PARA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE ESQUIZOFRENIA, caracterizada por compreender 38 isótopos de lipídeos marcados como padrão de referência (lysoPC a C14:0; lysoPC a C16:1; lysoPC a C17:0 ; lysoPC a C18:0; lysoPC a C18:1; lysoPC a C18:2; lysoPC a C20:3; lysoPC a C20:4; PC aa C30:0; PC aa C32:0; PC aa C32:1; PC aa C34:4; PC aa C36:4; PC aa C36:5; PC aa C38:4; PC aa C38:5; PC aa C38:6; PC aa C40:2; PC aa C40:5; PC aa C40:6; PC ae C32:1; PC ae C34:0; PC ae C34:1; PC ae C36:0; PC ae C36:1; PC ae C36:4; PC ae C38:1; PC ae C38:2; PC ae C38:3; PC ae C38:4; PC ae C38:5; PC ae C38:6; PC ae C40:2; PC ae C40:3; PC ae C40:6; PC ae C44:5; PC ae C44:6; e C0) para base de cálculo da concentração dos biomarcadores definidos na reivindicação 1 na amostra de soro.

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