BR102018070488A2 - aditivo, composição, processo de fermentação, uso do aditivo, uso da composição - Google Patents

Abstract

aditivo, composição, processo de fermentação, uso do aditivo, uso da composição. a presente invenção insere-se no campo da produção de biocombustíveis e bioquímicos. em particular, a presente invenção se refere a adição de xilooligossacarídeos ou seus derivados para estimular o crescimento e metabolismo de bactérias do gênero clostridium em fermentações industriais. adicionalmente são objetos da presente invenção uma composição compreendendo o aditivo e um processo fermentativo que emprega o aditivo na etapa de preparação do meio de cultura ou diretamente no fermentador ou ainda durante a propagação do inóculo do micro-organismo. a presente invenção permite a melhora da performance da fermentação industrial com a consequente obtenção de uma concentração maior de butanol e redução do substrato residual.

Description

(54) Título: ADITIVO, COMPOSIÇÃO, PROCESSO DE FERMENTAÇÃO, USO DO ADITIVO, USO DA COMPOSIÇÃO (51) Int. Cl.: C12N 1/20; C12N 1/38; C08H 8/00; C12P 7/16; C12R 1/145.

(71) Depositante(es): UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS - UNICAMP.

(72) Inventor(es): MARIA CAROLINA DE BARROS GRASSI; MARCELO FALSARELLA CARAZZOLLE; GONÇALO AMARANTE GUIMARÃES PEREIRA.

(57) Resumo: ADITIVO, COMPOSIÇÃO, PROCESSO DE FERMENTAÇÃO, USO DO ADITIVO, USO DA COMPOSIÇÃO. A presente invenção insere-se no campo da produção de biocombustíveis e bioquímicos. Em particular, a presente invenção se refere a adição de xilooligossacarídeos ou seus derivados para estimular o crescimento e metabolismo de bactérias do gênero Clostridium em fermentações industriais. Adicionalmente são objetos da presente invenção uma composição compreendendo o aditivo e um processo fermentativo que emprega o aditivo na etapa de preparação do meio de cultura ou diretamente no fermentador ou ainda durante a propagação do inóculo do micro-organismo. A presente invenção permite a melhora da performance da fermentação industrial com a consequente obtenção de uma concentração maior de butanol e redução do substrato residual.

T empcr (h)

Tempo (h)

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ADITIVO, COMPOSIÇÃO, PROCESSO DE FERMENTAÇÃO, USO DO ADITIVO, USO DA COMPOSIÇÃO”

Campo da invenção:

[001] A presente invenção insere-se no campo da produção de biocombustíveis e bioquímicos. Em particular, a presente invenção se refere a adição de xilooligossacarídeos ou seus derivados para estimular o crescimento e metabolismo de bactérias do gênero Clostridium em fermentações industriais, bem como permitir a melhora da performance da fermentação industrial com a consequente obtenção de uma maior concentração e produtividade de n-butanol, acetona, etanol em especial a produção de n-butanol e redução do substrato residual. A invenção se refere ainda a uma composição compreendendo o aditivo para aplicação em fermentações industriais.

[002] Adicionalmente a presente invenção se refere a um processo de fermentação em que o diferencial consiste em adicionar na etapa de preparação do meio de cultura ou diretamente no fermentador ou ainda durante a propagação do inóculo do micro-organismo o aditivo.

Fundamentos da invenção:

[003] N-butanol é amplamente utilizado como matériaprima química para a fabricação de butilglicol éter, acetato de butila, plastificante, assim como ésteres utilizados para revestimento, esmaltes e lacas. Energeticamente, o n-butanol também é um químico promissor para ser utilizado como biocombustível ou um como aditivo para combustíveis, pois pode ser misturado com a gasolina ou mesmo usado como combustível puro sem ser necessário qualquer modificação nos motores de veículos à combustão. A alta demanda de n-butanol

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2/17 reflete-se em seu mercado global, que atingiu em 2014 US$ 7,86 bilhões e é estimado em US $ 9,9 bilhões em 2020. A fermentação ABE (acetona-butanol-etanol) utilizando bactérias do gênero Clostridium é um dos processos de fermentação já bem estabelecido, que foi amplamente utilizado no início do século 20 para a produção de solventes como acetona e n-butanol. No entanto, devido ao alto preço do substrato de fermentação e ao baixo rendimento de solventes, a maior parte do n-butanol comercializado hoje é produzido a partir de rotas petroquímicas. Atualmente, o crescimento do mercado de n-butanol combinado com preocupações ambientais e geopolíticas relacionadas ao uso de derivados de petróleo renovou o interesse na rota de produção fermentativa, através da fermentação ABE.

[004] No entanto, a fermentação ABE tem vários problemas que devem ser solucionados para sua implementação em escala industrial. As principais deficiências da fermentação ABE são o baixo rendimento e a produtividade dos solventes devido à toxicidade elevada de n-butanol, além dos altos valores de substrato utilizado como matéria-prima. Portanto, atualmente, três quesitos são obrigatórios para tornar comercial a produção fermentativa de n-butanol: um substrato barato, um processo de fermentação otimizado e um microorganismo eficiente, capaz de produzir altas concentrações de n-butanol.

[005] As recentes tecnologias desenvolvidas para a produção de açúcares (pentoses e hexoses) a baixo custo a partir da hidrólise da biomassa lignocelulósica (tecnologia de segunda geração) geram um cenário favorável para a fermentação ABE. E o estabelecimento de um meio de cultura

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3/17 que utilize hidrolisado lignocelulósico, que tenha em sua composição nutrientes baratos para serem empregados em escala industrial e seja otimizado para o crescimento bacteriano é crucial para a obtenção de altas concentrações de n-butanol.

[006] Considerando esse cenário, a presente invenção buscou preencher uma lacuna existente no mercado de biocombustíveis e produtos bioquímicos e revelou que a adição de pequenas quantidades de xilooligossacarídeos e/ou arabinoxilooligossacarídeos em processo fermentativo estimula o crescimento e altera o metabolismo da bactéria do gênero Clostridium aumentando o rendimento e produtividade da fermentação industrial.

[007] Os xilooligossacarídeos são definidos como uma mistura de oligossacarídeos formados por resíduos de xilose ligados através de ligações β 1-4 (Xylooligosaccharides (XOS) as an Emerging Prebiotic: Microbial Synthesis, Utilization, Structural Characterization, Bioactive Properties, and Applications, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety Vol. 10, 2011) . Preferencialmente o xilooligossacarídeos contém de 2 a 10 resíduos de xilose e podem apresentar cadeias laterais de arabionose (definidos como arabinoxilooligossacarídeos), de grupos acetil e derivados de ácido urânico. Sendo definidos dessa maneira como derivados de xilooligossacarídeos.

Estado da técnica:

[008] Xilooligossacarídeos são moléculas resultantes da degradação de xilanas e apresentam propriedades prebióticas. Prebióticos, por sua vez, são definidos como compostos não digeridos pelo sistema digestivo que estimulam,

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4/17 seletivamente, o crescimento e/ou atividades de bactérias que vivem no cólon do intestino do hospedeiro, trazendo benefícios a sua saúde. A ação benéfica de prebióticos já foi demonstrada para diversas espécies hospedeiras e por esse motivo o estudo e a produção de xilooligossacarídeos vem tomando grandes proporções.

[009] Diversos trabalhos têm relatado as propriedades prebióticas dos xilooligossacarídeos, os quais estimulam o crescimento e atividade metabólica de algumas espécies de bactérias encontradas no sistema digestivo, tais como Bifidobacteriums spp., Lactobacillus spp., Selenomonas spp. (Aachary et al., Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 2011, 10:2-16, 2015). Igualmente, é feito uma revisão dos diversos benefícios biológicos trazidos pelo uso dos xilooligossacarídeos, tais como sua atuação na resposta imunomodeladora, sua atividade anticancerígena, antimicrobiana, antioxidante e como suplemento para alimentação animal.

[010] As matérias-primas xilanas e arabinoxilanas podem ser obtidas a partir do material lignocelulósico encontrado em diversos resíduos agrícolas, por exemplo, xilooligossacarídeos podem ser produzidos a partir da hidrólise enzimática de xilanas presentes no bagaço de canade-açúcar e já foi demonstrado ter potencial antioxidante (Bioresource Technology 2013, 127:236-241).

[011] Outros estudos demonstram a produção desses compostos a partir de espigas de milhos e seu efeito sobre o crescimento de bactérias do gênero Bifidobacterium, presentes no intestino humano Xylooligosaccharide increases bifidobacteria but not lactobacilli in human gut microbiota.

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Food Funct., 2014, 5, 436-445 e In vitro fermentation of xylo-oligosaccharides from corn cobs autohydrolysis by Bifidobacterium and Lactobacillus strains LWT - Food Science and Technology Volume 40, Issue 6, August 2007, Pages 963972) .

[012] Por outro lado, já se conhece do estado da técnica o uso de bactérias em fermentações industriais para a obtenção de químicos e commodities químicas - Lactobacillus spp. para a produção de ácido lático, Escherichia coli para a produção de fármacos e químicos renováveis, Clostridium spp. para a produção de n-butanol e acetona.

[013] Em particular, o uso de bactérias do gênero Clostridium na produção de n-butanol a partir do uso da biomassa lignocelulósica é descrito, por exemplo, em artigos como Reviving the Weizmann process for commercial n-butanol production, Nature Communications volume 9, Article number: 3682 (2018) e Pretreatment and hydrolysis of lignocellulosic wastes for butanol production: Challenges and perspectives, Bioresource Technology, in press, bem como nos pedidos de patente US 20160289707A1 e US 2011/031879A1.

[014] No estado da técnica há patentes e artigos que descrevem a fermentação de n-butanol a partir de hidrolisado lignocelulósico, como por exemplo US 2011/0318796 A1. No entanto, hidrolisados lignocelulósicos não apresentam grandes quantidades de xilooligossacarídeos, pois, para ser técnica e economicamente eficiente os açúcares devem ser totalmente digeridos até a fração de monômeros, glicose e xilose. Portanto, no estado da técnica as reações utilizando enzimas (ou ácidos) são otimizadas de modo a minimizar a quantidade de tais oligossacarídeos.

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6/17 [015] O pedido de patente US 20160289707A1 descreve a adição de polpa de celulose e complexo enzimático no processo fermentativo para aumento da produção de n-butanol por Clostridium, justificando o resultado por provável liberação de peptídeos e ou ativação dos mecanismos de Quorum Sensing bacteriano.

[016] Em relação ao pedido de patente US 20160289707A1, a presente invenção traz resultados semelhantes, mas que podem ser obtidos de forma menos laboriosa e a baixo custo, facilitando sua aplicação em escala industrial. Isto porque a presente invenção descreve a adição de xilooligossacarídeos ou seus derivados no processo fermentativo, sem que haja necessidade de adicionar uma polpa de celulose e um complexo enzimático, os quais muitas vezes apresentam alto custo e são de difícil obtenção técnica. Portanto, ao ser comparada com o pedido de patente US 2011/031879A1 a presente invenção se mostra mais competitiva e vantajosa.

[017] Diversos documentos do estado da técnica descrevem tecnologias e métodos para aumentar o rendimento e a produtividade da produção de n-butanol a partir da fermentação ABE. No entanto, em nenhum documento é descrito o uso de xilooligossacarídeos ou seus derivados em fermentações industriais com a finalidade de estimular o metabolismo bacteriano e aumentar a concentração, o rendimento e a produtividade do composto de interesse.

[018] A presente invenção descreve a adição no meio de cultivo de apenas Xilooligossacarídeos e/ou arabinoxilooligossacarídeos, compostos que podem ser obtidos comercialmente ou podem ser obtidos através de um processo

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7/17 de hidrólise parcial de um material lignocelulósico e atuam estimulando o crescimento e o metabolismo de bactérias do gênero Clostridium resultando no aumento do rendimento e da produtividade dos produtos da fermentação industrial, preferencialmente n-butanol.

Breve descrição da invenção:

[019] A presente invenção se refere a adição ao meio de cultura de xilooligossacarídeos ou seus derivados, preferencialmente os arabinoxilooligossacarídeos para estimular o crescimento e metabolismo de bactérias do gênero Clostridium em fermentações industriais.

[020] A referida adição permitiu a melhora da performance da fermentação industrial com a consequente obtenção de uma concentração maior de n-butanol e redução do substrato residual.

[021] Ainda a presente invenção se refere a uma composição compreendendo xilooligossacarídeos ou seus derivados, preferencialmente os arabinoxilooligossacarídeos.

[022] Adicionalmente a presente invenção se refere a um processo de fermentação em que o diferencial está em adicionar nas etapas de preparação do meio de cultura ou diretamente no fermentador ou ainda durante a propagação do inóculo do micro-organismo o aditivo, ou a composição compreendendo o aditivo.

Breve descrição das figuras:

[023] Para obter um total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue:

A Figura 1 apresenta o efeito do consumo de glicose

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8/17 no gráfico a) e a produção de n-butanol no gráfico b) por C. saccharoperbutylacetonicum cultivada em meio sintético contendo 2,5 pg/ml de xilooligossacarídeos (·) ou arabinoxilooligossacarídeos (O). Controle sem adição de oligos (A).

A Figura 2 ilustra de modo simplificado o processo industrial para a fermentação ABE, sendo que a Figura 2A representa o processo tradicional, e a Figura 2B apresenta o processo com a adição de xilooligossacarídeos e/ou derivados.

Descrição detalhada da invenção:

[024] A presente invenção trata de um aditivo que compreende xilooligossacarídeo ou derivados de xilooligossacarídeos, arabinoxilooligossacarídeos, ou a mistura destes, compreendendo pelo menos quatro resíduos de xilose, que estimulam o crescimento e o metabolismo da bactéria Clostridium sp em processo fermentativo.

[025] Na presente invenção, foi estabelecida a adição de, 0.005% a 2,5%(peso/volume), preferencialmente 2,5% (peso/volume) de xilooligossacarídeos ou arabinoxilooligossacarídeos para estimular o crescimento e metabolismo de bactérias do gênero Clostridium em fermentações industriais.

[026] Mais particularmente, as bactérias utilizadas na presente invenção foram selecionadas do gênero Clostridium. Mais preferivelmente, as bactérias foram selecionadas da espécie Clostridium saccharoperbutylacetonicum.

[027] Já os xilooligossacarídeos ou arabinoxilooligossacarídeos foram obtidos via sintética ou pela hidrólise parcial de material lignocelulósico. Mais

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9/17 preferivelmente, os xilooligossacarídeos ou arabinoxilooligossacarídeos podem ser obtidos pela hidrólise de xilanas obtidas de biomassa de cana-de-açúcar, canaenergia, milho, sorgo, soja, eucalipto, pinus, capim elefante.

[028] Ainda é objeto da presente invenção uma composição compreendendo

A -	fonte	de	açúcar;
B -	fonte	de	nitrogênio;
C -	fonte	de	vitaminas;
D -	fonte	de	aminoácidos;
E -	fonte	de	fósforo;

F - antiespumante;

[029] G - aditivo selecionado dentre xilooligossacarídeo, derivados de xilooligossacarídeos, preferencialmente arabinoxilooligossacarídeos, ou a mistura destes.

[030] A fonte de açúcar ser selecionada dentre glicose, xilose, sacarose, frutose, maltose, maltotriose, dextrinas, celulose, xilanas obtidas a partir de cana-de-açúcar, canaenergia, milho, sorgo, beterraba, eucalipto, capim elefante, Erianthus, e qualquer outra biomassa vegetal a partir das tecnologias de primeira e segunda geração.

[031] A fonte de nitrogênio ser selecionada dentre sulfato de amônio e uréia.

[032] A fonte de vitaminas ser selecionada dentre extrato de levedura, extrato de bactéria, complexos polivitaminicos.

[033] A fonte aminoácidos ser selecionada dentre extrato de levedura, extrato de bactéria, complexos.

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10/17 [034] A fonte de fósforo ser selecionada dentre fosfato monoamônico, fosfato diamônico.

[035] O antiespumante é selecionado dentre uma mistura de poliéter orgânico.

[036] Ainda é objeto da presente invenção uma composição compreendendo:

A - 3% a 10% (peso/volume) de fonte de açúcar selecionado dentre glicose, xilose, sacarose, frutose, maltose, maltotriose, dextrinas, celulose, xilanas obtidas a partir de cana-de-açúcar, milho, sorgo, beterraba, eucalipto, capim elefante, Erianthus, e qualquer outra biomassa vegetal a partir da tecnologia de segunda geração;

B - 0,1% a 2% (peso/volume), preferencialmente 0,2% (peso/volume), de fonte de nitrogênio selecionada dentre sulfato de amônio e ureia;

C - 0,2% a 2% (peso/volume), preferencialmente 0,4% (peso/volume) de fonte de vitaminas selecionada dentre extrato de levedura, extrato de bactéria, complexos polivitaminicos;

D - 0,2% a 2%(peso/volume), preferencialmente 0,4% (peso/volume) de fonte de aminoácidos selecionada dentre extrato de levedura, extrato de bactéria;

E - 0,1% a 2% % (peso/volume), preferencialmente 0,2%(peso/volume) de fonte de fósforo selecionada dentre fosfato monoamônico, fosfato diamônico;

F - 10 a 500ppm, preferencialmente 50 ppm de antiespumante;

G - 0.005% a 2,5%(peso/volume), preferencialmente 2,5% (peso/volume) de aditivo selecionado dentre xilooligossacarídeo, derivados de xilooligossacarídeos,

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11/17 preferencialmente arabinoxilooligossacarídeos, ou a mistura destes.

[037] Os xiloogossacarídeo ou derivados de xilooligossacarídeos, podem ser obtidos de material lignocelulósico ou via sintética. E o material lignocelulósico pode ser obtido de biomassa do grupo que compreende cana-de-açúcar, cana-energia, milho, sorgo, soja, eucalipto, pinus, capim elefante preferencialmente cana-deaçúcar e cana energia.

[038] Adicionalmente é objeto da presente invenção um processo de fermentação caracterizado por compreender as seguintes etapas

a) Preparação do inóculo da cepa bacteriana;

b) Preparação do meio de cultura;

c) Fermentação em batelada ou processo contínuo;

d) Separação e Purificação.

[039] Sendo que nas etapas (a), (b) ou (c) é adicionado o aditivo ou a composição compreendendo o aditivo.

[040] As condições do processo fermentativo devem ser padronizadas de acordo com o micro-organismo utilizado e não devem influenciar no efeito da adição do xilooligossacarídeos.

[041] Considerando processo de fermentação para a bactéria Clostridium sp na etapa (a) o inóculo é selecionado dentre Clostridium sp. , preferencialmente Clostridium saccharoperbutylacetonicum.

[042] Na etapa (b) o meio de cultura deve compreender preferencialmente 3% a 10% (peso/volume) de açúcares totais (xilose e/ou glicose), preferencialmente 0,4% (peso/volume) de extrato de levedura, preferencialmente 0,2 %

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12/17 (peso/volume) de sulfato de amônio e preferencialmente 50 ppm de antiespumante, preferencialmente uma mistura de poliéter orgânico.

[043] Na etapa (c), etapa de fermentação, o processo fermentativo é realizado entre 30-37°C, mas preferencialmente a 32°C, pH 5 a 6,5, mas preferencialmente 6,5 em atmosfera estritamente anaeróbica.

[044] No referido processo de acordo o inóculo da etapa (a) é selecionado dentre Clostridium sp., preferencialmente Clostridium saccharoperbutylacetonicum. Na concretização da invenção, sem, no entanto, restringir a esta modalidade foi utilizada a Clostridium saccharoperbutylacetonicum da cepa DSM 14923.

[045] O processo acima definido é utilizado para a produção de n-butanol, etanol, acetona. O n-butanol, pode ser usado como biocombustível ou bioquímico. Na presente invenção, entende-se como bioquímico, um produto que pode ser aplicado nas áreas química para a produção de tintas, vernizes, solventes entre outros, bem como na indústria farmacêutica.

[046] As fermentações industriais podem ser escolhidas do grupo selecionado de fermentações butanólicas, fermentações etanólicas, fermentações acidogênicas, preferencialmente, a fermentação industrial é a fermentação ABE (acetona-butanol-etanol).

[047] Adicionalmente é objeto da presente invenção o uso do aditivo para estimular o crescimento e o metabolismo da bactéria Clostridium sp em processo fermentativo para a produção de n-butanol, etanol, acetona, e por incrementar a produção de n-butanol. O aditivo pode ser usado no preparo

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13/17 de uma composição para potencializar o crescimento e o metabolismo da bactéria Clostridium sp.

[048] A composição obtida pode ser utilizada em processo fermentativo da bactéria Clostridium sp para a produção etanol, acetona, n-butanol, preferencialmente n-butanol, e incrementar a produção de n-butanol.

[049] Ainda o uso do aditivo ou o uso da composição da presente invenção permite 40% de aumento na produção de nbutanol, e a redução do substrato residual após finalização da fermentação industrial.

[050] Com o desenvolvimento da presente invenção, verificou-se um aumento na concentração e produtividade do produto final da fermentação, por exemplo, n-butanol e redução do substrato residual.

[051] Para evidenciar estes resultados, um exemplo da invenção é fornecido a seguir.

Exemplo da invenção:

[052] Em um exemplo da invenção, testes de suplementação de xilooligossacarídeos em fermentações com bactérias do gênero Clostridium foram realizados conforme protocolo a seguir:

1) Preparação do inóculo da cepa bacteriana [053] Todos os experimentos foram realizados usando a cepa Clostridium saccharoperbutylacetonicum DSM 14923 obtida de Leibniz Institute DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures. A cepa C. saccharoperbutylacetonicum DSM 14923 é estocada rotineiramente como célula vegetativa em uma solução de glicerol 30% a -80°C. Para propagar as células e preparar o inoculo para fermentação em batelada, inoculou-se 1 ml de

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14/17 cultura congelada, contendo cerca de 3x10⁸ células/ml em 50 ml de meio de cultura esterilizado e anaeróbico Clostridial Nutrient Medium - CNM (Sigma-Aldrich), composto por 0,5 g/l de cloridrato de L-cisteína, 5 g/l de D(+)-glicose, 10 g/l de extrato de carne, 5 g/l de peptona, 3 g/l de acetato de sódio, 5 g/l de cloreto de sódio, 1 g/l de amido, 3 g/l de extrato de levedura, 0,5 g/l de ágar. O inoculo foi incubado em câmara anaeróbica (Don Whitley/DG-250) com uma atmosfera de 80% de N2, 10% de CO2 e 10% de H2, a 32°C durante 20 horas. Após o período de incubação, a cultura foi centrifugada, as células foram recuperadas e utilizadas como inóculo para os ensaios fermentativos.

2) Fermentação em batelada [054] Os ensaios de fermentação em batelada foram realizados em frascos de vidro Schott de 100 ml com um volume de trabalho de 50 ml utilizando meio de cultura sintético para cultivo (Clostridium Synthetic Medium - CSM) . O meio de cultura foi preparado usando preferencialmente de 3 a 6% (peso/volume) de açúcares totais (xilose e/ou glicose), 0,4% (peso/volume) de extrato de levedura, 0,2 % (peso/volume) de sulfato de amônio e 50 ppm de antiespumante, na concretização da invenção, sem no entanto, restringir a esta modalidade foi utilizado Antifoam 204 Sigma, uma mistura de poliéter orgânico O pH do meio foi ajustado para 6,5 com de NaOH e o meio foi esterilizado por autoclave a 121°C e 1 atm por 20 minutos antes da inoculação das bactérias. Para estabelecer a anaerobiose dos meios de cultura antes da inoculação das bactérias, o frasco contendo o meio de cultura foi incubado em câmara anaeróbia a 32°C durante 20 horas.

[055] Para os ensaios fermentativos suplementados com

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15/17 xilooligossacarídeos arabinoxilooligossacarídeos preferencialmente 0,25% (peso/volume) de oligossacarídeos foram adicionados ao meio sintético compreendendo bactérias do gênero Clostridium (Clostridium Synthetic Medium - CSM).

[056]

Os frascos de vidro Schott contendo o meio de cultura foram inoculados com cultura de C. saccharoperbutylacetonicum na fase exponencial de crescimento (OD600~2) para se obter uma OD600 inicial próxima a 1. As culturas foram, então, incubadas em câmara anaeróbica (Don Whitley/DG-250) a 32°C, sem agitação ou controle de pH. Com o objetivo de manter a cultura em anaerobiose, as tampas dos frascos foram mantidas ligeiramente abertas. Periodicamente, foram coletadas amostras de 1 ml para análise do crescimento celular, consumo de açúcar e produção de metabólitos. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.

3) Análise do crescimento celular, consumo de açúcar e produção de metabólitos [057] O crescimento celular foi analisado pela medição de absorbância de luz a comprimento de onda 600 nm, utilizando um espectrofotómetro ULTROSPEC 2000 (Pharmacia Biotech). O consumo de substrato (glicose e xilose) e a produção de metabólitos (ácido acético, ácido butírico, nbutanol, acetona e etanol) foram determinadas utilizando cromatografia líquida de alta performance acoplada ao detector de índice de refração (HPLC-RI) (Chromatograph Waters 600) . Para análise por HPLC-RI, as amostras foram centrifugadas e filtradas utilizando um filtro de 0,2 pm (Millipore) para remoção de células. Em seguida, as amostras foram injetadas em coluna de exclusão de íons Aminex HPX-87H

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16/17 (Bio-Rad) operando a 35°C e com uma fase móvel de 0,16 M de ácido sulfúrico a um fluxo de 0,6 ml/min.

4) Resultados obtidos [058] A Figura 1 apresenta os resultados do consumo de glicose (gráfico a) e a produção de n-butanol (gráfico b) pela bactéria C. saccharoperbutylacetonicum cultivada em meio sintético contendo xilooligosacarídeo ou arabinoxilooligosacarídeo.

[059] Como pode ser observado na Figura 1, verificou-se, que nas fermentações suplementadas com xilooligossacarídeos ou arabinoXilooligossacarídeos, foi obtido, após 50 horas, um aumento de, aproximadamente, 40% na concentração final e na produtividade de n-butanol.

[060] Adicionalmente, houve o consumo de todo o substrato (glicose) adicionado na fermentação, ao contrário do observado no experimento controle (sem adição de oligos), no qual há cerca de 25% de açúcares residuais após 50 horas de fermentação.

[061] Entre as vantagens da presente invenção pode-se destacar:

a) Manutenção das condições padrões de fermentação (temperatura, pH, agitação, condições atmosféricas) e apenas a adição de xilooligossacarídeos, ou arabinoxilooligossacarídeos e/ou uma mistura de ambos no meio de cultura utilizado para cultivo da bactéria;

b) Aumento da concentração e produtividade do produto final da fermentação, por exemplo, n-butanol e

c) Redução do substrato residual.

[062] Conforme pode ser visualizado na Figura 2, o diferencial desta invenção em relação a um processo

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17/17 tradicional, trata da adição de xilooligossacarídeos ou seus derivados no meio de cultivo ou diretamente no processo fermentativo.

[063] Estas vantagens proporcionam gastos menores com substratos, maior obtenção e rendimento do produto final, assim como a instalação de fermentadores de tamanho menor, devido a maior produtividade, apenas pela adição de xilooligossacarídeos que podem ser obtidos comercialmente a baixo custo.

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Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES .

   1. Aditivo caracterizado por compreender xilooligossacarídeo ou derivados de xilooligossacarídeos, arabinoxilooligossacarídeos, ou a mistura destes, compreendendo pelo menos quatro resíduos de xilose, e por estimular o crescimento e o metabolismo da bactéria Clostridium sp em processo fermentativo.
2. 2. Composição caracterizada por compreender

   A - fonte de açúcar selecionado dentre glicose, xilose, sacarose, frutose, maltose, maltotriose, dextrinas, celulose, xilanas obtidas a partir de cana-de-açúcar, milho, sorgo, beterraba, eucalipto, capim elefante, Erianthus, e qualquer outra biomassa vegetal a partir da tecnologia de segunda geração;

   B - fonte de nitrogênio selecionada dentre sulfato de amônio e ureia;

   C - fonte de vitaminas selecionada dentre extrato de levedura, extrato de bactéria, complexos polivitaminicos;

   D - fonte de aminoácidos selecionada dentre extrato de levedura, extrato de bactéria;

   E - fonte de fósforo selecionada dentre fosfato monoamônico, fosfato diamônico;

   F - antiespumante selecionado dentre uma mistura de poliéter orgânico;

   G - aditivo selecionado dentre xilooligossacarídeo, derivados de xilooligossacarídeos, preferencialmente arabinoxilooligossacarídeos, ou a mistura destes.
3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 2 caracterizada por compreender

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   A - 3% a 10% (peso/volume) de fonte de açúcar selecionado dentre glicose, xilose, sacarose, frutose, maltose, maltotriose, dextrinas, celulose, xilanas obtidas a partir de cana-de-açúcar, milho, sorgo, beterraba, eucalipto, capim elefante, Erianthus, e qualquer outra biomassa vegetal a partir da tecnologia de segunda geração;

   B - 0,1% a Y2% (peso/volume), preferencialmente 0,2% (peso/volume), de fonte de nitrogênio selecionada dentre sulfato de amônio e ureia;

   C - 0,2% a 2% (peso/volume), preferencialmente 0,4% (peso/volume) de fonte de vitaminas selecionada dentre extrato de levedura, extrato de bactéria, complexos polivitaminicos;

   D - 0,2% a 2%(peso/volume), preferencialmente 0,4% (peso/volume) de fonte de aminoácidos selecionada dentre extrato de levedura, extrato de bactéria;

   E - 0,1% a 2 % (peso/volume), preferencialmente 0,2%(peso/volume) de fonte de fósforo selecionada dentre fosfato monoamônico, fosfato diamônico;

   F - 10 a 500ppm, preferencialmente 50 ppm de antiespumante;

   G - 0.005% a 2,5%(peso/volume), preferencialmente 2,5% (peso/volume) de aditivo selecionado dentre xilooligossacarídeo, derivados de xilooligossacarídeos, preferencialmente arabinoxilooligossacarídeos, ou a mistura destes.
4. 4. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato do xiloogossacarídeo ou derivados de xilooligossacarídeos, serem obtidos de material lignocelulósico ou via sintética.

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5. 5. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato do material lignocelulósico ser obtido de biomassa do grupo que compreende cana-de-açúcar, cana-energia, milho, sorgo, soja, eucalipto, pinus, capim elefante preferencialmente cana-de-açúcar e cana energia.
6. 6. Processo de fermentação caracterizado por compreender as seguintes etapas

   a) Preparação do inóculo da cepa bacteriana;

   b) Preparação do meio de cultura;

   c) Fermentação em batelada;

   d) Separação e Purificação;

   Sendo que na etapa (a), (b) ou (c), preferencialmente na etapa (b) ou (c), é adicionado o aditivo, conforme definido na reivindicação 1 ou a composição compreendendo o aditivo,

   conforme definida nas reivindicações 2 a 5 7. Processo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado pelo inóculo da etapa (a) ser selecionado dentre Clostridium sp. 8. Processo de acordo com a reivindicação 6

   caracterizado pelo fato do inóculo ser preferencialmente Clostridium saccharoperbutylacetonicum.
7. 9. Processo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado pelo fato do inóculo ser preferencialmente Clostridium saccharoperbutylacetonicum da cepa DSM 14923.
8. 10. Processo de acordo com as reivindicações de 6 a 9, caracterizado pelo fato de na etapa na etapa (c) o processo fermentativo ser realizado entre 30-37°C, preferencialmente 32°C, pH 5 a 6,5, preferencialmente 6,5 em atmosfera anaeróbica.

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9. 11. Processo de acordo com as reivindicações de 6 a 10 caracterizado pelo fato de ser na produção de n-butanol, etanol, acetona.
10. 12. Uso do aditivo conforme definido na reivindicação 1 caracterizado por estimular o crescimento e o metabolismo da bactéria Clostridium sp em processo fermentativo para a produção de n-butanol, etanol, acetona, e por incrementar a produção de n-butanol.
11. 13. Uso do aditivo conforme definido na reivindicação 1 caracterizado por ser no preparo de uma composição para potencializar o crescimento e o metabolismo da bactéria Clostridium sp.
12. 14. Uso da composição obtida conforme definida nas reivindicações 2 a 5, caracterizado por ser em processo fermentativo da bactéria Clostridium sp para a produção etanol, acetona, n-butanol, preferencialmente n-butanol, e por incrementar a produção de n-butanol.
13. 15. Uso do aditivo conforme definido na reivindicação

    1 ou da composição conforme definida nas reivindicações de

    2 a 5, caracterizada por apresentar 40% de aumento na produção de n-butanol, reduzir o substrato residual após finalização da fermentação industrial.

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    A)

    B)

    

    Tempo (h)

    Tempo (h)