BR102018003389A2 - herbal preparations with anti-inflammatory and antiviral activity from standardized extract of spondias mombin l. - Google Patents
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Abstract
a presente invenção refere-se à obtenção e ao emprego de extratos padronizados de spondias mombin l., mais especificamente os extratos hidroalcoólico e seco de spondias mombin l. padronizados em geraniina e ácido clorogênico, bem como ao emprego da geraniina. tanto os extratos quanto a geraniina são indicados para uso em preparações farmacêuticas com atividade antiviral contra o vírus da herpes tipo 1, denominado hsv-1 e anti-inflamatória em processos de inflamação associados à infecção por hsv-1. a invenção compreende ainda, a obtenção de composições farmacêuticas nas formas líquidas, sólidas ou semi-sólida, sendo estas preparações indicadas tanto para uso tópico quanto sistêmico que contenham como princípio ativo o extrato hidroalcoólico ou o extrato seco de spondias mombin l. (padronizados em geraniina e ácido clorogênico), ou gereniina, sendo estas preparações indicadas para o tratamento da herpes ocasionada pelo vírus herpes simples tipo 1, denominado hsv-1.The present invention relates to the production and use of standardized extracts of spondias mombin l., more specifically the hydroalcoholic and dry extracts of spondias mombin l. geraniin and chlorogenic acid, as well as the use of geraniine. Both extracts and geraniine are indicated for use in pharmaceutical preparations with antiviral activity against herpes virus type 1, called hsv-1 and anti-inflammatory in inflammation processes associated with hsv-1 infection. The invention further comprises the preparation of pharmaceutical compositions in liquid, solid or semi-solid forms, these preparations being indicated for both topical and systemic use which contain the hydroalcoholic extract or the dry spondias mombin 1 extract as active ingredient. (standardized in geraniin and chlorogenic acid), or gerenin, and these preparations are indicated for the treatment of herpes caused by the herpes simplex virus type 1, called hsv-1.
Description
PREPARAÇÕES FITOTERÁPICAS COM ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA E ANTIVIRAL A PARTIR DE EXTRATO PADRONIZADO DE Spondias mombin L.PHYTOTHERAPY PREPARATIONS WITH ANTIINFLAMMATORY AND ANTI-VIRAL ACTIVITY FROM STANDARD EXTRACT OF Spondias mombin L.
Campo da invenção [001] A presente invenção refere-se ao emprego da geraniina e dos extratos hidroalcóolico e seco de Spondias mombin L., padronizados em geraniina e ácido clorogênico, indicados para uso em preparações farmacêuticas com atividade antiviral contra o vírus HSV-1 e anti-inflamatória em processos de inflamação associados a herpes tipo 1.Field of the invention [001] The present invention relates to the use of geraniine and the hydroalcoholic and dry extracts of Spondias mombin L., standardized in geraniine and chlorogenic acid, indicated for use in pharmaceutical preparations with antiviral activity against the HSV-1 virus and anti-inflammatory in inflammation processes associated with type 1 herpes.
[002] A invenção compreende ainda, a obtenção de composições farmacêuticas (líquidas, sólidas ou semissólidas), de uso tópico e sistêmico que contenham a geraniina ou extrato (líquido ou seco) de Spondias mombin L., padronizado em geraniina e ácido clorogênico, bem como suas utilizações para o tratamento da herpes ocasionada pelo vírus herpes simples tipo 1.[002] The invention also comprises obtaining pharmaceutical compositions (liquid, solid or semi-solid), for topical and systemic use that contain the geraniine or extract (liquid or dry) of Spondias mombin L., standardized in geraniine and chlorogenic acid, as well as its uses for the treatment of herpes caused by the herpes simplex virus type 1.
ESTADO DA TÉCNICA [003] Os vírus, embora sejam os menores agentes patológicos existentes, são causadores de doenças infecciosas de alta incidência no mundo. Aproximadamente, três quartos das doenças infecciosas são causados por vírus. O herpes é uma inflamação da pele ou de uma membrana mucosa causada por um vírus, o HSV (herpes simplex virus), representante da família Herpesviridae, o qual se divide em dois grupos: tipo 1 (HSV-1) e tipo 2 (HSV-2). O herpes simples tem sido considerado como um dos mais comuns agentes de contaminação viral em humanos (GOPAL et al., J Virol Methods, v. 87, p. 71-80, 2000), sendo também a doença sexualmente transmissível de maior ocorrência (SAUERBREI & WUTZLER, Med Microbiol Immunol, v. 196, p. :89-94, 2007). As infecções agudas causadas pelo vírus da herpes simples tipo 1 ou 2 são caracterizadas pelo desenvolvimento de uma ou mais vesículas pequenas e cheias de líquido, superpostas em uma base eritematosa e inflamatória, as quais formam elevações na peleSTATE OF THE TECHNIQUE [003] Viruses, although they are the smallest pathological agents in existence, are the cause of infectious diseases of high incidence in the world. Approximately three-quarters of infectious diseases are caused by viruses. Herpes is an inflammation of the skin or mucous membrane caused by a virus, HSV (herpes simplex virus), representative of the Herpesviridae family, which is divided into two groups: type 1 (HSV-1) and type 2 (HSV -2). Herpes simplex has been considered as one of the most common agents of viral contamination in humans (GOPAL et al., J Virol Methods, v. 87, p. 71-80, 2000), and it is also the most common sexually transmitted disease ( SAUERBREI & WUTZLER, Med Microbiol Immunol, v. 196, p.: 89-94, 2007). Acute infections caused by the herpes simplex virus type 1 or 2 are characterized by the development of one or more small, fluid-filled vesicles, superimposed on an erythematous and inflammatory base, which form elevations in the skin
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2/15 ou qualquer outra membrana mucosa do corpo, como forma de manifestação primária ou reativação do vírus. Tais vesículas comumente se rompem e causam dor. Logo após a fase aguda ocorrem, alternadamente, períodos de latência e de reativação (GOPAL et al., J Virol Methods, v. 87, p. 71-80, 2000). A reativação do vírus permite a infecção de novos hospedeiros e o indivíduo infectado mantém-se com uma reserva de infecção para toda a vida (SCHUSTER & BUSS, Rev. CEFAC, v. 11, p 695-700, 2009).2/15 or any other mucous membrane in the body, as a form of primary manifestation or reactivation of the virus. Such vesicles commonly rupture and cause pain. Shortly after the acute phase, periods of latency and reactivation occur alternately (GOPAL et al., J Virol Methods, v. 87, p. 71-80, 2000). Reactivation of the virus allows infection of new hosts and the infected individual remains with an infection reserve for life (SCHUSTER & BUSS, Rev. CEFAC, v. 11, p 695-700, 2009).
[004] A maioria dos problemas causados pelo vírus HSV-1 é autolimitada em indivíduos imunocompetentes, com presença de feridas e vesículas na região orofacial (ALCHÉ et al., Phytotherapy Research, v. 16, p. 348 - 352, 2002), entretanto pode ser um grande problema em pacientes imunocomprometidos, incluindo recém-nascidos, pacientes HIV positivos ou que são submetidos a tratamento imunossupressor, transplantados e diabéticos descontrolados. Nestes indivíduos o vírus HSV-1 pode causar graves doenças sistêmicas e representar risco de vida, devido a debilidade do sistema imunológico (HARDEN et al., Antiviral Research, v. 83, p. 282-289, 2009; AKHTAR & SHUKLA, FEBS Journal, v. 276, p. 7228 -7236, 2009). Além disso, o vírus HSV-1 pode estar associado a doenças oculares, como a ceratite herpética estromal (HSK) que pode causar cegueira (BRANDÃO et al., Lett Appl Microbiol, v. 51, n. 4, p. 469-476, 2010).[004] Most of the problems caused by the HSV-1 virus are self-limited in immunocompetent individuals, with the presence of wounds and vesicles in the orofacial region (ALCHÉ et al., Phytotherapy Research, v. 16, p. 348 - 352, 2002), however, it can be a major problem in immunocompromised patients, including newborns, HIV positive patients or those undergoing immunosuppressive treatment, transplantation and uncontrolled diabetics. In these individuals, the HSV-1 virus can cause serious systemic diseases and be life-threatening, due to weak immune systems (HARDEN et al., Antiviral Research, v. 83, p. 282-289, 2009; AKHTAR & SHUKLA, FEBS Journal, v. 276, p. 7228 -7236, 2009). In addition, the HSV-1 virus can be associated with eye diseases, such as herpes stromal keratitis (HSK) that can cause blindness (BRANDÃO et al., Lett Appl Microbiol, v. 51, n. 4, p. 469-476 , 2010).
[005] O desenvolvimento de agentes terapêuticos anti-herpéticos tornou-se necessário devido à incidência crescente do vírus HSV-1 e ao aparecimento de cepas resistentes a drogas sintéticas, como o aciclovir, especialmente em pacientes imunocomprometidos (PIRET & BOIVIN, Antimicrob Agents Chemother, v. 55, p. 459-472, 2011). Atualmente no mercado existem algumas opções terapêuticas para o tratamento das infecções causadas pelo HSV-1, entre eles pode-se citar os antivirais aciclovir e seus análogos fanciclovir e valaciclovir, como terapia de escolha; docosanol e penciclovir, como drogas eficazes na terapia tópica; lisina, como alternativa na diminuição da duração da doença; e as vacinas (Lupidon H® para o HSV-1, Lupidon G® para o HSV2 e DISC - Desabled Infectides Singles Cycle). Porém, até o momento não existe cura para a doença, pois o tratamento adotado atualmente se restringe ao controle da doença e para prevenir recorrências (AZAMBUJA et al., Rev Fac Odontol, v. 45, p. 43-46, 2004).[005] The development of anti-herpetic therapeutic agents became necessary due to the increasing incidence of the HSV-1 virus and the appearance of strains resistant to synthetic drugs, such as acyclovir, especially in immunocompromised patients (PIRET & BOIVIN, Antimicrob Agents Chemother , v. 55, pp. 459-472, 2011). Currently, there are some therapeutic options on the market for the treatment of infections caused by HSV-1, among them the acyclovir antivirals and their analogs fanciclovir and valacyclovir, as the therapy of choice; docosanol and penciclovir, as effective drugs for topical therapy; lysine, as an alternative to decrease the duration of the disease; and vaccines (Lupidon H® for HSV-1, Lupidon G® for HSV2 and DISC - Desabled Infectides Singles Cycle). However, until now there is no cure for the disease, as the treatment currently adopted is restricted to controlling the disease and to prevent recurrences (AZAMBUJA et al., Rev Fac Odontol, v. 45, p. 43-46, 2004).
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3/15 [006] Os medicamentos existentes apenas ajudam a minimizar as crises instaladas, aliviar o desconforto e distanciar o aparecimento de novas manifestações, além disso, estão associados a um alto custo, moderada eficácia e ainda causam muitos efeitos colaterais aos pacientes. Diante do exposto, certamente é necessário investir no desenvolvimento de fármacos que apresentem vantagens terapêuticas em relação à farmacoterapia atual da herpes.3/15 [006] Existing medications only help to minimize installed crises, relieve discomfort and distance the appearance of new manifestations, in addition, they are associated with a high cost, moderate effectiveness and still cause many side effects to patients. Given the above, it is certainly necessary to invest in the development of drugs that have therapeutic advantages in relation to the current pharmacotherapy of herpes.
[007] Nesse contexto, os produtos naturais representam fonte de interesse para a pesquisa de novos fármacos antivirais e anti-inflamatórios. Inclusive algumas pesquisas têm demonstrado o potencial de alguns extratos e/ou moléculas de espécies vegetais (VANDEN BERGHE et al., Bulletin de l’Institut Pasteur, v. 84, p. 101-105, 1986; DE LOGU et al., Antiviral Research, v. 48, p. 177-185, 2000). Como é o caso do extrato da planta Uncaria tomentosa, que é o princípio ativo de um medicamento de uso tópico para o tratamento da herpes simples, o Imuno-Max®. No entanto, sabe-se que o tratamento tópico da herpes é frequentemente utilizado em indivíduos com recorrências menos frequentes e severas, e busca reduzir a dor, o desconforto e o impacto estético das lesões, com a redução do tempo de permanência da lesão e da dor. Além disso, o Imuno-Max® não apresenta resultados de eficácia na inibição da propagação viral.[007] In this context, natural products represent a source of interest for the research of new antiviral and anti-inflammatory drugs. Even some research has shown the potential of some extracts and / or molecules of plant species (VANDEN BERGHE et al., Bulletin de l'Institut Pasteur, v. 84, p. 101-105, 1986; DE LOGU et al., Antiviral Research, v. 48, pp. 177-185, 2000). As is the case with the extract of the plant Uncaria tomentosa, which is the active ingredient of a topical medication for the treatment of herpes simplex, the Immuno-Max®. However, it is known that the topical treatment of herpes is often used in individuals with less frequent and severe recurrences, and seeks to reduce the pain, discomfort and aesthetic impact of the lesions, with a reduction in the duration of the lesion and the ache. In addition, Imuno-Max® does not show results of effectiveness in inhibiting viral spread.
[008] A espécie Spondias mombin L., conhecida popularmente com cajazeira, é uma árvore nativa das terras baixas do México e das Américas Central e Sul (CROAT, Biotropica, v. 6, p. 135-137, 1974), comum no Oeste da Índia, nas florestas úmidas do Sul do México até o Peru estendendo-se até o Brasil (MORTON, Fruits of Warm Climates. Miami: FL., 1987, p. 245-248), é encontrada, no Brasil, isolada ou agrupada, notadamente em regiões da Amazônia e da Mata Atlântica e nas zonas mais úmidas dos Estados do Nordeste, principalmente na faixa litorânea e nas serras, e de forma espontânea e subespontânea, em matas, campos de pastagens, e pomares domésticos (SOUZA et al., Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 35, p. 215-220, 2000). No Ceará, ocorre com maior frequência nas zonas litorâneas próximas a Fortaleza e nas serras de Guaramiranga, Baturité, Meruoca e Ibiapaba (SACRAMENTO & SOUZA, Cajá (Spondias mombin L.). Jaboticabal: Funep, 2. 42 p., 2000).[008] The species Spondias mombin L., popularly known as cajazeira, is a tree native to the lowlands of Mexico and Central and South America (CROAT, Biotropica, v. 6, p. 135-137, 1974), common in the West India, in the humid forests of southern Mexico to Peru extending to Brazil (MORTON, Fruits of Warm Climates. Miami: FL., 1987, p. 245-248), is found in Brazil, isolated or grouped, notably in regions of the Amazon and the Atlantic Forest and in the wetter areas of the Northeastern States, mainly in the coastal strip and in the mountains, and spontaneously and sub-spontaneously, in forests, pasture fields, and domestic orchards (SOUZA et al ., Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 35, pp. 215-220, 2000). In Ceará, it occurs more frequently in coastal areas near Fortaleza and in the mountains of Guaramiranga, Baturité, Meruoca and Ibiapaba (SACRAMENTO & SOUZA, Cajá (Spondias mombin L.). Jaboticabal: Funep, 2. 42 p., 2000).
[009] Todas as partes de Spondias mombin L. têm sido utilizadas pela medicina tradicional. O decocto das frutas é bebido como um diurético e febrífugo. A goma é[009] All parts of Spondias mombin L. have been used by traditional medicine. The decoction of the fruit is drunk as a diuretic and febrifuge. The gum is
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4/15 utilizada como expectorante e vermífugo (RODRIGUES & HESSE, Journal of Basic Microbiology, v. 40, p. 261-267, 2000). O suco e o pó de suas folhas são usados sob a forma de cataplasmas como cicatrizante e anti-inflamatório tópico. O decocto do caule e das folhas é usado como emético, antidiarréico e no tratamento de disenteria, hemorróidas, gonorréia e leucorréia (AKUBUE et alJ. Ethnopharmacol., v. 8, p. 5363, 1983). O chá das flores e das folhas é indicado para aliviar estomatites, uretrite, cistite e inflamação da garganta (VILLEGAS et al., Journal of Ethnopharmacology, v. 55, p. 193-200, 1997).4/15 used as an expectorant and dewormer (RODRIGUES & HESSE, Journal of Basic Microbiology, v. 40, p. 261-267, 2000). The juice and powder from its leaves are used in the form of poultices as a healing and topical anti-inflammatory. The decoction of the stem and leaves is used as an emetic, antidiarrheal and in the treatment of dysentery, hemorrhoids, gonorrhea and leukorrhea (AKUBUE et alJ. Ethnopharmacol., V. 8, p. 5363, 1983). Flower and leaf tea is indicated to relieve stomatitis, urethritis, cystitis and throat inflammation (VILLEGAS et al., Journal of Ethnopharmacology, v. 55, p. 193-200, 1997).
[010] Flavonoides, alcaloides e taninos têm sido identificados em folhas de Spondias mombin L. com propriedades anti-herpes, antioxidante, antienvelhecimento, antiinflamatória e efeitos antimicrobianos em vários estudos com extratos da planta (NWAOGU et al, Afri J Biotech., v. 6, p. 890-893, 2007; CORTHOUT et al, Phytochemistry v. 31, p. 79, 1992; CORTHOUT et al., Planta Medica, v. 60, p. 460463, 1994; CABRAL, Caracterização dos marcadores químicos e avaliação de atividades biológicas do extrato de Spondias mombin. Dissertação, 2014).[010] Flavonoids, alkaloids and tannins have been identified in leaves of Spondias mombin L. with anti-herpes, antioxidant, anti-aging, anti-inflammatory and antimicrobial effects in several studies with plant extracts (NWAOGU et al, Afri J Biotech., V 6, p. 890-893, 2007; CORTHOUT et al, Phytochemistry v. 31, p. 79, 1992; CORTHOUT et al., Planta Medica, v. 60, p. 460463, 1994; CABRAL, Characterization of chemical markers and evaluation of biological activities of the extract of Spondias mombin (Dissertation, 2014).
[011] Corthout et al (1991) realizaram uma avaliação preliminar (sem descrição do modelo experimental) do efeito antiviral do extrato hidroetanólico (80 % em água) de Spondias mombin L (folhas ou cascas), que mostraram efeito sobre os vírus Coxsakii B2 e Herpes simplex 1 (HSV-1). Tratam-se de microorganismos responsáveis pelas crises de aftas dolorosas e pela herpes labial, e no estudo os autores atribuíram o efeito da planta à presença de quatro substâncias, sendo dois taninos (CORTHOUT et al., Phytochemistry, v. 30, p. 1190, 1991; FUKUCHI et al., Antiviral Research, v. 11, p. 285-297, 1989) e dois ésteres cafeoil (CORTHOUT et al., Phytochemistry v. 31, p. 79, 1992). Por outro lado, o éster butílico do ácido clorogênico (100 pg/mL) mostrou uma redução do título viral para HSV-1, enquanto a atividade antiviral do ácido 2-o-cafeoil(+)-allohidroxicítrico (100 pg/mL) deu-se para Coxacki B2 (CORTHOUT et al., Phytochemistry v. 31, p. 79, 1992).[011] Corthout et al (1991) carried out a preliminary assessment (without description of the experimental model) of the antiviral effect of the hydroethanolic extract (80% in water) of Spondias mombin L (leaves or peels), which showed an effect on Coxsakii B2 viruses and Herpes simplex 1 (HSV-1). These are microorganisms responsible for painful thrush and cold sores, and in the study the authors attributed the plant's effect to the presence of four substances, two of which are tannins (CORTHOUT et al., Phytochemistry, v. 30, p. 1190 , 1991; FUKUCHI et al., Antiviral Research, v. 11, p. 285-297, 1989) and two caffeyl esters (CORTHOUT et al., Phytochemistry v. 31, p. 79, 1992). On the other hand, the chlorogenic acid butyl ester (100 pg / mL) showed a reduction in the viral titer for HSV-1, while the antiviral activity of 2-o-caffeyl (+) - allohydroxycitric acid (100 pg / mL) gave to Coxacki B2 (CORTHOUT et al., Phytochemistry v. 31, p. 79, 1992).
[012] O tratamento de ratos Wistar albino ou camundongos Swiss albino com extratos (água, etanol ou metanol) das folhas de S. mombin (< 5g/Kg) por via oral não produziu efeitos tóxicos, enquanto a administração desses extratos (3,2 g/kg) por via[012] The treatment of albino Wistar rats or albino Swiss mice with extracts (water, ethanol or methanol) from the leaves of S. mombin (<5g / Kg) orally did not produce toxic effects, while the administration of these extracts (3, 2 g / kg) via
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5/15 intraperitoneal foi letal para as duas espécies. Nessa última condição, foi observada a seguinte ordem dos extratos quanto ao grau de toxicidade: extrato etanólico > metanólico > aquoso (AYOKA et al., Journal of Ethnopharmacology, v. 103, p. 166 175, 2006).5/15 intraperitoneal was lethal for both species. In the latter condition, the following order of extracts was observed as to the degree of toxicity: ethanolic> methanolic> aqueous extract (AYOKA et al., Journal of Ethnopharmacology, v. 103, p. 166 175, 2006).
[013] Sabe-se que a metodologia utilizada no processo de obtenção de extratos vegetais impacta diretamente na constituição química dos mesmos, que, por sua vez, pode influenciar nas propriedades biológicas destes. A presente invenção traz como novidade o desenvolvimento de um novo extrato hidroetanólico e seco (spray-dryer) de Spondias mombin L. padronizados e empregados na formulação inédita de medicamentos para uso sistêmico e local. Estes extratos de Spondias mombin L. padronizados quanto ao teor de dois fenóis bioativos (geraniina e ácido clorogênico) demonstraram resultados de eficácia antiinflamatória, e antiviral contra o vírus HSV-1, o que representa grande ineditismo, pois através do processo extrativo, a partir das folhas de Spondias mombin L., proposto na presente invenção, foi possível extrair os princípios ativos geraniina e ácido clorogênico que em concentrações adequadas, e associados aos demais componentes presentes nos extratos conferiram uma dupla, simultânea e inédita propriedade, como antiviral e antiinflamatório. Desta forma, as preparações farmacêuticas de uso sistêmico e tópico produzidas com o extrato seco ou extrato hidroalcoólico de Spondias mombin L. padronizados, são inéditas quanto ao processo de desenvolvimento e indicação do produto final, ou seja, anti-inflamatório e antiviral contra o vírus HSV-1. Além disso, estudos prévios realizados por nosso grupo de pesquisa demonstram que a geraniina possui atividades anti-inflamatória em neutrófilos humanos, bem como antiviral em vírus HSV-1.[013] It is known that the methodology used in the process of obtaining plant extracts directly impacts their chemical constitution, which, in turn, can influence their biological properties. The present invention brings as a novelty the development of a new hydroethanolic and dry extract (spray-dryer) from Spondias mombin L. standardized and used in the unprecedented formulation of medicines for systemic and local use. These extracts of Spondias mombin L. standardized in terms of the content of two bioactive phenols (geraniine and chlorogenic acid) demonstrated results of anti-inflammatory and antiviral efficacy against the HSV-1 virus, which represents great unprecedentedness, because through the extractive process, from from the leaves of Spondias mombin L., proposed in the present invention, it was possible to extract the active ingredients geraniine and chlorogenic acid which, in appropriate concentrations, and associated with the other components present in the extracts conferred a dual, simultaneous and unprecedented property, as antiviral and anti-inflammatory. In this way, the pharmaceutical preparations for systemic and topical use produced with the standardized dry extract or hydroalcoholic extract of Spondias mombin L. are unprecedented in terms of the development process and indication of the final product, that is, anti-inflammatory and antiviral against the virus. HSV-1. In addition, previous studies carried out by our research group demonstrate that geraniine has anti-inflammatory activities in human neutrophils, as well as antiviral activities in HSV-1 viruses.
[014] Foram encontrados alguns documentos de patente, os quais estão descritos abaixo, que relacionam o uso da espécie Spondias mombin L. ou geraniina:[014] Some patent documents were found, which are described below, which relate the use of the species Spondias mombin L. or geraniina:
[015] O documento PI9603851-9 A2 de 12 de setembro de 1996 e o documento PI1104660-0 de 30 de agosto de 2011 referem-se à preparação de um fitoterápico antivirótico utilizando folhas e ramos finos de Spondias mombin L. A presente invenção difere destas patentes devido ao fato da presente invenção envolver dentre outros aspectos um produto com características químicas diferenciadas e padronizadas considerando que todo o processo desde a secagem da droga vegetal até a produção dos extratos hidroalcoólico e seco de Spondias mombin L. e formulação do produto final[015] PI9603851-9 A2 of September 12, 1996 and PI1104660-0 of August 30, 2011 refer to the preparation of an antiviral herbal medicine using leaves and fine branches of Spondias mombin L. The present invention differs of these patents due to the fact that the present invention involves, among other aspects, a product with differentiated and standardized chemical characteristics considering that the whole process from the drying of the vegetable drug to the production of the hydroalcoholic and dry extracts of Spondias mombin L. and formulation of the final product
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6/15 serem controlados por métodos e parâmetros pré-estabelecidos, como secagem em estufa de ar circulante (60±5°C), que irá conferir menor perda de ativos durante a secagem; a granulometria do pó (0,30 a 0,70mm) da droga vegetal ser controlada, fato que irá garantir otimização do processo de extração, o tempo de maceração da droga também é otimizado no processo sendo de apenas 2 a 5 horas de maceração no líquido extrator. Desta forma, a presente invenção apresenta um processo inédito e otimizado de produção da droga vegetal, extratos hidroalcoólico e seco padronizados de Spondias mombin L. e formulações farmacêuticas. Adicionalmente, a presente invenção difere da patente supracitada, pelo fato dos extratos padronizados de Spondias mombin L. e de suas formulações, possuírem estudos que comprovam sua indicação não só como antiviral (vírus HSV-1), mas também é indicado para o tratamento de processos inflamatórios associados a esta patologia.6/15 be controlled by pre-established methods and parameters, such as drying in a circulating air oven (60 ± 5 ° C), which will confer less loss of assets during drying; the granulometry of the powder (0.30 to 0.70mm) of the vegetable drug is controlled, a fact that will guarantee optimization of the extraction process, the time of the drug's maceration is also optimized in the process, being only 2 to 5 hours of maceration in the extractor liquid. In this way, the present invention presents an unprecedented and optimized process for the production of the plant drug, standardized hydroalcoholic and dry extracts of Spondias mombin L. and pharmaceutical formulations. In addition, the present invention differs from the aforementioned patent in that the standardized extracts of Spondias mombin L. and their formulations have studies that prove their indication not only as an antiviral (HSV-1 virus), but also indicated for the treatment of inflammatory processes associated with this pathology.
[016] O documento PI9805479-1 A2 de 19 de novembro de 1998 e o documento PI0506647-6 A2 de 25 de novembro de 2005 referem-se à preparação de um gel fitoterápico a partir do extrato hidroalcoólico da espécie vegetal Spondias mombin L., utilizando-se como veículo e agente gelificante a quitosana, com propriedades antimicrobianas e antivirótica, notadamente contra o vírus do Herpes simplex tipo 1. A presente invenção difere desta devido os extratos utilizados nas composições farmacêuticas serem obtidos por tecnologias diferentes, padronizados em geraniina e ácido clorogênico, e indicados para o tratamento da herpes simples causada pelo vírus HSV-1 e de processos inflamatórios associados a esta patologia.[016] Document PI9805479-1 A2 of 19 November 1998 and document PI0506647-6 A2 of 25 November 2005 refer to the preparation of a herbal gel from the hydroalcoholic extract of the plant species Spondias mombin L., using chitosan as a vehicle and gelling agent, with antimicrobial and antiviral properties, notably against the Herpes simplex virus type 1. The present invention differs from this in that the extracts used in pharmaceutical compositions are obtained by different technologies, standardized in geraniine and acid chlorogenic, and indicated for the treatment of herpes simplex caused by the HSV-1 virus and inflammatory processes associated with this pathology.
[017] O documento PI0314104-7 A2 de 11 de setembro de 2003 refere-se à preparação de uma composição para tratamento da AIDS e condições associadas, enquanto o documento PI0404307-3 A2 de 19 de agosto de 2004 refere-se à preparação de um fitoterápico com atividade antiviral e bactericida. A presente invenção difere desta devido à secagem das folhas frescas de Spondias mombin L. na presente invenção ser realizada em estufa de renovação e circulação de ar com temperatura controlada de 60 ± 5 °C; a droga vegetal na presente invenção ser previamente seca e após, pulverizada em moinho de facas e ter granulometria classificada como pó moderadamente grosso; a droga vegetal na presente invenção ser submetida a extração por maceração dinâmica, em uma proporção de 1 a 5 g da droga vegetal para 10 a 50 mL do solvente em temperatura ambiente (25 a 30 ° C) e por apenas 2 a 5 h; os extratos obtidos na presente[017] Document PI0314104-7 A2 of 11 September 2003 refers to the preparation of a composition for the treatment of AIDS and associated conditions, while document PI0404307-3 A2 of 19 August 2004 refers to the preparation of a herbal medicine with antiviral and bactericidal activity. The present invention differs from this in that the drying of the fresh leaves of Spondias mombin L. in the present invention is carried out in a renovation and air circulation oven with a controlled temperature of 60 ± 5 ° C; the vegetable drug in the present invention is first dried and then sprayed on a knife mill and has a particle size classified as moderately coarse powder; the vegetable drug in the present invention is subjected to extraction by dynamic maceration, in a proportion of 1 to 5 g of the vegetable drug to 10 to 50 ml of the solvent at room temperature (25 to 30 ° C) and for only 2 to 5 h; the extracts obtained in this
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7/15 invenção serem padronizados em geraniina e ácido clorogênico e serem usados para o tratamento de infecções virais ocasionadas pelo vírus HSV-1 e como anti-inflamatório. Desta forma a presente invenção apresenta a obtenção inédita e otimizada de extratos hidroalcoólico e seco de Spondias mombin L. padronizados por cromatografia líquida de alta performance, em geraniina e ácido clorogênico, o que confere aos referidos extratos e as preparações obtidas a partir destes extratos ação anti-inflamatória e antiviral. Adicionalmente, reitero que a presente invenção difere da patente supracitada e das demais acima relacionadas, pelo fato dos extratos padronizados de Spondias mombin L. e de suas preparações, serem indicadas para o tratamento da herpes causada pelo vírus HSV-1 e de processos inflamatórios associados a esta patologia.7/15 invention be standardized on geraniine and chlorogenic acid and be used for the treatment of viral infections caused by the HSV-1 virus and as an anti-inflammatory. In this way the present invention presents the unprecedented and optimized obtaining of hydroalcoholic and dry extracts of Spondias mombin L. standardized by high performance liquid chromatography, in geraniine and chlorogenic acid, which gives said extracts and the preparations obtained from these extracts action anti-inflammatory and antiviral. In addition, I reiterate that the present invention differs from the aforementioned patent and from the others listed above, in that the standardized extracts of Spondias mombin L. and its preparations are indicated for the treatment of herpes caused by the HSV-1 virus and associated inflammatory processes to this pathology.
[018] O documento W02009018363 de 05 de fevereiro de 2009 refere-se a um método de inibição da COX 2 e NF-Kappa B e uso de um medicamento a partir de Spondias mombin L. formulado para tratamento da inflamação e Cancro, utilizando vários tipos de solventes nos processos extrativos. A presente invenção difere do documento citado em decorrência das composições farmacêuticas serem obtidas a partir de extratos de Spondias mombin L. distintos em relação aos documentos existentes. Além disso, na presente invenção os extratos são padronizados quanto ao teor de geraniina e ácido clorogênico, e empregados em formulações inéditas para uso sistêmico ou local indicadas como anti-inflamatória e antiviral contra o vírus HSV-1, o que caracteriza o ineditismo da presente invenção.[018] Document W02009018363 of February 5, 2009 refers to a method of inhibiting COX 2 and NF-Kappa B and using a drug from Spondias mombin L. formulated for the treatment of inflammation and cancer, using several types of solvents in extractive processes. The present invention differs from the document cited in that the pharmaceutical compositions are obtained from extracts of Spondias mombin L. different from the existing documents. In addition, in the present invention the extracts are standardized as to the content of geraniine and chlorogenic acid, and used in novel formulations for systemic or local use indicated as anti-inflammatory and antiviral against the HSV-1 virus, which characterizes the novelty of this invention.
[019] O documento AU2011219481 de 22 de setembro de 2011 refere-se ao uso de um medicamento a partir do extrato ou um éster de glicerol, alcaloide, saponina, uma gordura, um açúcar obtido do extrato de Spondias mombin L. para o uso do tratamento da AIDS. A presente invenção difere do documento citado em decorrência dos extratos hidroalcoólico e seco de Spondias mombin L. serem padronizados em ácido clorogênico e geraniina, e possuírem, tanto os extratos quanto as preparações de uso tópico e sistêmico obtidas a partir dos extratos seco e hidroalcoólico, atividade anti-inflamatória e antiviral e serem indicadas para o tratamento da herpes causada pelo vírus HSV-1 e de processos inflamatórios associados a esta patologia.[019] AU2011219481 of September 22, 2011 refers to the use of a medicine from the extract or an ester of glycerol, alkaloid, saponin, a fat, a sugar obtained from the extract of Spondias mombin L. for use AIDS treatment. The present invention differs from the document cited in that the hydroalcoholic and dry extracts of Spondias mombin L. are standardized in chlorogenic acid and geraniine, and have both extracts and preparations for topical and systemic use obtained from dry and hydroalcoholic extracts, anti-inflammatory and antiviral activity and are indicated for the treatment of herpes caused by the HSV-1 virus and inflammatory processes associated with this pathology.
[020] O documento BR 10 2013 023217 3 de 12 de agosto de 2013 refere-se à obtenção de extratos, frações e compostos isolados de raiz, tronco, partes aéreas, flores, frutos,[020] The document BR 10 2013 023217 3 of August 12, 2013 refers to obtaining extracts, fractions and isolated compounds from the root, trunk, aerial parts, flowers, fruits,
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8/15 sementes, suco e de composições farmacêuticas que contenham esses extratos, frações ou compostos isolados de Spondias mombin L., bem como suas utilizações para o tratamento de processos inflamatórios ocasionados por qualquer agente etiológico. A presente invenção difere desta tanto pela técnica de obtenção do extrato hidroalcoólico quanto pela obtenção do extrato seco; difere ainda pelo fato dos extratos de Spondias mombin L. objetos da presente invenção serem padronizados em geraniina e ácido clorogênico, o que confere aos extratos de Spondias mombin L. e as preparações de uso tópico e sistêmicas produzidas a partir dos extratos, ação anti-inflamatória e antiviral, e a utilização dos referidos extratos e composições farmacêuticas obtidas serem para o tratamento da herpes simples causada pelo vírus HSV-1 e de processos inflamatórios associados a esta patologia. Considerando todos os documentos de PI existentes, todos existentes empregam extratos de S. mombin L. distintos da presente invenção quanto a tecnologia empregada no desenvolvimento destes, a natureza dos marcadores selecionados e a indicação terapêutica.8/15 seeds, juice and pharmaceutical compositions containing these extracts, fractions or compounds isolated from Spondias mombin L., as well as their uses for the treatment of inflammatory processes caused by any etiological agent. The present invention differs from this both in the technique of obtaining the hydroalcoholic extract and in obtaining the dry extract; it also differs in that the extracts of Spondias mombin L. objects of the present invention are standardized in geraniine and chlorogenic acid, which gives the extracts of Spondias mombin L. and the topical and systemic preparations produced from the extracts, anti- inflammatory and antiviral, and the use of said extracts and pharmaceutical compositions obtained are for the treatment of herpes simplex caused by the HSV-1 virus and inflammatory processes associated with this pathology. Considering all existing IP documents, all existing ones use extracts of S. mombin L. distinct from the present invention in terms of the technology used in their development, the nature of the selected markers and the therapeutic indication.
[021] O documento CN 102727503 A de 17 de outubro de 2012 (China) refere-se à aplicação de geraniina de Geranium sibiricum Linne em preparações de medicamentos anti-herpes simplex tipos I e II. A presente invenção difere desta pela indicação, ou seja, por indicação da geraniina como anti-inflamatório e antiviral tópico e sistêmico.[021] CN 102727503 A of October 17, 2012 (China) refers to the application of Geranium sibiricum Linne geraniin in preparations of anti-herpes simplex medications types I and II. The present invention differs from this by indicating, that is, by indicating geraniine as a topical and systemic anti-inflammatory and antiviral.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [022] A presente invenção trata do emprego da geraniina e dos extratos hidroalcoólico e extrato seco de Spondias mombin L., padronizados em geraniina e ácido clorogênico, assim como de preparações farmacêuticas de uso sistêmico ou tópico que podem ser preparadas nas formas líquida, sólida ou semissólida, e que contém como princípio ativo a geraniina ou extrato (hidroalcoólico ou seco) de Spondias mombin L., sendo essas preparações indicadas como anti-inflamatórias e anti-herpes (HSV-1).DESCRIPTION OF THE INVENTION [022] The present invention deals with the use of geraniine and the hydroalcoholic and dry extract of Spondias mombin L., standardized in geraniine and chlorogenic acid, as well as pharmaceutical preparations for systemic or topical use that can be prepared in the forms liquid, solid or semi-solid, and containing as an active ingredient the geraniine or extract (hydroalcoholic or dry) of Spondias mombin L., these preparations being indicated as anti-inflammatory and anti-herpes (HSV-1).
[023] Portanto, a presente invenção relaciona a padronização da droga vegetal, do extrato hidroalcoólico e do extrato seco de Spondias mombin L., bem como o uso da geraniina e a incorporação dos referidos ativos (extratos ou geraniina), em preparações farmacêuticas em diferentes formas físicas (líquida, sólida ou semi-sólida), com a[023] Therefore, the present invention relates to the standardization of the plant drug, the hydroalcoholic extract and the dry extract of Spondias mombin L., as well as the use of geraniine and the incorporation of said assets (extracts or geraniine), in pharmaceutical preparations in different physical forms (liquid, solid or semi-solid), with the
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9/15 finalidade de tratamento da patologia herpes simples ocasionada pelo vírus HSV-1 que está associada a um processo inflamatório.9/15 purpose of treatment of herpes simplex pathology caused by the HSV-1 virus, which is associated with an inflammatory process.
[024] A novidade que traz esta invenção é o uso da geraniina, bem como a obtenção de extratos hidroalcoólico e seco padronizados (marcadores ativos: geraniina e ácido clorogênico) de Spondias mombin, como também formulações farmacêuticas para uso sistêmico e tópico que apresentem capacidade de agir simultaneamente como antiviral e anti-inflamatório nos processos inflamatórios desencadeados pelo vírus HSV-1.[024] The novelty that this invention brings is the use of geraniine, as well as obtaining standardized hydroalcoholic and dry extracts (active markers: geraniine and chlorogenic acid) from Spondias mombin, as well as pharmaceutical formulations for systemic and topical use that have capacity to act simultaneously as antiviral and anti-inflammatory in the inflammatory processes triggered by the HSV-1 virus.
[025] Com relação a forma de obtenção da droga vegetal, constituída pelas folhas da espécie Spondias mombin L., as etapas do processo compreendem:[025] Regarding how to obtain the vegetable drug, consisting of the leaves of the species Spondias mombin L., the steps of the process include:
a) Coletar as folhas de Spondias mombin L.;a) Collect the leaves of Spondias mombin L .;
b) Secar as folhas de Spondias mombin L. em estufa com circulação e renovação de ar com temperatura controlada de 60 ± 5 °C por 2 a 8 horas, preferencialmente 60 °C por 8 horas;b) Dry the leaves of Spondias mombin L. in an oven with circulation and air renewal with controlled temperature of 60 ± 5 ° C for 2 to 8 hours, preferably 60 ° C for 8 hours;
c) Triturar as folhas secas de Spondias mombin L. em moinho de facas;c) Grind the dried leaves of Spondias mombin L. in a knife mill;
d) Tamisar o pó obtido a partir das folhas secas de Spondias mombin L., e separar o pó classificado como moderadamente grosso para ser usado na preparação do extrato líquido de Spondias mombin L.d) Sieve the powder obtained from the dried leaves of Spondias mombin L., and separate the powder classified as moderately thick to be used in the preparation of the liquid extract of Spondias mombin L.
[026] Com relação a forma de preparação do extrato hidroalcoólico padronizado em geraniina e ácido clorogênico, a partir do pó das folhas de Spondias mombin L., as etapas do processo compreendem:[026] Regarding the preparation of the hydroalcoholic extract standardized in geraniine and chlorogenic acid, from the powder of the leaves of Spondias mombin L., the steps of the process include:
a) Extrair o pó das folhas de Spondias mombin L. em uma proporção de 100 a 500 gramas da droga vegetal para 1 a 5 litros do solvente que consiste em uma solução hidroalcoólica contendo de 50 a 80% de etanol, mais especificamente utilizando 300 gramas da droga vegetal para 1 litro de solução hidroalcoólica a 80%.a) Extract the powder from the leaves of Spondias mombin L. in a proportion of 100 to 500 grams of the vegetable drug to 1 to 5 liters of the solvent consisting of a hydroalcoholic solution containing 50 to 80% ethanol, more specifically using 300 grams of the vegetable drug to 1 liter of 80% hydroalcoholic solution.
b) Manter a mistura em maceração em temperatura ambiente de 25 a 30 ° C, por 2 a 5 horas, mais especificamente utilizando a temperatura de 27 ° C por 5 horas;b) Maintain the mixture in maceration at room temperature of 25 to 30 ° C, for 2 to 5 hours, more specifically using the temperature of 27 ° C for 5 hours;
c) Filtrar o extrato obtido.c) Filter the obtained extract.
d) Realizar os ensaios de doseamento de ácido clorogênico e geraniina no extrato obtido utilizando o equipamento cromatógrafo líquido de alta performance com detector de arranjo de diiodo.d) Carry out the assays for the determination of chlorogenic acid and geraniine in the extract obtained using the high performance liquid chromatograph equipment with diode diode detector.
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e) De acordo com o resultado do doseamento, concentrar o extrato hidroalcoólico em equipamento denominado rotaevaporador, de modo a obter um extrato com alto teor de geraniina e ácido clorogênico, mais especificamente um teor de geraniina de no mínimo 7 miligramas por mililitro de extrato e um teor de ácido clorogênico de no mínimo 1,5 miligramas por mililitro de extrato de Spondias mombin L.e) According to the dosing result, concentrate the hydroalcoholic extract in equipment called a rotary evaporator, in order to obtain an extract with a high content of geranine and chlorogenic acid, more specifically a geranine content of at least 7 milligrams per milliliter of extract and a chlorogenic acid content of at least 1.5 milligrams per milliliter of Spondias mombin L. extract
[027] Com relação a forma de obtenção do extrato seco de Spondias mombin L. padronizado em geraniina e ácido clorogênico, as etapas do processo compreendem:[027] Regarding how to obtain the dry extract of Spondias mombin L. standardized in geraniine and chlorogenic acid, the steps of the process include:
a) A partir do extrato hidroalcoólico padronizado em geraniina e ácido clorogênico, adicionar adjuvantes que podem ser a sílica coloidal, goma xantana, celulose microcristalina, amido, dextrana, lactose, em concentrações que podem variar de 10 a 50% de adjuvante ou mistura de adjuvantes em relação ao extrato hidroalcoólico de Spondias mombin L. Mais especificamente pode ser adicionado 200 gramas de sílica coloidal e 200 gramas de celulose microcristalina em 1 litro de extrato hidroalcoólico de Spondias mombin L. padronizado em geraniina e ácido clorogênico.a) From the hydroalcoholic extract standardized in geraniine and chlorogenic acid, add adjuvants that can be colloidal silica, xanthan gum, microcrystalline cellulose, starch, dextran, lactose, in concentrations that can vary from 10 to 50% of adjuvant or mixture of adjuvants in relation to the hydroalcoholic extract of Spondias mombin L. More specifically, 200 grams of colloidal silica and 200 grams of microcrystalline cellulose can be added in 1 liter of hydroalcoholic extract of Spondias mombin L. standardized in geraniine and chlorogenic acid.
b) A mistura do extrato hidroalcoólico e dos adjuvantes é submetida à secagem em equipamento spray dryer com um fluxo de 1 a 10 mililitros por minuto, mais especificamente 3 mililitros por minuto, e a temperatura de 50 a 100 graus célsius, mais especificamente a temperatura de 70°C.b) The mixture of hydroalcoholic extract and adjuvants is subjected to drying in spray dryer equipment with a flow of 1 to 10 milliliters per minute, more specifically 3 milliliters per minute, and at a temperature of 50 to 100 degrees Celsius, more specifically the temperature 70 ° C.
c) Realizar os ensaios de doseamento de ácido clorogenico e geraniina no extrato seco obtido utilizando o equipamento cromatógrafo líquido de alta performance com detector de arranjo de diiodo.c) Carry out the assays for the determination of chlorogenic acid and geranine in the dry extract obtained using the high performance liquid chromatograph equipment with diode diode detector.
d) De acordo com o resultado do doseamento, concentrar o extrato hidroalcoólico que é o ponto de partida para o extrato seco, em equipamento denominado rotaevaporador, e novamente submeter o extrato hidroalcoólico concentrado a secagem em spray dryer, de modo a obter um extrato seco com alto teor de geraniina e ácido clorogênico, mais especificamente um teor de geraniina de no mínimo 7 miligramas por mililitro de extrato e um teor de ácido clorogênico de no mínimo 1,5 miligramas por mililitro de extrato seco de Spondias mombin L.d) According to the dosing result, concentrate the hydroalcoholic extract which is the starting point for the dry extract, in equipment called a rotary evaporator, and again subject the concentrated hydroalcoholic extract to spray drying, in order to obtain a dry extract. with high content of geraniine and chlorogenic acid, more specifically a geraniine content of at least 7 milligrams per milliliter of extract and a chlorogenic acid content of at least 1.5 milligrams per milliliter of dry extract of Spondias mombin L.
[028] Com relação a geraniina, esta será adquirida comercialmente com grau de pureza acima de 98%.[028] Regarding geraniine, it will be acquired commercially with a purity level above 98%.
Petição 870190009981, de 30/01/2019, pág. 11/16Petition 870190009981, of 01/30/2019, p. 11/16
11/15 [029] Com relação à atividade anti-inflamatória da geraniina e dos extratos de Spondias mombin L., estudos foram realizados utilizando a seguinte metodologia:11/15 [029] Regarding the anti-inflammatory activity of geraniine and Spondias mombin L. extracts, studies were carried out using the following methodology:
a) A geraniina, extratos e formulações foram testados nas concentrações de 1 a 200 microgramas por mililitro;a) Geraniine, extracts and formulations were tested at concentrations from 1 to 200 micrograms per milliliter;
b) Polimorfonucleares, predominantemente neutrófilos (80-90 %), foram isolados do sangue humano, o plasma desprezado e o soro lavado diversas vezes com solução salina, utilizando solução de gelatina 2,5 % (p/v) para formar um gradiente de separação dos componentes sanguíneos;b) Polymorphonuclear cells, predominantly neutrophils (80-90%), were isolated from human blood, the plasma was discarded and the serum was washed several times with saline solution, using a 2.5% (w / v) gelatin solution to form a gradient of separation of blood components;
c) A suspensão de neutrófilos foi incubada com geraniina, extratos ou formulações, e em seguida, foi adicionado Forbol-12-miristato-13-acetato - PMA (induzir a desgranulação celular);c) The neutrophil suspension was incubated with geraniine, extracts or formulations, and then Forbol-12-myristate-13-acetate - PMA was added (to induce cell degranulation);
d) A avaliação da atividade anti-inflamatória foi realizada através do percentual de inibição da liberação de mieloperoxidase por neutrófilo previamente ativados por PMA. O resultado foi comparado a um fármaco de referência - indometacina (36 microgramas por mililitro).d) The evaluation of anti-inflammatory activity was performed through the percentage of inhibition of myeloperoxidase release by neutrophils previously activated by PMA. The result was compared to a reference drug - indomethacin (36 micrograms per milliliter).
[030] Com relação à atividade anti-herpes da geraniina e dos extratos de Spondias mombin L., os estudos foram realizados utilizando a seguinte metodologia:[030] Regarding the anti-herpes activity of geraniine and Spondias mombin L. extracts, studies were performed using the following methodology:
a) Os extratos foram avaliados nas concentrações entre 1 a 2000 microgramas por mililitro, enquanto que a geraniina foi avaliada nas concentrações ente 25 e 0,09 microgramas por mililitro;a) The extracts were evaluated at concentrations between 1 to 2000 micrograms per milliliter, while geraniine was evaluated at concentrations between 25 and 0.09 micrograms per milliliter;
b) Diluições de vírus foram incubadas a 37 °C durante 1 h com concentrações variadas dos extratos e geraniina;b) Dilutions of viruses were incubated at 37 ° C for 1 h with varying concentrations of extracts and geraniine;
c) As drogas testes foram então incubadas com células VERO (células de rim de macaco verde africano);c) The test drugs were then incubated with VERO cells (African green monkey kidney cells);
d) Em seguida foram incubadas em gel de agarose sendo realizada a contagem das unidades formadoras de placas;d) Then they were incubated on an agarose gel and the plaque forming units were counted;
e) A avaliação da atividade anti-herpes foi realizada através de cálculo da inibição viral, comparando-se células tratadas e células não tratadas. A CI50 foi determinada como a concentração da substância capaz de reduzir o número de UFP em 50%, por regressão linear.e) The evaluation of anti-herpes activity was performed by calculating viral inhibition, comparing treated cells and untreated cells. IC50 was determined as the concentration of the substance capable of reducing the number of UFP by 50%, by linear regression.
Petição 870190009981, de 30/01/2019, pág. 12/16Petition 870190009981, of 01/30/2019, p. 12/16
12/15 [031] As figuras 1 e 2 apresentam, respectivamente, a atividade anti-inflamatória da geraniina e do extrato hidroalcoólico de Spondias mombin L. padronizado em geraniina e ácido clorogênico em modelo de desgranulação de neutrófilos humano mensurada pela liberação da mieloperoxidase no meio. Neste método utilizou-se uma substância que induz a liberação da mieloperoxidade, o Forbol-12-miristato-13-acetato, uma droga padrão anti-inflamatória, a Indometacina, que causa a inibição da liberação de mieloperoxidade, e grupos testes que foram as diversas concentrações de geraniina e dos extratos (hidroalcoólico ou seco) de Spondias mombin L. padronizados em geraniina e ácido clorogênico por cromatografia líquida de alta eficiência. Na figura 1 estão representadas as quatros concentrações da geraniina. A primeira coluna da esquerda para direita representa a concentração de 1 micrograma por mililitro, na segunda coluna 10 microgramas por mililitro, na terceira coluna 25 microgramas por mililitro, na quarta coluna 50 microgramas por mililitro, na quinta coluna 100 microgramas por mililitro e na sexta coluna, o padrão de indometacina (36 microgramas por mililitro). É possível observar que o tratamento das células com a geraniina promoveu um efeito dual, estimulando a liberação de MPO induzida por PMA, ou seja, apresentando atividade pró-inflamatória nas menores concentrações (1 - 25 pg/mL) e inibindo a liberação de MPO induzida por PMA, ou seja, apresentando atividade antiinflamatória nas maiores concentrações (50 e 100 pg/mL). Na maior concentração, 100 microgramas por mililitro, a GR induziu um efeito anti-inflamatório comparável ao padrão anti-inflamatório, indometacina. Na figura 2 estão representadas as quatro concentrações do extrato hidroalcoólico de Spondias mombin L. A primeira coluna da esquerda para direita representa a concentração de 1 micrograma por mililitro, na segunda coluna 10 microgramas por mililitro, na terceira coluna 50 microgramas por mililitro, na quarta coluna 100 microgramas por mililitro, e na quinta coluna o padrão de indometacina (36 microgramas por mililitro). É possível observar que a adição do extrato hidroalcoólico padronizado de Spondias mombin L. inibiu parcialmente a liberação de MPO induzida por PMA, ou seja, apresentou atividade anti-inflamatória, sendo observado melhor efeito na menor concentração do extrato, ou seja na concentração de 1 micrograma por mililitro.12/15 [031] Figures 1 and 2 show, respectively, the anti-inflammatory activity of geraniine and hydroalcoholic extract of Spondias mombin L. standardized in geraniine and chlorogenic acid in a model of human neutrophil degranulation measured by the release of myeloperoxidase in middle. In this method, a substance that induces the release of myeloperoxity, Forbol-12-myristate-13-acetate, a standard anti-inflammatory drug, Indomethacin, which causes the inhibition of myeloperoxide release, and test groups that were various concentrations of geraniine and extracts (hydroalcoholic or dry) of Spondias mombin L. standardized in geraniine and chlorogenic acid by high performance liquid chromatography. Figure 1 shows the four concentrations of geraniine. The first column from left to right represents the concentration of 1 microgram per milliliter, in the second column 10 micrograms per milliliter, in the third column 25 micrograms per milliliter, in the fourth column 50 micrograms per milliliter, in the fifth column 100 micrograms per milliliter and in the sixth column, the indomethacin standard (36 micrograms per milliliter). It is possible to observe that the treatment of cells with geraniine promoted a dual effect, stimulating the release of MPO induced by PMA, that is, presenting pro-inflammatory activity in the lowest concentrations (1 - 25 pg / mL) and inhibiting the release of MPO induced by PMA, that is, presenting anti-inflammatory activity in the highest concentrations (50 and 100 pg / mL). At the highest concentration, 100 micrograms per milliliter, GR induced an anti-inflammatory effect comparable to the anti-inflammatory pattern, indomethacin. Figure 2 shows the four concentrations of the hydroalcoholic extract of Spondias mombin L. The first column from left to right represents the concentration of 1 microgram per milliliter, in the second column 10 micrograms per milliliter, in the third column 50 micrograms per milliliter, in the fourth column 100 micrograms per milliliter, and in the fifth column the indomethacin standard (36 micrograms per milliliter). It is possible to observe that the addition of the standardized hydroalcoholic extract of Spondias mombin L. partially inhibited the PMA release induced by PMA, that is, it showed anti-inflammatory activity, with a better effect being observed in the lower concentration of the extract, that is, in the concentration of 1 microgram per milliliter.
[032] Outro estudo realizado foi a investigação da eficiência do extrato hidroalcoólico de Spondias mombin L. e da geraniina na inativação do vírus HSV-1 em células VERO. Para tanto realizou-se um ensaio de citotoxicidade, através do método denominado[032] Another study was the investigation of the efficiency of the hydroalcoholic extract of Spondias mombin L. and of geraniine in the inactivation of the HSV-1 virus in VERO cells. To this end, a cytotoxicity test was performed, using the method called
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MTT. Foi também realizado ensaio da atividade anti-herpes com diferentes concentrações da geraniina e dos extratos hidroalcoólicos de Spondias mombin L. Para o extrato, através do teste de citotoxicidade, foi possível encontrar a concentração citotóxica que matou 50 % das células VERO (CC50 = 95 pg/mL) e através do ensaio anti-herpes foi possível encontrar a concentração que inativou 50 % dos vírus (CI50 = 4,56 pg/mL). Além disso, foi possível observar a ação do extrato hidroalcoólico de Spondias mombin L. padronizado em geraniina e ácido clorogênico contra o vírus HSV1, através da análise da morfologia das células VERO. A figura 3 representa as células VERO incubadas sem a presença de vírus e sem a presença de extratos (Controle de células). A figura 4 representa as células VERO incubadas com a presença do vírus HSV-1, e sem a presença de extratos (Controle de vírus). A figura 5 representa as células VERO incubadas com o extrato de Spondias mombin L. padronizado em geraniina e ácido clorogênico na concentração de 62,5 microgramas por mililitro. Como podem ser observadas nas fotomicrofotografias das células representada nas figuras 3, 4 e 5, a morfologia das células que foram testadas com o extrato de Spondias mombin L. (figura 5) se assemelha com o controle de células sem a presença do vírus (figura 3). Isto significa que o extrato de Spondias mombin L. padronizado em geraniina e ácido clorogênico, na concentração de 62,5 microgramas por mililitro, foi capaz de inativar o vírus HSV-1 no ensaio proposto.MTT. An assay of anti-herpes activity was also carried out with different concentrations of geraniin and hydroalcoholic extracts of Spondias mombin L. For the extract, through the cytotoxicity test, it was possible to find the cytotoxic concentration that killed 50% of VERO cells (CC50 = 95 pg / mL) and through the anti-herpes assay it was possible to find the concentration that inactivated 50% of the viruses (IC50 = 4.56 pg / mL). In addition, it was possible to observe the action of the hydroalcoholic extract of Spondias mombin L. standardized in geraniine and chlorogenic acid against the HSV1 virus, through the analysis of VERO cells morphology. Figure 3 represents VERO cells incubated without the presence of viruses and without the presence of extracts (Cell control). Figure 4 represents VERO cells incubated with the presence of the HSV-1 virus, and without the presence of extracts (Virus control). Figure 5 represents VERO cells incubated with the extract of Spondias mombin L. standardized in geraniine and chlorogenic acid at a concentration of 62.5 micrograms per milliliter. As can be seen in the photomicrographs of the cells represented in figures 3, 4 and 5, the morphology of the cells that were tested with the extract of Spondias mombin L. (figure 5) is similar to the control of cells without the presence of the virus (figure 3). This means that the Spondias mombin L. extract standardized in geraniine and chlorogenic acid, at a concentration of 62.5 micrograms per milliliter, was able to inactivate the HSV-1 virus in the proposed assay.
[033] Já para a geraniina, foi possível encontrar a concentração citotóxica que matou 50 % das células VERO (CC50 = 1680 pg/mL) e através do ensaio anti-herpes foi possível encontrar a concentração que inativou 50 % dos vírus (CI50 =11 pg/mL). A garantia da terapia antiviral está no índice de Seletividade (IS), que consiste na razão entre a Concentração Citotóxica para 50% (CC50) das células e a Concentração Inibitória para 50% (CI50) dos vírus, mostrando, dessa forma, o quão distante estas concentrações estão. O fármaco ideal é aquele que apresenta IS entre 100 e 1000. A geraniina apresentou um IS de 152,72, mostrando-se um fármaco indicado para o tratamento da herpes simplex causada pelo vírus HSV-1.[033] For geraniine, it was possible to find the cytotoxic concentration that killed 50% of VERO cells (CC50 = 1680 pg / mL) and through the anti-herpes assay it was possible to find the concentration that inactivated 50% of the viruses (CI50 = 11 pg / ml). The guarantee of antiviral therapy is in the Selectivity Index (IS), which consists of the ratio between the Cytotoxic Concentration for 50% (CC50) of the cells and the Inhibitory Concentration for 50% (IC50) of the viruses, thus showing how far these concentrations are. The ideal drug is one with an IS between 100 and 1000. Geraniine showed an IS of 152.72, showing a drug indicated for the treatment of herpes simplex caused by the HSV-1 virus.
[034] Abaixo relacionadas as formulações:[034] The formulations are listed below:
Exemplos de preparações de uso tópico e oral contendo extrato hidroalcoólico de Spondias mombin L. padronizado em geraniina e ácido clorogênico:Examples of topical and oral preparations containing hydroalcoholic extract of Spondias mombin L. standardized in geraniine and chlorogenic acid:
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Exemplo 1: Gel de uso tópico para o tratamento de herpes tipo 1.Example 1: Topical gel for the treatment of type 1 herpes.
Polímero carboxivinílico..........................................0,5 gramasCarboxyvinyl polymer .......................................... 0.5 grams
Glicerina.................................................................5,0 gramasGlycerin................................................. ................ 5.0 grams
Phenoxietanol e parabenos.......................................0,5 gramasPhenoxyethanol and parabens ....................................... 0.5 grams
Agua purificada.......................................................95 gramasPurified water................................................ ....... 95 grams
Aminometilpropanol..............................................0,25 gramasAminomethylpropanol .............................................. 0.25 grams
Extrato hidroalcoólico de Spondias mombin L..............5 gramasHydroalcoholic extract of Spondias mombin L .............. 5 grams
Modo de preparo: misturar os componentes polímero carboxivinílico, glicerina, phenoxietanol e parabenos e, água destilada, a frio. Após dispersão dos componentes adicionar o amimonetilpropanol e misturar até obter um gel homogêneo. Por fim adicionar o extrato de hidroalcoólico Spondias mombin L., e misturar até completa homogeneidade da preparação. Envasar em recipiente hermético e protegido da luz.Preparation: mix the components carboxyvinyl polymer, glycerin, phenoxyethanol and parabens, and cold distilled water. After dispersing the components, add ammonethylpropanol and mix until a homogeneous gel is obtained. Finally add the Spondias mombin L. hydroalcoholic extract, and mix until complete homogeneity of the preparation. Fill in an airtight container protected from light.
Exemplo 2: Elixir de uso oral para o tratamento de herpes tipo 1.Example 2: Elixir for oral use for the treatment of herpes type 1.
Carmelose...........................................................2 gramasCarmelose ................................................. .......... 2 grams
Metilparabeno....................................................0,12 gramasMethylparaben ................................................. ... 0.12 grams
Sacarina sódica..................................................0,1 gramasSodium saccharin ................................................ ..0.1 grams
Ciclamato de sódio............................................0,05 gramasSodium cyclamate ............................................ 0.05 grams
Água purificada................................................85,0 gramasPurified water................................................ 85.0 grams
Extrato hidroalcoólico de Spondias mombin L.... 15,0 gramasHydroalcoholic extract of Spondias mombin L .... 15.0 grams
Modo de preparo: Adicionar, aos poucos a carmelose em parte da água e homogeneizar até dissolução, aquecer parte da água e dissolver o metilparabeno, adicionar a mistura sacarina e ciclamato e homogeneizar. Completar o volume com o restante de água e adicionar o extrato hidroalcoólico de Spondias mombin L. Homogeneizar e envasar em frasco hermético protegido da luz.Preparation: Gradually add carmelose in part of the water and mix until dissolved, heat part of the water and dissolve the methyl paraben, add the saccharin and cyclamate mixture and mix. Make up the volume with the rest of the water and add the hydroalcoholic extract of Spondias mombin L. Homogenize and fill in an airtight container protected from light.
Exemplos de preparações de uso tópico e oral contendo geraniina:Examples of topical and oral preparations containing geraniine:
Exemplo 3: Gel de uso tópico com geraniina para o tratamento de herpes tipo 1.Example 3: Topical gel with geraniine for the treatment of herpes type 1.
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Polímero carboxivinílico..........................................0,5 gramasCarboxyvinyl polymer .......................................... 0.5 grams
Glicerina.................................................................5,0 gramasGlycerin................................................. ................ 5.0 grams
Phenoxietanol e parabenos.......................................0,5 gramasPhenoxyethanol and parabens ....................................... 0.5 grams
Agua purificada.......................................................92 gramasPurified water................................................ ....... 92 grams
Aminometilpropanol..............................................0,25 gramasAminomethylpropanol .............................................. 0.25 grams
Solução de etanol a 50%.........................................3,0 mililitros50% ethanol solution ......................................... 3.0 milliliters
Geraniina..................................................................10 miligramasGeraniina ................................................. ................. 10 milligrams
Modo de preparo: misturar os componentes polímero carboxivinílico, glicerina, phenoxietanol e parabenos e, água destilada, a frio. Após dispersão dos componentes adicionar o amimonetilpropanol e misturar até obter um gel homogêneo. Por fim adicionar a geraniina pré-solubilizada em solução de etanol, e misturar até completa homogeneidade da preparação. Envasar em recipiente hermético e protegido da luz.Preparation: mix the components carboxyvinyl polymer, glycerin, phenoxyethanol and parabens, and cold distilled water. After dispersing the components, add ammonethylpropanol and mix until a homogeneous gel is obtained. Finally add the pre-solubilized geraniine in an ethanol solution, and mix until complete homogeneity of the preparation. Fill in an airtight container protected from light.
Exemplo 4: Elixir de uso oral contendo geraniina para o tratamento de herpes tipo 1.Example 4: Elixir for oral use containing geraniine for the treatment of herpes type 1.
Carmelose...........................................................2 gramasCarmelose ................................................. .......... 2 grams
Metilparabeno....................................................0,12 gramasMethylparaben ................................................. ... 0.12 grams
Sacarina sódica..................................................0,1 gramasSodium saccharin ................................................ ..0.1 grams
Ciclamato de sódio............................................0,05 gramasSodium cyclamate ............................................ 0.05 grams
Água purificada................................................82,0 gramasPurified water................................................ 82.0 grams
Solução de etanol a 50%.........................................3,0 mililitros50% ethanol solution ......................................... 3.0 milliliters
Geraniina..................................................................10 miligramasGeraniina ................................................. ................. 10 milligrams
Modo de preparo: Adicionar, aos poucos a carmelose em parte da água e homogeneizar até dissolução, aquecer parte da água e dissolver o metilparabeno, adicionar a mistura sacarina e ciclamato e homogeneizar. Completar o volume com o restante de água e adicionar a geraniina previamente solubilizada em solução de etanol. Homogeneizar e envasar em frasco hermético protegido da luz.Preparation: Gradually add carmelose in part of the water and mix until dissolved, heat part of the water and dissolve the methyl paraben, add the saccharin and cyclamate mixture and mix. Make up the volume with the rest of the water and add the geranine previously solubilized in an ethanol solution. Homogenize and fill in an airtight container protected from light.
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|---|---|---|---|---|
| CN111084780A (en) * | 2020-01-09 | 2020-05-01 | 昆明医科大学 | Application of geraniin in preparing medicine for treating osteoporosis and fracture |
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- 2018-02-21 BR BR102018003389A patent/BR102018003389A2/en not_active Application Discontinuation
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