BR102019016046A2

BR102019016046A2 - TOPICAL FORMULATION CONTAINING MANGIFERIN WITH ACTIVITY AGAINST HERPES SIMPLEX VIRUS TYPE 1, SENSITIVE AND ACICLOVIR-RESISTANT STRUCTURES AND THEIR PRODUCTION PROCESS

Info

Publication number: BR102019016046A2
Application number: BR102019016046-2A
Authority: BR
Inventors: Daniele Zendrini Rechenchoski; Karoline Fontana Agostinho; Ligia Carla Faccin Galhardi; Audrey Alesandra Stinghen Garcia Lonni; João Vinicius Honório Da Silva; Fábio Goulart De Andrade; Arcelina Pacheco Cunha; Nágila Maria Pontes Silva Ricardo; Carlos Mitihiko Nozawa; Rosa Elias Carvalho Linhares
Original assignee: Universidade Estadual De Londrina; Universidade Federal Do Ceara
Priority date: 2019-08-02
Filing date: 2019-08-02
Publication date: 2021-02-02

Abstract

formulação tópica contendo mangiferina com atividade contra o vírus herpes simplex tipo 1, cepas sensível e resistente ao aciclovir e seu processo de produção a presente invenção refere-se a uma formulação de um antiviral tópico para o auxílio no controle de infecções pelo vírus herpes simplex tipo 1 (hsv-1), cepas sensível e resistente ao aciclovir. a formulação contém mangiferina, xantona glicosilada, que possui como fonte primária a mangueira (mangifera indica). trata-se de uma formulação semissólida tópica que deverá ser aplicada cinco vezes por dia durante dez dias e utilizada por pacientes que necessitam de uma melhora dos sintomas da infecção pelo hsv-1 . a formulação contendo mangiferina apresentou maior ação contra a cepa resistente do hsv-1 ao aciclovir, sendo de grande interesse médico e farmacêutico. finalmente, a invenção é importante para o controle de infecção por hsv-1 , inclusive nos casos em que a cepa do vírus é resistente a outros medicamentos disponíveis no mercado. portanto, pode interessar, preferencialmente, às indústrias farmacêuticas, visando a uma melhoria da área da saúde humana.topical formulation containing mangiferin with activity against the herpes simplex virus type 1, sensitive and resistant strains to acyclovir and its production process the present invention relates to a formulation of a topical antiviral to aid in the control of infections by the herpes simplex virus type 1 (hsv-1), strains sensitive and resistant to acyclovir. the formulation contains mangiferin, glycosylated xanthone, whose primary source is mango (mangifera indica). it is a semi-solid topical formulation that should be applied five times a day for ten days and used by patients who need an improvement in the symptoms of hsv-1 infection. the formulation containing mangiferin showed greater action against the resistant strain of hsv-1 to acyclovir, being of great medical and pharmaceutical interest. finally, the invention is important for the control of hsv-1 infection, even in cases where the virus strain is resistant to other drugs available on the market. therefore, it may interest, preferably, the pharmaceutical industries, aiming at an improvement in the area of human health.

Description

TOPICAL FORMULATION CONTAINING MANGIFERIN WITH ACTIVITY AGAINST HERPES SIMPLEX VIRUS TYPE 1, SENSITIVE AND ACICLOVIR-RESISTANT STRUCTURES AND THEIR PRODUCTION PROCESS

Field of the Invention

[001] A presente invenção refere-se a uma formulação de um antiviral tópico para o auxílio no controle de infecções pelo vírus herpes simplex tipo 1 (HSV1), cepas sensível e resistente ao aciclovir. A formulação contém mangiferina, xantona glicosilada, que possui como fonte primária a mangueira (Mangifera indica). Trata-se de uma formulação semissólida tópica que deverá ser aplicada cinco vezes por dia durante dez dias e utilizada por pacientes que necessitam de uma melhora dos sintomas da infecção pelo HSV-1. A formulação contendo mangiferina apresentou maior ação contra a cepa resistente do HSV-1 ao aciclovir, sendo de grande interesse médico e farmacêutico. Finalmente, a invenção é importante para o controle de infecção por HSV-1, inclusive nos casos em que a cepa do vírus é resistente a outros medicamentos disponíveis no mercado. Portanto, pode interessar, preferencialmente, às indústrias farmacêuticas, visando a uma melhoria da área da saúde humana.[001] The present invention relates to a formulation of a topical antiviral to aid in the control of infections by the herpes simplex virus type 1 (HSV1), sensitive and resistant strains to acyclovir. The formulation contains mangiferin, glycosylated xanthone, whose primary source is mango (Mangifera indica). It is a semi-solid topical formulation that should be applied five times a day for ten days and used by patients who need an improvement in the symptoms of HSV-1 infection. The formulation containing mangiferin showed greater action against the resistant strain of HSV-1 to acyclovir, being of great medical and pharmaceutical interest. Finally, the invention is important for the control of HSV-1 infection, even in cases where the virus strain is resistant to other drugs available on the market. Therefore, it may interest, preferably, the pharmaceutical industries, aiming at an improvement in the area of human health.

Background of the Invention

[002] Alguns dos medicamentos antivirais contra o HSV, já aprovados para a utilização clínica, incluem o aciclovir, o fosfonoformato e o cidofovir. Porém, o número de indivíduos infectados com HSV resistente ao aciclovir e, consequentemente, aos seus pró-fármacos, tem aumentado de forma significativa. Nesse caso, outras opções terapêuticas são o fosfonoformato e o cidofovir. Entretanto eles podem desencadear diversos efeitos colaterais, além da inconveniência da administração, que deve ser realizada em ambiente ambulatorial. Alguns polissacarídeos sulfatados como os derivados da alga verde Enteromorpha compressa (Chlorophyta, Ulvaceae), do micélio e corpo de frutificação do Agaricus brasiliensis e das plantas Adenanthera pavonina e Caesalpinia ferrea também se mostraram promissores no tratamento contra o HSV.[002] Some of the antiviral drugs against HSV, already approved for clinical use, include acyclovir, phosphonoformate and cidofovir. However, the number of individuals infected with acyclovir-resistant HSV and, consequently, its prodrugs, has increased significantly. In this case, other therapeutic options are phosphonoformate and cidofovir. However, they can trigger several side effects, in addition to the inconvenience of administration, which must be performed in an outpatient setting. Some sulfated polysaccharides such as those derived from the green algae Enteromorpha compressa (Chlorophyta, Ulvaceae), the mycelium and fruiting body of Agaricus brasiliensis and the plants Adenanthera pavonina and Caesalpinia ferrea have also shown promise in the treatment against HSV.

[003] O nosso grupo de pesquisa tem investigado a atividade antiviral de compostos naturais. A mangiferina, um desses compostos naturais testados, apresentou em ensaios prévios, atividade contra o poliovírus. Posteriormente, sabendo dessa ação antiviral, testamos a mesma substância contra o HSV-1, tanto para a cepa sensível como para a cepa resistente do vírus ao aciclovir. Em virtude de sua atividade antiviral comprovada por ensaios in vitro e in vivo, aliada à farmacotécnica e à cosmetologia, estamos propondo o uso de uma formulação tópica como alternativa terapêutica nos casos em que há resistência do vírus aos medicamentos atualmente disponíveis.[003] Our research group has investigated the antiviral activity of natural compounds. Mangiferin, one of those tested natural compounds, showed, in previous tests, activity against poliovirus. Later, knowing of this antiviral action, we tested the same substance against HSV-1, both for the sensitive strain and for the resistant strain of the virus to acyclovir. Due to its antiviral activity proven by in vitro and in vivo assays, combined with pharmacotechnics and cosmetology, we are proposing the use of a topical formulation as a therapeutic alternative in cases where the virus is resistant to the currently available drugs.

[004] A mangiferina e seus derivados têm sido amplamente utilizados em composições como já relatado em algumas patentes: US 5824320, FR2515043 e CN 102512359A. A invenção US5824320 (também citada como MX 9602837) diz respeito a composições farmacêuticas ou cosméticas contendo, como ingrediente ativo, mangiferina ou seus derivados, na forma pura (de origem natural ou por síntese química, enzimática ou biotecnológica) ou em extratos das folhas de Aphloia ou Mangifera. As formulações contendo a mangiferina purificada foram gel, emulsão, creme e loção, mas com a função específica de proteger a pele contra radiação ultravioleta e envelhecimento, melhorando a sua qualidade estrutural. Já a invenção aqui proposta refere-se a um creme contendo mangiferina natural purificada, com o diferencial de ter sido efetivo contra infecções causadas por cepas do vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1), sensível e resistente ao aciclovir. Além disso, a patente FR2515043 trata-se de um medicamento contendo mangiferina para o tratamento dos males provocados pelos vírus do grupo herpes. Foram propostas as formas farmacêuticas de unguento (2 a 5% de mangiferina) e comprimido (40% de mangiferina). Para os testes in vitro, utilizaram culturas de células de fibroblastos de embrião de galinha e nos testes in vivo, o vírus foi inoculado via intracerebral. A nossa invenção é um creme, de melhor aceitação pelo consumidor, com menos ativo (0.7% de mangiferina) e com o diferencial que inibiu uma cepa resistente do vírus ao aciclovir. Em nossos testes, in vitro, utilizamos células de rim de macaco verde africano e nos testes in vivo o vírus foi inoculado através da escarificação da pele.[004] Mangiferin and its derivatives have been widely used in compositions as already reported in some patents: US 5824320, FR2515043 and CN 102512359A. The invention US5824320 (also cited as MX 9602837) concerns pharmaceutical or cosmetic compositions containing, as active ingredient, mangiferin or its derivatives, in pure form (of natural origin or by chemical, enzymatic or biotechnological synthesis) or in extracts of leaves of Aphloia or Mangifera. The formulations containing purified mangiferin were gel, emulsion, cream and lotion, but with the specific function of protecting the skin against ultraviolet radiation and aging, improving its structural quality. The invention proposed here refers to a cream containing purified natural mangiferin, with the difference of having been effective against infections caused by strains of the herpes simplex virus type 1 (HSV-1), sensitive and resistant to acyclovir. In addition, the FR2515043 patent is a medication containing mangiferin for the treatment of the ailments caused by viruses of the herpes group. The pharmaceutical forms of ointment (2 to 5% mangiferin) and tablet (40% mangiferin) have been proposed. For in vitro tests, they used cultures of chicken embryo fibroblast cells and in in vivo tests, the virus was inoculated intracerebrally. Our invention is a cream, better accepted by the consumer, with less active (0.7% mangiferin) and with the differential that inhibited a resistant strain of the virus to acyclovir. In our in vitro tests, we used African green monkey kidney cells and in in vivo tests the virus was inoculated through scarification of the skin.

[005] A patente CN 102512359A intitulada “Mangiferin cream with anti-herpes simplex virus effect”, diz respeito a um creme obtido pelo processo de micronização contra o vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1), cepa padrão, sensível ao aciclovir (Sm 44) e herpes simplex tipo 2 (HSV-2), cepa padrão (333). Os testes in vitro foram realizados em células de rim de coelho. A patente acima mencionada testou a formulação (2,5% a 5% de mangiferina) apenas contra uma cepa do vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) sensível ao aciclovir (Sm 44) e outra cepa padrão do vírus herpes simplex tipo 2 (HSV-2) (333). Enquanto a presente invenção (creme de mangiferina a 0,7%) foi testada não apenas contra uma cepa do HSV-1 sensível ao aciclovir (KOS), mas também, contra uma cepa resistente do vírus (AR-29). O diferencial é uma formulação com menos ativo (3 a 4 vezes menos) e que age contra cepa do vírus resistente ao aciclovir, medicamento disponível para as infecções por HSV-1.[005] The patent CN 102512359A entitled “Mangiferin cream with anti-herpes simplex virus effect”, concerns a cream obtained by the micronization process against the herpes simplex virus type 1 (HSV-1), standard strain, sensitive to acyclovir ( Sm 44) and herpes simplex type 2 (HSV-2), standard strain (333). In vitro tests were performed on rabbit kidney cells. The aforementioned patent tested the formulation (2.5% to 5% mangiferin) only against one strain of herpes simplex virus type 1 (HSV-1) sensitive to acyclovir (Sm 44) and another standard strain of herpes simplex virus type 2 (HSV-2) (333). While the present invention (0.7% mangiferin cream) was tested not only against a strain of HSV-1 sensitive to acyclovir (KOS), but also against a resistant strain of the virus (AR-29). The difference is a formulation with less active (3 to 4 times less) and that acts against a strain of the virus resistant to acyclovir, a drug available for HSV-1 infections.

Summary of the invention:

[006] A presente invenção compreende o uso de uma formulação tópica contendo uma substância natural, a mangiferina, obtida de várias espécies de plantas, mas cuja fonte primária é a mangueira (Mangifera indica). Sabendo da potencialidade da mangiferina como agente antiviral, elaboramos uma formulação semissólida tópica contendo este composto natural, a qual apresentou atividade in vitro e in vivo contra o HSV-1, cepas sensível e resistente ao aciclovir. Portanto, a presente formulação é importante no controle das infecções herpéticas, inclusive nos casos de resistência ao medicamento de referência, o aciclovir.[006] The present invention comprises the use of a topical formulation containing a natural substance, mangiferin, obtained from several species of plants, but whose primary source is mango (Mangifera indica). Knowing the potential of mangiferin as an antiviral agent, we developed a semi-solid topical formulation containing this natural compound, which showed activity in vitro and in vivo against HSV-1, sensitive and resistant strains to acyclovir. Therefore, the present formulation is important in the control of herpetic infections, including in cases of resistance to the reference drug, acyclovir.

Brief description of the Figures

[007] Figura 1: O efeito da mangiferina na replicação do HSV-1, cepas AR-29 e KOS, quando adicionada concomitantemente à infecção viral (tempo 0h), em células Vero por ensaio de redução de plaque. A percentagem de inibição viral está expressa como a média ± desvio padrão da triplicata de experimentos independentes.[007] Figure 1: The effect of mangiferin on the replication of HSV-1, AR-29 and KOS strains, when added concomitantly to viral infection (time 0h), in Vero cells by plaque reduction assay. The percentage of viral inhibition is expressed as the mean ± standard deviation of the triplicate of independent experiments.

[008] Figura 2: O efeito virucida da mangiferina sobre as cepas AR-29 e KOS do HSV-1 em células Vero por ensaio de redução de plaque. A percentagem de inibição viral está expressa como a média ± desvio padrão da triplicata de experimentos independentes.[008] Figure 2: The virucidal effect of mangiferin on HSV-1 AR-29 and KOS strains in Vero cells by plaque reduction assay. The percentage of viral inhibition is expressed as the mean ± standard deviation of the triplicate of independent experiments.

[009] Figura 3: O efeito da mangiferina na inibição da adsorção das cepas AR29 e KOS do HSV-1 em células Vero por ensaio de redução de plaque. A percentagem de inibição viral está expressa como a média ± desvio padrão da triplicata de experimentos independentes.[009] Figure 3: The effect of mangiferin on the inhibition of the adsorption of HSV-1 AR29 and KOS strains on Vero cells by plaque reduction assay. The percentage of viral inhibition is expressed as the mean ± standard deviation of the triplicate of independent experiments.

[010] Figura 4: O efeito da formulação contendo mangiferina 0,7% (FM) nas lesões de pele causadas pela cepa AR-29 do HSV-1 em camundongos fêmeas BALB/c. Os animais foram infectados por escarificação da pele e tratados topicamente com FM ou aciclovir (ACV) (50 mg/g), 4 horas após a infecção, 5 vezes por dia, por 10 dias. Cada ponto representa o valor médio de 6 animais por grupo (± o desvio padrão).[010] Figure 4: The effect of the formulation containing 0.7% mangiferin (FM) on skin lesions caused by the HSV-1 AR-29 strain in female BALB / c mice. The animals were infected by scarification of the skin and treated topically with FM or acyclovir (ACV) (50 mg / g), 4 hours after infection, 5 times a day, for 10 days. Each point represents the average value of 6 animals per group (± the standard deviation).

[011] Figura 5: O efeito da formulação contendo mangiferina 0,7% (FM) nas lesões de pele causadas pela cepa AR-29 do HSV-1 em camundongos machos BALB/c. Os animais foram infectados por escarificação da pele e tratados topicamente com FM ou aciclovir (ACV) (50 mg/g), 4 horas após a infecção, 5 vezes por dia, por 10 dias. Cada ponto representa o valor médio de 6 animais por grupo (± o desvio padrão).[011] Figure 5: The effect of the formulation containing 0.7% mangiferin (FM) on skin lesions caused by the HSV-1 AR-29 strain in male BALB / c mice. The animals were infected by scarification of the skin and treated topically with FM or acyclovir (ACV) (50 mg / g), 4 hours after infection, 5 times a day, for 10 days. Each point represents the average value of 6 animals per group (± the standard deviation).

[012] Figura 6: O efeito da formulação contendo mangiferina 0,7% (FM) nas lesões de pele causadas pela cepa KOS do HSV-1 em camundongos fêmeas BALB/c. Os animais foram infectados por escarificação da pele e tratados topicamente com FM ou aciclovir (ACV) (50 mg/g), 4 horas após a infecção, 5 vezes por dia, por 10 dias. Cada ponto representa o valor médio de 6 animais por grupo (± o desvio padrão).[012] Figure 6: The effect of the formulation containing 0.7% mangiferin (FM) on skin lesions caused by the KOS strain of HSV-1 in female BALB / c mice. The animals were infected by scarification of the skin and treated topically with FM or acyclovir (ACV) (50 mg / g), 4 hours after infection, 5 times a day, for 10 days. Each point represents the average value of 6 animals per group (± the standard deviation).

[013] Figura 7: O efeito da formulação contendo mangiferina 0,7% (FM) nas lesões de pele causadas pela cepa KOS do HSV-1 em camundongos machos BALB/c. Os animais foram infectados por escarificação da pele e tratados topicamente com FM ou aciclovir (ACV) (50 mg/g), 4 horas após a infecção, 5 vezes por dia, por 10 dias. Cada ponto representa o valor médio de 6 animais por grupo (± o desvio padrão).[013] Figure 7: The effect of the formulation containing 0.7% mangiferin (FM) on skin lesions caused by the KOS strain of HSV-1 in male BALB / c mice. The animals were infected by scarification of the skin and treated topically with FM or acyclovir (ACV) (50 mg / g), 4 hours after infection, 5 times a day, for 10 days. Each point represents the average value of 6 animals per group (± the standard deviation).

Detailed description of the Invention 1-ACTIVE Collection and Preparation

[014] O isolamento e purificação da mangiferina foram realizados no LabPIM (Laboratório de Materiais de Polímero e Inovação) do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará. Foi feita uma extração a frio, em que foram desengorduradas 300 g das cascas da manga de Mangifera indica com hexano P.A (1:10; w/v) durante 5 dias, com mudanças diárias de solventes. Após esta etapa, 100 g das cascas foram secas e, submetidas a uma bateria de extração Soxhlet, durante 5 dias, utilizando o metanol P.A como solvente extrator. O extrato metanólico obtido foi concentrado num evaporador rotativo, a uma temperatura máxima de 65 °C, até a evaporação total do solvente, ressuspenso com acetato de etila, armazenado durante 96 h no refrigerador até a decantação de um sólido amarelado que foi separado por centrifugação com lavagens subsequentes em metanol.[014] The isolation and purification of mangiferin were performed at LabPIM (Laboratory of Polymer Materials and Innovation) of the Department of Organic and Inorganic Chemistry at the Federal University of Ceará. A cold extraction was performed, in which 300 g of the Mangifera indica mango peels were degreased with hexane P.A (1:10; w / v) for 5 days, with daily changes of solvents. After this step, 100 g of the shells were dried and subjected to a Soxhlet extraction battery for 5 days, using methanol P.A as the extracting solvent. The methanolic extract obtained was concentrated on a rotary evaporator, at a maximum temperature of 65 ° C, until the total evaporation of the solvent, resuspended with ethyl acetate, stored for 96 h in the refrigerator until the decantation of a yellowish solid that was separated by centrifugation. with subsequent washes in methanol.

2- MICRO-ORGANISMS

[015] Foram utilizadas duas cepas de HSV-1: KOS (sensível ao aciclovir) e AR29 (cepa resistente ao aciclovir), ambas cedidas pelo Laboratório de Inovação Tecnológica no Desenvolvimento de Fármacos e Cosméticos do Departamento de Ciências Básicas da Saúde da Universidade Estadual de Maringá, tituladas por ensaio de plaque e mantidas à -20°C com 10% de glicerol.[015] Two strains of HSV-1 were used: KOS (sensitive to acyclovir) and AR29 (strain resistant to acyclovir), both provided by the Laboratory of Technological Innovation in the Development of Drugs and Cosmetics of the Department of Basic Health Sciences at the State University from Maringá, titrated by a plaque test and maintained at -20 ° C with 10% glycerol.

3- PREPARATION OF FORMULATIONS / COSMETIC PRODUCTS Preparation technique

[016] A emulsão (óleo/água) foi preparada pelo método de inversão de fase em dois passos, utilizando álcool cetoestearílico 30:70, álcool cetoestearílico etoxilado 20 OE, monoestearato de glicerila, óleo mineral, triglicérides de ácido cáprico e caprílico, propilenoglicol, glicerina, metilparabeno, mangiferina 0,7% e água destilada. O álcool cetoestearílico 30:70, álcool cetoestearílico etoxilado 20 OE, monoestearato de glicerila, óleo mineral e triglicérides de ácido cáprico e caprílico foram dispersos na fase oleosa. A glicerina e o metilparabeno foram dispersos na fase aquosa. As fases oleosa e aquosa foram aquecidas separadamente a 75 ± 2 °C. A fase oleosa foi adicionada lentamente à fase aquosa com agitação a 450 rpm (misturador digital RW20, IKA, Wilmington, NC) até 40 °C. Em seguida, a mangiferina foi dispersa em propilenoglicol e depois adicionada à emulsão a 25 °C.[016] The emulsion (oil / water) was prepared by the two-step phase inversion method, using 30:70 ceto-stearyl alcohol, 20 OE ethoxylated ceto-stearyl alcohol, glyceryl monostearate, mineral oil, capric and caprylic acid triglycerides, propylene glycol , glycerin, methylparaben, 0.7% mangiferin and distilled water. The 30:70 ceto-stearyl alcohol, 20 OE ethoxylated ceto-stearyl alcohol, glyceryl monostearate, mineral oil and capric and caprylic acid triglycerides were dispersed in the oil phase. Glycerin and methylparaben were dispersed in the aqueous phase. The oil and water phases were heated separately to 75 ± 2 ° C. The oil phase was added slowly to the aqueous phase with stirring at 450 rpm (digital mixer RW20, IKA, Wilmington, NC) up to 40 ° C. Then, the mangiferin was dispersed in propylene glycol and then added to the emulsion at 25 ° C.

4- Characterization of the formulation

[017] As características de aparência, odor e cor foram analisadas, em triplicata, sendo as amostras avaliadas quanto à separação de fases, alteração de cor, precipitação e turbidez. Também foram classificadas por sua cor como normal, sem alteração, ligeiramente modificada, modificada ou fortemente modificada. A amostra apresentou-se amarelada, cor característica do ativo utilizado, homogênea e com odor característico.[017] The characteristics of appearance, odor and color were analyzed, in triplicate, and the samples were evaluated for phase separation, color change, precipitation and turbidity. They were also classified by their color as normal, without alteration, slightly modified, modified or strongly modified. The sample was yellowish, a characteristic color of the used asset, homogeneous and with a characteristic odor.

[018] Cada amostra foi avaliada quanto ao aparecimento de cremeação e coalescência após 24 h e após o teste de centrifugação. Cinco gramas de amostra foram centrifugados (Centrifuge Baby I 206 BL, Fanem, São Paulo, Brasil) a 3200 rpm por 30 min à temperatura ambiente. Após o teste de centrifugação a temperatura ambiente (25 ± 2°C), nenhuma amostra apresentou cremeação, coalescência ou separação de fases.[018] Each sample was evaluated for the appearance of creaming and coalescence after 24 h and after the centrifugation test. Five grams of sample were centrifuged (Centrifuge Baby I 206 BL, Fanem, São Paulo, Brazil) at 3200 rpm for 30 min at room temperature. After the centrifugation test at room temperature (25 ± 2 ° C), none of the samples showed creaming, coalescence or phase separation.

[019] Os valores de pH das amostras foram determinados usando um medidor de pH (Hanna, São Paulo, Brasil), calibrado com soluções tampão (pH 4,0 e 7,0) à temperatura ambiente (25 ± 5 °C) sendo o eletrodo inserido diretamente na amostra. Foram testadas três repetições de cada formulação. O pH medido em todas as amostras foi aproximadamente 5,5, valor compatível com o pH cutâneo.[019] The pH values of the samples were determined using a pH meter (Hanna, São Paulo, Brazil), calibrated with buffer solutions (pH 4.0 and 7.0) at room temperature (25 ± 5 ° C) and the electrode inserted directly into the sample. Three replicates of each formulation were tested. The pH measured in all samples was approximately 5.5, a value compatible with the cutaneous pH.

[020] O teste de espalhabilidade foi realizado, em triplicata e foram usadas duas lâminas de vidro (10 cm x 10 cm) posicionadas sobre um papel milimétrico. Cada amostra (0,5 g) foi introduzida no ponto central da lâmina.[020] The spreadability test was carried out in triplicate and two glass slides (10 cm x 10 cm) were placed on a millimeter paper. Each sample (0.5 g) was introduced at the central point of the slide.

[021] Depois, colocou-se uma lâmina de peso conhecido (4,93 g) sobre a amostra. Após um minuto, o diâmetro na posição oposta foi lido com a ajuda da escala de papel. Posteriormente, calculamos o diâmetro médio. Este procedimento foi repetido sucessivamente adicionando outros pesos (2 g, 4 g e 10 g) em intervalos de um minuto, respectivamente. Os resultados foram expressos como a espalhabilidade da amostra decorrente do peso aplicado, de acordo com a equação abaixo, que corresponde à média de três determinações.
Ei = d2. π / 4[021] Then, a slide of known weight (4.93 g) was placed on the sample. After one minute, the diameter in the opposite position was read with the aid of the paper scale. Subsequently, we calculated the average diameter. This procedure was repeated successively by adding other weights (2 g, 4 g and 10 g) at one minute intervals, respectively. The results were expressed as the spreadability of the sample due to the applied weight, according to the equation below, which corresponds to the average of three determinations.
Hey = d2. π / 4

[022] Onde: Ei: espalhabilidade da amostra para um dado peso (mm2); d = diâmetro médio (mm); π: constante (3,14).[022] Where: Hey: spreadability of the sample for a given weight (mm2); d = average diameter (mm); π: constant (3.14).

[023] Foi observada uma boa espalhabilidade, inclusive peso-dependente, indicando que essa formulação é fácil de ser aplicada na superfície da pele.[023] Good spreadability, including weight-dependent, was observed, indicating that this formulation is easy to apply to the skin surface.

5- ACTIVITY:

[024] Atividade anti-herpes vírus tipo 1, sensível e resistente ao aciclovir.[024] Anti-herpes virus type 1 activity, sensitive and resistant to acyclovir.

6-RESULTS

[025] No tratamento simultâneo (tempo 0 h), a mangiferina exibiu altas taxas de inibição viral (IV%): 94,4%, 100% e 100% nas concentrações de 6,25, 12,5 e 25 μg/mL, respectivamente para a cepa AR-29. Valores similares de IV% foram encontrados para a cepa KOS: 93,9%, 100% e 100%, respectivamente, nas mesmas concentrações (FIG 1).[025] In simultaneous treatment (time 0 h), mangiferin exhibited high rates of viral inhibition (IV%): 94.4%, 100% and 100% at concentrations of 6.25, 12.5 and 25 μg / mL , respectively for the AR-29 strain. Similar values of IV% were found for the KOS strain: 93.9%, 100% and 100%, respectively, in the same concentrations (FIG 1).

[026] Para o ensaio virucida, a mangiferina mostrou uma inibição máxima em todas as concentrações testadas para a cepa AR-29. Enquanto, a taxa de inibição foi menor, para a cepa KOS, alcançando uma inibição máxima de 74,8% na maior concentração testada (25 µg/mL) (FIG 2).[026] For the virucidal assay, mangiferin showed maximum inhibition at all concentrations tested for the AR-29 strain. Meanwhile, the inhibition rate was lower, for the KOS strain, reaching a maximum inhibition of 74.8% at the highest concentration tested (25 µg / mL) (FIG 2).

[027] Para o ensaio de inibição da adsorção, a mangiferina inibiu a cepa AR-29 por 71,3% e 74% nas concentrações de 12,5 e 25 μg/mL, respectivamente. Inibição máxima foi observada para a cepa KOS em 25 μg/mL. Entretanto em 3,12 μg/mL a IV% decaiu para 29,2% (FIG 3).[027] For the adsorption inhibition assay, mangiferin inhibited the AR-29 strain by 71.3% and 74% at concentrations of 12.5 and 25 μg / mL, respectively. Maximum inhibition was observed for the KOS strain at 25 μg / mL. However, at 3.12 μg / mL, IV% decreased to 29.2% (FIG 3).

[028] Os resultados in vivo da mangiferina contra a cepa AR-29, que corrobora os resultados in vitro (FIG 4 e 5), demonstraram que tanto camundongos fêmeas como machos tratados com a formulação contendo 0,7% de mangiferina (FM) apresentaram um atraso significativo no desenvolvimento e progressão das lesões cutâneas em comparação com o controle (p <0,05).[028] The in vivo results of mangiferin against strain AR-29, which corroborates the results in vitro (FIG 4 and 5), demonstrated that both female and male mice treated with the formulation containing 0.7% mangiferin (FM) showed a significant delay in the development and progression of skin lesions compared to the control (p <0.05).

[029] Comparativamente, para a cepa KOS, camundongos fêmeas e machos tratados com FM seguiram uma evolução semelhante à do grupo controle nos primeiros dias após a infecção, mas, a partir do sétimo dia, alguns animais já estavam com a pele recuperada. No entanto, não houve diferença estatisticamente significante entre esses grupos (p> 0,05) (FIG 6 e 7).[029] Comparatively, for the KOS strain, female and male mice treated with FM followed a similar evolution to that of the control group in the first days after infection, but, from the seventh day, some animals had their skin recovered. However, there was no statistically significant difference between these groups (p> 0.05) (FIG 6 and 7).

[030] Em síntese, nossos achados demonstraram que a mangiferina exibiu atividade antiviral in vitro e in vivo para as cepas AR-29 e KOS do HSV-1. É notável o efeito do composto na cepa AR-29, e, portanto a sua potencialidade no controle da infecção por HSV-1 resistente ao aciclovir.
Tabela 1: Composição da formulação semissólida tópica contendo a mangiferina:

[030] In summary, our findings demonstrated that mangiferin exhibited antiviral activity in vitro and in vivo for HSV-1 AR-29 and KOS strains. The effect of the compound on the AR-29 strain is remarkable, and therefore its potential to control infection by HSV-1 resistant to acyclovir.
Table 1: Composition of the semi-solid topical formulation containing mangiferin:

Claims

TOPICAL FORMULATION CONTAINING MANGIFERIN WITH ACTIVITY AGAINST HERPES SIMPLEX TYPE 1 VIRUS, SENSITIVE AND ACICLOVIR-RESISTANT STRUCTURES, characterized by containing 0.7% mangiferin

SEMISOLID FORMULATION, according to claim 1, characterized in that it comprises glycerol (2%), methyl paraben (0.2%), 30:70 ceto-stearyl alcohol (7%), glyceryl monostearate (2%), ethoxylated ceto-stearyl alcohol 20 OE (3%), mineral oil (10%), capric and caprylic acid triglycerides (2%), mangiferin (0.7%), propylene glycol (20%) and distilled water (qsp-100 mL)

PROCESS OF OBTAINING SEMISOLID FORMULATION, characterized by comprising the following phases: aqueous and oily

PROCESS, according to claim 3, characterized in that it is carried out as follows: 30:70 ceto-stearyl alcohol, 20 OE ethoxylated ceto-stearyl alcohol, glyceryl monostearate, mineral oil and capric / caprylic acids triglycerides were dispersed in the oil phase; Glycerin and methylparaben were dispersed in the aqueous phase; Finally, the oil phase was added slowly to the aqueous phase with stirring at 450 rpm (digital mixer RW20, IKA, Wilmington, NC) up to 40 ° C; Then, the mangiferin was dispersed in propylene glycol and then added to the emulsion at 25 ° C

USE of the formulation, characterized by its topical application in the treatment of infections by the herpes simplex virus type 1 (HSV-1), both for the sensitive strain and for the control of infections by strains resistant to acyclovir; The formulation will be applied five times a day on the lesions, omitting the night time, for ten days